ES2612572T3 - Matriz de cromatografía - Google Patents

Abstract

Una matriz de separación que comprende una pluralidad de ligandos de cromatografía definidos por la siguiente fórmula R1-R2-N(R3)-R4-R5 acoplados a un soporte a través del grupo amina, en donde R1 es un grupo fenilo no sustituido; R2 es -CH2-; R3 es -CH3; R4 es -CH2-CH2-CH2- o -CH2-CH2-; y R5 es OH.

Description

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DESCRIPCION

Matriz de cromatograffa Campo tecnico

La presente invencion se refiere a nuevas matrices de cromatograffa, que son utiles para la purificacion de biomoleculas tales como protemas. La presente matriz es util p.ej. para la purificacion de anticuerpos, preferiblemente inmovilizados en un soporte poroso tal como parffculas o una membrana. En consecuencia, la invencion abarca una matriz de cromatograffa que comprende nuevos ligandos, un metodo para la preparacion de los mismos y un metodo para la purificacion de anticuerpos.

Antecedentes

El sistema inmunitario esta compuesto de muchos tipos de celulas interdependientes que protegen colectivamente el organismo de infecciones bacterianas, parasitarias, fungicas, virales, y del crecimiento de celulas tumorales. Los guardianes del sistema inmunitario son los macrofagos que recorren continuamente el torrente sangumeo de su anfitrion. Al ser amenazados por la infeccion o inmunizacion, los macrofagos responden envolviendo los invasores marcados con moleculas foraneas conocidas como anffgenos. Este evento, mediado por las celulas T auxiliares, establece una complicada cadena de respuestas que da como resultado la estimulacion de las celulas B. Estas celulas B, a su vez, producen protemas llamadas anticuerpos, que se unen al invasor foraneo. El evento de union entre el anticuerpo y el anffgeno marca el invasor foraneo para su destruccion a traves de la fagocitosis o la activacion del sistema del complemento. Existen varias clases diferentes de anticuerpos, tambien conocidos como inmunoglobulinas, tales como IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Se diferencian no solo en sus papeles fisiologicos sino tambien en sus estructuras. Desde un punto de vista estructural, los anticuerpos IgG se han estudiado extensamente, quizas debido al papel dominante que juegan en una respuesta inmune madura. Los anticuerpos policlonales se producen de acuerdo con los metodos de inmunizacion convencionales de un animal con el anffgeno apropiado. En respuesta, el animal producira anticuerpos que son policlonales. Sin embargo, para muchos fines, se desea disponer de un unico clon de un determinado anticuerpo, conocido como anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales (MAb) son producidos por celulas tffbridas o fusionadas que comprenden una fusion entre una celula B normal, que produce solo un unico anticuerpo, y una celula de tumor de mieloma anormal. El tffbrido resultante, conocido como hibridoma, se utiliza hoy en dfa en metodos convencionales para la produccion de anticuerpos.

La actividad biologica que poseen las inmunoglobulinas es explotada a dfa de hoy en una serie de diferentes aplicaciones en el sector del diagnostico, de proteccion de la salud y terapeutico humanos y veterinarios. De hecho, en los ultimos anos, los anticuerpos monoclonales y los constructos de anticuerpos recombinantes se han convertido en la clase mas grande de protemas investigadas actualmente en ensayos clmicos y que reciben la aprobacion de la FDA como agentes terapeuticos y de diagnostico. Como complemento a los sistemas de expresion y las estrategias de produccion, se requieren protocolos de purificacion eficaces para obtener anticuerpos altamente puros de una manera sencilla y rentable.

Los metodos tradicionales para el aislamiento de inmunoglobulinas se basan en la precipitacion reversible selectiva de la fraccion proteica que comprende las inmunoglobulinas mientras se dejan otros grupos de protemas en solucion. Los agentes de precipitacion ffpicos son etanol, polietilenglicol, sales liotropicas, tales como sulfato de amonio y fosfato de potasio, y acido capfflico. Tfpicamente, estos metodos de precipitacion estan proporcionando productos muy impuros, mientras que al mismo tiempo son lentos y laboriosos. Ademas, la adicion del agente precipitante a la materia prima hace diffcil utilizar el sobrenadante para otros fines y crea un problema de eliminacion, que es particularmente relevante cuando se habla de la purificacion a gran escala de las inmunoglobulinas.

Un metodo alternativo para el aislamiento de las inmunoglobulinas es la cromatograffa, que abarca una familia de metodos de separacion estrechamente relacionados. La caracteffstica que distingue la cromatograffa de la mayoffa de otros metodos ffsicos y qrnmicos de separacion es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles, en donde una fase es estacionaria y la otra movil. La mezcla de muestra, introducida en la fase movil, experimenta una serie de interacciones con las fases estacionaria y movil, a medida que esta se lleva a traves del sistema por la fase movil. Las interacciones explotan las diferencias en las propiedades ffsicas o qrnmicas de los componentes de la muestra. Estas diferencias gobiernan la velocidad de migracion de los componentes individuales bajo la influencia de una fase movil que se mueve a traves de una columna que contiene la fase estacionaria. Los componentes separados emergen en orden creciente de interaccion con la fase estacionaria. El componente menos retardado eluye primero, el material retenido mas fuertemente eluye el ultimo. La separacion se obtiene cuando un componente es retardado suficientemente para evitar el solapamiento con la zona de un soluto adyacente a medida que los componentes de la muestra eluyen de la columna. Se estan realizando continuamente esfuerzos para disenar la fase estacionaria optima para cada proposito de separacion espedfico. Tal fase estacionaria esta compuesta comunmente de una matriz de soporte o base a la que se ha unido un ligando que comprende grupos funcionales, es decir, de union. Se hace referencia comunmente a cada tipo de cromatograffa basandose en el

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principio de interaccion que utiliza, tal como cromatograffa de afinidad, cromatograffa de interaccion hidrofoba y cromatograffa de intercambio ionico.

La cromatograffa de afinidad se basa en interacciones espedficas entre una biomolecula diana y un ligando bioespedfico de acuerdo con un principio de reconocimiento cerradura-llave. Por lo tanto, la diana y el ligando constituiran un par de afinidad, tal como anffgeno/anticuerpo, enzima/receptor etc. Los ligandos de afinidad basados en protemas son bien conocidos, tales como cromatograffa de afinidad con Protema A y Protema G que son ambos metodos generalizados para el aislamiento y la purificacion de anticuerpos. Es bien conocido que la cromatograffa con protema A proporciona una especificidad excepcional, en particular hacia los anticuerpos monoclonales, y por consiguiente se pueden obtener purezas elevadas. Utilizados combinados con etapas de intercambio ionico, interaccion hidrofoba, hidroxiapatita y/o filtracion en gel, los metodos basados en Protema A se han convertido en el metodo de purificacion de anticuerpos de eleccion para muchas compares biofarmaceuticas, vease, p.ej. el documento WO 8400773 y el documento US 5.151.350. Sin embargo, debido a los enlaces pepffdicos de las protemas, las matrices de protema A presentan un cierto grado de sensibilidad alcalina. Ademas, cuando se utilizan matrices de Protema A para purificar anticuerpos a partir de medios de cultivo celular, las proteasas procedentes de las celulas pueden causar una perdida de Protema A, o fragmentos pepffdicos de la misma.

La cromatograffa de intercambio ionico se utiliza con frecuencia en los protocolos para el aislamiento de inmunoglobulinas. En la cromatograffa de intercambio anionico, las cadenas laterales de aminoacidos con carga negativa de la inmunoglobulina interactuaran con ligandos cargados positivamente de una matriz de cromatograffa. En la cromatograffa de intercambio cationico por otra parte, las cadenas laterales de aminoacidos con carga positiva de la inmunoglobulina interactuaran con ligandos cargados negativamente de una matriz de cromatograffa.

La cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC) es otro metodo descrito y utilizado en los protocolos para el aislamiento de inmunoglobulinas. Si un producto de inmunoglobulina de alta pureza es el objeto, se recomienda comunmente combinar la HIC con una o mas etapas adicionales. En la HIC, con el fin de hacer que la inmunoglobulina se una de manera eficiente a la matriz de la HIC, se requiere la adicion de sales liotropicas a la fase movil. La inmunoglobulina unida se libera posteriormente de la matriz disminuyendo la concentracion de sal liotropica. Por lo tanto, una desventaja de este procedimiento es la necesidad de anadir sal liotropica a la materia prima, ya que esto puede causar problemas y en consecuencia un aumento del coste para el usuario a gran escala. Por ejemplo, para las materias primas tales como suero, plasma, y yema de huevo, la adicion de sales liotropicas a las materias primas seffa en muchos casos prohibitiva en aplicaciones a gran escala, ya que la sal podffa evitar cualquier uso economicamente factible de la materia prima empobrecida en inmunoglobulina. Un problema adicional en las aplicaciones a gran escala seffa la eliminacion de varios miles de litros de desechos.

El documento US 5.945.520 (Burton et al) describe resinas cromatograficas de modo mixto que presentan un caracter hidrofobo al pH de la union y un caracter hidrofilo y/o electrostatico al pH de desorcion. La resina esta disenada espedficamente para unir el compuesto diana de una solucion acuosa a una fuerza ionica baja y alta. Esto se consigue mediante ligandos ionizables seleccionados que comprenden un brazo espaciador y al menos una funcionalidad ionizable, en donde la densidad de los ligandos ionizables sobre la matriz solida de soporte es mayor que el menor de o bien aproximadamente 150 pmoles/ml de resina o bien 1 mmol/gramo de peso seco de resina. Ademas, el caracter hidrofobo de la resina que comprende dichos ligandos ionizables es suficiente para unir al menos 50% del compuesto diana en un medio acuoso a una fuerza ionica alta y baja a un primer pH. Los ejemplos ilustrativos de la funcionalidad ionizable son 4-(aminometil)piridina, 3-(aminometil)piridina, 2-(aminometil)piridina, 1- (3-aminopropil)imidazol, 2-(aminometil)bencimidazol, 4-(3-aminopropil)morfolina.

Adicionalmente, el documento WO 01/38228 (Belew et al.) se refiere a un metodo para la adsorcion de intercambio anionico en donde se utilizan intercambiadores anionicos de tioeter para eliminar una sustancia cargada negativamente de un lfquido mediante su union. Cada ligando comprende un nitrogeno cargado positivamente y un enlace tioeter a una distancia de 1-7 atomos de dicho nitrogeno cargado. Las sustancias deseadas, tales como celulas, partes de celulas y sustancias que comprenden estructuras de peptidos se adsorben a las concentraciones de sal en la region de NaCl 0,25 M.

El documento WO 01/38227 describe intercambiadores de aniones con ligandos aromaticos para la separacion de alto contenido de sal de, p.ej., protemas. J B Crowther et al.: J Chromatography 282, 619-628 (1983) describen matrices con ligandos de bencildimetilamina para separaciones de acido nucleico.

Finalmente, el documento US 6.702.943 (Johansson et al.) describe un metodo para la eliminacion de una sustancia diana de un lfquido mediante su adsorcion a una matriz que porta una pluralidad de ligandos que comprenden grupos de intercambio anionico y una estructura hidrofoba. Mas espedficamente, los ligandos contienen un anillo aromatico en la proximidad de los grupos de intercambio anionico con carga positiva. Se indica que las sustancias deseadas son celulas, partes de celulas y sustancias que comprenden estructuras pepffdicas. Los ligandos descritos se designan "ligandos de alta salinidad" debido a su capacidad de adsorber sustancias diana a altas concentraciones de sal tales como NaCl 0,25 M.

Sin embargo, para optimizar un procedimiento relacionado con la purificacion de una molecula diana espedfica, se requeriran condiciones especiales de funcionamiento, y la matriz de mejor separacion variara de un caso a otro. Por

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ejemplo, en la industria de la biotecnolog^a, se necesita disenar procedimientos espedficos para la purificacion de peptidos y protemas; acidos nucleicos; virus, etc. Adicionalmente, en la purificacion de anticuerpos, el tipo de anticuerpo sera decisivo para la eleccion de la matriz de separacion. Por lo tanto, todavfa existe una necesidad en este campo de matrices de separacion alternativas para proporcionar un amplio espectro de opciones para la purificacion de los muchos nuevos productos que se desarrollan constantemente.

Breve descripcion de la invencion

Un aspecto de la presente invencion es proporcionar una matriz de separacion novedosa que es util en la separacion de los anticuerpos de otros componentes de un lfquido.

Un aspecto espedfico de la invencion es proporcionar tal matriz, que es capaz de adsorber las protemas contaminantes, pero no el anticuerpo diana.

Otros aspectos y ventajas de la invencion apareceran a partir de la descripcion detallada que sigue.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es un ligando de cromatograffa ilustrativo de acuerdo con la invencion, es decir, N-bencil-N- metiletanolamina acoplado a un soporte a traves de su amina.

La Figura 2 muestra un cromatograma de la separacion del anticuerpo monoclonal en una matriz de separacion que comprende ligandos de N-bencil-N-metiletanolamina inmovilizados sobre Sepharose™ 6 FF; y como referencia, el fuerte intercambiador anionico Q Sepharose™ FF, y N,N-dimetil-bencilamina como se describe a continuacion.

Las Figuras 3 a) y b) muestran los resultados de la cromatograffa llevada a cabo en prototipos de ligandos con una mezcla de mAbl-rProtema A.

Las Figuras 4 a)-c) muestran los resultados de la cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) analttica en la muestra con MAb 1, rPrA al 1% y fracciones de flujo continuo y de eluato reunidas de las rondas cromatograficas en la figura 3.

Definiciones

Los terminos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

El termino "matriz de separacion" se utiliza en la presente memoria para denotar un material compuesto de un soporte al que se han acoplado uno o mas ligandos que comprenden grupos funcionales. El termino "resina" se utiliza a veces para una matriz de separacion en este campo.

El termino matriz de separacion "multi-modal" se refiere a una matriz capaz de proporcionar al menos dos sitios diferentes, pero cooperativos, que interactuan con el compuesto al que se van a unir. Por ejemplo, uno de estos sitios puede proporcionar un tipo atractivo de interaccion carga-carga entre el ligando y la sustancia de interes. El otro sitio puede proporcionar la interaccion de aceptor-donador de electrones y/o interacciones hidrofobicas y/o hidrofflicas. Las interacciones donador-aceptor de electrones incluyen interacciones tales como enlaces de hidrogeno, n-n, cation-n, transferencia de carga, dipolo-dipolo, dipolo inducido, etc. Las matrices de separacion "multimodales" tambien se conocen como matrices de separacion de "modo mixto".

El termino "superficie" significa en la presente memoria todas las superficies externas, e incluye en el caso de un soporte poroso las superficies exteriores, asf como las superficies de los poros.

El termino "eluyente" se utiliza en su significado convencional en este campo, es decir, un tampon de pH y/o fuerza ionica adecuados para liberar uno o mas compuestos de una matriz de separacion.

El termino "etapa de captura" se refiere en el contexto de la cromatograffa lfquida a la etapa inicial de un procedimiento de separacion. Con mas frecuencia, una etapa de captura incluye la clarificacion, concentracion, estabilizacion y una purificacion significativa de las impurezas solubles. Despues de la etapa de captura, puede seguir una purificacion intermedia, que reduce adicionalmente las cantidades restantes de impurezas tales como protemas de celulas anfitrionas, ADN, virus, endotoxinas, nutrientes, componentes de un medio de cultivo celular, tales como agentes antiespumantes y antibioticos, e impurezas relacionadas con el producto, tales como agregados, especies mal plegadas y agregados. El termino "desechable" se refiere en la presente memoria en el contexto de las columnas de cromatograffa y otras matrices de separacion a una matriz que esta destinada a un solo uso, o a un numero limitado de usos. Los productos desechables se utilizan ventajosamente para eliminar los contaminantes que son perjudiciales incluso en cantidades muy pequenas, en cuyo caso es conveniente adsorber dicho contaminante a la matriz y a continuacion descartar la matriz. Otra situacion en la que se desean productos desechables es para el procesamiento esteril, en cuyo caso la matriz es esteril o al menos aseptica.

