BRPI0518207B1

BRPI0518207B1 - Método de separação de um ou mais anticorpos de um ou mais outros compostos em uma amostra líquida

Info

Publication number: BRPI0518207B1
Application number: BRPI0518207-7A
Authority: BR
Inventors: Carina Engstrand; Annika Forss; Gunnar Glad; Bo-Lennart Johansson; Hans J. Johansson; Jean-Luc Maloisel
Original assignee: Cytiva Bioprocess R&D Ab
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2023-05-16
Also published as: US7867784B2; WO2006043896A1; AU2005296351A1; RU2010110437A; US8895710B2; CA2582113A1; JP2008518885A; KR20070067159A; RU2007112991A; KR101243425B1; EP1807205A1; ES2612572T3; BRPI0518216B1; WO2006043895A1; JP4831436B2; US20180154281A1; US20070244307A1; US20150073128A1; EP1827691B1; EP1807205B1

Abstract

MÉTODO DE SEPARAÇÃO DE UM OU MAIS ANTICORPOS DE UM OU MAIS OUTROS COMPOSTOS EM UMA AMOSTRA LÍQUIDA, KITS PARA A PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS DE UM OU MAIS OUTROS COMPONENTES EM UM LÍQUIDO, E PARA A CAPTURA DE ANTICORPOS DE UM OU MAIS OUTROS COMPONENTES EM UM LÍQUIDO, COLUNA DE CROMATOGRAFIA, E, FILTRO DESCARTÁVEL PARA A PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS. A presente invenção refere-se a um método de separar anticorpos de outro(s) composto(s) em uma amostra líquida, sendo que uma fase móvel compreendendo referida amostra é contactada com uma matriz de separação multimodal para adsorver compostos indesejados, enquanto que os anticorpos permanecem livres no líquido, sendo que a matriz de separação multimodal compreende primeiros grupos, que são capazes de interagir com sítios carregados negativamente dos compostos-alvo, e segundos grupos, que são capazes de pelo menos uma interação diferente de interação carga-carga com referidos compostos-alvo. A invenção refere-se também a uma coluna de cromatografia recheada com a matriz de separação multimodal descrita acima e um filtro apresentando referidos grupos multimodais adsorvidos em sua superfície.

Description

Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a um método de purificação de anticorpos. O método pode ser usado, por exemplo, em alimentação bruta, ou como uma etapa subseqüente à cromatografia de afinidade para remover contaminantes remanescentes e substâncias que vazaram da resina de afinidade. A presente invenção também compreende um kit para a purificação de anticorpos.

Anterioridades

[002] O sistema imunológico constitui-se de muitos tipos de células interdependentes que protegem coletivamente o corpo de infecções bacterianas, parasíticas, fúngicas, virais, e do crescimento de células de tumor. Os guardiãos do sistema imunológico são os macrófagos que percorrem continuamente o fluxo sangüíneo de seu hospedeiro. Quando expostos a infecção ou imunização, macrófagos respondem a invasores engolfando aqueles marcados com moléculas estranhas conhecidas como antígenos. Este evento, mediado por células T auxiliares, impõe uma complicada cadeia de respostas que resultam na estimulação de células B. Estas células B, por sua vez, produzem proteínas denominadas anticorpos, que se ligam ao invasor estranho. O evento de ligação entre anticorpo e antígeno marca o invasor estranho para destruição via fagocitose ou ativação do sistema de complemento. Existe uma quantidade de diferente classes de anticorpos, também conhecidos como imunoglobulinas, como IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Eles diferem não só quanto a seus papéis fisiológicos, mas também quanto a suas estruturas. De um ponto de vista estrutural, anticorpos de IgG foram estudados extensivamente, talvez devido ao papel dominante que eles desempenham em uma resposta imunológica madura. Anticorpos policlonais são produzidos de acordo com métodos convencionais por meio de imunização de um animal com o antígeno apropriado. Em resposta, o animal produzirá anticorpos que são policlonais. No entanto, para muitos fins, deseja-se possui um único clone de um determinado anticorpo, conhecidos como anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais (MAbs) são produzidos por meio de células híbridas ou fundidas constituídas de uma fusão entre uma célula B normal, que produz apenas um único anticorpo, com uma célula de tumor de mieloma anormal. O híbrido resultante, conhecido como hibridoma, é usado hodiernamente em métodos convencionais para a produção de anticorpos.

[003] A atividade biológica apresentada pelas imunoglobulinas é explorada hoje em dia numa gama de diversas aplicações no setor do diagnóstico humano e veterinário, de tratamento de saúde e terapêutico. Efetivamente, nos últimos poucos anos, anticorpos monoclonais e construções de anticorpos recombinantes tornaram-se a maior classe de proteínas correntemente investigadas em ensaios clínicos e recebendo aprovação do FDA como terapêuticos e diagnósticos. De forma complementar a sistemas de expressão e estratégias de produção, são necessários protocolos de purificação eficientes para se obter anticorpos altamente puros de uma maneira simples e econômica.

[004] Métodos tradicionais para o isolamento de imunoglobulinas baseiam-se em precipitação reversível seletiva da fração de proteína compreendendo as imunoglobulinas enquanto deixam outros grupos de proteínas em solução. Agentes de precipitação típicos são etanol, polietileno glicol, sais liotrópicos, como sulfato de amônio e fosfato de potássio, e ácido caprílico. Tipicamente, estes métodos de precipitação proporcionam produtos muito impuros ao mesmo tempo que são demorados e trabalhosos de produzir. Adicionalmente, a adição do agente precipitador à matéria-prima torna difícil usar o sobrenadante para outros fins e cria um problema de eliminação, o que é particularmente relevante quando se fala de purificação em grande escala de imunoglobulinas.

[005] Um método alternativo para o isolamento de imunoglobulinas é cromatografia, que compreende uma família de métodos de separação estreitamente relacionados. A característica que distingue a cromatografia da maior parte dos outros métodos de separação física e química é que se contacta duas fases mutuamente miscíveis, sendo que uma fase é estacionária e a outra é miscível. A mistura de amostra, introduzida na fase móvel, é submetida a uma série de interações com as fases estacionária e móvel como é realizada por meio do sistema pela fase móvel. Interações exploram diferenças nas propriedades físicas ou químicas dos componentes na amostra. Estas diferenças determinam a taxa de migração dos componentes individuais sob a influência de uma fase móvel que se move através de uma coluna contendo a fase estacionária. Componentes separados emergem na ordem de interação crescente com a fase estacionária. O componente mais retardado elui primeiro, o material mais fortemente retido elui por último. Separação é obtida quando um componente é retardado suficientemente para prevenir superposição com a zona de um soluto adjacente como componentes de amostra eluem da coluna. Realiza-se continuamente esforços para projetar a fase estacionária ótima para cada finalidade de separação específica. Comumente, uma fase estacionária do tipo referido constitui-se de uma suporte ou matriz de base a que um ligante compreendendo grupos de ligação, i.e. funcionais, ligou-se. Faz-se referência comumente a cada tipo de cromatografia com base no princípio de interação que utiliza, como cromatografia de troca de íon, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de afinidade.

[006] Cromatografia de troca de íon é freqüentemente usada em protocolos para o isolamento de imunoglobulinas. Em uma cromatografia de troca de íon, cadeias laterais de aminoácidos carregados negativamente da imunoglobulina interagirão com ligantes carregados positivamente de uma matriz de cromatografia. Por outro lado, na cromatografia de troca de cátion, cadeias laterais de aminoácidos carregadas positivamente da imunoglobulina interagirão com ligantes carregados negativamente de uma matriz de cromatografia.

[007] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) é outro método descrito e usado em protocolos para o isolamento de imunoglobulinas. Se o objeto for um produto de imunoglobulina altamente pura, comumente recomenda-se combinar HIC com uma ou mais etapas adicionais. Na HIC, visando tornar a imunoglobulina eficientemente com a matriz de HIC, torna-se necessária a adição de sais liotrópicos à fase móvel. A imunoglobulina ligada é liberada subseqüentemente da matriz por meio de redução da concentração de sal liotrópico. Assim, a desvantagem deste procedimento é a necessidade de adicionar sal liotrópico à matéria-prima, como isto pode causar problemas um custo conseqüentemente incrementado para o usuário em grande escala. Por exemplo, no caso de matérias-primas, como soro, plasma, e gema de ovo, a adição de sais liotrópicos às matérias- primas poderia ser, em alguns casos, proibitiva em aplicações de grande escala, como o sal poderia impedir qualquer uso economicamente exeqüível da matéria-prima depletada de imunoglobulina. Um problema adicional em aplicações de grande escala poderia ser a eliminação de vários milhares de litros de rejeito.

[008] Cromatografia de afinidade baseia-se em interações específicas entre uma biomolécula-alvo e um ligante bioespecífico em um princípio de reconhecimento fechadura-chave. Assim, o alvo e ligante constituirão um par de afinidade, como antígeno/anticorpo, enzima/receptor etc. Ligantes de afinidade à base de proteína são bem conhecidos, como cromatografia de afinidade de Proteína A e Proteína G que são, ambas, métodos disseminados de isolamento e purificação de anticorpos. É de conhecimento geral que cromatografia de Proteína A proporciona uma especificidade notável, particularmente com relação a anticorpos monoclonais, e, conseqüentemente, é possível obter altas purezas. Usados em combinação com troca de íon, interação hidrofóbica, etapas de hidroxiapatita e/ou filtração em gel, métodos à base de proteína A tornam-se o método de escol para purificação de anticorpo para muitas companhias biofarmacêuticas, ver p. ex. WO 8400773 e US 5.151.350. No entanto, devido às ligações peptídicas das proteínas, matrizes de proteína A apresentam um certo grau de sensibilidade alcalina. Adicionalmente, quando se usa matrizes de Proteína A para purificar anticorpos a partir de meios de cultura de células, proteases que se originam das células podem causar vazamento de Proteína A, ou fragmentos de peptídeos da mesma.

