ES2616057T3

ES2616057T3 - Método de producción de una enzima lipolítica

Info

Publication number: ES2616057T3
Application number: ES10723329.8T
Authority: ES
Inventors: Susan M Madrid; Cherry Lin; Masoud Rajabi Zargahi; Rikke Høegh Lorentsen; Mai Faurschou Isaksen; Michael Ward
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: International N&H Denmark ApS
Priority date: 2009-04-24
Filing date: 2010-04-23
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2030-04-23
Also published as: AU2010240473A1; EP2421963B1; GB0908770D0; EP2421963B2; DK2421963T3; WO2010122531A2; CN102439143B; BRPI1006628B1; US20150064309A1; EP2421963A2; DK2421963T4; CN102439143A; BRPI1006628B8; NZ595833A; BRPI1006628A2; US8940519B2; US9382523B2; AU2010240473B2; US20120196002A1; CA2759405A1

Abstract

Un método de producción de una enzima lipolítica que comprende las etapas de: (i) proporcionar una célula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende a) al menos una secuencia nucleotídica heteróloga que codifica una enzima lipolítica que comprende una secuencia aminoacídica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1 o 2; y/o b) al menos una secuencia nucleotídica heteróloga que codifica una enzima lipolítica, en la que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia nucleotídica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o c) al menos una secuencia nucleotídica heteróloga que codifica una enzima lipolítica, en la que la secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que hibrida con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotídica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas y, (ii) cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia o secuencias nucleotídicas heterólogas que codifican dicha enzima lipolítica; y (iii) elevar el pH al final de la fermentación a un pH por encima del pH de las condiciones de cultivo en la etapa (ii).

Description

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DESCRIPCION

Metodo de produccion de una enzima lipolftica

La presente invencion se refiere a un metodo para la produccion de una enzima lipolftica en Trichoderma reesei y a la enzima lipolftica obtenible del mismo. Ademas, la presente invencion se refiere al uso de Trichoderma para expresar una enzima lipolftica.

Antecedentes de la presente invencion

Las lipasas (EC 3.1.1.3), que pueden definirse como carboxilesterasas que catalizan la hidrolisis de acilgliceroles, son enzimas fisiologicamente muy importantes como una de las tres enzimas digestivas principales junto con amilasas y proteasas. Hidrolizan ftpidos hasta glicerol y acidos grasos, pero pueden funcionar tambien en reacciones de esterificacion o transesterificacion.

Las lipasas tienen aplicaciones en varios procesos industriales tales como el procesamiento de aceites y grasas, la fabricacion de detergente, el procesamiento de papel y las industrias de elaboracion de queso y panadera.

El documento WO 98/45453 divulga una enzima lipolftica (y variantes de la misma) derivada del hongo filamentoso Aspergillus tubingensis. Se hace referencia a veces a esta enzima como “lipasa 3”. El documento WO 98/45453 caracteriza varias de las caractensticas fisicoqmmicas de la lipasa 3. Se han descrito tambien usos de esta enzima lipolftica para mejorar las propiedades del pan, en particular para mejorar las propiedades del pan.

El documento WO 98/45453 describfa tambien la clonacion y expresion de lipasa 3 y sus variantes en Aspergillus tubingensis. Se encontro que esta enzima lipolftica podfa sobreexpresarse en Aspergillus tubingensis, sin embargo, la enzima estaba sobreglicosilada en A. tubingensis lo que, en algunas situaciones, puede disminuir su actividad.

El documento WO2006/077258 ensena un metodo para la produccion de un compuesto de interes en una celula fungica filamentosa.

El documento US 4.797.361 ensena una cepa microbiana capaz de producir una enzima glicoprotema extracelular.

Existe la necesidad de un metodo para la produccion de lipasa 3 y sus variantes y otras enzimas lipolfticas a escala comercial y usando hospedadoras de expresion que proporcionen altos niveles de expresion y rendimiento de protema. Ademas, existe tambien la necesidad de superar el problema de la actividad enzimatica disminuida debido a la sobreglicosilacion de la enzima lipolftica como se observa, por ejemplo, cuando se sobreexpresa en A. tubingensis.

Aspectos del resumen de la presente invencion

Se ha encontrado sorprendentemente que Trichoderma reesei es un hospedador de expresion altamente eficaz para enzimas lipolfticas, en particular lipasa 3 y sus variantes y otras enzimas lipolfticas.

Por consiguiente, en un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo de produccion de una enzima lipolftica que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una celula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende

a) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que las secuencia nucleotidica comprende la secuencia nucleotidica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotidica comprende una secuencia nucleotidica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas; y

(ii) cultivar la celula en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica; y

(iii) elevar el pH al final de la fermentacion hasta un pH superior al pH de las condiciones de cultivo de la etapa (ii).

Se ensena tambien en la presente memoria un metodo de produccion de una enzima lipolftica que comprende las etapas de:

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(i) transfectar o transformer una celula de Trichoderma reesei con

a) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleoftdica comprende la secuencia nucleoftdica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotfdica comprende una secuencia nucleoftdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas;

(ii) cultivar la celula en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleoftdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica.

(i) transfectar o transformar una celula de Trichoderma reesei con

c) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleoftdica comprende una secuencia nucleoftdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas;

(ii) repetir la etapa (i) en la celula para transfectar o transformar secuencialmente la celula con al menos una secuencia nucleoftdica heterologa adicional como se define en (i)(a), (i)(b) o (i)(c) (p.ej., tal como una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2); y

(iii) cultivar la celula en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica.

Se describe ademas en la presente memoria una enzima lipolftica obtenible mediante un metodo de la presente invencion.

Se describe en la presente memoria un comestible para consumo humano que comprende dicha enzima lipolftica obtenible mediante un metodo de la presente invencion.

Se ensena tambien en la presente memoria una celula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende:

a) al menos una secuencia nucleotfdica heterologa que codifica una protema enzima lipolftica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia

nucleoftdica que comprende la secuencia nucleoftdica mostrada como la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una

secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia

nucleoftdica comprende una secuencia nucleotfdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una

secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas.

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Se ensena tambien en la presente memoria un vector de expresion que comprende

i) al menos una secuencia nucleoftdica, y dicha secuencia nucleotfdica:

a) codifica una protema enzima lipolftica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) codifica una enzima lipolftica y comprende la secuencia nucleoftdica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleoftdica comprende una secuencia nucleotfdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas; y

ii) al menos un promotor de celobiohidrolasa, en la que dicha al menos una secuencia nucleoftdica esta bajo el control de dicho al menos un promotor de celobiohidrolasa.

Se describe en la presente memoria un uso de una celula de Trichoderma reesei en la expresion de

a) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica un enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleoftdica comprende la secuencia nucleoftdica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleoftdica comprende una secuencia nucleoftdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas;

para mejorar uno o mas de los siguientes: expresion de la enzima lipolftica, glicosilacion de la enzima lipolftica, actividad o rendimiento enzimatico.

Sorprendentemente, se ha encontrado que Trichoderma reesei es capaz de producir las enzimas lipolfticas con rendimientos significativamente altos.

Ademas, se ha encontrado que las enzimas lipolfticas producidas mediante la metodologfa de la presente invencion estan sorprendentemente no sobreglicosiladas y por lo tanto tienen una buena actividad enzimatica.

Bradner et al. (en Current Genetics, 44: 224-230, (2003)) usaba Trichoderma reesei como organismo hospedador de expresion en su busqueda de enzimas lipolfticas anteriormente desconocidas. Se clono una lipasa de un aislamiento antartico de Penicillium allii y se expreso en Trichoderma reesei. Bradner et al. concluyo que los metodos descritos senan utiles para explorar genes de lipasa potencialmente novedosos, pero no sugirio que pudiera usarse T. reesei para la sobreexpresion de protemas.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de produccion de una enzima lipolftica que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una celula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende al menos una secuencia nucleotfdica heterologa que codifica una enzima lipolftica;

(ii) cultivar la celula a pH 4 a pH 5,5 en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleoftdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica;

(iii) aislar, purificar o concentrar la enzima en un medio a pH 5,5 a pH 6,5.

En este aspecto, preferiblemente la enzima lipolftica:

a) comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o comprende una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) esta codificada por un nucleotido que comprende la secuencia mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o comprende una secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) esta codificada por una secuencia nucleoftdica que comprende una secuencia nucleoftdica que hibrida con la

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SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o comprende una secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas.

Aspectos detallados de la presente invencion

Preferiblemente, la secuencia nucleotfdica heterologa esta conectada operativamente (directa o indirectamente) con una secuencia promotora de tal modo que la secuencia nucleotfdica heterologa este bajo el control de la secuencia promotora.

La secuencia promotora puede ser cualquier promotor adecuado, tal como un promotor que esta naturalmente asociado con la secuencia nucleoftdica que codifica la enzima lipolftica y/o un promotor heterologo, tal como una secuencia promotora de celobiohidrolasa 1 o promotor Tef o promotor de glucoamilasa. Otras secuencias promotoras de Trichoderma derivadas de los genes stp (n° de serie de Estados Unidos 12/193.614), cbh2, egll, egl2 y gpd1 pueden estar ligadas con la secuencia nucleoftdica de la enzima lipolftica.

Para algunas realizaciones, la secuencia nucleotfdica que codifica la enzima lipolftica puede incluir uno o mas intrones.

Para algunas realizaciones, la secuencia nucleoftdica que codifica la enzima lipolftica es una secuencia genomica.

Para algunas realizaciones, la secuencia nucleoftdica que codifica la enzima lipolftica es una secuencia de ADNc.

El metodo de la presente invencion puede comprender la etapa adicional de aislar y/o purificar y/o recuperar la enzima lipolftica.

Para algunas realizaciones, el nivel de enzima lipolftica expresada es suficientemente alto para que pueda usarse el medio de caldo en que se ha secretado la enzima (preferiblemente despues de la retirada de la celula o celulas) o en forma concentrada (preferiblemente despues de la retirada de la celula o celulas).

Por lo tanto, en un aspecto preferido, el metodo de la presente invencion incluye la siguiente o siguientes etapas adicionales de aislamiento y/o purificacion y/o recuperacion de la enzima lipolftica.

En un aspecto mas preferido, el metodo de la presente invencion incluye la siguiente o siguientes etapas adicionales de retirada de la celula o celulas del medio (p.ej. caldo) en que se ha secretado la enzima.

En un aspecto mas preferido, el metodo de la presente invencion incluye la siguiente o siguientes etapas adicionales de retirada de la celula o celulas del medio (p.ej. caldo) en que se ha secretado la enzima y concentrar entonces el medio.

La celula o celulas pueden retirase del medio mediante tecnicas de separacion adecuadas, p.ej. tecnicas de filtracion y/o tecnicas de centrifugacion adecuadas. Es un ejemplo particular el uso de ultrafiltracion para preparar UFC (concentrados de ultrafiltracion).

En una realizacion, el pH del medio para cultivar es de aproximadamente pH 4 a aproximadamente 5,5, preferiblemente aproximadamente pH 4.

En una realizacion, el pH del medio para cultivar es de aproximadamente pH 4.

En una realizacion preferida, antes del aislamiento y/o purificacion y/o concentracion de la enzima, se eleva el pH del medio al final del curso de fermentacion cuando se alcanzan suficientes niveles de la enzima soluble secretada.

En una realizacion, el pH del medio para aislar y/o purificar y/o concentrar la enzima esta por encima de pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5.

Por tanto, en una realizacion, el pH del medio para cultivar es de aproximadamente pH 4 y se eleva entonces el pH del medio de tal modo que el pH del medio para aislar y/o purificar y/o concentrar la enzima este por encima de aproximadamente pH 5,5 hasta aproximadamente pH 6,5.

Por tanto, en una realizacion, el pH del medio para cultivar es de aproximadamente pH 4 y se eleva entonces el pH del medio de tal modo que el pH del medio para aislar y/o purificar y/o concentrar la enzima este por encima de aproximadamente pH 6 hasta aproximadamente pH 6,5.

En una realizacion preferida, el pH del medio para cultivar es de aproximadamente pH 4,5 y se eleva entonces el pH del medio de tal modo que el pH del medio para aislar y/o purificar y/o concentrar la enzima sea de aproximadamente pH 6.

Preferiblemente, se proporciona una celula de Trichoderma reesei con transformacion con, o se transforma con, la secuencia nucleotfdica usando electroporacion, tal como mediante la metodologfa de electroporacion divulgada en el documento WO 2008/153712 A2.

En otra realizacion, la celula de Trichoderma reesei puede proporcionarse con transformacion con, o puede transformarse con, la secuencia nucleoftdica usando transformacion bioftstica.

Adecuadamente, puede haber al menos una secuencia nucleotfdica heterologa que codifica la enzima lipolftica en la celula de Trichoderma reesei. En algunas realizaciones, puede haber dos o mas copias (concretamente, multiples 5 copias) de la o de cada secuencia nucleoftdica heterologa que codifica la enzima lipolftica segun la presente invencion en la celula de Trichoderma reesei. Por ejemplo, en una realizacion, puede haber al menos dos secuencias nucleotfdicas que codifican que enzima lipolftica en Trichoderma reesei. En otras realizaciones, puede haber al menos tres, tal como al menos cuatro, tal como al menos cinco o tal como al menos seis secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica. Adecuadamente, puede haber hasta 10 aproximadamente seis, preferiblemente hasta aproximadamente siete, preferiblemente hasta aproximadamente ocho, preferiblemente hasta aproximadamente diez secuencias nucleoftdicas heterologas que codifican la enzima lipolftica en la celula de Trichoderma reesei. En algunas realizaciones, cada secuencia nucleoftdica heterologa esta asociada con y bajo el control de un promotor. Adecuadamente, cada secuencia nucleoftdica heterologa puede tener un promotor separado asociado con ella y estar bajo el control de ese promotor. Los promotores pueden ser iguales 15 o diferentes.

Por tanto, en una realizacion, la celula de Trichoderma reesei puede comprender o estar transfectada o transformada con al menos 2 secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican la enzima lipolftica. En otra realizacion, la celula de Trichoderma reesei puede comprender o estar transfectada o transformada con al menos 3, o al menos 4, o al menos 5 o al menos 6 secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican la enzima lipolftica. En 20 una realizacion, hay hasta aproximadamente 6 secuencias nucleoftdicas heterologas que codifican la enzima lipolftica de acuerdo con la presente invencion. En algunas realizaciones, puede haber hasta aproximadamente 10 secuencias nucleoftdicas heterologas que codifican la enzima lipolftica de acuerdo con la presente invencion. En algunas realizaciones, cada secuencia nucleoftdica heterologa esta asociada con y bajo el control de un promotor. Adecuadamente, cada secuencia nucleoftdica heterologa puede tener un promotor separado asociado con ella y 25 estar bajo el control de ese promotor.

Adecuadamente, la (o cada) secuencia nucleoftdica heterologa puede comprender una secuencia nucleoftdica que codifica un peptido senal, estando dicha secuencia nucleoftdica que codifica dicho peptido senal ligada operativamente con dicha secuencia nucleoftdica que codifica dicha enzima lipolftica. Si hay multiples secuencias nucleotfdicas heterologas y en las que mas de una tiene una secuencia senal asociada con las mismas, entonces 30 las secuencias senal pueden ser iguales o diferentes.

Adecuadamente, la enzima lipolftica puede comprender un peptido senal endogeno o exogeno. Cuando el peptido senal es endogeno, significa que el peptido senal es el que esta ligado naturalmente con la enzima lipolftica cuando se produce naturalmente. Por ejemplo, el peptido senal puede ser el peptido senal de Aspergillus tubingensis que esta ligado naturalmente con la enzima lipolftica cuando se encuentra en Aspergillus tubingensis.

35 El termino “heterologo” como se usa en la presente memoria significa que no aparece naturalmente en la celula de Trichoderma reesei. En otras palabras, es exogeno a la celula de Trichoderma reesei. Por ejemplo, el termino “secuencia nucleoftdica heterologa” como se usa en la presente memoria significa que la secuencia nucleoftdica no aparece naturalmente en la celula de Trichoderma reesei. En otras palabras, la secuencia nucleoftdica es exogena de la celula de Trichoderma reesei. El termino incluye tambien multiples copias de la secuencia de origen natural, ya 40 que dichas copias multiples adicionales senan heterologas.

En una realizacion, preferiblemente la secuencia nucleoftdica heterologa se obtiene o es obtenible de un microorganismo, particularmente un hongo.

En una realizacion, preferiblemente la secuencia nucleoftdica heterologa se obtiene o es obtenible de Aspergillus, particularmente Aspergillus tubingensis.

45 Se ensena en la presente memoria un metodo de produccion de una enzima lipolftica que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una celula de Trichoderma reesei que comprende

50 b) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleoftdica comprende la secuencia nucleoftdica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleoftdica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia 55 nucleoftdica comprende una secuencia nucleoftdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleoftdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID

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NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas; y

(ii) cultivar la celula en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleotidicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica; y

en el que dicha celula de Trichoderma reesei tiene suprimidos al menos dos genes que codifican enzimas no lipolfticas.

(i) transfectar o transformar una celula de Trichoderma reesei con

b) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotidica comprende la secuencia nucleotidica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotidica comprende una secuencia nucleotidica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas;

(i) transfectar o transformar una celula de Trichoderma reesei con

a) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 30% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

(ii) repetir la etapa (i) en la celula para transfectar o transformar secuencialmente la celula con al menos una secuencia nucleotidica heterologa adicional como se define en (i)(a), (i)(b) o (i)(c) (p.ej., tal como una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2); y

(iii) cultivar la celula en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleotidicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica; y

Se ensena en la presente memoria una enzima lipolftica obtenible mediante los metodos de la presente invencion.

Se ensena tambien en la presente memoria un comestible para consumo humano que comprende dicha enzima lipolftica obtenible mediante un metodo de la presente invencion.

Se ensena tambien en la presente memoria una celula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que

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comprende:

c) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotidica comprende una secuencia nucleotfdica que hibrida con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotfdica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas bajo condiciones rigurosas; y

en la que dicha celula de Trichoderma reesei tiene suprimidos al menos dos genes que codifican enzimas no lipolfticas.

Preferiblemente, se suprimen al menos tres genes que codifican enzimas no lipolfticas.

Preferiblemente, se suprimen al menos cuatro genes que codifican enzimas no lipolfticas.

“Suprimido” significa que la celula no expresa la enzima no lipolftica relevante al mismo nivel que la celula no transformada/transfectada. En algunas realizaciones, “suprimido” significa que la celula no expresa la enzima no lipolftica relevante. La supresion puede causarse por tecnicas conocidas en la materia, tales como por deleciones.

Preferiblemente, al menos uno de los genes que codifica una enzima no lipolftica que esta suprimido es un gen de celulasa.

Preferiblemente, al menos dos de los genes que codifican una enzima no lipolftica que estan suprimidos son genes de celulasa.

Es un ejemplo de al menos uno de los genes que codifican una enzima no lipolftica que esta suprimido un gen que codifica una celobiohidrolasa (p.ej. CBHI o CBHII).

Es otro ejemplo de al menos uno de los genes que codifican un enzima no lipolftica que esta suprimido un gen que codifica una endoglucanasa (p.ej. EGI y EGII).

En algunas realizaciones, la celula de Trichoderma reesei es una celula en que se eliminan o desestabilizan los genes endogenos que codifican una o ambas celobiohidrolasas (CBHI y CBHII) y/o una o ambas endoglucanasas (EGI y EGII). Adecuadamente, la celula de Trichoderma reesei puede ser una celula de un MnMG o derivada de la misma, por ejemplo un derivado de la cepa RL-P37. Adecuadamente, la celula de Trichoderma puede ser un derivado de la cepa RL-P37 que se produce usando el metodo expuesto en el Ejemplo 10.

En algunas realizaciones, la secuencia nucleotidica heterologa puede codificar una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65% al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 o una secuencia que comprende una o varias adiciones, deleciones o sustituciones aminoaddicas en comparacion con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO. 2.

