ES2617089T3 - Aparato y método para investigar moléculas por resonancia del plasmón superficial - Google Patents

Aparato y método para investigar moléculas por resonancia del plasmón superficial Download PDF

Info

Publication number
ES2617089T3
ES2617089T3 ES08788753.5T ES08788753T ES2617089T3 ES 2617089 T3 ES2617089 T3 ES 2617089T3 ES 08788753 T ES08788753 T ES 08788753T ES 2617089 T3 ES2617089 T3 ES 2617089T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
molecule
nanopore
metal nanoparticle
substrate
electromagnetic field
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08788753.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Cameron Frayling
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Base4 Innovation Ltd
Original Assignee
Base4 Innovation Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Base4 Innovation Ltd filed Critical Base4 Innovation Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2617089T3 publication Critical patent/ES2617089T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/648—Specially adapted constructive features of fluorimeters using evanescent coupling or surface plasmon coupling for the excitation of fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/65—Raman scattering
    • G01N21/658—Raman scattering enhancement Raman, e.g. surface plasmons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/701—Integrated with dissimilar structures on a common substrate
    • Y10S977/702—Integrated with dissimilar structures on a common substrate having biological material component
    • Y10S977/704—Nucleic acids, e.g. DNA or RNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/724—Devices having flexible or movable element
    • Y10S977/733—Nanodiaphragm
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/778—Nanostructure within specified host or matrix material, e.g. nanocomposite films
    • Y10S977/781—Possessing nonosized surface openings that extend partially into or completely through the host material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)

Abstract

Un aparato para investigar una molécula (20) que comprende: - dos depósitos separados entre sí por un sustrato (11), el primer deposito (19) adecuado para recibir una muestra que comprende la molécula (20) a investigar, y un segundo depósito (21) adecuado para que la molécula (20) pase a su interior una vez que ha pasado a través de al menos un canal (10) provisto en el sustrato (11), siendo el canal (10) adecuado para el paso de la molécula (20) a su través; - al menos una nanopartícula metálica (14) capaz de generar un campo electromagnético derivado de resonancia del plasmón; - medios para inducir el paso de una molécula (20) a través del canal (10); - medios para inducir resonancia del plasmón en la nanopartícula metálica (14); y - medios para detectar interacción entre el campo electromagnético derivado de resonancia del plasmón producido por la nanopartícula metálica (14) y una molécula (20) que pasa a través del canal (10), caracterizado por que: - el al menos un canal es un nanoporo (10) que tiene un diámetro de 0,5 nm a 100 nm; y - la al menos una nanopartícula metálica (14) está ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a dicho nanoporo (10) y dispuesta en una posición adecuada para que el campo electromagnético producido por la nanopartícula metálica (14) interactúe con una molécula (20) que pasa a través del nanoporo (10).

