ES2618783T3 - Construcción de ADN inmunomodulador no codificante - Google Patents

Abstract

Una construcción de ADN no codificante que comprende al menos un motivo de secuencia N1N2CGN3N4, en la que N1N2 y N3N4 son cualquier combinación de A, C, T y G, y C es desoxicitidina, G es desoxiguanosina, A es desoxiadenosina y T es desoxitimidina y en la que al menos un nucleótido de los cinco nucleótidos terminales localizados en los extremos 5' y/o 3' de un ADN monocatenario está en conformación L.

Description

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CKm339, Lin2tPT TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCG TTCTTT los dos primeros así como del segundo y tercero hasta el último enlace fosfodiéster modificados en fosforotioatos

Los experimentos usando las secuencias de la Tabla 1 mostraron que las secuencias lineales protegidas con Lribosa que contenían motivos CG son capaces de estimular el sistema inmunitario y la respuesta inmunitaria inducida difiere claramente de la respuesta inmunitaria inducida por dSLIM como se desvela en el documento EP 1 5 196 178. Por tanto, una secuencia modificada llamada ODN2216 (GGGGGACGATCGTCGGGGGG; SEC ID 6) y modificaciones de la misma se usaron para investigar la influencia de la diferencia estructural como la influencia de los tramos G con respecto a su presencia, longitud y posición, el espaciado entre los motivos CG y la distancia entre tramos G con nucleótidos de Lribosa y motivos CG respectivamente.

10 La Tabla 2 resume las secuencias usadas y su efecto sobre la secreción de IFNalfa e IP10 en comparación con ODN2216 que tiene los dos primeros y los seis últimos nucleótidos modificados con fosforotioato, donde las letras en negrita representan nucleótidos que comprenden Lribosa, las letras en cursiva se refieren a un tramo G y las letras subrayadas se refiere a un motivo CG. Una raya situará a la secuencia respectiva en su sitio para la comparación con CKm508, pero no indica una modificación estructural ni una modificación funcional de la secuencia. 15 Tabla 2: Efecto de las secuencias indicadas sobre la secreción de IFNalfa e IP10 en comparación con ODN2216 (ODN2216 que tiene los dos primeros y los seis últimos nucleótidos modificados con fosforotioato).

Estimulador

PM IFNa (% de ODN2216) PM IP10 (% de ODN2216 Secuencia SEQ ID NO

CKm508

122,5093347 238,1577436 GGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGT 7

CKm458

105,7141511 204,6403984 GGAGGACGATCGTCGGGGGGT 8

CKm481

88,91417043 189,6025669 GGGGGACGATCGTCGGGGGT 9

CKm461

86,89157541 205,8046048 GGAAGACGATCGTCGGGGGGT 10

CKm3612

84,31376637 238,7118706 GGGGGACGATCGTCGGGGGGT 11

CKm479

83,60788319 176,7812306 GGGGGGACGATCGTCGGGGGGT 12

CKm503

64,99582032 258,7302716 AAGGGGGACGATCGTCGGGGGGAAT 13

CKm507

64,93994028 224,6315842 TTGGGGGACGATCGTCGGGGGGTTT 14

CKm459

62,45886305 171,4718235 GGGGGACGATCGTCGGAGGGT 15

CKm506

56,61452004 215,2548473 GGGGGACGATCGTGCGGGGGGT 16

Ckm478

25,22927502 137,4229666 GGGGGGCGATCGTCGGAAGGT 17

CKm480

18,07466107 150,4467402 GGGGGACGATGCTCGGGGGGT 18

CKm462

5,362851611 38,31712092 GGGGGACGATCGTCGGAAGGT 19

CKm505

2,196636001 82,40020833 GGGGGACGATCGTGCGGGGGT 20

CKm476

1,963187635 26,31602567 GGGGGAACGATCGTCGGAAGGT 21

CKm464

1,803712909 0,517748538 GGCCCCCGATCGTCGGGGGGT 22

CKm476

0,981593818 39,4740385 GGGGGAACGATCGTCGGAAGGT 23

CKm460

0,730938569 19,07664393 GGAGGACGATCGTCGGAGGGT 24

CKm475

0,318948048 1,703784315 CCCCCCCGATCGTCGGGGGGGT 25

CKm477

0,089962277 0,160156357 GGGGGAGCATGCTGCGGGGGGT 26

CKm463

0,024204793 8,911634665 GGAAGACGATCGTCGGAAGGT 27

CKm504

0 0,378654915 GGGGGAGCATCGTCGGGGGGT 28

CKm510

0 55,29535465 GGGGGCGATCGTCGGAGGGT 29

CKm509

0 1,382278733 CCCCCCCTCGATCGTCGGGGGGGT 30

Se obtuvieron buenos resultados con secuencias que tienen al menos un tramo G, especialmente en o cerca del 20 extremo 3'. La estimulación es también dependiente de la presencia de motivos CG (CKm477), demostrando de nuevo que la estimulación no es un efecto de la Lribosa, sino de los motivos CG.

