ES2619171T3 - Métodos y composiciones para aumentar la eficacia de anticuerpos terapéuticos utilizando compuestos para la potenciación de linfocitos NK - Google Patents

Abstract

Uso de (a) un anticuerpo anti receptor de linfocitos NK (NKR) que se une a, e inhibe la actividad de un receptor KIR2DL inhibidor de un linfocito NK y de (b) un anticuerpo terapéutico al que puede unirse CD16 a través de su región Fc y que empobrece células diana mediante ADCC, para la preparación de un fármaco para el tratamiento de una enfermedad, en donde dicho anticuerpo anti NKR aumenta la eficacia de dicho anticuerpo terapéutico mediante la potenciación de la ADCC, en donde dicho anticuerpo anti NKR se une a un determinante común de los receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 e inhibe la inhibición mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones para aumentar la eficacia de anticuerpos terapeuticos utilizando compuestos para la potenciacion de linfocitos nK

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere, en general, a metodos y composiciones para aumentar la eficacia de anticuerpos terapeuticos. De manera mas particular, la invencion se refiere al uso de un anticuerpo terapeutico en combinacion con un compuesto que bloquea un receptor inhibidor o estimula un receptor activador de linfocitos citollticos naturales (NK), permitiendo de este modo una potenciacion de la citotoxicidad de linfocitos NK en sujetos mamlferos, para potenciar la eficacia del tratamiento en sujetos humanos, en particular a traves de un aumento del mecanismo ADCC.

Antecedentes de la invencion

En seres humanos, diversas estrategias terapeuticas se basan en el uso de anticuerpos terapeuticos. Incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos terapeuticos desarrollados para empobrecer celulas diana, en particular celulas enfermas tales como celulas infectadas por virus, celulas tumorales u otras celulas patologicas. Normalmente, tales anticuerpos son anticuerpos monoclonales, de la especie IgG, normalmente con porciones Fc de IgG1 o IgG3 humana. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos naturales o recombinantes, y con frecuencia son anticuerpos de raton "humanizados" (es decir, que comprenden dominios funcionales procedentes de diversas especies, normalmente una porcion Fc de origen de primate humano o no humano, y con una region variable o una region determinante de complementariedad (CDR) de origen de raton). Como alternativa, el anticuerpo monoclonal puede ser totalmente humano a traves de la inmunizacion en ratones transgenicos que tengan el locus de Ig humano o se obtiene a traves de bibliotecas de ADNc obtenidas de celulas humanas.

Un ejemplo particular de tales anticuerpos terapeuticos es rituximab (Mabthera®, Rituxan®), el cual es un anticuerpo monoclonal anti CD20 quimerico fabricado con las regiones constantes y1 y k humanas (por lo tanto, con la porcion Fc de IgG1 humana) ligadas a los dominios variables murinos que confieren la especificidad para CD20. En anos recientes rituximab ha modificado de forma considerable la estrategia terapeutica frente a neoplasias linfoproliferativas B, en particular linfomas no Hodgkin (NHL, por sus siglas en ingles). Otros ejemplos de anticuerpos IgG1 humanizados incluyen alemtuzumab (Campath-1H®), el cual se utiliza en el tratamiento de neoplasias de linfocitos B, y trastuzumab (Herceptin®), el cual se utiliza en el tratamiento del cancer de mama. Se divulgan en la tecnica ejemplos adicionales de anticuerpos terapeuticos en desarrollo.

El mecanismo de accion de los anticuerpos terapeuticos todavla es materia de debate. La inyeccion de anticuerpos conduce al empobrecimiento de celulas que portan el antlgeno que el anticuerpo reconoce de forma especlfica. Este empobrecimiento se puede mediar a traves de al menos tres mecanismos: citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC, por sus siglas en ingles), lisis dependiente del complemento e inhibition antitumoral directa del crecimiento tumoral a traves de senales proporcionadas a traves el antlgeno al que se dirige el anticuerpo.

Aunque estos anticuerpos representan una estrategia novedosa y eficaz para la terapia de seres humanos, en particular para el tratamiento de tumores, no siempre exhiben una eficacia importante. Por ejemplo, aunque se mostro que rituximab, solo o en combinacion con quimioterapia, es eficaz en el tratamiento de NHL tanto de grado intermedio bajo como de grado alto, del 30 % al 50 % de los pacientes con NHL de grado bajo no tienen respuesta cllnica a rituximab. Se ha sugerido que el nivel de expresion de CD20 en celulas de linfoma, la presencia de una alta carga tumoral en el momento del tratamiento o las bajas concentraciones sericas de rituximab, pueden explicar la falta de eficacia de rituximab en algunos pacientes. No obstante, las causas reales del fracaso del tratamiento siguen siendo en gran parte desconocidas.

Ademas, el uso de anticuerpos terapeuticos puede estar limitado por efectos secundarios provocados por su administration. Por ejemplo, pueden aparecer en pacientes efectos secundarios tales como fiebre, cefaleas, nauseas, hipotension, jadeo, erupciones, infecciones y muchos otros, limitando potencialmente la cantidad posible o frecuencia con la cual se puedan administrar los anticuerpos.

Por lo tanto, serla muy interesante aumentar la eficacia de los anticuerpos terapeuticos o tener la capacidad de alcanzar una eficacia terapeutica utilizando dosis reducidas de anticuerpos que produzcan efectos secundarios de manera menos probable. La presente invencion aborda estas y otras necesidades.

Sumario de la invencion

La presente invencion concierne a la materia objeto de las reivindicaciones.

La presente solicitud divulga estrategias novedosas para potenciar la eficacia de anticuerpos terapeuticos. Sin limitarse a la siguiente teorla, se cree que los resultados sorprendentes alcanzados utilizando los presentes metodos

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se originan en su capacidad de mejorar el mecanismo de la ADCC in vivo, cuando se inyectan anticuerpos terapeuticos. De hecho, la presente invencion proporciona composiciones y metodos novedosos que superan la dificultad actual relacionada con la eficacia de los anticuerpos terapeuticos. En la presente solicitud se muestra que los linfocitos NK procedentes de un individuo pueden tener una ADCC mediada por Acm (anticuerpo monoclonal) terapeutico mala debido a una falta de activacion de linfocitos NK, por ejemplo, mediante una inhibicion de los receptores inhibidores en los linfocitos NK. Preferentemente, se alcanza un aumento del mecanismo ADCC mediante la administration de compuestos que bloquean un receptor inhibidor en linfocitos NK, estimulando de este modo una potenciacion de la citotoxicidad de los linfocitos NK en sujetos mamlfero. Preferentemente, el compuesto es un anticuerpo o un fragmento del mismo. Dichos anticuerpos reaccionan con un receptor inhibidor de linfocitos NK, por ejemplo, las moleculas del receptor inhibidor de linfocitos citollticos naturales (KIR) en linfocitos NK, neutralizando de este modo la inhibicion de las celulas y aumentando su actividad ADCC.

De forma mas concreta, la solicitud divulga metodos de tratamiento de un sujeto en el cual un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK se coadministra con el anticuerpo terapeutico al sujeto. La solicitud demuestra que se puede potenciar en gran medida la eficacia de un anticuerpo terapeutico mediante la coadministracion, por ejemplo la coinyeccion, de tal anticuerpo o un fragmento del mismo, que supere la inhibicion de los linfocitos NK, por ejemplo, mediante el bloqueo del receptor inhibidor de un linfocito NK.

La solicitud tambien divulga composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo terapeutico y un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK. La solicitud tambien divulga kits que comprenden un anticuerpo terapeutico, un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK.

La solicitud tambien divulga el uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de un linfocito NK, para aumentar la eficacia de un tratamiento con un anticuerpo terapeutico o para aumentar la ADCC en un sujeto sometido a un tratamiento con un anticuerpo terapeutico.

La solicitud tambien divulga el uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de un linfocito NK y un anticuerpo terapeutico para la preparation de un farmaco para el tratamiento de una enfermedad. De manera mas particular, el tratamiento de la enfermedad requiere el empobrecimiento de las celulas diana, preferentemente las celulas enfermas tales como celulas infectadas por virus, celulas tumorales u otras celulas patologicas. Preferentemente, la enfermedad es un cancer, una enfermedad infecciosa o inmunitaria. Mas preferentemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en un cancer, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria y una enfermedad vlrica. La enfermedad tambien concierne al rechazo de injerto, de forma mas particular rechazo de aloinjertos, y a la enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD, por sus siglas en ingles).

La presente solicitud tambien divulga un metodo para reducir la dosificacion de un anticuerpo terapeutico, por ejemplo un anticuerpo que une un receptor de Fcy, preferentemente CD 16 (FcYRIIIa). Por ejemplo, la coadministracion de un anticuerpo terapeutico y un anticuerpo que bloquea un receptor inhibidor en linfocitos Nk que permita una dosis menor del anticuerpo terapeutico a utilizar. Tales anticuerpos se pueden utilizar a una dosis del 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o mas baja, de la dosis recomendada en ausencia del compuesto.

Ademas, la presente solicitud divulga una composition farmaceutica que comprende un anticuerpo terapeutico, por ejemplo que pueda unir CD16, un anticuerpo que bloquea un receptor inhibidor de linfocitos NK, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente solicitud divulga un kit que comprende un anticuerpo terapeutico, por ejemplo que pueda unir cD16, y un anticuerpo que bloquea un receptor inhibidor de linfocitos NK.

Para cualquiera de los metodos, las composiciones o los kits mencionados anteriormente, en una realization el anticuerpo terapeutico tiene una portion Fc de IgG1 humana o IgG3 humana. En otro aspecto el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. En otro aspecto, el anticuerpo terapeutico no esta conjugado con una fraction radiactiva o toxica. En otro aspecto, el anticuerpo inhibe un receptor inhibidor de un linfocito NK. En un aspecto, los anticuerpos o compuestos terapeuticos pueden ser fragmentos de anticuerpo o derivados tales como, entre otros, un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv.

En un aspecto, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo. En otro aspecto, el anticuerpo terapeutico es rituximab o Campath. En otro aspecto, el anticuerpo es rituximab y dicho anticuerpo se administra a una dosificacion menor que 375 mg/m2 por semana. En otro aspecto, el anticuerpo es Campath y el anticuerpo se administra a una dosificacion menor que 90 mg por semana.

El anticuerpo se une a un determinante comun de los receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3, e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK. En otra realizacion, el anticuerpo se une al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. En otra realizacion, el compuesto compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 por la

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union a un receptor KIR en la superficie de un linfocito NK humano. En otra realizacion, el compuesto es el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 o un fragmento del mismo.

En otro aspecto, la presente solicitud divulga un metodo para aumentar la eficacia de un tratamiento que implica la administracion de un anticuerpo terapeutico que puede unir CD16 en un sujeto, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho sujeto antes de, de forma simultanea con, o despues de la administracion de dicho anticuerpo terapeutico, una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK. En un aspecto, el anticuerpo aumenta la eficacia del tratamiento mediante la potenciacion de la ADCC en dicho sujeto.

Leyendas de las figuras

Figura 1: El anticuerpo monoclonal DF200 se une a un determinante comun de diversos receptores KIR2DL humanos.