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Aparato y metodo para investigar moleculas por resonancia del plasmon superficial
La presente invencion se refiere a un aparato y a metodos para investigar moleculas, en particular moleculas biologicas tales como acidos nucleicos o protemas. El aparato y los metodos estan relacionados con la aplicacion de tecnolog^a a escala nanometrica a los problemas del analisis rapido y detallado de estas moleculas. En un aspecto, la presente invencion se refiere a un aparato y a un metodo de secuenciacion de acidos nucleicos.
La capacidad de secuenciar rapidamente acidos nucleicos sigue siendo de vital importancia en biologfa. Aunque ahora se conoce secuencia completa de muchos genomas (incluyendo la del genoma humano) y muchas mas se estan volviendo disponibles, sigue existiendo una necesidad de obtener datos de secuencia por muchas razones. Las actuales tecnoiogfas de secuenciacion se basan principalmente en la tecnica ("didesoxi") de Sanger y son laboriosas y lentas. Los metodos que implican la deteccion de la incorporacion de nucleotidos individuales por una polimerasa estan limitados intrmsecamente a la velocidad relativamente lenta a la que una polimerasa puede sintetizar una cadena de ADN complementaria. Actualmente, la maxima velocidad de secuenciacion para un unico dispositivo de secuenciacion es de aproximadamente 1 base/segundo; aunque una mejora respecto a las tecnicas de secuenciacion de Sanger convencionales, esto sigue siendo muy lento.
Se han propuesto metodos mediante los cuales el ADN es secuenciado detectando cambios de corriente a medida que el ADN pasa a traves de un poro conductor. Aunque dichos metodos tienen una velocidad de deteccion maxima teorica elevada, hasta la fecha se han conseguido velocidades de deteccion relativamente lentas y parece probable que sin modificacion exhaustiva del diseno global o el uso de etiquetas conductoras, el lfmite de deteccion seguira siendo bajo.
La nanotecnologfa, como la biologfa, es un area que se esta desarrollando rapidamente y conduce a nuevos enfoques y materiales para la manipulacion y el analisis de moleculas. Los nanotecnologos son capaces ahora de producir y manipular materiales hasta la escala subnanometrica. Esto proporciona el potencial para el desarrollo de dispositivos o tecnicas con un potencial nuevo y previamente no considerado. Sin embargo, aunque la nanotecnologfa ha resultado util, por ejemplo, en la industria electronica, aun no ha sido empleada ampliamente en el campo de la biologfa.
La resonancia del plasmon es un fenomeno mediante el cual plasmones sobre una superficie metalica son excitados por luz incidente sobre la superficie. La resonancia del plasmon se usa en una serie de maquinas analfticas convencionales, tales como Biacore®. Donde plasmones sobre una superficie plana son excitados, se usa la expresion resonancia del plasmon superficial (RPS), y donde una partfcula de tamano nanometrico es excitada, a menudo se usa la expresion resonancia del plasmon superficial localizada (RPSL) para diferenciar este aspecto del fenomeno. Cuando una partfcula metalica pequena es irradiada mediante luz, el campo electrico oscilante hace que los electrones de la partfcula oscilen de forma coherente. La oscilacion colectiva de estos electrones es llamada la resonancia del plasmon dipolar. La oscilacion colectiva en la nube electronica produce un campo electromagnetico (CEM) altamente localizado e intenso. Con el fin de producir estas oscilaciones colectivas, debe usarse la longitud de onda de excitacion correcta. Esta longitud de onda dependera tanto del tamano como de la forma de la partfcula o la nanoestructura metalica que es excitada.
El documento DE10361927 desvela un sensor biosensor de canal ionico que comprende un sustrato perforado intercalado entre dos depositos definidos por agrupaciones de microcanales. Cada una de dichas agrupaciones esta orientada de forma ortogonal unas con respecto a otras. Las perforaciones en el sustrato son normalmente de 5 a 50 micrometres de diametro. Tambien contienen una fraccion de canal ionico (membrana de proterna) que bloquea o permite el flujo de iones entre los dos depositos dependiendo de la presencia o ausencia de un nivel umbral de un producto qmmico que es detectado en el lado de entrada. La solucion contenida dentro del deposito de entrada es de mayor fuerza ionica que aquella en el deposito de salida, proporcionando de este modo la fuerza impulsora termodinamica necesaria para el transporte de iones. En una realizacion preferida, la solucion del deposito de entrada contiene iones de calcio que fluyen cuando el canal ionico esta abierto. Estos iones de calcio pueden ser capturados por un marcador en el deposito de salida y pueden transportarse a un detector independiente.
Se ha descubierto que, usando RPS altamente localizada, conseguible usando tecnicas nanotecnologicas, la estructura de moleculas biologicas puede investigarse a escala nanometrica.
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un aparato para investigar una molecula (20) que comprende:
- dos depositos separados entre sf por un sustrato (11), el primer deposito (19) adecuado para recibir una muestra que comprende la molecula (20) a investigar, y un segundo deposito (21) adecuado para que la molecula (20) pase al interior una vez que ha pasado a traves de al menos un canal (10) provisto en el sustrato (11), siendo el canal (10) adecuado para el paso de la molecula (20) a su traves;
- al menos una nanopartfcula metalica (14) capaz de generar un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
- medios para inducir el paso de una molecula (20) a traves del canal (10);
- medios para inducir resonancia del plasmon en la nanopartfcula metalica (14); y
- medios para detectar interaccion entre el campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon producido por la nanopartfcula metalica (14) y una molecula (20) que pasa a traves del canal (10), caracterizados por que:
- el al menos un canal es un nanoporo (10) que tiene un diametro de 0,5 nm a 100 nm; y
- la al menos una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a dicho nanoporo (10) y dispuesta en una posicion adecuada para que el campo electromagnetico producido por la nanopartfcula metalica (14) interactue con una molecula (20) que pasa a traves del nanoporo (10).
El aparato comprende dos depositos: un primer deposito adecuado para recibir una muestra que comprende la molecula a investigar, y un segundo deposito adecuado para que la molecula pase al interior una vez que ha pasado a traves del nanoporo.
Los dos depositos estan separados entre sf por el sustrato, y la molecula debe pasar a traves del al menos un nanoporo para pasar desde el primer deposito al interior del segundo deposito. De este modo, podna considerarse que el sustrato es una membrana o diafragma que separa los dos depositos.
Generalmente las dimensiones del nanoporo deben ser adecuadas para que una molecula a investigar pase a traves del nanoporo, y de modo que la molecula este obligada a pasar adecuadamente cerca de la nanopartfcula metalica de modo que se produzca una interaccion entre la molecula y el CEM localizado producido por la nanopartfcula metalica. El nanoporo generalmente debe tener tambien dimensiones adecuadas, de modo que solamente una molecula pueda pasar a traves del nanoporo cada vez.
Generalmente se prefiere que el nanoporo sea un orificio, aunque es posible que otras formas de canales tales como ranuras o surcos provistos en un sustrato tambien puedan ser adecuadas.
El nanoporo puede tener cualquier forma adecuada, aunque un nanoporo circular o aproximadamente circular esta previsto como el mas conveniente.
El nanoporo tiene un diametro de aproximadamente 0,5 nm a 100 nm preferentemente 50 nm o menos, especialmente 30 nm o menos. Aunque se usa el termino diametro, debe entenderse que esto no significa en un sentido geometrico estricto y puede aplicarse, por ejemplo, a la dimension mas pequena de un nanoporo no circular.
A menudo, orificios pequenos en un sustrato se denominan "poros", y este termino puede usarse en toda la memoria descriptiva y debe interpretarse en consecuencia.
Donde la molecula a investigar es un acido nucleico, el orificio mas pequeno a traves de cual pasara acido nucleico monocatenario es de aproximadamente 1 nm. Los acidos nucleicos bicatenarios pasaran a traves de un orificio de aproximadamente 2 nm o mayor [vease Heng J. B. et al. Biophysical Journal (2006), 90, 1098-1106].
Por consiguiente, donde un acido nucleico monocatenario es a investigar, es preferible que el nanoporo deba ser de 1 nm a 100 nm de diametro, preferentemente 1 nm a 30 nm, especialmente 1 a 10 nm, particularmente 1 a 5 nm. Para acidos nucleicos bicatenarios, el nanoporo debe ser de 2 nm a 100 nm de diametro, preferentemente de 2 nm a 30 nm, especialmente de 2 nm a 4 nm.
El nanoporo puede estar formado de cualquier sustancia adecuada. Puede ser organico o inorganico.
En una realizacion, el nanoporo puede estar formado a partir de un poro "organico", es decir un poro derivado de una estructura de origen natural, por ejemplo una protema que tiene un poro tal como a-hemolisina o el poro organico descubierto en la membrana externa de la mitocondria.
Como alternativa, el nanoporo podna proporcionarse mediante un gel usado convencionalmente para la manipulacion de acido nucleico u otras moleculas biologicas, tales como agarosa o poliacrilamida.
Como alternativa, el nanoporo podna estar disenado en un sustrato tal como una pelfcula formada a partir de nitruro de silicio u otro material de ese tipo. Vease, por ejemplo, Ho C. et al., PNAS (2005), 102(30) 10445-10450 que describe metodos de formacion de poros de diametro nanometrico a partir de nitruro de silicio.
El nanoporo tambien podna estar formado a partir de un material nanoporoso tal como oro poroso, un cristal coloidal, cavidades coloidales, toroides metalicos etc. Netti et al., describen la formacion de nanocavidades de oro y su capacidad para formar plasmones superficiales [vease Netti M.C. et al. Advanced Materials (2001), 13(18), 13681370]. Aizpurua O. et al., describen la formacion de nanoanillos de oro [vease Aizpurua et al. Physical Review Letters (2003), 90(5), 057401-1-057401-4].
Lesuffleur et al., describen agrupaciones de nanoporos de oro con resonancia del plasmon mejorada [Lesuffleur A. et al, Applied Physics Letter (2007), 90, 243110]. Donde el propio nanoporo esta formado a partir de una sustancia
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
metalica capaz de mostrar RPSL, entonces sera evidente que puede no requerirse una nanopartfcula metalica independiente.
Los medios para ingeniena nanometrica para producir diversas estructuras adecuadas para la presente invencion son bien conocidos, pero este es tambien un campo de tecnolog^a que se desarrolla rapidamente. Por lo tanto, se espera que novedosas tecnologfas y materiales adecuados para formar nanoporos en un sustrato segun lo requiere la presente invencion se desarrollaran en el futuro; dichas tecnologfas estan dentro del alcance de la presente invencion.
Generalmente se prefiere que el aparato comprenda una pluralidad de nanoporos que pasan a traves del sustrato. Los nanoporos podnan estar dispuestos en una agrupacion donde la posicion de cada nanoporo esta controlada; esto es particularmente conveniente donde se usa ingeniena nanometrica para formar nanoporos en un sustrato. Como alternativa, los nanoporos podnan estar dispersos por el sustrato sin control sobre su posicion.
La nanopartfcula metalica debe ser capaz de formar plasmones superficiales y, de este modo, formar un CEM localizado en las inmediaciones de la nanopartfcula. Cualquier material que es adecuado para conseguir esta funcion es adecuado para uso en la nanopartfcula metalica. Se ha descubierto que los metales oro, plata, cobre y aluminio tienen propiedades deseables en terminos de formacion y propagacion de plasmon y, por lo tanto, generalmente se prefiere que la nanopartfcula metalica este formada principal o completamente a partir de uno o mas de estos metales.
La nanotecnologfa permite la formacion de partfculas de oro o plata en esencialmente cualquier forma. La forma puede tener un efecto sustancial sobre el CEM producido por una partfcula [vease Mock J. J. et al., Journal of Chemical Physics, 116(15), 6755-6759].
Una partfcula esferica o sustancialmente esferica (por ejemplo, una esfera o esferoide) tiene propiedades adecuadas y, por lo tanto, forma una realizacion adecuada de la nanopartfcula metalica. Se ha descubierto que las partfculas metalicas esfericas que tienen un diametro de 50 nm a 150 nm de diametro son especialmente adecuadas debido a niveles elevados de intensificacion de fluorescencia [vease Nakamura y Hayashi, Japanese Journal of Applied Physics, 44(9A), 6833-6837].
En una realizacion alternativa, puede usarse una nanopartfcula metalica anular. Dicha nanopartfcula anular presenta ciertos beneficios; se ha demostrado que el CEM dentro de un anillo es intenso y es relativamente constante por toda el area interna definida por el anillo [vease Aizpurua et al., ibidem]. Donde la nanopartfcula metalica es un anillo, sera obvio que el anillo podna, a su vez, formar la nanopartfcula a traves de la cual pasara la molecula. Metodos de fabricacion de dichos nanoanillos se exponen en Aizpurua et al.
Otras formas tales como prismas poligonales u otras formas de multiples lados tambien pueden ser adecuadas.
En aras de la claridad, se senala que puede haber mas de una nanopartfcula metalica asociada con un nanoporo particular, y puede usarse mas de un tipo de metal. De hecho, puede ser deseable usar dos o mas materiales metalicos de modo que una region de maximo CEM se produzca como resultado de combinacion de los CEM separables de cada nanopartfcula. Esto puede dar origen a valores de CEM extremadamente altos en areas altamente localizadas.
