JP4831436B2 - クロマトグラフィーリガンド - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質のような生体分子の精製に有用である新規なクロマトグラフィーリガンドに関する。本発明のリガンドは、例えば、抗体の精製に有用であり、粒子又はメンブランのような多孔性担体に好ましくは固定される。従って、本発明は、新規リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックス、マトリックスの調製方法及び抗体を精製するためのキットも包含する。

免疫系は、細菌、寄生虫、真菌、ウイルスへの感染から及び腫瘍細胞の増殖から身体を集合的に防護する多くの相互依存性細胞型から構成される。免疫系の監視者は、その宿主の血流を絶え間なく動きまわるマクロファージである。感染又は免疫感作で攻撃されると、マクロファージは、抗原として知られる外来分子で刻印された侵入物を取り込むことで応答する。この事象は、ヘルパーＴ細胞によって仲介され、Ｂ−細胞の賦活を引き起こす複雑な連鎖応答を示す。これらのＢ−細胞は、今度は、外来侵入物に結合する抗体と呼ばれるタンパク質を産生する。抗体と抗原の間の結合事象は、食作用又は補体系の活性化による破壊に向けて外来侵入物に刻印する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭなど、免疫グロブリンとしても知られるいつかの異なる部類の抗体が存在する。それらは、その生理学的役割のみならずそれらの構造も異にする。構造の観点から、ＩｇＧ抗体は、多分それらが成熟免疫応答で演じる顕著な役割ゆえに、広範に研究されている。ポリクロナール抗体は、適切な抗原を用いる動物の免疫感作による標準的方法に従って産生される。応答して、動物は、ポリクロナールである抗体を産生する。しかし、多くの目的に対して、モノクロナール抗体として知られる特定抗体の単一クローンを有することが望まれる。モノクロナール抗体（ＭＡｂ）は、単一の抗体のみを産生する正常Ｂ−細胞と異常ミエローマ腫瘍細胞の間の融合から構成されるハイブリッド又は融合細胞によって産生される。得られるハイブリッドは、ハイブリドーマとして知られ、今日、抗体を産生するための標準方法で使用されている。

免疫グロブリンが所持する生物学的活性は、今日、ヒトの及び獣医学上の診断、ヘルスケア−及び治療の分野における様々な応用の領域で利用されている。実際、この数年、モノクロナール抗体及び組換え抗体構築物は、臨床試験で現在調べられ、治療薬及び診断薬としてＦＤＡの承認を受けている最も大きな部類のタンパク質になっている。簡単で費用効果の高い方式で高純度の抗体を得るためには、発現系に対する補足及び産生戦略、効率的な精製プロトコルが求められる。

免疫グロブリンの在来的単離方法は、タンパク質のその他の群を溶液中に残しながらの、免疫グロブリンを含むタンパク質画分の選択的な可逆的沈殿を基本にしている。典型的な沈殿剤は、エタノール、ポリエチレングリコール、リオトロピック塩（硫酸アンモニウム及びリン酸カリウムなど）及びカプリル酸である。典型的には、これらの沈殿方法は、極めて不純な産物を与え、同時に、時間がかかり、骨が折れる。更に、原料に沈殿剤を添加すると、上清を他の目的に使用することが困難になり、処理の問題が新たに生じる。このことは、免疫グロブリンの大規模精製の場合に特に実際的な重要性をもつ。

免疫グロブリンの代替的単離方法はクロマトグラフィーであり、それは一群の密接に関連した分離方法を包含する。大部分の他の物理的及び化学的分離方法からクロマトグラフィーを区別する特徴は、１つの相が固定であり、他の相が移動可能である２つの相互に混和できない相を接触させることである。試料混合物は、移動相中に導入され、混合物が移動相によって装置を通過して運搬される間に、固定相及び移動相との一連の相互作用を受ける。相互作用は、試料中の成分の物理的又は化学的特性の差異を利用する。これらの差異は、固定相を含むカラムを通過する移動相の影響の下で、個々の成分の移動速度を決定する。分離された成分は、固定相との相互作用が増大する順序で出てくる。最も阻止されなかった成分が最初に溶出し、最も強力に保持された物質が最後に溶出する。分離は、試料成分がカラムから溶出する際に、隣接する溶質ゾーンとの重なりを防止するように、１つの成分が十分に阻止される場合に達成される。それぞれ特定の分離目的に関して最適な固定相を設計するための努力が絶えずなされている。このような固定相は、一般に、官能基即ち結合基を含むリガンドが結び付いた担体又はベースマトリックスを含む。アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなど、それが利用する相互作用の原理に基づいた各種のクロマトグラフィーが一般に参照される。

アフィニティークロマトグラフィーは、鍵−鍵穴認識の原理による目標生体分子と生体分子特異的リガンドの間の特異的相互作用に基づく。従って、目標とリガンドは、抗原／抗体、酵素／受容体のような親和性対を構成する。抗体を単離及び精製するための双方とも普及している方法であるプロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーのように、タンパク質系親和性リガンドが広く知られている。プロテインＡクロマトグラフィーが、特にモノクロナール抗体に対して顕著な特異性を提供し、結果として高い純度が得られることが広く知られている。プロテインＡに基づく方法は、イオン交換、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト及び／又はゲル濾過段階と組み合わせて使用され、多くの生物薬剤会社のための優れた抗体精製法となっており、例えば、国際公開第８４００７７３号及び米国特許第５１５１３５０号を参照されたい。しかし、タンパク質のペプチド結合により、プロテインＡマトリックスは、ある程度のアルカリ感受性を示す。更に、プロテインＡを使用して細胞培養培地から抗体を精製する場合には、細胞に由来するプロテアーゼが、プロテインＡ又はそのペプチドフラグメントのリークを引き起こす可能性がある。

イオン交換クロマトグラフィーは、免疫グロブリンを単離するためのプロトコルで使用されることが多い。陰イオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの負に荷電したアミノ酸側鎖が、クロマトグラフィーマトリックスの正に荷電したリガンドと相互作用する。他方、陽イオン交換クロマトグラフィーでは、免疫グロブリンの正に荷電したアミノ酸側鎖が、クロマトグラフィーマトリックスの負に荷電したリガンドと相互作用する。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、免疫グロブリンを単離するためのプロトコルで記述され使用されるもう１つの方法である。高純度の免疫グロブリン製品が目的である場合には、ＨＩＣを１以上の更なる段階と組み合わせることが一般に推奨される。ＨＩＣでは、免疫グロブリンをＨＩＣマトリックスに効率的に結合させるために、移動相にリオトロピック塩を添加する必要がある。結合した免疫グロブリンは、続いて、リオトロピック塩の濃度を低下させることによってマトリックスから放出される。従って、この方法の欠点は、原料にリオトロピック塩を添加する必要があることであり、このことは、大規模使用者対して諸問題と結果として費用の増大を引き起こす可能性がある。例えば、ホエー、血漿及び卵黄のような原料の場合、原料にリオトロピック塩を添加することは、その塩が、免疫グロブリンの激減した原料の商業的に可能ななんらかの使用を妨げる可能性があるので、多くの場合、大規模な応用では採用されない。大規模応用における更なる問題は、数千リットルの廃液の処分である。

