ES2614929T3

ES2614929T3 - Material no viable derivado de probióticos, para la prevención y tratamiento de alergias

Info

Publication number: ES2614929T3
Application number: ES10757324.8T
Authority: ES
Inventors: Eric A.F. Van Tol; William Michael Russell; Udo Herz; Harald Renz; Holger Garn; Machtelt Braaksma; Maria Johanna Van Der Werf; Karin M. Overkamp
Original assignee: MJN US Holdings LLC
Current assignee: MJN US Holdings LLC
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2017-06-02
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: SG178230A1; RU2012114190A; IN2012DN00951A; US20110217402A1; JP2013504321A; KR20120061836A; TWI595090B; AU2010293145A1; EP2475764A1; WO2011031149A1; TW201124529A; PE20121557A1; EP2475764B1; ECSP12011786A; MX345077B; BR112012005533A2; EP2295535A1; PL2475764T3; CN102575224A; NZ597818A

Abstract

Un producto nutricional que comprende una composición que incluye una mezcla proteinácea, donde dicha composición es obtenible de un sobrenadante de cultivo en una fase exponencial tardía de un proceso de cultivación en lote de LGG, para uso en el tratamiento o prevención de enfermedades alérgicas.

Description

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DESCRIPCION

Material no viable derivado de probioticos, para la prevencion y tratamiento de alergias Campo de la invencion

La invencion se relaciona con un metodo para cosechar materiales biologicamente activos, no viables, de la cepa bacteriana probiotica Lactobacillus rhamnosus Goldin Gorbach (LGG). Particularmente, la invencion se relaciona con un proceso para la preparacion de un material probiotico antialergico, obtenible mediante dicho metodo de cosecha, y con productos dieteticos o nutricionales que comprenden dicho material probiotico.

Fundamento de la invencion

Lactobacillus GG (Lactobacillus G.G., cepa ATCC 53103) es una bacteria que ocurre naturalmente en el tracto digestivo humano. Es una bacteria muy estudiada, de beneficio para la salud generalmente reconocido. Es ampliamente reconocida como un probiotico, y consecuentemente incorporada en muchos productos nutricionales, tales como productos lacteos, suplementos nutricionales, formulas infantiles, y similares.

Los probioticos estan actualmente definidos en la tecnica como microorganismos vivos que cuando son administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio de salud al huesped. Sin embargo, la naturaleza viva de los probioticos trae consigo desaffos cuando se incorporan en los productos nutricionales. Estos desaffos pueden variar en orden de magnitud dependiendo de, entre otros, el tipo de cepa probiotica usada, el estado de salud del individuo que recibe el producto, o ambos. Tambien, desde el punto de vista de un proceso tecnologico, se requiere superar considerables obstaculos cuando se incorporan microorganismos vivos en los productos. Particularmente, esto juega un papel si uno fuera a incorporar probioticos en productos larga vida, por ejemplo productos en polvo tales como formulas infantiles. Tambien, los desaffos aumentan con el incremento en la complejidad de las matrices de los productos nutricionales.

En particular, respecto a los productos dieteticos para en mujeres embarazadas, ninos e infantes, el uso de bacterias probioticas esta sujeto a evaluacion adicional respecto a la inocuidad y eficacia. Las preguntas espedficas respecto a inocuidad se refieren a los posibles efectos en el uso de nutrientes, la exclusion de transferencia de resistencia a antibioticos y los efectos en el corto y largo plazo sobre la colonizacion intestinal, respuesta inmune e infecciones. Mientras esta no indica que los probioticos no podnan ser usados en tales productos, se anade a la complejidad practica de usar bacterias vivas o de otro modo viables.

Por otro lado, especialmente en el caso de productos dieteticos para infantes y ninos, existe una demanda importante para el suministro de los efectos beneficos de los probioticos. Ademas, es particularmente desafiante asegurar la estabilidad y vitalidad de las bacterias viables en los productos nutricionales que se ponen a disposicion a traves de canales de venta al por menor u hospitales y expuestos a temperatura ambiente. A este respecto, el uso de productos bacterianos, a traves de la aplicacion de sobrenadantes de cultivos (procesados), suministranan considerables ventajas.

Se sabe que la microflora intestinal en infantes esta mucho menos desarrollada que la de un adulto. Mientras la microflora del humano adulto consiste en mas de 1013 microorganismos y cerca de 500 especies, donde algunas son daninas y algunas son beneficas, la microflora de un infante contiene solo una fraccion de aquellos microorganismos, tanto en numero absoluto como tambien en diversidad de especies. Los infantes nacen con un intestino esteril, pero adquieren flora intestinal del canal natal, su ambiente inicial, y lo que ellos ingieren. Dado que la poblacion de microflora intestinal es muy inestable en la vida neonatal temprana, frecuentemente es diffcil para el intestino del infante mantener el delicado balance entre bacterias perjudiciales y beneficas, reduciendo asf la capacidad del sistema inmune para funcionar normalmente.

Es especialmente diffcil para infantes alimentados con formulas, mantener este balance, debido a las diferencias entre las especies bacterianas en el intestino de un infante alimentado con formulas y amamantado. Las heces de infantes amamantados contienen predominantemente Bifidobacterium, con Streptococcus y Lactobacillus como contribuyentes menos comunes. En contraste, la microflora de infantes alimentados con formulas, es mas diversa, conteniendo Bifidobacterium y Bacteroides asf como las especies mas patogenas Staphylococcus, Escherichia coli, y Clostridia. Las especies variadas de Bifidobacterium en las heces de infantes amamantados y alimentados con formulas, difieren tambien. Se ha propuesto una variedad de factores como la causa para la diferente flora fecal de infantes amamantados y alimentados con formulas, incluyendo el menor contenido y diferente composicion de protemas en la leche humana, un menor contenido de fosforo en la leche humana, la gran variedad de oligosacaridos en leche humana, y numerosos mediadores humorales y celulares de la funcion inmunologica en la leche de pecho. Agostoni, et al., Probiotic Bacteria in Dietetic Products for Infants: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition, J. Pediatr. Gastro. Nutr. 38:365-374 (Abril 2004).

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El establecimiento de una flora bacteriana intestinal normal tiene importantes implicaciones para la salud y enfermedades. La mayor funcion de la microbiota intestinal, desde el punto de vista el huesped, es prevenir la colonizacion del intestino con organismos patogenos e inhibir la proliferacion de microorganismos potencialmente patogenos, aumentando la resistencia natural a enfermedades infecciosas del tracto intestinal. Los probioticos ejercen este efecto previniendo la union de bacterias patogenas a los enterocitos, bien sea directamente produciendo compuestos antimicrobianos, o indirectamente alterando el pH del lumen intestinal a traves de la smtesis de acidos grasos volatiles de cadena corta.

Adicionalmente, la flora normal podna estimular la inmunidad gastrointestinal, mejorar la produccion de IgA de mucosas, estimular la produccion local de citoquinas antiinflamatorias y reducir la generacion de citoquinas proinflamatorias, caractensticas de la inflamacion alergica. Una revision de los estudios mas relevantes relacionados con el uso de probioticos en alergias alimentarias, dermatitis atopica, y prevencion primaria de atopfa ha mostrado que la terapia con probioticos alivia la inflamacion alergica, como se demuestra por el control de smtomas clmicos y la reduccion de marcadores inflamatorios locales y sistemicos (Miraglia del Giudice M, De Luca MG. The role of probiotics in the clinical management of food allergy and atopic dermatitis. J Clin Gastroenterol 2004;38(6 Suppl):S84-5; Prescott S , Bjorksten B, probiotics for the prevention or treatment of allergic disease. J. Allergy Clin. Immunol. 2007;120:255-262).