En algunas realizaciones, la secuencia nucleotidica heterologa puede codificar una enzima lipolftica y comprende una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65% al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO. 4 o una secuencia que comprende una o varias adiciones, deleciones o sustituciones nucleotfdicas en comparacion con la SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 4.

Preferiblemente, la secuencia nucleotidica heterologa codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65% al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 o una secuencia que comprende una o varias adiciones, deleciones o sustituciones aminoaddicas en comparacion con la SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2.

Preferiblemente, la secuencia nucleotidica heterologa codifica una enzima lipolftica y comprende una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO. 4 o una secuencia que comprende una o varias adiciones, deleciones o sustituciones en comparacion con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID

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NO. 4.

Se muestra en la Tabla 1 siguiente la identidad de secuencia aminoaddica de una serie de enzimas lipolfticas con la lipasa de Aspergillus tubingensis que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 3 (tambien llamada en la presente memoria lipasa 3).

Tabla 1 - Enzimas lipolfticas con identidad de secuencia con la enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis (lipasa

3).

Lipasas de diferentes hongos: N° de acceso % de identidad de secuencia aminoaddica

A. niger CBS 513.88: XP 001397501.1 93

Aspergillus niger: ABG73613.1 93

Aspergillus niger: ABG37906.1 93

Aspergillus nidulans FGSCA4: XP_681315.1 61

Aspergillus clavatus NRRL 1: XP_001276337.1 57

Neosartorya fischeri NRRL 181: XP_001266329.1 60

Aspergillus fumigatus Af293: XP_748138.1 59

Aspergillus oryzae RIB40: XP_001818694.1 56

Aspergillus terreus NIH2624: XP_001218444.1 54

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255: CAP96359.1 55

Aspergillus niger: ABG73614.1 54

Aspergillus niger: XP_001393532.1 53

Thermomyces lanuginosus: 059952 1 50

Penicillium marneffei ATCC 18224: XP_002147144.1 49

Aspergillus oryzae R: XP_001824529.1 44

Phaeosphaeria nodorum SN15: XP_001796872.1 45

Penicillium cyclopium: P61869.1 42

Penicillium camemberti.: ITIA_A 42

La celula hospedadora de Trichoderma reesei usada en la presente invencion puede ser cualquier celula de Trichoderma reesei. La celula puede considerarse que es una celula de Trichoderma reesei de tipo silvestre. La celula de Trichoderma reesei puede ser una de la que se han eliminado o desestabilizado los genes que codifican una o mas celobiohidrolasas secretadas (CBHI o CBHII), de modo que no se expresan. Adecuadamente, la celula de Trichoderma reesei puede ser una celula geneticamente no modificada o derivado de la misma, por ejemplo, un derivado de la cepa RL-P37. Adecuadamente, la celula de Trichoderma reesei puede ser un derivado de la cepa RL- P37 que se produce usando el metodo expuesto en el Ejemplo 10.

La presente invencion puede llevarse a cabo en un fermentador que puede comprender de aproximadamente 3 litros a aproximadamente 20 litros de medio de cultivo. Puede llevarse a cabo como una fermentacion a escala de 10-16 litros, preferiblemente a escala de 14 litros.

Preferiblemente, se lleva a cabo la fermentacion con mas de aproximadamente 12 litros, preferiblemente mas de aproximadamente 14 litros.

La celula hospedadora de Trichoderma reesei es preferiblemente adecuada para uso en fermentacion a gran escala.

La presente invencion puede llevarse a cabo a escala comercial. A este respecto, la fermentacion puede llevarse a cabo a una escala de mas de aproximadamente 50.000 litros, preferiblemente a una escala de mas de aproximadamente 80.000 litros, preferiblemente a una escala de fermentacion de mas de aproximadamente 200.000 litros.

En una realizacion, la protema total producida por el metodo esta muy por encima de aproximadamente 20 g/litro.

De la protema total producida, la mayona es la enzima lipolftica deseada. En una realizacion, la protema secretada total producida por el metodo comprende al menos un 50% de la enzima lipolftica deseada. En una realizacion, la

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protema secretada total producida por el metodo comprende al menos un 60% de la enzima lipolftica deseada. En una realizacion, la protema secretada total producida por el metodo comprende al menos un 70% de la enzima lipolftica deseada. En una realizacion, la protema secretada total producida por el metodo comprende al menos un 80% de la enzima lipolftica deseada.

Adecuadamente, el metodo puede comprender la seleccion de transformantes en que se ha verificado la produccion de enzima lipolftica (se seleccionan preferiblemente los altos productores de la enzima deseada).

En una realizacion, el metodo puede comprender adecuadamente una primera etapa de transformacion en la que se transforma una celula de Trichoderma reesei con al menos una secuencia nucleotfdica heterologa que codifica la enzima lipolftica definida en la presente memoria, la seleccion de los transformantes en que se ha verificado la produccion de la enzima lipolftica (se seleccionan preferiblemente los altos productores de la enzima lipolftica) y una segunda etapa de transformacion (concretamente, etapa de retransformacion) de un transformante seleccionado con al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica la enzima lipolftica definida en la presente memoria, seguidas de una seleccion adicional de los nuevos transformantes en que se ha verificado la produccion de la enzima lipolftica (se seleccionan preferiblemente los altos productores de la enzima deseada).

En algunas realizaciones, la enzima lipolftica producida puede estar glicosilada. En algunas realizaciones, la enzima lipolftica puede estar N-glicosilada en N32 (cuando se numera usando la SEQ ID NO: 2) o en una posicion equivalente para otras enzimas lipolfticas segun la invencion. Este aspecto puede conferir ventajas significativas porque la actividad de la enzima no se desestabiliza ni reduce por la glicosilacion de la enzima. Sin desear ligarse a teona alguna, puede observarse la reduccion de la actividad de la enzima lipolftica cuando se produce en otros hospedadores tales como A. tubingensis, y se cree que es debida a una sobreglicosilacion de la enzima en al menos el sitio N242.

La enzima lipolftica producida por la presente invencion es por lo tanto distinguible de la enzima lipolftica producida en otros hospedadores, p.ej. A. tubingensis, a causa del grado de glicosilacion de la enzima, particularmente en el sitio N32. En algunas realizaciones, la enzima tiene glicosilacion, al menos, en el sitio N32.

Adecuadamente, la enzima lipolftica puede producirse con un peptido senal. En otras palabras, la secuencia nucleotfdica heterologa usada en la presente invencion puede comprender una porcion de la misma que codifica un peptido senal.

El peptido senal puede usarse para dirigir la secrecion de la enzima lipolftica a traves de una membrana celular particular. Las secuencias de peptido senal pueden ser endogenas o exogenas de la secuencia de codificacion de la enzima lipolftica. Por ejemplo, el peptido senal puede ser el peptido senal que es endogeno de la enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis. Como alternativa, la secuencia de codificacion del peptido senal puede obtenerse (o ser obtenible) a partir de un gen de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei.

Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia de codificacion de peptido senal capaz de dirigir la enzima lipolftica expresada a la ruta secretora de una celula de Trichoderma reesei de eleccion.

Cuando se hace referencia a mejorar uno o mas de los siguientes: expresion de la enzima lipolftica, glicosilacion de la enzima lipolftica, actividad y/o rendimiento enzimatico, estos se comparan con los metodos convencionales de expresion de esta enzima lipolftica. Por ejemplo, en la presente invencion se proporciona una expresion de la enzima lipolftica, glicosilacion de la enzima lipolftica, actividad y/o rendimiento enzimatico mejorados en comparacion con la produccion de la enzima lipolftica en otro organismo hospedador (concretamente un organismo hospedador distinto de T. reesei). En particular, hay una expresion de la enzima lipolftica, glicosilacion de la enzima lipolftica, actividad y/o rendimiento enzimatico mejorados de la enzima lipolftica por la presente invencion (concretamente, producida en la celula de Trichoderma reesei) en comparacion con la expresion de la misma enzima lipolftica en una celula de Aspergillus tubingensis (por ejemplo, como se ensena en el documento WO98/45453).

El termino “glicosilacion mejorada” como se usa en la presente memoria significa que, preferiblemente, aparece glicosilacion en N32 (cuando se numera usando la SEQ ID NO: 2). Sin desear ligarse a teona alguna, en algunas situaciones, la enzima lipolftica producida en celulas hospedadoras distintas de T. reesei (y particularmente en Aspergillus tubingensis (p.ej. como se ensena en el documento WO98/45453)) puede estar glicosilada (o sobreglicosilada), particularmente en N242. Por lo tanto, la enzima lipolftica producida en celulas hospedadoras distintas de T. reesei, y particularmente en Aspergillus tubingensis (p.ej. como se ensena en el documento WO98/45453), puede estar glicosilada en ambos sitios N32 y N242. Sin embargo, y sin desear ligarse a teona alguna, el sitio N242 esta en la cercama de uno de los residuos de sitio activo, a saber His258 de la SEQ ID NO: 2. Por tanto, se cree que la glicosilacion (o sobreglicosilacion) en el sitio N242 puede conducir a una actividad reducida (concretamente la actividad lipasa) de la enzima. La enzima lipolftica de la presente invencion no tiene actividad reducida. La glicosilacion de la enzima lipolftica de la presente invencion puede aparecer en el sitio N32, que esta alejado de los residuos de sitio activo tales como His258.

El termino “actividad enzimatica mejorada” como se usa en la presente memoria significa que la actividad es la misma o mayor que la actividad lipasa de la enzima lipolftica producida naturalmente por Aspergillus tubingensis.

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Se entiende por actividad enzimatica al menos actividad lipasa. La actividad enzimatica (p.ej. actividad lipasa) puede medirse usando los protocolos relevantes expuestos a continuacion en la seccion de Ejemplos.

Se ha encontrado sorprendentemente que la enzima lipolftica producida de acuerdo con la presente invencion es facil de aislar del medio en que se ha excretado, concretamente el caldo de cultivo (fermentacion), ya que se obtienen altos niveles de expresion. La Figura 2 muestra un esquema para el metodo de la presente invencion.

Por tanto, segun un aspecto preferido de la presente invencion, el metodo de la presente invencion puede implicar una o mas de las siguientes etapas para el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues del cultivo de la celula: diluir el medio (preferiblemente con agua), separar la celula o celulas del medio, concentrar el medio (preferiblemente en el que dicho medio esta exento de celulas); granular dicho medio (preferiblemente en el que dicho medio esta exento de celulas).

En un aspecto preferido de la presente invencion, el metodo de la presente invencion implica las siguientes etapas para el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues del cultivo de la celula: diluir el medio (preferiblemente con agua), separar la celula o celulas del medio, concentrar el medio (preferiblemente en el que dicho medio esta exento de celulas) y opcionalmente granular dicho medio (preferiblemente en el que dicho medio esta exento de celulas).

En un aspecto preferido de la presente invencion, el metodo de la presente invencion implica las siguientes etapas para el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues de cultivar la celula: diluir el medio (preferiblemente con agua), separar la celula o celulas del medio, concentrar el medio (preferiblemente en el que dicho medio esta exento de celulas) y opcionalmente granular dicho medio (preferiblemente en el que dicho medio esta exento de celulas).

En un aspecto preferido de la presente invencion, el metodo de la presente invencion implica las siguientes etapas para el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues de cultivar la celula: diluir el medio con agua, separar la celula o celulas del medio, concentrar el medio, en el que dicho medio esta exento de celulas y opcionalmente granular dicho medio, en el que dicho medio esta exento de celulas.

En un aspecto preferido de la presente invencion, el metodo de la presente invencion implica las siguientes etapas para el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues de cultivar la celula: diluir el medio con agua, separar la celula o celulas del medio, concentrar el medio, en el que dicho medio esta exento de celulas, y granular dicho medio, en el que dicho medio esta exento de celulas.

La enzima preparada por la presente invencion puede usarse en un metodo para preparar un alimento o comestible pretendido para consumo humano, comprendiendo dicho metodo mezclar dicha enzima con un ingrediente de alimento o comestible adecuado. Preferiblemente, dicha enzima esta en el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues de cultivar la celula. Preferiblemente, dicho medio esta exento de celulas (concretamente, la celula o celulas se han separado del medio). Preferiblemente, dicho medio esta concentrado. En algunas realizaciones, preferiblemente el medio esta granulado.

Preferiblemente, la lipasa precipita de la solucion en el caldo de fermentacion. Preferiblemente, el precipitado de lipasa se resolubiliza por ajuste de pH. El pH se ajusta a un pH por encima del pH del caldo de fermentacion.

Ventajas

Ademas de las ventajas mencionadas anteriormente, es otra ventaja de la presente invencion que posibilita la produccion a escala comercial de la enzima lipolftica. El metodo de la presente invencion permite producir la enzima lipolftica con alto rendimiento.

Es una ventaja de la presente invencion que se ha encontrado sorprendentemente que es posible ir directamente desde la etapa de transformacion y verificacion (concretamente, digamos desde la placa de microvaloracion) directamente a la fermentacion a gran escala (p.ej., fermentacion de al menos 14 litros). Esto es sorprendentemente posible debido a que la etapa de verificacion (particularmente los resultados de la placa de microvaloracion) es altamente predictiva de una buena actuacion en la fermentacion a gran escala. Esto contrasta con los metodos convencionales, en que a menudo es necesario cultivar la cepa en matraces antes de pasar a una fermentacion a mayor escala. Esto tiene ventajas significativas en el acortamiento del tiempo de produccion y/o la simplificacion del procedimiento global y/o la reduccion de costes.

Es una ventaja adicional de la presente invencion que proporciona una expresion potenciada/aumentada y/o un rendimiento mejorado de la enzima lipolftica en comparacion con metodos convencionales de expresion de esta enzima lipolftica. Por ejemplo, en la presente invencion se proporciona una expresion potenciada/aumentada y/o un rendimiento mejorado de la enzima lipolftica en comparacion con la produccion de la enzima lipolftica en otro organismo hospedador (concretamente un organismo hospedador distinto de T. reesei). En particular, hay una expresion aumentada y/o un rendimiento mejorado de la enzima lipolftica por la presente invencion (concretamente producidos en la celula de Trichoderma reesei) en comparacion con la expresion de la misma enzima lipolftica en una celula de Aspergillus tubingensis (por ejemplo como se ensena en el documento WO98/45453).

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Es una ventaja adicional de la presente invencion que la enzima lipolftica producida de acuerdo con la presente invencion es facil de producir y aislar y/o purificar y/o concentrar.

Es una ventaja adicional de la presente invencion que la enzima lipolftica producida de acuerdo con la presente invencion es facil de resolubilizar.

Es una ventaja adicional de la presente invencion que la enzima lipolftica producida de acuerdo con la presente invencion puede usarse como granulo o como solucion.

Enzima lipolftica

El termino “enzima lipolftica” como se usa en la presente memoria significa una enzima con actividad hidrolizante de triacilglicerol (clasificada como E.C. 3.1.1.3).

Adecuadamente, la enzima lipolftica de la presente invencion puede exhibir una o mas de las siguientes actividades adicionales: actividad glicolipasa (E.C. 3.1.1.26), actividad fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4), actividad fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32) o actividad fosfolipasa B (E.C. 3.1.1.5). El termino “actividad glicolipasa” como se usa en la presente memoria engloba “actividad galactolipasa”.

Adecuadamente, la enzima lipolftica segun la presente invencion puede tener al menos una o mas de las siguientes actividades: actividad glicolipasa (E.C. 3.1.1.26) y/o actividad fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32) y/o actividad fosfolipasa A2 (E.C. 3.1.1.4) y/o actividad fosfolipasa B (E.C. 3.1.1.5)

Aislado

En un aspecto, preferiblemente la enzima lipolftica segun la presente invencion esta en forma aislada. El termino “aislado” significa que la enzima lipolftica esta al menos sustancialmente exenta de al menos otro componente con el que la enzima lipolftica esta naturalmente asociada en la naturaleza y como se encuentra en la naturaleza. El termino “aislado” puede significar que la enzima lipolftica esta al menos sustancialmente exenta de al menos otro componente en el medio de cultivo en que se produce. La enzima lipolftica de la presente invencion puede proporcionarse en una forma que este sustancialmente exenta de uno o mas contaminantes con que la sustancia podna estar asociada de otro modo o con que la enzima puede producirse en el hospedador T. reesei. Por tanto, por ejemplo puede estar sustancialmente exenta de la celula o celulas o de uno o mas polipeptidos y/o moleculas de acido nucleico potencialmente contaminantes. La enzima lipolftica puede aislarse separando la celula o celulas del caldo durante o despues de la fermentacion de modo que la enzima lipolftica permanezca en el caldo. La enzima lipolftica puede aislarse sometiendo el caldo de fermentacion a separacion celular por filtracion a vado.

Purificado

En un aspecto, preferiblemente la enzima lipolftica segun la presente invencion esta en forma purificada. El termino “purificado” significa que el compuesto dado esta presente a un alto nivel. El componente es deseablemente el componente predominante presente en una composicion. Preferiblemente, esta presente a un nivel de aproximadamente un 60%, o al menos aproximadamente un 65%, o al menos aproximadamente un 70%, o al menos aproximadamente un 75%, o al menos aproximadamente un 80%, estando determinado dicho nivel con una base de peso seco/peso seco con respecto a la composicion total en consideracion. Para algunas realizaciones, la cantidad es de al menos un 85% de dicho nivel, determinandose con una base de peso seco/peso seco con respecto a la composicion total bajo consideracion.

Concentrado

En un aspecto, se usa preferiblemente la enzima lipolftica segun la presente invencion como concentrado. El concentrado puede ser una forma concentrada del medio en que se ha excretado la enzima. Preferiblemente, el concentrado puede ser una forma concentrada del medio en que se ha excretado la enzima y en la que se han retirado la celula o celulas.

Secuencia nucleotfdica

El alcance de la presente invencion engloba secuencias nucleoftdicas que codifican protemas que tienen las propiedades y/o parametros especfticos definidos en la presente memoria.

El termino “secuencia nucleotfdica” como se usa en la presente memoria hace referencia a una secuencia oligonucleotfdica o secuencia polinucleotfdica y a variantes, homologos, fragmentos y derivados de las mismas (tales como porciones de las mismas). La secuencia nucleoftdica puede ser de origen genomico o sintetico o recombinante, que puede ser bicatenaria o monocatenaria si representa la hebra codificante o anticodificante.

El termino “secuencia nucleoftdica” con relacion a la presente invencion incluye ADN genomico, ADNc, ADN sintetico y ARN. Preferiblemente, significa ADN, mas preferiblemente una secuencia de ADNc que codifica la presente invencion.

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En una realizacion preferida, la secuencia nucleotfdica, cuando se refiere a y cuando se engloba por el alcance per se de la presente invencion, no incluye la secuencia nucleotfdica nativa segun la presente invencion cuando esta en su entorno natural y cuando esta ligada con su secuencia o secuencias naturalmente asociadas que estan tambien en su entorno natural. Por facilidad de referencia, se llamara a esta realizacion preferida “secuencia nucleotfdica no nativa”. A este respecto, el termino “secuencia nucleotfdica nativa” significa una secuencia nucleotfdica completa que esta en su entorno nativo y cuando esta ligada operativamente con un promotor completo con el que esta naturalmente asociada, estando dicho promotor tambien en su entorno nativo. Sin embargo, la secuencia aminoaddica englobada por el alcance de la presente invencion puede aislarse y/o purificarse despues de la expresion de una secuencia nucleotfdica en su organismo nativo. Preferiblemente, sin embargo, la secuencia aminoaddica englobada por el alcance de la presente invencion puede expresarse por una secuencia nucleotfdica en su organismo nativo, pero en la que la secuencia nucleotfdica no esta bajo el control del promotor con el que esta naturalmente asociada en ese organismo.