[009] Uma tentativa de reduzir vazamento de ligantes de matrizes de cromatografia de afinidade foi apresentada no WO 03/041859 (Boehringer Ingelheim Pharma KG), sugerindo-se pré-tratar, p. ex., matrizes de Proteína A com pelo menos um tensoativo para reduzir vazamento de ligante. A matriz de afinidade pode ser tratada, p. ex., com 5-15 volumes de leito de tensoativo. O tempo de contato é crucial para a efetividade do processo. Por exemplo, à temperatura ambiente, requer-se um tempo de contato de pelo menos 16 h para uma redução de vazamento.

[010] Uma abordagem alternativa para o problema de vazamento de ligantes de matrizes de cromatografia de afinidade é proporcionada na US 4.983.722 (Miles Inc.), sendo que a Proteína A é isolada seletivamente de um líquido contendo anticorpo e Proteína A por meio de exposição da mesma a um material de troca de ânion. Ambos os componentes são adsorvidos no material de troca de ânion, e os anticorpos e Proteína A são então eluídos seqüencialmente em condições de crescente intensidade iônica. Um trocador de ânion ilustrativo é dietilaminoetila (DEAF) Trisacrila M ou DEAF SepharoseTM.

[011] WO 2004/076485 (Lonza Biologics Plc.) refere-se a purificação de anticorpo por meio de cromatografia de troca de íon de Proteína A. A etapa de troca de íon compreende carregar o anticorpo purificado em Proteína A em um material de troca de íon em condições que permitem a ligação de Proteína A e coletar o anticorpo no material percolado. O trocador de ânion é um trocador de ânion à base de amina quaternária, sendo o mais preferivelmente SepharoseTM Q (Amersham Biosciences, agora GE Healthcare).

[012] US 5.429.746 (SmithKline Beecham Corp.) refere- se a refere-se a um processo em que anticorpo é adsorvido primeirmente em um suporte cromatográfico de Proteína A e eluído; depois, adsorvido em um suporte de troca de cátion e eluído seletivamente do mesmo; e, finalmente, adsorvido em um suporte de HIC e eluído. A mistura aplicada na coluna de HIC, após cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de troca de cátion, pode conter agregados de imunoglobulina, espécies mal-dobradas, proteínas de células hospedeiras e material residual da etapa de cromatografia de afinidade.

[013] US 6.498.236 (Upfront Chromatography) refere-se a problemas específicos causados por pequenas diferenças no peso molecular entre ligantes de afinidade à base de proteína e imunoglobulinas-alvo. Assim, divulga-se um método para o isolamento ou purificação de imunoglobulinas de uma solução, como um sobrenadante de cultura de células de hibridoma, soro ou plasma animal, sendo que referido método é sugerido como uma alternativa ao uso de Proteína A, Proteína G, peptídeos sintéticos e outros ligantes com pesos moleculares relativamente altos. As matrizes de fase sólida usadas no método divulgado são definidas pela fórmula M-SP1-X-A- SP2-ácido, sendo que M indica a espinha dorsal da matriz, SP 1 indica um espaçador, X indica O, S ou NH, A indica uma porção aromática ou heteroaromática, mono- ou bicíclica, opcionalmente substituída, SP2 indica um espaçador opcional e ácido indica um grupo ácido. Os substituintes específicos são indicados como sendo decisivos quanto ao fato de se a matriz ligará imunoglobulinas de maneira eficiente.

[014] US 5.945.520 (Burton et al) revela resinas cromatográficas de modo misto que apresentam um caráter hidrofóbico no pH de ligação, e um caráter hidrofílico e/ou eletrostático no pH de dessorção. A resina é projetada especificamente para ligar o composto-alvo de uma solução aquosa tanto a baixa como também a alta concentração iônica. Assim, a etapa de adsorção emprega HIC, enquanto que a dessorção baseia-se em repulsão de cargas.

[015] US 6.702.943 (Johansson et al) divulga um método para remoção de uma substância-alvo de um líquido por meio de adsorção da mesma em uma matriz portando uma pluralidade de ligantes compreendendo grupos trocadores de ânion e uma estrutura hidrofóbica. Mais especificamente, os ligantes contêm um anel aromático na proximidade dos grupos trocadores de ânion carregados positivos. Afirma-se que a inclusão de outros grupos capazes de interações entre aceitador de elétrons-doador de elétrons pode acentuar a intensidade da interação entre a substância e o adsorvente. Afirma-se que as substâncias desejadas são células, partes de células e substâncias compreendendo estruturas peptídicas. A capacidade de atravessamento da matriz é definida por proteínas de referência, como albumina de soro bovino e IgG. Os ligantes divulgados são indicados como "ligantes com alto teor salino" devido a sua capacidade de adsorver substâncias-alvo em altas concentrações de sal, como 0,25 M de NaCl.

[016] Adicionalmente, WO 01/38228 (Belew et al.) divulga outro método para a remoção de uma substância carregada negativamente de um líquido por meio de ligação da mesma a uma matriz que compreende ligantes de troca de ânion em modo misto. Cada ligante compreende um nitrogênio carregado positivamente e uma ligação tioéter a uma distância de 1 a 7 átomos de referido nitrogênio carregado. De maneira similar ao indicado acima, as substâncias desejadas, como células, partes de células e substâncias compreendendo estruturas peptídicas são adsorvidas a concentrações salinas na região de 0,25 M de NaCl.

[017] A hidroxiapatita cerâmica foi sugerida como útil para polimento da imunoglobulina. Mais especificamente, reportou-se (Chromatography, nota técnica 2849; S.G. Franklin, Bio-Rad Laboratories, Inc., 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 E.U.A.) que IgG1 pode ser resolvida de um complexo IgG1-Proteína A em meio não-fracionado em hidroxiapatita cerâmica CHT (Bio-Rad). Mais especificamente, hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2) é uma forma de fosfato de cálcio, que, como se mostrou, possui propriedades de separação únicas. No entanto, matrizes à base de hidroxiapatita também são conhecidas por envolverem determinadas desvantagens. Por exemplo, em virtude do vazamento de Ca, elas são instáveis em valores de pH ácido, e são sensíveis a agentes quelantes, como EDTA. Adicionalmente, mostrou-se que é difícil desenvolver, e de ampliar a escala, de um método de purificação robusto e reproduzível empregando matrizes à base de hidroxiapatita, p. ex. porque foi difícil empacotar hidroxiapatita, e manter o desempenho em colunas grandes. Finalmente, há um risco de alterações das propriedades da resina causadas por contaminação com íons de metal e troca de íons cálcio, sendo que referida alteração é um problema sério para autoridades reguladoras.

[018] Johansson et al (Journal of Chromatography A, 1016 (2003) 21-33: "Preparation and characterization of prototypes for multimodal separation media aimed for capture of negatively charged biomolecules at high salt conditions") [n.t.: Preparação e caracterização de protótipos para meios de separação multimodal objetivados para captura de biomoléculas carregadas negativamente a altas concentrações salinas] descrevem a seleção de protótipos de ligantes multimodais para a captura de proteínas carregadas negativamente de fases móveis com alta condutividade. Verificou-se que ligantes de troca de ânion multimodais não-aromáticos à base de ligantes de troca de íon fraco (aminas primárias e secundárias) foram ótimos para a captura de proteínas por meio de adsorção em condições de alta salinidade.

Breve descrição da invenção

[019] Um aspecto da presente invenção consiste em preparar um método de separar anticorpos de outros componentes de um líquido, o que requer menos tempo e etapas de processo do que métodos do estado da técnica. Isto pode ser obtido por meio de um método em que o líquido compreendendo anticorpos é contactado com uma matriz de separação multimodal, e recupera-se anticorpos substancialmente puros em modo de não-ligação. Por exemplo, se o líquido for aplicado em um coluna de cromatografia compreendendo referida matriz, os anticorpos são facilmente recuperados do material percolado.

[020] Outro aspecto da invenção consiste em preparar um método de separar anticorpos de outros componentes de um líquido, sendo que se obtém especificidades inéditas em comparação com métodos do estado da arte.

[021] Um aspecto adicional da invenção consiste em preparar um método de separar anticorpos de outros componentes de um líquido, sendo que a eliminação de contaminantes presentes em uma alimentação bruta, como proteínas de células hospedeiras é aperfeiçoada.

[022] Aspectos e vantagens adicionais da invenção aparecerão da descrição detalhada a seguir.

Breve descrição dos desenhos

[023] Figura 1 a) - d) mostram uma seleção ilustrativa de ligantes de troca de ânion multimodais úteis no método da presente invenção: N-benzil-N-metil etanolamina, N,N-dimetilbenzilamina, 2- aminobenzimidazol e tiomicamina.

[024] Figura 2 mostra um cromatograma de separação de anticorpo monoclonal em matrizes de separação multimodais compreendendo N-benzil-N-metil etanolamina imobilizada em SepharoseTM 6 FF; N,N- dimetilbenzilamina imobilizada em SepharoseTM 6 FF; e, para referência, o trocador de ânion forte Q SepharoseTM FF, como descrito no Exemplo 1 abaixo.

