ES2614980T3 - Medios y método para la inducción del salto de exón - Google Patents

Medios y método para la inducción del salto de exón Download PDF

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Abstract

Primer oligonucleótido antisentido (AON) que puede hibridar una parte interna de exón de un exón a partir de un precursor del ARNm de distrofina y un segundo AON que puede hibridar otra parte interna de exón de dicho exón para usar en el tratamiento DMD, donde la eficiencia con la cual dicho exón es excluido de un ARNm maduro se aumenta proporcionando dicho segundo AON, donde dicho exón de distrofina es el exón 45.

Description

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Medios y metodo para la induccion del salto de exon
[0001] La invencion se refiere a oligonucleotidos y equivalentes de los mismos y su uso para la induccion de exclusion de exones de ARNm.
[0002] La tecnologfa antisentido se ha desarrollado considerablemente en los ultimos anos.
El campo general de tecnologfa antisentido se puede dividir en diferentes areas.
Una de estas areas es el campo del salto de exon.
[0003] En este campo, moleculas pequenas se agregan a la celula para interferir especfficamente con el emplame de un ARN mensajero (ARNm) y mas especfficamente, con la incorporacion de, o mas bien la falta de incorporacion de un exon especffico en el ARNm maduro.
[0004] En el campo del salto de exon, se pueden distinguir dos metodos generales.
Un metodo focaliza en la interferencia del proceso de emplame enzimatico, es decir, la union ffsica de secuencias exonicas.
El otro metodo se basa en la interferencia con la 'logfstica' del proceso de empalme, es decir, el reconocimiento de exones por la maquinaria de empalme.
Ambos metodos usan moleculas pequenas para obtener los efectos deseados.
Las moleculas pequenas comparten todas la caracterfstica de acidos nucleicos de ser capaces de 'hibridar' secuencias complementarias.
Ejemplos de tales pequenas moleculas son, por supuesto, ARN y ADN, y tambien ARN modificado y ADN tal como LNA y morfolinos, y simuladores de acido nucleico tales como PNA.
Estas moleculas son ademas referidas por el termino general de moleculas pequenas o el termino usado mas frecuentemente oligonucleotido antisentido (AON).
[0005] Las moleculas pequenas estan pensadas para actuar por hibridacion a ubicaciones especfficas en el pre- ARNm.
La hibridacion esta pensada para interferir con el proceso enzimatico de empalme o el reconocimiento de exones.
[0006] Actualmente, el salto de exon focaliza en la exclusion especffica de uno o mas exones del ARNm maduro.
Sin embargo, tambien es posible redirigir la maquinaria de empalme de manera que otros exones se incluyan en el ARNm.
Este metodo es, por ejemplo, de uso en genes que estan sujetos a un empalme alternativo.
En estas situaciones, moleculas pequenas se pueden disenar redirigiendo la maquinaria de empalme de manera que una alternativa especffica se hace mas eficazmente.
[0007] La W02006/000057 divulga mas de 200 oligonucleotidos para la induccion del salto de un exon del gen DMD. El unico exon DMD solo para el que la W02006/000057 describe el uso de un coctel de oligonucleotidos para el salto de dicho exon es el exon 20.
[0008] En la presente invencion se ha descubierto que el proceso de salto de exon se puede hacer mas eficazmente. Mucho del trabajo anterior en salto de exon se hizo usando AON que fueron dirigidos hacia el salto de exon en el gen de distrofina.
Hasta la fecha tenemos identificada una serie de 114 AON de exon interno para inducir el salto de 35 exones en celulas musculares cultivadas (14).
Nuestros datos sugieren que AON de exon interno eficaces posiblemente actuan por impedimento esterico de la union de un miembro de la familia de protefna rica en serina/arginina (SR) sitios de intensificador de empalme exonico (ESE) (15).
Protefnas SR se enlazan con el motivo de secuencia exonica y reclutan otros factores de empalme para mediar el empalme (19).
Para mas exones que estudiamos, AON diana de un ESE unico fue suficiente para inducir niveles significativos de salto de exon (14).
Sin embargo, para algunos exones los rendimientos de salto se redujeron a cero.
En la presente invencion, demostramos que los niveles de salto estan mejorados por dirigir un exon de distrofina con dos o mas AON de exon interno.
Con este fin, la invencion proporciona un metodo in vitro para determinar si la eficiencia se puede aumentar con lo cual un exon de distrofina es excluido de un ARNm de distrofina maduro en una celula que produce un precursor de dicho ARNm que contiene un exon
Dicho metodo comprende la provision de dicha celula con un primer (AON) oligonucleotido antisentido que puede hibridar una parte interna de exon de dicho exon, y la determinacion de si dicha eficiencia se aumenta al proporcionar dicha celula con un segundo AON que puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon, donde dicho exon de distrofina es el exon 45.
El aumento de eficiencia se determina preferiblemente por la comparacion del nivel con la eficiencia de cualquier
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AON solo.
El termino eficiencia aumentada como se utiliza en este caso se refiere a la situacion donde (i) la cantidad de ARNm de la que el exon diana es excluido es mayor que con cualquier AON solo o donde (ii) el intervalo temporal dentro del que se puede detectar la exclusion del exon diana en dicha celula se aumenta o (iii) una combinacion de ambos. Un metodo de la invencion tambien proporciona robustez adicional cuando se compara con un metodo de salto de exon utilizando un AON unico.
Por lo tanto, la invencion proporciona un primer AON que puede hibridar una parte interna de exon de un exon a partir de un precursor del ARNm de distrofina y un segundo AON que puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon para usar en el tratamiento DMD, donde la eficiencia con la cual dicho exon es excluido de un ARNm maduro se aumenta proporcionando dicho segundo AON, donde dicho exon de distrofina es el exon 45.
[0009] Normalmente, se refiere a una secuencia como un exon debido a que la secuencia es parte de un pre-ARNm que acaba en un ARNm maduro.
Un pre-ARNm contiene al menos un intron.
El primer exon contiene el sitio tapa mientras que el exon ultimo contiene tfpicamente la senal poliA.
En la presente descripcion, el salto de exon se dirige preferentemente a exones internos.
Un exon interno es cualquiera de los exones 2 a exon n-1, donde n es el numero total de exones en dicho pre- ARNm.
Cuando un exon es saltado ya no se incluye en un ARNm maduro.
Esta caracterfstica podrfa ser considerada por algunos como que implica que la secuencia ya no es un exon sino una (parte de) un intron.
Por lo tanto, un exon se define aquf como una secuencia presente en un pre-ARNm, que se incorpora en un ARNm maduro por la maquinaria de empalme de la celula que esta expresando dicho pre-ARNm, cuando dicha celula no esta provista de un AON que induce el salto de dicho exon.
Por lo tanto, un metodo de salto de exon en la presente divulgacion tambien es referido como un metodo para cambiar una secuencia exonica en una secuencia intronica, alternativamente, un metodo de la divulgacion es un metodo para enmascarar una secuencia exonica de manera que, cuando se enmascara, dicha secuencia exonica ya no esta reconocida como un exon por la maquinaria de empalme de una celula.
[0010] Una celula puede estar provista de un AON en un numero de formas diferentes.
En una forma de realizacion preferida, dicho AON se proporciona a dicha celula por la incorporacion de dicho AON en un vehfculo de distribucion de gen, preferiblemente, un liposoma.
En otra forma de realizacion preferida, dicho AON se proporciona a dicha celula mediante un vector que expresa dicho AON o un precursor del mismo.