Figura 2: Reconstitucion de la lisis con el Acm (anticuerpo monoclonal) anti KIR2DL sobre la diana C1R Cw4 a la proporcion de efectoras/diana de 4/1. El anticuerpo monoclonal DF200 inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de linfocitos NK positivos para KIR2DL1 (reconstituir lisis) sobre las celulas diana positivas para Cw4.

Figura 3: Potenciacion de la ADCC mediada por Rituxan de un clon de NK positivo para KIR2DL1 sobre una llnea celular EBV positiva para Cw4 mediante el bloqueo de la interaccion KIR / hLa (complejo principal de histocompatibilidad). La citolisis de clones NK que portan KIR2DL1 se prueba frente a una llnea celular diana transformada con EBV (positiva para CD20) positiva para Cw4 a diversas proporciones de efectoras/diana (de 1 a 4) en presencia de anticuerpo anti CD20 (Rutixan) 5 pg/ml y de anticuerpo EB6 (anti KIR2DLl) 10 pg/ml; Rituxan solo; EB6 solo o sin ningun anticuerpo. En presencia del anticuerpo anti KIR2DLl (EB6) la ADCc se potencia en gran medida.

Figura 4: Potenciacion de la ADCC mediada por Campath de un clon de NK positivo para KIR2DL1 sobre una llnea celular EBV positiva para Cw4 mediante el bloqueo de la interaccion KIR / HLA. La citolisis del clon NK que porta KIR2DL1 se prueba frente a una llnea celular diana transformada con EBV (CD20 positivo) positiva para Cw4 en presencia de Campath y de anticuerpo EB6 (anti KIR2DLl) 100 pg/ml; Campath solo; EB6 solo o sin ningun anticuerpo. En presencia del anticuerpo anti KIR2DLl (EB6) la ADCC se potencia en gran medida.

Descripcion detallada de la invencion

La presente solicitud divulga un metodo para aumentar la eficacia de anticuerpos terapeuticos. De forma mas concreta, la solicitud divulga que el uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que potencia los linfocitos NK, mediante el bloqueo de un receptor inhibidor de un linfocito NK, puede aumentar significativamente la eficacia de los anticuerpos terapeuticos. De hecho, los inventores demuestran que la eficacia de multiples anticuerpos terapeuticos se puede potenciar en gran medida mediante la coadministracion de un anticuerpo dirigido frente a un receptor de linfocitos Nk inhibidor.

Por lo tanto, la solicitud divulga un metodo para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesite que comprende:

a) administrar a dicho sujeto un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK; y,

b) administrar a dicho sujeto un anticuerpo terapeutico.

El CD16 de los linfocitos NK puede unirse a dicho anticuerpo terapeutico, preferentemente a traves de su region Fc.

Preferentemente, dicho anticuerpo terapeutico tiene una porcion Fc de IgG1 humana o de IgG3 humana , en particular un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, preferentemente ademas un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo, por ejemplo, rituximab.

Se pretende que los anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean al receptor inhibidor de un linfocito NK se puedan administrar al sujeto antes, de forma simultanea con, o despues de, la administracion del anticuerpo terapeutico. El modo de administracion de los distintos anticuerpos depende de su biodisponibilidad y farmacocinetica. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico se administra dentro de una semana de la administracion de los anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean el receptor inhibidor de un linfocito NK, mas preferentemente dentro de 5 dlas o de 2 dlas. Preferentemente, el anticuerpo terapeutico se administra antes o de forma simultanea con los anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean al receptor inhibidor de un linfocito NK.

En un aspecto adicional, la solicitud divulga un metodo para aumentar la ADCC en un sujeto que recibe un

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tratamiento con anticuerpo terapeutico, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho sujeto antes de, de forma simultanea con, o despues de, la administracion de dicho anticuerpo terapeutico, una cantidad suficiente para aumentar la ADCC de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea al receptor inhibidor de un linfocito NK. El CD16 de los linfocitos NK puede unirse a dicho anticuerpo terapeutico, preferentemente a traves de su region Fc. Preferentemente, dicho anticuerpo terapeutico tiene una porcion Fc de IgG1 humana o de IgG3 humana, en particular un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, preferentemente ademas un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo, por ejemplo rituximab.

En un aspecto adicional, la solicitud divulga un metodo para aumentar en un sujeto la eficacia de un tratamiento con anticuerpo terapeutico, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho sujeto antes de, de forma simultanea con, o despues de, la administracion de dicho anticuerpo terapeutico una cantidad de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea al receptor inhibidor de un linfocito NK, suficiente para aumentar la eficacia de dicho anticuerpo terapeutico. CD16 puede unirse a dicho anticuerpo terapeutico, preferentemente a traves de su region Fc. Preferentemente, dicho anticuerpo terapeutico tiene una porcion Fc de IgG1 humana o de IgG3 humana, en particular un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, ademas preferentemente un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo, por ejemplo rituximab.

DEFINICIONES

Como se utiliza en el presente documento, los siguientes terminos tienen los significados atribuidos a los mismos a menos que se especifique otra cosa.

Como se utiliza en el presente documento, linfocitos "NK" se refiere a una subpoblacion de linfocitos que esta implicada en la inmunidad no convencional. Los linfocitos NK se pueden identificar en virtud de determinadas caracterlsticas y propiedades biologicas, tales como la expresion de antlgenos de superficie especlficos incluyendo CD16, CD56 y/o CD57, la ausencia del complejo TCR alfa/beta o gamma/delta en la superficie celular, la capacidad de unirse a, y destruir, celulas que fracasan en expresar antlgenos MHC/HLA "propios" mediante la activacion de enzimas citollticas especlficas, la capacidad de destruir celulas tumorales u otras celulas enfermas que expresan un ligando para los receptores activadores de NK y la capacidad para liberar moleculas de protelnas denominadas citocinas que estimulan o inhiben la respuesta inmunitaria. Se puede utilizar cualquiera de estas caracterlsticas y actividades para identificar linfocitos NK, utilizando metodos bien conocidos en la tecnica.

El termino "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos se asignan a una de cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Varias de estas se dividen adicionalmente en subclases o isotipos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y similares. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) a modo de ejemplo comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto de dos parejas identicas de cadenas polipeptldicas, teniendo cada pareja una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). El extremo N de cada cadena define una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos, que es la principal responsable del reconocimiento de antlgenos. Las expresiones cadena ligera variable (Vl) y cadena pesada variable (Vh) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan respectivamente "alfa", "delta", "epsilon" "gamma" y "mu". Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de distintas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. IgG y/o IgM son las clases preferentes de los anticuerpos empleados en la presente invencion, siendo IgG particularmente preferente, debido a que son los anticuerpos mas comunes en la situation fisiologica, debido a que son los que se fabrican de forma mas facil en el contexto de un laboratorio y debido a que los receptores de Fc gamma reconocen especlficamente las IgG. Preferentemente, el anticuerpo de la presente invencion es un anticuerpo monoclonal. Son particularmente preferentes los anticuerpos humanizados, quimericos, humanos o adecuados de otra forma para los seres humanos.

Dentro del contexto de la presente invencion, de forma mas concreta, la expresion "anticuerpo o anticuerpos terapeuticos" designa cualquier anticuerpo que funcione para empobrecer celulas diana en un paciente. En particular, los anticuerpos terapeuticos se unen especlficamente a los antlgenos presentes en la superficie de las celulas diana, por ejemplo antlgenos tumorales especlficos presentes de forma predominante o de forma exclusiva en celulas tumorales. Preferentemente, los anticuerpos terapeuticos incluyen porciones Fc de ser humano o tienen la capacidad de interactuar con los receptores de Fc humanos. Los anticuerpos terapeuticos se pueden dirigir a las celulas diana por cualquier medio, por ejemplo la ADCC o, de otro manera, y pueden estar "desnudos", es decir, sin fracciones conjugadas, o se pueden conjugar con compuestos tales como marcadores radiactivos o toxinas.

La expresion "se une especlficamente a" significa que un anticuerpo se puede unir preferentemente al companero de union en un ensayo de union competitiva, por ejemplo, un receptor de NK activador tal como NKp30, NKp44 o NKp46, o un receptor de Fc gamma humano, segun se evalua utilizando ya sea formas recombinantes de las protelnas, epltopos de las mismas o protelnas naturales presentes en la superficie de linfocitos NK aislados o de celulas diana relevantes. Mas adelante se describen adicionalmente y son bien conocidos en la tecnica ensayos de union competitiva y otros metodos para determinar la union especlfica.

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Un anticuerpo "adecuado para el ser humano" se refiere a cualquier anticuerpo, anticuerpo derivatizado o fragmento de anticuerpo que se puede utilizar de forma segura en seres humanos en, por ejemplo, los metodos terapeuticos descritos en el presente documento. Los anticuerpos adecuados para seres humanos incluyen todos los tipos de anticuerpos humanizados, quimericos o totalmente humanos, o cualesquiera anticuerpos en los cuales al menos una porcion de los anticuerpos se obtiene de seres humanos o se modifica de otra manera para evitar la respuesta inmunitaria que se provoca cuando se utilizan anticuerpos no humanos naturales.

En el presente documento se entiende por "fragmento inmunogenico" cualquier fragmento polipeptldico o peptldico que tenga la capacidad de producir una respuesta inmunitaria tal como (i) la generacion de anticuerpos que se unen a dicho fragmento y/o se unen a cualquier forma de la molecula que comprenda dicho fragmento, incluyendo el receptor unido a la membrana y los mutantes obtenidos del mismo, (ii) la estimulacion de una respuesta de linfocitos T que implique linfocitos T que reaccionan con el complejo bimolecular que comprende cualquier molecula MHC y un peptido obtenido de dicho fragmento y (iii) la union de vehlculos transfectados tales como bacteriofagos o bacterias que expresan genes que codifican inmunoglobulinas de mamlfero. Como alternativa, un fragmento inmunogenico tambien se refiere a cualquier construccion que tenga la capacidad de producir una respuesta inmunitaria segun se define anteriormente, tal como un fragmento peptldico conjugado con una protelna soporte mediante acoplamiento covalente, una construccion de polipeptido recombinante quimerica que comprende dicho fragmento peptldico en su secuencia de aminoacidos, e incluye especlficamente celulas transfectadas con un ADNc cuya secuencia comprende una porcion que codifica dicho fragmento.

Para los fines de la presente invencion, un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo en el cual la region marco conservada constante y variable de una o mas inmunoglobulinas de ser humano se fusiona con la region de union, por ejemplo, la CDR, de una inmunoglobulina animal. Tales anticuerpos humanizados se disenan para mantener la especificidad de union del anticuerpo no humano a partir del cual se obtienen las regiones de union, pero para evitar una reaccion inmunitaria frente al anticuerpo no humano.