米国特許第５９４５５２０号（Ｂｕｒｔｏｎら）は、結合のｐＨで疎水的特性を、脱離のｐＨで親水的及び／又は静電的特性を示す混成モードクロマトグラフィー樹脂を開示している。樹脂は、小さな及び大きなイオン強度の双方で水性溶液から目標化合物に結合するように特別に設計されている。このことは、スペーサーアーム及び１以上のイオン化可能な官能基を含む選択されたイオン化可能リガンドによって達成され、ここで、固体担体マトリックス上のイオン化可能リガンドの密度は、約１５０μモル／樹脂（ｍＬ）又は１ミリモル／樹脂の乾重量（ｇ）のより小さい方を超える。更に、イオン化可能リガンドを含む樹脂の疎水性は、最初のｐＨにおいて高い又は低いイオン強度で水性媒質中の目標化合物の５０％以上を結合するのに十分である。イオン化可能官能基の実例は、４−（アミノメチル）ピリジン、３−（アミノメチル）ピリジン、２−（アミノメチル）ピリジン、１−（３−アミノプロピル）−イミダゾール、２−（アミノメチル）−ベンズイミダゾール、４−（３−アミノプロピル）モルホリンである。

更に、国際公開０１／３８２２８号（Ｂｅｌｅｗら）は、チオエーテル陰イオン交換体を使用してその結合によって液体から負に荷電した物質を除去する、陰イオン交換吸着のための方法に関する。各リガンドは、正に荷電した窒素及び荷電窒素から１〜７原子の間隔を置いたチオエーテル結合を含む。所望する物質、例えば細胞、細胞の一部及びペプチド構造を含む物質などは、０．２５Ｍ ＮａＣｌの領域の塩濃度で吸着される。

最後に、米国特許６７０２９４３号（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら）は、目標物質を、陰イオン交換基及び疎水性構造を含む複数のリガンドを所持するマトリックスへ吸着することによって液体から除去する方法を開示している。より具体的には、リガンドは、正に荷電した陰イオン交換基の付近に芳香族環を含む。所望する物質は、細胞、細胞の一部及びペプチド構造を含む物質であると述べられている。開示されているリガンドは、０．２５Ｍ ＮａＣｌのような高い塩濃度で目標物質を吸着するそれらの能力のため、「高塩リガンド」と表示される。

しかし、特定の目標分子の精製に関連する工程を最適にするには、特有の操作条件が要求され、最善の分離マトリックスは場合毎に異なる。例えば、生物工学産業では、ペプチド及びタンパク質、核酸、ウイルスなどの精製に特殊な工程を設計する必要がある。更に、抗体の精製では、抗体の型が、分離マトリックスの選択にとって決定的に重要である。従って、この分野では、絶えず開発される多くの新規製品の精製に向けて広範な選択範囲を提供するように、代替的分離マトリックスがなお求められている。
国際公開第８４００７７３号パンフレット 米国特許第５１５１３５０号明細書 米国特許第５９４５５２０号明細書 国際公開第０１／３８２２８号パンフレット 米国特許第６７０２９４３号明細書 米国特許第６４２８７０７号明細書 米国特許第６６０２９９０号明細書 スウェーデン特許第０４０２３２２−２号明細書 Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａ．Ｋｒｉｓｈｍａ Ｍａｌｌｉａ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ、１９９２ Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２）、３９３〜３９８（１９６４） Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９）、７０〜７５（１９８８）

本発明の一態様は、液体中のその他の成分から抗体の分離に有用である新規リガンドを提供することである。

本発明の特定の態様は、夾雑タンパク質を吸着する能力を有するが、目標抗体を吸着する能力を有さないリガンドを提供することである。

本発明の更なる態様及び利点は、以下の詳細な説明から明らかであろう。

定義
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、本明細書中で互換的に使用される。

本明細書中で、用語「分離マトリックス」は、官能基を含む１つ以上のリガンドがカップリングしている担体からなる材料を表すのに使用される。用語「樹脂」は、この分野での分離マトリックスに使用される場合がある。

用語「マルチモーダル」分離マトリックスは、結合されるべき化合物と相互作用する２以上の異なるが協力的な部位を提供する能力のあるマトリックスを指す。例えば、これらの部位の１つは、リガンドと問題の物質との間に引力型の電荷−電荷相互作用を付与できる。他の部位は、電子受容体−供与体相互作用、並びに／或いは疎水性及び／又は親水性相互作用を付与できる。電子供与体−受容体相互作用には、水素結合、π−π、陽イオン−π、電荷移動、双極子−双極子、誘導双極子などが含まれる。「マルチモーダル」分離マトリックスは、「混成モード」分離マトリックスとしても知られている。

用語「表面」は、本明細書中で、すべての外部表面を意味し、多孔性担体の場合には外側表面及び細孔内表面を含む。

用語「溶出液」は、この分野でのその従来からの意味、即ち、分離マトリックスから１種以上の化合物を解き放すのに適切なｐＨ及び／又はイオン強度の緩衝液の意味で使用される。

用語「捕捉段階」は、液体クロマトグラフィーの文脈では、分離手順の初期段階を指す。最も一般的には、捕捉段階は、清澄化、濃縮、安定化及び可溶性不純物からのかなりの精製を含む。捕捉段階の後に、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、細胞培養培地の成分（消泡剤及び抗生物質など）及び製品関連不純物（凝集体、誤って折り畳まれた種及び凝集体など）のような不純物の残存量を更に低減する中間精製が続いてもよい。

用語「使い捨て」は、本明細書中、クロマトグラフィーカラム及びその他の分離マトリックスの文脈で、単回使用又は限られた回数の使用を意図したマトリックスを意味する。使い捨て製品は、極めて少量でも有害である夾雑物の除去に有利に使用され、このような場合、夾雑物をマトリックスに吸着し、次いでそのマトリックスを廃棄するのが好都合である。使い捨て製品が所望されるもう１つの状況は、滅菌処理の場合であり、この場合、マトリックスは滅菌又は少なくとも無菌である。

用語「仕上げ段階」は、液体クロマトグラフィーの文脈で、痕跡不純物を除去し有効で安全な製品を残す最終精製段階を指す。仕上げ段階中に除去される不純物は、目標分子の配座異性体又は考え得るリークであることが多い。

用語「Ｆｃ結合タンパク質」は、抗体の結晶可能部分（Ｆｃ）に結合できる能力のあるタンパク質を意味し、例えばプロテインＡ及びプロテインＧ又は結合特性を維持しているその任意のフラグメント又は融合タンパク質が含まれる。