En una forma de realizacion preferida, dicho vector comprende un vector vfrico, preferiblemente, un vector de virus adeno-asociado.
Asf la divulgacion proporciona ademas un vehfculo de distribucion de gen que comprende al menos dos AON de exon interno especfficos para el mismo exon.
[0011] Usando al menos dos AON de exon internos especfficos para el mismo exon para saltar dicho exon hace que el metodo de la divulgacion sea mas solido.
Ademas, permite el salto eficaz de exones que no saltan eficazmente cuando se usa solo un AON.
Sin pretender imponer ninguna teorfa se cree que un AON de exon interno induce el salto de un exon por el impedimento de la union de las denominadas protefnas SR (Ser-Arg) que enlazan con sitios de intensificador de empalme exonico (ESE).
En la presente descripcion, se ha observado entre otros que los exones pueden contener los denominados sitios independientes ESE.
Esto significa que cuando la actividad de un sitio ESE se bloquea u obstaculiza por, por ejemplo, por la presencia de un AON en dicho exon, otro ESE independiente en dicho exon permanece funcional.
Como este ESE permanece funcional, el exon todavfa se incorpora eficazmente al ARNm.
Este efecto se puede contrarrestar dirigiendo todos los sitios ESE independientes en dicho exon.
En este caso, esencialmente todos los sitios ESE estan dirigidos asf por un bloqueo u obstruccion AON de union de protefnas SR a dichos sitios ESE que posteriormente lleva a salto eficaz del exon asf dirigido.
Bloquear u obstruir un sitio ESE se puede conseguir de varias maneras.
Por ejemplo, la hibridacion de dicho AON puede alterar la estructura secundaria del exon, de manera que las protefnas SR ya no pueden enlazar con dicho sitio ESE.
En una forma de realizacion preferida, dicho AON solapa al menos parte de un sitio ESE predicho en el exon dirigido.
De esta manera, la union de protefnas SR a dicho sitio se bloquea estericamente por la hibridacion de dicho AON a este.
Se prefiere que dicho AON superponga al menos un sitio ESE predicho.
Ya que los sitios ESE predichos tienden al agrupamiento se prefiere que, dicho AON superponga al menos dos y, preferiblemente, al menos tres sitios ESE predichos en dicho exon.
Asf en una forma de realizacion preferida, un sitio de hibridacion de dicho primer AON en el ARN de dicho exon de distrofina 45 solapa al menos un sitio ESE predicho en dicho exon ARN.
Preferiblemente, dicho sitio de hibridacion de dicho segundo AON en dicho exon de distrofina 45 ARN solapa al
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menos un sitio ESE predicho en dicho exon ARN.
[0012] No se prefiere dirigir dicho primer y dicho segundo AON a un sitio ESE predicho unico en dicho exon de distrofina 45 ARN.
Aunque este puede ser el caso, se prefiere que dicho primer AON dirija un ESE diferente a dicho segundo AON.
Esto se puede conseguir de varias maneras.
Preferiblemente, se evita dirigir el mismo ESE, evitando un solapammiento significativo en los sitios de hibridacion de dicho AON en dicho exon de distrofina 45 ARN.
Asf, preferiblemente, un sitio de hibridacion de dicho primer AON y un sitio de hibridacion de dicho segundo AON muestra menos de un solapamiento de 5 nucleotidos consecutivos.
Mas preferiblemente, dichos sitios tienen menos de 3 y mas preferiblemente menos de 1 o ningun solapamiento.
Tal solapamiento se puede evitar facilmente por seleccion del AON.
Ya que un AON de la invencion tiene preferiblemente un sitio de hibridacion lineal y continuo en dicho exon de distrofina 45 ARN, el recubrimiento se evita, preferiblemente, evitando la identidad de secuencia significativa en los AON usados.
En este aspecto, se prefiere que dicho primer y dicho segundo AON tengan una identidad de secuencia de menos de 5 nucleotidos consecutivos.
Preferiblemente, dicho primer y dicho segundo sitio de hibridacion en dicho exon de distrofina 45 ARN tienen un solapamiento de menos de 3 de nucleotidos consecutivos, mas preferiblemente, menos de 2 y, preferiblemente, menos de 1 nucleotido o ningun recubrimiento.
De forma similar, dicho primer y dicho segundo AON, preferiblemente, tienen una identidad de menos de 3 secuencias de nucleotidos consecutivos, mas preferiblemente, menos de 2 y, preferiblemente, una identidad de menos de 1 secuencia de nucleotidos.
En una forma de realizacion preferida, dicho exon de distrofina 45 comprende al menos dos sitios ESE independientes.
Dicho primer AON esta preferiblemente dirigido a al menos dos sitios ESE independientes y dicho segundo AON a un segundo de los mismos.
[0013] La calificacion "identidad de secuencia" como se utiliza en este caso, preferiblemente, se refiere a la identidad utilizando los nucleotidos A, C, G o T, donde T se puede sustituir por un U. En los ultimos anos, se han generado muchos analogos de nucleotidos diferentes.
Algunos de estos tienen las mismas caracterfsticas de union en tipo y cantidad que los nucleotidos clasicos o naturales mencionados.
Sin embargo, la mayor parte de estos imitan las mismas caracterfsticas de union en el tipo pero no en la cantidad.
En muchos casos, la fuerza de union de un analogo al nucleotido complementario es inferior a la del nucleotido tradicional correspondiente.
Hay tambien analogos que imitan las caracterfsticas de union de dos o mas de los nucleotidos tradicionales y hay tambien analogos de nucleotido que son incorporados eficazmente a un acido nucleico pero que no exponen una selectividad significativa para o union para un nucleotido clasico particular en la cadena opuesta.
Un experto en la tecnica se familiariza con los particulares de estos y analogos similares, y puede usarlos en un AON de la invencion, siempre y cuando AON sea capaz de la hibridacion al sitio de hibridacion en el exon ARN.
[0014] Un AON de la invencion preferiblemente comprende entre 14-40 nucleotidos o sus analogos.
Preferiblemente, dicho AON comprende entre 14-25 nucleotidos o sus analogos.
Preferiblemente, un AON de la invencion comprende menos del 10 % de analogos de nucleotido.
Preferiblemente, un AON comprende menos de los 4 analogos de nucleotido, preferiblemente, menos de 3, mas preferiblemente, menos de 2.
[0015] Un AON de la invencion es preferiblemente un oligonucleotido modificado.
En una forma de realizacion preferida, particularmente, dicho AON comprende uno o mas 2'-O-metil oligoribonucleotidos, que hacen el AON resistente a la degradacion inducida por la RNasa H de hfbridos ADN/ARN. Adicionalmente, un esqueleto de fosforotioato se puede utilizar para aumentar la estabilidad de los AON contra las nucleasas y para mejorar la absorcion celular.
Un AON de la invencion tiene, en una forma de realizacion preferida, un esqueleto de fosforotioato de longitud total y todas las bases (nucleotidos) tienen una modificacion de 2'-O-metil.
Alternativamente, ADN de morfolino fosforodiamidada (morfolinos), acidos nucleicos bloqueados (LNA) y los acidos nucleicos oligos que comprenden etileno (ENA) se han usado para modular el empalme.
Por lo tanto, un AON de la presente invencion puede tambien tener estas modificaciones.
Estas modificaciones hacen que la RNasa H oligos y nucleasa sean resistentes y aumentan la afinidad para el ARN diana.