En vista de lo anterior, se entendera que es generalmente deseado suministrar productos nutricionales, productos dieteticos y, en particular formulas infantiles, con probioticos. El termino "formula infantil" se refiere a una composicion que satisface los requerimientos nutricionales de un infante, siendo un sustituto de la leche humana.

Tambien se entendera que se desea, particularmente en formulas infantiles, incorporar probioticos sin incorporar necesariamente bacterias vivas o de otro modo viables. De hecho, esto exige "probioticos no viables".

La investigacion sobre tales probioticos no viables esta en marcha. Sin embargo, como se establecio en un documento por Tao et al. (Am J. Physiol Cell Physiol. 290: C1018-C1030 (2006), aunque los probioticos parecen mejorar el curso de muchas enfermedades, sus mecanismos de accion son entendidos de manera deficiente. Solo recientemente se han hecho intentos para entender los mecanismos detras de sus acciones e interacciones con la celula huesped. Se han propuesto muchos diferentes mecanismos posibles, incluyendo la sobrerregulacion en la produccion de mucus, mejora en la funcion de la barrera epitelial, aumentan la produccion de IgA, aumento en la competencia por sitios de adhesion sobre el epitelio intestinal, asf como la produccion de acidos organicos, amomaco, peroxido de hidrogeno bacteriocinas, que inhiben el crecimiento de bacterias patogenas. Respecto a esto, Tao et al. presentan un estudio sobre ciertos efectos de factores solubles de LGG. Se ha concluido que cierta bioactividad reside en una fraccion de bajo peso molecular (MW < 10 kDa) de un ultra filtrado de LGG-CM. de ensenanza similar es el documento US 2007/123460. Aqrn, en lugar de bacterias vivas se usan compuestos libres de bacterias, derivados de probioticos, y particularmente una fraccion de bajo peso molecular (MW < 10 kDa), en el tratamiento de enfermedades particularmente inflamatorias del intestino (IBDs). Otras referencias que tocan probioticos no viables son por ejemplo el documento US 2004/208863, que en general se refiere a la accion antiinflamatoria de bacterias y productos secretados por ellas, y el documento US 7052896 que se relaciona con las propiedades antiinflamatorias y antialergicas de peptidos producidos por especies de Lactobacillus rhamnosus.

El documento US 6,506,389 describe una protema obtenible de un microorganismo no patogeno, donde dicha protema tiene actividad de union a la mucosa y un peso molecular DE 20-40 kD, preferiblemente 20-30 kD o un polipeptido equivalente de la misma. La esencia de la divulgacion es suministrar un metodo de discriminacion para identificacion de protemas y polipeptidos capaces de unirse de manera espedfica a la mucosa.

Ninguna de las referencias de la tecnica previa presenta un metodo de fermentacion y cosecha adecuadamente sencillo, de modo que a partir de LGG se obtenga un material probiotico no viable que soporte actividad antialergica.

Ademas, la cosecha de productos bacterianos secretados genera un problema, y es que el medio de cultivo no puede ser desprovisto facilmente de componentes indeseados. Esto se relaciona espedficamente con productos nutricionales para sujetos relativamente vulnerables, tales como formulas infantiles o nutricion clmica. So se incurre en este problema si componentes espedficos de un sobrenadante de cultivo son aislados primero, purificados y luego aplicados en un producto nutricional. Sin embargo, se desea hacer uso de un sobrenadante de cultivo mas completo. Esto servina para suministrar una composicion que refleje mejor la accion natural de los probioticos (es decir LGG). Sin embargo, actualmente no se puede usar simplemente el sobrenadante de cultivo en sf mismo como una base para materiales probioticos no viables, para que sea usado espedficamente en formulas infantiles y similares. Asf, se desea ademas suministrar un metodo para resolver esto.

Resumen de la invencion

Con objeto de atender mejor uno o mas de los anteriores deseos, la invencion, en un aspecto, presenta un

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producto nutricional que comprende una composicion que contiene una mezcla proteinacea, donde dicha composicion es obtenible a partir de un sobrenadante de cultivo en una fase exponencial tardfa de un proceso de cultivo en lote de LGG, para uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades alergicas.

En otro aspecto, la invencion es realizada sobre la base de un metodo de cosecha desde un medio de cultivo LGG de una composicion que tiene actividad antialergica, donde el metodo comprende el desarrollo de LGG en un medio de cultivo adecuado, la determinacion de la fase exponencial tardfa de crecimiento de poblacion de LGG, y la separacion del sobrenadante de cultivo en dicha fase exponencial tardfa del cultivo bacteriano.

Breve descripcion de los dibujos

Fig. 1 muestra una grafica que representa el incremento en la poblacion de LGG, con el tiempo, por cultivo; aqm, la Fig. 1a representa esto con referencia a la densidad optica (OD600) asf como un cambio de pH del medio de cultivo y la Fig. 1b presenta los recuentos bacterianos determinados por tecnicas de placa.

Fig. 2 muestra la produccion de citoquina IL-10 para las diferentes fases MJ1, MJ2, MJ3) de cosechas de cultivo LGG;

Fig.3 representa la lmea de tiempo de la sensibilizacion in vivo con ovoalbumina (OVA); el modelo de raton neonato usado en la prueba de la composicion, aplico en la invencion;

Fig. 4 representa imagenes al microscopio de tejido pulmonar tenido en ratones sometidos al modelo OVA y tratamiento oral con diferentes composiciones, incluyendo LGG viable y sobrenadante de LGG;

Fig. 5 muestra un diagrama que representa la infiltracion de celulas alergicas en los pulmones de animales alergicos a OVA; revelando reducida presencia de celulas alergicas (eosinofncas) en fluidos de lavado de pulmon tanto en ratones tratados con LGG como sobrenadante de LGG

Fig. 6 (a-c) despliega diagramas que representan las respuestas in vitro para tres diferentes citoquinas relevantes al proceso inflamatorio en enfermedad alergica; los datos muestran estfmulo superior de produccion de citoquina supresora (IL-10) por sobrenadante de LGG.

Fig. 7 presenta un esquema para una investigacion in vivo de la administracion perinatal de sobrenadante de cultivo de LGG aplicada en la invencion;

Fig. 8 muestra los resultados de reactividad alergica, como se muestra por presencia reducida de celulas alergicas (eosinofflicas) en fluidos de lavado de pulmon, por administracion perinatal de sobrenadante de cultivo de LGG aplicado en la invencion;

Descripcion detallada de las realizaciones

En un sentido amplio, la invencion se basa en la percepcion segun la cual del cultivo en lote de LGG puede cosecharse un sobrenadante de cultivo (que puede ser denominado tambien como "medio gastado"), el cual posee actividad antialergica. En el contexto de esta invencion, el termino "antialergico" incluye "actividad preventiva de alergias asf como actividad terapeutica antialergica."

Sin desear estar atados a la teona, se cree que esta actividad puede ser atribuida a la mezcla de componentes (incluyendo materiales proteinaceos, y posiblemente incluyendo materiales (exo)polisacaridos) como se encuentran liberados en el medio de cultivo en una etapa tardfa de la fase exponencial (o "log") del cultivo en lote de LGG. En lo sucesivo la composicion sera denominada como "sobrenadante de cultivo aplicado en la invencion."