Es generalmente importante que la nanopartfcula metalica este dispuesta en una posicion tal que interactuara con una molecula que pasa a traves del nanoporo, pero este separada suficientemente del nanoporo para impedir o mitigar la extincion de una senal emitida desde la molecula. Esto puede conseguirse de una serie de maneras. El nanoporo puede estar conformado y dimensionado de modo que una molecula que pasa a traves de el este constrenida en una posicion tal que no se acerque demasiado (evitando de este modo la extincion), o se aleje demasiado (garantizando de este modo la interaccion) de la nanopartfcula metalica - esto es especialmente adecuado cuando el propio nanoporo no tiene actividad de extincion. Como alternativa, pueden usarse medios de control para guiar la molecula, de modo que no se acerque demasiado a la nanopartfcula metalica.
Normalmente, la superficie de la nanopartfcula metalica debe estar posicionada para estar a 50 nm o menos de la molecula a medida que pasa a traves del nanoporo, preferentemente 30 nm o menos, especialmente 10 nm o menos.
Los medios para inducir el paso de una molecula a traves del nanoporo pueden ser uno o mas de medios para inducir electroforesis, un dispositivo microflmdico o un dispositivo de captura con laser. Sin embargo, tambien pueden ser adecuados cualesquiera otros medios adecuados para inducir que la molecula se mueva hasta y/o a traves del nanoporo.
El aparato puede comprender medios de control para controlar el paso de la molecula hacia, al interior y/o a traves del nanoporo. Los medios de control pueden estar adaptados para controlar uno o mas de la velocidad, la direccion, la posicion o la conformacion de la molecula.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El tipo de medios de control variara dependiendo del tipo de molecula a investigar y el tipo de control requerido. Donde se requiere secuenciacion de acido nucleico, es importante que la velocidad de paso de la molecula de acido nucleico lineal a traves del nanoporo este controlada. Para secuenciacion, tambien es deseable que la molecula de acido nucleico se mantenga en una conformacion lineal.
En una realizacion, los medios de control pueden comprender una matriz porosa a traves de la cual pasa la molecula, estando la matriz porosa inmediatamente adyacente a la entrada al nanoporo. Donde se usa una matriz porosa, es conveniente que se induzca el paso de la molecula a traves de la matriz mediante electroforesis. Las propiedades de la matriz porosa en combinacion con las condiciones de electroforesis sirven para permitir el control fino del movimiento de la molecula (por ejemplo, acido nucleico) a traves de la matriz y al interior del nanoporo. El control preciso de la velocidad de movimiento de un acido nucleico a traves de un gel puede conseguirse. Una ventaja adicional de la electroforesis a traves de una matriz porosa es que la conformacion de una molecula lineal es estirada a una forma lineal alargada a partir de la cual es particularmente adecuada para secuenciacion. Una matriz porosa adecuada puede estar formada a partir de materiales convencionales usados para manipular acido nucleicos y protemas, tales como poliacrilamida o agarosa. Como alternativa, otros materiales nanoporosos tambien pueden ser adecuados.
Los medios de control descritos anteriormente son muy adecuados para el control de acidos nucleicos y otras moleculas lineales. Otras moleculas pueden requerir un nivel de control diferente, o el grado de control puede ser mayor o menor.
Debe observarse que los medios para inducir el paso de una molecula a traves del nanoporo y los medios de control pueden proporcionarse mediante los mismos medios. Por ejemplo electroforesis en un medio lfquido en solitario puede ser adecuada para controlar moleculas donde no se requiere el control preciso de la conformacion y la velocidad. Como alternativa, puede usarse captura con laser para controlar de forma precisa el movimiento de una molecula hacia y al interior del nanoporo.
Los medios para detectar interaccion de la nanopartfcula metalica y la molecula pueden ser, por supuesto, cualquier dispositivo adecuado que pueda detectar la interaccion entre el CEM localizado derivado de resonancia del plasmon producido por la nanopartfcula y la molecula muy proxima a ella. Los medios adecuados pueden incluir medios para detectar fluorescencia o medios para detectar dispersion Raman.
Los medios adecuados para detectar fluorescencia incluyen cualquier dispositivo que sea suficientemente sensible para detectar fotones emitidos desde un fluoroforo que pasa a traves de la region del CEM. Los dispositivos adecuados incluyen un fotomultiplicador o un fotodiodo de avalancha. La fluorescencia es adecuada para detectar moleculas inherentemente fluorescentes o moleculas que han sido etiquetadas con un fluoroforo.
Los medios adecuados para detectar dispersion Raman incluyen un espectrometro Raman.
Para detectar moleculas no etiquetadas y no fluorescentes puede usarse dispersion Raman. Tecnicas para detectar dispersion Raman son bien conocidas en la materia. La deteccion usando dispersion Raman en la presente invencion se basa en el fenomeno de espectroscopfa Raman intensificada por superficie [vease para antecedentes Jeanmaire, David L.; Richard P. van Duyne (1977). "Surface Raman Electrochemistry Part I. Heterocyclic, Aromatic and Aliphatic Amines Adsorbed on the Anodized Silver Electrode". Journal of Electroanalytical Chemistry 84: 1-20.]
En muchas realizaciones puede preferirse que se use un metodo de deteccion que no dependa del etiquetado de la molecula. Esto simplifica la preparacion de la muestra a investigar, y tampoco requiere la presencia de una etiqueta que pueda interferir en el paso de la molecula a traves del canal.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para investigar una molecula (20) que comprende las etapas de:
- proporcionar una muestra de fluido que comprende una molecula (20) a investigar, en la que la molecula (20) es opcionalmente una molecula biologica (20) y opcionalmente un acido nucleico;
- inducir el paso de dicha molecula (20) a traves de un nanoporo (10) provisto en un sustrato (11), teniendo el nanoporo (10) un diametro de 0,5 nm a 100 nm, en el que una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a la abertura de un nanoporo (10) y se le induce la generacion de un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon; y
- detectar interaccion entre el campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon producido por la nanopartfcula metalica (14) y la molecula (20) a medida que pasa a traves del nanoporo (10).
Preferentemente, la molecula es una molecula biologica, por ejemplo un acido nucleico o una protema/peptido. Moleculas lineales tales como acidos nucleicos o protemas/peptidos lineales son particularmente adecuadas para investigacion usando el presente metodo. Los acidos nucleicos monocatenarios son especialmente adecuados para investigacion usando el presente metodo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En una realizacion preferida, el metodo es un metodo de secuenciacion de un acido nucleico.
Sin embargo, el metodo tambien puede usarse para investigacion de otras clases de moleculas, y no es necesario usarlo para secuenciacion. El uso del metodo para contar moleculas individuales en una muestra, y el mapeo de etiquetadores en moleculas lineales estan previstos entre otros usos potenciales.
Puede preferirse, aunque no es esencial, que la molecula comprenda una etiqueta que interactua con la nanopartfcula metalica. Por consiguiente, el metodo puede comprender, ademas, la etapa de etiquetar la molecula con una etiqueta que interactuara con dicha nanopartfcula metalica.
Las etiquetas adecuadas incluyen fluoroforos. Los fluoroforos son muy conocidos en la tecnica en relacion con el etiquetado fluorescente de todo tipo de moleculas biologicas. En la presente invencion, es importante que el fluoroforo sea suficientemente pequeno para que no inhiba el paso de la molecula etiquetada a traves del canal. Normalmente, el fluoroforo tendra un tamano efectivo de 2 nm o menos, y preferentemente una molecula colorante que mida menos de 1 nm en cualquier dimension.
Los ejemplos de fluoroforos adecuados incluyen Rosa de Bengala, Alexa Fluor 488 C5-maleimida, Alexa Fluor 532 C2-maleimida y Rojo Rodamina C2-meleimida, y Verde Rodamina. Estos fluoroforos pueden usarse, cada uno, para etiquetar las bases de acidos nucleicos usando tecnicas conocidas en la tecnica.
Adecuadamente, la molecula es un acido nucleico en el que una proporcion sustancial o toda de una base particular ha sido etiquetada. En una realizacion preferida, una proporcion sustancial o toda de una o mas bases en la molecula estan etiquetadas, teniendo cada tipo de base una etiqueta con un espectro de emision identificable individualmente. En una realizacion especialmente preferida todas, o sustancialmente todas, las bases estan etiquetadas, teniendo cada tipo de base una etiqueta con un espectro de emision identificable individualmente. El etiquetado de alta densidad de acido nucleico se describe en Tasara et al., Nucleic Acids Research, 2003, 31(10), 2636-2646.
Es importante que un fluoroforo seleccionado como una etiqueta sea capaz de interactuar con el CEM producido por la nanopartfcula metalica. Es un asunto rutinario hacer coincidir un fluoroforo con una nanopartfcula metalica de propiedades particulares. En general, para buena interaccion entre la nanopartfcula metalica y el fluoroforo, se prefiere que el fluoroforo tenga un pico de emision a una energfa ligeramente inferior que el pico de resonancia del plasmon superficial localizada de la nanopartfcula metalica, es decir el pico de emision del fluoroforo esta ligeramente desplazado hacia el rojo desde el pico de RPSL. Son adecuados desplazamientos hacia el rojo de aproximadamente 20 a 150 meV, preferentemente de aproximadamente 40 a 120 meV [vease Chen et al., Nano Letters (2007), 7(3), 690-696].
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un sustrato (11) adecuado para uso en un aparato para investigar una molecula (20) que comprende:
- al menos un canal (10) provisto en el sustrato (11), el canal (10) adecuado para el paso de una molecula (20) a su traves; y
- al menos una nanopartfcula metalica (14) capaz de generar un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon,
caracterizado por que:
- el al menos un canal es un nanoporo (10) que tiene un diametro de 0,5 nm a 100 nm; y
- la al menos una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a dicho nanoporo (10) para estar a 50 nm o menos de la molecula (20) a medida que pasa a traves del nanoporo (10) y dispuesta en una posicion tal que el campo electromagnetico producido por la nanopartfcula metalica (14) es capaz de interactuar con una molecula (20) que pasa a su traves.
Detalles adicionales de sustratos preferidos se han expuesto anteriormente.
A continuacion se describiran realizaciones de la invencion, a modo de ejemplos no limitantes, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra un poro y electrodo adecuados para uso en la presente invencion;
La figura 2 muestra un sustrato que comprende poros y electrodos;
La figura 3 muestra una representacion esquematica de aspectos de un aparato de acuerdo con la presente invencion;
La figura 4 muestra una representacion esquematica de una realizacion de un aparato de acuerdo con la presente invencion; y
Las figuras 5 a 7 muestran representaciones esquematicas de estructuras alternativas del sustrato.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Antecedentes
Cuando una partfcula metalica esferica pequena es irradiada con luz, el campo electrico oscilante hace que los electrones de la partfcula oscilen de forma coherente. La oscilacion colectiva de estos electrones es llamada la resonancia del plasmon dipolar. La oscilacion colectiva en la nube electronica produce un campo electromagnetico altamente localizado e intenso (CEM). Con el fin de producir estas oscilaciones colectivas, debe usarse la correcta longitud de onda de excitacion. Esta longitud de onda dependera tanto del tamano como de la forma de la partfcula metalica que es excitada. La longitud de onda correcta para una partfcula particular puede determinarse facilmente experimentalmente o, para ciertas formas, puede predecirse usando tecnicas de modelizacion conocidas.
Se ha demostrado en [1] que el CEM producido por la resonancia del plasmon de coloides metalicos tales como nanopartfculas de oro o plata puede usarse para excitar etiquetas fluorescentes usadas comunmente tales como Cy5 y Rosa de Bengala, entre otras. Estos experimentos implicaban colocar nanopartfculas de oro o plata sobre una superficie y situar los fluoroforos de modo que se beneficien del CEM intensificado. Esto da como resultado lo que se denomina fluorescencia intensificada por un metal (FIM).
Cuando un fluoroforo se coloca cerca de una partfcula metalica que muestra resonancia del plasmon, el fluoroforo se beneficia tanto del CEM localizado como de un fenomeno peor entendido en el que el tiempo de vida fluorescente se reduce. Un fenomeno similar se produce cuando se examina la dispersion Raman de una molecula. Donde la molecula esta en estrecha proximidad a una partfcula metalica que muestra resonancia del plasmon superficial localizada, se observa un incremento drastico del nivel de dispersion Raman.
Dado que la emision de fotones maxima de un fluoroforo se determina mediante su rendimiento cuantico y tiempo de vida fluorescente, un tiempo de vida fluorescente mas corto da como resultado una emision de fotones mas elevada. Un fluoroforo que tiene un 90 % de rendimiento cuantico y un tiempo de vida fluorescente de 2,5 ns podna emitir un maximo de 360 millones de fotones/s. En realidad, los colorantes fluorescentes pueden emitir varios millones de fotones antes del deterioro.
Induciendo un CEM intensificado altamente localizado, tal como se ha demostrado usando agrupaciones coloidales de oro y plata, [1, 2] asf como en nanocristales coloidales [3], nanocavidades cristalinas fotonicas [4], nanoanillos metalicos [5] y pelfculas metalicas finas porosas [6] y posicionar un fluoroforo de modo que se beneficiara de esto, puede inducirse FIM y el fluoroforo detectarse, o como alternativa detectarse dispersion Raman.