[025] Figura 3 a) e b) mostra cromatogramas de anticorpos monoclonais carregados em matrizes de separação compreendendo tiomicamina e 2-aminobenzimidazol imobilizado em SepharoseTM 6 FF em diferentes densidades, como descrito no Exemplo 3 abaixo. Figura 4 a)-g) mostra os resultados de cromatografia realizada em protótipos com uma mistura de mAb1-rProteína A.

[026] Figura 5 a)-h) mostra os resultados de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) analítica na amostra com MAb1, 1 % de rPrA e material percolado combinado e eluir frações das operações cromatográficas na figura 4.

[027] Fig. 6 mostra a separação de moléculas de anticorpo monoclonal usando a matriz multimodal Q Phenila SepharoseTM Fast Flow, como descrito no Exemplo 5.

Definições

[028] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados intercambiavelmente na presente descrição.

[029] O termo "matriz de separação" é usado aqui para indicar um material constituído de um suporte sobre o qual um ou mais ligantes compreendendo grupos funcionais foram acoplados.

[030] O termo matriz de separação "multimodal" refere-se a uma matriz capaz de dotar pelo menos dois sítios diferentes, porém cooperativos, que interagem com o composto a ser ligado. Por exemplo, um destes sítios pode fornecer um tipo atraente de interação carga-carga entre o ligante e a substância de interesse. O outro sítio pode proporcionar interação doador-aceitador de elétrons e/ou interações hidrofóbicas e/ou hidrofílicas. Interações de elétrons doadores-aceitadores incluem interações, como ligação de hidrogênio, ππ, cátion-n, transferência de carga, dipolo-dipolo, dipolo induzido etc. Matrizes de separação "multimodais" também são conhecidas como matrizes de separação de "modo misto".

[031] O termo "superfície" meio aqui todas as superfícies externas, e inclui, no caso de um suporte poroso, superfícies exteriores e também superfícies de poros.

[032] A expressão "interações de elétrons doadores- aceitadores" significa que um átomo eletronegativo com um par livre de elétrons atua como um doador e ligam-se a um átomo com deficiência de elétrons que atua como um receptor para o par de elétrons do doador. (Ver, p. ex., Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973) página 42.)

[033] O termo "grupo trocador de ânion" significa aqui um grupo que é carregado positivamente ou carregável.

[034] O termo "eluente" é usado em seu significado convencional neste campo, i.e. um tampão de pH apropriado e/ou intensidade iônica para liberar um ou mais compostos de uma matriz de separação.

[035] O termo "etapa de captura" refere-se, no contexto da cromatografia líquida, à etapa inicial de um procedimento de separação. Da forma mais comum, uma etapa de captura inclui clarificação, concentração, estabilização e uma significativa purificação de impurezas solúveis. Após a etapa de captura, pode seguir-se uma purificação intermediária, que reduz adicionalmente quantidades remanescente de impurezas, como proteínas de células hospedeiras, DNA, vírus, endotoxinas, nutrientes, componentes de um meio de cultura de células, como agentes anti-espuma e antibióticos, e impurezas relacionadas com o produto, como agregados, espécies mal- dobradas e agregados. O termo "etapa de polimento" refere-se, no contexto da cromatografia líquida, a uma etapa de purificação final, sendo que impurezas em traços são removidas deixando um produto ativo e seguro. Impurezas removidas durante a etapa de polimento são freqüentemente confôrmeros da molécula-alvo ou produtos suspeitos de vazamento.

[036] O termo uma "proteína de ligação de Fc" significa uma proteína capaz de ligar-se à parte cristalizável (Fc) de um anticorpo e inclui, p. ex., Proteína A e Proteína G, ou qualquer fragmento ou proteína de fusão do mesmo que conservou referida propriedade de ligação.

Descrição detalhada da invenção

[037] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método ou anticorpos de separação de um ou mais outros compostos de uma amostra líquida, sendo que uma fase móvel compreendendo referido amostra líquida é contactada com uma matriz de separação multimodal para adsorvir um ou mais compostos-alvo, enquanto que os anticorpos permanecem livres na fase móvel, sendo que a matriz de separação multimodal compreende primeiros grupos capazes de interagir com sítios carregados negativamente do(s) composto(s)-alvo(s) e segundos grupos capazes de pelo menos uma interação diferente de interação carga-carga com referido(s) composto(s)-alvo(s). A presente invenção também compreende um método em que terceiros grupos ou grupos adicionais são adicionados adicionalmente aos primeiros e segundos segundos grupos.

[038] Em uma concretização vantajosa, o presente método é realizado usando-se os princípios da cromatografia líquida, i.e. passando-se uma fase móvel sobre uma coluna de cromatografia compreendendo a matriz de separação multimodal. O suporte pode encontrar-se em forma de pars porosas ou não-porosas, como partículas essencialmente esféricas, um monolito, filtro, membrana, superfície, capilares, ou qualquer outro formato comumente usado. Em uma concretização alternativa, o presente método é realizado usando-se os princípios da cromatografia de leito expandido i.e. por meio de adição da fase móvel a um leito expandido de matriz de separação em forma de partículas, como partículas essencialmente esféricas, compreendendo uma carga de alta densidade. Em outra concretização alternativa, o presente método é realizado usando-se um processo de bateladas, sendo que a matriz de separação é adicionada a um vaso compreendendo a amostra líquida.

[039] Assim, no método para a purificação de anticorpos de acordo com a invenção, um ou mais compostos indesejados são adsorvidos na matriz de separação enquanto que os anticorpos desejados permanecem na fase móvel sem serem adsorvidos. No contexto do presente método, compreende-se que o termo compostos "alvo" refere-se aos compostos adsorvidos na matriz de separação. Obviamente, a natureza e a identidade dos compostos adsorvidos dependerão da origem da amostra líquida. Exemplos de compostos-alvo são células e fragmentos de células; proteínas e peptídeos; ácidos nucleicos, como DNA e RNA; endotoxinas, e vírus.

[040] Em uma concretização da presente invenção, a matriz de separação multimodal é proporcionada em uma coluna de cromatografia e a fase móvel é passada através de referida coluna por meio de gravidade e/ou bombeamento, sendo que os anticorpos são recuperados no material percolado da coluna. Uma vantagem do presente método é que ele não requer qualquer eluição dos anticorpos da coluna. A evitação de uma etapa de eluição específica é vantajosa de um ponto de vista de processo, porque menos etapas resultarão em um protocolo de purificação mais rápido e, conseqüentemente, reduzirão os custos de processo. Adicionalmente anticorpos são sensíveis a determinadas condições que podem prejudicar seu padrão de dobragem; ou degradá-los por meio de ataque de suas ligações peptídicas. Embora condições de eluição para trocadores de ânions geralmente não envolvam quaisquer produtos químicos extremos, cada alteração de salinidade e pH pode afetar o anticorpo sensível, sendo que o efeito varia de espécie para espécie dependendo do pH, distribuição de carga etc. Conseqüentemente, outra vantagem do presente método é que ele evita adicionar um adicionar um eluente e aplicar condições de eluição aos anticorpos.

[041] Como mencionado acima, no método de acordo com a invenção, os compostos-alvo, dos quais se deseja separar os anticorpos, são adsorvidos na matriz de separação multimodal. Para se obter as condições mais vantajosas para adsorção de compostos-alvo, a amostra líquida é combinada com um tampão apropriado ou outro líquido para proporcionar uma fase móvel. O presente método é realizado vantajosamente em condições convencionais para uma cromatografia de troca de íon, que envolve comumente adsorção a uma concentração de sal relativamente baixa. Assim, em uma concretização do presente método, a condutiviade da fase móvel situa-se na faixa de 0-25, como 10-15 MS/em. Em uma concretização, o pH da fase móvel é de cerca de 5-6. A pessoa versada neste campo pode adaptar- se facilmente a condições para se obter material percolado dos anticorpos, p. ex. por meio de ajuste do pH ou da condutividade, o que dependerá, por exemplo, da carga e distribuição de carga dos anticorpos a serem purificados. Se necessário, é possível aplicar uma ou mais etapas de lavagem antes ou entre qualquer passagem ou quaisquer passagens do tipo referido. Caso se deseje liberar subseqüentemente os compostos adsorvidos, p. ex. para reutilização da matriz, eluição pode ser realizada a uma maior concentração salina, p. ex. por meio do uso de um gradiente salino crescente. O valor do pH pode ser deslocado, igualmente ou alternativamente, p. ex. como um gradiente decrescente de pH, para eluir compostos adsorvidos.

[042] Como mencionado acima, a matriz de separação multimodal compreende primeiros grupos, que são capazes de interagir com sítios carregados negativamente dos compostos-alvo, e segundos grupos, que são capazes de pelo menos uma interação diferente de interação carga-carga com referidos compostos-alvo. Neste contexto, compreende-se que os diferentes modos de interação de grupos da matriz de separação são direcionados para o mesmo composto-alvo, i.e. cada composto-alvo é adsorvido idealmente por dois ou mais modos de interação. Ligantes multimodais que compreendem grupos trocadores de ânions carregados positivamente ou carregáveis são conhecidos neste campo, ver, p. ex., US 6.702.943 (Johansson et al), WO 01/38228 (Belew et al), e WO 02/053252 (Belew et al).