最初の態様において、本発明は、芳香族エタノールアミンを含むクロマトグラフィーリガンドである。本発明によるリガンドは、以下でより詳細に考察するように、抗体の精製に特に有用である。

最初の実施形態では、本発明のリガンドは次式で定義される。

Ｒ_１−Ｒ_２−Ｎ（Ｒ_３）−Ｒ_４−Ｒ_５
式中、
Ｒ_１は、置換又は非置換芳香族環系、例えばフェニル基であり、
Ｒ_２は炭素原子数０〜４の炭化水素鎖であり、
Ｒ_３は炭素原子数１〜３の炭化水素鎖であり、
Ｒ_４は炭素原子数１〜５の炭化水素鎖であり、
Ｒ_５はＯＨ又はＨである。

上式から明らかなように、基Ｒ_１は、炭素原子を含まなくてもよい（即ち、Ｒ_１とアミンの間で結合を構成する）或いは適宜置換されている１〜４個の炭素原子（例えば２〜３個の炭素原子など）を含んでいてもよい炭素鎖Ｒ_２を経由してアミンに連結されている。アミンをＲ_５と連結する炭素鎖Ｒ_４は、適宜置換されている１〜５個の炭素原子（例えば２〜４個の炭素原子）を含んでいてもよい。アミン中のＲ_３は、適宜置換されている１〜３個の炭素原子（例えば２個の炭素原子）を含んでいてもよい。

芳香族環系Ｒ_１は、その置換基がリガンドの結合特性を少しも実質的程度にまで減じないなら、置換又は非置換１つ以上のフェニル基を含んでいてもよい。従って、Ｒ_１は、１つ以上の芳香族環、例えば、フェニレン、ビフェニレン又はナフチレン構造及びその他の芳香族環系を含んでいてもよい。芳香族環は、複素環でもよく、即ち、１つ以上の窒素、酸素又は硫黄原子を含んでいてもよく、例えば、ピリジン、ピリミジン、ピロール、イミダゾール、チオフェン又はピランでよい。実例となる置換されたＲ_１基は、ヒドロキシフェニル（２−、３−及び４−）、２−ベンズイミダゾリル、メチルチオキシフェニル（２−、３−及び４−）、３−インドリル、２−ヒドロキシ−５−ニトロフェニル、アミノフェニル（２−、３−及び４−）、４−（２−アミノエチル）フェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、４−ニトロフェニル、３−トリフルオロメチルフェニル、４−イミダゾリル、４−アミノピリジン、６−アミノピリミジル、２−チエニル、２，４，５−トリアミノフェニル、４−アミノトリアジニル及び４−スルホンアミドフェニルからなる群から選択される。

有利な実施形態では、Ｒ_１は非置換フェニルである。代替的実施形態において，Ｒ_１は１つ以上のＯＨ基で置換されたフェニルである。

更に、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４の１以上が、リガンドの結合特性が少しも実質的程度まで損なわれない限り、任意の適切な置換基で置換されていてもよい。例えば、より親水性のリガンドが所望であれば、１つ以上の親水基、例えばＯＨ基を含んでいてもよい。代わりに、置換によりリガンドの疎水性を強化することができ、この場合、リガンドは、１つ以上の疎水基、例えばアルキル及び／又はフッ素を含んでいてもよい。最後に、置換は、１つ以上の更なる官能基、例えば荷電した実体を導入するために利用することができ、又、リガンドのマルチモーダル特性を増大させる。更に、炭素鎖Ｒ_２及びＲ_３は、枝分れがリガンドの結合特性を少しも実質的程度まで損なわない限り、直鎖又は枝分れ鎖でよい。

本発明リガンドの特定の実施形態では、Ｒ_２は−ＣＨ_２−である。他の実施形態では、Ｒ_３は−ＣＨ_３である。更なる実施形態では、Ｒ_４は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−又は−ＣＨ_２−ＣＨ_２−である。更に他の実施形態では、Ｒ_１は、非置換フェニルである。

従って、有利な実施形態では、本発明によるリガンドは、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（ＢＭＥＡ）を含む。代替的実施形態では、リガンドはＮ，Ｎ−ジメチルベンジルアミンである。

本発明によるリガンドは、当業者が有機化学の標準的方法を使用して容易に合成できる。

本発明の更なる態様は、担体に上述のような複数のリガンドを固定することを含む、分離マトリックスの調製方法である。特に医療又は診断分野での単回使用に適したマトリックスを提供するために、本発明で調製される分離マトリックスは、続く段階で滅菌される。従って、一実施形態では、方法は、上述のようなマトリックスを調製すること、カラム中に調製したマトリックスを用意すること及び調製したマトリックスを滅菌することを含む。滅菌は、例えば、熱処理、照射又は任意のその他の従来から使用されている方法のような適切な条件下で当業者によって容易に実施される。

の式から明らかなように、その非固定状態で、本発明によるリガンドは第３級アミンを含み、第３級アミンは、担体にカップリングするのに適切な取っ手を構成し、かくして第４級アミン及びフェニル基を含むカップリングしたリガンドを作り出す。結果として、本発明によるリガンドは、固定されると、正に荷電した第４級アミン基に加えて疎水性である芳香族環構造を含むので、マルチモーダル陰イオン交換リガンドであると考えられる。リガンドを多孔性又は非多孔性表面に固定する方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａ．Ｋｒｉｓｈｍａ Ｍａｌｌｉａ ａｎｄ Ｐａｕｌ Ｋ．Ｓｍｉｔｈ，「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＩＮＣ、１９９２を参照されたい。一実施形態では、担体表面のリガンド密度は、従来からのイオン交換マトリックスに通常使用されるものに近い範囲である。

有利な実施形態では、リガンドの担体へのカップリングは、担体とリンカーの間にリンカーを導入することによって用意される。カップリングは、任意の従来からの共有結合性カップリングの方法論に従って、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリル−グリシジルエーテル、ビス−エポキシド（ブタンジオールジグリシジルエーテルなど）、ハロゲン置換脂肪族物質（ジクロロプロパノールなど）及びジビニルスルホンを使用することによって実施できる。これらの方法は、当分野で周知であり、当業者により容易に実施される。

特定の実施形態では、本発明によるリガンドは、エクステンダーとしても知られるより長いリンカー分子を経由して担体にカップリングされる。エクステンダーは、当分野で周知であり、リガンドと担体の間の距離を立体的に拡大するのに一般的に使用される。エクステンダーは、可能な化学構造をより詳細に記述するため、触手又は可撓性アームと表示されることもあり、例えば、ここで参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６４２８７０７号を参照されたい。簡単に言えば、エクステンダーは、ホモ−又はコポリマーのようなポリマーの形態でよい。疎水性高分子エクステンダーは、合成起源（即ち合成骨格を有する）又は生物学的起源（即ち天然に見出される骨格を有するバイオポリマー）に属するものでよい。典型的な合成ポリマーは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル−及びポリメタクリルアミド、並びにポリビニルエーテルからなる群から選択される。典型的なバイオポリマーは、デンプン、セルロース、デキストラン及びアガロースのような多糖類からなるから選択される。