LGG es una cepa probiotica aislada de la flora intestinal de un humano saludable. Fue divulgada en el documento de EEUU No. 5,032,399 de Gorbach, et al., el cual es incorporado aqm en su totalidad como referencia. LGG es resistente a la mayona de los antibioticos, estable en presencia de acidos y bilis, y se une de manera avida a las celulas de la mucosa del tracto intestinal humano. Sobrevive por 1-3 dfas en la mayona de individuos y hasta 7 dfas en el 30% de los sujetos. Adicionalmente a su habilidad para la colonizacion, LGG afecta tambien de manera benefica las respuestas inmunes de la mucosa. LGG esta depositado en la autoridad depositaria American Type Culture Collection bajo numero de acceso ATCC 53103.

Las etapas reconocidas en el cultivo en lote de bacterias son conocidas por la persona experta. Estas son las fases "lag," "log" ("logantmica" o "exponencial"), la "estacionaria" y la "muerte" (o "declinacion logantmica"). En todas las fases durante las cuales estan presentes bacterias vivas, las bacterias metabolizan nutrientes del medio, y secretan (expelen, liberan) materiales hacia el medio de cultivo. Generalmente, la composicion del material segregado en un punto dado de tiempo de las etapas de crecimiento, no es predecible.

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En la presente invencion, los materiales segregados son cosechados de una fase exponencial tardfa. La fase exponencial ta^a ocurre tiempo despues de la fase exponencial media (que es la semivida de la duracion de la fase exponencial, por ello la referencia a la fase exponencial tardfa como que es la segunda mitad del tiempo entre la fase lag y la fase estacionaria). En particular, el termino "fase exponencial tardfa" es usado aqm refiriendose a la porcion del ultimo cuarto del tiempo entre la fase lag y la fase estacionaria del proceso de cultivo en lote de LGG. Preferiblemente, de acuerdo con la invencion, la cosecha del sobrenadante de cultivo esta en un punto en tiempo de 75% a 85% de la duracion de la fase exponencial, y con maxima preferencia esta en aproximadamente 5/6 del tiempo transcurrido en la fase exponencial.

El termino "cultivo" o "cultivacion" se refiere a la propagacion de microorganismos, en este caso LGG, sobre o en un medio adecuado. Tal medio de cultivo puede ser de una variedad de clases, y es en particular un caldo lfquido, como es costumbre en la tecnica. Un caldo preferido es por ejemplo el caldo MRS como se usa generalmente para el cultivo de lactobacillus. El caldo MRS comprende generalmente polisorbato, acetato, magnesio y manganeso, que son conocidos por actuar como factores especiales de crecimiento para lactobacillus, asf como una rica base nutriente. Una composicion tfpica comprende (cantidades en g/litros): peptona de casema 10.0; extracto de carne 8.0; extracto de levadura 4.0; D(+)-glucosa 20.0; hidrogenofosfato de dipotasio 2.0; Tween® 80 1.0; citrato de triamonio 2.0; acetato de sodio 5.0; sulfato de magnesio 0.2; sulfato de manganeso 0.04.

Un uso preferido del sobrenadante de cultivo aplicado en la invencion esta en formulas infantiles. Con objeto de que la invencion sea de total uso aqm, se desea asegurar que la composicion cosechada de cultivacion de LGG no contenga componentes (como pueden estar presentes en el medio de cultivo) que no son deseados, o legalmente permitidos, en tales formulas. Respecto al polisorbato presente regularmente en caldo MRS, el medio para el cultivo de bacterias puede incluir un tensioactivo emulsificante no ionico, por ejemplo sobre la base de sorbitano polietoxilado y acido oleico (tfpicamente disponible como polisorbatos Tween®, tales como Tween® 80). Mientras estos tensioactivos son encontrados frecuentemente en productos alimenticios, por ejemplo en helado de crema, y son reconocidos generalmente como seguros, ellos no son considerados deseables o incluso aceptables en todas las jurisdicciones, para uso en productos nutricionales para sujetos relativamente vulnerables, tales como formulas infantiles con nutricion clmica.

Asf, en una realizacion preferida, la presente invencion tambien es pertinente al uso en medio de cultivo en el cual pueden evitarse los polisorbatos mencionados anteriormente. Con este fin, un medio de cultivo preferido aplicado en la invencion esta provisto de Tween 80 y puede incluir un ingrediente oleoso seleccionado de entre el grupo consistente en acido oleico, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de semilla de colza, aceite de girasol y mezclas de ellos. Se entendera que el beneficio total del ingrediente oleoso es logrado si la presencia de un tensioactivo de polisorbato es esencialmente o totalmente evitada.

Con mayor preferencia, un medio MRS esta provisto de Tween 80 y comprende, adicionalmente a uno o mas de los aceites, peptona (tfpicamente 10 g/L), extracto de carne (tfpicamente 8 g/L), extracto de levadura (tfpicamente 4 g/L), D(+) glucosa (tfpicamente 20 g/L), hidrogenofosfato de dipotasio (tfpicamente 2 g/L), trihidrato de acetato de sodio (tfpicamente 5 g/L), citrato de triamonio (tfpicamente 2 g/L), heptahidrato de sulfato de magnesio (tfpicamente 0.2 g/L) y tetrahidrato de sulfato manganoso (tfpicamente 0.05 g/L).

El cultivo es realizado generalmente a una temperatura de 20 °C a 45°C, preferiblemente a 35 °C a 40°C, y con maxima preferencia a 37°C.

El punto de tiempo preferido durante la cultivacion para la cosecha del sobrenadante de cultivo, es decir en la fase exponencial tardfa mencionada anteriormente, puede ser determinado por ejemplo con base en la OD600nm y concentracion de glucosa. OD600 se refiere a la densidad optica a 600 nm, que es una medida de densidad conocida que tiene correlacion directa con la concentracion bacteriana en el medio de cultivo.

Adicionalmente a lo anterior, debena notarse que el cultivo de lactobacillus en lote, incluyendo LGG, es conocimiento general comun disponible para la persona experta en la tecnica. Asf, estos metodos no requieren aclaracion adicional aqm.

Preferiblemente, la composicion aplicada en la invencion es producida mediante fermentacion a gran escala (por ejemplo en un fermentador de mas de 100 L, preferiblemente aproximadamente 200 L o mas).

La composicion aplicada en la invencion puede ser cosechada por cualquier tecnica conocida para la separacion de sobrenadante de cultivo de un cultivo bacteriano. Tales metodos son bien conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, centrifugacion, filtracion, sedimentacion y similares.

El sobrenadante puede ser usado inmediatamente, o ser almacenado para un uso futuro. En el ultimo caso, en general el sobrenadante sera refrigerado, congelado o liofilizado. El sobrenadante puede estar concentrado o diluido, segun se desee.

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Se cree que la composicion, cosechada de acuerdo con la invencion, comprende una composicion proteinacea. La persona experta conoce el termino "proteinaceo", e indica que la composicion comprende uno o mas de peptidos, protemas, u otros compuestos que contienen residuos de aminoacido.

En cuanto a sustancias qmmicas, se cree que la composicion del sobrenadante de cultivo aplicado en la invencion es una mezcla de una pluralidad de aminoacidos, oligo- y polipeptidos, y protemas, de diferentes pesos moleculares. Ademas, se cree que la composicion comprende estructuras de polisacaridos.