[043] Em uma concretização, os primeiros grupos, i.e., os grupos trocadores de ânion da matriz de separação multimodal são fortes trocadores de ânion. Neste contexto, o termo trocadores de ânion "forte" é compreendido como grupos que permanecem carregados numa ampla faixa de pH. Em uma concretização vantajosa, os grupos trocadores de ânions fortes são aminas quaternárias, também conhecidos como grupos Q. Em uma concretização alternativa, os primeiros grupos da matriz de separação multimodal são trocadores de íons fracos. Neste contexto, o termo trocadores de ânions "fracos" é compreendido como significando grupos que são carregados em determinados valores de pH, mas que podem perder carga via troca de pH. Em uma concretização específica, os primeiros grupos compreendem uma mistura de grupos trocadores de ânion e funcionalidades adicionais, como trocadores de ânions e grupos de ligação de hidrogênio. Assim, nesta concretização, os primeiros grupos pode ser TRIS (tris(hidroximetil)aminometano).

[044] Em uma concretização, os segundos grupos da matriz de separação multimodal compreendem grupos aromáticos e/ou grupos de ligação de hidrogênio. Em uma concretização, referidos grupos aromáticos compreendem sistemas de anel compreendendo estruturas aromáticas ou heteroaromáticas. Em uma concretização vantajosa, os segundos grupos compreendem grupos fenila. Alternativamente, o segundo grupo pode compreender uma mistura de grupos hidrofóbicos aromáticos e não- aromáticos, como grupos alquila. Assim, em uma concretização específica, os primeiros grupos compreendem grupos alquila. A matriz de separação usada de acordo com a invenção pode compreender dois ou mais grupos funcionais do mesmo tipo, como dosi ou mais tipos diferentes de grupos hidrofóbicos; ou dois ou mais diferentes tipos de trocadores de ânions multimodais.

[045] Como o compreenderá uma pessoa versada neste campo, os grupos funcionais da matriz de separação usados no presente método podem estar presentes no mesmo ligante, sendo que, neste caso, cada ligante é multimodal, ou em diferentes ligantes, sendo que, neste caso, a natureza global da matriz de separação é multimodal.

[046] Assim, em uma concretização, a matriz de separação compreende primeiros e segundos grupos acoplados aos mesmos ligantes. Qualquer um dos primeiros e segundos grupos discutidos acima podem ser usados nesta concretização, como grupos de amina quaternária e grupos fenila. Em uma concretização, os ligantes foram acoplados ao suporte via seus primeiros grupos, como via aminas que resultam em aminas quaternárias. Em uma concretização, os primeiros e segundos grupos são distanciados entre si por uma cadeia hidrocarboneto compreendendo 1-6, como 1-3, de preferência, 1-2 átomos de carbono. Em uma concretização específica, os ligantes são selecionados do grupo que consiste de N-benzil-N- metil etanolamina; N,N-dimetilbenzilamina; 2-aminobenzimidazol; tiomicamina; e Q Fenila.

[047] Em uma concretização alternativa, a matriz de separação compreende primeiros e segundos grupos acoplados a diferentes ligantes. Qualquer um dos primeiros e segundos grupos discutidos acima podem ser usados nesta concretização, como grupos de amina quaternária e grupos fenila. Nesta concretização, no caso de uma matriz de separação particulada, referidos ligantes diferentes podem ser imobilizados a diferentes partículas ou partículas idênticas em quantidades substancialmente iguais ou diferentes. Alternativamente, ou adicionalmente, uma matriz de separação particulada pode compreender diferentes tipos de primeiros grupos; ou diferentes tipos de segundos grupos; imobilizados em partículas diferentes.

[048] A matriz de cromatografia multimodal usada no presente método é facilmente preparada por uma pessoa versada neste campo. Em resumo, a matriz constitui-se de ligantes acoplados a um suporte, conhecido neste campo como uma matriz de base, diretamente ou indiretamente via um espaçador convencional para proporcionar uma distância apropriada entre a superfície de suporte e os grupos que interagem. Para se obter elevadas capacidades de absorção, o suporte é, de preferência, poroso, e ligantes são então acoplados às superfícies externas e também às superfícies dos poros. Métodos para a imobilização de ligantes a superfícies porosas ou não-porosas são bem conhecidos neste campo; ver, p. ex., Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia e Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992. Em uma concretização, a densidade dos ligantes na superfície do suporte situa-se numa faixa próxima àquela comumente usada para matrizes de troca de íon convencionais. Os ligantes podem ser acoplados diretamente no suporte simplesmente via o elemento ligante resultante da química usada; ou via um elemento mais longo conhecido como extensor, tentáculo ou braço flexível, ver, p. ex., US 6.428.707, incorporada aqui por referência. Em resumo, o extensor pode ter a forma de um polímero, como um homopolímero ou um copolímero. Extensores poliméricos hidrofílicos podem ser de origem sintética, i.e. com um esqueleto sintético, ou de origem biológica, i.e. um biopolímero com um esqueleto naturalmente ocorrente. Polímeros sintéticos típicos são selecionados do grupo que consiste de alcoóis de polivinila; poliacril- e polimetacrilamidas; e éteres de polivinila. Biopolímeros típicos são selecionados do grupo que consiste de polissacarídeos, como amido; celulose; dextrano; e agarose.

[049] O suporte pode ser preparado de um material orgânico ou inorgânico. Em uma concretização, o suporte é preparado de um polímero nativo, como material de carboidrato reticulado, p. ex. agarose, agar, celulose, dextrano, quitosano, konjac, carragenina, gelano, alginato etc. Os suportes de polímero nativo são facilmente preparados e opcionalmente reticulados de acordo com métodos convencionais, como gelação de suspensão invertida (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Em uma concretização particularmente vantajosa, o suporte é um tipo de agarose relativamente rígida, porém porosa, que é preparada por meio de um método que acentua suas propriedades de fluxo, ver, p. ex., US 6.602.990 (Berg) ou SE 0402322-2 (Berg et al). Em uma concretização alternativa, o suporte é preparado de um copolímero ou polímero sintético, como polímeros sintéticos reticulados, p. ex. derivados de estireno ou estireno, divinilbenzeno, acrilamidas, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, ésteres de vinila, amidas de vinila etc. Referidos polímeros sintéticos são facilmente preparados e opcionalmente reticulados de acordo com métodos convencionais, ver p. ex. "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)). Suportes de polímero nativo ou sintético também são obteníveis de fontes comerciais, como GE Healthcare, Uppsala, Suécia, por exemplo em forma de partículas porosas. Em uma concretização alternativa adicional, o suporte é preparado de um polímero inorgânico, como sílica. Suportes inorgânicos porosos e não- porosos são bem conhecidos neste campo e facilmente preparados de acordo com métodos convencionais.

[050] Tamanhos de partículas vantajosos da presente matriz de separação podem apresentar um diâmetro na faixa de 5-500 μm, como 10-100 μm, p. ex. de 20-80 μm. No caso de partículas essencialmente esféricas, o o tamanho médio das partículas pode situar-se na faixa de 5-1000 μm, como 10-500. Em uma concretização específica, o tamanho médio das partículas situa-se na faixa de 10-200 μm. A pessoa versada neste campo pode determinar facilmente o tamanho e a porosidade vantajosos para as partículas dependendo do processo a ser usado. Por exemplo, para um processo em grande escala, por razões econômicas, pode-se preferir um suporte mais poroso, porém rígido, para permitir o processamento de grandes volumes, particularmente para a etapa de captura. Na cromatografia, parâmetros de processo, como o tamanho e a forma da coluna afetarão a escolha. Em um processo de leito expandido, a matriz contém comumente cargas de alta densidade, de preferência, cargas em aço inoxidável. Para outros processos, outros critérios podem afetar a natureza da matriz.

[051] Os anticorpos separados de acordo com a presente invenção podem originar-se de qualquer fonte comumente usada, como células cultivadas na superfície ou de cultura de tecidos contínua ou em forma de batelada em vasos ou tanques de fermentação. Assim, em uma concretização, o líquido é um sobrenadante obtido de fermentação de células. Exemplos de compostos que são adsorvidos são proteínas, DNA, vírus, endotoxinas, nutrientes, componentes de um meio de cultura de células, como agentes anti-espuma e antibióticos, e impurezas relacionadas com o produto,, como espécies mal-dobradas e agregados. A etapa de contato entre a fase móvel e a matriz de separação multimodal, i.e. a etapa de adsorção, pode ser precedida de uma etapa de filtração mecânica, centrifugação e/ou cromatografia. Por exemplo, se a amostra líquida for um brodo de fermentação, é vantajoso remover mecanicamente fragmentos de células, células inteiras e outros componentes relativamente grandes antes da cromatografia multimodal.

[052] Em uma concretização, o presente método constitui a etapa de captura de um protocolo de purificação. Em uma concretização específica, a amostra líquida é uma alimentação bruta que é filtrada antes do contato com a matriz de cromatografia multimodal. Conseqüentemente, esta concretização também poderia constituir uma etapa de captura, embora a amostra líquida tenha sido purificada por meios mecânicos. Como é de conhecimento geral, as células hospedeiras que produzem anticorpos também compreenderão uma quantidade de outras proteínas comumente conhecidas como proteínas de células hospedeiras (HCP). Referidas HCPs incluem enzimas, como proteases, e outras proteínas produzidas pelas células hospedeiras. De acordo com a presente invenção, verificou-se inesperadamente que as proteínas de células hospedeiras poderiam ser adsorvidas na matriz de separação multimodal enquanto os anticorpos permanecem livres na fase móvel. Assim, em uma concretização, substancialmente todas as proteínas de células hospedeiras da amostra líquida são adsorvidas na matriz de separação multimodal.