El termino "etapa de pulido" se refiere en el contexto de la cromatograffa lfquida a una etapa de purificacion final, en la que se retiran las trazas de impurezas para dejar un producto activo, seguro. Las ipurezas eliminadas durante la

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etapa de pulido son a menudo conformeros de la molecula diana o productos sospechosos de perdida.

El termino una "protema de union a Fc" significa una protema capaz de unirse a la parte cristalizable (Fc) de un anticuerpo, e incluye, p.ej., Protema A y Protema G, o cualquiera de sus fragmented o protemas de fusion que ha mantenido dicha propiedad de union.

Descripcion detallada de la invencion

En un primer aspecto, la presente invencion es una matriz de separacion que comprende ligandos de cromatograffa acoplados a traves del grupo amina a un soporte. La matriz de acuerdo con la invencion es especialmente util en la purificacion de anticuerpos, como se discutira en mas detalle a continuacion.

El presente ligando se define mediante la siguiente formula

R1-R2-N(Ra)-R4-R5 en donde

R1 es un grupo fenilo no sustituido;

R2 es -CH2-;

R3 es -CH3;

R4 es -CH2-CH2-CH2- o -CH2-CH2-; y

R5 es OH.

Por lo tanto, en una realizacion ventajosa, la matriz de acuerdo con la invencion comprende ligandos de N-bencil-N- metil etanol amina (BMEA).

El ligando es sintetizado facilmente por el experto en este campo utilizando metodos convencionales de qrnmica organica.

Un segundo aspecto de la invencion es un metodo de preparacion de una matriz de separacion, cuyo metodo comprende inmovilizar una pluralidad de ligandos como se describio anteriormente en un soporte. Con el fin de proporcionar una matriz adecuada para un solo uso especialmente en el campo medico o de diagnostico, la matriz de separacion preparada de acuerdo con la invencion tambien se esteriliza en una etapa posterior. Por lo tanto, en una realizacion, el metodo comprende preparar una matriz como se describio anteriormente; proporcionar la matriz preparada de este modo en una columna; y esterilizar la matriz asf preparada. La esterilizacion se realiza facilmente en condiciones adecuadas por el experto en este campo, tal como el tratamiento por calor; radiacion; o cualquier otro metodo utilizado convencionalmente.

Como se desprende de la formula anterior, en su estado no inmovilizado, el ligando comprende una amina terciaria que constituira un asa adecuada para el acoplamiento del mismo a un soporte, creando de este modo un ligando unido que comprende una amina cuaternaria y un grupo fenilo. En consecuencia, inmovilizado, el ligando segun la invencion se considera que es un ligando de intercambio anionico multi-modal, ya que ademas del grupo amina cuaternaria con carga positiva tambien comprende la estructura de anillo aromatico que es hidrofoba. Los metodos para la inmovilizacion de ligandos en las superficies porosas o no porosas son bien conocidos en este campo; vease, p.ej. Immovilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia y Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. En una realizacion, la densidad de ligandos en la superficie del soporte se encuentra en un intervalo cercano al que se utiliza comunmente para las matrices de intercambio ionico convencionales.

En una realizacion ventajosa, el acoplamiento del ligando al soporte se proporciona mediante la introduccion de un conector entre el soporte y el conector. El acoplamiento puede llevarse a cabo despues de cualquier metodologfa de acoplamiento covalente convencional, tal como mediante el uso de epiclorhidrina; epibromhidrina; alil-glicidileter; bis- epoxidos tales como butanodiol diglicidil eter; sustancias alifaticas sustituidas con halogeno, tales como di-cloro- propanol; y divinilsulfona. Estos metodos son bien conocidos en el campo y son llevados a cabo facilmente por el experto en la tecnica.

En una realizacion espedfica, de acuerdo con la invencion, el ligando se acopla al soporte a traves de una molecula conectora mas larga, tambien conocida como prolongador. Los prolongadores son bien conocidos en este campo, y se utilizan comunmente para aumentar estericamente la distancia entre el ligando y el soporte. Los prolongadores a veces se denominan tentaculos o brazos flexibles, para una descripcion mas detallada de las posibles estructuras qmmicas, vease, por ejemplo el documento US 6.428.707. En resumen, el prolongador puede estar en forma de un polfmero tal como un homo- o un copolfmero. Los prolongadores polimericos hidrofilos pueden ser de origen sintetico, es decir, con un esqueleto sintetico, o de origen biologico, es decir, un biopolfmero con un esqueleto de origen natural. Los polfmeros sinteticos tfpicos son poli(alcoholes vimlicos), poliacril- y polimetacrilamidas, poli(eteres

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vimlicos) etc. Los biopoKmeros tipicos son polisacaridos, tales como almidon, celulosa, dextrano, agarosa.

El soporte se puede preparar a partir de un material organico o inorganico, y puede ser poroso o no poroso. En una realizacion, el soporte se prepara a partir de un polfmero nativo, tal como material carbohidratado entrecruzado, por ejemplo, agarosa, agar, celulosa, dextrano, quitosano, konjac, carragenano, gelan, alginato, pectina, almidon, etc. Los soportes polimerico nativos son preparados facilmente y entrecruzados opcionalmente de acuerdo con metodos convencionales, tales como gelificacion en suspension inversa (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). En una realizacion especialmente ventajosa, el soporte es un tipo de agarosa relativamente ngida pero porosa, que se prepara por medio de un metodo que mejora sus propiedades de flujo, vease, p.ej. el documento US 6.602.990 (Berg) o el documento SE 0402322-2 (Berg et al.). En una realizacion alternativa, el soporte se prepara a partir de un polfmero o copolfmero sinteticos, tales como polfmeros sinteticos entrecruzados, por ejemplo estireno o derivados de estireno, divinilbenceno, acrilamidas, esteres acrilato, esteres metacrilato, vinilesteres, vinilamidas, etc. Tales polfmeros sinteticos se preparan facilmente y se entrecruzan opcionalmente de acuerdo con metodos convencionales, vease, p. ej. "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)). Los soportes polimericos nativos o sinteticos tambien estan disponibles de fuentes comerciales, tales como GE Healthcare, Uppsala, Suecia, por ejemplo, en forma de partmulas porosas. En otra realizacion alternativa, el soporte se prepara a partir de un polfmero inorganico, tal como sflice. Los soportes porosos y no porosos inorganicos son bien conocidos en este campo y se preparan facilmente de acuerdo con metodos convencionales.

Los tamanos de partmula adecuados de la presente matriz de separacion pueden estar en el intervalo de diametro de 5-500 pm, tal como de 10-100 pm, p.ej., de 20-80 pm. En el caso de partmulas esencialmente esfericas, el tamano medio de partmula puede estar en el intervalo de 5-1000 pm, tal como de 10-500. En una realizacion espedfica, el tamano medio de partmula esta en el intervalo de 10-200 pm. El experto en este campo puede seleccionar facilmente el tamano de partmula y la porosidad adecuados en funcion del procedimiento que se vaya a utilizar. Por ejemplo, para un procedimiento a gran escala, por razones economicas, puede ser preferible un soporte mas poroso pero ngido para permitir el procesamiento de grandes volumenes, especialmente para la etapa de captura. En la cromatograffa, los parametros de procesamiento, tales como el tamano y la forma de la columna afectaran a la eleccion. En un procedimiento de lecho expandido, la matriz contiene comunmente cargas de alta densidad, preferiblemente materiales de carga de acero inoxidable. Para otros procedimientos otros criterios pueden afectar a la naturaleza de la matriz.

