ES2616231T3 - Formulación para administración oral de proteínas - Google Patents

Abstract

Una formulacion farmaceutica solida de una endoproteinasa B2 de cebada (EPB2) o una forma recombinante de la misma, adecuada para administracion oral en forma de dosis unitaria, que comprende un antioxidante que contiene azufre seleccionado de un sulfato, un tiol libre y el grupo que consiste en sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, N-acetilcisteina, homocisteina, cisteina, monotioglicerol, tiosulfato de sodio, acido α-lipoico y ditiotreitol.

Description

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DESCRIPCION

Formulacion para administracion oral de protemas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos y a composiciones para la estabilizacion de proteasas destinadas a la administracion oral contra la degradacion en el estomago y en el jugo gastrico y en otros fluidos fisiologicos que pueden oxidar y degradar estas proteinas. Por tanto, la presente invencion se refiere a los campos de biologia, qmmica, biolog^a molecular, quimica medica, medicina y farmacologia.

Descripcion de divulgaciones relacionadas

Se sabe que la administracion oral de proteinas en el tracto gastrointestinal es problematica, como resultado de la mala estabilidad de las proteinas debido tanto al pH gastrico como a la digestion proteolitica por enzimas, asi como la mala absorcion. Se han realizado muchos intentos para administrar proteinas por via oral o localmente en el estomago. Las patentes de Estados Unidos 7.291,598; 7.265.097 y 7.244.709, por ejemplo, todas utilizan nanoparticulas que contienen chitosano para mejorar la absorcion y la estabilidad de las proteinas en el tracto gastrointestinal (Gl). En la patente de Estados Unidos 6.541.606 se utilizan proteinas cristalinas para evitar la degradacion en el estomago y para el tratamiento de enfermedades del tracto Gl y tratar la potencial bioadhesion a las placas de Peyer para mejorar la absorcion de proteinas en el tracto Gl. En la patente de Estados Unidos 7.351.741 se describen aditivos para mejorar la absorcion de las proteinas en el tracto Gl. En estas patentes se describen los problemas de estabilidad de las proteinas en el tracto Gl debido al pH acido en el estomago y debido a la digestion enzimatica, asi como a una mala absorcion en el tracto Gl. La inestabilidad de las proteinas en el tracto Gl o el estomago debido a la oxidacion o la digestion proteolitica no se describe en ninguna de las referencias mencionadas anteriormente.

La lactasa, una p-galactosidasa que metaboliza la lactosa, y la papaina, una proteasa cisteina, ambas enzimas se administran por via oral en forma de suplementos dieteticos. La lactasa es administrada como una ayuda digestiva para individuos que son deficientes en la capacidad de digerir la lactosa. Por ejemplo, la lactasa de Aspergillus oryzae se administra como Lactaid® (Pleasantville, NJ) como suplemento dietetico y en las patentes de Estados Unidos 6.660.313 y 6.562.339 se describen formulaciones de lactasa para la administracion oral en los suplementos dieteticos. La papaina, una proteasa de cisteina, se administra como una ayuda digestiva. Sin embargo, su temperatura optima es 65 °C y no esta claro que la papaina sea una enzima activa en el estomago.

En las patentes de Estados Unidos 7.320.788 y 7.303.871 se describe el uso de glutenasas, solo y en combinacion, como enzimas administradas por via oral para digerir el gluten para el tratamiento (y prevencion de los sintomas) de celiaquia. Una de las enzimas descritas como glutenasa es una version recombinante de una cisteina endoproteasa aislada originalmente a partir de cebada. En 1953, por primera vez se reconocio que la ingestion de gluten, una proteina de la dieta habitual presente en el trigo, la cebada y el centeno causa enfermedad en individuos sensibles. El gluten es una mezcla compleja de moleculas de glutenina y prolamina ricas en glutamina y prolina, que se piensa que es responsable de la induccion de la enfermedad. La ingestion de tales proteinas por individuos sensibles produce aplanamiento del revestimiento epitelial similar a un forro normalmente suntuoso del intestino delgado que se sabe que es responsable de la digestion terminal eficiente y extensa de peptidos y otros nutrientes. Los sintomas clinicos de la celiaquia incluyen fatiga, diarrea cronica, malaabsorcion de nutrientes, perdida de peso, distension abdominal, anemia, asi como un riesgo sustancialmente mayor del desarrollo de osteoporosis y neoplasias malignas intestinales (linfoma y carcinoma). La enfermedad tiene una incidencia de aproximadamente 1 de cada 200 en las poblaciones europeas.

Una enfermedad relacionada es la dermatitis herpetiforme, que es una erupcion cronica caracterizada por grupos de vesiculas intensamente pruriginosas, papulas y lesiones similares a la urticaria similar. Los depositos de IgA se producen en casi toda la piel de aspecto normal y perilesional. En del 75 al 90 % de los pacientes con dermatitis herpetiforme y en algunos de sus parientes se produce enteropatia sensible al gluten asintomatica. El inicio suele ser gradual. El picor y el ardor son graves y el rascado a menudo oculta las lesiones primarias con eczematizacion de la piel cercana, lo que lleva a un diagnostico erroneo de eccema. La adhesion estricta a una dieta libre de gluten durante periodos prolongados puede controlar la enfermedad en algunos pacientes. En ocasiones se prescribe dapsona, sulfapiridina y colchicina para el alivio del picor producido por la dermatitis herpetiforme.

La celiaquia y la dermatitis herpetiforme se consideran en general enfermedades autoinmunes y los anticuerpos que se encuentran en el suero de los pacientes indican una base inmunologica de la enfermedad. Los anticuerpos frente a la transglutaminasa tisular (tTG) y la gliadina aparecen en casi el 100 % de los pacientes con celiaquia activa y la presencia de tales anticuerpos, en particular de la clase IgA, se ha utilizado en el diagnostico de la enfermedad.

La gran mayoria de los pacientes con celiaquia y dermatitis herpetiforme expresan las moleculas HLA-DQ2 [DQ(a1*0501, b1*02)] y/o DQ8 [DQ(a1*0301, b1*0302)]. Se cree que el dano intestinal esta causado por las interacciones entre oligopeptidos especificos de gliadina y HLA-DQ2 o DQ8, que a su vez inducen proliferacion de

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linfocitos T en las capas subepiteliales. Las celulas T 1 colaboradoras y las citocinas aparentemente desempenan un papel importante en un proceso inflamatorio local que conduce a la atrofia de las vellosidades del intestino delgado.

En la actualidad, el unico tratamiento para la celiaquia es la estricta evitacion de todos los alimentos que contienen gluten, aunque se estan realizando ensayos clinicos de glutenasas. Aunque la retirada del gluten ha transformado el pronostico para los ninos con diagnostico de celiaquia y mejorado sustancialmente para pacientes adultos, algunas personas aun mueren de la enfermedad, principalmente adultos con enfermedad grave desde el principio. Una causa importante de muerte es la enfermedad linforreticular (especialmente linfoma intestinal). No se sabe si una dieta libre de gluten disminuye este riesgo. La remision clinica aparente se asocia a menudo con recaidas histologicas que se detectan unicamente mediante biopsias de revision o mediante el aumento de los titulos de EMA.