Se enfatiza, a diferencia de la tecnica, que la invencion se relaciona preferiblemente con el sobrenadante de cultivo completo, es decir no fraccionado. Se cree que la seleccion juiciosa de la cosecha en la fase exponencial tardfa mencionada anteriormente, y la retencion de virtualmente todos los componentes del sobrenadante contribuye a los resultados sorprendentes obtenidos con el, particularmente en vista de la actividad antialergica y mas particularmente en vista de tal actividad en infantes y neonatos, y mediante administracion perinatal a mujeres embarazadas, respectivamente lactantes.

El sobrenadante de cultivo completo es definido mas espedficamente como sustancialmente excluyente de componentes de bajo peso molecular, en general por debajo de 6 kDa. Esto se relaciona con el hecho segun el cual la composicion preferiblemente no incluye acido lactico y/o sales de lactato. Asf, el sobrenadante preferido aplicado en la invencion tiene un peso molecular mayor a 6kDa, en la medida en que este es el sobrenadante tfpico obtenido por retiro del acido lactico y sales de lactato. Esto involucra usualmente filtracion sobre cromatograffa en columna. De hecho, el producto retenido en esta filtracion representa un intervalo de peso molecular mayor a 6 kDa (en otras palabras, separan por filtracion constituyentes de menos de 6 kDa).

La composicion de sobrenadante aplicada en la invencion sera en general no solo proteinacea, sino que tambien comprendera polisacaridos, en particular exopolisacaridos (polfmeros de alto peso molecular compuestos por residuos de azucar como son producidos por LGG). Sin querer estar atados a la teona, se cree que la relacion entre las cantidades de materiales proteinaceos y las cantidades de materiales de carbohidrato como son cosechados de la fase exponencial tardfa como se discutio anteriormente, contribuye a la naturaleza antialergica comparada con las composiciones como son cosechadas en otras etapas, por ejemplo la fase exponencial media o la fase estacionaria.

El sobrenadante de cultivo cosechado de acuerdo con la invencion puede ser colocado en uso de diferentes formas, de modo que se tome beneficio de la actividad antialergica hallada. Tal uso en general involucrara alguna forma de administracion de la composicion aplicada en la invencion al sujeto que la necesita. Respecto a esto, el sobrenadante de cultivo puede ser usado como tal, por ejemplo incorporado dentro de capsulas para administracion oral o en una composicion nutricional lfquida tal como una bebida, o puede ser procesado antes del uso posterior. Se prefiere esta ultima.

Generalmente tal procesamiento involucra la separacion de la composicion proteinacea de la fase continua generalmente lfquida del sobrenadante. Esto es hecho preferiblemente mediante un metodo de secado, tal como secado por atomizacion o secado por congelacion (liofilizacion). Se prefiere el secado por atomizacion. En una realizacion preferida del metodo de secado por atomizacion, antes del secado por atomizacion se anadira un material vehmulo, por ejemplo maltodextrina DE29. Se cree que esto es ventajoso desde el punto de vista de la produccion de un polvo seco tambien bajo condiciones en las cuales el acido lactico (el cual es producido por LGG y que esta presente en el medio de cultivo gastado) es un lfquido.

Se ha hallado que la composicion aplicada en la invencion posee actividad antialergica (preventiva y/o terapeutica). La actividad antialergica puede ser determinada, por ejemplo en un modelo recientemente desarrollado de raton neonatal de sensibilizacion alergica e inflamacion del pulmon. Este modelo es en efecto una adaptacion del denominado modelo OVA, el cual es usado ampliamente para estudiar la patologfa inmune de enfermedades alergicas y asma asf como para identificar compuestos con actividad antialergica. Las enfermedades alergicas incluyen, pero no estan limitadas a asma (que puede estar basada en alergia), eczema atopico (que tambien puede estar basado en alergia), alergia alimentaria y rinitis/conjuntivitis alergicas.

Para que la composicion aplicada en la invencion ejerza su efecto benefico, antialergico, tiene que ser digerida por un sujeto, preferiblemente un sujeto humano. Particularmente, en una realizacion preferida, el sujeto es una mujer embarazada, una mujer lactante, un neonato, un infante o un nino. Como se menciono anteriormente, las ventajas de usar un material que podna ser mirado como "probiotico no viable" sera aprovechada por la mayona en productos dieteticos para infantes. El termino "infante" indica un humano postnatal de menos de aproximadamente 1 ano de edad.

Se entendera que la digestion por parte de un sujeto requerira la administracion oral de la composicion aplicada en la invencion. La forma de administracion de la composicion de acuerdo con la invencion no es cntica. En algunas realizaciones, la composicion es administrada a un sujeto mediante comprimidos, pfldoras, encapsulados,

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comprimidos en capsula, capsulas de gel, capsulas, gotas de aceite o bolsitas. En otra realizacion, la composicion esta encapsulada en un azucar, grasa o polisacarido.

Aun en otra realizacion, la composicion es anadida a un alimento o bebida y consumida. El alimento o bebida puede ser un producto nutricional para ninos, tal como una formula de seguimiento, leche de crecimiento, bebida, leche, yogur, jugo de frutas, bebida a base de frutas, comprimido masticable, galleta, galleta quebradiza o un polvo de leche. En otras realizaciones, el producto puede ser un producto nutricional para infantes, tal como una formula infantil o un producto de fortificacion de leche humana.

La composicion aplicada en la invencion, bien sea anadida en una forma separada de dosificacion o a traves de un producto nutricional, sera administrada generalmente en una cantidad efectiva en el tratamiento o prevencion de alergias. La cantidad efectiva es equivalente preferiblemente a 1x104 a aproximadamente 1x1012 equivalentes celulares de bacterias probioticas vivas por kg de peso corporal por dfa, y mas preferiblemente 108-109. El calculo inverso hasta equivalentes celulares esta bien dentro del ambito del conocimiento de la persona experta.

Si la composicion aplicada en la invencion es administrada a traves de una formula infantil, la formula infantil puede ser nutricionalmente completa y contener tipos y cantidades adecuados de lfpido, carbohidratos, protema, vitaminas y minerales. La cantidad de lfpido o grasa puede variar tfpicamente desde aproximadamente 3 a aproximadamente 7 g/100 kcal. Las fuentes de lfpido pueden ser cualquiera conocida o usada en la tecnica, por ejemplo aceites vegetales tales como aceite de palma, aceite de soja, olema de palma, aceite de coco, aceite de trigliceridos de cadena media, aceite de girasol alto en acido oleico, aceite de cartamo alto en acido oleico y similares. La cantidad de protema puede variar tfpicamente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 g/100 kcal. Las fuentes de protema pueden ser cualquiera conocida o usada en la tecnica, por ejemplo leche descremada, protema de suero, casema, protema de soja, protema (parcial o extensamente) hidrolizada, aminoacidos y similares. La cantidad de carbohidratos puede variar tfpicamente desde aproximadamente 8 a aproximadamente 12 g/100 kcal. las fuentes de carbohidrato pueden ser cualquiera conocida y usada en la tecnica, por ejemplo lactosa, glucosa, solidos de jarabe de mafz, maltodextrinas, sacarosa, almidon, solidos de jarabe de arroz y similares.