担体は、有機又は無機材料から作られ、多孔性又は非多孔性である。一実施形態では、担体は、架橋炭水化物材料のような天然ポリマー、例えば、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、キトサン、コンニャク、カラゲナン、ジェラン、アルギン酸塩、ペクチン、デンプンなどから調製される。天然ポリマー担体は、逆懸濁ゲル化のような標準的な方法に従って容易に調製され、適宜架橋される（Ｓ Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２）、３９３〜３９８（１９６４））。特に有利な実施形態では、担体は、１種の比較的堅いが多孔性のアガロースであり、それはその流動特性を高める方法で調製され、例えば、米国特許第６６０２９９０号（Ｂｅｒｇ）又はスウェーデン特許第０４０２３２２−２号（Ｂｅｒｇら）を参照されたい。代替的実施形態では、担体は、架橋合成ポリマーのような合成のポリマー又はコポリマー、例えば、スチレン又はスチレン誘導体、ジビニルベンゼン、アクリルアミド、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル、ビニルエステル、ビニルアミドなどから調製される。このような合成ポリマーは、標準的な方法に従って容易に調製され、適宜架橋され、例えば、「Ｓｔｙｒｅｎｅ Ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ７０（９），７０（９），７０〜７５（１９８８））を参照されたい。天然又は合成のポリマー担体は、スウェーデン、ＵｐｐｓａｌａのＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅのような商業的供給源から、例えば、多孔性粒子の形態で入手することもできる。更なる代替的実施形態では、担体は、シリカのような無機ポリマーから調製される。無機の多孔性及び非多孔性担体は、この分野で周知であり、標準的な方法に従って容易に調製される。

本発明の分離マトリックスの適切な粒子径は、５〜５００μｍ、例えば１０〜１００μｍ、例えば２０〜８０μｍの直径範囲でよい。本質的に球状の粒子の場合、平均粒子径は５〜１０００μｍ、例えば１０〜５００μｍの範囲でよい。特定の実施形態で、平均粒子径は１０〜２００μｍの範囲である。当業者は、使用を予定した処理に応じて適切な粒子径及び気孔率を容易に選択できる。例えば、大規模処理の場合には経済的理由のため、特に捕捉段階に対して大容積の処理を可能にするように、より多孔性であるが堅い担体を選ぶことができる。クロマトグラフィーでは、カラムの大きさ及び形状のような処理パラメーターが選択に影響を及ぼす。吸着流動床法において、マトリックスは、一般に、高密度フィラー、好ましくはステンレススチールのフィラーを含む。その他の処理の場合には、他の判定基準がマトリックスの性質に影響を及ぼす可能性がある。

従って、本発明の第２の態様は、担体にカップリングした上述のリガンドを含む分離マトリックスである。当業者には明らかであろうが、各担体は、一般に、複数種のリガンドを含む。特定の実施形態では、担体は、第２の種類のリガンドと組み合わせて上述のリガンドを含み、本発明によるリガンドは、リガンド総量の約３０％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、最も好ましくは約９０％以上存在する。このような組合せリガンドの分離マトリックスは、更なる相互作用の要素によってその分離特性が向上する特定の場合に向けて設計できる。第２の種類のリガンドは、電荷反発、疎水基、水素結合の能力を有する基、親和性基などによって化合物を溶出させるために使用される１種以上の荷電基、例えば陽イオン交換体を含んでいてもよい。

第１の実施形態では、本発明によるマトリックスは、粒子の形態、例えば、本質的に球状の、細長い又は不規則形状の粒子である。特定の実施形態では、分離マトリックスは、使用に際してそれらの元々の形態を確保するため液体に浸漬される乾燥粒子のように、乾燥される。例示的実施形態では、このような乾燥分離マトリックスは、乾燥アガロース粒子から構成される。しかし、本発明によるマトリックスは、代わりに、従来から分離に使用されている任意のその他の形状、例えば、モノリス、フィルター又はメンブラン、毛細管、チップ、表面のような形状を取ることができる。従って、第２の実施形態では、マトリックスは、メンブラン構造、例えば、単一メンブラン、積層メンブラン又はフィルターを含む。

本発明の第３の態様は、上述の分離マトリックスの使用である。第１の実施形態では、本発明は、上述のような分離マトリックスを、タンパク質の精製で使用する。本発明の使用の有利な実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体フラグメント又は抗体を含む融合タンパク質である。他の実施形態では、本発明は、上述のような分離マトリックスを、任意のその他の化合物、例えば、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらのオリゴヌクレオチド）、プラスミド、ウイルス、プリオン、細胞（原核又は真核細胞など）、脂質、炭水化物、有機分子（小型有機分子など）、薬剤標的、診断マーカー分子からなる群から選択される化合物の分離で使用する。使用は、後により詳細に考察される。更に他の実施形態では、本発明は、上述のような分離マトリックスを、細胞培養の支持体として、即ち表面で増殖する細胞を固定するために使用する。当業者は、本発明の応用において、用語「分離」は、精製、単離及び化合物の除去に対して使用されるが、診断目的の場合のように目標化合物の同定も包含することを理解するであろう。

本発明の第４の態様は、液体試料中の１種以上のその他の化合物から、液体試料を含む移動相を上述のような分離マトリックスと接触させることによって、抗体のような所望する化合物を分離する方法である。有利な実施形態では、本発明は、液体クロマトグラフィーの原理を使用して、即ち、本発明による分離マトリックスを含むクロマトグラフィーカラムに移動相を通すことによって実施される。他の代替的実施形態では、本発明の方法は、分離マトリックスを液体試料を含む容器に添加するバッチ方式のクロマトグラフィー処理を利用して実施される。特定の実施形態では、バッチ方式で添加される分離マトリックスは、乾燥粒子、例えば乾燥アガロース粒子を含む。他の実施形態では、方法は、吸着流動床クロマトグラフィーを使用して、即ち、移動相を、高密度フィラーを含む本質的に球状粒子の形態である分離マトリックスからなる吸着流動床、例えば流動床に添加することによって実施される。