Un "anticuerpo quimerico" es una molecula de anticuerpo en la cual (a) la region constante, o una porcion de la misma, se modifica, reemplaza o intercambia de tal forma que el sitio de union al antlgeno (region variable) se liga a una region constante de una clase, funcion efectora y/o especie distinta o modificada, o a una molecula totalmente distinta que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimerico, por ejemplo una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, farmaco, etc.; o (b) la region variable, o una porcion de la misma, se modifica, reemplaza o intercambia con una region variable que tenga una especificidad antigenica distinta o modificada. No obstante, en realizaciones preferentes de la presente invencion, el anticuerpo quimerico mantiene la region Fc de la inmunoglobulina, preferentemente una region Fc de ser humano, permitiendo de este modo las interacciones con los receptores Fc humanos en la superficie de las celulas diana.

Dentro del contexto de la presente invencion, linfocitos NK "potenciados", "activos" o "activados" designan linfocitos NK biologicamente activos, de forma mas particular linfocitos NK que tengan la capacidad de lisar celulas diana. Por ejemplo, un linfocito NK "activo" tiene la capacidad de destruir celulas que expresan un ligando de receptor activador de NK y fracasa en expresar antlgenos MHC/HLA "propios" (celulas incompatibles con KIR). Los ejemplos de celulas diana adecuadas para su uso en ensayos de destruccion redirigida son las celulas P815 y K562, pero se pueden utilizar y son bien conocidos en la tecnica cualquiera de varios tipos de celulas (vease, por ejemplo, Sivori et al. (1997). J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8: 1131-1135). Las celulas "potenciadas", "activas" o "activadas" tambien se pueden identificar por cualquier otra propiedad o actividad conocida en la tecnica como asociada con la actividad NK, tal como la produccion de citocinas (por ejemplo, IFN-y y TNF-a), de aumentos en los niveles de calcio intracelular libres. Para los fines de la presente invencion, linfocitos NK "potenciados", "activos" o "activados" se refieren en particular a linfocitos NK in vivo que no se inhiben a traves de la estimulacion de un receptor inhibidor, o en los cuales se ha superado tal inhibicion, por ejemplo, a traves de la estimulacion de un receptor activador.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion receptor de NK "que inhibe" o "inhibidor" se refiere a cualquier molecula en la superficie de linfocitos NK que, cuando se estimula, provoca una disminucion medible de cualquier propiedad o actividad conocida en la tecnica como asociada con la actividad NK, tal como la produccion de citosinas (por ejemplo, IFN-y y TNF-a), aumentos de los niveles de calcio libre intracelular o la capacidad para lisar celulas diana en un ensayo de destruccion redirigido segun se describe, por ejemplo, en alguna parte de la presente memoria descriptiva. Los ejemplos de tales receptores incluyen KIR2DL1, KiR2DL2/3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, LILRBl, NKG2A, NKG2C, NKG2E y LILRB5. Los metodos para determinar si un linfocito NK es activo o no se describen con mayor detalle mas adelante y son bien conocidos por aquellos expertos en la materia.

En la presente invencion, la expresion "bloquear un receptor inhibidor" se refiere a la capacidad de determinados anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos, de interactuar directamente con al menos un receptor de linfocitos NK inhibidor, por ejemplo KIR, NKG2A/C y otros enumerados en el presente documento, y las senales inhibidoras neutralizantes del receptor (en el caso de receptores inhibidores). Con los receptores inhibidores, preferentemente, el anticuerpo o un fragmento del mismo, tiene la capacidad de bloquear la interaccion entre el HLA

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y el receptor. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales. Se pueden producir mediante hibridomas o mediante celulas recombinantes modificadas tecnicamente para expresar los dominios variables y constantes deseados. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monocatenarios u otros derivados de anticuerpos que conserven la especificidad antigenica y la region bisagra inferior, o una variante de los mismos, tal como un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv. Estos pueden ser anticuerpos polifuncionales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados o variantes de los mismos.

Dentro del contexto de la presente divulgacion, un "determinante comun" designa un determinante o epltopo que se comparte por varios miembros de un grupo de receptores relacionados, por ejemplo, el grupo del receptor KIR2DL humano. El determinante o epltopo puede representar un fragmento peptldico o un epltopo conformacional compartido por dichos miembros. En una realizacion especlfica, el determinante comun comprende un epltopo que reconoce el anticuerpo monoclonal DF200, NKVSF1 o EB6.

Dentro del contexto de la presente divulgacion, la expresion anticuerpo que "se une" a un determinante comun designa un anticuerpo que se une a dicho determinante con especificidad y/o afinidad, por ejemplo, que no se une esencialmente con alta afinidad o con especificidad a otros motivos no relacionados o un determinante o estructuras en la superficie de los linfocitos NK humanos. De forma mas particular, la union de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invencion a dicho determinante se puede discriminar de la union de dicho anticuerpo a otro epltopo o determinante.

Los anticuerpos que tienen la capacidad de unirse a receptores inhibidores de linfocitos NK y evitar su estimulacion son, asl, compuestos "neutralizantes" o "inhibidores", preferentemente anticuerpos, en el sentido de que bloquean, al menos de forma parcial, la ruta de senalizacion inhibidora mediada por un receptor inhibidor de linfocitos NK, es decir, los receptores KIR o NKG2A/C. De manera mas importante, esta actividad inhibidora puede presentarse con respecto a varios tipos de receptores KIR o NKG2A/C, de tal forma que estos compuestos, preferentemente anticuerpos, se puedan utilizar en diversos sujetos con alta eficacia.

El termino "recombinante", cuando se utiliza con referencia, por ejemplo, a una celula o acido nucleico, protelna o vector, indica que la celula, acido nucleico, protelna o vector, se ha modificado mediante la introduccion de un acido nucleico o protelna heterologos o la modificacion de un acido nucleico o protelna naturales, o que la celula se obtiene de una celula modificada de esta forma. Por lo tanto, por ejemplo, las celulas recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma natural (no recombinante) de la celula o expresan genes naturales que, de otra manera, se expresan de forma anomala, se subexpresan o no se expresan en absoluto.

Dentro del contexto de la presente invencion, un sujeto o paciente incluye cualquier sujeto o paciente mamlfero, mas preferentemente un sujeto o paciente humano.

ANTICUERPOS TERAPEUTICOS

La presente solicitud proporciona el uso de compuestos que potencian linfocitos NK junto con anticuerpos terapeuticos, segun se reivindica. En la presente invencion se puede utilizar cualquiera de una gran variedad de anticuerpos terapeuticos. Se puede utilizar esencialmente, cualquier anticuerpo terapeutico, ya sea "desnudo" o conjugado con un radiomarcador, toxina u otra fraccion, o ya sea de longitud completa o un fragmento; o ya sea un anticuerpo verdadero o un derivado modificado de un anticuerpo. Preferentemente, los metodos se utilizan para potenciar la eficacia de las terapias en las cuales la actividad de los linfocitos NK desempena una funcion -no necesariamente exclusiva- en la eficacia de los anticuerpos terapeuticos administrados y, tambien, preferentemente los anticuerpos o fragmentos incluiran de forma natural, o se modificaran para que incluyan, una region Fc de ser humano u otro dominio que permita el reconocimiento especifico del anticuerpo por receptores del Fc de ser humano, por ejemplo receptores de Fc gamma.

Los presentes anticuerpos se pueden utilizar para potenciar la capacidad de los anticuerpos terapeuticos para empobrecer las celulas diana que expresan un antlgeno que reconocen de forma especlfica los anticuerpos terapeuticos. Por consiguiente, cualquier enfermedad o afeccion provocada o empeorada al menos en parte por celulas que pueden ser el objetivo de un anticuerpo terapeutico se pueden tratar utilizando los metodos descritos en el presente documento. Los ejemplos especlficos de celulas diana incluyen celulas tumorales, celulas infectadas por virus, celulas alogenas, celulas inmunocompetentes patologicas (por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, celulas presentadoras de antlgeno, etc.) implicadas en alergias, enfermedades autoinmunitarias, reacciones alogenas, etc., o incluso celulas sanas (por ejemplo, celulas endoteliales en una estrategia terapeutica anti angiogenica). Las celulas diana mas preferentes dentro del contexto de la presente invencion son celulas tumorales y celulas infectadas por virus. Los anticuerpos terapeuticos, por ejemplo, pueden mediar un efecto citotoxico o la lisis celular, en particular mediante la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC).

La ADCC requiere de receptores de leucocitos para la porcion Fc de IgG (FcyR), cuya funcion es ligar los antlgenos sensibilizados por IgG a celulas citotoxicas que portan FcyR y para desencadenar la maquinaria de activacion celular. Por lo tanto, el anticuerpo terapeutico tiene la capacidad de formar un complejo inmunitario. Por ejemplo, un complejo inmunitario puede ser una diana tumoral cubierta por anticuerpos terapeuticos. De forma mas particular,

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CD16 puede unirse al anticuerpo, preferentemente a traves de su region Fc. La determinacion de si un anticuerpo terapeutico se une a un receptor Fcy tal como, por ejemplo, CD16, se puede evaluar de cualquier forma adecuada, por ejemplo determinando la union a un polipeptido CD16 producido de forma recombinante o un fragmento del mismo, inmovilizado de forma opcional sobre un soporte, o por ejemplo determinando la union del anticuerpo terapeutico a una celula de la cual se sabe o se sospecha que expresa cD16.

Los anticuerpos terapeuticos pueden ser policlonales o, preferentemente, monoclonales. Pueden producirse por hibridomas o mediante celulas recombinantes modificadas tecnicamente para expresar los dominios variables y constantes deseados. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monocatenarios u otros derivados de anticuerpo que conserven la especificidad antigenica y la region bisagra inferior, o una variante de los mismos. Estos pueden ser anticuerpos polifuncionales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados, fragmentos o variantes de los mismos. Dicho fragmento o un derivado del mismo se selecciona preferentemente de un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv. Preferentemente, un fragmento es un fragmento de union a antlgeno. Los anticuerpos terapeuticos que comprenden un fragmento de anticuerpo tambien incluyen, pero sin limitacion anticuerpos biespeclficos; un ejemplo de un anticuerpo biespeclfico adecuado comprende una region de union a antlgeno especlfica para CD 16 y una region de union a antlgeno especlfica para un antlgeno tumoral. Otros formatos de anticuerpo que comprenden fragmentos incluyen derivados de un anticuerpo biespeclfico recombinante que combinan las regiones de union de dos anticuerpos distintos en una unica cadena polipeptldica, tambien denominada como BiTETM (Kufer P, et al. TRENDS in Biotechnology 204; 22(5): 238-244 y Baeuerle et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics 2003; 5(4): 413-419).

En general, los anticuerpos terapeuticos son especlficos para antlgenos de superficie, por ejemplo, antlgenos de membrana. Los anticuerpos terapeuticos mas preferentes son especlficos para antlgenos tumorales (por ejemplo, moleculas que expresan de forma especlfica las celulas tumorales), tales como CD20, CD52, ErbB2 (o HER2/Neu), CD33, CD22, CD25, MUC-1, CEA, KdR, aVp3, etc., en particular antlgenos de linfoma (por ejemplo, CD20). Los anticuerpos terapeuticos preferentemente tienen la porcion Fc de IgG1 o de IgG3 de primate humano o no humano, mas preferentemente IgG1 de ser humano.