Para la modificacion ENA y LNA este aumento se acompana por una especificidad de secuencia disminuida.
[0016] Una parte interna de exon de un exon es una parte que no expone el recubrimiento con un extremo 5'- o 3'- del exon.
Un extremo 5'- y 3'-de un exon contiene la informacion de secuencia que es pertinente para la region de union del exon.
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Una parte interna de exon del exon es al menos un y al menos dos y mas preferiblemente al menos 5 nucleotidos internos al lfmite del exon.
Un AON interno de exon tambien puede tener, ademas de la parte interna de exon, tal y como se define arriba, nucleotidos que se extienden al lfmite del exon o mas alla de este.
Sin embargo, este preferiblemente no es el caso.
[0017] Un primero y un segundo AON para uso segun la invencion o un metodo de la invencion preferiblemente comprende ademas incluir dicho primer y dicho segundo AON en un conjunto de AON cuando la provision de una celula con dicho segundo AON aumenta la eficiencia con la cual dicho exon de distrofina 45 se excluye de dicho ARNm de distrofina maduro en una celula que produce un precursor de dicho ARNm.
Preferiblemente, dicho conjunto se usa posteriormente para obtener un salto de exon en celulas diana que expresan dicho pre-ARNm.
La invencion tambien proporciona un conjunto que comprende al menos dos AON donde al menos un primer de dicho AON puede hibridar una parte interna de exon de un exon y un segundo de dicho AON puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon.
En una forma de realizacion preferida de la invencion, dicho conjunto se obtiene por un metodo de la invencion. Particularmente, en una forma de realizacion preferida, dicho primer y dicho segundo de dicho AON estan dirigidos a sitios ESE en dicho exon ARN.
Mas preferiblemente, dicho primer y dicho segundo de dicho AON estan dirigidos a sitios independientes ESE en dicho exon ARN.
[0018] Un conjunto de la divulgacion se puede usar en muchas vfas.
En una forma de realizacion, dicho conjunto se utiliza para reducir al menos en parte la produccion de una protefna aberrante en una celula.
Tales protefnas pueden por ejemplo ser onco-proteinas o protefnas virales.
En muchos tumores no solo la presencia de una onco-protefna, sino tambien su nivel relativo de expresion se han asociados al fenotipo de la celula tumoral.
De forma similar, no solo la presencia de protefnas virales, sino tambien la cantidad de protefna vfrica en una celula determina la virulencia de un virus particular.
Ademas, para una multiplicacion eficaz y extension de un virus, la sincronizacion de expresion en el ciclo de vida y el equilibrio en la cantidad de determinadas protefnas vfricas en una celula determina si los virus se han producido eficaz o ineficazmente.
Al utilizar un conjunto de la divulgacion es posible disminuir la cantidad de protefna aberrante en una celula de manera que, por ejemplo, una celula tumoral se vuelve menos tumorigenica (metastasica) y/o una celula infectada viral produce menos virus.
En una forma de realizacion preferida, un conjunto de la divulgacion se usa para convertir dicha protefna aberrante en una protefna funcional.
En una forma de realizacion, dicha protefna funcional es capaz de la realizacion de una funcion de una protefna normalmente presente en una celula pero ausente en las celulas que se van a tratar.
Muy a menudo, cada restauracion parcial de funcion produce un rendimiento significativamente mejorado de la celula asf tratada.
Debido al mejor rendimiento, tales celulas tambien pueden tener una ventaja selectiva sobre celulas no modificadas, de forma que ayudan a la eficacia del tratamiento.
Este aspecto de la divulgacion es particularmente adecuado para la restauracion de expresion de genes defectuosos.
Esto se consigue causando el salto especffico de exones previstos, pasando asf o corrigiendo mutaciones deletereas (tfpicamente mutaciones de parada o mutaciones puntuales de desplazamiento del marco de lectura, deleciones uni- o multi-exon o inserciones que conducen a una interrupcion de traslacion).
[0019] En comparacion con estrategias de introduccion de gen, la terapia genetica de salto de exon requiere la administracion de reactivos terapeuticos mucho mas pequenos, tfpicamente, pero no limitados a, aOn que comprende o imita entre aproximadamente 14-40 nucleotidos.
En una forma de realizacion preferida, se usan AON de 14-25 nucleotidos, ya que estas moleculas son mas faciles de producir e introducir en la celula mas eficazmente.
El conjunto de la divulgacion permite mas flexibilidad en el diseno posterior de estrategias de salto de exon eficaces y seguras y/o sistemas de administracion.
Una ventaja adicional importante de un conjunto de restauracion de funcion de gen de AON es que este restaura (al menos algo de) la actividad del gen endogeno, que todavfa posee mas o todo su circuito regulador de gen, de forma que asegura niveles de expresion apropiados y la sfntesis de isoformas tisulares especfficas.
[0020] Este aspecto de la divulgacion puede en principio ser aplicado a cualquier enfermedad genetica o predisposicion genetica a la enfermedad, donde el salto previsto de exones especfficos restaura el marco de lectura traslacional cuando este ha sido interrumpido por la mutacion original.
Esta aplicacion es particularmente util cuando la traslacion de una protefna internamente ligeramente mas corta o alterada es funcional completamente o parcialmente.
La presente descripcion puede ser de valor terapeutico en: predisposicion para las segundas mutaciones diana en
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los genes de supresor tumoral, por ejemplo, aquellos implicados en el cancer de mama, cancer de colon, esclerosis tuberosa, neurofibromatosis, etc., donde la restauracion (parcial) de actividad excluirfa la manifestacion de nulisomia por las segundas mutaciones diana y asf se protegerfan frente a la tumorigenesis.
Otra forma de realizacion preferida implica la restauracion (parcial) de productos geneticos defectuosos que tienen una enfermedad directa que causa el efecto de, por ejemplo, hemofilia A (coagulacion de deficiencia de Factor VIII, algunas formas de hipotiroidismo congenito (debido a deficiencia de sfntesis de tiroglobulina) y Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), donde las deleciones de desplazamiento del marco de lectura, duplicaciones y mutaciones de parada en el gen de distrofina vinculada al cromosoma X provoca la degradacion muscular severa progresiva.
DMD es letal tfpicamente en la adolescencia tardfa o edad adulta temprana, mientras deleciones de no desplazamiento del marco de lectura o duplicaciones en el mismo gen provocan la distrofia muscular de Becker mucho mas suave (BMD), compatible con una esperanza de vida entre 35-40 y lo normal.
En la forma de realizacion como se ha aplicado en DMD, la presente descripcion permite que el salto de exon se extienda a una delecion existente (o altere el producto ARNm de una duplicacion existente) por tantos exones adyacentes como se requiera para devolver el marco de lectura y generar una protefna internamente ligeramente acortada, pero todavfa funcional.
Basado en los sfntomas clfnicos mucho mas suaves de pacientes BMD con el equivalente de esta delecion inducida, la enfermedad en los pacientes DMD tendrfa un curso mucho mas tranquilo despues de la terapia AON. Considerando los muchos usos clfnicos de conjuntos de la divulgacion, un metodo de la invencion preferiblemente comprende ademas la provision de dicho conjunto a una celula humana.
En una forma de realizacion, la invencion proporciona un conjunto de AON obtenible por un metodo de la invencion. En una forma de realizacion preferida, dicho conjunto comprende al menos un AON representado por identidad de SEC n° 29, 30, 31, 32, 33, 34.