本発明方法の第１の実施形態では、所望しない化合物は、分離マトリックスに吸着され、一方、抗体のような所望の化合物は吸着されないで移動相に残留する。当業者には明らかであろうが、吸着される化合物の性質及び本体は、液体試料の起源によって決まる。所望の抗体が吸着されない実施形態において吸着される化合物の例は、細胞及び細胞破片、タンパク質及びペプチド、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）、エンドトキシン、ウイルス、培養培地からの残留物などである。特定の実施形態では、本発明の分離マトリックスをクロマトグラフィーカラム中に用意し、移動相を重力及び／又はポンプ輸送によってカラムを通過させ、カラムの通過液中に抗体を回収する。従って、この実施形態の利点は、カラムから抗体製品のいかなる溶出も必要としないことである。特定の溶出段階を回避することは、段階が少ないほど精製プロトコルがより迅速になり、結果として処理費用が低下するので、処理の観点から魅力的である。更に、抗体は、例えば、それらの折り畳みパターンを損なう又はそれらのペプチド結合を攻撃することによってそれらを劣化させる特定の条件に敏感である。従って、陰イオン交換体に関する溶出条件は、一般に、極端な化学薬品を少しも含まないが、塩及び／又はｐＨの変化は、敏感な抗体に影響を与える可能性があり、その影響は、ｐＩ、電荷分布などに応じて種毎に異なる。従って、この実施形態のもう１つの利点は、それが、溶出液の添加及び所望の化合物に対する溶出条件の適用を回避することである。化合物の吸着に最も適した条件を得るために、液体試料を適切な緩衝液又はその他の液体と組み合わせて移動相を用意する。本発明の実施形態は、有利には、一般に比較的低い塩濃度での吸着を含む、陰イオン交換クロマトグラフィーにとって通常的な条件下でランする。従って、本発明方法の一実施形態では、移動相の導電率は、０〜２５、例えば１０〜１５ｍＳ／ｃｍの範囲である。一実施形態では、移動相のｐＨは約５〜６である。続いて、例えばマトリックスを再利用するために吸着された化合物を解き放すことを望む場合には、より高い塩濃度で、例えば塩勾配の増加を利用して溶出を実施できる。そのうえ又は代わりにｐＨ値を、例えばｐＨ勾配の低減により変化させて吸着された化合物を溶出できる。

本発明方法の第２のそして代替的実施形態では、所望の化合物を、従来からの液体クロマトグラフィーと同様のマトリックスに吸着する。次いで、製品を選択的に溶出した後、マトリックスを再使用する、溶出は、カラム全体に適切な緩衝液を通液することによって容易に実施される。必要なら、任意のこのような通液の前又はその間に、１以上の洗浄段階を適用することができる。一実施形態では、この実施形態の操作条件は、従来からのイオン交換、即ち低導電率を有する移動相を使用する吸着及び上で考察した高導電率緩衝液を使用することによる溶出と同様である。当業者は、異なる条件を試験することによって条件を容易に調整し、吸着された化合物及び通過液を分析できる。特定の実施形態では、所望の化合物は抗体である。

上記第１及び第２の実施形態のどちらかを選択して、当業者は、有利にはｐＨ及び／又は導電率を調節することによって、特定の化合物を吸着するように条件を容易に適合させることができる。例えば、抗体の分離において、異なる部類の抗体は、異なる電荷及び電荷分布パターンを有し、これらは分離の目的と一緒になって、抗体を吸着するのがより好ましいか、或いは吸着しないでカラムを通過させるのがより好ましいかを決定する。

本発明の一実施形態により分離される抗体は、任意のよく知られた供給源（表面で培養された細胞など）に、或いは発酵タンク又は容器中でのバッチ方式又は連続細胞培養に由来することができる。従って、一実施形態では、液体は細胞発酵から得られる上清である。よって、抗体が分離される必要がある化合物の例は、ＤＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、栄養素、細胞培養培地の成分（消泡剤及び抗生物質など）及び製品類縁不純物（誤って折り畳まれた種及び凝集体など）である。移動相と本発明の分離マトリックスを接触させる段階、即ち、吸着段階は、機械的濾過、遠心及び／又はクロマトグラフィーの段階によって先行されてもよい。例えば、液体試料が発酵培養液であるなら、本発明のマトリックスを使用する段階の前に、細胞破片、全細胞及びその他の比較的大きな成分を機械的に除去するのが有利である。

一実施形態では、本発明は、精製プロトコル中の捕捉段階を構成する。特定の実施形態では、液体試料は、本発明によるクロマトグラフィーマトリックスとの接触の前に濾過される粗供給液である。従って、この実施形態は、液体試料が機械的手段によって精製されてはいるが、やはり捕捉段階を構成する。周知のように、抗体を産生する宿主細胞も、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）として一般的に知られている幾つかのその他のタンパク質を含む。このようなＨＣＰには、プロテアーゼのような酵素及び宿主細胞によって産生されるその他のタンパク質が含まれる。従って、一実施形態では、液体試料中の実質的にすべての宿主細胞タンパク質は、本発明の方法によって、例えば、分離マトリックスへの吸着などによって除去される。

代替的実施形態では、本発明は、中間精製又は最終仕上げ段階など、純化プロトコルにおける第２、第３又は更には第４のクロマトグラフィー段階として使用される。従って、一実施形態では、本発明の分離マトリックスに適用される移動相は、分離マトリックスからの抗体含有溶出液を含む。一実施形態では、液体試料は、先行するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスからの溶出液である。有利な実施形態では、それから溶出液が得られる分離マトリックスは、１種以上のＦｃ結合タンパク質リガンド、例えばプロテインＡを含む。用語、プロテインＡリガンドには、この文脈で、天然及び組換えのプロテインＡ又はその機能性フラグメントが含まれる。この文脈で、用語「機能性」フラグメントは、タンパク質の最初の結合特性を保持したフラグメントを意味する。このようなアフィニティーマトリックスは、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）のように商業的に入手できる。従って、この実施形態では、除去される、好ましくは吸着される化合物は、解き放されたプロテインＡ、プロテインＡ分子当たり幾つかの抗体（１つのプロテインＡ分子と複合した２〜４個の抗体など）を含むプロテインＡと抗体の間で形成された複合体（プロテインＡ−ＭＡｂ複合体など）及び解き放されたプロテインＡの凝集体又は抗体からなる群から選択される１以上の化合物でよい。当業者には明らかであろうが、先行段階（アフィニティークロマトグラフィーなど）で使用される特定の条件に応じて、溶出液は、適切な添加又は修正による調節を必要とする場合がある。従って、溶出液を適切な緩衝液又は液体と組み合わせて移動相を用意する。

本発明の方法は、任意のモノクロナール又はポリクロナール抗体、例えば、哺乳動物宿主（例えばマウス、ネズミ、霊長類、ヒト）起源の抗体又はハイブリドーマ起源の抗体の分離に有用である。一実施形態では、分離される抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。抗体は、任意の部類、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭからなる群から選択されるものでよい。一実施形態では、抗体は、プロテインＡに結合する能力のある抗体又はＦｃを含有する抗体フラグメント又は融合タンパク質である。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１のような免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。一実施形態では、本発明方法は、６〜９の範囲、例えば７〜８の範囲のｐＩを有する抗体の精製に使用される。特定の実施形態では、精製抗体のｐＩは約９である。本発明の文脈で、用語「抗体」は、抗体フラグメント及び抗体又は抗体フラグメントを含む任意の融合タンパク質も含むと解されたい。従って、本発明は、上で言及した抗体及びこのような抗体を含む融合タンパク質のいずれか１つのフラグメントの精製も包含する。一実施形態では、抗体はモノクロナール抗体である。特定の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。