El gluten es tan ampliamente utilizado, por ejemplo, en sopas comerciales, salsas, helados, perritos calientes y otros alimentos, que los pacientes necesitan listas detalladas de los productos alimenticios que deben evitar y asesoramiento experto de un dietista familiarizado con la celiaquia. La ingestion de pequenas cantidades de gluten puede prevenir la remision o inducir recaidas. Tambien pueden ser necesarios suplementos de vitaminas, minerales y hematinicos, dependiendo del grado de deficiencia experimentado por un paciente particular. Unos pocos pacientes responden mal o nada a la retirada del gluten, ya sea porque el diagnostico es incorrecto o porque la enfermedad es resistente. En este ultimo caso, los corticosteroides orales (por ejemplo, prednisona 10 a 20 mg dos veces al dia) pueden inducir respuesta.

Tal vez, la nueva terapia mas prometedora en el desarrollo clinico es el uso de glutenasas como se describe en las patentes de Estados Unidos 7.320.788 y 7.303.871 (veanse tambien las publicaciones PCT N.° 2008/115428; 2008/115411; 2007/044906; y 2007/047303; y US 20080193436) para prevenir y/o tratar los sintomas de celiaquia y/o dermatitis herpetiforme mediante la disminucion de los niveles de oligopeptidos toxicos del gluten en los productos alimenticios, ya sea antes o despues de la ingestion por un paciente. Estas publicaciones de patente describen que ciertos oligopeptidos del gluten son resistentes a la escision por las enzimas gastricas y pancreaticas, que la presencia de tales peptidos en el intestino delgado da lugar a efectos toxicos en la celiaquia (y la dermatitis herpetiforme) de los pacientes y que el tratamiento enzimatico puede eliminar tales peptidos y sus efectos toxicos. Por digestion con glutenasas, estos oligopeptidos toxicos se escinden en fragmentos, lo que previene o alivia sus efectos toxicos en los pacientes de celiaquia o dermatitis herpetiforme.

Muchas glutenasas comprenden residuos de cisteina y/o metionina y las proteinas que contienen cisteina o metionina pueden estar sujetos a oxidacion durante el almacenamiento ya sea como la enzima a granel o como formas farmaceuticas, y las enzimas con cisteina en el sitio activo, especificamente las cisteina proteasas, se pueden inactivar mediante la oxidacion de la cisteina. La estabilidad de estas proteinas durante el almacenamiento o despues de la liofilizacion puede mejorarse mediante la adicion de acetilcisteina o metionina para secuestrar el ataque de radicales libres.

Se sabe que diversos antioxidantes son utiles como conservantes durante el almacenamiento de productos farmaceuticos y alimentos, incluyendo antioxidantes que contienen azufre, tioles libres, tales como cisteina, homocisteina, tioglicerol, acetilcisteina, asi como sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio y similares, disulfuros (tales como ditiotreitol y acido a-lipoico, donde se pueden generar tioles libres), y otras clases de antioxidantes, tales como agentes quelantes, tales como EDTA, acido ascorbico, acido galico y sus derivados, tocoferol y sus derivados, y otros conocidos en la tecnica porque se sabe que previenen la oxidacion. La selection de un antioxidante que funciona para una proteina particular, a menudo no es predecible e implica ensayo y error.

Debido a la prevention de la oxidacion en formas farmaceuticas implica volumenes limitados de farmaco, cantidades pequenas de antioxidante puede ser eficaz, ya que la concentration del antioxidante en la forma farmaceutica es relativamente grande. Sin embargo, la cantidad de antioxidante en la forma farmaceutica tendria una actividad insignificante en el volumen mas grande del estomago, que puede ser 1 litro en volumen o mas.

Se ha notificado que ciertas cisteina proteasas, en particular, papaina y ciertas catepsinas, estan desactivadas por S-nitrosilacion de la cisteina del sitio activo (vease Wang et al. (2000) JBC 2002 277(21):18568-73; Ascenzi et al. (2001) Curr. Protein Pept. Sci. 2: 137-153.; y Venturini et al. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 270: 437441.). Se ha demostrado que ciertos donantes de NO que contienen sulfhidrilo inhiben de forma reversible esta enzima mediante la formation de enlaces S-NO en el sitio activo, Cys25. Esta inhibition se invirtio mediante ditiotreitol, pero no con acido ascorbico. Los investigadores presumieron que un enlace disulfuro entre la papaina y el donante de S-NO era responsable de la inhibicion.

Se ha demostrado que el nitrato en la saliva, en ratas, se convierte en nitrito, que despues se puede convertir adicionalmente en NO al pH gastrico en ayunas de 2 (Bjorne et al. (2004) J. Clin. Invest. 113: 106-114). En tales condiciones, el aumento de la formacion de NO a partir de nitritos y el aumento del flujo sanguineo, presumiblemente mediado por NO, se observaron repetidamente. Se sabe que, desde el lado serosal, el oxido nitrico actua en el estomago para influir en la motilidad gastrointestinal, posiblemente mediante la formacion de intermedios de la proteina S-nitrosiltiol.

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Por lo tanto, sigue habiendo la necesidad de formulaciones farmaceuticas y formas farmaceuticas unitarias que pueden mejorar la estabilidad de una protema en el estomago alimentado. La presente invencion satisface estas y otras necesidades.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona formulaciones farmaceuticas de una proteina adecuada para la administration oral que estabiliza la proteina en el estomago alimentado. La presente invencion proporciona una formulation farmaceutica solida de una endoproteinasa B2 de cebada (EPB2) o una forma recombinante de la misma adecuada para administracion oral en forma de dosis unitaria que comprende un antioxidante que contiene azufre seleccionado de un sulfato, un tiol libre y el grupo que consiste en sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, N-acetilcistema, homocistema, cistema, monotioglicerol, tiosulfato de sodio, acido a-lipoico, y ditiotreitol. En diversas realizaciones, la formulacion farmaceutica comprende opcionalmente un agente quelante. En una realization, el agente quelante es EDTA. En otras realizaciones, el agente quelante es acido citrico.

En una realizacion, la endoproteasa de cebada EPB2 se mezcla con una prolil endopeptidasa (PEP). En una realizacion, la PEP es PEP De Sphingomonas capsulata o una forma modificada de dicha proteasa, o una version recombinante de cualquiera de ellas. En una realizacion, la PEP es PEP de Aspergillus niger o una forma modificada de dicha proteasa, o una version recombinante de cualquiera de ellas.

La presente invencion es util en un metodo para prevenir y/o tratar la celiaquia y/o dermatitis herpetiforme en un paciente, comprendiendo dicho metodo la etapa de administrar por via oral una cistema proteasa estabilizada que contiene la formulacion farmaceutica de la invencion a dicho paciente, simultaneamente con la ingestion de un producto alimenticio que contiene gluten por el paciente.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona formas de dosis unitarias de las nuevas composiciones de la invencion, como se define en las reivindicaciones. En diversas realizaciones, la forma de dosis unitaria se puede utilizar convenientemente en el metodo de la invencion. Las formas farmaceuticas y las formulaciones farmaceuticas de la invencion se pueden usar para el tratamiento de mamiferos, asi como de seres humanos.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra la actividad de ALV001* (la forma activa de la proenzima ALV001) durante la incubation con el fluido gastrico posprandial.

La figura 2 muestra la actividad de ALV001 durante la incubacion con el fluido gastrico posprandial.

La figura 3 es una transferencia Western de ALV001 que muestra la estabilizacion de ALV001 en el fluido gastrico posprandial con 1 -tioglicerol.

La figura 4 muestra la actividad de ALV003 durante la incubacion con el fluido gastrico posprandial en ausencia o presencia de 1 -tioglicerol.