Por lo tanto, la presente invencion es una matriz de separacion que comprende los ligandos descritos anteriormente, acoplados a un soporte. Como entiende el experto en este campo, cada soporte comprendera comunmente una pluralidad de ligandos. En una realizacion espedfica, el soporte comprende un ligando como se describe anteriormente combinado con un segundo tipo de ligando, en donde el ligando de acuerdo con la invencion esta presente hasta al menos aproximadamente 30%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, mas preferiblemente al menos aproximadamente 70% y lo mas preferiblemente al menos aproximadamente 90% de la cantidad total de ligando. Tal matriz de separacion de ligando combinada puede ser disenada para un caso concreto, cuando un elemento de nuevas interacciones mejora sus propiedades de separacion. El segundo tipo de ligando puede comprender uno o mas grupos cargados, tal como un intercambiador de cationes utilizado para eluir compuestos por repulsion de cargas; grupos hidrofobos; grupos capaces de formar enlaces de hidrogeno; grupos de afinidad o similares.

En una primera realizacion, la matriz de acuerdo con la invencion esta en forma de partmulas, tales como partmulas de forma esencialmente esferica, alargada o irregular. En una realizacion espedfica, la matriz de separacion se seca, de manera que las partmulas secas que en el uso se sumergen en lfquido conservan su forma original. En una realizacion ilustrativa, tal matriz de separacion seca se compone de partmulas de agarosa secas. Sin embargo, la matriz de acuerdo con la invencion puede adoptar alternativamente cualquier otra forma utilizada convencionalmente en la separacion, tal como monolitos; filtros o membranas; capilares; chips; superficies; etc. En consecuencia, en una segunda realizacion, la matriz comprende una estructura membranosa, tal como una sola membrana, una pila de membranas o un filtro.

Un aspecto adicional de la presente invencion es el uso de la matriz de separacion descrita anteriormente. En una primera realizacion, la presente invencion utiliza una matriz de separacion como se ha descrito anteriormente en la purificacion de protemas. En una realizacion ventajosa del presente uso, la protema es un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo; o una protema de fusion que comprende un anticuerpo. En otra realizacion, la presente invencion utiliza una matriz de separacion como se describio anteriormente en la separacion de cualquier otro compuesto, por ejemplo, uno seleccionado del grupo que consiste en polipeptidos; acidos nucleicos, p.ej., ADN, ARN o sus oligonucleotidos, plasmidos; virus; priones; celulas, tales como celulas procariotas o eucariotas; lfpidos; carbohidratos; moleculas organicas, tales como moleculas organicas pequenas; dianas de medicamentos; moleculas marcadoras de diagnostico. El uso sera discutido en mas detalle a continuacion. En otra realizacion mas, la presente invencion utiliza una matriz de separacion como se describio anteriormente como soporte en cultivo celular, es decir, para inmovilizar celulas que crecen en las superficies. Como reconocera el experto en este campo, en la presente solicitud, el termino separacion se utiliza para la purificacion; el aislamiento; y la eliminacion de compuestos, pero tambien abarca la identificacion de un compuesto diana, por ejemplo para fines de diagnostico.

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Un tercer aspecto de la presente invencion es un metodo de separacion, en donde un compuesto deseado tal como un anticuerpo se separa de uno o mas de otros compuestos de una muestra Ifquida poniendo en contacto una fase movil que comprende dicha muestra lfquida con una matriz de separacion como se describio anteriormente. En una realizacion ventajosa, el presente metodo se lleva a cabo utilizando los principios de la cromatograffa lfquida, es decir, mediante el paso de una fase movil a traves de una columna de cromatograffa que comprende la matriz de separacion de acuerdo con la invencion. En otra realizacion alternativa, el presente metodo se lleva a cabo utilizando un procedimiento de cromatograffa discontinua, en donde se anade la matriz de separacion a un recipiente que comprende la muestra lfquida. En una realizacion espedfica, la matriz de separacion anadida en el modo discontinuo comprende partmulas secas, tales como partmulas de agarosa secas. En otra realizacion, el metodo se lleva a cabo utilizando los principios de la cromatograffa de lecho expandido, es decir, mediante la adicion de la fase movil a un lecho expandido, tal como un lecho fluidizado, de una matriz de separacion que esta en forma de partmulas esencialmente esfericas que comprenden carga de alta densidad.

En una primera realizacion del presente metodo, los compuestos no deseados se adsorben a la matriz de separacion mientras que los compuestos deseados, tales como los anticuerpos, permanecen en la fase movil sin ser adsorbidos. Como entiende el experto en este campo, la naturaleza e identidad de los compuestos adsorbidos dependeran del origen de la muestra lfquida. Los ejemplos de los compuestos adsorbidos en la realizacion en la que los anticuerpos deseados no son adsorbidos son celulas y restos celulares; protemas y peptidos; acidos nucleicos, tales como ADN y ARN; endotoxinas, virus, residuos de los medios de cultivo, etc. En una realizacion espedfica, la presente matriz de separacion se proporciona en una columna de cromatograffa y la fase movil se hace pasar a traves de dicha columna por gravedad y/o bombeo, recuperandose los anticuerpos en el flujo continuo de la columna. Por lo tanto, una ventaja de esta realizacion es que no requiere ninguna elucion del producto de anticuerpo de la columna. La evitacion de una etapa de elucion espedfica es atractiva desde un punto de vista del procedimiento, ya que un menor numero de etapas se traducira en un protocolo de purificacion mas rapido y por lo tanto reducira los costes del procedimiento. Ademas los anticuerpos son sensibles a ciertas condiciones que, p.ej, perjudicanan su patron de plegamiento; o los degradanan atacando sus enlaces peptfdicos. Por lo tanto, a pesar de que las condiciones de elucion para los intercambiadores anionicos en general no implican ningun producto qmmico extremo, el cambio de sal y/o pH puede afectar al anticuerpo sensible, variando el efecto de una especie a otra, dependiendo del pi, la distribucion de carga etc. En consecuencia, otra ventaja de esta realizacion es que se evita la adicion de un eluyente y la aplicacion de condiciones de elucion a los compuestos deseados. Para obtener las condiciones mas adecuadas para la adsorcion de compuestos, la muestra lfquida se combina con un tampon adecuado u otro lfquido para proporcionar una fase movil. La presente realizacion se ejecuta ventajosamente en condiciones convencionales para la cromatograffa de intercambio anionico, que comunmente implica la adsorcion a una concentracion relativamente baja de sal. Por lo tanto, en una realizacion del presente metodo, la conductividad de la fase movil esta en el intervalo de 0-25, tal como de 10-15 mS/cm. En una realizacion, el pH de la fase movil es de aproximadamente 5-6. Si se desea liberar posteriormente los compuestos adsorbidos, por ejemplo, para la reutilizacion de la matriz, la elucion se puede llevar a cabo a una concentracion de sal superior, p.ej. mediante el uso de un gradiente de sal creciente. Tambien o alternativamente se puede desplazar el valor de pH, p.ej., para que sea un gradiente de pH decreciente, para eluir los compuestos adsorbidos.

En una segunda y alternativa realizacion del presente metodo, los compuestos deseados se adsorben a la matriz como en la cromatograffa lfquida convencional. La matriz puede ser reutilizada a continuacion despues de la elucion selectiva del producto. La elucion se lleva a cabo facilmente haciendo pasar un tampon adecuado a traves de la columna. Si fuera necesario, se pueden aplicar una o mas etapas de lavado antes o entre cualquiera de tales pases. En una realizacion, las condiciones de funcionamiento de esta realizacion son como en el intercambio ionico convencional, es decir, adsorcion utilizando una fase movil que tiene una baja conductividad y elucion utilizando un tampon de alta conductividad, como se comento anteriormente. El experto en este campo puede ajustar facilmente las condiciones sometiendo a ensayo diferentes condiciones y analizar el compuesto o los compuestos adsorbidos y el flujo continuo. En una realizacion espedfica, los compuestos deseados son anticuerpos.