De manera conveniente, pueden usarse productos nutricionales comercialmente disponibles para prenatales, prematuros, infantes y ninos. Por ejemplo, Expecta® Enfamil®, formula para prematuros Enfamil®, Lactofree ®, Nutramigen®, Gentlease®, Pregestimil ®, ProSobee®, Enfakid®, Enfaschool®, Enfagrow®, Kindercal® (disponible de Mead Johnson & Company, Evansville, Ind., EEUU) pueden ser suplementados con niveles adecuados de composicion aplicada en la invencion.

En una realizacion, la composicion aplicada de la invencion puede combinarse con uno o mas probioticos viables. Cualquier probiotico viable conocido en la tecnica puede ser aceptable en esta realizacion, siempre que logre el resultado pretendido.

Si un probiotico viable es administrado en combinacion con la composicion aplicada en la invencion, la cantidad de probiotico viable puede corresponder a entre aproximadamente 1*104 y 1*1012 unidades formadoras de colonia (cfu) por kg de peso corporal por dfa. En otra realizacion, los probioticos viables pueden comprender entre aproximadamente 1*106 y 1*1012 cfu por kg de peso corporal y por dfa. Aun en otra realizacion, los probioticos viables pueden comprender aproximadamente 1*109 cfu por kg de peso corporal por dfa. En una realizacion todavfa adicional, los probioticos viables pueden comprender aproximadamente 1*1010 cfu por kg de peso corporal por dfa.

En otra realizacion, la composicion aplicada en la invencion puede ser combinada uno o mas prebioticos. Un "prebiotico" indica un ingrediente alimenticio no digerible que estimula el crecimiento y/o actividad de probioticos. Cualquier prebiotico conocido en la tecnica sera aceptable en esta realizacion, siempre y cuando logre el resultado deseado. Los prebioticos utiles en la presente invencion pueden incluir lactulosa, gluco-oligosacaridos, inulina, polidextrosa, galacto-oligosacaridos, fructooligosacaridos, isomalto-oligosacaridos, oligosacaridos de soja, lactosacarosa, xilo-oligosacaridos, y gentio-oligosacaridos.

En aun otra realizacion de la presente invencion, la formula infantil puede contener otros agentes activos tales como LCPUFAs. Los LCPUFAs adecuados incluyen, pero no estan limitados a acido [alfa]-linoleico, acido [gamma]-linoleico, acido linoleico, acido linolenico, acido eicosapentanoico (EPA), acido araquidonico (ARA) y/o acido docosohexaenoico (DHA). En una realizacion, la composicion aplicada en la invencion es administrada en combinacion con DHA. En otra realizacion, la composicion aplicada en la invencion es administrada en combinacion con ARA. En aun otra realizacion, la composicion aplicada en la invencion es administrada en combinacion con DHA y ARA. Las formulas infantiles comercialmente disponibles que contienen DHA, ARA, o una combinacion de ellos pueden ser suplementadas con la composicion aplicada en la invencion y usadas en la presente invencion. Por ejemplo, Enfamil® LIPIL®, que contiene niveles efectivos de DHA y ARA, esta

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comercialmente disponible y puede ser suplementado con la composicion aplicada en la invencion y utilizado en la presente invencion. Si se incluye, la cantidad efectiva de ARA en una realizacion de la presente invencion es tfpicamente desde aproximadamente 5 mg por kg de peso corporal por dfa hasta aproximadamente 150 mg per kg de peso corporal por dfa. En una realizacion de esta invencion, la cantidad vana desde aproximadamente 10 mg per kg de peso corporal por dfa hasta aproximadamente 120 mg per kg de peso corporal por dfa. En otra realizacion, la cantidad vana desde aproximadamente 15 mg per kg de peso corporal por dfa hasta aproximadamente 90 mg per kg de peso corporal por dfa. En aun otra realizacion, la cantidad vana desde aproximadamente 20 mg per kg de peso corporal por dfa hasta aproximadamente 60 mg per kg de peso corporal por dfa. Si se utiliza la formula infantil, la cantidad de DHA en la formula infantil puede variar desde aproximadamente 5 mg/100 kcal hasta aproximadamente 80 mg/100 kcal. En una realizacion de la presente invencion, DHA vana desde aproximadamente 10 mg/100 kcal hasta aproximadamente 50 mg/100 kcal; y en otra realizacion, desde aproximadamente 15 mg/100 kcal hasta aproximadamente 20 mg/100 kcal. En una realizacion particular de la presente invencion, la cantidad de DHA es aproximadamente 17 mg/100 kcal. Si se usa una formula infantil, la cantidad de ARA en la formula infantil puede variar desde aproximadamente 10 mg/100 kcal hasta aproximadamente 100 mg/100 kcal. En una realizacion de la presente invencion, la cantidad de ARA vana desde aproximadamente 15 mg/100 kcal hasta aproximadamente 70 mg/100 kcal. En otra realizacion, la cantidad de ARA vana desde aproximadamente 20 mg/100 kcal hasta aproximadamente 40 mg/100 kcal. En una realizacion particular de la presente invencion, la cantidad de ARA es de aproximadamente 34 mg/100 kcal. Si se usa una formula infantil, la formula infantil puede ser suplementada con aceites que contienen DHA y ARA, usando tecnicas estandar conocidas en la tecnica. Por ejemplo pueden anadirse DHA y ARA a la formula, reemplazando una cantidad equivalente de un aceite, tal como aceite de girasol alto del acido oleico, normalmente presente en la formula. Como otro ejemplo, pueden anadirse a la formula los aceites que contienen DHA y ARA, reemplazando una cantidad equivalente del resto de la mezcla de grasa total normalmente presente en la formula, sin DHA y ARA. Si se utiliza, la fuente de DHA y ARA puede ser cualquier fuente conocida en la tecnica, tal como aceite marino, aceite de pescado, aceite de celula individual, lfpido de yema de huevo, lfquido cerebral y similares. En algunas realizaciones, los DHA y ARA son suministrados por el aceite Martek de celula individual, DHASCO®, o variaciones de el. El DHA y ARA pueden estar en forma natural, siempre y cuando el resto de la fuente de LCPUFA no de como resultado ningun efecto perjudicial sustancial en el infante. De modo alternativo el DHA y ARA pueden ser usados en forma refinada. En una realizacion de la presente invencion, son fuentes de DHA y ARA los aceites de celula individual como lo ensenan los documentos 5,374,567; 5,550,156; y 5,397,591, cuyas divulgaciones se incorporan aqu en su totalidad como referencia. Sin embargo, la presente invencion no esta limitada solo a tales aceites. En una realizacion, se usa una fuente de LCPUFA que contiene EPA en combinacion con al menos una composicion aplicada en la invencion. En otra realizacion, se usa una fuente de LCPUFA que esta sustancialmente libre de EPA, en combinacion con al menos una composicion aplicada en la invencion. Por ejemplo, en una realizacion de la presente invencion, se suplementa una formula infantil que contiene menos de 16 mg EPA/100 kcal, con la composicion aplicada en la invencion. En otra realizacion, se suplementa una formula infantil que contiene menos de aproximadamente 10 mg EPA/100 kcal, con la composicion aplicada en la invencion. En todavfa otra realizacion, se suplementa una formula infantil que contiene menos de aproximadamente 5 mg EPA/100 kcal, con la composicion aplicada en la invencion.

Otra realizacion de la invencion incluye una formula infantil suplementada con la composicion aplicada en la invencion, que esta libre de cantidades incluso trazas de EPA. Se cree que el suministro de una combinacion de la composicion aplicada en la invencion con DHA y/o ARA suministra efectos complementarios o sinergicos respecto a las propiedades antialergicas de formulaciones que contienen estos agentes.