En otra forma de realizacion preferida, dicho conjunto de al menos dos AON comprende h45AON1 y h45AON4, h45AON1 y h45AON5, h45AON1 y h45AON9, h45AON2 y h45AON3, h45AON3 y h45AON4, h45AON3 y h45AON5, h45AON3 y h45AON9, h45AON4 y h45AON5, h45AON5 y h45AON9, segun la reivindicacion 11.
La presente descripcion tambien proporciona un conjunto que comprende al menos AON de la tabla 1 y/o tabla 2.
La presente descripcion proporciona un conjunto de al menos dos AON de la tabla 1 y/o la tabla 2 que comprende h2AON1 y h2AON3, h43AON1 y h43AON2, h43AON1 y h43AON3, h43AON1 y h43AON4, h43AON1 y h43AON5, h43AON2 y h43AON5, h43AON3 y h43AON5, h43AON4 y h43AON5, h45AON1 y h45AON4, h45AON1 y h45AON5, h45AON1 y h45AON9, h45AON2 y h45AON3, h45AON2 y h45AON4, h45AON2 y h45AON5, h45AON3 y h45AON4, h45AON3 y h45AON5, h45AON3 y h45AON9, h45AON4 y h45AON5, h45AON5 y h45AON9, h46AON4 y h46AON8, h46AON4 y h46AON20, h46AON4 y h46AON22, h46AON6 y h46AON21, h46AON8 y h46AON22, h46AON8 y
h46AON23, h46AON8 y h46AON26, h46AON9 y h46AON21, h46AON9 y h46AON22, h46AON9 y h46AON26;
h46AON22 y h46AON24; h46AON24 y h46AON26, h47AON1 y h47AON3, h47AON1 y h47AON5, h47AON2 y h47AON3, h47AON2 y h47AON5, h47AON3 y h47AON4, h47AON3 y h47AON5, h47AON3 y h47AON6, h47AON4 y h47AON5, h47AON5 y h47AON6, h48AONl y h48AON4, h48AON1 y h48AON6, h48AON1 y h48AON8, h48AON1 y h48AON9, h48AON1 y h48AON10, h48AON2 y h48AON10, h48AON3 y h48AON4, h48AON4 y h48AON6,
h48AON6 y h48AON8, h48AON6 y h48AON9, h48AON6 y h48AON10, h48AON7 y h48AON9, h57AON1 y
h57AON3 y/o h57AON2 y h57AON3.
En una forma de realizacion preferida, dicho conjunto de al menos dos AON de la tabla 1 y/o la tabla 2 comprende h43AONl y h43AON3, h45AON1 y h45AON4, h45AON1 y h45AON5, h45AONl y h45AON9, h45AON2 y h45AON3, h45AON2 y h45AON4, h45AON3 y h45AON4, h45AON3 y h45AON5, h45AON3 y h45AON9, h45AON4 y h45AON5, h45AON5 y h45AON9, h46AON9 y h46AON21, h47AON1 y h47AON3, h47AON1 y h47AON5, h47AON2 y h47AON3, h47AON2 y h47AON5, h47AON3 y h47AON4, h47AON3 y h47AON5, h47AON3 y h47AON6, h47AON4 y h47AON5, h47AON5 y h47AON6, h48AON1 y h48AON4, h48AON1 y h48AON8, h48AON3 y h48?ON4, h57AON1 y h57AON3, .h57AON2 y h57AON3.
En una forma de realizacion preferida, particularmente, dicho conjunto de al menos dos AON de la tabla 1 y/o la tabla 2 comprende h45AON1 y h45AON4, h45AON1 y h45AON5, h45AON1 y h45AON9, h45AON2 y h45AON3, h45AON3 y h45AON4, h45AON3 y h45AON5, h45AON3 y h45AON9, h45AON4 y h45AON5, h45AON5 y h45AON9, h47AON1 y h47AON3, h47AON1 y h47AON5, h47AON2 y h47AON3, h47AON2 y h47AON5, h47AON3 y h47AON4, h47AON3 y h47AON5, h47AON3 y h47AON6, h47AON4 y h47AON5, h47AON5 y h47AON6, h57AON1 y h57AON3, h57AON2 y h57AON3.
La presente descripcion proporciona ademas un AON de la tabla 2.
Preferiblemente, dicho AON de la tabla 2 es h33AON1, h33AON2, h44AON3, h44AON4; h45AON11 o h52AON3.
[0021] En un aspecto, la divulgacion proporciona ademas un metodo para el tratamiento del padecimiento de un individuo de un tumor, una infeccion viral y o una enfermedad genetica y/o una predisposicion genetica, que comprende administrar un conjunto de AON de la divulgacion a dicho individuo.
La divulgacion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende un conjunto de AON, segun la invencion.
Preferiblemente, dicho conjunto se usa para el tratamiento del padecimiento de un individuo de un tumor, una infeccion viral y o una enfermedad genetica y/o predisposicion genetica.
Preferiblemente, dicho conjunto se usa para el tratamiento de Distrofia Muscular de Duchenne (DMD).
[0022] La invencion tambien proporciona una celula que produce un precursor que contiene un exon de una distrofina ARNm, donde dicha celula comprende un primer AON que puede hibridar una parte interna de exon de
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dicho exon y un segundo AON que puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon y donde el exon de distrofina es el exon 45.
Ejemplos
Exon de distrofina 45 de la invencion y otros exones de distrofina de la divulgacion. Resultados y exposicion Doble diana dentro de un exon
[0023] Supusimos que dirigiendo los ESE multiples diana dentro de un exon, las eficiencias de salto se pueden aumentar para exones que no se podrfan saltar a altos niveles usando AON individuales.
Las ubicaciones relativas de los AON para ESE putativos (como se ha predicho por ESEfinder) se representan para cada uno de estos exones en la Fig. lA.
[0024] Primero evaluamos la doble diana de 2 exones insaltables (exon 47 y 57).
Cuando los cultivos de miotubo de control humano fueron tratados con combinaciones diferentes de estos AON, se prodrfan haber conseguido niveles significativos de salto de exon 47 y 57 como se determino con el analisis RT-PCR (Figs. 1BC, tabla suplementaria 1).
De manera interesante, para el exon 47 solo combinaciones de no solapamiento de AON indujeron al salto de exon, mientras aquellos que hacen el solapamiento fueron inefectivos (tabla suplementaria 1).
De forma similar, para el exon 57, la combinacion de AON que casi se solapa (h57AON1 y 2) no indujo a un salto de exon.
Esto encaja con nuestra hipotesis de que dos sitios ESE mutuamente excluyentes estan presentes en estos exones.
[0025] Tanto para el exon 2 como para el exon 45 solo un AON unico reproductivamente indujo bajos niveles de salto de exon (h2AON1 y h45AON5, respectivamente).
Niveles considerablemente-superiores de salto de exon 45 podrfan ser inducidos por la combinacion del AON efectivo h45AON5 con inefectivos, al igual que por la combinacion de dos AON inefectivos individualmente (por ejemplo, h45AON3 y h45AON9) (Fig. 1D).
Asf para este exon, es posible que dos ESE eficaces tambien esten presentes.
En cambio, las combinaciones de AON no aumentaron las eficiencias de salto para el exon 2.
De hecho, combinando el efectivo h2AON1 con el inefectivo h2AON2 se abolio el salto de exon 2 (Fig. 1E).
Esta interferencia no se observo para una combinacion de h2AON1 con h2AON3 (que solapa menos de h2AON2). Para exones 43 y 48, los niveles eficaces de AON indujeron solo niveles moderados del salto.