Eligiendo entre la primera y la segunda realizaciones anteriores, el experto en este campo puede adaptarse facilmente a las condiciones para adsorber un compuesto espedfico, de manera ventajosa mediante el control del pH y/o la conductividad. Por ejemplo, en la separacion de anticuerpos, diferentes clases de anticuerpos tienen diferentes cargas y patrones de distribucion de carga, que junto con el proposito de la separacion decidiran si es mas preferible adsorber los anticuerpos o dejarlos pasar por la columna sin ser adsorbidos.

Los anticuerpos separados de acuerdo con una realizacion de la presente invencion pueden proceder de cualquier fuente conocida, tal como celulas cultivadas en una superficie o de cultivo celular discontinuo o continuo en tanques o recipiente de fermentacion. Por lo tanto, en una realizacion, el lfquido es un sobrenadante obtenido de la fermentacion de celulas. Los ejemplos de los compuestos de los que necesitan ser separados los anticuerpos son en ese caso protemas, ADN, virus, endotoxinas, nutrientes, componentes de un medio de cultivo celular, tales como agentes antiespumantes y antibioticos, e impurezas relacionadas con el producto, tales como especies mal plegadas y agregados. La etapa de contacto entre la fase movil y la presente matriz de separacion, es decir, la etapa de adsorcion, puede estar precedida por una etapa de filtracion mecanica, centrifugacion y/o cromatograffa. Por ejemplo, si la muestra lfquida es un caldo de fermentacion, es ventajoso eliminar mecanicamente los desechos celulares, las celulas enteras y otros componentes relativamente grandes antes de la etapa de utilizacion de la presente matriz.

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En una realizacion, el presente metodo constituye la etapa de captura de un protocolo de purificacion. En una realizacion espedfica, la muestra Kquida es una carga bruta que se filtra antes del contacto con la matriz de cromatograffa de acuerdo con la invencion. En consecuencia, esta realizacion todavfa constituina una etapa de captura, a pesar de que la muestra lfquida ha sido previamente purificada por medios mecanicos. Como es bien sabido, las celulas anfitrionas que producen anticuerpos tambien comprenderan otras diversas protemas conocidas comunmente como protemas de la celula anfitriona (PCA). Tales PCA incluyen enzimas, tales como proteasas, y otras protemas producidas por las celulas anfitrionas. Por lo tanto, en una realizacion, se eliminan sustancialmente todas las protemas de la celula anfitriona de la muestra lfquida mediante el presente metodo, por ejemplo mediante adsorcion a la matriz de separacion.

En realizaciones alternativas, el presente metodo se utiliza como una segunda, tercera o incluso cuarta etapa de cromatograffa en un protocolo de limpieza, tal como una etapa de purificacion o pulido intermedia. Por lo tanto, en una realizacion, la fase movil aplicada a la presente matriz de separacion comprende un eluato que contiene anticuerpo de una matriz de separacion. En una realizacion, la muestra lfquida es un eluato de una matriz de cromatograffa de afinidad anterior. En una realizacion ventajosa, la matriz de separacion de la que se obtiene el eluato comprende uno o mas ligandos de la protema de union a Fc, tales como ligandos de Protema A. El termino ligandos de Protema A incluye en este contexto protema A nativa asf como recombinante, o fragmentos funcionales de la misma. En este contexto, el termino fragmento "funcional" significa un fragmento que conserva las propiedades de union originales de la protema. Tales matrices de afinidad estan disponibles comercialmente, tal como MabSelect™ de GE Healthcare. En consecuencia, en esta realizacion, los compuestos extrafdos, preferiblemente adsorbidos pueden ser uno o mas seleccionados del grupo que consiste en Protema A liberada; complejos formados entre Protema A y anticuerpos, tales como complejos de Protema A-MAb, cuyos complejos pueden comprender varios anticuerpos por molecula de Protema A, tal como 2-4 anticuerpos formando complejo con una molecula de Protema A; y agregados de Protema A liberada o anticuerpos. Como comprendera el experto en este campo, dependiendo de las condiciones espedficas utilizadas en la etapa anterior, tales como cromatograffa de afinidad, el eluato puede necesitar acondicionamiento mediante adiciones o ajuste adecuados. Por lo tanto, el eluato se combina con un tampon o lfquido adecuado para proporcionar una fase movil.

El presente metodo es util para separar cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal, tal como anticuerpos procedentes de anfitriones marnfferos, por ejemplo, ratones, roedores, primates y seres humanos, o anticuerpos procedentes de hibridomas. En una realizacion, los anticuerpos separados son anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos pueden ser de cualquier clase, es decir, seleccionados del grupo que consiste en IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. En una realizacion, los anticuerpos son anticuerpos capaces de unirse a la protema A, o fragmentos de anticuerpos que contienen Fc o protemas de fusion. En una realizacion espedfica, los anticuerpos son inmunoglobulina G (IgG), tales como IgG1. En una realizacion, el presente metodo se utiliza para purificar anticuerpos que tienen un pi en el intervalo de 6-9, tal como en el intervalo de 7-8. En una realizacion espedfica, el pi de los anticuerpos purificados es de aproximadamente 9. En el presente contexto, se debe entender que el termino "anticuerpos" tambien incluye fragmentos de anticuerpo y cualquier protema de fusion que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Asf, la presente invencion tambien abarca la separacion de fragmentos de uno cualquiera de los anticuerpos anteriormente mencionados, asf como protemas de fusion que comprenden tales anticuerpos. En una realizacion, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. En una realizacion espedfica, los anticuerpos son anticuerpos humanizados.

Como se desprende de lo anterior, en el presente metodo, se recupera una fraccion sustancialmente pura de anticuerpos no adsorbidos. En este contexto, se entiende que el termino "sustancialmente puro" significa que se han eliminado sustancialmente todos los compuestos que no son anticuerpos. Mas ventajosamente, se retira en la presente matriz de separacion al menos aproximadamente 80%, tal como al menos aproximadamente 95%, es decir, en el intervalo de 95 a 100%, tal como al menos aproximadamente 98%, es decir, en el intervalo de 98 a 100% y preferiblemente al menos aproximadamente 99%, es decir, en el intervalo de 99-100%, de la cantidad total de contaminantes. Sin embargo, como el experto en este campo apreciara, la pureza obtenida dependera de la concentracion de anticuerpo en la muestra lfquida aplicada a la matriz de separacion, asf como de otras condiciones utilizadas. Por lo tanto, en una realizacion, los anticuerpos separados de acuerdo con el presente metodo son anticuerpos de grado terapeutico. De este modo, los anticuerpos purificados de acuerdo con la invencion son utiles en la investigacion y tambien para la preparacion de productos farmaceuticos de anticuerpos, tales como farmacos de MAb. Un uso alternativo de los anticuerpos purificados es para uso diagnostico. Adicionalmente, los anticuerpos purificados son tambien utiles en productos alimenticios tales como aditivos de alimentos para seres humanos. Por ejemplo, los anticuerpos de especie bovina purificados de acuerdo con la presente invencion son utiles en productos alimenticios.

En una realizacion espedfica del presente metodo, la presente matriz de separacion se proporciona como una columna de cromatograffa desechable o un filtro desechable. Una ventaja de la utilizacion de productos desechables en un metodo para la purificacion de compuestos terapeuticos tales como anticuerpos es que permite evitar la contaminacion cruzada entre dos procedimientos diferentes. Por lo tanto, en una realizacion, la presente matriz de separacion se proporciona como una columna de cromatograffa o filtro esteriles. En una realizacion, el presente metodo se lleva a cabo como un procedimiento discontinuo, en el que se anade una matriz de separacion desechable a un recipiente que comprende el lfquido del que se van a recuperar los anticuerpos. Se permite un tiempo adecuado para que los compuestos de interes se fijen a la matriz, despues de lo cual la fase lfquida que

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comprende los anticuerpos se retira del recipiente. La matriz utilizada puede desecharse a continuacion, sin liberar los compuestos adsorbidos, lo que de nuevo puede ser ventajoso desde un punto de vista de seguridad ya que no se necesita manipular nuevamente compuestos tales como endotoxinas y/o ciertas protemas de la celula anfitriona. En una realizacion alternativa, la presente matriz se proporciona como un producto desechable en una columna de cromatograffa que se utiliza en un modo en el que los anticuerpos son adsorbidos. En una realizacion ventajosa, la columna y la matriz han sido esterilizadas, lo que permite al usuario purificar el producto de anticuerpo en condiciones asepticas o incluso esteriles.