En una realizacion preferida adicionalmente, el producto dietetico para uso de acuerdo con la invencion comprende uno o mas materiales bio-activos normalmente presentes en la leche humana de pecho, tal como protemas o polisacaridos.

La composicion aplicada en la invencion es usada preferiblemente con objeto de prevenir, reducir, mejorar o tratar alergias y/o smtomas de ellas.

Se define alergia como una "hipersensibilidad anormal a una sustancia que es normalmente tolerada y generalmente considerada inofensiva." Los smtomas de alergias pueden variar desde un flujo nasal hasta un choque anafilactico. Cerca de 50 millones de estadounidenses sufren de enfermedades alergicas, y la incidencia de estas enfermedades esta aumentando.

Hay dos fases basicas involucradas en la respuesta alergica. La primera etapa involucra el desarrollo de la fase temprana de una respuesta de hipersensibilidad de tipo inmediato a los alergenos. La primera vez que un alergeno encuentra el sistema inmune, no ocurre reaccion alergica. En lugar de ello, el sistema inmune se prepara para futuros encuentros con el alergeno. Los macrofagos, que son celulas carroneras, y las denominadas celulas dendnticas rodean y rompen el alergeno invasor. Las celulas entonces despliegan los fragmentos de alergeno sobre sus paredes celulares a los linfocitos T, los cuales son los principales coordinadores de la reaccion inmune

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del cuerpo. Esta senal cognitiva mas varias senales no cognitivas (por ejemplo citoquinas) activan las celulas T vfrgenes e instruyen la diferenciacion de celulas T en subpoblaciones de efector de celula T. vfrgenes Los jugadores clave en la cascada alergica son las celulas T del fenotipo Th-2 (TH-2). Las celulas T de tipo TH-2 se caracterizan por la secrecion de varias citoquinas incluyendo interleuquina-4 (IL-4), IL-5 y IL-13. Las citoquinas IL-4 y IL-13 activan entonces los linfocitos B para producir anticuerpos de la subclase E (IgE) que se dirigen contra el alergeno particular. La interaccion de anticuerpos IgE espedficos sobre la superficie de las celulas efectoras (mastocitos y basofilos) con un alergeno, desencadena la fase temprana de respuesta de hipersensibilidad de tipo inmediato.

Esta activacion de mastocitos ocurre usualmente dentro de minutos despues de la segunda o adicional exposicion a un alergeno. Los anticuerpos IgE sobre los mastocitos, construidos durante la fase de sensibilizacion, reconocen el alergeno y se unen al invasor. Una vez que el alergeno esta unido al receptor, los granulos en los mastocitos liberan sus contenidos. Estos contenidos, o mediadores, son sustancias proinflamatorias tales como histamina, factor activador de plaquetas, prostaglandinas, citoquinas y leucotrienos. Estos mediadores realmente desencadenan el ataque alergico. La histamina estimula la produccion de moco y causa enrojecimiento, hinchamiento e inflamacion. Las prostaglandinas constrinen las vfas respiratorias y agrandan los vasos sangumeos.

La segunda fase de la respuesta inmune alergica esta caracterizada por la infiltracion de celulas inflamatorias, tales como eosinofilos, en las vfas respiratorias despues de la exposicion al alergeno. Una asociacion importante entre la sensibilizacion y la inflamacion esta representada por las celulas T que segregan mediadores no solo involucrados en la smtesis de IgE, sino que tambien son responsables por el reclutamiento, activacion y supervivencia de eosinofilos. El tejido de mastocitos y celulas circundantes producen mensajeros qmmicos que dan senal a los basofilos, eosinofilos y otras celulas circulantes, para que migren dentro de ese tejido y ayuden a luchar contra el material extrano. Los eosinofilos secretan sustancias qmmicas por sf mismos, que sostienen la inflamacion, causan dano de los tejidos, y reclutan aun mas celulas inmunes. Esta fase puede ocurrir en cualquier momento entre varias horas y varios dfas despues de la exposicion alergica, y puede durar horas e incluso dfas.

La alergia respiratoria es un tipo particular de alergia que afecta el tracto respiratorio. El revestimiento de las vfas respiratorias desde la nariz hasta los pulmones es similar en estructura, y frecuentemente es afectado de modo similar por el proceso alergico. Por ello, un alergeno que afecta la nariz o senos tambien podna afectar los pulmones.

Por ejemplo, la rinitis alergica, tambien conocida como fiebre del heno, es causada por reacciones alergicas de las membranas mucosas en la nariz y vfas respiratorias, a los alergenos en el aire. Los smtomas de rinitis alergica incluyen frecuentemente picazon en la nariz, garganta y ojos y excesivos estornudos. Frecuentemente sigue congestion y flujo nasal.

Dado que los alergenos en un area del tracto respiratorio pueden afectar otras areas del tracto respiratorio, la rinitis en los pasajes nasales puede conducir a asma, la cual es una enfermedad mucho mas seria que ocurre en las vfas respiratorias inferiores de los pulmones. El asma se caracteriza por el desarrollo de hiperreactividad de las vfas respiratorias, disnea, sibilancias en la exhalacion, tos seca y un sentimiento de opresion en el pecho. La exposicion repetida a un alergeno puede sostener la respuesta inmune inflamatoria en las vfas respiratorias, dando como resultado una remodelacion de las vfas respiratorias, comunmente conocida como asma cronica. No toda persona con rinitis alergica desarrollara smtomas de asma, pero un numero significativo, especialmente aquellos con alergias recurrentes no tratadas, mostraran cambios de inflamacion de los pulmones. Cerca de 40% de la gente con rinitis alergica desarrollara realmente asma en estado avanzado.

Si la inflamacion nasal que acompana la rinitis alergica alcanza los senos, el resultado puede ser una infeccion incomoda llamada sinusitis, o rino-sinusitis, en la cual los senos no pueden vaciarse a sf mismos de bacterias. Los smtomas incluyen congestion nasal, flujo nasal, garganta adolorida, fiebre, dolor de cabeza, fatiga y tos, asf como dolor en la frente, detras de las mejillas, e incluso dolor de dientes y mandfbula.

Las alergias respiratorias son una de las aflicciones mas comunes de la infancia. Como con los adultos, las alergias respiratorias en ninos aparecen con mayor probabilidad en la forma de rinitis alergica y asma.

La prevencion de alergias respiratorias es especialmente importante en infantes y ninos pequenos, dado que parece que la sensibilizacion alergica temprana a los alergenos esta asociada con un retraso en la maduracion de las respuestas inmunes normales. Adicionalmente, la sensibilizacion alergica es considerada generalmente el primer paso en el desarrollo de enfermedad atopica. Baena-Cagnani, Role of Food Allergy in Asthma in Childhood, Allergy. Clin. Immun. 1(2):145-149 (2001). Frecuentemente, el asma que comienza temprano en la vida esta asociada con la atopfa, asf la sensibilizacion alergica temprana parece jugar un papel importante en el asma persistente tambien. Martinez, F., Development of Wheezing Disorders and Asthma in Preschool Children, Pediatr.

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109:362-367 (2002).

No solo hay una fuerte asociacion entre la sensibilizacion alergica y el asma, sino que la asociacion parece ser dependiente de la edad. Aunque algunos ninos se tornan sensibilizados por los alergenos durante los primeros pocos anos de vida, la gran mayona de aquellos que se tornan sensibilizados durante este penodo desarrollan mas tarde en la vida smtomas similares al asma. Martinez, F., Viruses and Atopic Sensitization in the First Years of Life, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162:S95-S99 (2000). Asf, es importante encontrar vfas para prevenir la sensibilizacion temprana a los alergenos, reactividad alergica, y prevenir alergias respiratorias mas tarde en la vida.