Tfpicamente, la secuencia nucleotfdica englobada por el alcance de la presente invencion se prepara usando tecnicas de ADN recombinante (concretamente, ADN recombinante). Sin embargo, en una realizacion alternativa de la invencion, la secuencia nucleotfdica podna sintetizarse, toda o en parte, usando metodos qmmicos bien conocidos en la materia (veanse Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)

Preparacion de la secuencia nucleotfdica

Puede identificarse y/o aislarse y/o purificarse una secuencia nucleotidica que codifica una protema que tiene las propiedades espedficas definidas en la presente memoria o una protema que es adecuada para modificacion a partir de cualquier celula u organismo productor de dicha protema. Son bien conocidos en la materia diversos metodos para la identificacion y/o aislamiento y/o purificacion de secuencias nucleotidicas. A modo de ejemplo, pueden usarse tecnicas de amplificacion por PCR para preparar mas de una secuencia una vez se haya identificado y/o aislado y/o purificado una secuencia adecuada.

A modo de ejemplo adicional, puede construirse una coleccion de ADN genomico y/o ADNc usando ADN cromosomico o ARN mensajero del organismo productor de la enzima. Si es conocida la secuencia aminoaddica de la enzima, pueden sintetizarse sondas oligonucleotidicas marcadas y usarse para identificar clones codificantes de enzimas de la coleccion genomica preparada a partir del organismo. Como alternativa, podna usarse una sonda oligonucleotfdica marcada que contiene secuencias homologas de otro gen enzimatico conocido para identificar clones codificantes de enzimas. En este ultimo caso, se usan condiciones de hibridacion y lavado de bajo rigor.

Como alternativa, podnan identificarse clones codificantes de enzimas insertando fragmentos de ADN genomico en un vector de expresion, tal como un plasmido, transformando bacterias negativas de enzima con la coleccion de ADN genomico resultante y sembrando entonces las bacterias transformadas sobre placas de agar que contienen un sustrato para la enzima (concretamente maltosa), permitiendo asf identificar los clones que expresan la enzima.

En una realizacion alternativa mas, puede prepararse sinteticamente la secuencia nucleotfdica que codifica la enzima mediante metodos estandares establecidos, p.ej., el metodo de fosforoamidita descrito por Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, pag. 1859-1869, o el metodo descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, pag. 801-805. En el metodo de fosforoamidita, se sintetizan oligonucleotidos, p.ej. en un sintetizador de ADN automatico, se purifican, se reasocian, se ligan y se clonan en vectores apropiados.

La secuencia nucleotidica puede ser de origen genomico y sintetico mixto, de origen sintetico y de ADNc mixto o de origen genomico y de ADNc mixto, preparada ligando fragmentos de origen sintetico, genomico o de ADNc (segun sea apropiado) de acuerdo con tecnicas estandares. Cada fragmento ligado corresponde a diversas partes de la secuencia nucleotidica completa. La secuencia de ADN puede prepararse tambien mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores espedficos, por ejemplo como se describe en el documento US 4.683.202 o en Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pag. 487-491).

Secuencias aminoaddicas

El alcance de la presente invencion engloba tambien secuencias aminoaddicas de enzimas que tienen las propiedades espedficas definidas en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, el termino “secuencia aminoaddica” es sinonimo del termino “polipeptido” y/o del termino “protema”. En algunos casos, el termino “secuencia aminoaddica” es sinonimo del termino “peptido”. En algunos casos, el termino “secuencia aminoaddica” es sinonimo del termino “peptido”. En algunos casos, el termino “secuencia aminoaddica” es sinonimo del termino “enzima”.

La secuencia aminoaddica puede prepararse/aislarse a partir de una fuente adecuada, o puede elaborarse sinteticamente o puede prepararse mediante el uso de tecnicas de ADN recombinante.

La protema englobada en la presente invencion puede usarse junto con otras protemas, particularmente enzimas. Por tanto, la presente invencion cubre tambien una combinacion de protemas en la que la combinacion comprende

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la protema/enzima de la presente invencion y otra protema/enzima, que puede ser otra protema/enzima segun la presente invencion. Este aspecto se discute en una seccion posterior.

Preferiblemente, la secuencia aminoaddica cuando se refiere a y cuando esta englobada por el alcance per se de la presente invencion no es una enzima nativa. A este respecto, el termino “enzima nativa” significa una enzima completa que esta en su entorno nativo y cuando se expresa por su secuencia nucleotidica nativa.

Identidad de secuencia u homologfa de secuencia

La presente invencion engloba tambien el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia u homologfa de secuencia con la secuencia o secuencias aminoaddicas de un polipeptido que tiene las propiedades espedficas definidas en la presente memoria o de cualquier secuencia nucleotidica que codifique dicho polipeptido (se hace referencia de aqm en adelante como “secuencia o secuencias homologas"). Aqm, el termino “homologo” significa una entidad que tiene una cierta homologfa con las secuencias aminoaddicas en cuestion y las secuencias nucleotidicas en cuestion. Aqrn, el termino “homologfa” puede equipararse a “identidad”.

La secuencia aminoaddica y/o secuencia nucleotidica homologa debena proporcionar y/o codificar un polipeptido que retenga la actividad funcional y/o potencie la actividad de la enzima.

En el presente contexto, se toma una secuencia homologa que incluye una secuencia aminoaddica que puede ser al menos un 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85 o 90% identica, preferiblemente al menos un 95 o 98% identica, a la secuencia en cuestion. Tfpicamente, los homologos comprenderan los mismos sitios activos, etc. que la secuencia aminoaddica en cuestion. Aunque la homologfa puede considerarse tambien en terminos de similitud (concretamente, residuos aminoaddicos que tienen propiedades qmmicas/funciones similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.

En el presente contexto, se toma una secuencia homologa que incluye una secuencia nucleotidica que puede ser al menos un 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 85 o 90% identica, preferiblemente al menos un 95 o 98% identica, a una secuencia nucleotidica que codifica un polipeptido de la presente invencion (la secuencia en cuestion). Tfpicamente, los homologos comprenderan las mismas secuencias que codifican los sitios activos etc. de la secuencia en cuestion. Aunque la homologfa puede considerarse tambien en terminos de similitud (concretamente, residuos aminoaddicos que tienen propiedades qmmicas/funciones similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de homologfa pueden realizarse visualmente o, mas habitualmente, con la ayuda de programas de comparacion de secuencia facilmente disponibles. Estos programas informaticos comercialmente disponibles pueden calcular el % de homologfa entre dos o mas secuencias.

El % de homologfa puede calcularse en secuencias contiguas, concretamente se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoacido en una secuencia con el correspondiente aminoacido en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se llama un alineamiento “sin huecos”. Tfpicamente, dichos alineamientos sin huecos se efectuan solo con un numero relativamente corto de residuos.

Aunque este es un metodo muy sencillo y consistente, no consigue tener en consideracion que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demas identicas, una insercion o delecion causara que los siguientes aminoacidos salgan del alineamiento, dando por tanto como resultado potencialmente una gran reduccion del % de homologfa cuando se efectua un alineamiento global. En consecuencia, la mayona de metodos de comparacion de secuencia se disenan para producir alineamientos optimos que tengan en consideracion las posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuacion de homologfa global. Esto se consigue insertando “huecos” en el alineamiento de secuencia para intentar maximizar la homologfa local. Sin embargo, estos metodos mas complejos asignan “penalizaciones de hueco” a cada hueco que aparece en el alineamiento de modo que, para el mismo numero de aminoacidos identicos, un alineamiento de secuencia con los menores huecos posibles, que reflejan la mayor relacion entre las dos secuencias comparadas, conseguira una puntuacion mayor que uno con muchos huecos. Se usan tipicamente “costes de huecos afines” que cargan un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una menor penalizacion por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuacion de huecos mas comunmente usado. Las altas penalizaciones de hueco produciran por supuesto alineamientos optimizados con menos huecos. La mayona de programas de alineamiento permitiran modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencia.

El calculo del % de homologfa maxima requiere por lo tanto en primer lugar la produccion de un alineamiento optimo, teniendo en consideracion las penalizaciones de hueco. Es un programa informatico adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.). Los ejemplos de software que puede efectuar comparaciones de secuencia incluyen, pero sin limitacion, el paquete BLAST (vease Ausubel et al. 1999 “Short Protocols in Molecular Biology”, 4a Ed - capttulo 18), BLAST 2 (vease FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al. 1990 J Mol. Biol. 403410) y AlignX, por ejemplo. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA estan disponibles para busqueda fuera de lmea y en lmea (vease Ausubel et al 1999, paginas 7-58 a 7-60).

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Aunque el % de homologfa final puede medirse en terminos de identidad, el proceso de alineamiento mismo no esta tipicamente basado en una comparacion por pares de todo o nada. En lugar de ello, se usa generalmente una matriz de puntuacion por similitud graduada que asigna puntuaciones a cada comparacion por pares basandose en la similitud qmmica o la distancia evolutiva. Es un ejemplo de dicha matriz usada comunmente la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto del conjunto de programas BLAST. Los programas Vector NTI usan generalmente los valores por defecto publicos o una tabla de comparacion de sfmbolos a medida si se suministra (vease el manual del usuario para mas detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto para el paquete Vector NTI Advance™ 11.

Como alternativa, pueden calcularse las homologfas porcentuales usando el rasgo de alineamiento multiple en Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.), basandose en un algoritmo analogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244). Una vez el software ha producido un alineamiento optimo, es posible calcular el % de homologfa, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software tipicamente hace eso como parte de la comparacion de secuencia y genera un resultado numerico.

Las penalizaciones de hueco debenan usarse cuando se determina la identidad de secuencia, entonces se usan preferiblemente los siguientes parametros para alineamiento por pares:

PARA BLAST

ABERTURA DE HUECO: 0

EXTENSION DE HUECO: 0

PARA CLUSTAL: ADN PROTEfNA

TAMANO DE PALABRA: 2 1 K triple

PENALIZACION DE HUECO: 15 10

EXTENSION DE HUECO: 6,66 0,1

En una realizacion, puede usarse CLUSTAL con la penalizacion de hueco y la extension de hecho establecidas como se define anteriormente.

Adecuadamente, se determina el grado de identidad con respecto a una secuencia nucleotidica en al menos 20 nucleotidos contiguos, preferiblemente en al menos 30 nucleotidos contiguos, preferiblemente en al menos 40 nucleotidos contiguos, preferiblemente en al menos 50 nucleotidos contiguos, preferiblemente en al menos 60 nucleotidos contiguos, preferiblemente en al menos 100 nucleotidos contiguos.

Adecuadamente, puede determinarse el grado de identidad con respecto a una secuencia nucleotidica en la secuencia completa.

Variantes/homologos/derivados

La presente memoria descriptiva engloba tambien el uso de variantes, homologos y derivados de cualquier secuencia aminoaddica de una protema o de cualquier secuencia nucleotfdica que codifique dicha protema.

Aqrn, el termino “homologo” significa una entidad que tiene una cierta homologfa con las secuencias aminoaddicas en cuestion y con las secuencias nucleotidicas en cuestion. Aqrn, el termino “homologfa” puede equipararse con “identidad”.

En el presente contexto, se toma una secuencia homologa que incluye una secuencia aminoaddica que puede ser al menos un 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90% identica, preferiblemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% identica a la secuencia en cuestion. Tfpicamente, los homologos comprenderan los mismos sitios activos etc. que la secuencia aminoaddica en cuestion. Aunque la homologfa puede considerase tambien en terminos de similitud (concretamente, residuos aminoaddicos que tienen propiedades qmmicas/funciones similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.

En el presente contexto, se toma una secuencia homologa que incluye una secuencia nucleotidica que puede ser al menos un 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90% identica, preferiblemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% identica, a una secuencia nucleotidica que codifica una enzima de la presente invencion (la secuencia en cuestion). Tfpicamente, los homologos comprenderan las mismas secuencias que codifican los sitios activos etc. que la secuencia en cuestion. Aunque la homologfa puede considerarse tambien en terminos de similitud (concretamente, residuos aminoaddicos que tienen propiedades qmmicas/funciones similares), en el contexto de la presente invencion se prefiere expresar la homologfa en terminos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de homologfa pueden realizarse visualmente o, mas habitualmente, con la ayuda de programas

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de comparacion de secuencia facilmente disponibles. Estos programas informaticos comercialmente disponibles pueden calcular el % de homologfa entre dos o mas secuencias.

El % de homologfa puede calcularse en secuencias contiguas, concretamente se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoacido de una secuencia con el correspondiente aminoacido de la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se llama alineamiento “sin huecos”. Tfpicamente, dichos alineamientos sin huecos se efectuan solo en un numero relativamente corto de residuos.

Aunque este es un metodo muy sencillo y consistente, no consigue tener en consideracion que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demas identicas, una insercion o delecion causara que los siguientes aminoacidos salgan del alineamiento, dando por tanto como resultado potencialmente una gran reduccion del % de homologfa cuando se efectua un alineamiento global. En consecuencia, la mayona de metodos de comparacion de secuencia se disenan para producir alineamientos optimos que tengan en consideracion las posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuacion de homologfa global. Esto se consigue insertando “huecos” en el alineamiento de secuencia para intentar maximizar la homologfa local.

Sin embargo, estos metodos mas complejos asignan “penalizaciones de hueco” a cada hueco que aparece en el alineamiento de modo que, para el mismo numero de aminoacidos identicos, un alineamiento de secuencia con los menores huecos posibles, que reflejan la mayor relacion entre las dos secuencias comparadas, conseguira una puntuacion mayor que uno con muchos huecos. Se usan tfpicamente “costes de huecos afines” que cargan un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una menor penalizacion por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuacion de huecos mas comunmente usado. Las altas penalizaciones de hueco produciran por supuesto alineamientos optimizados con menos huecos. La mayona de programas de alineamiento permitiran modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo, cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalizacion por hueco por defecto para secuencias aminoaddicas es -12 para un hueco y -4 para cada extension.

El calculo del % de homologfa maxima requiere por lo tanto en primer lugar la produccion de un alineamiento optimo, teniendo en consideracion las penalizaciones de hueco. Es un programa informatico adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12, pag. 387). Los ejemplos de otro software que puede efectuar comparaciones de secuencia incluyen, pero sin limitacion, el paquete BLaSt (vease Ausubel et al. 1999 “Short Protocols in Molecular Biology”, 4a Ed - capttulo 18), FASTA (Altschul et al. 1990 J Mol. Biol. 403-410) y el grupo GENEWORKS de herramientas de comparacion. Tanto BLAST como FASTA estan disponibles para busqueda fuera de lmea y en lmea (vease Ausubel et al 1999, “Short Protocols in Molecular Biology”, paginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Esta tambien disponible una nueva herramienta, llamada BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias proteicas y nucleotidicas (veanse FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Aunque el % de homologfa final puede medirse en terminos de identidad, el proceso de alineamiento mismo no esta tfpicamente basado en una comparacion por pares de todo o nada. En lugar de ello, se usa generalmente una matriz de puntuacion por similitud graduada que asigna puntuaciones a cada comparacion por pares basandose en la similitud qrnmica o la distancia evolutiva. Es un ejemplo de dicha matriz usada comunmente la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto del conjunto de programas BLAST. El conjunto de programas GCG Wisconsin usan generalmente los valores por defecto publicos o una tabla de comparacion de sfmbolos a medida si se suministra (vease el manual del usuario para mas detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto para el paquete GCG, en el caso de otro software, la matriz por defecto tal como BLOSUM62.

Como alternativa, pueden calcularse los porcentajes de homologfa usando el rasgo de alineamiento multiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basandose en un algoritmo analogo a CLUSTAL (Higgins DG y Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

Una vez el software ha producido un alineamiento optimo, es posible calcular el % de homologfa, preferiblemente el % de identidad de secuencia. El software hace tfpicamente eso como parte de la comparacion de secuencia y genera un resultado numerico.

Las secuencias pueden tener tambien deleciones, inserciones o sustituciones de residuos aminoaddicos que producen un cambio silencioso y dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones aminoaddicas deliberadas basandose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipatica de los residuos siempre que se retenga la actividad de union secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico y acido glutamico; los aminoacidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina y los aminoacidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Pueden hacerse sustituciones conservativas, por ejemplo, segun la Tabla siguiente. Los aminoacidos en el mismo bloque de la segunda columna y preferiblemente en la misma lmea de la tercera columna pueden sustituirse entre sf.

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alifAtico: No polar G A P

I L V

Polar - no cargado: C S T M

N Q

Polar - cargado: D E

K R

aromAtico: H F W Y

La presente invencion engloba tambien la sustitucion homologa (sustitucion y reemplazo se usan ambos en la presente memoria para indicar el intercambio de un residuo aminoaddico existente por un residuo alternativo) que puede aparecer, concretamente, sustitucion de similar por similar tal como basico por basico, acido por acido, polar por polar, etc. Tambien puede aparecer sustitucion no homologa, concretamente, de una clase de residuo por otra o que implica como alternativa la inclusion de aminoacidos no naturales tales como ornitina (de aqrn en adelante designada como Z), ornitina de acido diaminobutmco (de aqrn en adelante designada como B), norleucina-ornitina (de aqrn en adelante designada como O), pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

Los reemplazos pueden hacerse tambien por aminoacidos no naturales e incluyen aminoacidos alfa* y alfa* disustituidos, N-alquilaminoacidos*, acido lactico*, derivados de haluro de aminoacidos naturales tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alilglicina*, 13-alanina*, acido L- aminobutmco*, acido L-aminoisobutmco*, acido L-aminocaproico#, acido 7-aminoheptanoico*, L-metioninsulfona*, L- norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metilicos de fenilalanina (Phe) tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metilo)*, L-Phe (4-isopropilo)*, L-Tic (acido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carbox^lico)*, acido L-diaminopropionico y L-Phe (4-bencilo)*. La notacion * se ha utilizado con el fin de la discusion anterior (respecto a sustitucion homologa o no homologa) para indicar la naturaleza hidrofoba del derivado, mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrofila del derivado, #* indica caractensticas anfipaticas.

Las secuencias aminoaddicas variantes pueden incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos residuos aminoaddicos cualesquiera de la secuencia, incluyendo grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo, ademas de espaciadores aminoaddicos tales como residuos de glicina o alanina. Una forma adicional de variacion, que implica la presencia de uno o mas residuos aminoaddicos en forma peptoide, sera bien entendida por los especialistas en la materia. Para evitar dudas, “la forma peptoide” se usa para hacer referencia a residuos aminoaddicos variantes en los que el grupo sustituyente de carbono esta en el atomo de nitrogeno del residuo en lugar de en el de carbono. Son conocidos en la materia procesos para preparar peptidos en forma peptoide, por ejemplo Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.

Las secuencias nucleotfdicas para uso en la presente invencion pueden incluir en ellas nucleotidos sinteticos o modificados. Son conocidos en la materia una serie de diferentes tipos de modificacion de oligonucleotidos. Estos incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adicion de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molecula. Con los fines de la presente invencion, se entiende que las secuencias nucleotfdicas descritas en la presente memoria pueden modificarse mediante cualquier metodo disponible en la materia. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar la actividad in vivo o la vida util de las secuencias nucleotfdicas de la presente invencion.

La presente memoria descriptiva engloba tambien el uso de secuencias nucleotfdicas que son complementarias de las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es complementaria de un fragmento de la misma, entonces puede usarse esa secuencia como sonda para identificar secuencias de codificacion similares en otros organismos, etc.

Pueden obtenerse de una serie de modos polinucleotidos que no son 100% homologos de las secuencias de la presente invencion, pero que entran dentro del alcance de la invencion. Pueden obtenerse otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria por ejemplo sondeando colecciones de ADN compuestas por una serie de individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones. Ademas, pueden obtenerse otros homologos y dichos homologos y fragmentos de los mismos seran en general capaces de hibridar selectivamente con las secuencias mostradas en el listado de secuencias de la presente memoria. Dichas secuencias pueden obtenerse sondeando colecciones de ADNc elaboradas a partir de, o colecciones de ADN genomico de, otra especie animal, y sondeando dichas colecciones con sondas que comprenden toda o parte de una cualquiera de las secuencias del listado de secuencias adjunto en condiciones de rigor medio a alto. Se aplican consideraciones similares para obtener homologos de especie y variantes alelicas de las secuencias polipeptfdicas o nucleotfdicas de la invencion.