Si un dispositivo esta fabricado de modo que exista una region en el espacio donde solamente un fluoroforo pueda beneficiarse de FIM en un momento dado, la posicion de ese fluoroforo puede ser conocida. Mediante la disposicion de una estructura plasmonica (por ejemplo una fraccion metalica) alrededor de o adyacente a un orificio (poro), una partfcula fluorescente puede orientarse de modo que pase a traves de un area de maxima intensificacion fluorescente (MaxIF). Los poros adecuados incluyen: geles (usados comunmente para confinar polinucleotidos), poros organicos tales como a-hemolisina, poros en estado solido tales como los que pueden realizarse en nitruro de silicio, materiales nanoporosos tales como oro poroso, cristales coloidales, cavidades coloidales, toroides metalicos, o cualquier otro poro de menos de 10 nm de diametro y preferentemente menos de 5 nm de diametro, especialmente entre 1,5 y 2,5 nm.
Dado lo siguiente:
- el CEM entre dos superficies con resonancia del plasmon se incrementa cuando la distancia entre ellas se reduce,
- que la proximidad a una superficie con resonancia del plasmon tambien reduce el tiempo de vida fluorescente del fluoroforo,
- que las distancias entre estas superficies pueden hacerse de menos de 5 nm,
- y que los coloides, pelfculas finas porosas, agrupaciones de cristal en 2D, y otras nanoestructuras pueden hacerse de menos de 2 nm de tamano,
es razonable asumir que puede hacerse que la emision de fotones maxima se produzca en una region extremadamente pequena.
De una manera similar, propiedades particulares de una molecula, o regiones dentro de una molecula, pueden identificarse mediante patrones caractensticos de dispersion Raman. Esto, como con la identificacion de la ubicacion de un fluoroforo particular, la posicion de una caractenstica particular que tiene un espectro Raman identificable puede identificarse por su proximidad a la estructura plasmonica.
Si se induce el paso de un ion a traves de un poro por medio de, por ejemplo microflmdca o electroforesis, se le puede hacer pasar a traves de esta area de MaxIF, de modo que la deteccion de un unico conjugado ion-fluoroforo, o una region que tiene un espectro Raman particular pueda detectarse.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Induciendo el paso de un ion cargado etiquetado de forma fluorescente, tal como una protema, a traves de un nanoporo de modo que solamente un ion pueda desplazarse a traves del poro cada vez, la cuantificacion de esos iones sena posible de la siguiente manera:
- Dados dos conjugados partfcula/ion fluorescentes identicos, a medida que el primero pasa a traves del poro y entra en el CEM confinado, el fluoroforo comenzara a emitir fotones. A medida que el fluoroforo se acerca mas a la region de MaxIF, un numero creciente de fluoroforos son emitidos. Dado que la emision de fotones esta directamente relacionada con la intensidad del CEM, que a su vez se incrementa exponencialmente a medida que la distancia hasta la region de MaxIF se reduce, la emision de fotones tambien se incrementara exponencialmente, produciendo un pico de emision de fotones en la region de MaxIF y disminuyendo a medida que el conjugado se aleja del area de MaxIF. La segunda partfcula fluorescente identica producira el mismo patron de emision de fotones. Mientras que la emision de fotones maxima se produzca en una region discreta con un grosor menor que la distancia entre los dos conjugados fluoroforo/ion, la fluorescencia producida por estos dos fluoroforos puede diferenciarse.
- Si los dos conjugados estan separados tan estrechamente entre sf (menos de 0,5 nm) que la deteccion individual sena diffcil, la presencia de mas de un fluoroforo en el area de MaxIF podna determinarse mediante emision de fotones. Dos fluoroforos identicos expuestos a intensidades de CEM iguales deben emitir aproximadamente dos veces tantos foton/es que un unico fluoroforo. Dado que una region de MaxIF puede contener dos, tres o mas conjugados, si la velocidad a la que se desplazan a traves del CEM es conocida, la cuantificacion del numero de conjugados que pasan a traves del CEM puede conseguirse.
Creando dos camaras separadas por una barrera que garantiza que los iones solamente podnan pasar de un lado al otro mediante un poro, los iones cuya migracion puede ser inducida podnan cuantificarse independientemente de si la region de MaxIF puede contener dos, tres o mas conjugados siempre que ese numero haya sido determinado.
Etiquetado de acidos nucleicos
Etiquetas fluorescentes se incorporan comunmente en los ADN y ARN con polinucleotidos tanto monocatenarios (mc) como bicatenarios (bc). Existen muchos metodos bien establecidos para incorporar etiquetas fluorescentes en ADN y mediante la eleccion cuidadosa tanto de ADN polimerasa como de nucleotido modificado de forma fluorescente, Se ha mostrado [7] que es posible etiquetar de forma fluorescente todas de una o mas de las cuatro bases (CGTA). Se sabe que las distancias entre nucleotidos en ADNbc y ARNbc son de 0,34 nm, mientras que el ADNmc y ARNmc, los polfmeros pueden estar en conformacion lineal, permitiendo que la maxima separacion espacial sea mayor-aunque la distancia exacta vana entre 0,5 y 1 nm dependiendo de la fuerza de estiramiento impuesta [8].
El proceso de secuenciacion
Es conocido que el control preciso de la velocidad a la cual una cadena individual de ADN pasa a traves de un poro organico tal como a-hemolisina [10] o un poro en estado solido en nitruro de silicio puede conseguirse [8, 9]. Etiquetando un polinucleotido, de modo que todas de una o mas de sus bases estan etiquetadas de forma fluorescente e induciendo el paso de ese polinucleotido mediante microflmdica, electroforesis o algunos otros medios a traves de un CEM a una velocidad conocida, de modo que los nucleotidos pasen a traves de una region de MaxIF capaz de contener al menos un nucleotido etiquetado de forma fluorescente, la posicion de los nucleotidos etiquetados a lo largo del fragmento de ADN puede determinarse.
Una secuencia de polinucleotidos completa podna ensamblarse de la siguiente manera:
Suponiendo que toda de una base sera etiquetada de una vez, pueden realizarse cuatro reacciones de PCR en las que en cada una, todas las bases de nucleotidos C, T, G o A estan etiquetadas de forma fluorescente. Las cadenas se desnaturalizan a continuacion formando ADNmc o ARNmc. A continuacion, se induce el paso de cada cadena a traves de un nanoporo a una velocidad conocida y a traves de un area de MaxIF capaz de contener un numero conocido de nucleotidos. A medida que los nucleotidos etiquetados pasan a traves del CEM, sus posiciones pueden determinarse con respecto a los otros nucleotidos etiquetados - proporcionando un mapa de distancia para cada uno de los cuatro polinucleotidos identicos pero etiquetados de forma diferente. Estos cuatro mapas de distancia pueden ensamblarse a continuacion facilmente en una secuencia de polinucleotidos completa.
Secuenciacion del genoma completo:
Con el fin de secuenciar un genoma usando este metodo, cebadores aleatorios etiquetados de forma fluorescente, tales como estan disponibles para amplificacion del genoma completo, podnan usarse. La secuencia de estos cebadores se conocena y la etiqueta fluorescente podna servir para indicar la orientacion 5' o 3' del fragmento de ADN a medida que pasa a traves del poro. El cebador etiquetado tambien servina como un punto de referencia inicial a partir del cual podna relacionarse el mapa de distancia de los nucleotidos etiquetados. Preferentemente, todas o mas de una de las cuatro bases estanan etiquetadas de forma fluorescente y se usanan etiquetas fluorescentes con diferentes espectros de emision para diferenciar estas bases. Mas de un espectro de etiqueta
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
fluorescente tambien podna usarse para etiquetar todas de un tipo de base, siempre que las etiquetas tuvieran distintos espectros de emision maxima.
A continuacion se podna inducir el paso de estos fragmented de ADN a traves del poro tal como se ha descrito anteriormente a una velocidad determinada por la emision de fotones. Usando el colorante Cy5, las velocidades de emision de fotones para FIM de entre 3 y 9 millones de fotones/s se han obtenido [1]. Esto podna permitir que el ADN pase a traves a una velocidad de ligeramente menos de un millon de bases de nucleotido por segundo por nanoestructura. Una agrupacion de nanoestructuras permitina que esta velocidad se multiplique por el tamano de la agrupacion. Dado que estos cebadores son aleatorios y la posicion del mapa de distancias para los fragmentos de ADN dentro del genoma no se conoce, se requerina software de ensamblaje del genoma completo, tal como se usa para secuenciacion aleatoria completa para un alineamiento y ensamblaje precisos.
Ventajas de la presente invencion
La presente invencion proporciona diversas ventajas respecto a otros metodos de secuencia de ADN asf como otros metodos de deteccion de moleculas individuales:
• La invencion permite deteccion de moleculas individuales intensificada.
• La invencion puede usarse para determinar la posicion y la velocidad de moleculas individuales.
• Aunque puede usarse PCR para etiquetar de forma fluorescente moleculas individuales, el presente aparato y metodo no dependen de reacciones qmmicas o enzimaticas.
• El aparato puede estar dispuesto de forma ordenada, de modo que decenas, cientos, miles o millones de estas nanoestructuras puedan estar funcionando al mismo tiempo.
• La secuenciacion de ADN usando el metodo perfilado anteriormente sena extremadamente rapida. El coste de la secuenciacion usando este metodo estana limitado al coste de no mas de cuatro reactivos de PCR tales como etiquetas fluorescentes, nucleotidos, polimerasas y otros consumibles secundarios.
Metodos de construccion
El meollo de la invencion se basa en la induccion del paso de una molecula individual a traves de un CEM altamente localizado de manera controlada y la deteccion de la interaccion entre la molecula y el CEM. Existen muchos metodos bien investigados para controlar tanto protemas como polinucleotidos que incluyen geles, poros organicos, poros en estado solido, fijacion a perlas, e inmovilizacion sobre una superficie. Esto permite que se construya una amplia gama de dispositivos que podnan controlar una molecula individual, tal como una protema o un fragmento de ADN de modo que se le pueda hacer pasar a traves de un CEM altamente localizado.
La presente invencion permite que se use cualquier superficie, siempre que la resonancia del plasmon inducida por un CEM incidente induzca FIM en una molecula individual etiquetada de forma fluorescente o ERIS, y se pueda inducir el paso de esa molecula individual a traves de un area de MaxIF.
La presente invencion permite cualquier medio de induccion del paso de una molecula individual a traves de una region de MaxIF incluyendo microflmdica, electroforesis, o captura con laser.
Donde la fluorescencia es el metodo de deteccion seleccionado, la presente invencion permite que se use cualquier etiqueta fluorescente que emita fluorescencia a la frecuencia de resonancia del plasmon maxima de la superficie que esta siendo usada.
Idealmente, la etiqueta fluorescente tendra un elevado rendimiento cuantico, bajo tiempo de vida fluorescente, bajo peso molecular, y sera incorporada facilmente por una polimerasa. Preferentemente, los propios nucleotidos son intnnsecamente fluorescentes.
La ERIS tiene la ventaja de que no se requiere ningun etiquetado, sino en su lugar el espectro Raman espedfico de caractensticas de la molecula a identificar debe ser conocido.
Estas caractensticas permiten que la invencion se disene de al menos tres maneras generales, teniendo cada una de las cuales ventajas distintas:
- El uso de un poro "organico" para controlar una molecula individual permite que nanopartteulas de oro se unan covalentemente al propio poro o a los lfpidos circundantes. Como alternativa, el poro organico puede colocarse dentro de un nanoporo en estado solido mas grande tal como puede hacerse en nitruro de silicio, y la estructura plasmonica (por ejemplo fraccion metalica) situarse de modo que FIM o ERIS se optimice para esas moleculas o partes de moleculas dentro del poro organico. Como alternativa, un poro organico podna colocarse dentro de una estructura plasmonica tal como una nanocavidad fotonica (vease las figuras 5 and 6). Las ventajas de este metodo incluyen el comportamiento bien caracterizado de moleculas individuales cuyo paso a traves de dicho poro se indujo, el pequeno y altamente reproducible diametro de poro que permite un poro organico, y el bajo
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
coste de producir dichos poros organicos.
- El uso de un nanoporo en estado solido permite el control sobre el diametro de poro y nanoposicionar estructuras plasmonicas de modo que FIM o ERIS se optimice. Idealmente, la emision de fotones puede controlarse adicionalmente por medio de una gma de ondas. Esto permitina una deteccion de fotones mas eficiente y velocidades de deteccion mas elevadas.
- Un tercer metodo de construccion general es para permitir una distribucion aleatoria de CEM altamente localizados, de modo que la intensidad del campo en cualquier punto dado sobre una superficie porosa no se conozca y para permitir que la molecula individual pase a traves de esta superficie a una velocidad controlada pero una ubicacion incontrolada (figura 7). Esto tiene una tremenda ventaja respecto a los otros dos metodos ya que ni la ubicacion ni la distribucion de los CEM o las moleculas individuales estan controladas de forma precisa, la facilidad con la que dicho dispositivo puede estar construido es correspondientemente mayor. Un metodo que controla la velocidad de las moleculas individuales en la interseccion de un poro de 20 nm y una superficie que contiene CEM distribuidos aleatoriamente se describe a continuacion. Este metodo tiene la ventaja de que es intnnsecamente multiplexado. Incluso si la fluorescencia producida por una molecula individual que pasa a traves de un CEM es tal que solamente una molecula puede ser detectada por segundo, el dispositivo puede multiplexarse de modo que varios cientos o miles o millones de poros esten en funcionamiento al mismo tiempo.
Metodo para la construccion de un aparato de acuerdo con la presente invencion y realizar la secuenciacion