上から明らかなように、本発明方法において、吸着されていない抗体の実質的に純粋な画分が回収される。この文脈において、用語「実質的に純粋」は、実質的にすべての非抗体化合物が除去されていることを意味すると解される。最も有利には、夾雑物総量の約８０％以上、例えば約９５％以上即ち９５〜１００％の区間、例えば９８％以上即ち９８〜１００％の区間、好ましくは約９９％以上即ち９９〜１００％の区間が、本発明の分離マトリックス上で除去される。しかし、当業者が認識するように、得られる純度は、分離マトリックスに適用される液体試料中の抗体濃度及び使用されるその他の条件に左右される。従って、一実施形態では、本発明方法により分離される抗体は、治療用グレードの抗体である。従って、本発明で精製された抗体は、研究において及びＭＡｂ薬剤のような抗体医薬の調製に有用である。精製抗体の代替的用途は、診断用途に向けたものである。更に、精製抗体は、ヒト用食品添加剤のような食品においても有用である。例えば、本発明で精製されたウシ抗体は食品において有用である。

本発明方法の特定の実施形態では、本発明の分離マトリックスは、使い捨てクロマトグラフィーカラム又は使い捨てフィルターとして供給される。抗体のような治療用化合物を精製する方法で使い捨て製品を使用する利点は、２つの異なる処理間での相互汚染を回避できることである。従って、一実施形態では、本発明の分離マトリックスは、滅菌されたクロマトグラフィーカラム又はフィルターとして供給される。一実施形態では、本発明方法は、使い捨て分離マトリックスを、抗体を回収する予定の液体を入れた容器に添加するバッチ方式処理として実施される。時間が適切なら、目標化合物はマトリックスに吸着すること可能になり、その後、抗体を含む液相が容器から回収される。次いで、使用したマトリックスを、吸収された化合物を放出しないで処理することができ、このことが、更に、エンドトキシン及び／又はある種の宿主タンパク質のような化合物をもはや更に取り扱う必要がないので、安全性の観点から有利である場合がある。代替的実施形態では、本発明のマトリックスは、抗体を吸着する方式で使用されるクロマトグラフィーカラムにおける使い捨て製品として提供される。有利な実施形態では、カラム及びマトリックスは、滅菌されており、使用者が無菌又は滅菌条件下で抗体製品を精製することが可能になる。

第２の態様において、本発明は、液体中の１種以上の成分から抗体を精製するためのキットに関するものであり、キットは、分割した区画中に、上記の分離マトリックスを充填したクロマトグラフィーカラム、１種以上の緩衝液及び使用説明書を含む。分離マトリックスは上述の通りでよい。使用説明書は、有利には、上で詳細に規定したような方法を説明する。

図面の詳細な説明
図１は、ビーズ形態の担体に窒素原子を経由して固定されたプロトタイプリガンドであるＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを示す。左側には図式的に描いたリンカーと、右側には実例としての親水性リンカーとカップリングしたリガンドを示す。実験の部で、プロトタイプリガンドを６％アガロースマトリックスであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にカップリングした。

図２は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ上に固定したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンのリガンドを含む（９０１０３５Ａ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ上に固定したＮ，Ｎ−ジメチルベンジルアミンのリガンドを含む及びＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦを含む分離マトリックスに、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（〜１２ｍＳ／ｃｍ）、ｐＨ６．５で適用した、５０ｍｇのＭａｂ１を含む試料のクロマトグラムを示す。溶出は、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で実施した。

図３ａ及び図３ｂは、ｍＡｂ１−ｒプロテインＡについてプロトタイプで実施されたクロマトグラフィーの結果を示す。Ａ−緩衝液は、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０とした。導電率は約７ｍＳ／ｃｍであった。溶出には、Ｂ−緩衝液、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０を使用した。流速は０．５ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であった。試料は、ｍＡｂ１が４ｍｇ／ｍｌ、ｒプロテインＡが１％（ｗ／ｗ）の濃度の、１０ｍｇのｍＡｂ１、０．１０ｍｇのｒＰｒＡとした。図３ａは対照のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ、図３ｂはＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、１４６μモル／ｍＬ（９０１０３５Ａ）である。

図４ａ〜図４ｃは、ＭＡｂ１、１％ｒＰｒＡを含む試料、図３のクロマトグラフィーランからのプールした通過液及び溶出画分に関する分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す。青色曲線は、通過液（ＦＴ）画分であり、赤色は溶出液である。より具体的には、図４ａは、４ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ１、０．０４ｍｇ／ｍＬのｒＰｒＡ（１％（ｗ／ｗ）に相当）の試料を示し、図４ｂは、図３ａのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦからのＦＴ及び溶出液を示し、図４ｃは、図３ｂのＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、１４６μモル／ｍＬ（９０１０３５Ａ）からのＦＴ及び溶出液を示す。

本発明の実施例は、例示目的のためにのみ提供され、添付の特許請求の範囲で規定される通りの本発明の範囲をいかなる点でも制限するものと解釈されるべきでない。本明細書中の以下で又は他の場所で提供されるすべての参照文献を、ここで参照により本明細書に組み込む。

実施例１
本発明による分離マトリックスの調製
ＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの調製
架橋アガロースゲル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から出発する、本発明による分離マトリックスの調製方法の一実施形態を以下に示す。

Ａ．マトリックスへのアリル基の導入
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗをアリルグリシジルエーテルで次のように活性化した。即ち、１００ｍｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを吸引乾燥し、０．３ｇのＮａＢＨ_４、１２ｇのＮａ_２ＳＯ_４及び３５ｍｌの５０％ＮａＯＨ水溶液と混合した。混合物を５０℃で１時間撹拌した。１００ｍｌのアリルグリシジルエーテルを添加した後、懸濁液を激しく撹拌しながら５０℃で更に１６時間保持した。混合物を濾過した後、ゲルを５００ｍｌの蒸留水、５００ｍｌのエタノール、２００ｍｌの蒸留水、２００ｍｌの０．２Ｍ酢酸及び５００ｍｌの蒸留水で順次洗浄した。