Pueden obtenerse tambien variantes y homologos de cepa/especie usando PCR degenerada, que usara cebadores disenados para orientarse a secuencias en las variantes y homologos que codifican secuencias aminoaddicas conservadas en las secuencias de la presente invencion. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por

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ejemplo, alineando las secuencias aminoaddicas de varias variantes/homologos. Los alineamientos de secuencia pueden efectuarse usando software informatico conocido en la materia. Por ejemplo, se usa ampliamente el programa PileUp de GCG Wisconsin.

Los cebadores usados en PCR degenerada contendran una o mas posiciones degeneradas y se usaran en condiciones menos rigurosas que las usadas para clonar secuencias con cebadores de secuencia unicos contra secuencias conocidas.

Como alternativa, dichos polinucleotidos pueden obtenerse mediante mutagenesis dirigida a sitio de secuencias caracterizadas. Esto puede ser util cuando se requieren, por ejemplo, cambios de secuencia de codon silenciosos para optimizar las preferencias de codon por una celula hospedadora particular en que se expresan las secuencias polinucleotidicas. Pueden desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzima de restriccion, o para alterar la propiedad o funcion de los polipeptidos codificados por los polinucleotidos.

Los polinucleotidos (secuencias nucleotfdicas) de la invencion pueden usarse para producir un cebador, p.ej. un cebador de PCR, un cebador para una reaccion de amplificacion alternativa, una sonda, p.ej. marcada con un marcaje revelador por medios convencionales usando marcajes radiactivos o no radiactivos, o el polinucleotido puede clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos seran de al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40 nucleotidos de longitud, y estan tambien englobados por el termino polinucleotidos como se usa en la presente memoria.

Los polinucleotidos tales como polinucleotidos y sondas de ADN pueden producirse recombinante, sinteticamente o mediante cualquier medio disponible por los especialistas en la materia. Pueden clonarse tambien por tecnicas estandares.

En general, se produciran cebadores por medios sinteticos, que implican una fabricacion por etapas de la secuencia de acido nucleico deseada de un nucleotido cada vez. Las tecnicas para lograr estos usando tecnicas automatizadas estan facilmente disponibles en la materia.

Se produciran generalmente polinucleotidos mas largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando tecnicas de clonacion por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa). Los cebadores pueden disenarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion adecuados de modo que pueda clonarse el ADN amplificado en un vector de clonacion adecuado.

Hibridacion

La presente memoria descriptiva engloba tambien secuencias que son complementarias de las secuencias de acido nucleico de la presente invencion, o secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias de la presente invencion o las secuencias que son complementarias de las mismas.

El termino “hibridacion” como se usa en la presente memoria incluira “el proceso mediante el cual se une una hebra de un acido nucleico con una hebra complementaria mediante apareamiento de bases”, asf como el proceso de amplificacion como se lleva a cabo en las tecnologfas de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

La presente memoria descriptiva engloba tambien el uso de secuencias nucleotidicas que son capaces de hibridar con secuencias que son complementarias de las secuencias presentadas en la presente memoria, o cualquier derivado, fragmento o derivado de las mismas.

El termino “variante” engloba tambien secuencias que son complementarias de secuencias que son capaces de hibridar con las secuencias nucleotfdicas presentadas en la presente memoria.

Preferiblemente, el termino “variante” engloba secuencias que son complementarias de secuencias que son capaces de hibridar en condiciones rigurosas (p.ej., 50°C y 0,2xSsC {1xSSC= NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0}) con las secuencias nucleotidicas presentadas en la presente memoria.

Mas preferiblemente, el termino “variante” engloba secuencias que son complementarias de secuencias que son capaces de hibridar en condiciones de alto rigor (p.ej. 65°C y 0,1xSSC {1xSsC= NaCl 0,15 M, citrato de Na3 0,015 M, pH 7,0}) con las secuencias nucleotfdicas presentadas en la presente memoria.

La presente invencion se refiere tambien a secuencias nucleotidicas que pueden hibridar con las secuencias nucleotfdicas de la presente invencion (incluyendo secuencias complementarias de aquellas presentadas en la presente memoria).

La presente invencion se refiere tambien a secuencias nucleotidicas que son complementarias de secuencias que pueden hibridar con las secuencias nucleotfdicas de la presente invencion (incluyendo secuencias complementarias de aquellas presentadas en la presente memoria).

Se incluyen tambien en el alcance de la presente memoria descriptiva secuencias polinucleotfdicas que son capaces de hibridar con las secuencias nucleotfdicas presentadas en la presente memoria en condiciones de rigor intermedio

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a maximo.

En un aspecto preferido, la presente memoria descriptiva cubre secuencias nucleotidicas que pueden hibridar con la secuencia nucleotidica de la presente invencion, o el complemento de la misma, en condiciones rigurosas (p.ej. 50°C y 0,2xSSC).

En un aspecto mas preferido, la presente memoria descriptiva cubre secuencias nucleotfdicas que pueden hibridar con la secuencia nucleotfdica de la presente invencion, o el complemento de la misma, en condiciones de alto rigor (p.ej. 65°Cy 0,1xSSC).

Evolucion molecular

Como ejemplo no limitante, es posible producir numerosas mutaciones dirigidas a sitio o aleatorias en una secuencia nucleotidica, tanto in vivo como in vitro, y posteriormente verificar la funcionalidad mejorada del polipeptido codificado por diversos medios.

Ademas, pueden recombinarse mutaciones o variantes naturales de una secuencia polinucleotfdica con el tipo silvestre u otras mutaciones o variantes naturales, produciendo nuevas variantes. En dichas nuevas variantes, puede verificarse tambien la funcionalidad mejorada del polipeptido codificado. Puede conseguirse la produccion de nuevas variantes preferidas mediante diversos metodos bien establecidos en la materia, por ejemplo mutagenesis de umbral de error (documento WO 92/18645), mutagenesis aleatoria mediada por oligonucleotidos (documento US 5.723.323), transposicion de ADN (documento US 5.605.793), ensamblaje genico exomediado (documento WO00/58517). La aplicacion de estos metodos de evolucion molecular dirigidos aleatorios y similares permite la identificacion y seleccion de variantes de las enzimas de la presente invencion que tienen caractensticas preferidas sin un conocimiento previo de la estructura o funcion proteica, y permite la produccion de mutaciones o variantes no predecibles pero beneficiosas. Existen numerosos ejemplos de la aplicacion de evolucion molecular en la materia para la optimizacion o alteracion de actividad enzimatica, dichos ejemplos incluyen, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes:

expresion y/o actividad optimizada en una celula hospedadora o in vitro, actividad enzimatica aumentada, especificidad de sustrato y/o producto alterada, estabilidad enzimatica o estructural aumentada o disminuida, actividad/especificidad enzimatica alterada en condiciones ambientales preferidas, p.ej. temperatura, pH, sustrato.

Mutagenesis dirigida a sitio

Una vez se ha aislado una secuencia nucleotidica codificante de protema, o se ha identificado una presunta secuencia nucleotidica codificante de protema, puede ser deseable mutar la secuencia para preparar una protema de la presente invencion.

Las mutaciones pueden introducirse usando oligonucleotidos sinteticos. Estos oligonucleotidos contienen secuencias nucleotidicas que flanquean sitios de mutacion deseados.

Se divulga un metodo adecuado en Morinaga et al., (Biotechnology (1984) 2, pag. 646-649). Se describe otro metodo de introduccion de mutaciones en secuencias nucleotidicas codificantes de enzima en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, pag. 147-151).

Recombinante

En un aspecto, la secuencia para uso en la presente invencion es una secuencia recombinante, concretamente una secuencia que se ha preparado usando tecnicas de ADN recombinante.

Estas tecnicas de ADN recombinante estan dentro de las capacidades de un especialista en la materia. Dichas tecnicas se explican en la bibliograffa, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T Maniatis, 1989, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2a edicion, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sintetica

En un aspecto, la secuencia para uso en la presente invencion es una secuencia sintetica, concretamente una secuencia que se ha preparado mediante smtesis qmmica o enzimatica in vitro. Incluye, pero sin limitacion, secuencias elaboradas con un uso de codon optimo para los organismos hospedadores T. reesei

Expresion de enzimas

La secuencia nucleotfdica para uso en la presente invencion puede incorporarse a un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar y expresar la secuencia nucleotidica, en forma de protema, y/o a partir de una celula hospedadora compatible.

La expresion puede controlarse usando secuencias de control, p.ej. secuencias reguladoras.

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La protema producida por una celula recombinante hospedadora por expresion de la secuencia nucleotidica puede secretarse o puede estar contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o del vector usado. Las secuencias de codificacion pueden disenarse con secuencias senal que dirijan la secrecion de secuencias de codificacion de sustancia a traves de una membrana celular procariotica o eucariotica particular.

Vector de expresion

El termino “vector de expresion” significa un constructo capaz de expresion in vivo o in vitro.

Preferiblemente, se incorpora el vector de expresion al genoma de un organismo hospedador adecuado. El termino “incorporar” cubre preferiblemente incorporacion estable al genoma.

La secuencia nucleotidica de la presente invencion puede estar presente en un vector en que la secuencia nucleotfdica esta ligada operativamente con secuencias reguladoras capaces de proporcionar la expresion de la secuencia nucleotidica por un organismo hospedador adecuado.

Los vectores para uso en la presente invencion pueden transformarse en una celula hospedadora adecuada como se describe a continuacion, proporcionando la expresion de un polipeptido de la presente invencion.

La eleccion del vector, p.ej. un plasmido, cosmido o vector de fago, dependera a menudo de la celula hospedadora en que se vaya a introducir.

Los vectores para uso en la presente invencion pueden contener uno o mas genes marcadores seleccionables, tales como un gen que confiere resistencia a antibioticos p.ej. resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Como alternativa, la seleccion puede lograrse mediante cotransformacion (como se describe en el documento WO91/17243).

Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo para la produccion de ARN, o usarse para transfectar, transformar, transducir o infectar una celula hospedadora.

Por tanto, en una realizacion adicional, la memoria descriptiva proporciona un metodo de elaboracion de secuencias nucleotfdicas de la presente invencion mediante la introduccion de una secuencia nucleotidica de la presente invencion en un vector replicable, la introduccion del vector en una celula hospedadora compatible y el crecimiento de la celula hospedadora en condiciones que causen la replicacion del vector.

El vector puede comprender ademas una secuencia nucleotidica que posibilite al vector replicar en la celula hospedadora en cuestion. Son ejemplos de dichas secuencias los ongenes de replicacion de los plasmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMBI y pIJ702.

Secuencias reguladoras

En algunas aplicaciones, la secuencia nucleotidica para uso en la presente invencion puede estar ligada operativamente con una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresion de la secuencia nucleotfdica, tal como por la celula hospedadora elegida. A modo de ejemplo, la presente memoria descriptiva cubre un vector que comprende la secuencia nucleotidica de la presente invencion ligada operativamente con dicha secuencia reguladora, concretamente el vector es un vector de expresion.

El termino “ligado operativamente” hace referencia a una yuxtaposicion en la que los componentes descritos estan en una relacion que les permite funcionar de su manera pretendida. Una secuencia reguladora “ligada operativamente” con una secuencia de codificacion esta ligada de tal modo que se consiga la expresion de la secuencia de codificacion en condiciones compatible con las secuencias de control.

El termino “secuencias reguladoras” incluye promotores y potenciadores y otras senales de regulacion de la expresion.

El termino “promotor” se usa en el sentido normal de la materia, p.ej., un sitio de union a ARN polimerasa.

Puede conseguirse tambien la expresion potenciada de la secuencia nucleotidica que codifica la enzima de la presente invencion mediante la seleccion de regiones reguladoras heterologas, p.ej. regiones promotora, lfder de secrecion y terminadora.

Preferiblemente, la secuencia nucleotfdica segun la presente invencion esta ligada operativamente con al menos un promotor.

Pueden usarse incluso otros promotores para dirigir la expresion de polipeptido de la presente invencion.

Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion de la secuencia nucleotidica en un hospedador bacteriano, fungico o de levadura son bien conocidos en la materia.

En una realizacion, puede ser un promotor adecuado un promotor de celobiohidrolasa.

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En una realizacion, puede ser un promotor adecuado un promotor de celobiohidrolasa obtenible (u obtenido) a partir de T. reesei.

El promotor puede incluir adicionalmente rasgos para asegurar o aumentar la expresion en un hospedador adecuado. Por ejemplo, los rasgos pueden ser regiones conservadas tales como sitios de union a factor de transcripcion o sitios de union a represor eliminados.

Constructos

El termino “constructo”, que es sinonimo de terminos tales como “conjugado”, “modulo” e “hubrido”, incluye una secuencia nucleotidica para uso segun la presente invencion enlazada directa o indirectamente con un promotor.

Es un ejemplo de un enlazamiento indirecto la provision de un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia intronica, tal como el intron Sh1 o el intron ADH, intermedio entre el promotor y la secuencia nucleotidica de la presente invencion. Se aplica lo mismo para el termino “fusionado” con relacion a la presente invencion, que incluye enlazamiento directo o indirecto. En algunos casos, los terminos no cubren la combinacion natural de la secuencia nucleotidica que codifica protema asociada normalmente al promotor tipo silvestre, y cuando estan ambas en su entorno natural.

El constructo puede incluso contener o expresar un marcador que permita la seleccion del constructo genetico.

Para algunas aplicaciones, preferiblemente el constructo de la presente memoria descriptiva comprende al menos la secuencia nucleotidica de la presente invencion ligada operativamente con un promotor.

Celulas hospedadoras

El termino “celula hospedadora”, con relacion a la presente invencion, incluye cualquier celula de T. reesei que comprenda la secuencia nucleotfdica o un vector de expresion como se describe anteriormente, y que se use en la produccion recombinante de una protema que tiene las propiedades espedficas definidas en la presente memoria.

Por tanto, la presente invencion proporciona celulas hospedadoras T. reesei transformadas o transfectadas con una secuencia nucleotfdica que expresa la protema de la presente invencion.

El uso de una celula hospedadora T reesei puede proporcionar modificaciones postraduccionales (p.ej., miristoilacion, glicosilacion, truncamiento, lapidacion y fosforilacion de tirosina, serina o treonina), segun puedan necesitarse, para conferir una actividad biologica optima a productos de expresion recombinante de la presente invencion.

Organismo

El termino “organismo” con relacion a la presente invencion incluye T. reesei que comprende la secuencia nucleotfdica que codifica el polipeptido segun la presente invencion y/o productos obtenidos a partir del mismo, y/o en la que un promotor puede permitir la expresion de la secuencia nucleotidica segun la presente invencion cuando esta presente en el organismo.

El organismo es T. reesei.

El termino “organismo transgenico” con relacion a la presente invencion incluye un T. reesei que comprende la secuencia nucleotfdica que codifica el polipeptido segun la presente invencion y/o los productos obtenidos a partir de la misma, y/o en la que un promotor puede permitir la expresion de la secuencia nucleotidica segun la presente invencion en el organismo. Preferiblemente, la secuencia nucleotfdica se incorpora al genoma del organismo.

El termino “organismo transgenico” no cubre secuencias de codificacion nucleotfdicas nativas en su entorno natural cuando estan bajo el control de su promotor nativo que esta tambien en su entorno natural.

Por lo tanto, el organismo transgenico para uso en la presente invencion incluye un organismo que comprende una cualquiera, o combinaciones, de la secuencia nucleotidica que codifica el polipeptido segun la presente invencion, constructos como se ensenan en la presente memoria, vectores como se ensenan en la presente memoria, plasmidos como se ensenan en la presente memoria, celulas como se ensenan en la presente memoria, tejidos como se ensenan en la presente memoria o los productos de los mismos.

Por ejemplo, el organismo transgenico puede comprender tambien la secuencia nucleotidica que codifica el polipeptido de la presente invencion bajo el control de un promotor heterologo.

Transformacion de celulas/organismos hospedadores

Los hongos filamentosos pueden transformarse usando diversos metodos conocidos en la materia, tales como un proceso que implica la formacion de protoplastos y la transformacion de protoplastos seguida de regeneracion de la pared celular de manera conocida.

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Se presentan las ensenanzas generales sobre la transformacion de hongos en las siguientes secciones.

Hongo transformado

El organismo hospedador es T. reesei

Se discute la transformadon de hongos filamentosos en el documento US-A-5741665, que afirma que las tecnicas estandares para la transformacion de hongos filamentosos y el cultivo de los hongos son bien conocidas en la materia. Se encuentra una revision extensa de las tecnicas aplicadas a N. crassa, por ejemplo, en Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.

Se revisan ensenanzas adicionales, que puede utilizarse tambien en la transformacion de hongos filamentosos, en el documento US-A-5674707.

Ademas, se ensena la expresion genica en hongos filamentosos en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol mayo de 2002; 20(5): 200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4): 273-306.

La presente memoria descriptiva engloba la produccion de hongos filamentosos transgenicos segun la presente invencion preparados mediante el uso de estas tecnicas estandares.

Cultivo y produccion

Las celulas hospedadoras T. reesei transformadas con la secuencia nucleotfdica de la presente invencion pueden cultivarse en condiciones conducentes a la produccion del polipeptido codificado y que facilitan la recuperacion del polipeptido de la celula o celulas y/o del medio de cultivo.

En una realizacion, la celula o celulas de T. reesei transformadas o transfectadas proporcionadas de acuerdo con la presente invencion se cultivan en condiciones selectivas para permitir la seleccion de la celula o celulas transformadas o transfectadas con la enzima lipolftica como se define en la presente memoria.

El medio usado para cultivar la celula o celulas puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la celula hospedadora en cuestion y obtener la expresion del polipeptido.

La protema producida por una celula recombinante puede exhibirse sobre la superficie de la celula.

La protema puede secretarse por las celulas hospedadoras y puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo usando procedimientos bien conocidos.

Secrecion

A menudo, es deseable secretar la protema del hospedador de expresion al medio de cultivo, de donde la protema puede recuperarse mas facilmente. Segun la presente memoria descriptiva, la secuencia lfder de secrecion puede seleccionarse basandose en el hospedador de expresion deseado. Pueden usarse tambien secuencias senal dbridas con el contexto de la presente invencion.

Los ejemplos tfpicos de secuencias lfder de secrecion heterologas son aquellos originarios del gen de amiloglucosidasa fungica (AG) (g/aA - ambas versiones de 18 y 24 aminoacidos, p.ej. de Aspergillus), el gen de factor a (levaduras, p.ej. Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de amilasa (Bacillus).

En una realizacion, preferiblemente el peptido senal es aquel mostrado en la SEQ ID NO: 1 en negrita en la Figura 15. En una realizacion, el peptido senal mostrado en negrita en la figura 15 se escinde postraduccionalmente, proporcionando un peptido que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.

Deteccion

Son conocidos en la materia una variedad de protocolos para detectar y medir la expresion de la secuencia aminoaddica. Los ejemplos incluyen ensayo de inmunosorcion ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS).

Son conocidas una amplia variedad de marcajes y tecnicas de conjugacion por los especialistas en la materia y pueden usarse en diversos ensayos nucleicos y aminoaddicos.

Una serie de compares tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) suministran kits comerciales y protocolos para estos procedimientos.

Las moleculas o marcajes informadores adecuados incluyen los radionucleidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogenicos, asf como sustratos, cofactores, inhibidores, partmulas magneticas y similares. Las patentes que ensenan el uso de dichos marcajes incluyen los documentos US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149yUS-A-4.366.241.

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Tambien pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el documento US-A-4.816.567 Protemas de fusion

La secuencia aminoaddica para uso segun la presente invencion puede producirse como una protema de fusion, por ejemplo para ayudar a la extraccion y purificacion. Los ejemplos de copartfcipes de protema de fusion incluyen glutation-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de union a ADN y/o activacion transcripcional) y (galactosidasa). Puede ser tambien conveniente incluir un sitio de escision proteolftico entre el copartfcipe de protema de fusion y la secuencia proteica de interes para permitir la retirada de secuencias de la protema de fusion.