La figura 5 muestra la inversion de la perdida de actividad enzimatica con antioxidante.

La figura 6 muestra la estabilizacion de ALV001 en fluido gastrico posprandial con agentes reductores.

La figura 7 muestra la estabilizacion como en la figura 6, con tiosulfato de sodio a 0,5 mM, metabisulfito de sodio a 0,5 mM y acido lipoico a 5 mM.

La figura 8 muestra un curso de tiempo para la estabilizacion con sulfito de sodio.

La figura 9 muestra una titulacion de metabisulfito de sodio.

La figura 10 muestra una restauracion de la actividad despues de la adicion de agentes reductores.

La figura 11 muestra una dependencia de la dosis de metabisulfito de sodio en la estabilizacion de ALV001.

La figura 12 muestra una titulacion de metabisulfito en la concentration 2X de enzima ALV001.

La figura 13 muestra que el metabisulfito de sodio estabiliza la actividad de ALV001 en zumo de naranja. 3 mg/ml ALV001 se reconstituyeron en zumo de naranja con o sin metabisulfito de sodio 840 |jM. La actividad de la enzima cromogenico se midio en los puntos de tiempo indicados para determinar la cantidad relativa de enzima funcional.

La figura 14 muestra que la cistema estabiliza la actividad de ALV001 en condiciones gastricas simuladas posprandiales. Una comida libre de gluten se mastico y escupio en el fluido gastrico en reposo. ALV003 y diferentes niveles de cistema se anadieron a tiempo 0 y la estabilidad de la actividad ALV001 analizo mediante el control de actividad de la enzima cromogenica en el tiempo. La secretion de acido gastrico se simulo durante todo el experimento.

La figura 15 muestra el estudio de estabilidad de ALV001. Se formularon 150 mg de enzima con 300 mg de acido citrico monohidrato y 8 mg de bisulfito de sodio se introdujeron en una botella de polipropileno y se sellaron en bolsas de aluminio. Un ensayo cromogenico se midio en puntos especificos de tiempo para evaluar la estabilidad.

Descripcion detallada de la invencion

En la tecnica actual de la administracion oral (la administracion de una sustancia por via oral, es decir, la administracion oral) de las proteinas, no se ha tratado la estabilizacion en el tracto Gl para evitar la oxidation de

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protemas; en cambio, el foco de los esfuerzos del pasado ha estado en la inestabilidad potencial de la protema ingerida por v^a oral de acido o a la proteolisis mediante enzimas digestivas. Por lo tanto, la necesidad de proporcionar una estabilizacion adicional de las protemas administradas por v^a oral a la oxidacion no se ha apreciado antes de la presente invencion. Por otra parte, los beneficios de tal estabilizacion pueden ser particularmente beneficiosos, en particular para la administration oral de enzimas en el estomago con el fin de mejorar la proteolisis. La presente invencion surgio al menos en parte del descubrimiento de que la oxidacion puede desempenar un papel clave en la degradation de tales enzimas administrados por via oral.

La enzima ALV001, una forma modificada recombinante de la cisteina proteasa conocida como EPB2 de cebada, se inactivo rapidamente en los extractos ex vivo de fluido gastrico humano alimentado y a velocidades que eran significativamente mas rapidas que las observadas a un pH similar (3 a 5) y el contenido de pepsina. Un aspecto de la presente invencion surge del descubrimiento de que la adicion de antioxidantes, en particular antioxidantes que contienen azufre, tales como sulfitos o tioles libres o agentes que generan tioles libres en el fluido gastrico, estabilizan ALV001 (y por lo tanto, otras cisteina proteasas y protemas que contienen cisteina) en el fluido gastrico. Sorprendentemente, estos antioxidantes que contienen azufre tambien pueden regenerar la enzima activa a partir de ALV001 inactivada en fluido gastrico. Otros antioxidantes, tales como acido ascorbico y metionina (en los que el grupo sulfhidrilo esta metilado) no estabilizaron (conservaron la actividad de) ALV001. El ETDA ayudo a estabilizar ALV001 en el fluido gastrico ex vivo, aunque en menor medida que los antioxidantes, y, por tanto, los agentes quelantes generalmente proporcionan cierta estabilizacion, solos o en combination con un antioxidante, de acuerdo con la invencion. Entre los antioxidantes, son particularmente eficaces en la estabilizacion de ALV001 el sulfito de sodio y el metabisulfito de sodio.

Como se usa en este documento, un "antioxidante" es una molecula capaz de ralentizar o prevenir la oxidacion de otras moleculas. La oxidacion es una reaction quimica que transfiere electrones de una sustancia a un agente oxidante. Entre tales antioxidantes se incluyen, sin limitaciones, agentes reductores, acido ascorbico (vitamina C), acido lipoico, melatonina, acido urico, carotenos, retinoles, tocoferoles y tocotrienoles, por ejemplo, a-tocoferol (vitamina E), la ubiquinona (coenzima Q), y similares.

Como se usa en el presente documento un "agente reductor" es cualquier compuesto en la subclase de compuestos antioxidantes fisiologicamente aceptables que reduce otra especie en una reaccion redox (reduction-oxidation) y, al hacerlo, se oxida y, de este modo, sirve como donante de electrones en la reaccion redox. Entre los agentes reductores incluyen, sin limitaciones, metionina, glutatiol, ditiotreitol, ditioeritritol, p-mercaptoetanol, metabisulfito de sodio, tioglicolato, cisteina, N-acetilcisteina, homocisteina, monotioglicerol, sulfito de sodio, bisulfito de potasio, tiosulfito de sodio, y similares. Algunos de estos agentes comprenden un grupo tiol libre (es decir, mercaptan), por ejemplo monotioglicerol, tiosulfito de sodio, metabisulfito de sodio, y similares. Los agentes que estan en una forma oxidada, pero que comprenden un tiol libre en acido incluyen, sin limitaciones, acido a-lipoico, ditiotreitol, glutation, y similares.

Para ciertos antioxidantes, los niveles necesarios para actuar en un volumen de un litro del estomago requeririan una cantidad de antioxidante en la forma farmaceutica (o que deben tomarse acompanando a la forma farmaceutica) que son mas grandes de lo que actualmente esta aceptado por razones toxicologicas en la Guia de ingredientes inactivos de la FDA. En consecuencia, su uso en las composiciones de la invencion requeriria, probablemente, pruebas clinicas adicionales del propio antioxidante. Por el contrario, los sulfitos y metabisulfitos, especialmente sus sales de sodio y de potasio y combinaciones, con su larga historia como conservantes en la industria alimentaria y su potencia inusual como agentes reductores de las cisteina proteasas como se describe en el presente documento, son excipientes farmaceuticos eficaces y aceptados.

En algunas realizaciones de la invencion, el antioxidante se selecciona de sulfito de sodio, bisulfito de sodio, bisulfato de potasio, metabisulfito de potasio, tiosulfato de sodio, glutation, cisteina, homocisteina, ditionito de sodio, tioglicerol, y acetilcisteina, solos o en combinacion. En otras realizaciones, un antioxidante que contiene azufre se selecciona del grupo que consiste en sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, N-acetilcisteina, homocisteina, cisteina, monotioglicerol, tiosulfato de sodio, acido a-lipoico, y ditiotreitol. En algunas realizaciones, el antioxidante es metabisulfito de sodio.