Tambien se hace referencia a un kit para la purificacion de anticuerpos a partir de uno o mas de otros componentes en un lfquido, cuyo kit comprende en compartimentos separados una columna de cromatograffa empaquetada con una matriz de separacion como se describio anteriormente; uno o mas tampones; e instrucciones por escrito. La matriz de separacion puede ser la que se ha descrito anteriormente. Dichas instrucciones describen ventajosamente un metodo como se ha definido anteriormente en detalle.

Descripcion detallada de los dibujos

La Figura 1 muestra el ligando prototipo N-bencil-N-metil etanolamina inmovilizado a traves del atomo de nitrogeno en un soporte en forma de una esfera. El ligando unido se muestra a la izquierda con el conector dibujado esquematicamente; y a la derecha con un conector hidrofflo ilustrativo. En la parte experimental, el ligando prototipo se acoplo a la matriz de agarosa al 6% Sepharose™ 6 FF (GE Healthcare, Uppsala, Suecia).

La Figura 2 presenta un cromatograma de muestra que contiene 50 mg de Mab1 aplicado a matrices de separacion que comprenden ligandos de N-bencil-N-metil etanolamina inmovilizados sobre Sepharose™ 6 FF (901035A); N,N- dimetilbencilamina (ejemplo de referencia) inmovilizada sobre Sepharose 6 FF; y Q Sepharose™ FF en Bis-Tris 25 mM, NaCl 100 mM (~ 12 mS/cm), pH 6,5. La elucion se realizo con Bis-Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 6,5.

Las Figuras 3 a) y b) muestran los resultados de la cromatograffa llevada a cabo en prototipos con mAbl-rProtema

A. El tampon A fue Bis-Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0. La conductividad fue de aproximadamente 7 mS/cm. El tampon B, acetato de sodio 0,5 M, pH 4,0, se utilizo para la elucion. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min (150 cm/h). La muestra fue de 10 mg de mAb1, 0,10 mg de rPrA a una concentracion de mAb1 de 4 mg/ml y rProtema A al 1% (p/p). 3a) ref. Q Sepharose™ FF; y b) N-bencil-N-metiletanolamina, 146 pmoles/ml (901035A).

Las Figuras 4 a)-c) muestran los resultados de la cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) analttica en la muestra con MAb 1, rPrA al 1% y las fracciones de flujo continuo y de eluato agrupadas de las rondas cromatograficas en la figura 3. La curva de color azul son las fracciones de flujo continuo (FT) y el color rojo es el eluato. Mas espedficamente, la Figura 4a) presenta una muestra de mAb1 de 4 mg/ml, rPrA 0,04 mg/ml que proporciona 1% (p/p); 4b) muestra FT y el eluato de la fig. 3a) Q Sepharose™ FF; y 4c) muestra FT y eluato de la fig. 3b) N-bencil-N-metiletanolamina, 146 pmoles/ml (901035A).

Parte experimental

Los presentes ejemplos se proporcionan solo a efectos ilustrativos, y no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la invencion como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: Preparacion de la matriz de separacion de acuerdo con la invencion

Preparacion de BMEA Sepharose Fast Flow

Una realizacion del metodo de preparacion de una matriz de separacion de acuerdo con la invencion se muestra a continuacion, a partir de un gel de agarosa entrecruzado (Sepharose™ 6 Fast Flow, GE Healthcare, Uppsala, Suecia).

A. Introduccion de grupo alilo en la matriz

Se activo Sepharose 6 Fast Flow con alil glicidil eter de la siguiente manera: se secaron mediante succion 100 ml de Sepharose 6 Fast Flow, se mezclaron con 0,3 g de NaBH4, 12 g de Na2SO4 y 35 ml de solucion acuosa al 50% de NaOH. La mezcla se agito durante 1 hora a 50°C. Despues de la adicion de 100 ml de alil glicidil eter la suspension se dejo a 50°C con agitacion vigorosa durante 16 horas adicionales. Despues de la filtracion de la mezcla, el gel se lavo sucesivamente, con 500 ml de agua destilada, 500 ml etanol, 200 ml de agua destilada, 200 ml de acido acetico 0,2 M, y 500 ml de agua destilada.

La titulacion proporciono un grado de sustitucion de 0,22 mmoles de alilo/ml de gel.

B. Activacion de alil Sepharose 6 Fast Flow a traves de bromacion

Se anadio bromo a una suspension agitada de 50 ml de Sepharose 6 Fast Flow activada con alilo (0,22 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado), 1 g de acetato de sodio y 15 ml de agua destilada, hasta que se obtuvo un color amarillo persistente. A continuacion se anadio formiato de sodio hasta que la suspension se decoloro completamente. La mezcla de reaccion se filtro y el gel se lavo con 500 ml de agua destilada. El gel activado se

transfirio directamente a un recipiente de reaccion y se hizo reaccionar adicionalmente con N-bencil-N- metiletanolamina.

C. Introduccion de grupos BMEA (N-bencil-N-metiletanolamina) en la matriz activada

Los grupos amina se introdujeron en la matriz directamente a traves del atomo de nitrogeno de los grupos amina. En 5 un procedimiento tipico, el acoplamiento a la matriz se realizo a traves de bromacion del grupo alilo y sustitucion nucleofflica en condiciones alcalinas. Se transfirieron 25 ml de gel activado con bromo (0,22 mmoles de grupos alilo/ml de gel drenado) a un vial de reaccion que contema una solucion de N-bencil-N-metiletanolamina (16,0 ml). Se anadieron 5 ml de agua y el pH de la solucion de reaccion se ajusto a 12,0 con una solucion de hidroxido de sodio. La reaccion se dejo durante 16 horas agitando a 50°C. Despues de la filtracion de la mezcla de reaccion el gel 10 se lavo sucesivamente con 3 x 10 ml de agua destilada, 3 x 10 ml de HCl acuoso 0,5 y finalmente 3 x 10 ml de agua destilada. El gel BMEA Sepharose Fast Flow se obtuvo con un grado de sustitucion de 0,15 mmoles de aminas/ml de gel.

Ejemplo 2: Purificacion de los anticuerpos en el flujo continuo Ejemplo 2A) Disposicion

15 En condiciones en las que no se produda union, las muestras que conteman aproximadamente 50 mg de mAb1 se cargaron en el prototipo 901035 A (N-bencil-N-metil etanolamina) a aproximadamente 5 y 12 mS/cm. Las fracciones de flujo continuo (FT) se recogieron a los 5, 10 y 15 volumenes de la columna (CV). Las fracciones del pico de elucion se reunieron. Las fracciones de FT se analizaron para determinar el contenido de PCA y Protema A.

Para confirmar que el rendimiento cromatografico no era unico para un mAb concreto, los ciclos cromatograficos se 20 repitieron utilizando una muestra que contema mAb2 a pH 6,0 y aproximadamente 12 mS/cm. El rendimiento del prototipo se evaluo primero con SEC analftica. Las fracciones seleccionadas se analizaron para determinar el contenido de PCA y protema A. Despues del escrutinio las fracciones con fracciones de SEC seleccionadas se enviaron para el analisis de PCAy Protema A.