Para estos exones, los niveles de salto podrfan no ser aumentados usando combinaciones de AON (tabla suplementaria 1).
En estos exones, pueden estar presentes tres o incluso mas ESE.
Por lo tanto, dirigimos el exon 48 con una combinacion de 3 AON diferentes, que todavfa no mejoraron niveles de salto.
Asf, parece mas posible que el empalme de este exon sea en gran medida independiente de sitios ESE.
Este se soporta por el hecho de que los sitios de empalme predichos son perfectos (3' sitio de empalme) o casi perfectos (5' sitio de empalme) y que solo unos pocos ESE son predichos para el exon 48.
[0026] Finalmente, usamos combinaciones de exon 46 AON especfficos, algunos de los cuales fueron ya muy eficaces individualmente.
Intentamos aumentar niveles de salto a (cerca de) 100 %.
Sin embargo, ninguna de las combinaciones usaron otros niveles de salto mejorados cuando se comparan con la simple diana (tabla suplementaria 1).
Esto indica que el bloqueo de un sitio ESE es suficiente para perturbar el empalme correcto de este exon.
Es posible que los sitios ESE de este exon sean dependientes unos de otros, de modo que por el bloqueo de uno, mas o todos los ESE son inactivados.
Alternativamente, la estructura secundaria del pre-ARNm se puede cambiar al unir AON, de modo que los otros sitios ESE ya no estan disponibles para la union de protefnas SR.
[0027] De manera interesante, una vez mas (parcialmente) combinaciones de solapamiento parecfan interferir negativamente con las capacidades de salto de exon individuales, con independencia de si los AON unicos fueron efectivos o inefectivos.
Estaba previsto que combinaciones de dos AON inefectivos de solapamiento tambien serfan inefectivas, ya que ambos o dirigen el sitio ESE no funcional o dirigen los mismos de dos (o mas) sitios ESE mutuamente excluyentes. Para combinaciones AON eficaces de solapamiento, este hallazgo fue inesperado.
Es posible, sin embargo, que estos AON concurran entre sf y se fuerzan el uno al otro a separar desde la transcripcion diana en un proceso dinamico, de forma que se hace el sitio diana disponible nuevamente para protefnas SR.
Tras unir las protefnas SR reclutaran otros factores de empalme a los sitios de empalme y asf mejoran la inclusion de exon antes que el salto de exon.
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Materiales y metodos AON y cebadores
[0028] Todos los AON usados para los experimented de doble diana fueron previamente descritos (ver tabla suplementaria 1) ((11, 14, 15).
Todos los AON contienen 2-O-metil ARN, columna vertebral de fosforotioato y 5' etiquetas de fluorescefna y fueron fabricados por Eurogentec (Belgica). (RT-) cebadores de la PCR fueron elegidos en exones que flanquean los exones saltados (Eurogentec, Belgica; secuencias disponibles bajo peticion).
Cultivo de tejido, transfeccion y analisis RT-PCR
[0029] El control y cultivos miotubo derivados de paciente DMD fueron obtenidos como se describe previamente (9, 22).
Para los experimented de salto de exon, se realizaron transfecciones al menos dos veces con 200 nM de cada AON. En todos los experimentos se uso polietilenimina (PEI, ExGen 500, MBI Fermentas) segun las instrucciones del fabricante, con 2 a 3,5 pl PEI por pg AON.
Dependiendo del numero de AON eficaces disponibles para cada uno de los exones diana, se evaluaron combinaciones diferentes de AON (tabla suplementaria 1).
Las soluciones separadas de complejos AON PEI fueron preparadas para cada AON.
Los rendimientos de transfeccion se basaron generalmente sobre 80 % en la presencia de senales fluorescentes nucleares.
ARN fue aislado 24-48 horas despues de que se realizara la transfeccion y el analisis RT-PCR, como se describe previamente (14).
La transfeccion exitosa de cada AON fue confirmada por analisis RT-PCR con cebadores en los exones que flanquean el exon(es) diana.
Fragmentos de la PCR fueron aislados desde el gel de agarosa y el analisis de secuenciacion se realizo como se describe previamente (10).
Tabla 1. Caracteristicas de los AON usados
AON
Secuencia Exon diana Salto' Valores ESEfinder sobre umbral^ Distancia ded Longitud Fraccion 4 abierta % GC
SF2/ASF2
SC35 SRp40 SRp55 3' SS3 5' SS
H2AON1'
cccauuuugugaauguuuucuuuu 2 + + 1,49 1,54 3,37 1,12 19 21 24 0,29 29 %
H2AON27
uugugcauuuacccauuuugug 2 - 1,49 1,44 1,40 2,71 32 10 22 0,32 36 %
H2AON37
Gaaaauugugcauuuacccauuuu 2 ” 1,59 1,44 1,40 2,71 35 5 24 0,29 29 %
H8AON1
cuuccuggauggcuucaau 8 + + 1,31 0,12 2,57 2,57 26 139 19 0,53 47 %
H8AON3
guacauuaagauggacuuc 8 + + -1,19 0,70 1,82 3,22 84 81 19 0,53 37 %
H17AON1
ccauuacaguugucuguguu 17 + + 3,77 2,92 3,04 2,91 36 122 20 0,40 40 %
H17AON2
uaaucugccucuucuuuugg 17 + 1,76 -0,68 3,83 1,54 132 26 20 0,60 40 %
H19AON'
ucugcuggcaucuugc 19 + 2,83 1,92 2,26 2,46 39 35 16 0,56 56 %
H29AON1'
uauccucugaaugucgcauc 29 + + 5,74 1,07 4,60 3,53 15 117 20 0,30 45 %
H29AON27
gguuauccucugaaugucgc 29 + + 5,74 1,07 4,60 2,04 18 114 20 0,40 50 %
H29AON4
ccaucuguuagggucugug 29 + + 3,09 3,24 2,40 2,91 59 74 19 0,58 53 %
H29AON6
ucugugccaauaugcgaauc 29 + + 1,26 3,28 2,33 4,33 45 87 20 0,55 45 %
H29AON9
uuaaaugucucaaguucc 29 + 1,83 1,41 1,09 1,39 105 29 18 0,28 33 %
H29AON10
guaguucccuccaacg 29 - 1,61 0,79 1,68 -0,11 127 9 16 0,44 56 %
H29AON11
cauguaguucccucc 29 + 0,13 1,95 3,63 3,16 131 6 15 0,67 53 %