Un aparato de acuerdo con la presente invencion comprende lo siguiente:
- Un primer deposito 19 capaz de alojar varios |il de solucion y que contiene un electrodo 26 embebido en su superficie inferior;
- Una capa de silicio (sustrato) 11 con una agrupacion de nanoporos 10, que tienen 20 nm de diametro y que estan separados 1 |im grabados en su superficie. Los electrodos 12 estan embebidos en la capa de silicio 11, de modo que cada poro 10 de 20 nm de diametro contiene un electrodo 12, y cada electrodo 12 esta conectado a un suministro de tension con una elevada tasa de oblicuidad (no mostrado);
- Una membrana porosa 22, sobre la cual se depositan una agrupacion regular de nanopartfculas de oro 14, esta unida a la capa de silicio. Las nanopartfculas de oro 14 son de tamano y geometna conocidas, y cuando se excitan a la frecuencia apropiada, producen un CEM;
- Un gel 24 tal como agarosa o poliacrilamida se aplica a la membrana 22 que tiene un tamano de poro promedio de modo que, cuando se induce la migracion de ADNmc 20 a traves del gel 22, este adoptara una conformacion aproximadamente lineal. Esto forma los medios de control en la presente realizacion de la invencion;
- Un segundo deposito 21 esta provisto sobre el otro lado del sustrato 22 en el que una molecula pasara despues de haberse desplazado a traves del poro;
- Una agrupacion of moduladores de tension (no mostrados) con una elevada tasa de oblicuidad estan unidos a un detector de fotones sensibles tales como un fotodiodo de avalancha (no mostrados);
- Se proporciona un detector de fotones tal como un fotodiodo de avalancha (no mostrado);
- Se proporciona un medio de controlar una agrupacion de fuentes de tension basado en la entrada desde un detector de fotones (no mostrado);
- Se proporciona un laser de una frecuencia capaz de inducir resonancia del plasmon en los coloides metalicos de tamano y geometna conocidas (no mostrado).
Metodo de funcionamiento para realizar la secuenciacion:
El ADN esta etiquetado mediante PCR tal como se ha descrito anteriormente, de modo que todas de las dos bases (C y A o G y T) en una cadena dada de ADNmc estan etiquetadas de forma fluorescente con etiquetas fluorescentes que tienen una emision maxima cerca, pero preferentemente desplazada hacia el rojo en relacion con la frecuencia con resonancia del plasmon de los coloides metalicos 14 que se estan usando.
El ADNmc etiquetado se coloca a continuacion en el primer deposito 19. La membrana 22 revestida con un gel nanoporoso 24 y que contiene una distribucion aproximadamente uniforme de nanopartfculas de oro 14, de modo que la separacion entre ellas vane aleatoriamente entre 1 nm y 100 nm se coloque por encima del primer deposito 19. La capa de silicio 11 se coloca a continuacion sobre la membrana 22 y todo el conjunto puede sumergirse en una solucion conductora. Una carga positiva es administrada a continuacion a los electrodos 12 dentro de los poros de 20 nm 10, de modo que se inducira la migracion del ADNmc 20 a traves del segundo deposito 21 al interior del gel 24, paso a traves del gel 24 en conformacion lineal y paso de la agrupacion de nanopartfculas de oro 14 que emiten fotones a medida que pasan a traves del CEM producido por la resonancia del plasmon. Dado que los cebadores aleatorios etiquetados de forma fluorescente se usaron en la reaccion de PCR, la primera emision de fotones se producira por el cebador 5' o 3'. La emision de fotones obtenida a partir del cebador indicara inmediatamente la velocidad a la que se puede inducir la migracion del fragmento de ADNmc 20 a traves del CEM y seguir obteniendose una senal clara. Dado que la situacion del ADNmc 20 con respecto a las esferas de oro 14 sera diferente dentro de cada uno de los poros de 20 nm 10 para cada fragmento de ADNmc 20, habra una tension optima que puede aplicarse a cada poro 10 en cualquier momento dato. Tal como se ha perfilado anteriormente, un mapa de distancia que contiene las distancias relativas entre sf y con respecto a los cebadores conocidos puede crearse a partir de la emision de fotones data. Estos datos pueden ensamblarse en una secuencia del genoma
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
completo.
Metodos adicionales para la preparacion de un sustrato y realizar la secuenciacion
Existen muchas maneras en las que un sustrato adecuado puede producirse usando tecnicas nanotecnologicas. Lo siguiente describe dos posibles maneras y la manera en la que se realizara un protocolo de secuenciacion.
Ejemplo 1 - Poro organico en una nanocavidad plasmonica (Tal como se ilustra en las figuras 5 y 6)
1) Una agrupacion de estructuras plasmonicas tales como nanocavidades fotonicas 30 estan construidas de un material adecuado 32 tal como se describe en [4], teniendo las nanocavidades un diametro interno de 8 a 10 nm como en la figura 5, o teniendo un diametro interno de 4 a 5 nm como en la figura 6.
2) Un poro organico 34 tal como a-hemolisina se posiciona a continuacion dentro de estas estructuras plasmonicas mediante medios sugeridos en [13] de modo que los poros organicos 34 esten separados aproximadamente 1 |im.
3) La longitud de onda de resonancia del plasmon de estas nanocavidades 30 se determina a continuacion de forma precisa y espectros laser y de colorante fluorescente se seleccionan para corresponder con la resonancia del plasmon definida. Los espectros de colorante fluorescente deben estar ligeramente desplazados hacia el rojo (20 a 150 meV) desde el pico de resonancia del plasmon.
4) Se lleva a cabo transporte electrolftico a traves del nanoporo organico 34 tal como se describe en [10].
5) La emision de fotones desde las etiquetas fluorescentes se detecta usando un sistema de deteccion de fotodiodo de avalancha bien conocido en la tecnica.
6) Despues de extraer ADN a partir de una fuente genetica seleccionada, el ADNmc se etiqueta de forma fluorescente usando PCR y cebadores aleatorios tales como se usan en amplificacion del genoma completo. De los cuatro nucleotidos presentes en la reaccion de PCR, uno estara presente solamente en su forma modificada por colorante, garantizando un etiquetado fluorescente de alta densidad del nucleotido seleccionado. Con el fin de garantizar un etiquetado de alta densidad con longitudes de lectura largas, se puede tener que ensayar varios colorantes fluorescentes con diversas polimerasas tal como se describe en [7].
7) Esta reaccion de PCR se lleva a cabo a continuacion para los tres nucleotidos restantes, de modo que se habran llevado a cabo cuatro reacciones de PCR, dando como resultado cuatro muestras que contienen ADN etiquetado de forma fluorescente en todos los nucleotidos C, T, G y A respectivamente.
8) Inmediatamente antes de que se haga pasar el ADN a traves del dispositivo de secuenciacion, las reacciones de PCR se desnaturalizan tal como es bien conocido en la tecnica, para permitir que el ADNmc etiquetado pase a traves de los nanoporos 34.
9) Se permite pasar una reaccion de PCR desnaturalizada cada vez a traves del nanoporo 34.
10) La emision de fotones a partir de las moleculas de colorante se obtiene mediante un APD con una precision de una millonesima de segundo. Las temporizaciones de estas rafagas de emision de fotones se normalizan con lo que se conoce respecto a la traslocacion de ADNmc a traves de un poro y se crean varios miles o millones de mapas de distancia que revelan la separacion entre nucleotidos identicos.
11) Estos mapas de distancia se reensamblan en primer lugar en cuatro secuencias completamente reensambladas de nucleotidos identicos, y se componen en una secuencia de genoma completo.
Ejemplo 2 - Nanoporo sintetico (tal como se ilustra en la figura 7)
1) Una agrupacion de nanoporos conicos que tienen un radio interno en la punta de 30 nm o menos se graban mediante ataque qmmico en una membrana de nitruro de silicio semiconductora o de metal conductora 40 usando litograffa por haz de electrones bien conocida en la tecnica. Estos nanoporos estan separados 1 |im. La membrana de silicio grabada se instala sobre una plataforma tal como se describe en [11] y se coloca en lfquido de galvanoplastia en un pequeno tubo de Teflon (2 mm de diametro), que funciona como un bano de galvanoplastia. Como lfquido de galvanoplastia se usa TEMPEREX 8400 (Tanaka Kikinzoku), que inclrna el 1,17 % (p/p) de KAu(CN)2, a temperatura ambiente. Un alambre de oro (0,5 mm de diametro) se sumergio en la solucion como contraelectrodo. A continuacion, se aplica una tension de polarizacion de 1,4 a 1,5 V a los electrodos iniciales con respecto al contraelectrodo en el sistema. A esto le sigue la electrodeposicion de oro sobre la superficie de los electrodos iniciales. Normalmente, una corriente de induccion de 0,2 mA permite una tasa de electrodeposicion de 1 A°/s a temperatura ambiente.
2) A continuacion se deposita una capa de oro 42 usando electrodeposcion tal como se describe en [11] para producir un poro de 1,5 a 2,5 nm de diametro. Cuando es excitada por una onda incidente de la longitud de onda apropiada, esta estructura producira un CEM altamente localizado concentrado en la punta del poro conico [12].
3) A medida que se induce la migracion del ADNmc etiquetado a traves del poro 44 por electroforesis, etiquetas individuales entran en contacto con el borde 43 del poro 44. Dado que el CEM esta altamente localizado alrededor del borde del poro 44, a medida que una etiqueta fluorescente pasa a traves del campo, se esperana emision de fotones. El contacto entre la superficie de oro en la punta del poro 44 y el ADNmc etiquetado de forma fluorescente, sin embargo, induce extincion fluorescente. A medida que el ADNmc etiquetado sigue moviendose pasada la punta del poro y al interior del canal, el canal se expande. Esta expansion elimina el contacto con la superficie de la estructura plasmonica y la extincion fluorescente resultante.
4) La longitud de onda de resonancia plasmonica de estos poros conicos electrodepositados 44 se determina a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
continuacion de forma precisa y espectros laser y de colorante fluorescente se seleccionan para corresponder con la resonancia del plasmon definida. Los espectros de colorante fluorescente deben estar ligeramente desplazados hacia el rojo (20 a 150 meV) desde el pico de resonancia del plasmon.
5) Se lleva a cabo transporte electrolftico a traves del nanoporo conico 44 tal como se describe en [8, 9].
6) La emision de fotones desde las etiquetas fluorescentes se detecta usando un sistema de deteccion de fotodiodo de avalancha bien conocido en la tecnica.
7) Despues de extraer ADN a partir de una fuente genetica seleccionada, el ADNmc se etiqueta de forma fluorescente usando PCR y cebadores aleatorios tales como se usan en amplificacion del genoma completo. De los cuatro nucleotidos presentes en la reaccion de PCR, uno estara presente solamente en su forma modificada por colorante, garantizando etiquetado fluorescente de alta densidad del nucleotido seleccionado. Con el fin de garantizar etiquetado de alta densidad con longitudes de lectura largas, se puede tener que ensayar varios colorantes fluorescentes con diversas polimerasas tal como se describe en [7].
8) Esta reaccion de PCR se lleva a cabo a continuacion para los tres nucleotidos restantes, de modo que se habran llevado a cabo cuatro reacciones de PCR, dando como resultado cuatro muestras que contienen ADN etiquetado de forma fluorescente en todos de los nucleotidos C, T, G y A respectivamente.
9) Inmediatamente antes de que se haga pasar el ADN a traves del dispositivo de secuenciacion, las reacciones de PCR se desnaturalizan tal como es bien conocido en la tecnica, para permitir que el ADNmc etiquetado pase a traves de los nanoporos 44.
10) Se permite pasar una reaccion de PCR desnaturalizada cada vez a traves del nanoporo 44.
11) La emision de fotones a partir de las moleculas de colorante se obtiene mediante un APD con una precision de una millonesima de segundo. Las temporizaciones de estas rafagas de emision de fotones se normalizan con lo que se conoce respecto a la traslocacion de ADNmc a traves de un poro 44 y se crean varios miles o millones de mapas de distancia que revelan la separacion entre nucleotidos identicos.
12) Estos mapas de distancia se reensamblan en primer lugar en cuatro secuencias completamente reensambladas de nucleotidos identicos, y se componen en una secuencia de genoma completo.
Referencias:
[1] Fu, Yi, Lakowicz; Joseph R., "Single molecule studies of enhanced fluorescence on silver island films", Plasmonics, Vol. 2, N.° 1,2O07.
[2] Nakamura, Toshihiro; Hayashi, Shinji, "Enhancement of dye fluorescence by gold nanoparticles: Analysis of Particle Size.
[3] Pompa, P.P. et al, "Metal enhanced fluorescence of colloidal nanocrystals with nanoscale control", Nature, publicado en lmea el 3 de noviembre de 2006.
[4] Netti, M. Caterina et al, "Confined plasmons in gold photonic nanocavities", Advanced Materials, Vol. 13, N.° 18, 2001.
[5] Aizpurua, J. et al, "Optical properties of gold nanorings", Physics Review Letters, Vol. 90, N.° 5, 2003.
[6] Kucheyev, S.O. et al, "Surface-enhanced Raman scattering on nanoporous Au", Applied Physics Letters, Vol. 89, 2006.
[7] Taurai, Tasara et al, "Incorporation of reporter molecule-labelled nucleotides by DNA polymerases. II. High- density labelling of natural DNA", Nucleic Acids Research, Vol. 31, N.° 10, 2003.
[8] Heng, J.B. et al, "The Electromechanics of DNA in a synthetic nanopore", Biophysical Journal, Vol. 90, febrero de 2006.
[9] Ho, Chuen et al, "Electrolytic transport through a synthetic nanometer-diameter Pore", PNAS, Vol. 102, N.° 30, 2005.
[10] Astier, Yann; Braha, Orit; Bayley, Hagan, "Towards single molecule DNA sequencing", Journal of American Chemical Society, Vol. 128, 2006.
[11] Kashimura, Yoshiaki et al, "Fabrication of nano-gap electrodes using electroplating technique" Thin Solid Films 438 - 439, 2003.
[12] Downes, Andrew; Salter, Donald; Elfick, Alistair, "Simulations of atomic resolution tip-enhanced optical microscopy" OPTICS EXPRESS, Vol. 14, N.° 23, 2006.
[13] Bayley, Hagan; Cremer, Paul S., "Stochastic sensors inspired by biology", NATURE, Vol. 413, septiembre de 2001.