La dosis de un antioxidante para los propositos de la presente invencion se puede determinar empiricamente mediante ensayos conocidos en la materia, por ejemplo mediante la prueba de un intervalo de dosis para el efecto estabilizante de una concentration conocida de proteina. Un experto en la tecnica entendera que el intervalo de dosificacion dependera del antioxidante especifico. En algunas realizaciones, la dosis de antioxidante es al menos aproximadamente 2 mg por forma farmaceutica; al menos aproximadamente 5 mg por forma farmaceutica; al menos aproximadamente 10 mg por forma farmaceutica, al menos aproximadamente 50 mg por forma farmaceutica; y no mas de aproximadamente 500 mg por forma farmaceutica, por lo general no mas de aproximadamente 300 mg por forma farmaceutica.

En algunas realizaciones, el antioxidante es metabisulfito de sodio, que puede estar presente a una concentracion de aproximadamente 2-50 mg por forma farmaceutica, preferiblemente a desde aproximadamente 4-16 mg por forma farmaceutica, y, lo mas preferiblemente, a de aproximadamente 6-10 mg por forma farmaceutica. En otras

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realizaciones, el antioxidante es cistema, que puede estar presente a una concentration de aproximadamente 5-400 mg por forma farmaceutica, preferiblemente a desde aproximadamente 10-350 mg por forma farmaceutica, y, lo mas preferiblemente, a de aproximadamente 50-300 mg por forma farmaceutica.

En diversas realizaciones, la formulation farmaceutica comprende opcionalmente un agente quelante. El agente quelante es un componente fisiologicamente aceptable. Entre los ejemplos del agente quelante se incluyen, sin limitaciones, acido etilendiaminotetraacetico, etilendiaminotetraacetato (EDTA), etilendiaminotetraacetato de sodio, EGTA, acido fitico, acido citrico, por ejemplo, acido citrico anhidro, y similares. Estos pueden ser usados solos o en mezcla. En una realization, el agente quelante es EDTA.

La dosis de un agente quelante puede determinarse empiricamente mediante ensayos conocidos en la tecnica, por ejemplo mediante el ensayo un intervalo de dosis para el efecto de estabilizacion en una concentracion conocida de proteina, por lo general en combination con un antioxidante seleccionado. Un experto en la tecnica entendera que el intervalo de dosificacion dependera del agente quelante especifico y de la proteina que se va a administrar. En algunas realizaciones, la dosis es de al menos aproximadamente 5 mg por forma farmaceutica; al menos aproximadamente 10 mg por forma farmaceutica; al menos aproximadamente 50 mg por forma farmaceutica, al menos aproximadamente 100 mg por forma farmaceutica; y no mas de aproximadamente 500 mg por forma farmaceutica, por lo general no mas de aproximadamente 300 mg por forma farmaceutica.

En algunas realizaciones, el agente quelante es acido citrico, por ejemplo, acido citrico anhidro, monohidrato de acido citrico, que puede estar presente a una dosis de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 mg por forma farmaceutica, por lo general a una dosis de aproximadamente 25 a 350 mg por forma farmaceutica, y se pueden proporcionar a una dosis de aproximadamente 45 - 275 mg por forma farmaceutica.

En las formulaciones de la presente invention, un antioxidante, por ejemplo, un agente reductor como se ha descrito anteriormente, se proporciona a una concentracion eficaz para estabilizar el agente activo de la proteasa cuando se expone al fluido gastrico, particularmente cuando se expone a fluido gastrico posprandial. Las formulaciones estan destinadas para su uso in vivo. Sin embargo, por conveniencia, la estabilidad se puede analizar in vitro, por ejemplo, mediante la combinacion de la proteasa con fluido gastrico posprandial y la evaluation de la actividad proteolitica en un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, durante aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, o mas. Una concentracion eficaz es suficiente para mantener al menos aproximadamente 25 % de la actividad enzimatica de partida, al menos aproximadamente 50 % de la actividad enzimatica de partida, al menos aproximadamente 75 % de la actividad enzimatica de partida, o al menos aproximadamente 90 % de la actividad enzimatica de partida, o es suficiente sustancialmente para mantener la actividad original durante al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, o mas.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona nuevas formulaciones de proteinas adecuadas para administration oral, en las que las proteinas son mas resistentes a la degradation oxidativa que las composiciones actualmente disponibles. Los expertos en la tecnica apreciaran que este descubrimiento puede aumentar el potencial terapeutico de una amplia variedad de proteinas para administracion oral, dado que las pruebas o las propiedades anteriores de una proteina pueden haber indicado que la proteina no proporcionaria un beneficio terapeutico en la administracion oral. Por ejemplo, aunque la papaina se comercializa como un nutraceutico, no ha encontrado uso como agente terapeutico. A pesar de su alta temperatura optima, la papaina puede proporcionar un beneficio terapeutico si se administra en una formulacion de la invencion.

Por tanto, los expertos en la tecnica apreciaran que la presente invencion proporciona formulaciones farmaceuticas de una proteina como se define en las reivindicaciones adecuadas para administracion oral, que estabilizan la proteina en el estomago alimentado. En una realizacion, la formulacion comprende, ademas de la proteina, un antioxidante que contiene azufre y/o un agente quelante.

Se ha notificado que las cistema proteasas son utiles para diversos propositos terapeuticos. Por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 6.241.973 se describen cistema proteasas utiles para blanquear los dientes. La publication PCT n.° WO 2004/058816 describe cistema proteasas utiles en las vacunas contra fasciola hepatica. La publication de la solicitud de patente de Estados Unidos. N.° 20080039400 describe cistema proteasas utiles en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal y otras afecciones. La publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos. N.° describe cistema proteasas utiles en el tratamiento de la intolerancia a los alimentos. La publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos. N.° 20070148267 describe cistema proteasas utiles en la regulation de la ingesta de alimentos. La publicacion de la solicitud de patente de Estados Unidos. N.° 20060134017 y 20060134018 describen cistema proteasas utiles en la prevention de la adhesion bacteriana a superficies biologicas, es decir, para la prevencion de la formation de placa. Las cistema proteasas tambien se han descrito para tratamientos sistemicos, incluyendo, por ejemplo, la induction de la apoptosis en tipos de cancer. Las composiciones de la invencion son, por consiguiente, utiles en tales metodos.

La endoproteasa de cebada EPB2 o una forma recombinante de la misma es una proteasa capaz de digerir un peptido de gluten que es toxico para un paciente de celiaquia en fragmentos no toxicos, ya sea solo o en combinacion con otra proteasa.

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Tal como se utiliza en el presente documento, una "formulacion farmaceutica", o "forma farmaceutica" incluye cualquier formulacion destinada a la administration a seres humanos o mam^feros y, por lo tanto, incluye no solamente las formulaciones que se someten a pruebas clinicas y la aprobacion de las autoridades reguladoras, tales como la FDA, sino tambien formulaciones que no requieren la aprobacion regulatoria, tales como nutraceuticos.

Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones de la invention, incluyendo formulaciones farmaceuticas y formas farmaceuticas, pueden tambien incluir, dependiendo de la formulacion deseada, vehiculos o diluyentes no toxicos farmaceuticamente aceptables, que se definen como vehiculos habitualmente utilizados para formular composiciones farmaceuticas para la administracion a animales o a seres humanos. El diluyente se selecciona de manera que no afecte adversamente a la actividad biologica de la proteasa. Ejemplos de dichos diluyentes son agua destilada, agua tamponada, solution salina fisiologica, PBS, solution de Ringer, solution de dextrosa y solution de Hank. Ademas, la composition o formulacion farmaceutica puede incluir otros vehiculos, adyuvantes, o estabilizantes no toxicos, no terapeuticos, no inmunogenicos, excipientes y similares. Las composiciones tambien pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a las condiciones fisiologicas, tales como agentes de ajuste del pH y tampon, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes humectantes y detergentes.