滴定によれば、置換度は、アリル０．２２（ミリモル）／ゲル（ｍＬ）であった。

Ｂ．ブロム化によるアリルＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの活性化
５０ｍｌのアリル活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（アリル基０．２２ミリモル／ｍｌ排水ゲル）、１ｇの酢酸ナトリウム及び１５ｍｌの蒸留水からなる撹拌懸濁液に、臭素を黄色が持続するまで添加した。次いで、ギ酸ナトリウムを懸濁液が完全に脱色されるまで添加した。反応混合物を濾過し、ゲルを５００ｍｌの蒸留水で洗浄した。次いで、活性化ゲルを反応容器に直ちに移送し、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンと更に反応させた。

Ｃ．活性化マトリックスへのＢＭＥＡ（Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン）の導入
アミン基の窒素原子を経由してマトリックスにアミン基を直接導入した。典型的な手順において、マトリックスへのカップリングは、アリル基の臭素化及び塩基性条件下での求核置換により実現された。２５ｍｌの臭素活性化ゲル（アリル基０．２２ミリモル／ｍｌ排水ゲル）を、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（１６．０ｍｌ）の溶液を含む反応ガラス瓶に移した。５ｍｌの水を添加し、反応溶液のｐＨを水酸化ナトリウム溶液で１２．０に調整した。反応物を撹拌下に５０℃で１６時間保持した。反応混合物を濾過した後、ゲルを、１０ｍｌの蒸留水で３回、１０ｍｌの０．５ＨＣｌ水で３回、最後に１０ｍｌの蒸留水で３回、順次洗浄した。ＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲルが、アミン０．１５ミリモル／ｍｌゲルの置換度で得られた。

実施例２
通過液中の抗体の精製
実施例２Ａ：実験配置
非結合条件下で、約５０ｍｇのｍＡｂ１を含む試料を、プロトタイプ９０１０３５Ａ（Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン）上に約５及び１２ｍＳ／ｃｍで注入した。５、１０及び１５カラム体積（ＣＶ）時に通過液画分（ＦＴ）を集めた。溶出ピークからの画分をプールした。ＦＴ画分を、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量について分析した。

クロマトグラフィーの性能が、ある特定のｍＡｂに対してのみでないことを確認するために、ｍＡｂ２を含有する試料を使用し、ｐＨ６．０及び約１２ｍＳ／ｃｍでクロマトグラフィーのランを繰り返した。プロトタイプの性能は、まず、分析ＳＥＣで評価した。画分をＳＥＣでスクリーニングした後、選択した画分をＨＣＰ及びプロテインＡの分析に供した。

プロトタイプのｒプロテインＡ除去を試験するために、ＭＡｂ１に１％（ｗ／ｗ）の組換えプロテインＡ（ｒＰｒＡ）を添加した。プロトタイプに、１０ｍｇのＭＡｂ１、１％のｒプロテインＡに相当する試料容積をｐＨ６．０及び約７ｍＳ／ｃｍの導電率で注入した。通過液及び溶出画分を別個にプールし、ＳＥＣで分析した。

材料／調査単位
カラム及びゲルは、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。

装置
クロマトグラフィー装置 ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅ（商標）１０
分光計 Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ｐｌｕｓ。

化学薬品
使用する化学薬品はすべて分析級とした。水はＭｉｌｌｉＱで濾過した。

クロマトグラフィー媒体
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＦＦ）（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。分離マトリックスのリガンドは、下表１に記載した通りのプロトタイプである。

試料
ＭＡｂ１及びＭＡｂ２と表示され、それぞれ１．４６及び１．５０の吸光係数を有する２つの異なるヒト化ＩｇＧ抗体、サブクラス１を使用した。双方の抗体とも、ＣＨＯ培養で発現させ、続いて本発明の実験に先立って従来からのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。

緩衝液の交換は、緩衝液で平衡化したＨｉＰｒｅｐ（商標）脱塩カラム（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、Ｓｕｐｅｒｌｏｏｐ（商標）（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて適切な容積（５〜１５ｍＬ）を注入して行った。流速を５ｍＬ／分とし、５ｍＬの画分を集めた。溶出ピークを含む画分をプールし、式１により濃度を計算するために２８０ｎｍでの吸光度を二重に測定した。

Ａ_２８０＝ε・Ｃ・ｌ （式１）
式中、
Ａ_２８０は２８０ｎｍでの吸光度であり、
ε（ｍＬ・ｍｇ^−１・ｃｍ^−１）は特定のタンパク質に対する吸光係数であり、
Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）はタンパク質の濃度であり、
ｌ（ｃｍ）は光路長である。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ １０／３００カラム（スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、０．５ｍＬ／分の流速で実施した。緩衝液は、錠剤（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−４４１７）から調製されたＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理食塩水）、即ち、１０ｍＭリン酸塩、０．１３７Ｍ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４である。

ｍＡｂを用いるプロトタイプでのクロマトグラフィー
緩衝液は、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０又は６．５とした。所望される導電率、約５又は１２ｍＳ／ｃｍに応じて、３５又は１００ｍＭのＮａＣｌを含めた。溶出緩衝液（Ｂ−緩衝液）は、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５とした。流速は０．５ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）とした。

ＭＡｂ−ｒプロテインＡを用いるプロトタイプでのクロマトグラフィー
Ａ−緩衝液は２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．０とした。導電率は、５０ｍＭ ＮａＣｌを添加して約７ｍＳ／ｃｍとし、Ｂ−緩衝液は、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０とした。流速は０．５ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）とした。試料濃度は、ＭＡｂを４ｍｇ／ｍＬ、ｒＰｒＡを０．０４ｍｇ／ｍＬ（１％（ｗ／ｗ）に相当）とした。

ＣＩＰ（ＣＩＰ洗浄）
各クロマトグラフィーランの後に、プロトタイプ及び対照マトリックスＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦを次のＣＩＰ処置にかけた。

プロテインＡの分析
選択した画分を、８００μＬのＳＰＡ試料希釈液＋２００μＬ試料の比率でＳＰＡ試料希釈液と混合した。混合後、画分を加熱ブロック上、９９℃で１０分間加熱し、次いで、再混合した。次いで、試料を組換えプロテインＡについて分析した。

宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の分析
試料（最小で６００μＬ）をＨＣＰ含有量について分析した。検出下限は１０ｎｇ／ｍＬである。

実施例２Ｂ
プロトタイプリガンドＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（９０１０３５Ａ）で精製したＭＡｂ−１含有試料
５０ｍｇのＭＡｂ１を含む試料を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦに固定化し、上記の実施例１に記載した通りに調製したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン（９０１０３５Ａ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦに固定化したＮ，Ｎ−ジメチルベンジルアミン（９０１０３５Ｂ）及び対照マトリックスＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦに、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（〜１２ｍＳ／ｃｍ）、ｐＨ６．５で適用した。溶出は、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で実施した。

実施例２のクロマトグラムを図２に示す。図から、プロトタイプ、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ＦＦ（９０１０３５Ａ）は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦに同等であることが判る。分析用に選択した通過液（ＦＴ）画分は矢印で示す。下表２及び３に示すＨＣＰ及びプロテインＡの除去に関する結果は、プロトタイプが、この点でＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦより優れていることを示している。