[053] Em concretizações alternativas, o presente método é usado como uma segunda, terceira ou mesmo quarta etapa em um protocolo de limpeza, como uma purificação intermediária ou etapa de polimento. Assim, em uma concretização, a fase móvel aplicada na matriz de separação multimodal compreende um eluato contendo anticorpo de uma matriz de separação. Em uma concretização, a amostra líquida é um eluato de uma matriz de cromatografia de afinidade precedente. Em uma concretização vantajosa, a matriz de separação de que o eluato é obtido compreende um ou mais ligantes de proteína de ligação de Fc, como ligantes de Proteína A. O termo ligantes de Proteína A inclui neste contexto proteína A nativa ou recombinante, ou seus fragmentos funcionais. Neste contexto, o termo fragmento "funcional" significa um fragmento que conservou as propriedades de ligação da proteína. Referidas matrizes de afinidade são comercialmente obteníveis, como MabSelectTM da GE Healthcare. Conseqüentemente, nesta concretização, os compostos adsorvidos podem ser um ou mais selecionados do grupo que consiste de Proteína A liberada; complexos formados entre Proteína A e anticorpos, como Complexos Proteína A-MAb, sendo que referidos complexos podem compreender uma quantidade de anticorpos por molécula de Proteína A, como 2-4 anticorpos complexados com uma molécula de Proteína A; e agregados de Proteína A ou anticorpos liberados. Como o compreenderá uma pessoa versada neste campo, dependendo das condições específicas usadas na etapa precedente, como cromatografia de afinidade, o eluato pode necessitar de condicionamento por meio de adições ou ajuste apropriado. Assim, o eluato é combinado com um tampão apropriado ou líquido para proporcionar uma fase móvel. Observe-se que, embora possa ser preferido por razões práticas, se um eluato de uma coluna de Proteína A tiver que ser purificado, o presente método não é realizado necessariamente diretamente após a cromatografia de afinidade, ou mesmo nas mesmas instalações.

[054] Em uma concretização específica, o presente método é um processo de múltiplas etapas compreendendo uma etapa de captura em uma matriz de cromatografia de afinidade, como uma proteína de cromatografia de Proteína A e uma etapa de polimento em uma matriz de separação multimodal, como descrito acima. A amostra líquida aplicada na matriz de cromatografia de afinidade pode ser um líquido de cultura de células ou um brodo de fermentação, que foi opcionalmente submetido a pré- tratamento, como filtração e/ou condicionamento por meio de ajuste do pH e/ou da condutividade para proporcionar uma fase móvel. Neste processo, a etapa de captura removerá uma ou mais proteínas de células hospedeiras e radicais de células hospedeiras, como fragmentos de células e proteínas, DNA, endotoxinas, e análogos. Na etapa de polimento subseqüente, primariamente, compostos em forma de radicais formam a etapa de captura, como agregados de Proteína A-anticorpo, serão adsorvidos.

[055] O presente método é útil para recuperar qualquer anticorpo monoclonal ou policlonal, como anticorpos que se originam de hospedeiros mamíferos, p. ex. camundongos, roedores, primatas e humanos, ou anticorpos que se originam de hibridomas. Em uma concretização, os anticorpos recuperados são anticorpos humanos ou humanizados. Em uma concretização vantajosa, os anticorpos são anticorpos monoméricos. Os anticorpos podem ser de qualquer classe, i.e. selecionados do grupo que consiste de IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Em uma concretização, os anticorpos a serem purificados são anticorpos capazes de ligação com Proteína A, ou fragmentos de anticorpos contendo Fc ou proteínas de fusão. Em uma concretização específica, os anticorpos recuperados são imunoglobulina G (IgG), como IgG1. Em uma concretização, o presente método é usado para purificar anticorpos apresentando um p 1 na faixa de 6-9, como na faixa de 78. Em uma concretização específica, o pI dos anticorpos purificados é de cerca de 9. No presente contexto, deve-se considerar que o termo "anticorpos" também inclui fragmentos de anticorpo e qualquer proteína de fusão que compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Assim, a presente invenção também compreende a purificação de fragmentos de qualquer um dos anticorpos indicados acima e também proteínas de fusão compreendendo referidos anticorpos. Em uma concretização, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

[056] Como se depreende do exposto acima, no presente método, compostos indesejados são adsorvidos na matriz de separação multimodal, e recupera-se uma fração substancialmente pura de anticorpos não-adsorvidos. Neste contexto, o termo "substancialmente puro" é compreendido como significando que substancialmente todos os compostos não-anticorpo foram removidos. Da forma mais vantajosa, pelo menos cerca de 80 %, como pelo menos cerca de 95 %, i.e. no intervalo de 95-100 %, como pelo menos cerca de 98 %, i.e. no intervalo de 98-100 % e, de preferência, pelo menos cerca de 99 %, i.e. no intervalo de 99-100 %, da quantidade total de contaminantes são removidos na matriz de separação multimodal. No entanto, como o perceberá uma pessoa versada neste campo, as possíveis purezas dependerão da concentração de anticorpo na amostra líquida aplicada na matriz de separação e também de outras condições empregadas. Assim, em uma concretização, os anticorpos separados de acordo com o presente método são anticorpos de classe terapêutica. Assim, os anticorpos purificados de acordo com a invenção são úteis na pesquisa e também para a preparação de farmacêuticos à base de anticorpos, como drogas MAb. Um uso alternativo dos anticorpos purificados é para uso diagnóstico. Adicionalmente, os anticorpos purificados também são úteis em produtos alimentícios, como aditivos alimentícios para humanos. Por exemplo, anticorpos bovinos purificados de acordo com a presente invenção são úteis em produtos alimentícios.

[057] Em uma concretização específica do presente método, a matriz de separação multimodal é proporcionada como uma coluna de cromatografia ou filtro descartável. Uma vantagem de se usar produtos descartáveis em um método para purificação de compostos terapêuticos, como anticorpos, é que descartando-se a matriz de separação após o uso, elimina-se o risco de contaminação cruzada entre dois processos. Em muitos métodos do tipo referido, é necessário manter condições assépticas. Assim, em uma concretização do presente método, a matriz de separação multimodal foi esterilizada, e a matriz de separação multimodal estéril é proporcionada como uma coluna de cromatografia recheada estéril ou um filtro. Em uma concretização, o presente método é realizado como um processo em bateladas, sendo que uma matriz multimodal de separação descartável é adicionada em um vaso compreendendo o líquido de que os anticorpos serão recuperados. Em uma concretização vantajosa, a matriz de separação descartável constitui- se então de partículas secas, como partículas de agarose secas, que incham facilmente em contato com o líquido aquoso. Permite-se um tempo apropriado para que compostos-alvo sejam adsorviso na matrix, após o que a fase líquida compreendendo os anticorpos é removida do vaso. A matriz usada pode então ser descartada, sem liberação dos compostos adsorvidos, o que, novamente, pode ser vantajoso de um ponto de vista de segurança porque compostos, como endotoxinas; príons e/ou determinadas proteínas de células hospedeiras não precisam ser mais manuseadas.

[058] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere- se a um kit para a purificação de anticorpos de um ou mais outros componentes em um líquido, sendo que referido kit compreende, em compartimentos separados, uma primeira coluna de cromatografia recheada com uma primeira matriz de separação; uma segunda coluna de cromatografia recheada com uma matriz de separação multimodal, que compreende primeiros grupos capazes de interagir com sítios carregados negativamente dos compostos-alvo, e segundos grupos capazes de pelo menos uma interação diferente de uma interação carga-carga com referidos compostos-alvo; um ou mais tampões; e instruções escritas. Em uma concretização vantajosa, as instruções ensinam a purificação de anticorpos a partir do material percolado de uma matriz de separação multimodal. Os ligantes; suporte e outros detalhes da matriz de separação multimodal podem ser como descrito acima. As instruções descrevem vantajosamente um método como definido acima. Em uma concretização do kit, a primeira matriz de separação é uma matriz de cromatografia de afinidade e, de preferência, compreende ligantes de proteína, como ligantes de proteína A ou G. Em outra concretização, a primeira e/ou a segunda colunas de cromatografia são colunas estéreis e/ou descartáveis.

[059] Finalmente, a presente invenção refere-se também a uma coluna de cromatografia descartável para a purificação de anticorpos, sendo que referida coluna compreende uma matriz de separação multimodal compreendendo primeiros grupos capazes de interagir com sítios-alvo carregados negativamente e segundos grupos capazes de pelo menos uma interação diferente de interação carga-carga. Os ligantes; suporte e outros detalhes da matriz de separação multimodal podem ser como descrito acima. Em uma concretização, a matriz de separação é capaz de adsorver proteínas diferentes de anticorpos de uma fase móvel sendo que a condutividade situa- se na faixa de 0-50, como 0-25, p. ex., 0-15 mS/cm. Uma concretização alternativa deste aspecto é um filtro descartável para a purificação de anticorpos, sendo que referido filtro compreende primeiros grupos capazes de interagir com sítios-alvo carregados negativamente e segundos grupos capazes de pelo menos uma interação diferente de interação carga-carga, sendo que referidos grupos são acoplados à superfície do filtro. Em uma concretização específica, o presente filtro é capaz de adsorver proteínas diferentes de anticorpos de uma fase móvel sendo que a condutividade situa- se na faixa de 0-50,, como 0-25 p. ex. 0-15 mS/cm.