Las composiciones de la invencion tambien pueden incluir cualquiera de diversos agentes estabilizantes, tales como un antioxidante, por ejemplo. Las proteinas o polipeptidos en una composicion de la invencion tambien pueden formar complejos con moleculas que mejoran sus atributos in vivo. Tales moleculas incluyen, por ejemplo, hidratos de carbono, poliaminas, aminoacidos, otros peptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso), y lipidos.

Orientation adicional con respecto a las formulaciones que son adecuadas para diferentes tipos de administracion se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17a ed. (1985). Para una breve revision de los procedimientos para la liberation de farmacos, vease Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

Para la administracion oral, el principio activo se puede administrar por via oral en formas farmaceuticas solidas, tales como capsulas, comprimidos y polvos, tal como en un sobre o en pulverization, o en formas farmaceuticas liquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. El o los componentes activos se pueden encapsular en capsulas de gelatina o hipromelosa junto con los ingredientes inactivos y vehiculos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidon, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, acido estearico, sacarina sodica, talco, carbonato de magnesio. Ejemplos de ingredientes activos adicionales que se pueden anadir para proporcionar un color, gusto, estabilidad, capacidad tampon, dispersion y otras caracteristicas deseables conocidas son oxido de hierro rojo, gel de silice, laurilsulfato sodico, dioxido de titanio y tinta blanca comestible. Se pueden usar diluyentes similares para formar pastillas comprimidas. Tanto los comprimidos como las capsulas se pueden fabricar en forma de productos de liberacion sostenida, para proporcionar la liberacion continua de medication durante un periodo de horas. Las pastillas comprimidas pueden estar recubiertas con azucar o recubiertas con pelicula para enmascarar el gusto y proteger el comprimido de la atmosfera, o con recubrimiento enterico para la disgregacion selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas farmaceuticas liquidas para administracion oral pueden contener agentes colorantes y aromatizantes para aumentar la aceptacion por el paciente.

Los componentes utilizados para formular las composiciones farmaceuticas de la invencion son, preferiblemente, de alta pureza y estan sustancialmente libres de contaminantes potencialmente nocivos (por ejemplo, normalmente al menos de calidad de National Food (NF), generalmente al menos de calidad analitica, y, mas normalmente, al menos de calidad farmaceutica). En la medida en que un compuesto dado tiene que sintetizarse antes de su uso, el producto resultante esta normalmente sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente toxico, en particular cualquier endotoxina, que pueden estar presentes durante el proceso de sintesis o purification.

Las formulaciones nutraceuticas se definen como "un alimento o parte de un alimento que ofrece beneficios medicos y/o de salud, incluyendo la prevention o el tratamiento de enfermedades". (Dr. Stephen DeFelice, director of Foundation for Innovation In Medicine). Los productos van desde nutrientes aislados, suplementos dieteticos y dietas, a alimentos manipulados geneticamente, alimentos funcionales, productos a base de hierbas y alimentos procesados, tales como cereales, sopas y bebidas. Los alimentos funcionales, el termino mas popular entre los consumidores pero no una categoria de producto claramente delineada, los define Clare Hasler, doctorada por la University of Illinois, como alimentos que incluye "cualquier alimento, o ingrediente alimentario modificado, que pueden proporcionar un beneficio para la salud mas alla de los nutrientes tradicionales que contiene". Las formulaciones nutraceuticas de interes incluyen alimentos para uso veterinario o humano, tales como las barras de alimentos saludables, bebidas y suplementos de bebidas, y similares. Estos alimentos se han potenciado mediante la inclusion de una proteasa biologicamente activa en una composicion como se proporciona en el presente documento.

Cuando la forma farmaceutica o las formas farmaceuticas son para el tratamiento de la celiaquia y contienen la enzima ALV001, al menos una forma farmaceutica puede contener ALV001 solo o en combination con ALV002. El contenido total de ALV001 administrada con una comida cuando ALV001 se administra sin ALV002 es de 50 a 2.000

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mg de la proteina ALV001, preferiblemente entre 100 y 1.000 mg, y aun mas preferiblemente entre 100 y 600 mg de ALV001. Cuando ALV001 y ALV002 se administran en una combinacion, ya sea en la misma o en distintas formas farmaceuticas, se pueden administrar en una proporcion de 10:1 a 1:10, mas preferiblemente de 3:1 a 1:3, y, lo mas preferiblemente, en una proporcion de 1,5:1 a 1:1,5. 1.5. Si se administra en una proporcion de de aproximadamente 1:1, el contenido total de enzima administrada con una comida puede ser de 50 a 2.000 mg, mas preferiblemente de 50 a 900 mg, y lo mas preferiblemente de 100 a 400 mg.

La actividad proteolitica de ALV001 a 25 °C contra el sustrato cromogenico Z-Phe-Arg-pNA se evalua mediante la medicion de la tasa de cambio en la absorbancia de la luz a 410 nm. El metodo se basa en la liberation de para- nitroanilina (pNA, 4-nitroanilina) en solution, que absorbe la luz a 410 nm. La especificacion es > 5.000 u/mg para ALV001.

La actividad proteolitica de ALV002 a 25 °C contra el sustrato cromogenico Z-Gly-Pro-pNA se evalua mediante la medicion de la tasa de cambio en la absorbancia de la luz a 410 nm. El metodo se basa en la liberacion de para- nitroanilina (pNA, 4-nitroanilina) en solucion, que absorbe la luz a 410 nm. La especificacion es > 3.000 u/mg para ALV002.

La presente invention proporciona un metodo para prevenir y/o tratar la celiaquia y/o la dermatitis herpetiforme en un paciente, comprendiendo dicho metodo la etapa de administrar por via oral una cisteina proteasa estabilizada que contiene la formulation farmaceutica de la invencion, en la que la formulation se estabiliza con un antioxidante, y en la que la proteasa es capaz de degradar gluten en fragmentos no toxicos para pacientes celiacos tras la administration oral, a dicho paciente simultaneamente con la ingestion por un paciente de un producto alimenticio que contiene gluten. Las patentes de Estados Unidos n.° 7.320.788 y 7.303.871 describen metodos para la identification de proteasas capaces de degradar el gluten en fragmentos no toxicos para los pacientes de celiaquia.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona formulaciones farmaceuticas y formas farmaceuticas, es decir, formas de dosis unitarias, de las nuevas composiciones descritas en el presente documento. En diversas realizaciones, la forma de dosis unitaria se puede utilizar convenientemente en el metodo de la presente divulgation.