H40AON1'
gagccuuuuuucuucuuug 40 + + 1,31 -0,39 1,44 0,77 13 123 19 0,58 37 %
H40AON27
uccuuucaucucugggcuc 40 + + 2,81 2,76 3,93 1,21 127 9 19 0,47 53 %
H41AON1'
cuccucuuucuucuucugc 41 + + 3,82 -0,39 1,53 0,93 18 148 19 0,74 47 %
H41AON27
cuucgaaacugagcaaauuu 41 + 2,39 2,62 1,32 0,86 145 20 20 0,50 35 %
H42AON1'
cuugugagacaugagug 42 + 2,89 3,20 5,76 3,14 90 90 17 0,47 47 %
H42AON27
cagagacuccucuugcuu 42 + 3,23 3,37 1,98 1,19 175 4 18 0,00 50 %
H43AON1'
ugcugcugucuucuugcu 43 - 1,83 1,47 3,61 2,83 52 105 18 0,39 50 %
H43AON27
uuguuaacuuuuucccauu 43 + -0,78 1,06 -0,24 0,10 134 22 19 0,63 26 %
H43AON3
uguuaacuuuuucccauugg 43 - 0,50 1,06 4,15 0,10 132 23 20 0,55 35 %
H43AON4
cauuuuguuaacuuuuuccc 43 - -0,78 1,06 1,11 0,06 137 18 20 0,45 30 %
H43AON58
cuguagcuucacccuuucc 43 + + 1,37 2,97 1,43 2,57 90 66 19 0,37 53 %
H44AON1'
cgccgccauuucucaacag 44 + + 0,25 0,64 0,86 2,51 15 116 19 0,26 58 %
H44AON27
uuuguauuuagcauguuccc 44 + + -0,64 1,47 2,01 2,41 87 43 20 0,40 35 %
H45AON1'
gcugaauuauuucuucccc 45 - 1,79 1,01 3,07 2,41 58 101 19 0,37 42 %
H45AON2'
uuuuucugucugacagcug 45 - 3,03 0,82 2,07 0,93 154 5 19 0,74 42 %
H45AON3
ucuguuuuugaggauugc 45 - 0,37 1,82 1,97 1,85 75 85 18 0,39 39 %
H45AON4
ccaccgcagauucaggc 45 - 3,27 1,45 1,81 3,39 122 39 17 0,47 65 %
H45AON58
gcccaaugccauccugg 45 + 0,50 2,30 1,19 0,35 6 155 17 0,29 65 %
H45AON98
uuugcagaccuccugcc 45 - 3,96 3,20 0,86 2,56 137 24 17 0,65 59 %
H46AON4®
cugcuuccuccaacc 46 + 2,34 2,82 1,68 0,01 63 72 15 0,07 60 %
H46AON6®
guuaucugcuuccuccaacc 46 + 2,34 2,82 1,68 2,46 63 67 20 0,15 50 %
H46AON8®
gcuuuucuuuuaguugcugc 46 + + -1,14 1,08 3,52 1,04 115 15 20 0,60 40 %
H46AON9®
uuaguugcugcucuu 46 - 0,66 1,30 0,51 2,83 111 24 15 1,00 40 %
H46AON20
gaaauucugacaagauauucu 46 + 1,35 1,08 2,07 1,48 15 114 21 0,48 29 %
H46AON21
uaaaacaaauucauu 46 - -2,28 -0,40 -0,72 0,83 47 88 15 0,40 13 %
H46AON22
uccagguucaagugggauac 46 + + 2,39 3,47 3,70 0,78 90 40 20 0,60 50 %
H46AON23
uuccagguucaagug 46 + + 1,61 1,03 1,47 0,78 96 39 15 0,53 47 %
H46AON24
ucaagcuuuucuuuuag 46 + -1,19 -1,09 3,52 0,18 122 11 17 0,35 29 %
H46AON25
cugacaagauauucuu 46 + -0,80 1,08 0,74 1,48 14 120 16 0,88 31 %
H46AON26
agguucaagugggauacua 46 + + 2,39 3,47 3,70 2,09 88 43 19 0,79 42 %
H47AON1'
ucuugcucuucugggcuu 47 - 3,82 1,55 3,68 1,21 87 47 18 0,22 50 %
H47AON27
uugagcuuauuuucaaguuu 47 - -0,89 2,17 2,20 0,53 101 30 21 0,48 29 %
H47AON3
uccaguuucauuuaauuguuug 47 - 1,70 0,22 2,76 1,02 39 91 22 0,45 27 %
H47AON4
cugcuugagcuuauuuucaaguu 47 - 0,74 2,17 2,20 0,53 103 26 23 0,39 35 %
H47AON5
agcacuuacaagcacgggu 47 - -1,37 2,05 1,25 2,07 63 70 19 0,53 53 %
H47AON6
uucaaguuuaucuugcucuuc 47 1,11 0,96 0,74 -0,40 94 37 21 0,33 33 %
H48AON1'
uuucuccuuguuucuc 48 - 0,83 0,08 2,44 1,38 19 153 16 0,81 38 %
H48AON2’
uuauaaauuuccaacugauuc 48 - 0,64 1,50 2,33 1,31 133 34 21 0,48 24 %
H48AON3
ggucuuuuauuugagcuuc 48 - 0,01 1,72 2,83 1,58 37 132 19 0,74 37 %
H48AON4
cuucaagcuuuuuuucaagcu 48 - -1,34 1,32 2,32 0,42 62 105 21 0,62 33 %
H48AON6
gcuucaauuucuccuuguu 48 + 0,83 0,34 1,62 2,57 23 146 19 0,63 37 %
H48AON7
uuuauuugagcuucaauuu 48 + 0,01 1,72 1,62 2,57 32 137 19 0,68 21 %
H48AON8
gcugcccaaggucuuuu 48 - 0,91 1,96 0,25 1,90 48 123 17 0,53 53 %
H48AON9
cuucaaggucuucaagcuuuu 48 + 0,91 1,96 2,32 2,21 71 96 21 0,62 38 %
H48AON10
uaacugcucuucaaggucuuc 48 + 0,91 1,96 2,32 2,21 79 88 21 0,48 43 %
H49AON1'
cuuccacauccgguuguuu 49 + + 3,02 0,52 1,96 3,41 25 60 19 0,42 47 %
H49AON27
guggcugguuuuuccuugu 49 + + 0,56 0,05 0,70 1,38 60 25 19 0,32 47 %
H50AON1'
cucagagcucagaucuu 50 + + 1,69 3,02 2,71 -0,03 11 83 17 0,24 47 %
H50AON27
ggcugcuuugcccuc 50 + 1,10 1,37 1,41 2,83 60 36 15 0,47 67 %
H51AON1'
ucaaggaagauggcauuucu 51 + + -0,31 1,48 1,35 0,41 68 147 20 0,70 40 %
H51AON24
gaaagccagucgguaaguuc 51 - 1,77 1,14 4,90 2,04 132 83 20 0,80 50 %
H51AON27
cacccaccaucaccc 51 - 0,39 1,74 0,38 1,31 181 39 15 0,00 67 %
H51AON27
ccucugugauuuuauaacuugau 51 + + 2,68 2,27 3,94 2,91 160 52 23 0,22 30 %
H51AON29
ugauauccucaaggucaccc 51 + + 1,67 1,91 2,88 2,82 191 24 20 0,25 50 %
H52AON1
uugcuggucuuguuuuuc 52 + 1,56 3,61 2,44 0,52 69 33 18 0,50 39 %
H52AON2
ccguaaugauuguucu 52 -0,07 1,11 2,28 -0,80 97 7 16 0,25 38 %
H53AON1'
cuguugccuccgguucug 53 + 3,08 2,26 1,63 0,77 45 151 18 0,78 61 %
H53AON27
uuggcucuggccuguccu 53 2,20 4,04 3,40 0,21 128 68 18 0,50 61 %
H54AON1
uacauuugucugccacugg 54 + + 3,77 1,64 4,00 1,88 21 118 18 0,56 50 %
H54AON2
cccggagaaguuucaggg 54 + + 3,14 1,80 3,54 1,34 58 80 19 0,58 58 %
H55AON1
cuguugcaguaaucuaugag 55 + 0,74 4,82 4,92 2,92 33 139 20 0,65 40 %
H55AON2
ugccauuguuucaucagcucuuu 55 + 2,70 2,29 3,46 1,27 167 2 23 0,52 39 %
H55AON3
ugcaguaaucuaugaguuuc 55 + 0,74 4,82 4,92 2,41 29 143 20 0,60 35 %
H55AON5
uccuguaggacauuggcagu 55 + + 3,03 2,67 5,66 2,34 104 68 20 0,35 50 %
H55AON6
gagucuucuaggagccuu 55 + + 0,87 5,77 3,36 0,33 139 35 18 0,28 50 %
H56AON1
uuuuuuggcuguuuucaucc 56 + 2,77 1,56 2,52 2,22 48 107 20 0,55 35 %
H56AON2
guucacuccacuugaaguuc 56 - 0,78 1,88 4,04 1,52 129 26 20 0,35 45 %
H56AON3
ccuuccagggaucucagg 56 + 1,81 5,52 3,68 0,27 69 88 18 0,56 61 %
H57AON1
uaggugccugccggcuu 57 - 2,11 3,30 2,54 2,03 97 45 17 0,41 65 %
H57AON2
cugaacugcuggaaagucgcc 57 - 2,47 1,95 2,77 2,41 118 20 21 0,57 57 %
H57AON3
uucagcuguagccacacc 57 - 2,83 4,73 4,81 4,10 64 77 18 0,28 56 %
H58AON1
uucuuuaguuuucaauucccuc 58 - 0,63 1,70 2,52 1,60 9 92 22 0,64 32 %