En una realizacion, los anticuerpos incluiran las modificaciones en su porcion Fc que potencian la interaccion del anticuerpo con linfocitos NK durante la ADCC. Tales anticuerpos terapeuticos modificados ("anticuerpos modificados") en general comprenden modificaciones, preferentemente en la region Fc, que modifican la afinidad de union del anticuerpo a uno o mas FcyR. Se conocen en la tecnica los metodos para modificar anticuerpos con union modificada a uno o mas FcyR, veanse, por ejemplo, las publicaciones pCt n. ° WO 2004/016750 (Solicitud Internacional PCT/US2003/025399), WO 99/158572, WO 99/151642, WO 98/123289, WO 89/107142, WO 88/107089 y las patentes de Estados Unidos n. ° 5.843.597 y 5.642.821.

Los anticuerpos terapeuticos identificados en el presente documento, tales como D2E7 (Cambridge Antibody Technology Group, plc (Cambridge,UK)/BASF (Ludwigshafen, Alemania)), utilizado para tratar la artritis reumatoide, o Infliximab (Centocor, Inc., Malvern, PA; utilizado para tratar la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide), o los anticuerpos divulgados en la Solicitud de Patente Internacional WO 2004/016750, se pueden modificar segun se ensena en las solicitudes identificadas anteriormente y mas adelante, y se utilizan para el tratamiento de enfermedades para las cuales se utilizan normalmente tales anticuerpos. En algunas realizaciones, la invencion proporciona anticuerpos modificados que tienen una afinidad modificada, una afinidad ya sea superior o inferior, por un FcyR activador, por ejemplo, FcyRiII. En determinadas realizaciones preferentes, se proporcionan anticuerpos modificados que tienen afinidad mas alta por FcyR. Preferentemente, tales modificaciones tambien tienen una funcion efectora mediada por Fc alterada.

Se conocen bien en la tecnica las modificaciones que afectan la funcion efectora mediada por Fc (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n. ° 6.194.351). Los aminoacidos que se pueden modificar incluyen, pero sin limitacion, la prolina 329, la prolina 331 y la lisina 322. La prolina 329 y/o 331 y la lisina 322 pueden, preferentemente, reemplazarse por alanina, sin embargo, tambien se contempla la sustitucion con cualquier otro aminoacido. Vease la Publication Internacional n. °: WO 00/142072 y el documento U.S. 6.194.551.

Por lo tanto, la modification de la region Fc puede comprender una o mas modificaciones en los aminoacidos encontrados en la region Fc del anticuerpo. Tales modificaciones pueden dar como resultado un anticuerpo con una funcion efectora mediada por anticuerpo modificada, una union modificada a otros receptores de Fc (por ejemplo, los receptores de activation de Fc), una actividad ADCC modificada, una actividad de union a Clq modificada, una actividad de citotoxicidad dependiente del complemento modificada o cualquier combination de los mismos.

En una realizacion, el anticuerpo se reconoce de forma especlfica por un receptor Fc gamma tal como FCGR3A (tambien denominado CD16, FCGR3, receptor de Fc de inmunoglobulina G III; IGFR3, receptor para el fragmento Fc de IgG, Ilia de baja afinidad; vease, por ejemplo, OMIM 146740), FCGR2A (tambien denominado CD32, CDw32, receptor para el fragmento Fc de IgG, iia de baja afinidad, FCG2, receptor de Fc de inmunoglobulina G II; vease, por ejemplo, OMIM 146790), FCGR2B (tambien denominado CD32, receptor para el fragmento Fc de IgG, iib de baja afinidad; FCGR2B, FC-gamma-RIIB; vease, por ejemplo OMIM 604590), FCG1RA (tambien denominado CD64; receptor para el fragmento Fc de IgG, ia de alta afinidad; IGFR1; vease, por ejemplo, OMIM 146760); el fragmento

FCGR1 de IgG, Ic de alta afinidad, receptor de Fc de inmunoglobulina G IC, IGFRC; vease, por ejemplo, OMIM 601503) o FCGR1B (tambien denominado CD64, receptor para el fragmento Fc de IgG, lb de alta afinidad; receptor de Fe de inmunoglobulina G IB, IGFRB; vease, por ejemplo, OMIM 601502).

5 Los ejemplos tlpicos de anticuerpos terapeuticos de la presente invencion son rituximab, alemtuzumab y trastuzumab. Tales anticuerpos se pueden utilizar de acuerdo con protocolos cllnicos que se hayan autorizado para su uso en sujetos humanos. Los ejemplos especlficos adicionales de anticuerpos terapeuticos incluyen, por ejemplo, epratuzumab, basiliximab, daclizumab, cetuximab, labetuzumab, sevirumab, tuvurimab, palivizumab, infliximab, omalizumab, efalizumab, natalizumab, clenoliximab, etc. De forma opcional, cuando un compuesto que estimula un 10 receptor activador de un linfocito NK es una citocina, el anticuerpo terapeutico es un anticuerpo que no es rituximab o herceptin o, de forma opcional, otro que no sea un anticuerpo anti CD20 o anti HER2/neu. Otros ejemplos de anticuerpos terapeuticos preferentes para su uso en conformidad con la invencion incluyen anticuerpos anti ferritina (Publicacion de Patente de Estados Unidos n. ° 2002/0106324), anticuerpos anti p140 y anti sc5 (documento WO 02/50122) y anticuerpos anti KIR (receptor de linfocitos NK) (los receptores KIR se describen en Carrington y 15 Norman, The KIR Gene Cluster, 3 de mayo de 2003, disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books). Otros ejemplos de anticuerpos terapeuticos se enumeran en la siguiente tabla, cualquiera de los cuales (y otros) se puede utilizar en los presentes metodos. Se apreciara que, sin importar que se enumeren o no en la siguiente tabla o se describan en algun lugar de la presente memoria descriptiva, cualquier anticuerpo que pueda empobrecer celulas diana, preferentemente mediante ADCC, puede obtener beneficio de los presentes metodos, y que la siguiente Tabla 20 1 no es exhaustiva, ni con respecto a los anticuerpos enumerados en ella, ni con respecto a las dianas o

indicaciones de los anticuerpos que se enumeran.

Tabla 1: Anticuerpos terapeuticos

Especificidad del Ab

DCI Nombre comercial Indicaciones tlpicas

Anti CD20

rituximab MabThera®, Rituxan® NHL B

Anti CD20

Zevalin NHL

Anti CD20

Bexocar NHL

Anti CD52

alemtuzumab CAMPATH-1H® LLC, aloinjertos,

Anti CD33

SMART-M195 LMA

Anti CD33

ZamyITM Leucemia mieloide aguda

Anti antlgeno HLA-DR

SMART-ID 10 NHL

Anti HLA-DR

RemitogenTM NHL B

Anti CD22

epratuzumab LymphoCide™ NHL B

Anti HER2

MDX-210 cancer de prostata y otros canceres

Anti erbB2 (HER-2/neu)

trastuzumab Herceptin®, Cancer de mama metastasico

Anti CA125

OvaRex Cancer ovarico

Anti MUC1

TriAb Cancer de mama metastasico

Anti MUC1

BravaRex Canceres metastasicos

Anti antlgeno PEM

Theragyn, Therex Cancer ovarico, cancer de mama

Anti CD44

bivatuzumab cancer de cabeza y cuello

Anti gp72

MAb, 105AD7 idiotlpico Cancer colorrectal

Anti EpCAM

Anti EpCAM; MT201 IS-IL2 Cancer

Anti VEGF

MAb-VEGF NPNM metastasico, cancer colorrectal

Anti CD18

Fab de AMD Degeneracion macular relacionada con la edad

Anti CD18

Anti CD18

Infarto de miocardio

Anti receptor de VEGF

IMI-1 cl I Cancer colorrectal

anti nuC242

nuC242-DMI Cancer colorrectal, gastrico y pancreatico

Anti EGFR

MAb425 Cancer

Anti EGFR

ABX-EGF Cancer

Anti EGFR

cetuximab Canceres de GNO y colorrectal

(HER-1, erbB1)

Anti MUC-1

Therex® Canceres de mama y epitelial

Anti CEA

CEAVac Cancer colorrectal

Anti CEA

labetuzumab CEA-CideTM Tumores solidos

Anti aVp3

Vitaxin Ieiomiosarcoma, cancer colorrectal y otros (anti angiogenicos)

Anti KDR (VEGFR2)

Canceres (anti angiogenicos)

Protelna de fusion anti VRS

palivizumab Synagis® Enfermedades vlricas

Idem

Numax™

Idem

CMV

sevirumab Protovir Infeccion por CMV

HBs

tuvirumab Ostavir™ Hepatitis B

Anti CD25

basiliximab Simulect® Prevencion/tratamiento del rechazo a aloiniertos

Anti CD25

daclizumab Zenapax® Prevencion/tratamiento del rechazo a aloiniertos

Anti TNF-a

infliximab RemicadeTM Enfermedad de Crohn, artritis reumatoide

Anti CD80

IDEC-114 psoriasis

Anti IgE

E-26 Asma alergica y rinitis

Anti IgE

omalizumab Xolair™ Asma

Anti IgE

Rhu-MAb E25 Alergia/asma

Anti integrina aL (CD11a, LFA-I)

efalizumab XanelimTM psoriasis

Anti integrina beta 2

LDP-01 Ictus, rechazo a aloiniertos

Anti integrina aL 11a, LFA- I)

anti CDlla psoriasis

Anti CD4

keliximab siplizumab MEDI-507 GVHD, psoriasis

Anti CD4

0KT4A Rechazo a aloiniertos

Anti CD3

OKT 3 Rechazo a aloiniertos

Anti CD3

SMART-aCD3 Enfermedad autoinmunitaria, rechazo a aloiniertos, psoriasis

Anti CD64

Anemia

Anti CD147

GVHD

Anti integrina a4 (a4p1- a437)