Ejemplos

1. Demostracion de la inestabilidad de ALV001 en fluido gastrico humano posprandial

Los fluidos gastricos posprandiales humanas congeladas se descongelaron y se centrifugaron a 21.000 g durante 5 minutos para sedimentar el material insoluble y el sobrenadante se utilizo para este ejemplo. Se anadieron entre 50 y 200 |jl de fluido gastrico a los pocillos de una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C. Cuando se anadieron antioxidantes, se anadieron en esta etapa. ALV001 o ALV001 activado* (vease la solicitud de patente PCT N.° 2008/003425 con respecto a como ALV001* (la forma activa de ALV001) se produce tras la escision proteolitica de ALV001) se disolvio en una proporcion de 20 jl de agua/mg de polvo, la concentration se midio mediante la absorbancia a 280 nm y se anadio la proteina al fluido gastrico a una concentracion de 0,1 a 0,3 mg/ml. En el tiempo de obtencion de muestras especificado, una muestra de 1,6 jl de fluido gastrico se diluyo en tampon de ensayo para dar un volumen final de 280 jl, y la concentracion se midio mediante un ensayo de actividad cromogenica utilizando Z-Phe-Arg-p-nitroanilina (pNA) como sustrato. El metodo se basa en la capacidad de pNA para absorber a 410 nm cuando se libera del sustrato. ALV001 es la proenzima o cimogeno para la endoproteasa B (isoforma 2) que escinde el lado C-terminal de la arginina en la secuencia Phe-Arg. La escision enzimatica y la posterior liberacion de pNA pueden controlarse mediante el cambio de absorbancia a 410 nm. Para determinar la velocidad de reaction, la absorbancia a 410 nm se midio cada 10 segundos durante 1 minuto. La pendiente de la linea de regresion dividida por la concentracion de la enzima era la actividad enzimatica indicada.

La estabilidad de ALV001* en el fluido gastrico humano se analizo para 4 voluntarios sanos en ayunas y a los 15, 30, 45, 60, 75, y 90 minutos despues de una comida. El fluido gastrico se retiro de estos temas a traves de una sonda nasogastrica. Se midio la actividad enzimatica de ALV001 despues de 1,5, 5, 10, 20, y 60 minutos de la adicion al fluido gastrico. Tambien se realizaron transferencias Western para investigar la degradation proteolitica de ALV001* en el fluido gastrico.

La figura 1 muestra que la actividad de ALV001 * era solo detectable en el fluido gastrico posprandial de 15 y 30 minutos del sujeto 4 e incluso entonces desaparecio despues de 20 minutos de incubation. Se observaron resultados similares para los otros 3 sujetos y con la adicion del cimogeno, ALV001. En el fluido gastrico en ayunas, se esperaba una rapida degradacion enzimatica de ALV001* debido al pH bajo, por ejemplo, pH 1,3 para el sujeto 4, y el contenido de pepsina. El fluido gastrico posprandial tiene un aumento transitorio de pH al intervalo de 3,5 o 4 o incluso mayor, y en este mayor pH, se reduce la actividad de la pepsina, y cabe esperar que ALV001 * sea mas resistente a la digestion proteolitica y a la degradacion por la acidez.

Como se muestra en la Figura 2, para el sujeto 1 en la muestra posprandial de 15 minutos a pH 4,0, mediante el ensayo cromogenico, se demostro que la enzima ALV001 se inactivaba rapidamente, pero la enzima todavia estaba intacta, medida mediante transferencia Western, mostrada en Figura 3. En el mismo sujeto, en las muestras

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gastricas posprandiales de 30 y 60 minutos, que estaban a pH de 2,5 y 1,2, respectivamente, la enzima estaba inactiva y habia sufrido proteolisis. Se obtuvieron Datos similares con las muestras de otros pacientes. La conclusion fue que una perdida inesperada de la actividad enzimatica de esta cistema proteasa ALV001 en las primeras muestras de fluido gastrico posprandial era el resultado de un mecanismo que no estaba relacionado con la proteolisis.

2. Demostracion de estabilizacion de ALV001 en fluido gastrico posprandial por 1-tioglicerol (monotioglicerol)

La figura 4 muestra los resultados de la adicion de un intervalo de concentraciones de monotioglicerol (MTG), de 0,01 a 50 mM, a los pocillos de fluido gastrico posprandial de 15 minutos como se ha descrito anteriormente. Tambien se incluyo un control sin MTG. La tasa de perdida de la actividad enzimatica de ALV001 disminuyo con el aumento de las concentraciones de MTG sin perdida a MTG 50 mM. Por lo tanto, el antioxidante MTG evito la perdida de la actividad enzimatica de esta cisteina proteasa.

Ademas, como se muestra en la Figura 5, la preincubacion de ALV003, una combination de ALV001 y ALV002 (una forma recombinante de prolil endopeptidasa de Sphingomonas) a una relation de aproximadamente de la enzima 1:1, en fluido gastrico posprandial de 15 minutos, seguido de la adicion de MTG 50 mM frente a ninguna adicion mostro que el antioxidante MTG podria revertir la perdida de actividad enzimatica de ALV001*. Despues de aproximadamente 20 minutos, la adicion de MTG a ALV001* no funcional preincubado, se restauro caso toda la actividad enzimatica.

3. Demostracion de estabilizacion de ALV001 en fluido gastrico posprandial mediante determinados agentes reductores

Numerosos agentes reductores, en particular, N-acetilcisteina, L-cisteina, homocisteina, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, tris(2-carboxietil)fosfina clorhidrato (TCEP), acido lipoico, tiosulfato de sodio, sulfito de sodio, y metabisulfito de sodio, demostraron todos ellos que estabilizaban ALV001* en el fluido gastrico posprandial temprano. En contraste, L-metionina y el acido ascorbico no estabilizaron la enzima. El EDTA potencio la estabilidad de ALV001*, lo que sugiere una dependencia de metales para la inactivation.

Mostrado en la figura 6, determinados agentes reductores se anadieron en 5 mM al fluido gastrico posprandial ex vivo que se obtuvo de un voluntario sano 15 minutos despues de comer y se incubo a 37 °C. La proenzima ALV001 se anadio al fluido gastrico. El tampon acetato a pH 4,5 se utilizo como control, porque ALV001 esta completamente activada en estas condiciones. Se tomaron muestras para determinar la actividad de ALV001 despues de 1,5, 5, 10, 20, 45 minutos.

Como se puede ver en la figura, la cisteina proteasa ALV001 era completamente activa en tampon de acetato. En contraste, la enzima se inactiva rapidamente en agua, gluten, e incluso con la adicion de acido ascorbico, un antioxidante. Hay evidencia de la estabilizacion con el agente quelante, EDTA. Se observaron mejoras sustanciales en la estabilidad con los agentes reductores, cisteina y N-acetilcisteina, y la estabilizacion mas eficaz se demostro con el agente reductor sulfito de sodio.

Como se muestra en la Figura 7, en un segundo conjunto de pruebas realizadas de la misma manera, se demostro que el tiosulfato de sodio a 0,5 mM, metabisulfito de sodio a 0,5 mM, y el acido lipoico en 5 mM mejoraban la estabilidad de ALV001 en fluido gastrico posprandial.

Como se muestra en la Figura 8, el sulfito de sodio era un agente reductor particularmente eficaz para estabilizar la ALV001, persistiendo la eficacia hasta 0,05 mM. El metabisulfito de sodio mejoro la estabilidad de ALV001 incluso a concentraciones de 50 |jM.

Como se muestra en la figura 9, en otra serie de prueba se examino la capacidad de estos agentes reductores y un agente quelante para invertir la degradation de ALV001 en el fluido gastrico. Se anadio ALV001 al fluido gastrico posprandial y se incubo durante 15 minutos a 37 °C. Los agentes reductores se anadieron a 5 mM a al fluido gastricos y, despues, se tomaron muestras para examinar la actividad de ALV001 a 1,5, 5, 10, 20, y 40 minutos despues de la adicion de los agentes reductores. El control de tampon y EDTA no restauraron la actividad enzimatica y el sulfito de sodio y la acetilcisteina restauraron parcialmente la actividad enzimatica.