H58AON2
gaguuucucuaguccuucc 58 + 1,65 3,45 2,18 0,68 86 18 19 0,37 47 %
H59AON1
caauuuuucccacucaguauu 59 - 1,77 0,34 3,53 2,23 66 184 21 0,57 33 %
H59AON2
uugaaguuccuggagucuu 59 + + 1,31 4,84 3,26 1,34 134 118 19 0,47 42 %
H60AON1
guucucuuucagaggcgc 60 + 0,66 3,66 2,29 3,00 19 112 18 0,56 56 %
H60AON2
gugcugagguuauacggug 60 2,87 2,56 4,08 2,78 92 38 19 0,84 53 %
H61AON1
gucccugugggcuucaug 61 - 5,26 2,92 5,97 2,57 31 31 19 0,37 58 %
H61AON2
gugcugagaugcuggacc 61 + 2,28 3,32 4,43 3,64 51 12 18 0,56 61 %
H62AON1
uggcucucucccaggg 62 + + 1,08 0,33 1,89 -0,50 15 32 16 0,50 69 %
H62AON2
gggcacuuuguuuggcg 62 1,70 0,56 1,71 0,09 37 9 17 0,47 59 %
H63AON1
ggucccagcaaguuguuug 63 + 1,70 0,97 3,16 1,25 11 34 19 0,79 53 %
H63AON2
guagagcucugucauuuuggg 63 + 2,81 2,57 3,12 0,93 33 10 21 0,38 48 %
H71AON1
gccagaaguugaucagagu 71 + + 0,12 3,35 4,36 1,47 8 14 19 0,79 47 %
H71AON2
ucuacuggccagaaguug 71 + + 1,37 4,61 4,36 1,47 16 7 18 0,50 50 %
H72AON1
ugaguaucaucgugugaaag 72 + + 6,59 0,60 6,02 0,25 20 28 20 0,60 40 %
H72AON2
gcauaauguucaaugcgug 72 + 0,77 2,43 1,26 2,14 42 7 19 0,47 42 %
H73AON1
gauccauugcuguuuucc 73 + + 1,22 0,89 2,16 2,47 13 37 18 0,39 44 %
H73AON2
gagaugcuaucauuuagauaa 73 + -0,48 0,68 2,28 3,64 31 16 21 0,29 29 %
H74AON1
cuggcucaggggggagu 74 + + 1,35 2,39 2,35 1,39 51 93 17 0,59 71 %
H74AON2
uccccucuuuccucacucu 74 + 3,04 0,33 1,68 2,82 72 70 19 0,16 53 %
H75AON1
H75AON2
ccuuuauguucgugcugcu
ggcggccuuuguguugac
75
75
++
++
3,64
1,51
1,41
1,11
3,39
3,71
2,83
1,12
33
144
194
84
19
18
0,21
0,39
47 % 61 %
H76AON1
H76AON2
gagagguagaaggagagga
auaggcugacugcugucgg
76
76
0,08
3,23
1,28
1,47
3,53
4,30
3,22
1,58
37
65
70
42
19
19
0,32
0,32
53 % 58 %
H77AON1
H77AON2
Uuguguccuggggagga
Ugcuccaucaccuccucu
77
77
++
++
4,26
2,43
3,50
0,32
3,57
-0,21
-0,18
1,65
20
47
58
30
17
18
0,47
0,39
59 % 56 %
H78AON1
H78AON2
Gcuuuccagggguauuuc
Cauuggcuuuccagggg
78
78
++
++
1,81
1,81
4,04
2,95
3.32
3.32
0,62
0,27
4
10
12
7
18
17
0,78
0,71
50 % 59 %
++ Salto de exon observado en sobre 25 % de transcritos en los cultivos de miotubo de control normales; + salto de exon observado en hasta 25 % de transcritos; - ningun salto de exon detectado
2Por cada AON el valor de maximo se da para cada una de las proteinas SR 3Numero de nucleotidos entre los AON y los sitios de empalme 5' y 3' (SS) en nucleotidos.
La distancia a los sitios de empalme 3' y 5' se determina del primer (sitio de empalme 3') o ultimo (sitio de empalme 5') nucleotido en la secuencia diana 4La fraccion de nucleotidos disponibles diana por el AON en la estructura ARN secundaria diana sobre la longitud total del AON 5Este AON dirige parte del ESE eliminado en la delecion Kobe (Matsuo et at, 1990; Matsuo et al., 1991)
6Previamente publicado (van Deutekom et al., 2001)
7Previamente publicado (Aartsma-Rus et al., 2002)
8Previamente publicado (van Deutekom et al., 2001; Aartsma-Rus et al., 2003; Aartsma-Rus et al., 2004)________________________________________________
Tabla 2
Nombre AON
Exon de distrofina humana diana Secuencia Eficaz
H33AON1
33 cugacguccagucuuuauc Si
H33AON2
33 gggauuuuccgucugcuu Si
H44AON3
44 ccgccauuucucaacag Si
H44AON4
44 uucucaggaauuugugucuuu Si
H45AON10
45 caguuugccgcugccca No
H45AON11
45 guugcauucaauguucugac Si
H45AON12
45 auuuuuccuguagaauacugg No
H52AON3
52 gcuggucuuguuuuucaa Si
H52AON4
52 uggucuuguuuuucaaauuu No
H52AON5
52 gucuuguuuuucaaauuuug No
H52AON6
52 cuuguuuuucaaauuuuggg No
H52AON7
52 uguuuuucaaauuuugggc No
H64AON1
64 uccuauaagcugagaaucug No
H64AON2
64 gccuucugcagucuucgg No
Tabla suplementaria 1. Vista de los AON usados y resultados obtenidos de los experimentos de doble diana
Exon diana
AON
Resultado
L
—
T
Combinado con (Resultado):
43
4b
h2AONl
h2AON2
h2AON3
AON2 (■)
h43AONl
h43AON2
h43AON3
h43AON4
h43AON5
h45AONl
h45A()N2
h45AON3
h45AON4
h45AON5
h4RAON9
imagen1
AON2 (■)
AON5 (+) AONfi (*)
imagen2
46
h46AON4
h46AON6
h46AON8
h46AON9
h46AON2
0
h46AON2
1
h46A0N2
2
h46A0N2
3
+
imagen3
AO NO (-)
imagen4
AON25 (-)
AON24 (-)
imagen5
/_
\—/
AON24 (-)
h46AON2 4 h46AON2 5 h46AON2 AON26 (=)
47
h47AON1 h47AON2 h47AON3 h47AON4 h47AON5 h47AON6 AON2 (•) AON3 (+) AON3 ■ .(+) ■; A0N4 (■) A0N5 (+) AO 145 (i) AON5 (+) AON5 (+)
A0N4 ■ ($:; . AON6 (+)
AON6 (+)
48
h48AON 1 h48AON2 h48AON3 h48AON4 h48AON6 h48AON7 h48AON8 h48AON9 h48AON 1 0 + + , AON2 (•) A0N3 (■) A0N3 () AON 4 (+) AON4 (+) AON6 () AON6 (=) AON7 (-) AON7 (-) AON9 (=) AON9 <=) ' (=) AON 10 (-) AON 10 (■) AON 10 (■)
57
h57AON 1 h57A()N2 h57AON3 AON2 (•) AON3 <+) A0N3 (+)
“+” salto de exon observado para este AON individual, salto de exon no observado (reproductivamente) para este AON individual 2Resultados de la doble diana comparados con la simple diana “+” doble diana es mas eficiente que la diana con cualquiera de los AON individuales eficiencia de doble diana comparada con el simple AON mas eficiente, doble diana no efectiva o menos eficiente el simple AON mas eficiente Los AON efectivos estan sombreados de gris claro, combinaciones que funcionan notablemente mejor que el somplie AON mas efectivo estan
sombreadas en gris oscuro, las combinaciones que se solapan estan subrayadas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Breve descripcion de los dibujos
[0030] Figura 1. Doble diana (A). Ubicaciones relativas de AON y sitios ESE putativos dentro de exones 2, 43, 45-48 y 57.