Existe evidencia creciente de que muchos aspectos de salud y enfermedad son determinados no solo durante la infancia, sino tambien durante el embarazo. Esto es especialmente cierto con enfermedades alergicas, donde las respuestas inmunes en el nacimiento implican exposicion intrauterina como un evento de sensibilizacion primaria. Por ejemplo, las celulas T espedficas de alergenos estan ya presentes en el nacimiento, y la sensibilizacion temprana a los alergenos alimentarios es identificada como predictor de desarrollo posterior de alergias respiratorias. IHi, et al., The Natural Course of Atopic Dermatitis from Birth to Age 7 Years and the Association with Asthma, Clin. Exp. Allergy 27:28-35 (1997). Adicionalmente, el desarrollo de los pulmones comienza muy temprano despues de la fertilizacion y continua por al menos dos o tres anos despues del nacimiento. Asf, tanto el desarrollo prenatal como postnatal de las rutas respiratorias, son importantes en la patogenesis de alergias respiratorias en infantes y ninos.

Tambien se ha mostrado que el feto humano desarrolla celulas B que producen IgE, temprano en la gestacion y que es capaz de producir anticuerpos IgE en respuesta a estfmulos antigenicos apropiados, de una manera analoga a las bien reconocidas respuestas IgM que se observan en diferentes infecciones prenatales. Weil, G., et al., Prenatal Allergic Sensitization to Helminth Antigens in Offspring of Parasite-Infected Mothers, J. Clin. Invest. 71 1124-1129 (1983). Esto ilustra tambien la importancia de prevenir la sensibilizacion alergica tanto prenatal como postnatal, a los alergenos respiratorios.

[0068] Las medicaciones tradicionales para alergias respiratorias incluyen antihistammicos, esteroides nasales topicos, descongestionantes, y solucion de cromolina. Como una alternativa a las medicaciones tradicionales, los probioticos han emergido como tratamientos posibles para ciertos tipos de alergias. Con referencia a las limitaciones mencionadas anteriormente en el uso de probioticos viables o vivos, la presente invencion es de particular beneficio en la sustitucion de tales probioticos en productos que sirven para prevenir, reducir, mejorar o tratar enfermedades alergicas y/o smtomas de los mismos. Con este fin, la composicion es administrada preferiblemente a traves de un producto dietetico nutricional, mas preferiblemente una formula o composicion nutricional prenatal, para infantes o ninos, un alimento medico, o un alimento para propositos medicos espedficos (es decir un alimento etiquetado para un proposito medico definido), mas preferiblemente una formula infantil, o nutricion perinatal para mujeres embarazadas o lactantes, como se discute sustancialmente a continuacion. Adicionalmente, la invencion tambien habilita el suministro de probioticos en una forma mejorada. Por XX, los materiales derivados de probioticos no viables de acuerdo con la invencion pueden ser producidos de una manera estandarizada y reproducible en un ambiente industrial, evitando aquellos problemas que son inherentes a los probioticos vivos. Tambien, en virtud de la naturaleza no viable y particularmente cuando se suministran como un polvo seco, ellos pueden ser incorporados y dosificados de manera adecuada en composiciones nutricionales, para la prevencion o tratamiento de reactividad o enfermedades alergicas.

A continuacion sera ilustrada la invencion con referencia a los siguientes ejemplos, no limitantes, y las figuras acompanantes.

Ejemplo 1

En un proceso de fermentacion en lote, se cultivo LGG bajo condiciones fisiologicas. Se mantuvo constante el pH a pH de 6 mediante adicion de NaOH al 33%, se mantuvo la temperatura a 37°C. La velocidad del agitador fue 50 rpm, se purgo el espacio de cabeza con N2. Se suministro el siguiente medio de cultivo (un caldo MRS adaptado) (Tabla 1).

Tabla 1

Componente: (g)

Solucion 1 (separadamente en autoclave a 110 °C)

GlucosaH2O: 66

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Agua desmineralizada: 84

Solucion 2 (en autoclave a 121 °C)

Tween-80: 2.0

Acetato de Na3 H2O: 10.0

NH4Cl: 2.6

Componente: (g)

Na3-citrato2 H2O: 4.8

K2HPO4: 4.0

MgSO4-7 H2O: 0.4

MnSO4H2O: 0.08

Extracto de levadura (Gistex LS, polvo): 46

Agua desmineralizada: 780

Total: 1 kg del medio

En las Figuras 1 (a) y (b) se representa el crecimiento bacteriano.

La Fig. 1a muestra la evolucion del pH, la cantidad de NaOH (33%) titulada (base DM = base de Vigilancia de Dosificacion) y OD600 durante la fermentacion de LGG. Se hace referencia a la leyenda dada en la figura. Las mediciones de pH y OD600 permiten una determinacion del crecimiento bacteriano en el fermentador; aqu la adicion de NaOH requerida para mantener el pH a 6 tiene correlacion con la produccion de lactato (es decir una medida de la actividad metabolica bacteriana) y OD 600 es una medicion de densidad que tiene correlacion con el numero de bacterias en el fermentador.

En la Fig. 1b el eje vertical indica, sobre una escala logantmica, el recuento bacteriano en el medio de cultivo. El eje horizontal indica tiempo.

Se tomaron muestras del sobrenadante de cultivo en tres puntos de tiempo (indicados como MJ1, MJ2, y MJ3 en las figuras).

Ejemplo 2

De manera analoga al Ejemplo 1, se condujo el cultivo de LGG sobre la base de medio de cultivo modificado. Aqu estaba ausente Tween, y se anadio un aceite como sigue:

(a) Acido oleico en 1 g/kg, 2 g/kg y 4 g/kg de concentracion.

(b) Aceite de linaza en 1 g/kg, 2 g/kg y 4 g/kg de concentracion.

(c) Aceite de oliva en 1 g/kg, 2 g/kg y 4 g/kg de concentracion.

(d) Aceite de colza en 1 g/kg, 2 g/kg y 4 g/kg de concentracion.

(e) Aceite de girasol en 1 g/kg, 2 g/kg t 4 g/kg de concentracion.

En todas estas pruebas (a)-(e), se observa un crecimiento exitoso de que contema Tween. Adicionalmente a esto, de modo sorprendente adicion de Tween o cualquiera de los aceites.

Ejemplo 3

En este ejemplo, los sobrenadantes obtenidos como en el Ejemplo 1 actividad antialergica y antiinflamatoria, usando un modelo in vitro de celula (lmea celular de macrofago de raton) RAW 264, aceptado en la tecnica. Los cultivos celulares RAW mostraron un incremento sustancial en la

LGG, comparable al crecimiento en el medio se cultivo tambien exitosamente LGG sin la

, fueron sometidos a un cribado respecto a la

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produccion de la citoquina IL-10 reguladora durante la incubacion con la cosecha de muestra de sobrenadante MJ2 del cultivo LGG, comparada con las otras cosechas de muestra de sobrenadante. Vease la Fig. 2.