Como se muestra en la figura 11, la dependencia de la dosis de metabisulfito de sodio y la estabilidad mejorada de ALV001 a 0,12 mg/ml se midio en fluido gastrico posprandial. Las muestras se recogieron a 1,5, 5, 10, 20 y 40 minutos. Aunque el metabisulfito de sodio proporciono estabilizacion considerable, incluso a 25 jM, se observo la mejor estabilizacion a 50 jM. Esta prueba se repitio a dos veces la concentration de la enzima para asegurar que el efecto no dependia de la concentracion de la enzima, la Figura 12.

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4. Prueba de la estabilidad de la forma farmaceutica

65 mg de ALV003, una mezcla que consiste en 38 mg de ALV001 (Lote A031207) y 27 mg de ALV002 (Lote B061707) se pesaron en cada tamano de capsulas de hipromelosa 0 (Qualicaps). Para un conjunto de capsulas, primero se anadieron 0,8 mg por capsula de metabisulfito de sodio (Spectrum, Lote WG 0855) al polvo de ALV003 y se mezclo a mano con una espatula antes de la colocacion en las capsulas. Las capsulas de hipromelosa se introdujeron en viales de 30 ml de polipropileno con botes de 1 g de desecante (Sorb-It). Los viales se transfirieron a camaras de estabilidad a 25 °C/60 % de HR y 40 °C/75 % de HR. Las muestras fueron retiradas a los intervalos inicial (T = 0), 2, 4 y 8 semanas para el analisis de la actividad enzimatica.

5. Metabisulfito de sodio en el zumo de uva como antioxidante

Las composiciones de la invencion incluyen productos alimenticios modificados para contener una proteasa terapeutica y un anti-oxidante, agente reductor, y/o agente quelante. Este ejemplo ilustra el uso del agente reductor metabisulfito de sodio en combinacion con la cisteina proteasa ALV001 tomada o mezclada con zumo de uva y otros zumos. Para demostrar la capacidad de estabilizar ALV001 en el fluido gastrico por el zumo de uva, como un ejemplo, se realizo el siguiente experimento. ALV001 se preparo en agua a 20|jl/mg de polvo o aproximadamente 9,5 mg/ml. En una placa de 96 pocillos se anadieron 54jl fluido gastrico posprandial de 15 minutos pre-incubado a 37 °C, 5 jl de jugo y 2,66 jl de ALV001 diluido a 1: 1 con agua. Los zumos analizados eran zumo de uva blanca espumoso (Welch's), zumo de uva blanca (Welch's), zumo de uva blanca (Safeway), zumo de lima Realime) y zumo de limon (Safeway). Estos zumos de frutas contienen metabisulfito como conservante. Se uso agua como control. El control de agua mostro la rapida degradation habitual de ALV001 en fluido gastrico posprandial. El zumo de lima y de limon mostro degradacion mas lenta de ALV001 y los 3 zumos de uva se mantuvieron estables durante el transcurso de tiempo de 20 minutos de la prueba.

Por lo tanto, en una realization de la invencion, se administra ALV003 u otra glutenasa (por ejemplo, 300 mg de farmaco) en una capsula de HPMC y se toma con un vaso, de aproximadamente 100 a 250 ml o mas, de zumo de uva.

6. Metabisulfito de sodio en zumo de naranja como antioxidante

3 mg/ml ALV001 se reconstituyeron en zumo de naranja con o sin metabisulfito de sodio 840 jM. La actividad enzimatica cromogenico se midio como se ha descrito anteriormente, en los puntos de tiempo indicados, para determinar la cantidad relativa de enzima funcional, como se muestra en la Figura 13. Los datos muestran una mayor estabilidad en presencia de metabisulfito de sodio.

7. Cisteina como antioxidante

Una comida libre de gluten se mastico y escupio en el fluido gastrico en reposo. ALV003 y diferentes niveles de cisteina se anadieron a tiempo 0 y la estabilidad de la actividad ALV001 se midio mediante el control de actividad de la enzima cromogenica en el tiempo. La secretion de acido gastrico se simulo durante todo el experimento. Como se muestra en la figura 14 muestra que la cisteina estabiliza la actividad de ALV001 en estas condiciones gastricas simuladas posprandiales.

8. Acido citrico monohidrato y bisulfito de sodio como antioxidante

Se formularon 150 mg de enzima (ALV001) con 300 mg de acido citrico monohidrato y 8 mg de metabisulfito de sodio se introdujeron en una botella de polipropileno y se sellaron en bolsas de aluminio. Un ensayo cromogenico se midio en puntos especificos de tiempo para evaluar la estabilidad, como se muestra en la figura 15.

9. Formas farmaceuticas

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene 300 mg o 900 mg de ALV003, opcionalmente en forma de comprimido, con manitol y celulosa microcristalina anadidos y 8 mg de metabisulfito de sodio.

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene un polvo liofilizado de ALVO01 en el que se habia anadido metabisulfito de sodio a la solution antes de la liofilizacion en lugar de monotioglicerol en una proportion de 100:8 (p/p) a una proportion de 900:4 (p/p).

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene un polvo liofilizado de ALVO01 en el que se habia anadido metabisulfito de sodio a la solucion antes de la liofilizacion en lugar de monotioglicerol en una proporcion de 100:8 (p/p) a una proporcion de 900:4 (p/p).

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene liberation inmediata de ALV001 en un intervalo de 100 a 900 mg y metabisulfito de sodio en un rango de 1 a 10 mg.

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La presente invention proporciona una forma farmaceutica que contiene liberation controlada de ALV001 en un intervalo de 100 a 900 mg y metabisulfito de sodio en un rango de 1 a 10 mg, liberados de 30 minutos a 6 horas.

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene liberacion controlada de ALV001 en un intervalo de 100 a 900 mg y metabisulfito de sodio en un rango de 1 a 10 mg, liberados de 30 minutos a 6 horas.

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene liberacion pulsada de ALV001 en un intervalo de 100 a 900 mg y metabisulfito de sodio en un rango de 1 a 10 mg en un pulso de liberacion inmediata y un segundo pulso liberado de 20 minutos a 6 horas despues.

La presente divulgation proporciona una forma farmaceutica que contiene una proteasa y una cantidad de un antioxidante que alcanza una concentration de antioxidante de al menos 30, 50, 100, o 200 jM en el estomago.

La presente divulgacion proporciona una forma farmaceutica que contiene una proteasa y una cantidad de un compuesto que genera una concentracion de tiol libre de al menos 100, 200 o 500 jM en el estomago.

La presente invencion proporciona una forma farmaceutica que contiene metabisulfito de sodio y puede contener tanto ALV001 como ALV002, donde un componente enzimatico se formula para proporcionar una liberacion inmediata y el otro componente enzimatico se libera de forma pulsada o para proporcionar una liberacion controlada.