natalizumab Antegren® Esclerosis multiple, Crohn

Anti integrina 37

Crohn, colitis ulcerosa

Alfa 4 beta 7

LDP-02 Colitis ulcerosa

Anti HLA- DR10 beta

Oncolym NHL

Anti CD3

Nuvion Neoplasias de linfocitos T

Anti gangliosido GD2

Trigem Melanoma metastasico y cancer de pulmon microcltico

Anti antlgeno SK-1

Carcinoma colorrectal y pancreatico

Anti CD4*

clenoliximab

Anti IL-8

ABX-IL8 psoriasis

Anti VLA-4

Antegren MS

Anti CD40L

Antova SLE, rechazo a aloiniertos

Anti CD40L

IDEC-131 MS, SLE

Anti selectina E

CDP850 psoriasis

Anti CD11/CD18

Hu23F2G MS, ictus

Anti ICAM-3

ICM3 psoriasis

Anti CBL

ABX-CBL GVHD

Anti CD147

Anti CD23

IDEC-152 Asma, alergias

Anti CD25

Simulect Rechazo a aloiniertos

Anti T1-ACY

ACY-110 Cancer de mama

Anti TTS

TTS-CD2 Cancer pancreatico, renal

Anti TAG72

AR54 Cancer de mama, ovarico, de pulmon

Anti CA19.9

GivaRex Colorrectal, pancreatico, gastrico

Anti PSA

ProstaRex Cancer prostatico

Anti HMFG1

R1550 Cancer de mama, gastrico

pemtumomab Theragyn Cancer gastrico, ovarico

Anti GCh

CTP-16, CTP- 21 Multiples canceres

Anti colageno de tipos 1-V

HU177; HUIV26; XL313 Multiples canceres

Anti CD46

Crucell/J&J Multiples canceres

Anti 17A-1

Edrecolomab Panorex Cancer Colorrectal

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Anti HM1.24

AHM Mieloma multiple

Anti CD38

Anti CD38

Mieloma multiple

Anti receptor de IL 15

Linfoma HuMax Linfoma

Anti IL6

B-E8 Linfoma

Anti TRAIL-R1

TRM-1 Multiples canceres

Anti VEGF2

Multiples canceres

Anti BlyS

Linfostat Multiples canceres

Anti SCLC, CEA y DTPA

Pentacea Cancer de pulmon

Anti CD52

CAMPATH Leucemia, Linfoma

Anti antlgeno de Lewis Y

1GN311 Canceres epiteliales

Anti cadherina VE

E4G10 Multiples canceres

Anti CD56

BB10901, huN901DC1 Cancer colorrectal, de pulmon

Anti mertansina/mucina

Cantuzumab Cancer colorrectal, pulmonar, pancreatico

Anti AFP

AFP-cide Cancer hepatico

Anti CSAp

Mu-9 Cancer colorrectal

Anti CD30

MDX-060 Melanoma, enfermedad de Hodgkin

Anti PSMA

MDX-070 Cancer prostatico

Anti CD15

MDX-11 Leucemia

Anti TAG72

MDX-020 Cancer colorrectal

Anti CD19, CD3 biespeclfico

MT103 Linfoma

Anti antlgeno mesotelina

SS1-PE38 Cancer de cerebro y ovarico, mesotelioma

Anti ADN e histonas

Cotara Canceres colorrectal, pancreatico, sarcoma, de cerebro y otros

Anti Integrina a5B1

Anti a5 B1 Multiples canceres

Anti p97

SGN17/19 Melanoma

Anti CD5

Genimune Leucemia, linfoma

COMPUESTOS QUE REGULAN LA ACTIVIDAD DE LOS LINFOCITOS NK

La actividad de los linfocitos NK esta regulada por un mecanismo complejo que implica senales estimuladoras e inhibidoras. Por consiguiente, la terapia mediada por linfocitos NK eficaz puede lograrse mediante una estimulacion de estas celulas o de una neutralization de senales inhibidoras. Tambien se apreciara que el mecanismo mediante el cual los receptores se bloquean no es crltico para las ventajas que proporciona la invention. Los anticuerpos pueden unirse de forma directa a los receptores e inhibirlos (en el caso de los receptores inhibidores). El parametro crltico es el efecto que los anticuerpos tienen sobre la capacidad de los anticuerpos terapeuticos de empobrecer sus celulas diana in vivo.

Los receptores inhibidores especlficos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en ingles) de clase I regulan de forma negativa a los linfocitos NK (Karre et al., 1986; Ohlen et al., 1989). Estos receptores especlficos se unen a determinantes polimorficos de las moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I o HLA e inhiben la lisis de linfocitos citollticos naturales (NK). En seres humanos, una familia de receptores denominados receptores similares a Ig de linfocitos citollticos naturales (los KIR) reconoce grupos de alelos del HLA de clase I.

Existen varios grupos de receptores KIR, incluyendo KIR2DL, KIR2DS, KIR3DL y KIR3DS. Los receptores KIR que tienen dos dominios de Ig (KIR2D) identifican los alotipos HLA-C: KIR2DL2 (anteriormente designado p58.1) o el producto genico estrechamente relacionado KIR2DL3, reconoce un epltopo compartido por los alotipos del HLA-C del grupo 2 (Cwl1, 3, 7 y 8), mientras que KIR2DL1 (p58.2) reconoce un epltopo compartido por los alotipos del HLA- C de grupo 1 reclprocos (Cw2, 4, 5 y 6). El reconocimiento mediante KIR2DL1 se estipula por la presencia de un resto Lys en la position 80 de los alelos del HLA-C. El reconocimiento mediante KIR2DL2 y KIR2DL3 se estipula por la presencia de un resto Asn en la posicion 80. Notablemente, la gran mayorla de alelos del HLA-C tienen ya sea un resto Asn o uno Lys en la posicion 80. Un KIR con tres dominios de lg, KIR3DL1 (p70), reconoce un epltopo compartido por los alelos del HLA-Bw4. Por ultimo, un homodlmero de moleculas con tres dominios de Ig, KIR3DL2 (p140), reconoce HLA-A3 y A-11.

Aunque los linfocitos NK pueden coexpresar los KIR y otros receptores inhibidores de clase I (Moretta et al., 1997; Valiante et al., 1997; Lanier, 1998), en cualquier repertorio de NK de un individuo dado existen celulas que expresan un unico KIR y, asl, los linfocitos NK correspondientes se bloquean unicamente por celulas que expresan un grupo de alelos de clase I especlfico. Por consiguiente, como se describira mas adelante, cuando se tienen como objetivo los receptores inhibidores, los presentes metodos con frecuencia implicaran la administration de anticuerpos que se

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dirijan a multiples receptores inhibidores, asegurando de este modo un efecto extenso que alcance una maxima variedad de linfocitos NK.

Preferentemente, un anticuerpo o un fragmento del mismo que bloquea el receptor inhibidor de un linfocito NK es un anticuerpo o un fragmento del mismo, que neutraliza la senal inhibidora de KIR2DL2, KIR2DL3 y KIR2DL1.

La solicitud tambien divulga el uso de una combinacion de varios anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloqueen distintos receptores inhibidores de linfocitos NK. Preferentemente, los anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloqueen receptores inhibidores de linfocitos NK son especlficos de un receptor inhibidor seleccionado de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A y NKG2C, y tienen la capacidad de inhibir la inhibition mediada por KIR o NKG2A/C relacionada de la citotoxicidad de linfocitos NK.

En un aspecto preferente se utilizan anticuerpos monoclonales, as! como fragmentos y derivados de los mismos, en el que dicho anticuerpo, fragmento o derivado reacciona de forma cruzada con varios KIR en la superficie de los linfocitos NK, como se reivindica, y neutraliza sus senales inhibidoras.

En una realization, se utiliza un anticuerpo monoclonal que se une a un determinante comun de receptores KIR2DL humanos, segun se reivindica, e inhibe Ia ruta inhibidora correspondiente. En una realizacion especlfica, el anticuerpo monoclonal se une a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL2/3 en la superficie de los linfocitos NK humanos e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL1 y KIR2DL2/3 de la citotoxicidad de linfocitos NK. El anticuerpo inhibe de forma especlfica la union de moleculas del HLA-C a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Mas preferentemente, el anticuerpo facilita la actividad de los linfocitos NK in vivo. Debido a que KIR2DL1 y KID2DL3 (o KIR2DL2) son suficientes para incluir la mayorla de los alotipos de HLA-C, los alotipos del HLA-C de grupo I y los alotipos del HLA- C de grupo 2 respectivamente, tales anticuerpos se pueden utilizar para aumentar la eficacia de un anticuerpo terapeutico en la mayorla de individuos humanos, normalmente en aproximadamente el 90 % de los individuos humanos, o mas. En tal realizacion, se puede utilizar en conformidad con la invention cualquiera de los anticuerpos descritos en la Solicitud de Patente PCT WO 2005/003172, presentada el 1 de julio de 2004, titulada "Compositions and methods for regulating NK cell activity".

En un aspecto particular de la presente divulgation, el anticuerpo que bloquea el receptor inhibidor de un linfocito NK es un anticuerpo monoclonal, en el que dicho anticuerpo se une a un determinante comun de los receptores KIR2DL humanos e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL de Ia citotoxicidad de linfocitos NK. El anticuerpo se une de forma mas especlfica al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 y/o compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 por la union a un receptor KIR en la superficie de un linfocito NK humano. Segun se analiza, los ejemplos de anticuerpos, ensayos funcionales y ensayos para determinar si los anticuerpos compiten por la union a dichos anticuerpos se describen en la Solicitud de Patente PCT WO 2005/003172.

En una aspecto especlfico, el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. En otros aspectos, el anticuerpo es un fragmento o derivado del anticuerpo DF200. El hibridoma que produce el anticuerpo DF200 se ha depositado en la coleccion de cultivos CNCM, con el n.° de identification "DF200", n.° de referencia CNCM 1-3224, registrado el 10 de junio de 2004, Collection Nationale de Cultures de Microorganismos, Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, Francia.

La union de cualquier compuesto a cualquiera de los receptores de linfocitos NK descritos en el presente documento se puede detectar utilizando cualquiera de diversos metodos convencionales. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de tipo ELISA colorimetricos, como puede utilizarse inmunoprecipitacion y radioinmunoensayos. Se pueden emplear ensayos de competition, por ejemplo, para comparar la union de un compuesto de prueba con un compuesto conocido, para unirse a un receptor de linfocitos NK, en los cuales el control (por ejemplo, BAB281, que se une de forma especlfica a NKp46) y los compuestos de prueba se combinan (o se preadsorben) y se aplican a una muestra que contiene la protelna que contiene el epltopo, por ejemplo, NKp46 en el caso de BAB281. Los protocolos a base de ELISA, radioinmunoensayos, transferencia de Western y el uso de BIACORE, son adecuados para su uso en tales estudios de competicion simple y son bien conocidos en la tecnica.

La inhibicion de la inhibicion mediada por KIR o NKG2A/C de la citotoxicidad de linfocitos NK de linfocitos NK, se puede evaluar mediante diversos ensayos o pruebas, tales como ensayos de union, citotoxicidad y otros moleculares o celulares.

En una realizacion especlfica, la actividad inhibidora se ilustra por la capacidad de dicho anticuerpo para reconstituir la lisis de los clones de NK positivos para KIR en las dianas positivas para HLA-C. En otra realizacion especlfica, el anticuerpo se define como que inhibe la union de moleculas de HLA-C a los receptores KIR2DL1 y KIR2DL3 (o el KIR2DL2 relacionado estrechamente), como ademas preferentemente su capacidad para modificar la union de una molecula de HLA-C seleccionada de Cw1, Cw3, Cw7 y Cw8 (o de una molecula de HLA-C que tenga un resto Asn en la position 80) a KIR2DL2/3; y la union de una molecula de HLA-C seleccionada de Cw2, Cw4, Cw5 y Cw6 (o de una molecula de HLA-C que tenga un resto Lys en la posicion 80) a KIR2DL1.

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La actividad inhibidora o de potenciacion de un anticuerpo, se puede evaluar de cualquiera de diversas formas, por ejemplo, por su efecto sobre el calcio libre intracelular segun se describe, por ejemplo, en Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136. La actividad de los linfocitos NK tambien se puede evaluar utilizando ensayos de citotoxicidad basados en celulas, por ejemplo, midiendo la liberacion de cromo, tal como evaluando la capacidad del anticuerpo para estimular los linfocitos Nk para destruir celulas diana tales como celulas P815, K562, o celulas tumorales apropiadas segun se expone en Sivori et al. (1997) J. Exp. Med. 186: 1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med. 188: 953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun. 8: 11311135); Pende et al. (1999) J. Exp. Med.190: 1505-1516). Tambien se proporcionan ensayos de citotoxicidad adecuados en la seccion de ejemplos de la presente memoria descriptiva. En una realizacion preferente, los anticuerpos provocan al menos un aumento del 10 % en la citotoxicidad NK, preferentemente al menos un aumento del 40 % o 50 % en la citotoxicidad NK, o mas preferentemente al menos un aumento del 70 % en la citotoxicidad NK.