Preferiblemente, la protema de fusion no impedira la actividad de la secuencia proteica.

POI adicionales

Las secuencias para uso segun la presente invencion pueden usarse tambien junto con una o mas protemas de interes (POI) o secuencias nucleotidicas de interes (NOI) adicionales.

Los ejemplos no limitantes de POI incluyen: protemas o enzimas implicadas en el metabolismo del almidon, protemas o enzimas implicadas en el metabolismo del glicogeno, acetilesterasas, aminopeptidasas, amilasas, arabinasas, arabinofuranosidasas, carboxipeptidasas, catalasas, celulasas, quitinasas, quimosina, cutinasa, desoxirribonucleasas, epimerasas, esterasas, galactosidasas, galactosidasas, glucanasas, glucano liasas, endoglucanasas, glucoamilasas, glucosa oxidasas, glucosidasas, glucosidasas, glucuronidasas, hemicelulasas, hexosa oxidasas, hidrolasas, invertasas, isomerasas, lacasas, fosfolipasas, galactolipasas, ftpido aciltransferasa, liasas, manosidasas, oxidasas, oxidorreductasas, pectato liasas, pectina acetileterasas, pectina despolimerasas, pectina metilesterasas, enzimas pectinolfticas, peroxidasas, fenoloxidasas, fitasas, poligalacturonasas, proteasas, ramnogalacturonasas, ribonucleasas, taumatina, transferasas, protemas de transporte, transglutaminasas, xilanasas, hexosa oxidasa (D-hexosa: O2-oxidorreductasa, EC 1.1.3.5) o combinaciones de las mismas. Las NOI pueden incluso ser una secuencia anticodificante de cualquiera de esas secuencias.

La POI puede ser incluso una protema de fusion, por ejemplo para ayudar a la extraccion y purificacion.

La POI puede estar incluso fusionada con una secuencia de secrecion.

Otras secuencias pueden facilitar tambien la secrecion o aumentar el rendimiento de POI secretadas. Dichas secuencias podnan codificar protemas chaperonas como como por ejemplo el producto del gen cyp B de Aspergillus niger descrito en la aplicacion de patente del RU 9821198.0.

La NOI puede genomanipularse para alterar su actividad por una serie de razones, incluyendo pero sin limitacion, alteraciones que modifican el procesamiento y/o la expresion del producto de expresion de la misma. A modo de ejemplo adicional, la NOI puede modificarse tambien para optimizar la expresion en una celula hospedadora particular. Pueden desearse otros cambios de secuencia para introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion.

La NOI puede incluir en ella nucleotidos sinteticos o modificados, tales como esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato.

La NOI puede modificarse para aumentar la estabilidad intracelular y la vida media. Las posibles modificaciones incluyen, pero sin limitacion, la adicion de secuencias flanqueantes de los extremos 5' y/o 3' de la molecula o el uso de ligamientos de fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de fosfodiesterasa en el esqueleto de la molecula.

Produccion/aplicacion a gran escala

En una realizacion preferida de la presente memoria descriptiva, se usa la enzima lipolftica para aplicaciones a gran escala y/o se produce a gran escala.

El termino gran escala significa en un fermentador o condiciones de cultivo de al menos 1000 litros.

Preferiblemente, la enzima lipolftica se produce en una cantidad de al menos 5 g por litro de volumen de cultivo celular total despues del cultivo del organismo hospedador. Preferiblemente, la enzima lipolftica se produce en una cantidad de al menos 10 g por litro de volumen de cultivo celular total despues del cultivo del organismo hospedador. Preferiblemente, se produce la enzima lipolftica en una cantidad de al menos 15 g por litro del volumen de cultivo celular total despues del cultivo del organismo hospedador. Preferiblemente, se produce la enzima lipolftica en una cantidad de al menos 20 g por litro del volumen de cultivo celular total despues del cultivo del organismo hospedador.

Fermentacion

Las enzimas de la presente invencion puede producirse por cultivo solido o sumergido, incluyendo procesos por lotes, de flujo semicontinuo y continuo. El cultivo se logra en un medio de crecimiento que comprende un medio

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acuoso de sales minerales, factores de crecimiento organicos, material fuente de carbono y ene^a, ox^geno molecular y, por supuesto, un inoculo de partida de una o mas especies de microorganismos particulares para emplear.

Ademas de la fuente de carbono y energfa, oxfgeno, nitrogeno asimilable y un inoculo del microorganismo, es necesario suministrar cantidades adecuadas en proporciones apropiadas de nutrientes minerales para asegurar un crecimiento apropiado del microorganismo, maximizar la asimilacion de la fuente de carbono y energfa por las celulas en el proceso de conversion microbiana y conseguir los rendimientos celulares maximos con la densidad celular maxima en los medios de fermentacion.

La composicion del medio mineral acuoso puede variar en un amplio intervalo, dependiendo en parte del microorganismo y del sustrato empleado, como es conocido en la materia. Los medios minerales debenan incluir, ademas de nitrogeno, cantidades adecuadas de fosforo, magnesio, calcio, potasio, azufre y sodio, en formas ionicas y combinadas asimilables solubles adecuadas, y tambien debenan estar preferiblemente presentes ciertos elementos traza tales como cobre, manganeso, molibdeno, cinc, hierro, boro y yodo, y otros, de nuevo en forma asimilable soluble adecuada, todo como es conocido en la materia.

La reaccion de fermentacion es un proceso aerobico en que se suministra el oxfgeno molecular por un gas que contiene oxfgeno tal como aire, aire enriquecido con oxfgeno o incluso oxfgeno molecular sustancialmente puro, a condicion de que mantenga los contenidos del recipiente de fermentacion con una presion parcial de oxfgeno adecuada para ayudar a la especie de microorganismo a crecer de forma floreciente. En efecto, al usar un sustrato hidrocarburo oxigenado, se reduce el requisito de oxfgeno para el crecimiento del microorganismo. No obstante, debe suministrarse oxfgeno molecular para el crecimiento, puesto que la asimilacion del sustrato y el correspondiente crecimiento de los microorganismos es, en parte, un proceso de combustion.

Aunque la velocidad de aireacion puede variar en un intervalo considerable, la aireacion se realiza generalmente a una velocidad que esta en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 10, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 7 volumenes (a la presion empleada y a 25°C) de gas que contiene oxfgeno por volumen de lfquido en el fermentador por minuto. Esta cantidad esta basada en el aire de contenido de oxfgeno normal que se suministra al reactor, y en terminos de oxfgeno puro, los intervalos respectivos senan de aproximadamente 0,1 a 1,7, o preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 1,3, volumenes (a la presion empleada y a 25°C) de oxfgeno por volumen de lfquido en el fermentador por minuto.

La presion empleada para el proceso de conversion microbiana puede oscilar ampliamente. Las presiones estan generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0 a 345 kPa (de aproximadamente 0 a 50 psig), actualmente preferiblemente de aproximadamente 0 a 207 kPa (de aproximadamente 0 a 30 psig), mas preferiblemente ligeramente por encima de la presion atmosferica, para conseguir un equilibrio del coste de equipos y operativo frente a la solubilidad del oxfgeno. Son ventajosas presiones mayores que la atmosferica porque dichas presiones no tienden a aumentar la concentracion de oxfgeno disuelto en el fermento acuoso, lo que su vez puede ayudar a aumentar las velocidades de crecimiento celular. Al mismo tiempo, esto se equilibra por el hecho de que las altas presiones atmosfericas aumentan los costes de equipos y operativos.

La temperatura de fermentacion puede variar algo, pero para hongos filamentosos tales como Trichoderma reesei, la temperatura estara generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 20 a 40°C, generalmente preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 25 a 34°C, dependiendo de la cepa de microorganismo elegida.

Los microorganismos requieren tambien una fuente de nitrogeno asimilable. La fuente de nitrogeno asimilable puede ser cualquier compuesto o compuestos que contienen nitrogeno capaz de liberar nitrogeno en una forma adecuada para utilizacion metabolica por el microorganismo. Aunque pueden emplearse una variedad de compuestos fuente de nitrogeno organico, tales como hidrolizados de protema, habitualmente pueden utilizarse compuestos que contienen nitrogeno baratos tales como amoniaco, hidroxido de amonio, urea y diversas sales de amonio tales como fosfato de amonio, sulfato de amonio, pirofosfato de amonio, cloruro de amonio o diversos otros compuestos de amonio. El amoniaco gas mismo es conveniente para operaciones a gran escala, y puede emplearse burbujeando a traves del fermento acuoso (medio de fermentacion) en cantidades adecuadas. Al mismo tiempo, dicho amoniaco puede emplearse tambien para ayudar al control del pH.

El intervalo de pH en el fermento microbiano acuoso (mezcla de fermentacion) debena estar en el intervalo ejemplar de aproximadamente 2,0 a 8,0. Con hongos filamentosos, el pH esta normalmente en el intervalo de aproximadamente 2,5 a 8,0; con Trichoderma reesei, el pH esta normalmente en el intervalo de aproximadamente 3,0 a 7,0. Las preferencias de pH para ciertos microorganismos dependen de los medios empleados en cierta medida, asf como del microorganismo particular, y por tanto cambian algo con el cambio de medios, como puede determinarse facilmente por los especialistas en la materia.

Aunque el tiempo medio de retencion de la mezcla de fermentacion en el fermentador puede variar considerablemente, dependiendo en parte de la temperatura de fermentacion y el cultivo empleado, generalmente estara en el intervalo de aproximadamente 24 a 500 horas, preferiblemente actualmente de aproximadamente 24 a 400 horas. Preferiblemente, la fermentacion se realiza de tal manera que el sustrato que contiene carbono pueda

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controlarse como factor limitante, proporcionando as^ una buena conversion del sustrato que contiene carbono en celulas y evitando la contaminacion de las celulas con una cantidad sustancial de sustrato no convertido. Esto ultimo no es un problema con sustratos hidrosolubles, puesto que se desprende facilmente por lavado cualquier traza restante. Sin embargo, puede ser un problema en el caso de sustratos no hidrosolubles, y requiere etapas de tratamiento de producto anadidas tales como etapas de lavado adecuadas. Como se describe anteriormente, el tiempo para alcanzar este nivel no es cntico y puede variar con el microorganismo y el proceso de fermentacion particular que se realicen. Sin embargo, es bien conocido en la materia como determinar la concentracion de fuente de carbono en el medio de fermentacion y si se ha conseguido o no el nivel deseado de fuente de carbono.

Aunque la fermentacion puede realizarse como una operacion en lotes o continua, es mucho mas preferida la operacion semicontinua por la facilidad de control, produccion de cantidades uniformes de productos y usos mas economicos de todos los equipos. Si se desea, pueden anadirse parte o todo el material fuente de carbono y energfa y/o parte de la fuente de nitrogeno asimilable tal como amoniaco al medio mineral acuoso antes de alimentar el medio mineral acuoso al fermentador. Cada una de las corrientes introducidas en el reactor se controla preferiblemente a una velocidad predeterminada, o en respuesta a una necesidad determinable monitorizando tales como concentracion de sustrato de carbono y energfa, pH, oxfgeno disuelto, oxfgeno o dioxido de carbono en los gases de salida del fermentador, densidad celular mensurable por transmitancia de luz o similares. Las velocidades de alimentacion de los diversos materiales pueden variarse de modo que se obtenga una velocidad de crecimiento celular lo mas rapido posible, consistente con una utilizacion eficaz de la fuente de carbono y energfa, para obtener el rendimiento de celulas de microorganismos mayor posible respecto a la carga de sustrato.

En la operacion por lotes o la semicontinua preferida, todos de equipo, reactor o medio de fermentacion, recipiente o envase, conducciones, dispositivos de circulacion o enfriamiento auxiliares y similares se esterilizan inicialmente, habitualmente empleando vapor tal como a aproximadamente 121°C durante al menos aproximadamente 15 minutos. Se inocula entonces en el reactor esterilizado un cultivo del microorganismo seleccionado en presencia de todos los nutrientes requeridos, incluyendo oxfgeno y el sustrato que contiene carbono. El tipo de fermentador empleado no es cntico, aunque se prefiere actualmente la operacion con Biolafitte de 15 l (Saint-Germain-en-Laye, Francia)

La recogida y purificacion de las enzimas de la presente invencion del caldo de fermentacion puede hacerse tambien mediante procedimientos conocidos per se en la materia. El caldo de fermentacion contendra generalmente desechos celulares, incluyendo celulas, diversos solidos suspendidos y otros contaminantes de biomasa, asf como el producto enzimatico deseado de la presente invencion, que se retiran preferiblemente del caldo de fermentacion por medios conocidos en la materia. Los procesos adecuados para dicha retirada incluyen tecnicas de separacion solido-lfquido convencionales tales como, p.ej., centrifugacion, filtracion, dialisis, microfiltracion, filtracion en rotavapor u otros procesos conocidos, produciendo un filtrado exento de celulas. Puede ser preferible concentrar ademas el caldo de fermentacion o el filtrado exento de celulas usando tecnicas tales como ultrafiltracion, evaporacion o precipitacion. La precipitacion de los componentes proteicos del sobrenadante o filtrado puede lograrse mediante una sal, p.ej. sulfato de amonio. Puede conseguirse opcionalmente una purificacion adicional mediante cristalizacion o mediante una variedad de procedimientos cromatograficos, p.ej. cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad o procedimientos reconocidos en la materia similares.

La lipasa puede formularse ademas antes del uso en comestibles. La lipasa puede estar en una formulacion lfquida, secada o granulada.

En una realizacion, puede usarse un portador, preferiblemente el portador es trigo o un componente de trigo.

En una realizacion, la lipasa se seca sobre trigo o se seca sobre uno o mas componentes de trigo.

En una realizacion, la lipasa es una formulacion lfquida adecuada para consumo, preferiblemente dicha composicion lfquida contiene tampon, sales, sorbitol y/o glicerol.

En una realizacion, la lipasa se granula o cogranula con otras enzimas.

Alimento

La enzima de la presente invencion puede usarse como, o en la preparacion de, un alimento. Aqrn, el termino “alimento” significa alimento pretendido para consumo humano. Tambien el termino “comestible” significa un comestible pretendido para consumo humano.

El alimento puede estar en forma de una solucion o un solido, dependiendo del uso y/o del modo de aplicacion y/o del modo de administracion.

Cuando se usa como, o en la preparacion de, un alimento, tal como un alimento funcional, la enzima de la presente invencion puede usarse junto con uno o mas de: un portador nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un coadyuvante nutricionalmente aceptable y un ingrediente nutricionalmente activo.

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Ingrediente alimentario

La enzima de la presente invencion puede usarse como un ingrediente alimentario y/o puede estar comprendida en una composicion de aditivo alimentario para seres humanos.

Como se usa en la presente memoria, el termino “ingrediente alimentario” incluye una formulacion que es o puede anadirse a comidas o comestibles funcionales como suplemento nutricional y/o suplemento de fibra.

El ingrediente alimentario puede estar en forma de una solucion o un solido, dependiendo del uso y/o dependiendo del modo de aplicacion y/o del modo de administracion.

Suplementos alimentarios

La composicion de la presente invencion puede ser, o puede anadirse a, suplementos alimentarios para seres humanos.

Alimentos funcionales

La composicion de la presente invencion puede ser, o puede anadirse a, alimentos funcionales para seres humanos.

Como se usa en la presente memoria, el termino “alimento funcional” significa un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutritivo y/o una satisfaccion gustativa a un ser humano, sino que es tambien capaz de suministrar un efecto beneficioso adicional al consumidor

Por consiguiente, los alimentos funcionales son habitualmente alimentos que tienen componentes o ingredientes (tales como los descritos en la presente memoria) incorporados a ellos que confieren al alimento un beneficio funcional espedfico, p.ej. medico o fisiologico, distinto de un efecto puramente nutritivo a un ser humano.

Aunque no existe una definicion legal de alimento funcional, la mayona de partes con interes en esta area coinciden en que son alimentos comercializados por tener efectos saludables espedficos.

Algunos alimentos funcionales son nutraceuticos. Aqm, el termino “nutraceutico” significa un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional y/o una satisfaccion gustativa, sino que es tambien capaz de suministrar un efecto terapeutico (u otro beneficioso) al consumidor. Los nutraceuticos cruzan las lmeas divisorias tradicionales entre alimentos y medicinas.

Las encuestas han sugerido que los consumidores hacen mas hincapie en las afirmaciones de alimentos funcionales relativas a la enfermedad cardiaca. Prevenir el cancer es otro aspecto de la nutricion que interesa muchnsimo a los consumidores, pero de forma interesante es el area sobre la que los consumidores sienten que ejercen menos control. De hecho, segun la Organizacion Mundial de la Salud, al menos un 35% de los casos de cancer estan relacionados con la dieta. Ademas, las afirmaciones relativas a la osteoporosis, salud intestinal y efectos sobre la obesidad son tambien factores clave que es probable que inciten a la adquisicion de alimentos funcionales e impulsen el desarrollo del mercado.

Productos alimentarios

La composicion de la presente invencion puede usarse en la preparacion de productos alimentarios para seres humanos tales como uno o mas de: mermeladas, mermeladas dtricas, jaleas, productos lacteos (tales como leche o queso), productos carnicos, productos avfcolas, productos del pescado y productos de repostena.

A modo de ejemplo, la enzima de la presente invencion puede usarse como ingrediente de refrescos, zumo de frutas o una bebida que comprende protema de suero, tes medicinales, bebidas de cacao, bebidas de leche y bebidas de bacterias de acido lactico, yogur y yogur bebible, queso, helado, polos y postres, pastelena, tartas de bizcocho y mezclas para tartas, aperitivos, cereales de desayuno, fideos instantaneos y fideos en vaso, sopas instantaneas y sopas en vaso, alimentos y bebidas equilibrados, edulcorantes, tacos, tortillas, barritas de aperitivo de textura mejorada, barritas de fibra, rellenos de fruta estables al horneado, bano para tartas, relleno de repostena de chocolate, relleno aromatizado de tarta de queso, relleno de tarta aromatizado con fruta, glaseado de tarta y rosquillas, relleno de repostena termoestable, cremas de relleno de repostena instantaneas, relleno para galletas, relleno de repostena listo para usar, relleno bajo en calonas, bebida nutritiva para adultos, bebida/zumo de soja acidificado, bebida de chocolate aseptica/destilada, cocteles, bebidas en polvo, leche de soja/clasica con chocolate enriquecida con calcio, bebida de cafe enriquecida con calcio.

Una enzima segun la presente invencion puede usarse ademas como ingrediente en productos alimentarios tales como salsa de queso americana, agente antiapelmazante para queso rallado y desmenuzado, salsa para mojar patatas fritas, queso en crema, crema agria desnatada de cobertura batida mezclada en seco, crema batida lactea congelada/descongelada, cobertura batida estable a la congelacion/descongelacion, queso cheddar natural bajo en grasas y ligero, yogur de estilo suizo bajo en grasas, postres congelados gasificados y barritas de golosinas, helado duro, helado duro de etiquetado comprensible, economfa y gratificacion mejoradas, helado bajo en grasas: helado suave, salsa de barbacoa, salsa de queso para mojar, aderezo de requeson, salsa Alfredo de mezcla seca, salsa de

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queso de mezcla, salsa de tomate de mezcla seca y otros.

Para ciertos aspectos, preferiblemente el comestible es una bebida.

Para ciertos aspectos, preferiblemente el comestible es un producto de repostena, tal como pan, pastas danesas, bizcochos o galletas.

Pienso

La enzima de la presente invencion puede usarse como, o en la preparacion de, un pienso animal o un componente de mismo. Por tanto, la presente memoria descriptiva comprende tambien un pienso que comprende o esta compuesto por la enzima de la presente invencion, y un proceso para elaborar el mismo.