Descrição detalhada dos desenhos

[060] Na figura 1, a) mostra o ligante multimodal protótipo 2-aminobenzimidazol; b) mostra o ligante multimodal protótipo tiomicamina; c) mostra o ligante multimodal protótipo N-benzil-N-metil etanolamina imobilisado em um suporte em forma de uma conta; e d) mostra o ligante multimodal protótipo N,N-dimetilbenzilamina. Na parte experimental, os ligantes protótipo foram acoplados com a matriz de agarose a 6 % SepharoseTM 6 FF.

[061] Figura 2 mostra um cromatograma de amostra contendo 50 mg de Mab1 aplicados em matrizes de separação multimodais compreendendo ligantes de N-benzil-N-metil etanolamina imobilisados em SepharoseTM 6 FF (901035A); N,N-dimetilbenzilamina imobilisada em SepharoseTM 6 FF (901035B); e Q SepharoseTM FF em 25 MM de Bis-Tris, 100 mM de NaCl (~ 12 mS/cm), pH 6,5. Eluição foi realizada com 25 mM de Bis-Tris, 0,5 M de NaCl, pH 6,5.

[062] Figura 3 a) e b) mostram cromatogramas de amostra contendo 20 mg de MAb 2, carregados sobre protótipos e referência, como descrito no Exemplo 3 abaixo. Tampões foram 25 mM de Bis-Tris, 100 mM de NaCl (~ 12 mS/cm), pH 6,0 para equilíbrio e carregamento. Tampão de eluição foi 0,5 M de acetato de sódio, pH 4,0. 3 a) tiomicamina (1282004, verde), 65 μmol/ml, tiomicamina (1282002, azul), 128 μmol/ml e Q SepharoseTM FF (preto), b) 2-aminobenzimidazol (1282045, azul), 65 μmol/ml, 2-aminobenzimidazol (1282030, verde), 146 μmol/ml e Q SepharoseTM FF (preto).

[063] Figura 4 a)-g) mostra os resultados de cromatografia realizadas em protótipos com mAb1-rProteína A. Tampão A foi 25 mM de Bis-Tris, 50 mM de NaCl, pH 6,0. A condutividade foi de aproximadamente 7 mS/cm. Tampão B, 0,5 M de acetato de sódio, pH 4,0, foi usado para eluição. Taxa de fluxo foi de 0,5 ml/min (150 cm/h). Amostra foi 10 mg de mAb1, 0,10 mg de rPrA a uma concentração de 4 mg/ml de mAb1 e 1 % de rProteína A (peso/peso). 4a) tiomicamina, 65 μmol/ml (1282004); b) tiomicamina, 128 μmol/ml (1282002); c) ref. Q SepharoseTM FF; d) 2-aminobenzimidazol, 65 μmol/ml (1282045); e) 2-aminobenzimidazol, 146 μmol/ml (1282032); f) N- benzil-N-metiletanolamina, 146 μmol/ml (901035A); e g) N,N- dimetilbenzilamina, 175 μmol/ml (901035B).

[064] Figura 5 a)-h) mostra os resultados de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC, size exclusion chromatography) analítica em amostra com MAb1, 1 % de rPrA e material percolado combinado e frações de eluato dos ciclos cromatográficos na figura 4. A curva azul representa frações de material percolado (FT) e a vermelha é eluato. Mais especificamente, Figura 5a) mostra uma amostra de 4 mg/ml mAb1, 0,04 mg/ml rPrA dando 1 % (peso/peso); 5b) mostra FT e eluato da fig. 4a) tiomicamina, 65 μmol/ml (1282004); 5c) mostra FT e eluato da fig. 4b) tiomicamina, 128 gmol/ml (1282002); 5d) mostra FT e eluato da fig. 4c) Q SepharoseTM FF; 5e) mostra FT e eluato da fig. 4d) 2-aminobenzimidazol, 65 μmol/ml (1282045); 5f) mostra FT e eluato da fig. 4e) 2-aminobenzimidazol, 146 gmol/ml (1282032); 5g) mostra FT e eluato da fig. 4f) N-benzil-N- metiletanolamina, 146 gmol/ml (901035A); e 5h) mostra FT e eluato da fig. 4g) N,N-dimetilbenzilamina, 175 μmol/ml (901035B).

[065] Fig. 6 mostra os resultados do Exemplo 5 abaixo. Mais especificamente, mostra-se o cromatograma resultante da amostra contendo 50 mg de Mab aplicados em Q Phenila SepharoseTM 6 Fast Flow. Eluição foi realizada com 25 mM de Tris, 0,5 M de NaCl, pH 8,0. Parece que a Figura 6 mostra que as moléculas de anticorpo monoclonal não são adsorvidas em Q Phenyl Sepharoset Fast Flow, porque só se observou um pequeno pico no cromatograma na eluição de gradiente.

Parte experimental

[066] Os presentes exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos, e não deveriam ser interpretados de qualquer forma que venha a limitar o escopo da invenção como definido pelas reivindicações anexas. Todas as referências fornecidas abaixo e alhures na presente descrição são incorporadas aqui por referência.

Disposição

[067] Em condições não-ligantes, amostra contendo aproximadamente 50 mg de mAb1 foram carregadas sobre protótipos 901035 A (N-benzil-N-metil etanolamina) e 901035 B (N,N-dimetilbenzilamina) a aproximadamente 5 e 12 mS/cm. Coletou-se frações de material percolado (FT) a 5, 10 e 15 volumes de coluna (CV). Frações do pico de eluição foram combinadas. Frações FT foram analisadas quanto a HCP e teor de Proteína A.

[068] Preparou-se protótipos com densidades alta e baixa de ligantes para os ligantes multimodais 2-aminobenzimidazol e tiomicamina. A pH 6,5, amostra[s] contendo 20 mg de mAb1 foram carregadas nas colunas a aproximadamente 5 e 12 mS/cm. O desempenho dos protótipos foi avaliado primeiro com SEC analítica. Frações selecionadas foram analisadas quanto ao teor de HCP e Proteína A. Após seleção das frações com frações selecionadas com SEC foram enviadas para análise de HCP e Proteína A.

[069] Para confirmar que o desempenho cromatográfico não foi único para um mAb particular, os ciclos cromatográficos foram repetidos usando-se uma amostra contendo mAb2 a pH 6,0 e aproximadamente 12 mS/cm. O desempenho dos protótipos foi avaliado primeiro com SEC analítica. Frações selecionadas foram analisadas quanto ao teor de HCP e Proteína A. Após seleção das frações com frações selecionadas com SEC foram enviadas para análise de HCP e Proteína A.

[070] Para distinguir com mais facilidade quais dos protótipos que proporcionaram a melhor eliminação de rProteína A, MAb1 apresentou pico com 1 % (peso/peso) de Proteína A recombinante (rPrA). Cada protótipo foi injetado com um volume de amostra correspondendo a 10 mg de MAb1, 1 % de rProteína A a pH 6,0 e uma condutividade de aproximadamente 7 mS/cm. Frações de material percolado e eluato foram combinadas separadamente e analisadas com SEC. Materiais / Unidades investigadas Colunas Instrumentos Sistemas de cromatografia: Espectrofotômetro

Produtos químicos

[071] Todos os produtos químicos foram de classe analítica. Água foi filtrada com MilliQ.

Meio de cromatografia

[072] A matriz de referência foi Q SepharoseTM Fast Flow (FF) (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). Os protótipos de matriz de separação multimodal portaram ligantes como descrito na Tabela 1 abaixo: Tabela 1: Ligantes de troca de ânion multimodais

Preparação de protótipo N-benzil-N-metil etanolamina Sepharose™ Fast Flow

A. Introdução de grupo alila na matriz

[073] SepharoseTM 6 Fast Flow (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi ativado com alil glicidil éter como a seguir: 100 ml de SepharoseTM 6 Fast Flow foram secados com sucção, misturados com 0,3 g de NaBH4, 12 g de Na2SO4 e 35 ml de solução aquosa de NaOH a 50 %. A mistura foi agitada durante 1 hora a 50°C. Após adição de 100 ml de alil glicidil éter a suspensão foi deixada a 50°C sob agitação vigorosa durante mais 16 horas. Após filtração da mistura, o gel foi lavado sucessivamente, com 500 ml de água destilada, 500 ml de etanol, 200 ml de água destilada 200 ml, 0,2 M de ácido acético e, 500 ml de água destilada.

[074] Titulação deu um grau de substituição de 0,22 mmol de alila/ml de gel. B. Ativação de alila Sepharose™ 6 Fast Flow via bromação

[075] Adicionou-se bromo a uma suspensão agitada de 50 ml de SepharoseTM 6 Fast Flow ativado com alila (0,22 mmol de grupos alila/ml de gel drenado), 1 g de acetato de sódio e 15 ml de água destilada, até obter uma cor amarela persistente. Adicionou-se então formiato de sódio até que a suspensão se descolorisse totalmente. A mistura de reação foi filtrada e o gel lavado com 500 ml de água destilada. Em seguida, o gel ativado foi transferido diretamente para um vaso de reação e reagido adicionalmente como N-benzil-N-metiletanolamina. C. Introdução de grupos BMEA (N-benzil-N- metiletanolamina) na matriz ativada

[076] Os grupos amina foram introduzidos na matriz diretamente via o átomo de nitrogênio dos grupos amina. Em um procedimento típico, o acoplamento com a matriz foi realizado via bromação do grupo alila e substituição nucleofílica em condições básicas. 25 ml de gel ativado com bromo (0,22 mmol de grupos alila/ml de gel drenado) foram transferidos para um frasco de reação contendo uma solução de N-benzil-N-metiletanolamina (16.0 ml). Adicionou-se 5 ml de água e o pH da solução de reação foi ajustado em 12,0 com solução de hidróxido de sódio. A reação foi deixada durante 16 horas sob agitação a 50°C. Após filtração da mistura de reação o gel foi lavado sucessivamente com 3 x 10 ml de água destilada, 3 x 10 ml de HCl aquoso 0,5 e, finalmente, 3 x 10 ml de água destilada. Obteve-se gel BMEA SepharoseTM Fast Flow com um grau de substituição de 0,15 mmol de aminas/ml de gel.