La actividad de linfocitos NK tambien se puede evaluar utilizando un ensayo de liberacion de citocinas, en el que los linfocitos NK se incuban con el anticuerpo para estimular la produccion de citocinas de linfocitos NK (por ejemplo, la produccion de IFN-y y TNF-a). En un protocolo a modo de ejemplo, la produccion de IFN-y procedente de CMSP se evalua por la tincion de la superficie celular e intracitoplasmica, y el analisis mediante citometrla de flujo despues de 4 dlas de cultivo. En resumen, se anade Brefeldina A (Sigma Aldrich) a una concentracion final de 5 pg/ml durante las ultimas 4 horas de cultivo. Despues, las celulas se incuban con Acm de anti CD3 y anti CD56 antes de la permeabilizacion (IntraPrepTM; Beckman Coulter) y se tinen con PE-anti IFN-y o PE-IgG1 (Pharmingen). Utilizando ELISA (GM-CSF: DuoSet Elisa, R&D Systems, Minneapolis, MN; IFN-y: equipo OptElA, Pharmingen) se midio en los sobrenadantes la produccion de GM-CSf e IFN-y de los linfocitos NK activados policlonales.

En un aspecto preferente, se evalua la capacidad del anticuerpo para activar los linfocitos NK humanos, en donde la capacidad para activar linfocitos NK humanos, as! como linfocitos NK no humanos, indica que los compuestos son adecuados para su uso de acuerdo con la presente divulgacion. En particular, se puede evaluar la capacidad del compuesto para potenciar la capacidad de los anticuerpos terapeuticos para dirigir el empobrecimiento de celulas diana adecuadas mediante linfocitos NK in vitro o in vivo.

Los anticuerpos pueden presentar una actividad inhibidora parcial, por ejemplo, reducir parcialmente la inhibicion mediada por KIR2DL de la citotoxicidad de linfocitos NK. Los anticuerpos mas preferentes tienen la capacidad de inhibir al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30 %, 40 % o 50 % o mas de la actividad de los linfocitos NK, por ejemplo, segun se mide en un ensayo de toxicidad celular, en comparacion con las celulas en ausencia del anticuerpo. Tambien es preferente que el anticuerpo pueda proporcionar un aumento del empobrecimiento de celulas diana en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 %, o mas con respecto al nivel de empobrecimiento en ausencia del anticuerpo. Como alternativa, los anticuerpos tambien tiene la capacidad de inducir la lisis de una poblacion de celulas diana coincidente o de HLA compatible o autologa, es decir, la poblacion celular que podrla no lisarse de forma eficaz mediante linfocitos NK en ausencia de dicho anticuerpo. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente divulgacion tambien se pueden definir como que facilitan de la actividad de linfocitos NK in vivo.

La solicitud tambien se relaciona con aspectos en los cuales los anticuerpos que bloquean el receptor inhibidor de un linfocito NK, son fragmentos de tal anticuerpo monoclonal que tienen substancialmente la misma especificidad antigenica, incluyendo, pero sin limitacion: un fragmento Fab, un fragmento Fab'2, una CDR y un ScFv. Ademas, el anticuerpo monoclonal puede ser humanizado, humano o quimerico (por ejemplo, un anticuerpo biespeclfico o funcionalizado). Para cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden utilizar derivados, por ejemplo, con secuencias modificadas o con grupos funcionales heterologos conjugados u otros compuestos.

Los anticuerpos que bloquean el receptor inhibidor de un linfocito NK de acuerdo con la divulgacion se pueden producir mediante diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Normalmente, se producen mediante la inmunizacion de un animal no humano con un inmunogeno que comprende un polipeptido KIR o un fragmento inmunogenico del polipeptido, y una recoleccion de celulas esplenicas (para producir hibridomas mediante la fusion con llneas celulares apropiadas). Los metodos para producir anticuerpos monoclonales procedentes de diversas especies son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow et al., "Antibodies: A laboratory Manual," CSH Press, 1988; Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Ademic Press, 1986). De forma mas especlfica, estos metodos comprenden inmunizar un animal no humano con el antlgeno, seguido de una recuperacion de celulas esplenicas que despues se fusionan con celulas inmortalizadas, tales como celulas de mieloma. Los hibridomas resultantes producen los anticuerpos monoclonales y se pueden seleccionar mediante diluciones limitantes para aislar clones individuales. Los anticuerpos tambien se pueden producir mediante la seleccion de bibliotecas combinatorias de inmunoglobulinas, segun se divulga por ejemplo en Ward et al. (1989).

Los anticuerpos preferentes que bloquean el receptor inhibidor de un linfocito NK de acuerdo con la divulgacion se preparan mediante inmunizacion con un inmunogeno que comprende un receptor de linfocitos NK inhibidor, por ejemplo, un polipeptido KIR2DL, mas preferentemente un polipeptido KIR2DL humano. El polipeptido KIR2DL puede comprender la secuencia de longitud completa de un polipeptido KIR2DL humano, o un fragmento o derivado del mismo, normalmente un fragmento inmunogenico, es decir, una porcion del polipeptido que comprende un epltopo,

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preferentemente un epltopo de linfocitos T o B. Normalmente, tales fragmentos contienen al menos 7 aminoacidos consecutivos de la secuencia polipeptldica madura, incluso mas preferentemente al menos 10 aminoacidos consecutivos de la misma. Se obtienen esencialmente del dominio extra celular del receptor. En una realizacion preferente, el inmunogeno comprende KIR2DL humano tipo silvestre, en una membrana lipldica, normalmente en la superficie de una celula. En una realizacion especlfica, el inmunogeno comprende linfocitos NK intactos, en particular linfocitos NK humanos intactos, de forma opcional tratados o lisados.

Mientras que los anticuerpos terapeuticos pueden tener regiones Fc modificadas para potenciar su union mediante a los receptores tales como CD16, en determinadas realizaciones los anticuerpos potenciadores de linfocitos NK tendran regiones Fc modificadas para reducir su afinidad por los receptores Fc, reduciendo de este modo la probabilidad de que los linfocitos NK unidos por los anticuerpos se unan y lisen ellos mismos.

Los anticuerpos que bloquean los receptores KIR2DL de linfocitos NK se pueden producir mediante metodos que comprenden: i) inmunizar un mamlfero no humano con un inmunogeno que comprende un polipeptido KIR2DL; ii) preparar anticuerpos monoclonales procedentes de dicho animal inmunizado, en los que dichos anticuerpos monoclonales se unen a dicho polipeptido KIR2DL; iii) seleccionar los anticuerpos monoclonales procedentes de la etapa ii) que reaccionan de forma cruzada con al menos dos serotipos distintos de los polipeptidos KIR2DL y iv) seleccionar los anticuerpos monoclonales de (iii) que inhiben la inhibicion mediada por KIR2DL de los linfocitos NK.

El orden de las etapas (iii) y (iv) se puede cambiar. De forma opcional, el metodo puede comprender, ademas, etapas adicionales para la fabricacion de fragmentos o derivados del anticuerpo monoclonal, segun se divulga mas adelante.

En otra variante, el metodo comprende: i) seleccionar, a partir de una biblioteca o repertorio, un anticuerpo monoclonal o un fragmento o derivado del mismo que reaccione de forma cruzada con al menos dos serotipos distintos de polipeptidos KIR2DL; y ii) seleccionar un anticuerpo de la etapa i) que inhiba la inhibicion mediada por KIR2DL de los linfocitos NK.

En una realizacion preferente, el animal no humano utilizado en estos metodos, o utilizados en la produccion de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, es un mamlfero, tal como un roedor (por ejemplo, raton, rata, etc.), bovino, porcino, caballo, conejo, cabra, oveja, etc.

Ademas, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento se puede modificar geneticamente o modificar tecnicamente para que sean adecuados para el ser humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados, quimericos o humanos. Se conocen bien en la tecnica los metodos para humanizar anticuerpos. En general, un anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invencion tiene uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el, procedentes del anticuerpo original. Estos restos de aminoacido murinos u otros no humanos se denominan con frecuencia como restos "de importacion", que normalmente se toman de un dominio variable "de importacion". La humanizacion se puede realizar esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., (1986) Nature 321: 522; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534 (1988)). En algunos casos, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (Cabilly et al., patente de Estados Unidos n.° 4.816.567), en los que se ha sustituido substancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente del anticuerpo original. En la practica, los anticuerpos humanizados de acuerdo con la presente invencion normalmente son anticuerpos humanos en los cuales algunos restos de la CDR y posiblemente algunos restos de la FR se sustituyen por restos procedentes de sitios analogos en el anticuerpo original.

Otro metodo para fabricar anticuerpos monoclonales "humanizados" es utilizar un XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) como el raton utilizado para la inmunizacion. Un XenoMouse es un hospedador murino en el que se ha reemplazado los genes de inmunoglobulina por genes de inmunoglobulina humana funcional. Por lo tanto, los anticuerpos producidos por este raton o en hibridomas fabricados a partir de linfocitos B de este raton, ya estan humanizados. El XenoMouse se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6.162.963. Se puede conseguir un metodo analogo utilizando un HuMAb-Mouse™ (Medarex).

Los anticuerpos humanos tambien se pueden producir de acuerdo con otras diversas tecnicas, tales como utilizando para la inmunizacion otros animales transgenicos que se hayan modificado tecnicamente para expresar un repertorio de anticuerpos humanos (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), o mediante la seleccion de repertorios de anticuerpos utilizando metodos de presentacion en fagos. Estas tecnicas son conocidas para el experto en la materia y se pueden implementar comenzando a partir de los anticuerpos monoclonales, segun se divulga en la presente solicitud.

Los anticuerpos de la presente solicitud tambien se pueden derivatizar a anticuerpos "quimericos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porcion de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en el anticuerpo original, mientras que la cadena (o cadenas) restante es identica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos obtenidos de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, as! como los fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando presenten la

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actividad biologica deseada (Cabilly et al., supra; Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851).

El anticuerpo puede ser policlonal o, preferentemente, monoclonal. El anticuerpo se puede producir mediante un hibridoma o mediante una celula recombinante modificada tecnicamente para expresar los dominios variable y constante deseados. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monocatenario u otro derivado de anticuerpo que conserve la especificidad antigenica y la region bisagra inferior o una variante del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo polifuncional, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humanizado o un fragmento o derivado del mismo. Dicho fragmento o un derivado del mismo se selecciona preferentemente de un fragmento Fab, un fragmento Fab' 2, una CDR y un ScFv. El fragmento es un fragmento union a antlgeno. Un anticuerpo que comprende un fragmento de anticuerpo tambien puede incluir, pero sin limitacion, anticuerpos biespeclficos.