Para someter a ensayo de aclaramiento de rProtema A del prototipo, el MAb1 se enriquecio con protema A 25 recombinante (rPrA) al 1% (p/p). Al prototipo se le inyecto un volumen de muestra correspondiente a 10 mg de MAb1, rProtema A al 1% a pH 6,0 y una conductividad de aproximadamente 7 mS/cm. Las fracciones de flujo continuo y de eluato se agruparon por separado y se analizaron mediante SEC.

Materiales/unidades investigadas

Las columnas y los geles se obtuvieron de GE Healthcare, Uppsala, Suecia

HiPrep™ 26/10 Desalinizacion

num. cat. 17-5087-01 CV = 53,09 ml

Tricorn™ 5/50

num. cat. 18-1163-09 CV = 1 ml

HR 5/5™

num. cat. 18-0338-01 CV = 1 ml

Superdex™ 200 10/300 GL,

num. cat. 17-5175-01 CV = 23,56 ml

30 Aparatos

sistemas de cromatograffa:

AKTAexplorer™ 10

espectrofotometro

Spectra MAX plus

Productos qmmicos

Todos los productos qmmicos utilizados fueron de grado analftico. El agua fue filtrada mediante MilliQ.

Medios de cromatograffa

35 Q Sepharose™ Fast Flow (FF) (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Los ligandos de las matrices de separacion son prototipos como se describe en la Tabla 1 a continuacion.

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Tabla 1: Ligando

Ref. prototipo

Ligando Capacidad Cl- (pmoles/ml)

901035A

N-bencil-N-metil etanolamina 146

Muestras

Se utilizaron dos anticuerpos IgG humanizados diferentes, de la subclase 1, indicados como MAb 1 y Mab 2, con un coeficiente de extincion de 1,46 y 1,50 respectivamente. Ambos anticuerpos se expresaron en cultivos CHO y posteriormente se purificaron utilizando cromatograffa de afinidad con Protema A convencional antes de los presentes experimentos.

El cambio de tampon se realizo en una columna HiPrep™ de desalinizacion (GE Healthcare, Uppsala, Suecia), equilibrada con el tampon de interes, mediante la inyeccion de un volumen apropiado (5-15 ml) con un Superloop™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La velocidad de flujo fue de 5 ml/min y se recogieron fracciones de 5 ml. Las fracciones que conteman el pico eluido se agruparon y se determino la absorbancia a 280 nm por duplicado, con el fin de calcular la concentracion de acuerdo con la ecuacion 1:

A280 = eCl (Ecn. 1)

en donde A280 es la absorbancia a 280 nm.

e (ml*mg"1*cm"1) es el coeficiente de extincion para una protema concreta.

C (mg/ml) es la concentracion de la protema.

l (Cm) es la longitud del recorrido.

La cromatograffa de exclusion por tamano (SEC) se llevo a cabo en una columna Superdex™ 200 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. El tampon fue PBS (solucion salina tamponada con fosfato); fosfato 10 mM, NaCl 0,137 M, KCl 2,7 mM, pH 7,4 preparado a partir de comprimidos (Sigma, P-4417).

Metodo

Equilibrado

2/0,1 CV; 2 CV utilizacion por primera vez; 0,1 CV entre las rondas

inyeccion de la muestra

50 Ml

Elucion isocratica

1,5 CV

Cromatograffa en prototipos con mAb

El tampon A fue Bis-Tris 25 mM, pH 6,0 o 6,5. Dependiendo de la conductividad deseada, aproximadamente 5 o 12 mS/cm, se incluyo NaCl 35 o 100 mM. El tampon de elucion (tampon B) fue Bis-Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 6,5. La velocidad de flujo de 0,5 ml/min (150 cm/h).

Metodo:

Equilibrado

5 CV tampon A

Inyeccion de la muestra

5-25 ml cont de muestra. 20 o 50 mg de mAb

Lavado

5 CV tampon A

Elucion en Gradiente

10 CV tampon B al 0-100%

Elucion

10 CV tampon B al 100%

Regeneracion

5 CV tampon A

Cromatograffa en prototipos con MAb-rProtema A

El tampon A fue Bis-Tris 25 mM, pH 6,0. La conductividad fue de aproximadamente 7 mS/cm mediante la adicion de NaCI 50 mM, el tampon B fue acetato de sodio 0,5 M, pH 4,0. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min (150 cm/h). La 5 concentracion de la muestra fue MAb 4 mg/ml rPrA 1 a 0,04 mg/ml proporcionando 1% (p/p).

Metodo:

Equilibrado

5 CV tampon A

Inyeccion de la muestra

2,5 ml 10 mg MAb, rPrA al 1%

Lavado

5 CV tampon A

Elucion en gradiente

10 CV tampon B al 0-100%

Elucion

10 CV tampon B al 100%

Regeneracion

5 CV tampon A

CIP (limpieza in situ)

Despues de cada serie cromatografica, el prototipo y la matriz de referencia Q Sepharose™ FF se sometieron al 10 siguiente procedimiento CIP;

Isopropanol al 30%

5 CV (Volumenes de Columna)

H2O

5 CV

NaOH 1,0 M

4 CV (incl. pausa de 15 min.)

H2O

5 CV

tampon A

5 CV

H2O

5 CV

EtOH al 20%

5 CV

Analisis de Protema A

Las fracciones seleccionadas se mezclaron con diluyente de la muestra SPA en proporciones de 800 pl de diluyente de la muestra SPA + 200 microlitros de muestra. Despues de mezclar, las fracciones se calentaron en un bloque de 15 calentamiento a 99°C durante 10 minutos, a cntinuacion se mezclaron de nuevo. Las muestras se analizaron a continuacion para determinar la protema A recombinante.

Analisis de protemas de las celulas anfitrionas (PCA)

Las muestras (min. 600 pl) se analizaron para determinar el contenido de PCA. El lfmite inferior de deteccion es de 10 ng/ml.

20 Ejemplo 2B) Muestra que contiene MAb1 purificada en ligandos prototipo de N-bencil-N-metiletanolamina (901035A)

La muestra que contema 50 mg de MAb1 se aplico a N-bencil-N-metil etanolamina inmovilizada sobre Sepharose™ 6 FF (901035a) preparada como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior y la matriz de referencia Q Sepharose™ FF en Bis-Tris 25 mM, NaCl 100 mM (~ 12 mS/cm), pH 6,5. La elucion se llevo a cabo con Bis-Tris 25 mM, NaCl 0,5 M, pH 6,5.

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Los cromatogramas del ejemplo 2 se muestran en la Figura 2, que muestra el prototipo de Sepharose™ 6 FF (901035A) con N-bencil-N-metil etanolamina en comparacion con Q Sepharose™ FF. Las fracciones de flujo continuo (FT) seleccionadas para el analisis se indican con flechas. Los resultados para el aclaramiento de PCA y Protema A que se muestran en las tablas 2 y 3 a continuacion revelan que el prototipo es superior a Q Sepharose™ FF a este respecto.

Tabla 2: Resultados de los analisis de PCA

Columna

pH Inicio (ng/ml) FT1 (ng/ml) FT2 (ng/ml) FT3 (ng/ml)

Q Sepharose™ FF (ref)

6,5 890 160 200 180

N-bencil-N-metiletanolamina, 146 pmoles/ml (901035A)

6,5 890 10 20 35

Tabla 3: Resultados del analisis PRA

Columna

pH Inicio (ng/ml) FT1 (ng/ml) FT2 (ng/ml) FT3 (ng/ml)

Q Sepharose ™ FF (ref)

6,5 0,40 0,69 0,46 0,31

N-bencil-N-metiletanolamina, 146 pmoles/ml (901035A)

6,5 0,40 0 0 0

Ejemplo 3:

Purificacion de MAb1 en el flujo continuo de una muestra que comprende MAb1 y protema A recombinante (rPrA) en el ligando prototipo de N-bencil-N-metiletanolamina

En este ejemplo, se llevo a cabo la cromatograffa sobre prototipos con una muestra que contema mAb1-rProtema A. El tampon A fue Bis-Tris 25 mM, NaCl 50 mM, pH 6,0. La conductividad fue de aproximadamente 7 mS/cm. El tampon B fue acetato de sodio 0,5 M, pH 4,0. La velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min (150 cm/h). La muestra fue de 10 mg mAbl, 0,10 mg de rPrA a una concentracion de mAbl de 4 mg/ml y rProtema A al 1% (p/p). Los resultados se muestran en la Figura 3.