Los exones y AON se extraen para escalar como lineas para cada exon.
Los sitios de union putativos de SF2/ASF, SC35; SRp40 y SRp55 como se ha predicho por ESEfinder se representan como cajas a sus ubicaciones respectivas. (B-E). Algunos ejemplos del analisis RT-PCR despues de experimented de doble diana. (BC). Para los exones 47 y 57 ninguno de los AON disponibles reproductivamente indujeron el salto de exon.
Sin embargo, utilizando combinaciones de estos AON, el salto de exon 47 y 57 fue inducido reproductivamente a niveles significativos.
Para combinaciones de exon 57 que contienen h57AON3 fueron mas eficaces, mientras para el exon 47 todas las combinaciones de no solapamiento indujeron niveles comparables de salto de exon 47.
En algunos casos, una banda adicional podrfa ser observada en el exon 47 PCR, que fue ligeramente mas corto que el producto tipo salvaje.
Esta banda no era reproducible, fue observada en muestras tratadas y no tratadas, y parecfa ser un producto PRC especffico que contiene exones DMD 72-74. (D).
Para el exon 45 solo uno de los AON disponibles indujeron reproductivamente el salto, sin embargo a niveles bajos (h45AON5).
Niveles muy bajos de salto de exon fueron ocasionalmente observados para h45AON1 y h45AON4, pero este no era reproducible.
El salto de exon 45 podrfa conseguirse a niveles mucho mas altos usando combinaciones de AON.
Los niveles maximos de salto de exon 45 fueron observados para combinaciones de h45AON5 y h45AON1 o h45AON3 y para h45AON1 y h45AON9.
En cambio, una mezcla del solapamiento h45AON2 y h45AON9 fue inefectiva. (E).
Para el exon 2 solo el solapamiento AON estaba disponible.
Cuando el h2AON1 efectivo se combino con el, inefectivo, de solapamiento h2AON2, ningun salto podrfa ser inducido.
Este efecto no se vio cuando h2AON1 se combino con el inefectivo, de menos solapamiento h2AON3.
La secuencia del AON mencionado se da en el artfculo Aartsma-Rus A, et al. (2005).
El analisis funcional de AON de exon interno 114 para salto de exon DMD diana: indicacion para el impedimento esterico de sitios de union de protefnas SR.
Oligonucleotidos 15: 284-297.
NT no es transfectado, -RT es control negativo, M es marcador de tamano 100 bp.
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[0031]
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Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Primer oligonucleotido antisentido (AON) que puede hibridar una parte interna de exon de un exon a partir de un precursor del ARNm de distrofina y un segundo AON que puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon para usar en el tratamiento DMD, donde la eficiencia con la cual dicho exon es excluido de un ARNm maduro se aumenta proporcionando dicho segundo AON, donde dicho exon de distrofina es el exon 45.
  2. 2. Metodo in vitro para la determinacion de si se puede aumentar la eficiencia con la cual un exon de distrofina es excluido de un ARNm de distrofina maduro en una celula que produce un precursor que contiene un exon de dicho ARNm dicho metodo comprende proporcionar dicha celula con un primer oligonucleotido antisentido (AON) que puede hibridar una parte interna de exon de dicho exon y determinar si dicha eficiencia se aumenta al proporcionar un segundo AON a dicha celula con que puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon, donde dicho exon de distrofina es el exon 45.
  3. 3. Primero y un segundo AON para uso, segun la reivindicacion 1, o un metodo segun la reivindicacion 2, donde un sitio de hibridacion de dicho primer AON y un sitio de hibridacion de dicho segundo AON muestran un solapamiento de menos de 5 nucleotidos.
  4. 4. Primero y segundo AON para uso, segun la reivindicacion 1 o 3, o un metodo segun la reivindicacion 2 o 3, donde un sitio de hibridacion de dicho primer AON en el ARN de dicho exon solapa un sitio intensificador de empalme exonico predicho (ESE) en dicho ARN de exon.
  5. 5. Primero y segundo AON para uso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, o un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde un sitio de hibridacion de dicho segundo AON en el ARN de dicho exon solapa un sitio ESE predicho en dicho ARN de exon.
  6. 6. Primero y segundo AON para uso, segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-5, o un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde dicho exon comprende al menos dos sitios ESE independientes.
  7. 7. Primero y segundo AON para uso, segun la reivindicacion 6, o un metodo segun la reivindicacion 6, que comprende ademas la provision de dicho conjunto a una celula humana.
  8. 8. Conjunto de AON obtenible por un metodo, segun la reivindicacion 2.
  9. 9. Conjunto de AON, segun la reivindicacion 8, que comprende al menos un AON representado por SEC ID n.°: 29, 30, 31, 32, 33, 34.
  10. 10. Conjunto de AON, segun la reivindicacion 9, que comprende:
    SEC ID n.°
    : 29 y 32,
    SEC ID n.°
    : 29 y 33,
    SEC ID n.°
    : 29 y 34,
    SEC ID n.°
    30 y 31,
    SEC ID n.°
    31 y 32,
    SEC ID n.°
    31 y 33,
    SEC ID n.°
    31 y 34,
    SEC ID n.°
    32 y 33 o SEC ID n.°:33 y 34
  11. 11. AON representado por SEC ID n.°: 120.
  12. 12. Celula que produce un precursor que contiene un exon de un ARNm de distrofina, donde dicha celula comprende un primer AON que puede hibridar una parte interna de exon de dicho exon y un segundo AON que puede hibridar otra parte interna de exon de dicho exon y donde el exon de distrofina es el exon 45.
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