Ejemplo 4

Se realizo una comparacion entre el sobrenadante MJ2 de cultivo obtenido en el Ejemplo 1 y bacterias viables LGG, en un modelo de sensibilizacion con ovoalbumina (OVA). Este modelo in vivo, bien aceptado en la tecnica, es aplicado normalmente a los ratones adolescentes o adultos. En este Ejemplo, se adapto el modelo convencional de modo que permitiera el estudio de alergia de modo temprano en la vida.

[0079] Asf, los ratones Balb/C neonatos recibieron LGG o sobrenadante de cultivo LGG completo cada dos dfas por seis semanas mediante administracion intragastrica. Los animales fueron sensibilizados a la ovoalbumina (OVA) dos veces los dfas 42 y 56, seguido por desaffo posterior y exposicion a un aerosol de OVA los dfas 61, 62, y 63. En la Fig.3 se muestra este esquema de tiempo. Se evaluaron los parametros de asma bronquial experimental mediante analisis de la funcion pulmonar, histologfa, y lavado broncoalveolar (BAL). Se evaluo la reactividad alergica sistemica mediante niveles de anticuerpos y respuestas de citoquina. Estas ultimas fueron medidas en el lavado broncoalveolar (BAL) asf como en cultivos celulares de drenaje de nodos reestimulados de linfa.

Se encontro que tanto la exposicion a LGG viable asf como a sobrenadante de LGG reducfa la inflamacion de las vfas respiratorias y la hiperplasia de celulas de copa. La tincion histologica de secciones de tejido pulmonar (vease Fig.4) mostro aumento en el infiltrado de celulas inflamatorias e hiperplasia en celulas de copa en los animales alergicos a OVA, mientras los animales tratados con LGG o sobrenadante de LGG mostraron arquitectura e histologfa pulmonar casi normales. En la Fig. 4 "control negativo" indica: ni desaffo, ni sujeto a LGG o sobrenadante de LGG; "control positivo" indica: sujeto a desaffo con OVA, no a LGG o a sobrenadante de LGG; " LGG viable" indica: sujeto a desaffo con LGG viable; "sobrenadante de LGG" indica: sujeto a desaffo y a tratamiento con sobrenadante de LGG aplicado en la invencion.

Ademas, se determino la ocurrencia de celulas inflamatorias que se infiltran (eosinofilos). La Fig. 5 muestra que el aumento en la infiltracion de eosinofilos en los pulmones de animales alergicos a OVA fue reducido fuertemente mediante tratamiento con LGG viable o sobrenadante de LGG. En la Fig.5, el eje vertical indica el porcentaje de incremento de celulas alergicas. En el eje horizontal se representan las siguientes muestras: "control negativo": sin desaffo de OVA; sin tratamiento; "control positivo": desaffo con OVA; sin tratamiento; "LGG completo": desaffo con OVA seguido por tratamiento con LGG viable; "sobrenadante de LGG": desaffo con OVA seguido por tratamiento con sobrenadante de LGG aplicado en la invencion.

Ejemplo 5

Este ejemplo refleja una determinacion (conducida de una manera conocida) del cultivo in vitro de celulas aisladas de nodos de linfa. El perfil ffpico de citoquina Th2 en cultivos de nodos reestimulados de linfa de ratones alergicos a OVA, mostro aumento en las respuestas y IL-5, y bajas respuestas y IL-10 e IFN. El tratamiento con LGG entero (viable) o sobrenadante de LGG aplicado la invencion revelo efectos antialergicos como revela el descenso en la respuesta a IL-5 y fuerte estimulacion de produccion de IFN-y y IL-10 en estos cultivos. Esto esta representado en la Fig.6.

Ejemplo 6

Este ejemplo representa la administracion perinatal de sobrenadante de cultivo LGG aplicado en la invencion, en el modelo de alergia a ovoalbumina (OVA) en ratones Balb/C. Madres embarazadas y lactantes recibieron administracion intragastrica de sobrenadante de LGG, cada dos dfas. Su descendencia fue sensibilizada y desafiada con OVA. En la Fig. 7 se ilustra un esquema de esta prueba.

Se evaluaron parametros de asma bronquial experimental mediante analisis de la funcion pulmonar, histologfa y lavado broncoalveolar (BAL). Se evaluo la reactividad alergica sistemica mediante niveles de anticuerpo y respuestas a citoquina. Esta ultima fue medida tanto en BAL como tambien en cultivos de nodos de linfa que drenan. Fig. 8 indica los resultados, en diagramas que se explican por sf mismos, revelando reduccion en la infiltracion de celulas inflamatorias (eosinofilos, macrofagos) en los animales tratados con sobrenadante de LGG.

Claims

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Reivindicaciones

1. Un producto nutricional que comprende una composicion que incluye una mezcla proteinacea, donde dicha composicion es obtenible de un sobrenadante de cultivo en una fase exponencial tardfa de un proceso de cultivacion en lote de LGG, para uso en el tratamiento o prevencion de enfermedades alergicas.
2. Un producto nutricional para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la composicion es obtenible mediante un proceso que comprende los pasos de (a) someter LGG a cultivacion en un medio de cultivo adecuado usando un proceso de lote; (b) cosechar el sobrenadante de cultivo en una fase exponencial tardfa del paso de cultivacion, fase que es definida con referencia a la segunda mitad del tiempo entre la fase lag y la fase estacionaria del proceso de cultivacion en lote LGG; (c) opcionalmente retirar constituyentes de bajo peso molecular del sobrenadante de modo que se retienen constituyentes con peso molecular por encima de 6 kDa; (d) retirar el contenido lfquido del sobrenadante de cultivo, de modo que se obtiene la composicion.
3. Un producto nutricional para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que la fase exponencial tardfa esta definida con referencia a la porcion del ultimo cuarto del tiempo entre la fase lag y la fase estacionaria del proceso de cultivacion en lote de LGG, preferiblemente 0.75-0.85 del tiempo transcurrido en la fase exponencial.
4. Un producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cultivacion en lote de LGG es conducida en un medio de cultivo provisto de Tween 80, donde opcionalmente el medio contiene un ingrediente oleoso seleccionado del grupo consistente en acido oleico, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de colza, aceite de girasol y mezclas de ellos.
5. Un producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cultivacion en lote de LGG es conducida a un pH neutro, preferiblemente pH 6, a temperatura fisiologica, preferiblemente 37°C.
6. Un producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en una forma seca, preferiblemente seca por atomizacion o seca por congelacion.
7. Un producto nutricional para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que se anade al sobrenadante un material vehmulo farmaceuticamente aceptable, tal como maltodextrina DE29, seguido de secado por atomizacion.
8. El producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en el que el producto nutricional es una formula infantil o para ninos, que es nutricionalmente completa con respecto a la presencia de lfpidos, carbohidratos, protemas, vitaminas y minerales.
9. El producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el producto nutricional comprende ademas uno o mas acidos grasos poliinsaturados (PUFA's), preferiblemente acidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFA's) tales como acido araquidonico (ARA) o acido docosahexaenoico (DHA).
10. El producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el producto nutricional comprende ademas uno o mas ingredientes bio-activos, tales como protemas o polisacaridos, normalmente presentes en la leche humana de pecho.
11. El producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el producto nutricional comprende ademas uno o mas prebioticos, seleccionados preferiblemente del grupo que consiste en oligosacaridos no digeribles, polisacaridos no digeribles, y mezclas de ellos.
12. El producto nutricional para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el producto nutricional es una formula o composicion nutricional o suplemento prenatal, infantil o para ninos, un alimento medico, o un alimento para propositos medicos espedficos.