Por ultimo, se realizaron SEC analtticas sobre la muestra con mAb1, rPrA al 1% y fracciones del flujo continuo y del eluato reunidas de las rondas cromatograficas de la figura 4. Los resultados se muestran en la Figura 4. En la Figura 4a, el pico sombreado es el complejo de MAb1-Protema A. La curva de color azul son las fracciones de flujo continuo (FT) y la de color rojo es el eluato.

Ejemplo 4: Modo de adsorcion

4A) Disposicion

Para someter a ensayo la selectividad de BMEA Sepharose Fast Flow (BMEA; N-bencil-N-metiletanolamina) se sometio a ensayo en el modo de adsorcion el tiempo de retencion de la IgG humana y ocho protemas diferentes. Los resultados se compararon con un intercambiador de aniones Q Sepharose Fast Flow disponible en el mercado. El principio del metodo de ensayo fue que las protemas se inyectaron en una columna HR5/5 (que contema los ligandos inmovilizados sobre BMEA Sepharose Fast Flow™) equilibrada con el tampon A (que contema piperazina como componente del tampon). Se utilizo un gradiente de sal para la elucion de las protemas (vease el metodo a continuacion).

Materiales/Unidades investigadas

Las columnas y Q Sepharose Fast Flow se obtuvieron de GE Healthcare, Uppsala, Suecia.

HR de 5/5™: num. de cat 18-0338-01

Volumen de la Columna (CV = 1 ml)

Aparato

Sistemas de cromatograffa: AKTAexplorer™ 10

Productos qmmicos y muestras

La protemas, ovoalbumina, p-lactoglobulina, albumina de suero bovino, a-lactalbumina, mioglobina, lactoferrina, ribonucleasa A y citocromo C se adquirieron de Sigma y la IgG humana (Gammanorm) se adquirio de Octapharma. Las protemas se disolvieron en los tampones A a una concentracion de 1-10 mg/ml. Q Sepharose Fast Flow se 5 obtuvo de GE Healthcare, Uppsala Suecia. Todos los productos qmmicos utilizados fueron de grado analttico y el agua utilizada se filtro mediante MilliQ.

Cromatograffa

Las columnas se equilibraron con el tampon A a una velocidad de flujo de 0,6 ml/min antes de aplicar 100 pl de la solucion de muestra. Solo se analizo una protema cada vez. Las protemas se eluyeron mediante un gradiente lineal 10 de tampon A a tampon B con un volumen de gradiente de 21 volumenes de columna (vease el metodo de mas abajo). El tampon A fue piperazina 25 mM, pH 10,0 y el tampon B fue piperazina 25 mM, NaCl 1,0 M, pH 10,0. Se detecto la absorbancia a 280 nm durante todas las rondas.

Metodo:

Equilibrado:

5 CV de tampon A

Inyeccion de la muestra:

100 pl (aprox 0,2 mg de protema)

Gradiente:

21 CV de tampon B al 100%

Equilibrado despues del gradiente:

5 CV de tampon A

15 Resultados

Para documentar si el ligando BMEA interactua selectivamente con las inmunoglobulinas, se aplico IgG humana a una columna de 1 ml (HR 5/5) cargada con el nuevo medio. Ademas, tambien se aplicaron las protemas ovoalbumina, p-lactoglobulina, albumina de suero bovino, a-lactalbumina, mioglobina, lactoferrina, ribonucleasa A y citocromo C. Los resultados se compararon con los tiempos de retencion de las protemas observadas para Q

20 Sepharose Fast Flow. Q Sepharose Fast Flow es un fuerte intercambiador de aniones y se utiliza como intercambiador de aniones de referencia, ya que tiene la misma matriz de soporte (material de soporte, tamano de esfera, tamanos de poro, volumen de poro, procedimiento de carga, etc.) y tiene esencialmente el mismo grado de sustitucion (medido como capacidad de intercambio ionico). Como se desprende de la Tabla 1 BMEA Sepharose Fast Flow retardo todas las protemas investigadas con mas fuerza en comparacion con Q Sepharose Fast Flow.

25 Ademas, IgG fue la protema que proporciono el tiempo de retencion mas largo con BMEA Sepharose Fast Flow (Tabla 1). Esto refleja una union mucho mas fuerte al medio BMEA que a Q Sepharose Fast Flow. En comparacion con Q Sepharose Fast Flow el tiempo de retencion de IgG aumento 27,3 min cuando se utilizo BMEA Sepharose Fast Flow (Tabla 1). Estos resultados indican claramente que BMEA Sepharose Fast Flow se puede utilizar para capturar y eluir IgG de una manera selectiva.

30 Tabla 1. Tiempo de retencion (tr) de diferentes protemas en Q Sepharose Fast Flowy BMEA Sepharose Fast Flow.

Protema

Peso molecular pI tr en Q Sepharose Fast Flow (min) tr en BMEA Sepharose Fast Flow (min) Atr (trBMEA - trQ)

Citocromo C

12400 9,6 15,3 16,8 1,5

Ribonucleasa A

13700 9,4 15,8 22,6 6,8

Lactoferrina

75000 7,9 15,1 19,4 4,3

Mioglobina

17600 7,2 16,1 20,5 4,4

IgG humana

160000 16,5 43,8 27,3

a-Lactalbumina

14400 5,2 24,6 40,3 15,7

Protema

Peso molecular PI tr en Q Sepharose Fast Flow (min) tr en BMEA Sepharose Fast Flow (min) Atr (trBMEA - trQ)

Albumina de suero bovino

69000 5,1 25,3 32,6 7,3

B-Lactoglobulina

35000 5,1 25,1 37,1 12,0

B-Lactoglobulina

35000 5,1 30,0X 37,1 7,1

Ovoalbumina

43500 4,7 21,8 30,8 9,0

na = no analizado,x Se observaron dos picos

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Una matriz de separacion que comprende una pluralidad de ligandos de cromatograffa definidos por la siguiente formula

   R1-R2-N(Ra)-R4-R5

   acoplados a un soporte a traves del grupo amina, en donde R1 es un grupo fenilo no sustituido;

   R2 es -CH2-;

   R3 es -CH3;

   R4 es -CH2-CH2-CH2- o -CH2-CH2-; y R5 es OH.
2. 2. Una matriz de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el soporte comprende partmulas, tales como partmulas esfericas.
3. 3. Una matriz de separacion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el soporte comprende una estructura membranosa.
4. 4. Un metodo de preparacion de una matriz de separacion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, cuyo metodo comprende inmovilizar una pluralidad de ligandos en un soporte.
5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4 en donde el soporte es poroso.
6. 6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en donde el soporte se prepara a partir de un material organico.
7. 7. Un metodo de separacion de uno o mas anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o protemas de fusion que comprenden un anticuerpo de uno o mas de otros compuestos en una muestra lfquida, en donde se pone en contacto una fase movil que comprende dichos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o protemas de fusion que comprenden un anticuerpo y el compuesto o los compuestos con una matriz de separacion de acuerdo con la reivindicacion 1.
8. 8. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde la matriz de separacion se proporciona en una columna de cromatograffa, la fase movil se hace pasar a traves de dicha columna por gravedad y/o bombeo, y los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o protemas de fusion que comprenden un anticuerpo se recuperan en el flujo continuo de la columna.
9. 9. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en donde la muestra lfquida comprende un sobrenadante obtenido a partir de la fermentacion de celulas.
10. 10. Un metodo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el contacto con la matriz de separacion es precedido por una etapa de filtracion mecanica y/o cromatograffa.
11. 11. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en donde la muestra lfquida comprende una carga bruta.