Detergente

La enzima de la presente invencion puede usarse como, o en la preparacion de, un detergente o un componente de mismo. Por tanto, la presente memoria descriptiva engloba tambien un detergente que comprende o esta compuesto por la enzima de la presente invencion, y un proceso para elaborar el mismo

Tecnicas generales de metodologfa de adn recombinante

La presente invencion emplea, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de qmmica, biologfa molecular, microbiologfa, ADN recombinante e inmunoiogfa que estan dentro de las capacidades de un especialista en la materia. Dichas tecnicas se explican en la bibliograffa. Veanse, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2a edicion, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periodicos; “Current Protocols in Molecular Biology”, cap. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, “DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques”, John Wiley & Sons; M. J. Gait (Editor), 1984, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach”, Irl Press y D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, “Methods of Enzymology: dNa Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology”, Academic Press.

La invencion se describira ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos.

Breve descripcion de las figuras

La presente invencion se ilustra ademas por referencia a las figuras adjuntas, en que:

La Figura 1 muestra un modelo de las modificaciones traduccionales predichas en una enzima lipolftica (a la que a veces se hace referencia en la presente memoria como “lipasa 3") y mostrada en la presente memoria como SEQ ID NO 2; los residuos de sitio activo se muestran en un cftculo, veanse Ser146, Asp201 y His258; hay 7 residuos de cistema y 4 estan implicados en puentes disulfuro, mostrados como una lmea de puntos y como una lmea solida sobre los residuos, hay 2 sitios para glicosilacion N-ligada, a saber N32 y N242, que se muestran en negrita y estan subrayados (el ultimo, a saber N242, esta cerca del sitio activo de His). NOTA: la numeracion en esta Figura se refiere a la enzima lipolftica mostrada como SEQ ID NO. 2 sin el peptido senal de 27 aminoacidos, por lo tanto, cuando se hace referencia a la enzima lipolftica mostrada en la SEQ ID NO. 1 (concretamente, con el peptido senal), la numeracion con respecto a los residuos de sitio activo tiene que ajustarse anadiendo 27 aminoacidos.

La Figura 2 muestra un esquema del metodo de la presente invencion.

La Figura 3 muestra un diagrama esquematico del ADN genomico de la enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis. La Figura 4 muestra el constructo de expresion "ATlipase3Trex".

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de actividad de lipasa efectuado en sobrenadante de transformantes de Trichoderma reesei.

La Figura 6 muestra un perfil proteico por PAGE-SDS efectuado sobre sobrenadante de transformantes de Trichoderma reesei. El carril indicado con una flecha muestra uno de los transformantes que expresa muy altos niveles de la enzima lipolftica (“lipasa 3").

La Figura 7 muestra un perfil proteico por PAGE-SDS de sobrenadante de transformantes de Trichoderma reesei cultivados en un fermentador de 3 litros. La flecha indica la banda de protema enzima lipolftica (“lipasa 3”).

La Figura 8 muestra el rendimiento de la protema enzima lipolftica (lipasa 3) en el caldo de fermentacion cuando se expresa la enzima lipolftica en diferentes hospedadores de expresion. El rendimiento se expresa como % de aumento de rendimiento en cada organismo:

1 Aspergillus tubingensis;

2 Pichia pastoris;

5

10

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20

25

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35

40

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3 Hansenula polymorpha;

4 Trichoderma reesei.

La Figura 9 muestra una transferencia Southern que muestra cepas de T. reesei transformadas que se hadan transformado con multiples copias del gen de la enzima lipolftica “lipasa 3”, los carriles se marcan como sigue:

M - cepa hospedadora no transformada,

B - cepa transformada usando transformacion bioftstica;

E - cepa transformada usando electroporacion.

La Figura 10 muestra un perfil proteico por PAGE-SDS usado para caracterizar la enzima lipolftica (“lipasa 3”) expresada en Trichoderma reesei. Las muestras de cultivos crecidos en diferentes caldos mostraron protema lipasa 3 como bandas dobles o triples.

La Figura 11a muestra dos UFC (concentrados de ultrafiltracion) diferentes que muestran la precipitacion de la enzima lipolftica "lipasa 3". La protema menos concentrada en el UFC 1035 muestra una gran precipitacion y la protema mas concentrada en el UFC 1036 muestra una precipitacion muy grande. La precipitacion es dependiente de la concentracion, cuanto mayor es la concentracion de protema, es mas probable que precipite.

La Figura 11b muestra una PAGE-SDS que muestra la presencia de la protema enzima lipolftica “lipasa 3” en los precipitados de la Figura 11a:

Carril 1 - sobrenadante bruto filtrado centrifugado

Carril 2 - sedimento resolubilizado del UFC 1035

Carril 3 - sedimento resolubilizado del UFC 1036

La Figura 12 muestra la resolubilizacion de la enzima lipolftica precipitada ("lipasa 3") usando diferentes concentraciones de tampon fosfato de sodio. Las muestras estaban a pH 5,30.

Carril 1. Control bruto.

Carriles 2-6. Fosfato de sodio 5 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM y 50 mM.

La Figura 13 muestra la caracterizacion de la enzima lipolftica recombinante “lipasa 3” por analisis de MALDI- TOF/MS de lipasa glicosilada en comparacion con desglicosilada. El tamano del N-glicano es de aproximadamente 1384 Da y las moleculas de enzima lipolftica (lipasa 3) pueden tener glicanos enlazados en el sitio N32 (cuando se considera la SEQ ID NO.2).

La Figura 14 muestra un analisis de protema por PAGE-SDS de enzima lipolftica (lipasa 3) purificada sometida a desglicosilacion. Enzima de desglicosilacion: Endo-H, 20 mg/ml. Se anadio Endo-H a una relacion de 1:50 y 1:100 (p/p) y se incubo durante 20 horas a temperatura ambiente, pH 5,5.

Carril 1 - Control

Carril 2 - dilucion 1:100 del sobrenadante Carril 3 - dilucion 1:50 del sobrenadante

Se muestran las actividades espedficas en la tabla 1 siguiente. La glicosilacion N-ligada no tiene efecto sobre la actividad espedfica de la protema enzima lipolftica (lipasa 3). La desglicosilacion de la enzima lipolftica (lipasa 3) no afectaba a la actividad enzimatica.

La Figura 15 muestra la secuencia aminoaddica (SEQ ID NO. 1) de una enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis, en la que el peptido senal endogeno se muestra en negrita.

La Figura 16 muestra la secuencia aminoaddica (SEQ ID NO. 2) de una enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis que es la misma que la SEQ ID No 1, excepto porque se ha retirado el peptido senal endogeno.

La Figura 17 muestra la secuencia nucleotidica que codifica una enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis (como se muestra en la SEQ ID NO. 1) incluyendo la secuencia senal, la secuencia nucleotidica es una secuencia de ADN genomico (y se ha designado como SEQ ID NO. 3). La secuencia senal se muestra en negrita y los intrones se muestran en minusculas.

La Figura 18 muestra la secuencia nucleotidica que codifica una enzima lipolftica de Aspergillus tubingensis (como se muestra en la SEQ ID No 2) que no incluye la secuencia senal, la secuencia nucleotidica es una secuencia de

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ADN genomico (y se ha designado como SEQ ID NO. 4). Los intrones se muestran en minusculas.

La Figura 19 muestra la secuencia del promotor de gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) designada SEQ ID NO. 5. Ejemplo 1

Expresion de la Lipasa 3 de Aspergillus tubingensis en Trichoderma reesei

1. Constructo de expresion y cepa usados para transformacion

Se uso ADN del plasmido pDONR™221 obtenido de Invitrogen (n° de catalogo 12536-017) como vector donante. Se recombino pDONR221::lip 3 que contiene ADN genomico de lipasa 3 de Aspergillus tubingensis (Figura 3) en el vector de destino Gateway de T. reesei pTrex3G (descrito con detalle en el documento WO 05/001036), dando como resultado el constructo de expresion final ATlipase3Trex (Figura 4).

El modulo de expresion contema las regiones promotora y terminadora del gen de celobiohidrolasa 1 (cbh1) de T. reesei. Contema tambien el gen amdS de acetamidasa de Aspergillus nidulans como marcador seleccionable para la transformacion de T. reesei.

El ADN genomico de lipasa 3 de Aspergillus tubingensis codifica una enzima lipolttica lipasa 3 que tiene la secuencia aminoaddica mostrada en la SEQ ID NO. 1.

El termino “lipasa 3”, cuando se usa en la presente memoria, hace referencia a una enzima lipolftica que comprende la secuencia aminoaddica mostrada en la SEQ ID NO. 2, tal como la secuencia aminoaddica mostrada en la SEQ ID NO. 1. La SEQ. ID NO. 1 contiene la sec. senal y la SEQ. ID No 2 es la protema lipasa madura sin la secuencia senal.

La cepa usada para transformacion era de Trichoderma reesei, un derivado de la cepa RL-P37 no GMM del que se han eliminado los genes que codifican las dos celobiohidrolasas secretadas, CBHI y CBHII, y dos de las endoglucanasas secretadas, EGI y EGII.

El vector de expresion pTrex3g.

A continuacion, se describe la construccion del vector pTrex3g que puede usarse para expresar los genes de la presente invencion.

Este vector esta basado en el vector pSL1180 de E. coli (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, EE.UU.) que es un vector basado en el fagemido pUC118 (Brosius, J. (1989) DNA 8: 759) con un sitio de clonacion multiple extendido que contiene 64 secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion hexamericas. Se diseno como vector de destino Gateway (Hartley, J.L., Temple, G.F. y Brasch, M.A. (2000) Genome Research 10:1788-1795) para permitir la insercion usando la tecnologfa Gateway (Invitrogen) de cualquier marco abierto de lectura deseado entre las regiones promotora y terminadora del gen cbhl de T. reesei. Contiene tambien el gen amdS de Aspergillus nidulans para uso como marcador seleccionable en la transformacion de T reesei.

Los detalles de pTrex3g son como siguen. El vector es de 10,3 kb de tamano.

Estan insertados en la region de poliligador de pSL1180 los siguientes segmentos de ADN:

1. un segmento de ADN de 2,2 pb de la region promotora del gen cbh1 de T reesei;

2. el modulo de marco lectura Gateway A de 1,7 kb adquirido en Invitrogen que incluye los sitios de recombinacion attRI y attR2 en cualquier extremo flanqueante del gen de resistencia a cloranfenicol (CmR) y el gen ccdB;

3. un segmento de ADN de 336 pb de la region terminadora del gen cbh1 de T. reesei;

4. un segmento de ADN de 2,7 kb que contiene el gen amdS de Aspergillus nidulans con sus regiones promotora y terminadora nativas.

2. Transformacion de la Cepa Hospedadora de T. reesei con cuadruple delecion

Se transformo el constructo de expresion ATlipase3Trex, que contiene el gen de lipasa 3 de A. tubingensis, en una cepa de T. reesei usando electroporacion o transformacion biolfstica por bombardeo de partfculas usando el sistema pDs-1000 Helium (BioRad n° de cat. 165-02257). Se usaron productos de PCR que contienen solo ADN fungico o todo el plasmido de expresion para generar transformantes por transformacion biolfstica y electroporacion.

A. Transformacion por electroporacion

Se hizo crecer la cepa hospedadora T. reesei para transformar hasta esporulacion completa en placas de PDA durante 5 dfas. Se recolectaron esporas de 2 placas con sorbitol 1,2 M y se filtraron a traves de Miracloth para

deshacerse del agar. Se transfirieron las esporas a un tubo Falcon de 50 ml y se lavaron por centrifugacion repetida 5-6 veces con 50 ml de agua. Se resuspendieron las esporas en un volumen pequeno (menos de 2x el volumen de sedimento) usando una solucion de sorbitol 1,2 M. Se mantuvo entonces la suspension de esporas en hielo. Se tomaron alfcuotas de 90 ul de suspension de esporas en la cubeta de electroporacion (E-shot, cubeta de 5 electroporacion estandar de 0,1 cm de Invitrogen). Se anadieron 10-20 ul de constructo de ADN (plasmido de la

Figura 4 o producto de PCR) a la suspension de esporas y se fijo la electroporacion a 16 kV/cm, 25 jF, 50 Q. Despues de la electroporacion, se dejo la suspension de esporas en hielo, se resuspendio en 5 partes de sorbitol 1,0 M y 1 parte de YEPD y se dejo germinar por incubacion a 28°C con agitacion a 250 rpm durante una noche. El dfa siguiente, se sembraron los germinantes en placas de agar que contienen acetamida. Se escogieron los 10 transformantes y se transfirieron individualmente a placas de agar y acetamida.

B. Transformacion por Bombardeo de Partfculas (transformacion biolfstica)

Se preparo una suspension de esporas de una cepa de T. reesei con cuadruple delecion. Se dispersaron 200 ul de suspension de esporas sobre el centro de las placas de acetamida en medio mmimo (MM). (las placas de acetamida en Mm teman la siguiente composicion: acetamida 0,6 g/l; CsCl 1,68 g/l; glucosa 20 g/l, KH2PO4 20 g/l, CaCl2-2H2O 15 0,6 g/l; solucion de elementos traza 1000x 1 ml/l; agar Noble 20 g/l y pH 5,5. La solucion de elementos traza 1000x

contema FeSO4-7H2O 5,0 g/l; MnSO41,6 g/l; ZnSO4-7H2O 1,4 g/l y CoCl2-6H2O 1,0 g/l. Se dejo secar la suspension de esporas sobre la superficie de medio MM con acetamida durante 1 hora en campana esteril. La transformacion siguio las instrucciones del fabricante. Se dispusieron 60 mg de partfculas de wolframio en un tubo de microcentnfuga. Se anadio 1 ml de etanol y se dejo reposar durante 15 segundos. Se retiro el etanol y se lavaron las 20 partfculas tres veces con H2Od esteril antes de anadir 250 ul de glicerol esteril al 50% (v/v). Se dispusieron 25 ul de

suspension de partfculas de wolframio en un tubo de microcentnfuga. Mientras se agitaba continuamente con vortex, se anadio lo siguiente: 5 ul (100-200 ng/ul) de ADN de plasmido, 25 ul de CaCl2 2,5 M y 10 ul de espermidina 0,1 M. Se centrifugaron las partfculas durante 3 segundos. Se retiro el sobrenadante y se lavaron las partfculas con 200 ul de etanol al 100% y se centrifugaron durante 3 segundos. Se retiro el sobrenadante. Se anadieron 24 ul de etanol al 25 100% y se mezclaron por pipeteo, se retiraron entonces alfcuotas de 8 ul de partfculas y se dispusieron en el centro

de discos microportadores que se mantuvieron en un desecador. Una vez se seco la solucion de wolframio/ADN, se dispuso el disco microportador en la camara de bombardeo junto con la placa de MM con acetamida con esporas y se llevo a cabo el proceso de bombardeo segun las instrucciones del fabricante. Despues del bombardeo de las esporas en placa con las partfculas de wolframio-ADN, se incubaron las placas a 28°C. Se transfirieron las colonias 30 transformadas a placas recientes de medio MM con acetamida y se incubaron a 28°C.

3. Crecimiento de transformantes en placas de microvaloracion

Despues de 5 dfas de crecimiento en placas de MM con acetamida, se inocularon transformantes obtenidos por electroporacion o por transformacion biolfstica y que exhiben una morfologfa estable en 200 ul de medio definido con glucosa/soforosa en placas de microvaloracion de 96 pocillos. El medio definido con glucosa/soforosa (por litro) 35 consiste en 5 g de (NH4)2SO4, 33 g de tampon PIPPS, 9 g de casaminoacidos, 4,5 g de KH2PO4, 1 g de CaCl2

(anhidro), 1 g de MgSo4'7H2O, pH 5,50 ajustado con NaOH al 50% con H2O milli-Q llevado a 966,5 ml. Despues de la esterilizacion, se anadio lo siguiente: 5 ml de Mazu, 26 ml de glucosa/soforosa al 60% y 2,5 ml de 400X metales traza de T. reesei. Se incubo la placa de microvaloracion en una camara de crecimiento con oxfgeno a 28°C durante 5 dfas.

40 Ejemplo 2

Verificacion por ensayo a la gota y PAGE-SDS de Lipasa

Se retiro el micelio por centrifugacion y se analizo en el sobrenadante la actividad lipasa usando el ensayo a la gota. El ensayo de placa de lipasa esta basado en la liberacion de acido graso del sustrato (tributirina) en presencia de lipasa. Se forma un color rosa cuando se libera el acido graso y forma un complejo con rodamina B. La placa de 45 ensayo contema 2,0 g de Bacto Agar (disuelto calentando durante 5 minutos en 100 ml de tampon fosfato de sodio

50 mM pH 5,5). Se mantuvo la solucion en bano de agua a 70°C y se anadieron con agitacion 0,5 ml de rodamina al 2% y 40 ml de tributirina. Se sometio la mezcla a sonicacion durante 2 minutos y se vertieron 10-15 ml en placas Petri. Se perforaron orificios y se aplico el sobrenadante de cultivo a los orificios. Se incubaron las placas a 37°C hasta que se formo un color rosa indicativo de la presencia de actividad lipolftica. Se comprobo en el sobrenadante 50 (10 ul) de los transformantes la actividad lipasa usando el ensayo a la gota mostrado en la Figura 5, las flechas

indican la aparicion del color rosa despues de 30 minutos de incubacion a 37°C, mostrando una alta actividad lipasa.

Se determino el perfil proteico de aquellos transformantes que exhiben alta actividad lipasa por PAGE-SDS usando geles de poliacrilamida NuPAGE al 4-12% y MES como tampon de proceso. Se mezclaron muestras del sobrenadante con un volumen apropiado de 2x tampon de carga de muestra con agente reductor. Se tineron los 55 geles con Simply blue Safestain (Invitrogen). En la Figura 6, el carril marcado con una flecha muestra uno de los transformantes que expresa muy altos niveles de lipasa 3 apareciendo como una doble banda. El resto de los transformantes mostraba bandas unicas distintas y ligeramente borrosas. El mejor transformante crecido en fermentador de 3 litros daba una valoracion de protema secretada total de al menos 20 g/litro y el analisis de PAGE- SDS mostraba una amplia banda de lipasa (Figura 7).

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Ejemplo 3

Fermentacion a gran escala (14 litros) de Transformantes de lipasa 3

Se cultivaron transformantes de Trichoderma reesei en fermentadores como se describe en el documento WO 2004/035070. Se cultivaron 4 transformantes diferentes, generados por electroporacion. La medida de la protema total y la actividad lipasa en sobrenadantes de cultivo, despues de la retirada de las celulas, indico que estaban presentes mas de 20 gramos por litro de lipasa despues de 160 horas de fermentacion. Se hicieron crecer tambien dos cepas, generadas por transformacion bioKstica. Estas mostraban mas de 20 gramos por litro de lipasa en el sobrenadante de cultivo despues de 160 horas de fermentacion. La cantidad de lipasa 3 producida por estos transformantes estaba muy por encima de la cantidad de lipasa 3 producida por otras especies hospedadoras microbianas (Figura 8).

Se cultivaron transformantes de Trichoderma reesei en fermentadores. Se cultivaron cuatro transformantes diferentes, generados por electroporacion. La medida de la protema total y la actividad lipasa en sobrenadantes de cultivo, despues de la retirada de celulas, indico que estaban presentes mas de 20 gramos por litro de lipasa despues de 160 horas de fermentacion. Se hicieron crecer tambien dos cepas, generadas por transformacion biolfstica. Estas mostraban mas de 20 gramos por litro de lipasa en el sobrenadante de cultivo despues de 160 horas de fermentacion. La cantidad de lipasa 3 producida por estos transformantes estaba muy por encima de la cantidad de lipasa 3 producida por otras especies hospedadoras microbianas (Figura 8).

Ejemplo 4

Solubilidad de lipasa 3

Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que Trichoderma reesei es capaz de producir lipasa 3 a muy altos niveles. El procesamiento posterior de la lipasa despues de la fermentacion requiere la concentracion del caldo de cultivo 4x por ultrafiltracion usando una membrana con un corte de peso molecular de 10.000. La lipasa 3 tiende a la precipitacion como se muestra en la Figura 11a. Se observa una alta precipitacion en el UFC mas concentrado. La presencia de protema lipasa 3 en los precipitados se confirmo por PAGE-SDs.