Todas las formas farmaceuticas de ALV001 anteriores pueden tambien modificarse para incluir una segunda proteasa. En una realization, la segunda proteasa es una prolil endopeptidasa (PEP). En una realization, la PEP es PEP de Sphingomonas capsulata, por ejemplo y sin limitaciones, como se describe en la publication de PCT n.° 2008/115411. En diversas realizaciones, entre 1-2.000 mg de PEP y ALV001 se dosifican en una relation PEP:ALV001 en peso de de entre 1:100 a 100:1, mas preferiblemente entre 1:20 a 20:1, mas preferiblemente entre 1:5 y 5:1, y, lo mas preferiblemente, a una proportion de 1:1. En una realizacion, la forma farmaceutica se construye de manera que ALV001 y el antioxidante, por ejemplo, metabisulfito de sodio, se liberan inmediatamente y el PEP se libera de forma inmediata; o se entrega en uno o mas, pulsos cortos tardios (a partir de 10 minutos a 3 horas); o se libera segun un modo de liberacion sostenida durante 10 minutos a 3 horas.

En una realizacion, la presente divulgacion proporciona una forma farmaceutica en la que el antioxidante es un antioxidante que no es metabisulfito de sodio.

La presente divulgacion proporciona formas farmaceuticas oral que comprenden una proteina y un antioxidante seleccionados del grupo que consiste en sulfito de sodio, bisulfito de sodio, bisulfato de potasio, metabisulfito de potasio, solo o combination; tiosulfato de sodio; glutation, cisteina, homocisteina, ditionito de sodio, tioglicerol; y acetilcisteina

La presente divulgacion proporcionar de rodillos granulos compactos o granulos de la enzima. El antioxidante puede estar contenido en los granulos o sedimentos o mezclado con los granulos o sedimentos y, o bien se cargan o comprimen una forma farmaceutica.

Las formulaciones farmaceuticas de la invencion pueden estar en la forma de, por ejemplo y sin limitation, particulas, particulas en capsula o bolsita, o comprimido. Los comprimidos pueden ser de una sola capa, de dos capas, o de multiples capas y pueden estar recubiertos o sin recubrir. La formulation puede, por ejemplo y sin limitaciones, anadirse a un alimento o bebida y, despues, administrarse, por ejemplo, como una formulacion en polvo o granulo rociada o como una extension en forma de una mermelada o en polvo. Una capsula de bajo contenido en agua puede ser deseable para la estabilidad, y se pueden usar capsulas de hipromelosa, HPMC, de tamano 1, 0, o 00. Las capsulas pueden envasarse en un ambiente seco, ya sea con desecante o paquetes de desecantes o en blister con nitrogeno seco o en otro entorno seco.

Las formulaciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender un lubricante, tal como estearato de magnesio, acido estearico, fumarato de estearilo de sodio o lactilato de estearilo de sodio, aceite vegetal hidrogenado (tal como, trigliceridos hidrogenados y refinados de acidos estearico y palmitico). Estos pueden ser de 0,3 a 5% del peso de la forma farmaceutica. Si hay manitol contenido a una concentracion alta en el polvo liofilizado, pueden usarse las concentraciones mas altas de lubricante.

La cisteina proteasa de (u otro ingrediente farmaceutico activo de otra proteina) en polvo se puede mezclar con lubricante u otros excipientes, tales como un relleno o aglutinante y se granula. Si la cisteina proteasa es inestable con agua y la temperatura, se pueden compactar con rodillo en granulos, si es necesario mediante el uso de rodillos refrigerados para la estabilidad. Opcionalmente, se puede incluir un agente que modifica o controla el pH, al menos durante los primeros minutos despues de que la forma farmaceutica esta en el tracto Gl, para facilitar la activation de las proteinas de cimogeno como ALV001.

Las cargas, tales como fosfato dicalcico, celulosa microcristalina, maltodextrinas, manitol, lactosa, sacarosa, trehalosa se pueden incluir y mezclar con los polvos o incluirse en el polvo liofilizado o polvo secado por

pulverizacion. Estas cargas hidrofilicas, tales como celulosa microcristalina, pueden evitarse para ciertas enzimas, tales como ALV001.

Los excipientes de liberacion controlada se pueden mezclar para formar matrices polimericas que contienen el 5 farmaco. Estas matrices pueden ser de aproximadamente 1 mm de diametro con respecto al tamano de un comprimido completo 10 a 12 mm de ancho y hasta 1,8 cm o mas de longitud. Estas matrices pueden proporcionar de liberacion prolongada en el estomago siendo retenido con comida para V2 a 8 horas, dependiendo del tamano. Estas matrices pueden o no pueden ser hinchables. Si los polimeros hidrofilos de liberacion prolongada hinchables que son apropiados incluyen polimeros de celulosa y sus derivados (tales como por ejemplo hidroxietilcelulosa, 10 hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa y celulosa microcristalina, polisacaridos y sus derivados, oxidos de polialquileno, polietilenglicoles, quitosano, poli(alcohol vimlico), goma xantana, copolimeros de anhidrido maleico, poli(vinilpirrolidona), almidon y polimeros a base de almidon, poli(2-etil-2-oxazolina), poli(etilenimina), hidrogeles de poliuretano y acidos poliacrilicos reticulados y sus derivados. Otros ejemplos son copolimeros de los polimeros mencionados en la frase precedente, incluyendo copolimeros de bloque y polimeros injertados. Los recubrimientos 15 de liberacion extendida tambien se podrian preparar sobre estas particulas utilizando algunos de los polimeros anteriores.

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   REIVINDICACIONES

   1. Una formulacion farmaceutica solida de una endoproteinasa B2 de cebada (EPB2) o una forma recombinante de la misma, adecuada para administracion oral en forma de dosis unitaria, que comprende un antioxidante que contiene azufre seleccionado de un sulfato, un tiol libre y el grupo que consiste en sulfito de sodio, metabisulfito de sodio, N-acetilcistema, homocistema, cistema, monotioglicerol, tiosulfato de sodio, acido a-lipoico y ditiotreitol.
2. 2. La formulacion farmaceutica de la reivindicacion 1, en la que dicho antioxidante esta presente en una dosis de al menos aproximadamente 2 mg por forma farmaceutica a no mas de aproximadamente 500 mg por forma farmaceutica.
3. 3. La formulacion farmaceutica de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho antioxidante que contiene azufre es metabisulfito de sodio, que esta presente a razon de aproximadamente 2 - 50 mg por forma farmaceutica.
4. 4. La formulacion farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicho antioxidante que contiene azufre es cistema, que esta presente a razon de aproximadamente 5 - 400 mg por forma farmaceutica.
5. 5. La formulacion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un quelante.
6. 6. La formulacion farmaceutica de la reivindicacion 5, en la que el quelante es EDTA o acido citrico.
7. 7. La formulacion farmaceutica de la reivindicacion 6, en la que dicho quelante esta presente en una dosis de al menos aproximadamente 5 mg por forma farmaceutica a no mas de aproximadamente 500 mg/forma farmaceutica.
8. 8. La formulacion farmaceutica de la reivindicacion 7, en la que dicho quelante es acido citrico, que esta presente a razon de 10 a 500 mg por forma farmaceutica.
9. 9. La formulacion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la dosis unitaria comprende ademas una prolil endopeptidasa.
10. 10. La formulacion farmaceutica de la reivindicacion 9, en la que dicha prolil endopeptidasa es una PEP de Sphingomonas capsulata o una forma recombinante de la misma.
11. 11. La formulacion farmaceutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la formulacion es una capsula, un comprimido, un polvo, un sobre o un pulverizador.
12. 12. La formulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en un metodo para prevenir y/o tratar celiaquia y/o dermatitis herpetiforme en un paciente, comprendiendo dicho metodo la etapa de administrar por via oral dicha formulacion a dicho paciente de forma simultanea a la ingesta por el paciente de un producto alimentario que contiene gluten.