実施例３
プロトタイプリガンド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンでの、ＭＡｂ１及び組換えプロテインＡ（ｒＰｒＡ）を含む試料からの通過液中のＭＡｂ１の精製
この実施例では、Ａｂ１−ｒプロテインＡを含む試料についてのプロトタイプでのクロマトグラフィーを実施した。Ａ−緩衝液は、２５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０とした。導電率は約７ｍＳ／ｃｍであった。Ｂ−緩衝液は、０．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０とした。流速は０．５ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時間）であった。試料は、ｍＡｂ１が４ｍｇ／ｍＬ、ｒプロテインＡが１％（ｗ／ｗ）の濃度の、１０ｍｇのｍＡｂ１、０．１０ｍｇのｒＰｒＡとした。結果を図３に示す。

最後に、ｍＡｂ１、１％ｒＰｒＡを含む試料、図４のクロマトグラフィーランからのプールした通過液及び溶出画分に関する分析ＳＥＣを実施した。結果を図４に示す。図４ａで、斜線ピークはＭＡｂ１−プロテインＡの複合体である。青色の曲線は通過液（ＦＴ）画分であり、赤線は溶出液である。

実施例４
吸着方式
４Ａ）実験配置
吸着方式でのＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＢＭＥＡ；Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン）の選択性を試験するために、ヒトＩｇＧ及び８種の異なるタンパク質の保持時間を試験した。結果を、市販の陰イオン交換体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗと比較した。試験方法の原理は、タンパク質を、Ａ−緩衝液（緩衝液成分としてピペラジンを含む）で平衡化したＨＲ５／５カラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに固定したＢＭＥＡリガンドを含む）中に注入するものである。タンパク質の溶出には塩勾配を使用した（下記の方法を参照のこと）。

材料／調査単位
カラム及びＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。
ＨＲ ５／５（商標）：カタログ番号１８−０３３８−０１ カラム体積ＣＶ＝１ｍＬ。

装置
クロマトグラフィー装置 ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ（商標）１０。

化学薬品及び試料
タンパク質、卵白アルブミン、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、α−ラクトアルブミン、ミオグロビン、ラクトフェリン、リボヌクレアーゼＡ及びシトクロムＣはＳｉｇｍａから購入し、ヒトＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）はＯｃｔａｐｈａｒｍａから購入した。タンパク質は、Ａ−緩衝液に１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗはスウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。使用したすべての化学薬品は分析級であり、水はＭｉｌｌｉＱで濾過した。

クロマトグラフィー
１００μｌの試料用液を適用する前に、０．６ｍｌ／分の流速のＡ−緩衝液でカラムを平衡化した。１回に１種のタンパク質のみを分析した。緩衝液Ａから緩衝液Ｂまで２１カラム容積の勾配容積を用いる線形勾配によってタンパク質を溶出した（下記の方法を参照のこと）。緩衝液Ａは、２５ｍＭピペラジン、ｐＨ１０．０とし、緩衝液Ｂは、２５ｍＭピペラジン、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０とした。ラン中はすべて２８０ｎｍでの吸光度を検出した。

結果
ＢＭＥＡリガンドが、免疫グロブリンと選択的に相互作用するか否かを立証するために、新規媒体を充填した１ｍｌカラム（ＨＲ５／５）にヒトＩｇＧを適用した。更に、タンパク質卵白アルブミン、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、α−ラクトアルブミン、ミオグロビン、ラクトフェリン、リボヌクレアーゼＡ及びシトクロムＣも適用した。結果を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗで観察されたタンパク質の保持時間と比較した。Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、強陰イオン交換体であり、それは同一の担体マトリックス（担体材料、ビーズ径、細孔径、細孔容積、充填方法など）を有し、本質的に同一の置換度（イオン交換容量として測定して）を有するので、対照の陰イオン交換体として使用される。表１から明らかなように、ＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、調べたすべてのタンパク質を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比べてより強力に遅延させた。更に、ＩｇＧは、ＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗで最も長い保持時間を与えるタンパク質であった（表１）。これは、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに対するよりもＢＭＥＡ媒体に対するはるかにより強い結合を反映している。ＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用すると、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗに比べ、ＩｇＧの保持時間が２７．３分増加する（表１）。これらの結果は、ＢＭＥＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用して、選択的方式でＩｇＧを捕捉し、溶出できることを明瞭に示している。

本発明による例示的クロマトグラフィーリガンド、即ちそのアミンを経由して担体にカップリングしているＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを示す図である。 前に説明したような、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６ ＦＦに固定したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンドを含む分離マトリックス及び対照としての強陰イオン交換体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ上でのモノクロナール抗体の分離クロマトグラムを示す図である。 ｍＡｂ１−ｒプロテインＡの混合物についてリガンドプロトタイプで実施したクロマトグラフィーの結果を示す図である。 ｍＡｂ１−ｒプロテインＡの混合物についてリガンドプロトタイプで実施したクロマトグラフィーの結果を示す図である。 ＭＡｂ１、１％ｒＰｒＡを含む試料、プールした通過液及び図３のクロマトグラフィーランからの溶出画分に関する分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す図である。 ＭＡｂ１、１％ｒＰｒＡを含む試料、プールした通過液及び図３のクロマトグラフィーランからの溶出画分に関する分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す図である。 ＭＡｂ１、１％ｒＰｒＡを含む試料、プールした通過液及び図３のクロマトグラフィーランからの溶出画分に関する分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す図である。

Claims (10)

1. 次式で定義されるクロマトグラフィーリガンドをそのアミン基を介して担体にカップリングしてなる分離マトリックス。
   Ｒ₁−Ｒ₂−Ｎ（Ｒ₃）−Ｒ₄−Ｒ₅
   式中、
   Ｒ₁は、置換又は非置換フェニル基であり、
   Ｒ₂は炭素原子数０〜４の炭化水素鎖であり、
   Ｒ₃は炭素原子数１〜３の炭化水素鎖であり、
   Ｒ₄は炭素原子数１〜５の炭化水素鎖であり、
   Ｒ₅はＯＨ又はＨである。
2. Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃及びＲ₄の１以上がＯＨで置換されている、請求項１記載の分離マトリックス。
3. Ｒ₁が非置換フェニル基である、請求項１又は請求項２記載の分離マトリックス。
4. Ｒ₂が−ＣＨ₂−である、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分離マトリックス。
5. Ｒ₃が−ＣＨ₃である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の分離マトリックス。
6. Ｒ₄が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−又は−ＣＨ₂−ＣＨ₂−である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の分離マトリックス。
7. 前記リガンドがＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の分離マトリックス。
8. 前記担体が粒子を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の分離マトリックス。
9. 前記担体が球状粒子を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の分離マトリックス。
10. 前記担体がメンブラン構造を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の分離マトリックス。

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