[077] Preparou-se protótipos de 2-aminobenzimidazol e tiomicamina com densidades alta e baixa de ligantes de acordo com procedimentos convencionais (ver US 6.702.943 (Johansson et al), WO 01/38228 (Belew et al), e WO 02/053252 (Belew et al)).

Amostras

[078] Usou-se dois anticorpos IgG humanizados diferentes, subclasse 1, indicados como MAb1 e MAb 2, com um coeficiente de extinção de 1,46 e 1,50 respectivamente. Ambos os anticorpos foram expressos em culturas de CHO e subseqüentemente purificados usando-se cromatografia de afinidade de Proteína A convencional antes dos presentes experimentos.

[079] Troca de tampão foi realizada em uma coluna de dessalinização HiPrepTM (GE Healthcare, Uppsala, Suécia), equilibrada com o tampão de interesse, por meio de injeção de um volume apropriado (5-15 ml) com um SuperloopTM (GE Healthcare, Uppsala, Suécia). A taxa de fluxo foi de 5 ml/min e coletou-se frações de 5 ml. Frações contendo o pico eluído foram combinadas e determinou-se a absorbância a 280 nm em duplicatas, para calcular a concentração de acordo com a equação 1: A280= ε.C.1 (equação 1) em que A280éa absorbância a 280 nm. ε (ml*mg-1*cm-1) é o coeficiente de extinção para uma proteína particular. C (mg/ml) é a concentração da proteína. 1 (cm) é o comprimento do percurso.

[080] Realizou-se cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) em uma coluna SuperdexTM 200 10/300 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. O tampão foi PBS (solução salina tamponada com fosfato); 10 mM de fosfato, 0,137 M de NaCl, 2,7 mM de KCl, pH 7,4 preparado de tabletes (Sigma, P-4417). Método Equilíbrio Injeção de amostra Eluição isocrática

Cromatografia em protótipos com mAb

[081] Tampão A foi 25 mM de Bis-Tris, pH 6,0 ou 6,5. Dependendo da condutividade desejada, incluiu-se aproximadamente 5 ou 12 mS/cm, 35 ou 100 mM de NaCl. Para protótipos 901035 A e 901035 B, tampão de eluição (Tampão B) foi 25 mM de Bis-Tris, 0,5 M de NaCl, pH 6,5. Para protótipos com tiomicamina e AB1 como ligantes, tampão de eluição (Tampão B) foi 0,5 M acetato de sódio, pH 4,0. A taxa de fluxo foi de 0,5 ml/min (150 cm/h). Método: Equilíbrio Injeção de amostra 5 CV 5-25 ml Tampão A cont. da amostra 20 ou 50 mg MAb lavagem 5 CV Tampão A eluição de gradiente 10 CV 0-100 % de B tampão eluição 10 CV 100 % de B tampão regeneração 5 CV Tampão A

Cromatografia em protótipos com MAb-rProteína A

[082] Tampão A foi 25 mM de Bis-Tris, pH 6,0. A condutividade foi de aproximadamente 7 mS/cm por meio de adição de 50 mM de NaCl, Tampão B foi 0,5 M acetato de sódio, pH 4,0. Taxa de fluxo foi de 0,5 ml/min (150 cm/h). Concentração de amostra foi de 4 mg/ml MAb1- 0,04 mg/ml de rPrA dando 1 % (peso/peso). Método: equilíbrio 5 CV Tampão A injeção de amostra 2,5 ml 10 mg de MAb, 1 % de rPrA lavagem 5 CV Tampão A eluição de gradiente 10 CV 0-100 % Tampão B eluição 10 CV 100 % Tampão B regeneração 5 CV Tampão A CIP (limpeza no local)

[083] Após cada ciclo cromatográfico, os protótipos e a matriz de referência Q SepharoseTM FF foram submetidos ao seguinte procedimento de CIP; 30 % de isopropanol 5 CV (volumes de coluna) H2O 5 CV 1,0 M de NaOH 4 CV (incl. pausa de 15 min.) H2O 5 CV Tampão A 5 CV H2O 5 CV 20 % de EtOH 5 CV Análise de Proteína A

[084] Frações selecionadas foram misturadas com diluente de amostra SPA em proporções de 800 μl de diluente de amostra SPA + 200 μl de amostra. Após misturar, as frações foram aquecidas em um bloco de aquecimento a 99°C durante 10 minutos, depois novamente misturados. As amostras foram então analisadas quanto a Proteína A recombinante. Análise de Proteínas de células hospedeiras (HCP)

[085] As amostras (min. 600 μl) foram analisadas quanto ao teor de HCP. O limite de detecção inferior é de 10 ng/ml. Exemplo 1: Amostra contendo MAb1 purificado em ligantes de protótipo N-benzil-N-metiletanolamina (901035A) e N,N-dimetilbenzilamina (901035B)

[086] No Exemplo 1, amostra contendo 50 mg de MAb1 foi aplicada em N-benzil-N-metil etanolamina imobilizada em SepharoseTM 6 FF (901035A), N,N-dimetilbenzilamina imobilizada em SepharoseTM 6 FF (901035B), e a matriz de referência Q SepharoseTM FF em 25 mM de Bis-Tris, 100 mM de NaCl (~ 12 mS/cm), pH 6,5. Eluição foi realizada com 25 mM de Bis-Tris, 0,5 M de NaCl, pH 6,5.

[087] Os cromatogramas do Exemplo I são mostrados na Figura 2, que mostra os dois protótipos N-benzil-N-metil etanolamina Sepharoset 6 FF (901035A) e N,N-dimetilbenzilamina SepharoseTM 6 FF (901035B) comparados com Q SepharoseTM FF. Frações de material percolado (FT) selecionadas para análise são indicadas com setas. Os resultados para eliminação de HCP e Proteína A mostrados nas Tabelas 2 e 3 abaixo revelam que os protótipos são superiores a Q SepharoseTM FF com relação àquilo. Tabela 2: Resultados de análise de HCP

Tabela 3: Resultados de análise de PrA

Exemplo 2: Amostra contendo MAb1 purificada em ligantes de protótipo tiomicamina e 2-aminobenzimidazol

[088] Neste exemplo, amostra contendo 20 mg de MAb1 foi carregada em protótipos e matrizes de separação de referência. Tampões foram 25 mM de Bis-Tris, 35 mM de NaCl (~5 mS/cm), pH 6,5 para equilíbrio e carregamento. Tampão de eluição foi 0,5 M acetato de sódio, pH 4,0, a) Tiomicamina, 65 μmol/ml (1282004), b) Tiomicamina 128 μmol/ml (1282002), c) Q Sepharose™ FF, d) 2-aminobenzimidazol (ABI), 65 μmol/ml (1282045) e e) 2-aminobenzimidazol (ABI), 146 μmol/ml(1282032). Os resultados para as análises de HCP e Proteína A são mostrados abaixo nas Tabelas 4 e 5. Tabela 4: Resultados de análise de HCP

Tabela 5: Resultados de análise de PrA

Exemplo 3: Amostra contendo MAb2 purificada em ligantes de protótipo tiomicamina e 2-aminobenzimidazol

[089] Amostra contendo 20 mg de MAb2 foi aplicada em protótipos e referência. Tampão foi 25 mM de Bis-Tris, 100 mM de NaCl (~12 mS/cm), pH 6,0. Eluição foi realizada com 0,5 M de acetato de sódio, pH 4,0. Os cromatogramas resultantes são mostrados na Figura 3. 3 a) Tiomicamina (1282004, verde), 65 μmol/ml, Tiomicamina (1282002, azul), 128 μmol/ml e Q Sepharose™ FF (preto). b) 2-aminobenzimidazol (1282045, azul), 65 μmol/ml, 2-aminobenzimidazol (1282030, verde), 146 μmol/ml e Q SepharoseTM FF (preto). Usou-se SEC analítica para selecionar frações para análises de HCP e Proteína A como mostrado nas Tabelas 6 e 7 abaixo. Tabela 6: Resultados de análise de HCP

Tabela 7: Resultados de análises de PrA

Exemplo 4: Purificação de MAb1 de uma amostra compreendendo MAb1 e Proteína A recombinante (rPrA) em ligantes de protótipo N-benzil-N- metiletanolamina, N,N-dimetilbenzilamina, tiomicamina e 2- aminobenzimidazol

[090] Neste exemplo, realizou-se cromatografia em protótipos com uma amostra contendo mAb1-rProteína A. Tampão A foi 25 mM de Bis-Tris, 50 mM de NaCl, pH 6,0, A condutividade foi de aproximadamente 7 mS/cm. Tampão B foi 0,5 M de acetato de sódio, pH 4,0. A taxa de fluxo foi de 0,5 ml/min (150 cm/h). Amostra foi 10 mg de mAb1, 0,10 mg de rPrA a uma concentração de 4 mg/ml de mAb1 e 1 % de rProteína A (peso/peso). Os resultados são mostrados na Figura 4.