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un aparato para investigar una molecula (20) que comprende:
    - dos depositos separados entre s^ por un sustrato (11), el primer deposito (19) adecuado para recibir una muestra que comprende la molecula (20) a investigar, y un segundo deposito (21) adecuado para que la molecula (20) pase a su interior una vez que ha pasado a traves de al menos un canal (10) provisto en el sustrato (11), siendo el canal (10) adecuado para el paso de la molecula (20) a su traves;
    - al menos una nanopartfcula metalica (14) capaz de generar un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon;
    - medios para inducir el paso de una molecula (20) a traves del canal (10);
    - medios para inducir resonancia del plasmon en la nanopartfcula metalica (14); y
    - medios para detectar interaccion entre el campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon producido por la nanopartfcula metalica (14) y una molecula (20) que pasa a traves del canal (10),
    caracterizado por que:
    - el al menos un canal es un nanoporo (10) que tiene un diametro de 0,5 nm a 100 nm; y
    - la al menos una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a dicho nanoporo (10) y dispuesta en una posicion adecuada para que el campo electromagnetico producido por la nanopartfcula metalica (14) interactue con una molecula (20) que pasa a traves del nanoporo (10).
  2. 2. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el nanoporo (10) tiene un diametro de aproximadamente 0,5 nm a 50 nm.
  3. 3. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado por que el nanoporo (10) tiene un diametro de aproximadamente 0,5 nm a 30 nm.
  4. 4. Un aparato de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizado por que el nanoporo (10) tiene un diametro de 1 nm a 5 nm.
  5. 5. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el nanoporo (10) es organico.
  6. 6. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el sustrato (11) esta dotado de una pluralidad de nanoporos (10).
  7. 7. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la nanopartfcula metalica (14) esta hecha de oro, plata, cobre o aluminio.
  8. 8. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la nanopartfcula metalica (14) es sustancialmente esferica o sustancialmente anular; o es un prisma poligonal.
  9. 9. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la nanopartfcula metalica (14) tiene un diametro de 50 nm a 150 nm.
  10. 10. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la nanopartfcula metalica (14) esta situada para estar a 50 nm o menos de la molecula (20) a medida que pasa a traves del nanoporo (10).
  11. 11. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la nanopartfcula (14) esta situada para estar a 10 nm o menos de la molecula (20) a medida que pasa a traves del nanoporo (10).
  12. 12. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios para inducir el paso de una molecula (20) a traves del nanoporo (10) comprenden uno o mas de medios para inducir electroforesis, un dispositivo microflmdico, o un dispositivo de captura con laser.
  13. 13. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende ademas medios de control para controlar el paso de la molecula (20) a traves del nanoporo (10).
  14. 14. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la interaccion entre el campo electromagnetico y la molecula (20) genera fluorescencia o luz con dispersion Raman.
  15. 15. Un aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que los medios para detectar la interaccion entre el campo electromagnetico y la molecula (20) se seleccionan entre un fotomultiplicador, un fotodiodo de avalancha y un espectrometro Raman.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
  16. 16. Un metodo para investigar una molecula (20) que comprende las etapas de:
    - proporcionar una muestra de fluido que comprende una molecula (20) a investigar, en el que la molecula (20) es opcionalmente una molecula biologica (20) y opcionalmente un acido nucleico;
    - inducir el paso de dicha molecula (20) a traves de un nanoporo (10) provisto en un sustrato (11), teniendo el nanoporo (10) un diametro de 0,5 nm a 100 nm, en el que una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a la abertura de un nanoporo (10) y se le induce la generacion de un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon; y
    - detectar interaccion entre el campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon producido por la nanopartfcula metalica (14) y la molecula (20) a medida que pasa a traves del nanoporo (10).
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 16, que comprende las etapas de:
    proporcionar una muestra de fluido que comprende el acido nucleico (20) a secuenciar, opcionalmente en el que todas de una o mas de las cuatro bases en el acido nucleico (20) esta etiquetada con un fluoroforo; inducir el paso de una unica molecula de acido nucleico (20) en una conformacion lineal a traves de un nanoporo (10) en un sustrato (22), teniendo el nanoporo (10) un diametro de 0,5-100 nm y teniendo opcionalmente un diametro de 1-50 nm, en el que una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a la abertura de un nanoporo (10) y se le induce la generacion de un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon; y
    detectar interaccion entre el campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon producido por la nanopartfcula metalica (14) y la unica molecula de acido nucleico (20) a medida que pasa a traves del nanoporo (10).
  18. 18. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 16 o 17, en el que la molecula (20) comprende una etiqueta que interactua con la nanopartfcula metalica (14), opcionalmente en el que la etiqueta es un fluoroforo, opcionalmente seleccionado entre Rosa de Bengala, C5-maleimida, C2-maleimida, Rojo Rodamina, C2-meleimida, y Verde Rodamina, y opcionalmente en el que la etiqueta tiene un pico de emision a una energfa ligeramente inferior que el pico de resonancia del plasmon localizado de la nanopartfcula metalica (14).
  19. 19. Un sustrato (11) adecuado para uso en un aparato para investigar una molecula (20) que comprende:
    - al menos un canal (10) provisto en el sustrato (11), el canal (10) adecuado para el paso de una molecula (20) a su traves; y
    - al menos una nanopartfcula metalica (14) capaz de generar un campo electromagnetico derivado de resonancia del plasmon,
    caracterizado por que:
    - el al menos un nanoporo (10) tiene un diametro de 0,5 nm a 100 nm; y
    - la al menos una nanopartfcula metalica (14) esta ubicada sobre el sustrato (11) adyacente a la abertura del nanoporo (10) para estar a 50 nm o menos de la molecula (20) a medida que pasa a traves del nanoporo y dispuesta en una posicion tal que el campo electromagnetico producido por la nanopartfcula metalica (14) sea capaz de interactuar con una molecula (20) que pasa a su traves.
ES08788753.5T 2007-09-04 2008-09-04 Aparato y método para investigar moléculas por resonancia del plasmón superficial Active ES2617089T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0717150.7A GB0717150D0 (en) 2007-09-04 2007-09-04 Apparatus and method
GB0717150 2007-09-04
PCT/GB2008/050783 WO2009030953A1 (en) 2007-09-04 2008-09-04 Apparatus and method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2617089T3 true ES2617089T3 (es) 2017-06-15