Las Figuras 11a y 11b muestran que la precipitacion de lipasa 3 es dependiente de la concentracion.

La Figura 11a muestra dos concentrados de ultrafiltracion (UFC) diferentes que muestran precipitacion de lipasa 3. El UFC 1035 contiene menos protema concentrada y muestra una alta precipitacion. El UFC 1036 contiene mas protema concentrada y muestra muy alta precipitacion.

La Figura 11b muestra una PAGE-SDS que muestra la presencia de protema lipasa 3 en los precipitados mostrados en la Figura 11a.

Carril 1 Sobrenadante bruto filtrado centrifugado

Carril 2 Sedimento resolubilizado del UFC 1035

Carril 3 Sedimento resolubilizado del UFC 1036

Para la resolubilizacion de precipitados de lipasa, se uso tampon concentrado. El tampon concentrado consiste en tampon fosfato de sodio 1,0 M, pH 8,0, Na2HPO4-2H2O (177,99 g) anadido a 900 ml de agua DI. Se anadieron a muestras de 10,0 g de lipasa 3 bruta del UFC 1036, a pH 4,44 50, 100, 200, 400 y 500 pl de solucion tampon concentrada a una concentracion final de fosfato de sodio 5, 10, 20, 40 y 50 mM, respectivamente, se mezclaron todos los viales y se dejaron a temperatura ambiente durante unos pocos minutos.

Como se muestra en la Figura 12, la adicion de fosfato de sodio a mas de 40 mM llevo a la lipasa 3 precipitada a solucion. La solucion resultante era transparente y exenta de cualquier material solido. El pH de las muestras se midio a pH 5,3 (a una concentracion de Na-P 50 mM).

Ejemplo 5

Caracterizacion de lipasa 3 recombinante por Analisis de MALDI-TOF/MS y digestion proteolttica

Se purifico lipasa 3 expresada por T. reesi del sobrenadante de cultivo usando una combinacion de cromatograffa de intercambio y de interaccion hidrofoba. Se llevo a cabo la desglicosilacion usando endoglicosidasa H en tampon de reaccion consistente en citrato de sodio 50 mM, pH 5,5. Se anadio endoglicosidasa H (20 mg/ml) a lipasa 3 a una relacion proteica de 1/1000 a 1/100 (p/p). Se efectuo la reaccion de desglicosilacion a 37°C durante 3 horas. Se puso la muestra de protema reaccionada en una ZipTip® (columna en fase inversa Micro C4) (Millipore, Bedford, MA) para limpieza de la muestra antes del analisis de MALDI-TOF/MS. Se efectuo el proceso de limpieza para desalar las muestras. Se usaron al menos 5 ciclos de lavado con solucion de lavado consistente en metanol al 5% en TFA al 0,1%/agua. Despues, se eluyeron las muestras para espectrometna de masas.

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Analisis de MALDI-TOF/MS de protema intacta

Se preparo la muestra de protema desalada para analisis de MALDI-TOF/MS mediante crocristalizacion de un volumen igual (1 jl) de muestra con matriz de acido sinapmico (saturado con 50% de acetonitrilo, 0,1% de acido formico) usando el metodo de gota seca. Se obtuvieron los espectros de masas de protema usando un espectrometro de masas Voyager DE-STR MALDI-TOF (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Los ajustes del instrumento de MS fueron los siguientes para el intervalo de 20000-80000 m/z: modo de operacion lineal, modo de extraccion retardada, polaridad positiva, voltaje de aceleracion de 25 kV, voltaje de rejilla del 93% y tiempo de retardo de la extraccion de 750 ns. Se usaron como calibrador externo 300 disparos laser/espectro y BSA.

Cartograffa de la digestion proteolftica y el sitio o sitios de N-glicosilacion por analisis de LC/MS/MS

Se precipitaron todas las muestras ftquidas tratadas con Endo-H con TCA al 10% seguido de reacciones de reduccion con DTT 20 mM a 50°C durante 15-20 min. Se efectuo tambien la reaccion de alquilacion con yodoacetamida 55 mM. Se dejo proceder la reaccion de alquilacion en la oscuridad durante 45 min a temp. ambiente. Se efectuaron las digestiones proteolfticas por incubacion con diversas proteasas en bicarbonato de amonio 25 mM durante 4 h a 37°C (la relacion de enzima a sustrato era de 1:20). La cartograffa peptfdica llevada a cabo usando 3 digestiones proteolfticas diferentes (tripsina, quimotripsina, endoproteinasa GluC) sobre la lipasa glicosilada confirmo la ausencia de modificacion proteica por truncamiento y la presencia de una protema lipasa intacta con extremos N- y C-terminales autenticos.

La lipasa 3 tiene 2 sitios de N-glicosilacion potenciales en N32 y N242. Se llevo a cabo la cartograffa peptfdica tanto para lipasa 3 (no tratada) como tratada con Endo-H. Para determinar el sitio de N-glicosilacion, se adquirieron los datos de MS y MS/MS usando el sistema Surveyor™ LC acoplado con LCQ Advantage o LCQ Deca XP (ThermoFinnigan, San Jose, CA). Se programo el gradiente de HPLC de 0% a 70% de B durante 50 minutos. Disolvente A: TFA al 0,1% en agua y disolvente B: TFA al 0,08% en acetonitrilo. Se efectuo el procesamiento de datos usando TurboSEQUEST y Xcalibur (ThermoFinnigan, San Jose, CA).

Como se muestra en la Figura 13, la PAGE-SDS mostraba que la lipasa recombinante secretada por Trichoderma apareda como una doble banda antes del tratamiento con endoglicosidasa H. El analisis de MALDI-TOF/MS mostraba que la especie de mayor peso molecular era una forma glicosilada de lipasa 3 con un peso molecular de 30.236 Da y la especie de menor peso molecular era una forma desglicosilada con un peso molecular de 29.210 Da. Se generaron muestras de lipasa desglicosilada experimentalmente usando endoglicosidasa H. Los pesos moleculares observados despues del tratamiento con endoglicosidasa H eran de 29.035 Da (se supone que es una forma no glicosilada), 29.219 (se supone que es una forma de lipasa 3 con 1 N-acetilglucosamina N-ligada en posicion N32 o N242) y 29.422 (se supone que es una forma de lipasa 3 con dos residuos de N-acetilglucosamina enlazados con el esqueleto proteico en posiciones N32 y N242). La cadena de glicano que esta presente antes de la desglicosilacion con endoglicosidasa H tiene un peso molecular de aproximadamente 1384 Da, con la mayona de molecula de lipasa teniendo glicano enlazado solo con el sitio N32 (numerado de acuerdo con la SEQ ID NO. 2)

Ejemplo 6

Actividad espedfica de la enzima lipolftica lipasa 3 producida en T. Reesei usando 2 sustratos diferentes

Se sometio la lipasa 3 purificada a desglicosilacion por tratamiento con endoglicosidasa H. Se caracterizaron las muestras no tratadas y desglicosiladas mediante la medida de actividades espedficas usando sustratos tanto de cadena corta (C4) como de cadena larga (C18).

Como se muestra en la Figura 14 y la Tabla 2, la presencia de cadenas laterales de glicano no tiene efecto sobre la actividad espedfica de la protema.

La Tabla 2 muestra los resultados de los experimentos de desglicosilacion. La muestra era lipasa 3 de Trichoderma purificada y la enzima de desglicosilacion era Endo-H.

: Actividad espedfica, %

Muestra: LIPU/ml (cadena corta, C4) LUSol/ml (cadena larga, C18)

Control (carril 1): 100 100

1:100 Endo-H (carril 2): 99,4 103

1:50 Endo-H (carril 3): 97,7 105

Ejemplo 7

Analisis de Transferencia Southern

La Figura 9 muestra una transferencia Southern que muestra cepas de T. reesei transformadas que se habfan

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transformado con multiples copias del gen de la enzima lipolftica “lipasa 3”, los carriles se marcan como sigue.

M - Cepa hospedadora no transformada,

B - cepa transformada usando transformacion bioftstica;

E - cepa transformada usando electroporacion.

Ejemplo 8

Estudios de expresion

Se clono la lipasa de Thermomyces lanuginosus y se expreso en T. reesei. Se aislaron los transformantes y se ensayo el mejor productor de lipasa en fermentacion a escala de 14 litros para investigar si Trichoderma reesei es una cepa hospedadora adecuada para la expresion de otras lipasas. Se estimo que la protema total al final (200 horas) de la fermentacion era de mas de 20 g/l como se muestra en la Figura 14. La PAGE-SDS mostro que la lipasa era la protema dominante producida. La actividad lipasa medida al final de la fermentacion era de 30.000 U/ml usando el ensayo de DGGR. Se filtro el caldo y se concentro hasta UFC. A alta concentracion, la lipasa parecfa precipitar. Se devolvio facilmente a la solucion diluyendo con tampon o sal.

Ejemplo 9

Estudios de expresion

La Tabla 3 proporciona los resultados de una serie de estudios de expresion.

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que la enzima lipolftica “lipasa 3” producida en Trichoderma reesei esta menos glicosilada (en particular, menos glicosilacion N-ligada) en comparacion con la misma enzima producida en otros organismos.

Tabla 3 Comparacion con otros hospedadores usados para expresar lipasa 3 de Aspergillus tubingensis

Hospedador de expresion: Glicosilacion en los sitios N32 y N242 Calidad de protema

Aspergillus tubigensis 3M: Hiperglicosilacion (sobreglicosilacion del 10%) (en ambos sitios N32 y N242) Actividad reducida

Pichia pastoris GS115: Hiperglicosilacion (ambos sitios N32 y n242) con O-glicanos Actividad > actividad observada con la cepa de lipasa recombinante de A. tubigensis

Hansenula polymorpha RB11: Glicosilacion (ambos sitios N32 y N242) con 1% de glicano Actividad > actividad observada con la cepa de lipasa recombinante de A. tubigensis

T. reesei: Mayona de N-glicosilacion en N32 La actividad es la misma que en la lipasa 3 nativa de la cepa no recombinante de Aspergillus 1M341

Ejemplo 10

Las celulas hospedadoras de expresion adecuadas para uso en la presente invencion pueden ser de una cepa de T. reesei en que se han inactivado los genes que codifican celobiohidrolasa I (CBHI, Cel7a), celobiohidrolasa II (CBHII, Cel6a), endoglucanasa I (EGI, Cel7b) y endoglucanasa II (EGII, Cel5a) por delecion o desestabilizacion usando tecnicas geneticas moleculares. Esta cepa (una cepa con cuadruple delecion) es util como hospedador para la sobreexpresion de genes que codifican otras protemas secretadas por T. reesei.

Preferiblemente, las celulas hospedadoras adecuadas para uso en la presente invencion pueden derivar de una celula de Trichoderma reesei de la cepa RL-P37 usando los metodos descritos en los documentos WO 2005/001036 y US28026376 A1.

Una cepa de T.reesei adecuada para uso en la presente invencion puede derivar de la cepa RL-P37 de T.reesei publicamente disponible. La cepa RL-P37 de T.reesei puede modificarse formando la cepa 1A52 de T.reesei como se describe en el documento Wo 05/001036. La cepa 1A52 de T.reesei puede modificarse como se describe en el documento US 20080026376 formando una celula de T.reesei utilizable en la presente invencion.

RL-P37 puede modificarse formando la cepa 1A52 de T.reesei como se describe a continuacion.

La cepa hospedadora de T. reesei usada puede derivar de la cepa RL-P37 publicamente disponible, que se ha usado anteriormente para fabricar preparaciones de celulasa comerciales por Genencor International, inc. La

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derivacion y caracterizacion de esta cepa se ha publicado anteriormente (Sheir-Neiss, G. y Montenecourt, B S. (1984) Appl. Microbiol. Biotechnol. 20.46-53; patente de EE.UU. 4.797.361). Es una cepa mutante sobreproductora de celulasa que se ha obtenido como resultado de varias etapas de mutagenesis a partir de la cepa de tipo silvestre (QM6a).

1) Aislamiento de una cepa mutante de pyr4.

Para preparar la cepa RL-P37 para transformacion con ADN de plasmido, era necesario aislar un derivado que tuviera una mutacion nula en el gen pyr4.

El gen pyr4 codifica la 5'-monofosfato de oritidina descarboxilasa, una enzima requerida para la biosmtesis de uridina. Se incorpora el inhibidor toxico acido 5-fluoroorotico (FOA) a la uridina por las celulas de tipo silvestre y por tanto envenena las celulas. Sin embargo, las celulas defectivas en el gen pyr4 son resistentes a este inhibidor, pero requieren uridina para el crecimiento. Por lo tanto, es posible seleccionar cepas mutantes de pyr4 usando FOA. En la practica, se dispersaron esporas de la cepa RL-P37 de T. reesei sobre la superficie de un medio solidificado que contema uridina 2 mg/ml y fOa 1,2 mg/ml. Aparecieron colonias resistentes a FOA espontaneas al cabo de 3 a 4 dfas. Se identificaron los mutantes resistentes a FOA que requenan uridina para el crecimiento. Para identificar aquellos mutantes que teman espedficamente un gen pyr4 defectivo, se generaron protoplastos y se transformaron con un plasmido que contema un gen pyr4 de tipo silvestre (Smith, J.L., Bayliss, F.T. y Ward, M. (1991) Curr. Genet 19: 27-33). Despues de la transformacion, se sembraron los protoplastos en medio carente de uridina. El crecimiento posterior de colonias transformadas demostro la complementacion de un gen pyr4 defectivo por el gen pyr4 portado por plasmido. De este modo, se identifico la cepa GC69 como un mutante de pyr4 de la cepa RL-P37.

2) Construccion de un plasmido disenado para eliminar el gen que codifica CBHI

Se clono el gen cbhl, que codifica la protema CBHI, a partir del ADN genomico de la cepa RL-P37 mediante hibridacion con una sonda oligonucleotfdica disenada basandose en la secuencia publicada para este gen (Shoemaker, S, Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. e Innis, M. (1983) Biotechnology 1:691-696). El gen cbhl reside en un fragmento PstI de 6,5 kb y se inserto en el sitio PstI de pUC4K (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, EE.UU.) reemplazando al gen de resistencia a kanamicina de este vector. Se corto entonces el plasmido resultante, pUC4K::cbh1, con HindIII, se aislo el fragmento mas grande y se religo, dando pUC4K::cbh1AH/H. Este procedimiento retiro la secuencia de codificacion de cbhl completa y aproximadamente 1,2 kb de secuencias flanqueantes 5' y 1,5 kb de 3'. Permanecio aproximadamente 1 kb de ADN flanqueante en cada extremo del fragmento PstI original. Se clono el gen pyr4 de T. reesei como un fragmento HindIII de 6,5 kb de ADN genomico en pUCI8, formando pTpyr2 (Smith, J.L., Bayliss, F.T. y Ward, M. (1991) Curr. Genet. 19: 27-33). Se corto el plasmido pUC4K::cbh1AH/H con HindIII y se desfosforilaron los extremos con fosfatasa alcalina intestinal de ternero. Se ligo este ADN con el fragmento HindIII de 6,5 kb que contiene el gen pyr4, dando pACBHIpyr4.

La digestion de pACBHIpyr4 con EcoRI libero un fragmento mayor que consistfa en las regiones flanqueantes del locus cbhl en cada extremo, con el gen pyr4 reemplazando a la secuencia de codificacion de cbhl en el centro. El unico ADN de este fragmento que no derivaba de T. reesei era un fragmento de 21 pb derivado del sitio de clonacion multiple de pUC4K.

3) Delecion del gen cbhI de T. reesei.

Se transformaron protoplastos de micelio de la cepa GC69 con plasmido pACBHIpyr4 digerido con EcoRI usando metodos resumidos por Smith et al., 1991. Se obtuvieron transformantes estables y aquellos de los que se habfa eliminado el gen cbhl se identificaron como se describe a continuacion.

Se aislo el ADN total de los transformantes, se digirio con PstI, se sometio a electroforesis en gel de agarosa y se transfirio a un filtro de membrana. Se hibrido entonces el filtro con pACBHIpyr4 marcado con P32 y se observo el patron de hibridacion por autorradiograffa. Esta sonda hibridaba con los genes cbhl y pyr4 nativos en una cepa no transformada. En un transformante (cepa P37PACBHI), se observo el patron de hibridacion que se predecina si ocurriera un evento de integracion cruzada doble. Es decir, el gen cbhl se habfa eliminado por integracion de una sola copia del fragmento de EcoRI mayor obtenido de pACBHIpyr4 en el locus cbhl de la cepa RL-P37.

Se efectuo tambien el analisis Southern como anteriormente, excepto que la sonda usada era plntCBHI radiomarcado. Este plasmido consistfa en un vector pUC que contema un fragmento Bglll de 2 kb del locus cbhl en la region que se elimino en pUC4K::cbh1AH/H. Este plasmido hibridaba con el locus cbhl de la cepa GC69, pero no hibridaba con ADN de la cepa P37PACBHI. Esto confirma que el gen cbhl se habfa eliminado y que el fragmento de ADN de pUC de pACBHIpyr4 no se habfa incorporado por la cepa con delecion.

El analisis de protemas secretadas por separacion en geles de enfoque isoelectrico mostro que la protema CBHI no se produda por la cepa P37PACBHI.

4) Generacion de un mutante de P37PACBHI nulo de pyr4.

Se dispersaron esporas del transformante (P37PACBHI) del que se hada eliminado el gen cbhl sobre medio que

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contema FOA. Se obtuvo posteriormente un derivado deficiente en pyr4 de este transformante usando los metodos descritos en la seccion anterior. Esta cepa deficiente en pyr4 se designo P37PACBHIPyr-26. El analisis Southern mostro que habfa ocurrido una delecion espontanea cuando se selecciono la cepa P37PACBHIPyr-26. Esta delecion retiraba completamente el gen pyr4 que se habfa integrado en el locus cbhl de la cepa P37PACBHI, as^ como el ADN flanqueante del locus cbhl mas alla de la extension del fragmento Pstl de 6,5 kb de ADN genomico que se clono originalmente.

5) Construccion de un vector disenado para eliminar el gen cbh2

El gen cbh2 de T.reesei, que codifica la protema CBHII, se ha clonado como un fragmento EcoRI de 4,1 kb de ADN genomico (Chen et al., 1987, Biotechnology 5: 274-278). Se inserto este fragmento de 4,1 kb entre los sitios EcoRI de pUC4XL. Este ultimo plasmido es un derivado de pUC (construido por R. M. Berka, Genencor International Inc.) que contiene un sitio de clonacion multiple con un patron simetrico de sitios de endonucleasa de restriccion dispuestos en el orden mostrado aqrn: EcoRI, BamHI, SacI, Smal, HindIII, XhoI, BgIII, ClaI, BgIII, Xhol, HindIII, SmaI, SacI, BamHI, EcoRI. Se construyo el plasmido pPACBHII, en que se ha retirado una region central de 1,7 kb de este clon de cbh2, entre un sitio HindIII (a 74 pb en direccion 3' del sitio de inicio de la traduccion de CBHII) y un sitio Clal (a 265 pb en direccion 3' del ultimo codon de CBHII) y se ha reemplazado por un fragmento de ADN HindIII-ClaI de 1,6 kb que contiene el gen pyr4 de T. reesei obtenido como sigue. Se escindio el gen pyr4 de T. reesei de pTpyr2 en un fragmento NheI-SphI de 1,6 kb y se inserto entre los sitios Sphl y XbaI de pUC219 (derivado de pUC119 mediante expansion del sitio de clonacion multiple para incluir los sitios de restriccion para BgIII, ClaI y XhoI; Wilson et al., 1989, Gene 77: 69, 78), creando p219M (Smith et al., 1991, Curr. Genet. 19: 27-33). El gen pyr4 pudo retirarse entonces como un fragmento HindIII-ClaI que tiene 7 pb de ADN en un extremo y 6 pb de ADN en el otro extremo derivado del sitio de clonacion multiple de pUC219 e insertado en los sitios HindIII y ClaI del gen cbh2, formando el plasmido pPACBHII.