Los resultados obtenidos con secuencias modificadas de ODN 2216 que identifican componentes estructurales positivos se transfirieron a la secuencia de ADN de CKm374. La Tabla 3 muestras los resultados de emplear las 25 secuencias modificadas en comparación con dSLIM con forma de mancuerna como se devela en el documento EP 1 196 178. De nuevo, las letras en negrita representan nucleótidos que comprenden Lribosa, las letras en cursiva se

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refieren a un tramo G, las letras con doble subrayado representan nucleótidos modificados con fosforotioato y las letras subrayadas se refieren a un motivo GC.

Como puede extraerse de los resultados de la tabla 3, un tramo G localizado directamente en el extremo 5' parece 5 ser ventajoso (comp. CKm532 y CKm499). Además, el uso de cuatro en lugar de tres desoxiguanosinas en el extremo 5' aumenta adicionalmente la estimulación de IFNalfa e IP10 (comp. CKm501 y CKm532).

La adición de un tramo G adicional entre motivos CG parecer ser también beneficioso (comp. CKm532 y CKm520). La distancia entre el primer y el segundo tramo G influye adicionalmente en la eficacia de la molécula de ADN. 10 Además, el empleo de desoxinucleótidos que comprenden Lribosa solamente en o cerca del extremo 3' parece producir un grado suficiente de estabilización de la molécula de ADN. Puede observarse una buena estimulación de IFNalfa e IP10, que es lo que se pretende (véase a continuación). Como IL8 ha demostrado ser responsable de la inducción de neoangiogénesis, parece ser beneficioso que la secreción de IL8 se induzca solamente en pequeñas cantidades. 15 Claramente, la presencia y la posición cuidadosamente elegida de los tramos G en combinación con el efecto estabilizador de los desoxinucleótidos que contienen Lribosa permite la producción de una molécula de ADN que supera la eficacia estimuladora de la molécula dSLIM.

20 Tabla 3: Comparación del efecto de las secuencias indicadas sobre la secreción de IFNalfa, IP10 e IL8 en comparación con dSLIM.

Estim.

Secuencia PM IFNa % dSLIM PM IP10 % dSLIM PM IL8 % dSLIM SEQ ID NO

CKm532

GGGGTCATTAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTTT 2300,05 297,32 261,91 31

CKm527

GGGGTCATTAAACGTTCTTCGGGGCGGGGGTTTTT 702,07 118,20 91,58 32

CKm501

GGGTCATTAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTTT 493,25 80,23 226,82 33

CKm534

GGGTCATTAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTTT 99,87 86,36 120,92 34

CKm520

GGGGTCATTAAACGTTCTTCGTTCTTCGGGGGTTTTT 52,19 24,40 378,74 35

CKm535

TCATTAAACGTTCTTCGGGGCGGGGGTTTTT 51,32 30,49 68,75 36

CKm528

GGGTCATTAAAACGTTCTCGGGGCGTTCTTTTT 33,71 39,01 158,76 37

CKm339

TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTT 10,51 25,46 615,76 38

CKm498

TCATTGGAAAACGTTCTTCGTTCTTCGGGGGGGTTT 8,25 23,15 170,77 39

CKm536

GGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTT 3,13 35,64 53,03 40

CKm499

TCATTGGGAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTTT 3,10 21,04 69,59 41

CKm533

GGGTCATTAAACGTGGGTCGGGGCGTTCTTTTT 1,63 26,61 248,48 42

CKm500

TCATTAAAGGGCGTTCTTCGGGGCGTTCTTTTT 1,16 9,06 70,83 43

CKm521

GGGAACGTTCTTCGGGGCGTCTTTT 0,15 15,09 68,07 44

CKm502

GGGCGTTCTTCGGGGCGTCTTTT 0,13 13,57 92,81 45

CKm374

TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTT 0,00 11,34 77,11 46

CKm497

TCATTGGAAAACGTTCTTCGTTCTTCGGGGTTT 0,00 2,57 159,64 47

CKm524

GGGTCATTAAAGCTTCTTGCGGGGCTTCTTTTT 0,00 9,10 37,40 48

CKm525

TCATTGGAAAAGCTTCTTGCGGGGCTTCTTT 0,00 2,10 27,29 49

CKm526

GGGAAACGTTCTTCGGGGCGTTCTTTT 0,00 13,38 79,35 50

CKm537

GGGGTCATTAAACGTGGGTCGGGGCGGGGGTTTTT 0,00 7,45 49,24 51

CKm538

GGGGAAACGGGGTTCGGGGTTCGGGGGTTTTT 0,00 2,30 32,49 52

Breve descripción de las figuras

25 La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante ejemplos y figuras sin limitarse las realizaciones desveladas. Muestra:

Fig. 1 Electroforesis en gel de agarosa de construcciones de ADN después de digestión enzimática. Fig. 2 Intensidad de GFP después de estimulación de una línea celular de macrófagos de ratón. 30 Fig. 3 Concentración de MIP1alfa después de estimular células dendríticas plasmacitoides (PDC). Fig. 4 Concentración de MIP1beta después de estimular PDC. Fig. 5 Concentración de IL8 después de estimular PDC.

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Claims (1)

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