COMPOSICION Y ADMINISTRACION

La solicitud tambien proporciona una composition que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea el receptor inhibidor de un linfocito NK, segun se reivindica, y un anticuerpo terapeutico, el uso de dicha composicion para aumentar la eficacia del anticuerpo terapeutico, para aumentar la ADCC en un sujeto tratado con un anticuerpo terapeutico o para tratar a un sujeto que tenga una enfermedad, de forma mas particular una enfermedad que requiera el empobrecimiento de las celulas diana, preferentemente celulas enfermas tales como celulas infectadas por virus, celulas tumorales u otras celulas patogenicas. Preferentemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en un cancer, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria y una enfermedad vlrica. La enfermedad tambien concierne a un rechazo de injerto, de forma mas particular un rechazo de aloinjerto, y una enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD).

De forma mas particular, el tratamiento de la enfermedad requiere el empobrecimiento de las celulas que se tienen como objetivo, preferentemente las celulas enfermas tales como celulas infectadas por virus, celulas tumorales u otras celulas patogenicas. Preferentemente, la enfermedad es un cancer, una enfermedad infecciosa o inmunitaria. Mas preferentemente, la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en un cancer, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad inflamatoria y una enfermedad vlrica. La enfermedad tambien concierne a un rechazo de injerto, de forma mas particular el rechazo de aloinjerto, y una enfermedad del injerto contra el hospedador (GVHD).

Dichas enfermedades incluyen la proliferation neoplasica de celulas hematopoyeticas. De forma opcional, dichas enfermedades se seleccionan del grupo que consiste en leucemia linfoblastica, leucemia mielogena aguda o cronica, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, slndrome mielodisplasico, mieloma multiple y leucemia linfocltica cronica. Dichas enfermedades tambien incluyen cancer de ONG, canceres colorrectales, cancer de mama y cancer epitelial. Dichas enfermedades incluyen infection por CMV y hepatitis B. Dichas enfermedades incluyen enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, asma, psoriasis, esclerosis multiple o diabetes. En particular, se puede tratar cualquier enfermedad enumerada en la tabla proporcionada anteriormente.

CD16 puede unirse a dicho anticuerpo terapeutico, preferentemente a traves de su region Fc. Preferentemente, dicho anticuerpo terapeutico tiene una portion Fc de IgG1 o una de IgG3 humana, en particular un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, ademas preferentemente un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo, por ejemplo, rituximab.

El anticuerpo se une a un determinante comun de los receptores KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 humanos e inhibe la inhibition mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK. En un aspecto particular, dicho anticuerpo inhibe la union de una molecula del alelo HLA-C que tiene un resto Lys en la position 80 a un receptor KIR2DL1 humano, y la union de una molecula del alelo HLA-C que tiene un resto Asn en la posicion 80 a los receptores KIR2DL2 y KIR2DL3 humanos. En una otra realization particular, este anticuerpo se une al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200. De forma opcional, este anticuerpo compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200 por la union con un receptor KIR en la superficie de un linfocito NK humano. En una realizacion preferente, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200.

La composicion de acuerdo con la presente divulgation puede comprender una combination de varios anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean distintos receptores inhibidores de linfocitos NK. Preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que bloquean los receptores inhibidores de los linfocitos NK, son especlficos de un receptor inhibidor seleccionado de KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, KIR3DL2, NKG2A y NKG2C, y tienen la capacidad de inhibir la inhibicion mediada por KIR o NKG2A/C relacionados de la citotoxicidad de linfocitos NK. Mas preferentemente, la combinacion de los anticuerpos "neutralizantes" tiene la capacidad de inhibir la inhibicion mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK. Al proporcionar una combinacion de anticuerpos, se bloqueara en un numero maximo de pacientes un numero maximo de distintos receptores inhibidores. Como se describira mas adelante, en una realizacion preferente, se puede obtener una muestra de linfocitos NK de un paciente antes de la aplicacion de los presentes metodos, y se puede evaluar el grado de reaction de los linfocitos NK a distintas combinaciones de anticuerpos, por ejemplo, en presencia de celulas diana y del anticuerpo terapeutico.

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Las composiciones de la presente invencion pueden comprender cualquier vehlcuio o excipiente farmaceuticamente aceptable, normalmente un tampon, soluciones isotonicas, suspension acuosa, de forma opcional complementados con agentes estabilizantes, conservantes, etc. Las formulaciones tlpicas incluyen una solucion salina y, de forma opcional, una molecula protectora o estabilizadores, tal como una protelna de alto peso molecular (por ejemplo, seroalbumina humana).

Tambien se proporcionan kits que comprenden cualquier combinacion de uno o mas anticuerpos terapeuticos, uno o mas anticuerpos potenciadores de linfocitos NK y, preferentemente, las instrucciones para su uso.

De acuerdo con los metodos y composiciones de la presente divulgacion, los anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquean un receptor inhibidor de un linfocito NK y los anticuerpos terapeuticos se administran en una cantidad "eficaz" o "terapeuticamente eficaz".

La cantidad eficaz de anticuerpos terapeuticos administrada al receptor puede estar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. La cantidad eficaz del anticuerpo depende, sin embargo, de la forma del anticuerpo (Ig completa o fragmentos), la afinidad del Acm y el parametro de farmacocinetica, que se deben determinar para cada anticuerpo particular.

La cantidad eficaz de anticuerpos o un fragmento de los mismos, que bloquea el receptor inhibidor de un linfocito NK, administrada al receptor, puede estar entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg. La cantidad eficaz del anticuerpo depende, sin embargo, de la forma del anticuerpo (Ig completo o fragmentos), la afinidad del Acm y los parametros farmacocineticos, que se deben determinar para cada uno de los anticuerpos particulares.

En un aspecto importante de la divulgacion, el uso de los presentes anticuerpos puede permitir conseguir una eficacia terapeutica con dosis reducidas de anticuerpos terapeuticos. El uso (por ejemplo, la dosificacion, el regimen de administracion) de los anticuerpos terapeuticos, puede estar limitado por los efectos secundarios, por ejemplo, en el caso de rituximab, fiebre, cefaleas, jadeo, disminucion de la tension arterial, y otros. Por consiguiente, mientras que en muchos pacientes se administrara una dosificacion convencional de los anticuerpos terapeuticos junto con los anticuerpos potenciadores de linfocitos NK descritos en el presente documento (es decir, la dosis recomendada en ausencia de cualesquiera otros compuestos), mejorando de este modo la eficacia de la dosificacion convencional en pacientes que necesitan incluso una mayor eficacia terapeutica, en otros pacientes, por ejemplo aquellos afectados gravemente por los efectos secundarios, la administracion de los presentes anticuerpos permitira conseguir una eficacia terapeutica a una dosificacion reducida de anticuerpos terapeuticos, evitando de este modo los efectos secundarios. En la practica, un medico experto sera capaz de determinar para un paciente dado la dosis ideal y el regimen administrativo del anticuerpo terapeutico y del compuesto potenciador de linfocitos NK, por ejemplo, la estrategia terapeutica que sera la mas apropiada a la vista de las necesidades particulares y el estado global del paciente. Estan disponibles varias referencias para guiar la determinacion de las dosificaciones apropiadas, tanto para los anticuerpos terapeuticos como para los anticuerpos potenciadores de linfocitos NK, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, por Gennaro (2003), ISBN: 0781750253; Goodman y Gilmans, The Pharmacological Basis of Therapeutics, por Hardman, Limbird y Gilman (2001), ISBN: 0071354697; Rawlins E. A., editor, "Bentley's Textbook of Pharmaceutics", Londres: Bailliere, Tindall y Cox, (1977) y otros.

En un aspecto, un medico puede reducir de forma gradual la cantidad del anticuerpo terapeutico proporcionada junto con la administracion de cualquiera de los presentes anticuerpos potenciadores de linfocitos NK, ya sea en terminos de dosificacion o de frecuencia de administracion, y controlar la eficacia del anticuerpo terapeutico, por ejemplo, controlar la actividad de los linfocitos NK, controlar la presencia de celulas diana en el paciente, controlar diversas indicaciones cllnicas, o mediante cualesquiera otros medios, y, a la vista de los resultados del control, ajustar las concentraciones relativas o los modos de administracion de los anticuerpos terapeuticos y/o del anticuerpo potenciador de linfocitos NK para optimizar la eficacia terapeutica y la limitacion de los efectos secundarios.

En otro conjunto de aspectos, los linfocitos NK se obtendran del paciente antes de la administracion del anticuerpo terapeutico y los anticuerpos potenciadores de linfocitos NK (y, si es apropiado, durante el tratamiento), y se evaluaran para determinar el anticuerpo ideal o ajustar los anticuerpos a utilizar para una maxima eficacia. Por ejemplo, se puede determinar la identidad de los receptores inhibidores o activadores presentes en los linfocitos NK, y los anticuerpos administrados que se dirigen especlficamente a los receptores mas prominentes. Como alternativa, los linfocitos Nk obtenidos se pueden incubar con el anticuerpo terapeutico y las celulas diana, y se puede evaluar la capacidad de uno o mas anticuerpos para potenciar el empobrecimiento de las celulas diana. Despues se pueden seleccionar para su uso en los presentes metodos de tratamiento cualquiera de uno o mas anticuerpos que sean los mas eficaces para potenciar el empobrecimiento in vitro.

Las dosis adecuadas de los anticuerpos y/o anticuerpos terapeuticos en general se pueden determinar tambien in vitro o en modelos animales, por ejemplo, incubando in vitro diversas concentraciones de un anticuerpo terapeutico en presencia de celulas diana, linfocitos NK (preferentemente linfocitos NK humanos), de forma opcional otras celulas inmunitarias y concentraciones variables de uno o mas anticuerpos potenciadores de linfocitos NK, y

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evaluando el grado o tasa de empobrecimiento de celulas diana en diversas condiciones, utilizando ensayos convencionales (por ejemplo, como describe en la seccion de ejemplos). Como alternativa, se pueden proporcionar dosificaciones variables de los anticuerpos terapeuticos a modelos animales para enfermedades que se puedan tratar con los anticuerpos (por ejemplo, un modelo animal para NHL en el caso de rituximab), junto con dosificaciones variables de los anticuerpos descritos en el presente documento, y puede valorarse la eficacia de los anticuerpos (por ejemplo, como se determina mediante cualquier ensayo o criterio cllnico, celular o molecular adecuado) en el tratamiento de los animales.

La composition de acuerdo con la presente divulgation se puede inyectar directamente a un sujeto, normalmente mediante via intravenosa, intraperitoneal, intraarterial, intramuscular o transdermica. Varios anticuerpos monoclonales han mostrado ser eficaces en situaciones cllnicas, tales como Rituxan (Rituximab) o Xolair (Omalizumab), y se pueden utilizar con la composicion de la presente invention reglmenes de administration similares (es decir, formulaciones y/o dosis y/o protocolos de administracion).

Ademas, las composiciones de la presente divulgacion pueden comprender ademas, o se pueden utilizar en combination con, otros agentes activos o programas terapeuticos tales como quimioterapia u otras inmunoterapias, ya sea de forma simultanea o de forma secuencial.