La digestion de este plasmido con EcoRI libero un fragmento que tema 0,7 kb de ADN flanqueante del locus cbh2 en un extremo, 1,7 kb de ADN flanqueante del locus cbh2 en el otro extremo y el gen pyr4 de T reesei en el medio. El unico ADN de este fragmento que no derivaba de T. reesei eran los fragmentos de 6 pb y 7 pb del sitio de clonacion multiple de pUC219 en cada extremo del gen pyr4.

6) Delecion del gen cbh2 de la cepa P37PACBHIPyr"26

Se generaron protoplastos de la cepa P37PACBHIPyr"26 y se transformaron con pPACBHII digerido con EcoRI segun los metodos resumidos en 3 anteriormente. Se cultivaron los transformantes estables en matraces agitados y se examino la protema en los sobrenadantes de cultivo por enfoque isoelectrico. Se identifico un transformante (designado P37PAACBH67) que no produda ninguna protema CBHII (ni CBHI).

Se extrajo ADN de la cepa P37PAACBH67, se digirio con EcoRI y Asp718, y se sometio a electroforesis en gel de agarosa. Se transfirio el ADN de este gel a un filtro de membrana y se hibrido con pPACBHII marcado con 32P. Se observo el fragmento EcoRI de 4,1 kb que contiene el gen cbh2 de tipo silvestre en el ADN de una cepa de control no transformada. En contraposicion, en la cepa P37PAACBH67, se eliminaba la banda unica de 4,1 kb y se reemplazaba por dos bandas de aproximadamente 0,9 y 3,1 kb. Este es el patron esperado si se habfa integrado una unica copia del fragmento de EcoRI mayor de pPACBHII precisamente en el locus cbh2 y eliminado el gen cbh2.

Se digirieron tambien las mismas muestras de ADN con EcoRI y se efectuo el analisis Southern como anteriormente. En este ejemplo, la sonda era plntCBHII marcado con 32P. Este plasmido contiene una porcion de la secuencia de codificacion del gen cbh2 de la que se elimino ese segmento de ADN de cbh2 en el plasmido pPACBHII. No se observo hibridacion con ADN de la cepa P37PACBH67, confirmando que el gen cbh2 estaba eliminado y que no se habfa incorporado el fragmento del plasmido pUC de pPACBHII por esta cepa.

7) Seleccion de un mutante nulo de pyr4 de la cepa P37PACBH67.

Se dispersaron esporas del transformante (P37PAACBH67), que habfa eliminado ambos genes cbhl y cbh2, sobre medio que contema FOA. Se obtuvo posteriormente un derivado deficiente en pyr4 de este transformante usando los metodos descritos en la seccion 1 anterior. Esta cepa deficiente en pyr4 se designo P37PAACBH67Pyr"1. El analisis Southern mostro que habfa ocurrido una delecion espontanea cuando se selecciono la cepa P37PAACBH67Pyr"1. Esta delecion eliminaba completamente el gen pyr4 que se habfa integrado en el locus cbh2 de la cepa P37PACBH67, asf como el ADN flanqueante del locus cbh2 mas alla de la extension del fragmento EcoRI de 4,1 kb de ADN genomico que se clono originalmente. Los fragmentos cortos (6 pb y 7 pb) de ADN derivado del sitio de clonacion multiple de pUC219 que estaban presentes en cualquier extremo del gen pyr4 se habnan retirado tambien del genoma por esta delecion.

8) Construccion de un plasmido disenado para desestabilizar el gen egl2

Se ha clono el gen egl2, que codifica EGII (al que se hace referencia anteriormente como EGIII por algunos) a partir de T. reesei y se publico la secuencia de ADN (Saloheimo et al., 1988, Gene 63: 11-21). Se obtuvo el gen de la cepa RL-P37 como un fragmento PstI-XhoI de aproximadamente 4 kb de ADN genomico insertado entre los sitios PstI y XhoI de pUC219. Se inserto el gen pyr4 de T. reesei, presente en un fragmento Sall de 2,7 kb de ADN genomico

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obtenido a partir de pTpyr2, en un sitio Sail en la secuencia de codificacion de EGII, creando el plasmido pEGII::P-1. Esto dio como resultado la desestabilizacion de la secuencia de codificacion de EGII pero sin delecion de ninguna secuencia. El plasmido, pEGII::P-1, puede digerirse con HindIII y BamHI, procurando un fragmento lineal de ADN derivado exclusivamente de T. reesei excepto por 5 pb en un extremo y 16 pb en el otro extremo, ambos derivados del sitio de clonacion multiple de pUC219.

9) Desestabilizacion del gen egl2 de la cepa P37PACBH67Pyr"1.

Se transformo la cepa P37PAACBH67Pyr"1 con pEGII::P-1, que se habfa digerido anteriormente con HindIII y BamHI, y se seleccionaron transformantes estables. Se aislo el ADN total de transformantes y se uso el analisis Southern para identificar las cepas en que se habfa integrado el fragmento de ADN de plasmido que contema los genes pyr4 y egl2 en el locus egl2 y consiguientemente desestabilizado la secuencia de codificacion de EGII. Se efectuo el analisis Southern usando como sonda un fragmento PstI de aproximadamente 4 kb de ADN de T. reesei que contema el gen egl2. Cuando se digirio el ADN aislado de la cepa P37PA67P"1 con Pstl para analisis Southern, se visualizo posteriormente el locus egl2 como una unica banda de 4 kb en la autorradiograffa. Sin embargo, para un transformante con desestabilizacion del gen egl2, esta banda se perdfa y se reemplazaba por dos nuevas bandas como se esperaba. Cuando el ADN se digirio con BgIII o EcoRV, el tamano de la banda correspondiente al gen egl2 aumento en tamano aproximadamente 2,7 kb (el tamano del fragmento de pyr4 insertado) entre la cepa P37PAA67P"1 no transformada y el transformante con desestabilizacion de egl2. Este ultimo transformante, con delecion ahora de los genes cbhl, cbh2 y egl2, se designo como cepa B31. El analisis Southern adicional confirmo que el fragmento de ADN de pUC de pEGII::P-1 no se incorporaba en esta cepa.

10) Seleccion de un mutante nulo de pyr4 de la cepa B31.

Se dispersaron esporas del transformante (B31), que tema delecion de los genes cbhl, cbh2 y egl2, sobre medio que contema FOA. Se obtuvo posteriormente un derivado deficiente en pyr4 de este transformante usando los metodos descritos en la seccion 1 anterior. Esta cepa deficiente en pyr4 se designo B31P6. El analisis Southern mostro que habfa ocurrido una delecion espontanea cuando se selecciono la cepa B31P6. Esta delecion retiraba la mayona del gen pyr4 que se habfa integrado en el locus egl2 de la cepa B31, pero no se extendfa al ADN flanqueante del locus egl2.

11) Construccion de un plasmido disenado para eliminar el gen egll

Se clono el gen egl1 de T. reesei y se publico la secuencia de ADN del gen (Penttila et al., 1986, Gene 45; 253-263; van Arsdell et al., 1987, Biotechnology 5: 60-64). Se obtuvo este gen de la cepa RL-P37 de T. reesei como un fragmento HindIII de 4,2 kb de ADN genomico insertado en el sitio HindIII de pUC100 (un derivado de pUC18 con un oligonucleotido insertado en el sitio de clonacion multiple que anade sitios de restriccion para BgIII, Clal y Xhol), dando pUCEGI. Se retiro un fragmento EcoRV de aproximadamente 1 kb que se extiende desde una posicion cercana la mitad de la secuencia de codificacion de eGi hasta una posicion mas alla del extremo 3' de la secuencia de codificacion y se reemplazo por un fragmento ScaI de 3,5 kb de ADN de T. reesei que contema el gen pyr4 obtenido a partir de pTpyr2. El plasmido resultante se llamo pPAEGI

El plasmido pPAEGI podfa digerirse con HindIII, liberando un fragmento de ADN que comprende solo ADN genomico de T. reesei que tiene un segmento del gen egl1 en cada extremo y el gen pyr4, que reemplaza a parte de la secuencia de codificacion de EGI, en el centro.

12) Delecion del gen eal1 en la cepa B31P6.

Se construyeron dos formas de pPAEGI que difenan solo en la orientacion del gen pyr4 con respecto a las regiones flanqueantes de egll. Se transformo la cepa B31P6 con una mezcla de ambas formas del plasmido despues de digerir con HindIII. Se extrajo el ADN total de transformantes estables, se digirio con HindIII y se sometio a analisis Southern. La sonda usada era pUCEGI radiomarcado. Se observo hibridacion con un fragmento de 4,2 kb de ADN de la cepa B31P6 que representa el gen egll no eliminado. Se identifico un transformante (cepa 1A52) en que estos 4,2 kb no estaban ya presentes sino que se habfan reemplazado por un fragmento de aproximadamente 6,8 kb. Este es el patron esperado si el fragmento HindIII mayor de pPAEGI se habfa integrado precisamente como se predice en el locus egll, conduciendo a la delecion de parte de la secuencia de codificacion de EGI y la insercion de pyr4 en esta posicion. Usando un plasmido pUC como sonda para analisis Southern, se confirmo que el fragmento de ADN de pUC de pPAEGI no se habfa incorporado a la cepa 1A52

Puede modificarse la cepa 1A52 de T.reesei para formar una celula de T.reesei utilizable en la presente invencion. Ejemplo 11- Protocolos de ensayo

Ensayo de actividad hidrolizante de triacilglicerol (clasificada como E.C. 3.1.1.3) ensayos de LIPU/LUSol de actividad hidrolizante de Triacilglicerol

Se lleva a cabo la determinacion de la actividad lipasa en LIPU mediante la enzimacion de una emulsion de tributilglicerol. La hidrolisis enzimatica de los lfpidos libera acidos grasos libres. Mediante la valoracion continua del

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acido graso libre liberado, se determina la actividad lipasa por el consumo de base. 1 LIPU (unidad lip^dica) (tambien llamada 1 unidad en la presente memoria) se define como la cantidad de enzima que libera 1 pmol de acido graso libre por minuto en las condiciones de ensayo dadas.

Se disolvieron las muestras enzimaticas en agua desmineralizada. El valorante era NaOH 0,05 M. El sustrato era una emulsion homogeneizada de tributiringlicerol al 5% (v/v) (Merck, n° de artfculo 101958), goma arabiga al 0,10% (p/v) (Sigma, n° de artfculo G9752), glicerol al 7,5% (p/v) (Merck, n° de artfculo 1.04092), NaCl 51 mM (p.a. Merck, n° de artfculo 1.06404), KH2PO4 0,50 mM (p.a. Merck, n° de artfculo 1.04873). El pH de la reaccion era de 5,5 y la temperatura de reaccion era de 30°C. Se anadio una muestra de 2,00 ml a 25,0 ml de sustrato aclimatado a la temperatura de reaccion. Se calculo la actividad a partir de la pendiente de una curva de valoracion lineal que representa el consumo de valorante frente al tiempo de reaccion.

Los sustratos usados eran tributirina (Lipu) y aceite de girasol (LUSol).

Ensayo de DGGR de actividad hidrolizante de triacilglicerol

Se uso este ensayo para medir la lipasa de Thermomyces lanuginosus expresada en Trichoderma.

Los sustratos y tampones usados en este ensayo fueron los siguientes:

Ester 6-metilresorufmico del acido 1,2-di-O-lauril-rac-glicero-3-glutarico 3,32 mM disuelto en DMSO (sustrato, 2,5 mg/ml).

Se somete a sonicacion una solucion madre consistente en 50 mg de sustrato anadidos a 20 ml de DMSO, se toman alfcuotas y se almacenan a -80°C hasta el uso. El tampon usado es HEPES 0,5 M pH 8 + 1028 ppm (60 gpg) de dureza de agua de Ca:Mg 3:1 (vease CAM300) y goma arabiga al 4%. Se usa solucion madre de enzima lipasa (1 mg/l) como patron. Para el ensayo, se preparan 50 ml de tampon de ensayo anadiendo 5 ml de HEPES + dureza y 25 ml de goma arabiga al 4% a 10 ml de agua. Se incuba el tampon de ensayo a la temperatura de ensayo deseada (tfpicamente 25°C). Se anaden muestras enzimaticas de 10 ul a placas de 96 pocillos a la temperatura de ensayo. Se recomiendan 1-10 ppm de enzima activa en la muestra. Para mejores resultados, se ajusta la concentracion desconocida a ±2 veces la actividad del patron.

Se determina la velocidad de fondo (sin enzima, concretamente tampon de ensayo). Se anaden 10 ml de sustrato DGGR 3,32 mM en DMSO a tampon de ensayo y se mezclan bien usando un vortex. Se anaden inmediatamente 200 ul de sustrato en tampon de ensayo a las muestras enzimaticas en microplacas desde un deposito de reactivo usando una pipeta multicanal. Se mezcla bien la placa de microvaloracion y se transfiere inmediatamente a un lector de placas. Se mide la DO a 580 nm durante hasta 10 min a la temperatura de ensayo deseada (tfpicamente 25°C). Se hace el calculo de la actividad enzimatica restando la velocidad de fondo de la desconocida y del patron para obtener las velocidades diferenciales. Se determina la relacion de las velocidades diferenciales para desconocido a patron y se multiplica por la concentracion del patron. Se incluyen en el calculo todas las diluciones.

Concentracion desconocida= (velocidad desconocida x concentracion del patron) / velocidad del patron.

Determinacion de la actividad lipasa de triacilglicerido: ensayo basado en triglicerido (tributirina) como sustrato (LIPU):

Se mide la actividad lipasa basada en tributirina segun el “Food Chemical Codex”, 4a edicion, National Academy Press, 1996, pag. 803, con las modificaciones que la muestra se disuelve en agua desionizada en lugar de tampon de glicina y el punto de ajuste del peactnmetro es 5,5 en lugar de 7.

1 LIPU se define como la cantidad de enzima que puede liberar 1 mol de acido butrnco por minuto en condiciones de ensayo.

Ensayo de actividad fosfolipasa

Actividad fosfolipasa A1 (E.C. 3.1.1.32)

Actividad fosfolipaa A2 (E.C. 3.1.1.4)

Actividad fosfolipasa B (E.C. 3.1.1.5)

Sustrato

Se disuelven 1,75% de L-fosfatidilcolina de planta al 95% (441601, Avanti Polar Lipids), 6,3% de Triton X-100 (n° T9284, Sigma) y CaCl2 5 mM en tampon HePeS 50 mM pH 7,0.

Procedimiento de ensayo

Se diluyeron las muestras, calibracion y control en HEPES 10 mM pH 7,0 y 0,1% de Triton X-100 (n° T9284, Sigma). Se llevo a cabo el analisis usando un autoanalizador Konelab (Thermo, Finlandia). Se realizo el ensayo a 30°C. Se

termostatizaron 34 |jl de sustrato durante 180 s, antes de anadir una muestra de 4 jl. La enzimacion duro 600 s. Se midio la cantidad de acido graso libre liberada durante la enzimacion usando el kit NEFA C (999-75406, WAKO, Alemania). Se anadieron 56 jl de NEFA A y se incubo la mezcla durante 300 s. Despues, se anadieron 113 jl de NEFA B y se incubo la mezcla durante 300 s. Despues, se anadieron 113 jl de NEFA B y se incubo durante 300 s. 5 Se midio entonces la DO a 520 nm. Se calculo la actividad enzimatica LATU (jmol de FFA/minml) basandose en una preparacion enzimatica patron.

Ensayo de actividad glicolipasa (galactolipasa)

Sustrato

Se disolvieron 1,75% de didalactosildiglicerido (DGDG, purificado de lfpidos de trigo), 6,3% de Triton X-100 (n° 10 T9284, Sigma) y CaCl2 5 mM en tampon HEPES 50 mM pH 7,0.

Procedimiento de ensayo

Se diluyeron muestras, calibracion y control en HEPES 10 mM pH 7,0 y 0,1% de Triton X-100 (n° T9284, Sigma). Se llevo a cabo el analisis usando un autoanalizador Konelab (Thermo, Finlandia). Se realizo el ensayo a 30°C. Se termostatizaron 34 jl de sustrato durante 180 s, antes de anadir 4 jl de muestra. La enzimacion duro 600 s. Se 15 midio la cantidad de acido graso libre liberada durante la enzimacion usando el kit NEFA C (999-75406, WAKO, Alemania). Se anadieron 56 jl de NEFA A y se incubo la mezcla durante 300 s. Despues, se anadieron 113 jl de NEFA B y se incubo la mezcla durante 300 s. Despues, se anadieron 113 jl de NEFA B y se incubo la mezcla durante 300 s. Se midio entonces la DO a 520 nm. Se calculo la actividad enzimatica de GLU-K (jmol de FFA/min ml) basandose en una preparacion enzimatica patron.

20

Claims

5

10

15

20

25

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40

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo de produccion de una enzima lipolftica que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una celula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende

a) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica que comprende una secuencia aminoaddica mostrada como SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o una secuencia aminoaddica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 1 o 2; y/o

b) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotidica comprende la secuencia nucleotidica mostrada como SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; y/o

c) al menos una secuencia nucleotidica heterologa que codifica una enzima lipolftica, en la que la secuencia nucleotidica comprende una secuencia nucleotidica que hibrida con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o una secuencia nucleotidica que tiene al menos un 40% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4 o el complemento de una cualquiera de las mismas en condiciones rigurosas y,

(ii) cultivar la celula en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica; y

(iii) elevar el pH al final de la fermentacion a un pH por encima del pH de las condiciones de cultivo en la etapa (ii).
2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que la secuencia nucleotidica heterologa comprende ademas una secuencia promotora, siendo dicha secuencia promotora una secuencia promotora de celobiohidrolasa.
3. Un metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que se produce la enzima lipolftica en una cantidad de al menos 20 g/litro de sobrenadante de cultivo.
4. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se prepara la celula de Trichoderma reesei mediante transformacion o transfeccion de una celula de Trichoderma reesei con la secuencia nucleotidica.
5. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se proporciona la celula de Trichoderma reesei transformandola con o se transforma con la secuencia nucleotidica usando transformacion bioftstica.
6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la celula de Trichoderma reesei comprende uno o mas genes suprimidos que codifican una enzima o enzimas no lipolfticas, preferiblemente dos o mas genes suprimidos que codifican enzimas no lipolfticas, preferiblemente tres o mas genes suprimidos que codifican enzimas no lipolfticas, preferiblemente cuatro genes suprimidos que codifican enzimas no lipolfticas.
7. El metodo segun la reivindicacion 6, en el que al menos uno o cada uno de los genes suprimidos que codifican enzimas no lipolfticas es un gen suprimido que codifica una celulasa.
8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que despues de la expresion de la secuencia nucleotidica, se retira la celula de Trichoderma reesei del medio en que se ha secretado la enzima, y opcionalmente se concentra entonces el medio exento de celulas.
9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se eleva el pH del medio en que se secreta la enzima despues de un periodo de tiempo, procurando niveles suficientes de la enzima secretada y antes del aislamiento y/o purificacion y/o concentracion de la enzima.
10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se llevan a cabo las siguientes etapas en el medio en que se ha secretado la enzima de la presente invencion despues del cultivo de la celula: ajuste del pH del medio, dilucion del medio con agua, separacion de la celula o celulas del medio, concentracion del medio en el que dicho medio esta exento de celulas y opcionalmente granulacion de dicho medio en el que dicho medio esta exento de celulas.
11. Un metodo de produccion de una enzima lipolftica que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una celula de Trichoderma reesei transformada o transfectada que comprende al menos una secuencia nucleotfdica heterologa que codifica una enzima lipolftica;

(ii) cultivar la celula a un pH de 4 a pH 5,5 en condiciones que permitan la expresion de dicha secuencia o secuencias nucleotfdicas heterologas que codifican dicha enzima lipolftica;

(iii) aislar, purificar o concentrar la enzima en un medio de un pH de 5,5 a pH 6,5.