[091] Finalmente, realizou-se SEC analítica em amostra com mAb1, 1 % de rPrA e material percolado combinado e frações de eluato dos ciclos cromatográficos na figura 4. Os resultados são mostrados na Figura 5. Na Figura 5 a, o pico sombreado é o complexo de MAb1-Proteína A. A curva azul são as frações de material percolado (FT) e a vermelha é o eluato. Exemplo 5: Purificação de anticorpo em disposição Q Phenila Sepharose 6 Fast Flow

[092] Em condições não-ligantes, amostra[s] contendo aproximadamente 50 mg de mAb foram carregadas em protótipo Q Phenila SepharoseTM 6 Fast Flow. Frações de material percolado (FT) foram coletadas a 5, 10 e 15 volumes de coluna (CV, volumes de coluna). Frações do pico de eluição foram analisadas.

[093] Q Phenila SepharoseTM 6 Fast Flow foi preparado ligando-se grupos Q (-N(CH3)3) a Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow (45 μmol grupos fenila/ml de gel) de acordo com procedimento padrão (ver abaixo). A capacidade de troca de íon de Q Phenila SepharoseTM 6 Fast Flow foi de 108 μmol/ml de gel. A pH 7,0 ou 8,0, amostra[s] contendo 50 mg de mAb (purificado com MabSelect) foram carregadas na coluna e o desempenho de Q Phenila SepharoseTM 6 Fast Flow foi avaliado por meio de análise de frações selecionadas de material percolado com relação ao teor de proteínas de células hospedeiras (HCP) e Proteína A.

Materiais / Unidades investigadas

[094] Colunas e Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow foram obtidos da GE Healthcare, Uppsala, Suécia HR 5/5TM n° cat. 18-0338-01 CV = 1 ml Instrumentos Sistemas de cromatografia: ÀKTAExplorer™ 10 Espectrofotômetro Spectra MAX plus Produtos químicos

[095] Todos os produtos químicos foram de classe analítica. Água foi filtrada com MilliQ. Preparação de Q Phenila SepharoseTM 6 Fast Flow

[096] Uma maneira de preparar uma matriz de separação de acordo com a invenção é exemplificada abaixo, partindo de um gel de agarose reticulada (Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow (high sub), GE Healthcare, Uppsala, Suécia).

Introdução de grupo Q em Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow (high sub):

[097] Grupos Q (-N(CH3)3 foram introduzidos em Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow (high sub) via reação com cloreto de glicidil trimetilamônio (G-MAC) como a seguir: 15 g de Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow (high sub) secada com sucção foi misturada com 5 ml de água, 5 ml de solução aquosa de NaOH a 50 %, 0,02 g de NaBH4, e 40 ml de G-MAC. A mistura foi agitada durante 16 hora a 30°C. Após filtração da mistura, o gel foi lavado sucessivamente, com 100 ml água destilada, 100 ml etanol, e 100 ml água destilada. Titulação deu um grau de substituição de 0,11 nunol aminas/ml de gel.

Amostras

[098] O anticorpo monoclonal usado foram expressos em culturas de CHO e subseqüentemente purificados com o emprego de cromatografia de afinidade de Proteína A convencional antes dos presentes experimentos. Determinação da concentração de mAb

[099] A amostra de mAb foi diluída dez vezes com tampão. Duas replicatas da solução de amostra foram medidas a A280. O valor médio foi usado para calcular a concentração de acordo com a lei de Lambert Beer: C = A/(1 x ε) C = concentração de IgG A = absorbância a 280 nm 1 = comprimento do percurso ε = coeficiente de extinção molar para a o mAb, mg-1 ml = 1,46

Cromatografia em Q Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow

[0100] A separação de mAb de proteínas de células hospedeiras e proteína A foi testada em condições não-ligantes. A amostra aplicada nas colunas foi de mAb purificado com MabSelect. A taxa de fluxo foi de 0,5 ml/min (150 cm/h). A absorbância a 280 nm foi detectada durante todos os ciclos. Testou-se dois tampões diferentes (ver abaixo). A troca de tampão para Tampão A foi realizada antes de cada ciclo. Usou-se colunas de dessalinização HiPrep e de dessalinização HiTrap dependendo do volume da amostra.

[0101] Tampões: Tampão A: 25 mM de Tris/HCl pH 8,0 Tampão B: 25 mM de Tris/HCl, 0,5 M de NaCl, pH 8,0 Tampão A: 25 mM de Tampão de fosfato pH 7,0 Tampão B: 25 mM de Tampão de fosfato, 0,5 M de NaCl, pH 7,0

[0102] Método: Eluato de MabSelect com pH ajustado foi usado como material de partida. Equilíbrio 5 CV Tampão A injeção de amostra 16 CV (50 mg de mAb) lavagem 5 CV Tampão A gradiente 5 CV 100 % Tampão B limpar após 5 CV Tampão A gradiente

[0103] Frações de 1 ml foram coletadas durante injeção de amostra, lavagem e eluição

[0104] CIP (limpeza no local) com 1 M de NaOH foi realizada após cada ciclo. O tempo de permanência foi de aproximadamente 25 minutos. Análise de Proteína A

[0105] Frações selecionadas foram misturadas com diluente de amostra SPA em proporções de 800 μl de diluente de amostra SPA + 200 μl de amostra. Após misturação, as frações foram aquecidas em um bloco de aquecimento a 99°C durante 10 minutos, e, depois, novamente misturadas. As amostras foram então analisadas quanto a Proteína A recombinante.

Análise de proteínas de células hospedeiras (HCP)

[0106] As amostras (min. 600 μl) foram analisadas quanto ao teor de HCP. O limite de detecção inferior é de 10 ng/ml.

Resultados

[0107] Em condições não-ligantes, aproximadamente 50 mg mAb foram carregados em uma coluna HR 5/5 recheada com Q Phenyl SepharoseTM Fast Flow a dois pHs diferentes (pH 7,0 e 8,0). Frações de material percolado foram coletadas a 5, 10 e 15 volumes de coluna (CV, volumes de coluna) de acordo com a Figura 1. Tabelas 8 e 9 apresentam os resultados da análise de Proteína A e HCP das frações de material percolado. Não foi possível detectar restos de proteína A nas frações. Adicionalmente, não foi possível detectar proteínas de células hospedeiras em FT1 e FT2 quando se usou uma amostra com pH 8,0. Observou-se pequenas quantidades de proteínas de células hospedeiras quando se usou uma amostra com pH 7,0, porém a redução de HCP foi de cerca de 50 vezes em comparação com o teor de HCP na amostra. Fig. 6 também mostra que as moléculas de anticorpo monoclonal não são adsorvidas sobre Q Phenyl SepharoseTM Fast Flow porque se observou um pico muito pequeno no cromatograma na eluição de gradiente (Fig. 6). Tabela 8. Resultados de análise de proteína A

[0108] O volume da amostra foi de 16 ml e os FT1-FT3 foram frações de 1 ml. Os volumes de eluição combinados foram de 2 ml. Tabela 9. Resultados de análise proteínas de células hospedeiras.

[0109] O volume de amostra foi de 16 ml e FT1-FT3 foram frações de 1 ml. Os volumes de eluição combinados foram de 2 ml.

Claims

1. Método de separação de um ou mais anticorpos de um ou mais outros compostos em uma amostra líquida, em que uma fase móvel compreendendo referida amostra líquida é contactada com uma matriz de separação multimodal para adsorver um ou mais compostos-alvo enquanto que os anticorpos permanecem livres na fase móvel, em que a amostra líquida compreende um eluente da matriz de separação, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação multimodal compreende primeiros grupos e segundos grupos, em que os primeiros grupos são aminas quaternárias e os segundos grupos são selecionados do grupo consistindo em N-benzil-N-metil etanolamina; N,N-dimetilbenzilamina, 2- aminobenzimidazol e tiomicinamina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação multimodal é proporcionada em uma coluna de cromatografia, a fase móvel é passada através de referida coluna por meio de gravidade e/ou bombeamento, e os anticorpos são recuperados no material percolado da coluna.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação de que se obtém o eluato compreende ligantes de proteína, de preferência, ligantes de proteína A ou G.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que ligantes de proteína A e/ou proteína G são adsorvidos na matriz de separação multimodal.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a condutividade da fase móvel situa-se na faixa de 0-25, como 0-15 mS/cm.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação compreende primeiros e segundos grupos acoplados aos mesmos ligantes.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo grupo são distanciados entre si por uma cadeia de hidrocarbonetos de 1-3 átomos de carbono.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os ligantes foram imobilizados em um suporte via seus primeiros grupos.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação compreende primeiros e segundos grupos acoplados a diferentes ligantes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação é particulada e compreende uma mistura de primeiras partículas, em que ligantes compreendendo os primeiros grupos foram imobilizados; e segundas partículas, em que ligantes compreendendo os segundos grupos foram imobilizados.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação é um filtro em que uma mistura de primeiros ligantes compreendendo os primeiros grupos; e segundos ligantes compreendendo os segundos grupos foram imobilizados.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação compreende terceiros grupos capazes de uma terceira interação com um composto-alvo.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são anticorpos monoclonais.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são anticorpos humanizados.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que os anticorpos separados são anticorpos monoclonais de classe terapêutica.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação multimodal é proporcionada em uma coluna de cromatografia descartável.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a coluna descartável foi esterilizada antes do contato com a fase móvel.