Family

ID=38640188

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08788753.5T Active ES2617089T3 (es) 2007-09-04 2008-09-04 Aparato y método para investigar moléculas por resonancia del plasmón superficial

Country Status (9)

Country Link
US (3) US8865455B2 (es)
EP (1) EP2188618B1 (es)
JP (2) JP2010538290A (es)
CN (2) CN103087904A (es)
BR (1) BRPI0816426A2 (es)
CA (1) CA2698876A1 (es)
ES (1) ES2617089T3 (es)
GB (1) GB0717150D0 (es)
WO (1) WO2009030953A1 (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009020682A2 (en) 2007-05-08 2009-02-12 The Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
GB0717150D0 (en) * 2007-09-04 2007-10-17 Univ Warwick Apparatus and method
EP2196796A1 (en) * 2008-12-09 2010-06-16 Imec Single molecule optical spectroscopy in solid-state nanopores in a transmission-based approach
EP2483680A4 (en) 2009-09-30 2014-01-01 Quantapore Inc ULTRASOUND SEQUENCING OF BIOLOGICAL POLYMERS WITH THE HELP OF A MARKED NANOPORE
US8748091B2 (en) * 2009-12-18 2014-06-10 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Characterizing stretched polynucleotides in a synthetic nanopassage
AU2011218847B2 (en) * 2010-02-23 2015-03-12 Christopher Gordon Atwood Methods for the detection of biologically relevant molecules and their interaction characteristics
US10010272B2 (en) 2010-05-27 2018-07-03 Profusa, Inc. Tissue-integrating electronic apparatus
EP2402738A3 (en) * 2010-07-02 2012-01-11 Imec Spectroscopy using nanopore cavities
CN103069267B (zh) * 2010-09-29 2016-05-11 株式会社日立高新技术 生物聚合物的光学的解析装置以及方法
WO2012048150A1 (en) 2010-10-06 2012-04-12 Profusa, Inc. Tissue-integrating sensors
US9274053B2 (en) * 2011-05-18 2016-03-01 Uvic Industry Partnerships Inc. Flow through metallic nanohole arrays
WO2012165400A1 (ja) * 2011-06-03 2012-12-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマーの光学的解析装置及び方法
GB2493397A (en) 2011-08-05 2013-02-06 Base4 Innovation Ltd Pulse counter for single photon events
US9007576B2 (en) 2011-08-12 2015-04-14 Savannah River Nuclear Solutions, Llc Surface enhanced Raman scattering spectroscopic waveguide
WO2013039778A2 (en) 2011-09-12 2013-03-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Devices with a fluid transport nanochannel intersected by a fluid sensing nanochannel and related methods
AU2012339711B2 (en) * 2011-11-14 2014-10-16 Brigham Young University Two- chamber dual-pore device
GB2497784A (en) * 2011-12-20 2013-06-26 Base4 Innovation Ltd Identification of polymers using nanopore devices
JP6339024B2 (ja) * 2012-02-10 2018-06-06 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ 流体ナノファンネルを有する装置、関連する方法、製造及び解析システム
GB201212135D0 (en) * 2012-07-09 2012-08-22 Base4 Innovation Ltd Improved sequencing apparatus
CN110579435B (zh) 2012-10-15 2023-09-26 纳诺赛莱克特生物医药股份有限公司 颗粒分选的系统、设备和方法
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
GB201301178D0 (en) * 2013-01-23 2013-03-06 Dynamic Biosensors Gmbh Method for sequencing a template nucleic acid immobilized on a substrate
KR20150132125A (ko) 2013-02-28 2015-11-25 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 거대분자의 통제된 포획, 고정, 및 전달을 위한 통합된 부품을 가진 나노유체 장치 및 관련 분석 방법
US9255288B2 (en) 2013-03-13 2016-02-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanofluidic devices for the rapid mapping of whole genomes and related systems and methods of analysis
US20160003732A1 (en) * 2013-03-14 2016-01-07 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Devices to detect a substance and methods of producing such a device
WO2014158988A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Profusa, Inc. Method and device for correcting optical signals
GB201306446D0 (en) * 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Nanopore plasmonic detector
GB201306447D0 (en) * 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Plasmonic detector
AU2014270410B2 (en) 2013-05-24 2020-07-16 Illumina Cambridge Limited Pyrophosphorolytic sequencing
CA2910019A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Quantapore, Inc. Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed fret detection
JP2014235043A (ja) * 2013-05-31 2014-12-15 キヤノン株式会社 検査器具、検査システム、および検査方法
US10219729B2 (en) 2013-06-06 2019-03-05 Profusa, Inc. Apparatus and methods for detecting optical signals from implanted sensors
WO2015081294A2 (en) * 2013-11-26 2015-06-04 Stc.Unm Innovative nanopore sequencing technology
US10612084B2 (en) * 2014-04-08 2020-04-07 International Business Machines Corporation Reduction of entropic barrier of polyelectrolyte molecules in a nanopore device with agarose gel
EP2995934A1 (en) 2014-09-15 2016-03-16 Base4 Innovation Ltd Improved nanopore plasmonic analyser
EP2995933A1 (en) 2014-09-15 2016-03-16 Base4 Innovation Ltd Improved nanopore plasmonic analyser
ES2789000T3 (es) 2014-10-10 2020-10-23 Quantapore Inc Análisis de polinucleótidos basado en nanoporos con marcadores fluorescentes que se inactivan mutuamente
CN107002126B (zh) * 2014-10-24 2021-05-25 昆塔波尔公司 使用纳米结构阵列的聚合物的高效光学分析
HK1245348A1 (zh) * 2015-02-02 2018-08-24 奥特拉公司 来自样品背景的靶多核苷酸的纳米孔隙检测
US10471428B2 (en) 2015-05-11 2019-11-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Fluidic devices with nanoscale manifolds for molecular transport, related systems and methods of analysis
JP6559187B2 (ja) * 2016-07-01 2019-08-14 ツィンファ ユニバーシティ 単一分子検出用のキャリア及び単一分子検出装置
CN107561053B (zh) * 2016-07-01 2020-04-28 清华大学 一种单分子检测方法
JP2019522983A (ja) 2016-07-05 2019-08-22 クアンタポール， インコーポレイテッド 光学ベースのナノポア配列決定
WO2018119400A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Profusa, Inc. System and single-channel luminescent sensor for and method of determining analyte value
JP7272967B2 (ja) 2017-06-20 2023-05-12 イラミーナ インコーポレーテッド ナノポアシーケンサー
EP3441143B1 (en) * 2017-08-08 2022-04-13 Roche Diagnostics GmbH Laboratory instrument base plate
CN114846130A (zh) * 2019-12-03 2022-08-02 国立研究开发法人科学技术振兴机构 纳米孔结构体及包含纳米孔结构体的碱基序列分析装置
WO2022165276A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Armonica Technologies, Inc. Enhancement structures for surface-enhanced raman scattering
US20230055537A1 (en) * 2021-08-18 2023-02-23 University Of South Florida Multi-modal nanopore sensors for nucleic acid sequencing
CN118401821A (zh) * 2021-11-19 2024-07-26 国立大学法人北海道大学 微粒试样的光谱数据的生成方法、微粒的分析方法、微粒的判别方法、有无来自癌细胞的外泌体的判定方法、微粒的光谱测量用基板、微粒的光谱测量用器件和微粒的光谱测量用装置

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63273651A (ja) * 1987-04-30 1988-11-10 Toa Nenryo Kogyo Kk 超高分子量ポリエチレン微多孔膜の製造方法
CN1038499A (zh) * 1988-06-05 1990-01-03 青州水泵厂 往复运动轴杆密封装置
US6267872B1 (en) * 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
US6818907B2 (en) * 2000-10-17 2004-11-16 The President And Fellows Of Harvard College Surface plasmon enhanced illumination system
EP1372828A4 (en) * 2001-03-24 2008-10-29 Aviva Biosciences Corp BIOCHIPS WITH ION TRANSPORTATION STRUCTURES AND USE METHOD
US7670556B2 (en) * 2001-07-10 2010-03-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Surface plasmon resonance imaging of micro-arrays
US7238477B2 (en) * 2001-09-24 2007-07-03 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by Raman scattering
US6982165B2 (en) * 2001-09-24 2006-01-03 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of molecular deconstruction
US6972173B2 (en) * 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
DE10157070B4 (de) * 2001-11-16 2005-11-17 Technische Universität Dresden Anordnung zur Messung von durch Ionenkanäle fließenden Ionenströmen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser und Messverfahren
US7744816B2 (en) * 2002-05-01 2010-06-29 Intel Corporation Methods and device for biomolecule characterization
US20050019784A1 (en) * 2002-05-20 2005-01-27 Xing Su Method and apparatus for nucleic acid sequencing and identification
US6970239B2 (en) * 2002-06-12 2005-11-29 Intel Corporation Metal coated nanocrystalline silicon as an active surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrate
AU2003296014B2 (en) * 2002-11-26 2010-06-03 University Of Maryland Biotechnology Institute High-sensitivity assays for pathogen detection using metal-enhanced fluorescence
JP4173375B2 (ja) * 2003-01-09 2008-10-29 三菱レイヨン株式会社 電気泳動装置及びそれを用いた生体関連物質の検出方法
US7151598B2 (en) 2003-04-04 2006-12-19 Vladimir Poponin Method and apparatus for enhanced nano-spectroscopic scanning
US7248771B2 (en) * 2003-06-16 2007-07-24 Brigham Young University Integrated sensor with electrical and optical single molecule sensitivity
US20050023156A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Ramsey J. Michael Nanostructured material transport devices and their fabrication by application of molecular coatings to nanoscale channels
FR2863053B1 (fr) * 2003-11-28 2007-04-06 Univ Claude Bernard Lyon Nouvelles sondes hybrides a luminescence exaltee
DE10361927B4 (de) * 2003-12-19 2006-12-14 Technische Universität Dresden Ionenkanal-Sensorarray
US20050148064A1 (en) * 2003-12-29 2005-07-07 Intel Corporation Microfluid molecular-flow fractionator and bioreactor with integrated active/passive diffusion barrier
WO2005078415A1 (ja) * 2004-02-13 2005-08-25 Omron Corporation 表面プラズモン共鳴センサー
JP4579593B2 (ja) * 2004-03-05 2010-11-10 キヤノン株式会社 標的物質認識素子、検出方法及び装置
JP4548416B2 (ja) * 2004-03-31 2010-09-22 オムロン株式会社 局在プラズモン共鳴センサ及び検査装置
WO2006137891A2 (en) * 2004-09-29 2006-12-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Membrane with nanochannels for detection of molecules
US7289203B2 (en) * 2004-09-30 2007-10-30 Chromaplex, Inc. Method and system for spectral analysis of biological materials using stimulated cars
WO2006050257A2 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Massachusetts Institute Of Tecchnology Detection of ion channel or receptor activity
US7476787B2 (en) * 2005-02-23 2009-01-13 Stc.Unm Addressable field enhancement microscopy
WO2007039852A1 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Koninklijke Philips Electronics N.V. Biosensors with improved sensitivity
TWI296044B (en) * 2005-11-03 2008-04-21 Ind Tech Res Inst Coupled waveguide-surface plasmon resonance biosensor
KR20080082976A (ko) * 2005-12-16 2008-09-12 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 서브-미크론 표면 플라즈몬 공진 센서 시스템들
US7659977B2 (en) * 2006-04-21 2010-02-09 Intel Corporation Apparatus and method for imaging with surface enhanced coherent anti-stokes raman scattering (SECARS)
CN100999764A (zh) * 2006-12-14 2007-07-18 上海交通大学 光学镊控制单链核酸穿孔速度的方法
JP5397577B2 (ja) * 2007-03-05 2014-01-22 オムロン株式会社 表面プラズモン共鳴センサ及び当該センサ用チップ
US20080239307A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-02 The Regents Of The University Of California Sequencing single molecules using surface-enhanced Raman scattering
GB0717150D0 (en) * 2007-09-04 2007-10-17 Univ Warwick Apparatus and method

Also Published As

Publication number Publication date
EP2188618B1 (en) 2016-10-26
US8440403B2 (en) 2013-05-14
EP2188618A1 (en) 2010-05-26
CN101842692B (zh) 2012-09-12
BRPI0816426A2 (pt) 2015-03-03
US20110036994A1 (en) 2011-02-17
JP2010538290A (ja) 2010-12-09
JP2014145771A (ja) 2014-08-14
GB0717150D0 (en) 2007-10-17
JP5827360B2 (ja) 2015-12-02
US20120237940A1 (en) 2012-09-20
US8865455B2 (en) 2014-10-21
US20150001085A1 (en) 2015-01-01
CN103087904A (zh) 2013-05-08
CA2698876A1 (en) 2009-03-12
WO2009030953A1 (en) 2009-03-12
CN101842692A (zh) 2010-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2617089T3 (es) Aparato y método para investigar moléculas por resonancia del plasmón superficial
ES2288154T3 (es) Construccion de electrodos para aparato dielectroforetico y separacion por dielectroforesis.
EP3446157B1 (en) Photonic stucture-based devices and compositions for use in luminescent imaging of multiple sites within a pixel, and methods of using the same
US6263286B1 (en) Methods of analyzing polymers using a spatial network of fluorophores and fluorescence resonance energy transfer
JP5925854B2 (ja) 生体ポリマーの光学的解析装置及び方法
Chansin et al. Single-molecule spectroscopy using nanoporous membranes
US20040158051A1 (en) Mono and dual conjugation of nanostructures and methods of making and using thereof
JP2016101177A (ja) 標識されたナノポアを使用する生物学的なポリマーの超高速配列決定
JPWO2012165400A1 (ja) 生体ポリマーの光学的解析装置及び方法
Fosdick et al. Two-dimensional bipolar electrochemistry
Pradhan et al. Gold-nanorod-enhanced fluorescence correlation spectroscopy of fluorophores with high quantum yield in lipid bilayers
Rong et al. Insights from a nanoparticle minuet: two-dimensional membrane profiling through silver plasmon ruler tracking
EP2870474A1 (en) Improved sequencing apparatus
US20210003547A1 (en) Light-enhancing plasmonic nanowell-nanopore biosensor and use thereof
GB2558482A (en) Biological sample analyzer and biological sample analysis method
JP5026359B2 (ja) 核酸分析デバイス、核酸分析装置及び核酸分析方法
HK1181809A (en) Apparatus and method for investigating molecules
Cipriany et al. Single-molecule detection
Lusitani A wide-field view at single molecules and single particles