En determinado ejemplo preferente, el metodo de la invencion comprende adicionalmente una o varias inyecciones de dos o mas anticuerpos que bloquean un receptor inhibidor de un linfocito NK. Por lo tanto, se pueden utilizar en combinacion estos dos o mas anticuerpos. Esto puede servir para provocar un aumento aun mayor de la ADCC y de la eficacia de los anticuerpos terapeuticos, y/o puede servir para reducir la dosificacion de un anticuerpo particular que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK. Por ejemplo, se sabe que los compuestos tales como IL-2 son toxicos a dosis aumentadas. Por ejemplo, un regimen preferente es donde dichos dos compuestos son (i) un primer compuesto seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo que bloquea un receptor KIR inhibidor, y (ii) un segundo compuesto seleccionado del grupo que consiste en IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21. Por lo tanto, la divulgacion proporciona adicionalmente un metodo de tratamiento de una enfermedad en un sujeto que lo necesite que comprende: (a) administrar a dicho sujeto un compuesto de acuerdo con la divulgacion, un anticuerpo o un fragmento del mismo, que bloquea un receptor inhibidor de un linfocito NK; (b) administrar a dicho sujeto un anticuerpo terapeutico; y c) administrar a dicho sujeto IL-2. La IL2 esta disponible de Research Diagnostics, NJ7 RDI- 202, o de Chiron Corp. (Emeryville, CA).

La citocina se puede administrar de acuerdo con cualquier regimen de administracion adecuado y se puede administrar antes, de forma simultanea y/o despues de la administracion del compuesto que bloquea un receptor inhibidor o estimula un receptor activador de un linfocito NK, y antes, de forma simultanea y/o despues de la administracion del anticuerpo terapeutico. En un ejemplo tlpico, la citoquina se administra diariamente durante un perlodo de 5-10 dlas, inyectandose primero la citocina (o citocinas) en el mismo dla que la primera inyeccion del compuesto que bloquea un receptor inhibidor o estimula un receptor activador de un linfocito NK. Preferentemente, dicho metodo comprende una o dos inyecciones/dla de citocina (o de citocinas) por via subcutanea.

La dosificacion de la citoquina se elegira dependiendo del estado del paciente a tratar. En ejemplos preferentes, se puede utilizar una dosis relativamente baja de citoquina. Por ejemplo, una dosis eficaz normalmente es menor que 1 millon de unidades/metros cuadrados/dla de citocina (o citocinas), cuando se utiliza la composicion farmaceutica que contiene citocina para una inyeccion subcutanea diaria. En un ejemplo preferente, se inyecta IL-2 por via subcutanea a dosis diarias inferiores a 1 millon de unidades/m2 durante 5 a 10 dlas. En la publication de Patente Internacional WO 2004/056392 y en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 60/435.344, titulada "Pharmaceutical compositions having an effect on the proliferation of NK cells and a method using the same" se describen detalles adicionales sobre el uso de citocinas.

Ademas, se apreciara que los anticuerpos terapeuticos y los anticuerpos potenciadores de linfocitos NK se pueden coadministrar, por ejemplo, coinyectar, o se pueden administrar de forma simultanea pero en distintas formulaciones, o se pueden administrar de forma independiente, por ejemplo, el compuesto se administra horas, dlas o semanas antes o despues de la administracion del anticuerpo.

Los aspectos y ventajas adicionales de la presente invencion se divulgan en la siguiente seccion experimental, que se debe considerar como ilustrativa y no limitativa del ambito de la presente solicitud.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generation de un anticuerpo pan KIR2DL

Purificacion de LSP y generacion de lineas de linfocitos NK policlonales o clonales

Los LSP se obtuvieron de donantes sanos por gradientes de Ficoll Hypaque y el empobrecimiento de celulas adherentes plasticas. Para obtener linfocitos NK enriquecidos, los LSP se incubaron con los Acm anti CD3, anti CD4 y anti HLA-DR (30 min a 4 °C), seguido de perlas magneticas anti raton de cabra (Dynal) (30 min a 4 °C) y la selection inmunomagnetica mediante metodos conocidos en la tecnica (Pende et al., 1999). Se cultivan celulas CD3

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negativas, CD4 negativas, DR negativas en celulas alimentadoras irradiadas e Interleucina 2 (Proleukin, Chiron Corporation) 100 U/ml y fitohemaglutinina A (Gibco BRL) 1,5 ng/ml para obtener poblaciones de linfocitos NK policlonales. Los linfocitos NK se clonan por dilucion limitante y se caracterizan los clones de linfocitos NK por citometrla de flujo para la expresion de receptores de superficie celular.

En este estudio se utilizaron los siguientes clones:

CP11, CN5 y CN505 son clones positivos para KIR2DL1 y se tinen por los anticuerpos EB6 o XA-141. CN12 y CP502 son clones positivos para KIR2DL3 y se tinen por el anticuerpo GL183.

Analisis por citometrfa de flujo

Los Acm utilizados se produjeron en el laboratorio JT3A (IgG2a, anti CD3), EB6 y GL183 (IgG1 anti KIR2DL1 y KIR2DL3, respectivamente), IgM XA-141 anti KIR2DL1 (misma especificidad en comparacion con EB6, anti CD4 (HP2.6), anti DR (Dl.12, IgG2a). En lugar de JT3A, HP2.6, y DR1.12, se pueden utilizar Acm disponibles de forma comercialmente con las mismas especificidades, por ejemplo de Beckman Coulter Inc, Fullerton, CA. EB6 y GL183 estan disponibles de forma comercial en Beckman Coulter Inc, Fullerton, CA. XA-141 no esta disponible de forma comercial, pero se puede utilizar EB6 para controlar la reconstitucion de la lisis, segun se describe en (Moretta et al., 1993).

Citometrfa de flujo

Las celulas se tineron con los anticuerpos apropiados (30 min a 4 °C) seguido de los anticuerpos anti raton policlonales conjugados con PE o FITC (Southern Biotechnology Associates Inc). Las muestras se analizaron por analisis citofluorometrico en un aparato FACSAN (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Experimentos de citotoxicidad

La actividad citolltica de los clones de NK se evaluo mediante un ensayo de liberacion de 51Cr de 4 h convencional, en el cual los linfocitos NK efectores se probaron en llneas celulares positivas para Cw3 o Cw4 conocidas por su sensibilidad a la lisis por linfocitos NK. Todos las dianas se utilizan a 5000 celulas por pocillo en una placa de microtitulacion y la proporcion de Efector sobre la diana se indica en las figuras (habitualmente 4 efectores por celulas diana). El analisis citolltico se realiza con o sin sobrenadante de los anticuerpos monoclonales indicados a una dilucion al 1/2. El procedimiento es esencialmente el mismo que el descrito en (Moretta et al., 1993).

Generacion de Acm nuevos

Los Acm se han generado inmunizando ratones Balb C de 5 semanas de edad con llneas de linfocitos NK policlonales o monoclonales activadas segun se describe en (Moretta et al., 1990). Despues de distintas fusiones celulares, los Acm se seleccionaron primero por su capacidad reaccionar de forma cruzada con las llneas y los clones de linfocitos NK positivos para EB6 y GL183. Los anticuerpos monoclonales positivos se exploraron adicionalmente por su capacidad para reconstituir la lisis mediante los clones de NK positivos para EB6 o positivos para GL183 de las dianas positivas para Cw4 o Cw3, respectivamente.

DF200, un anticuerpo monoclonal nuevo frente a un determinante comun de los receptores de NK KIR2DL humanos

Se encontro que uno de los anticuerpos monoclonales, el Acm de DF200, reacciona con diversos miembros de la familia KIR, incluyendo KIR2DL1 y KIR2DL2/3. Con respecto a la tincion de los linfocitos NK con el Acm DF200, se tineron de forma brillante tanto las celulas KIR2DL1+ como las KIR2DL2/3+ (figura 1).

Los clones NK que expresaban uno u otro (o incluso ambos) de estos receptores inhibidores especlficos de HLA clase I se utilizaron como celulas efectoras frente a celulas diana que expresan uno o mas alelos de HLA-C. Como se esperaba, los clones NK KIR2DL1+ presentaron poca o ninguna actividad citolltica frente a celulas diana que expresaban HLA-Cw4 y los clones de NK KIR2DL3+ que presentaron poca o ninguna actividad sobre las dianas positivas para Cw3. Sin embargo, en presencia del Acm DF200 (utilizado para enmascarar sus receptores KIR2DL) los clones de NK se volvieron inestables para reconocer sus ligandos HLA-C y presentaron una importante actividad citolltica sobre las dianas Cw3 o Cw4.

Por ejemplo, los clones de NK KIR2DL1+ (CN5/CN505) no destruyeron la llnea celular C1R (llnea celular EBV CW4+, ATCC n.° CRL 1993), pero la inhibition se pudo invertir de forma eficaz mediante el uso de ya sea DF200 o de un Acm anti KIR2DL1 convencional. Por otro lado, los clones de NK que expresaban el fenotipo KIR2DL2/3+ KIR2DL1- (CN12) destruyeron de forma eficaz a C1R y esta destruction no se vio afectada por el Acm DF200 (Figura 2). Pueden obtenerse resultados similares con los clones de NK positivos para KIR2DL2 o KIR2DL3 sobre las dianas positivas para Cw3.

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Analisis de Biacore de las interacciones Acm DF200/KIR2DL1 y Acm DF200/KIR2DL3.

Materiales y metodos

Produccion y purificacion de protefnas recombinantes. Las protelnas recombinantes KIR2DL1 y KIR2DL3 se produjeron en E. coli. Se amplified por PCR el ADNc que codificaba el dominio extracelular completo de KIR2DL1 y KIR2DL3, a partir del vector pCDM8 clon 47.11 (Biassoni et al.) y el vector RSVS(gpt)183 clon 6(Wagtman et al., 1995), respectivamente, utilizando los siguientes cebadores:

Sentido: 5'-GGAATTCCAGGAGGAATTTAAAATGCATGAGGGAGTCCACAG-3'

Antisentido: 5'-CCCAAGCTTGGGTTATGTGACAGAAACAAGCAGTGG-3'

Se clonaron en el vector de expresion pML1 en fase de lectura con una secuencia que codifica una senal de biotinilacion (Saulquin et al., 2003).

La expresion de protelnas se realizo en la cepa bacteriana BL21 (DE3) (Invitrogen). Las bacterias transfectadas se cultivaron hasta una OD600=0,6 a 37 °C en medio complementado con ampicilina (100 pg/ml) y se indujeron con IPTG 1 mM.

Las protelnas se recuperaron de los cuerpos de inclusion en condiciones desnaturalizantes (urea 8 M). El replegamiento de las protelnas recombinantes se realizo el tampon Tris 20 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM que contenla L-arginina el (400 mM, Sigma) y p-mercaptoetanol (1 mM) a Ta, disminuyendo la concentracion de urea en una dialisis de seis etapas (urea 4, 3, 2, 1, 0,5 y 0 M, respectivamente). Durante las etapas de dialisis con urea 0.5 y 0 M se anadio glutation reducido y oxidado (sigma 5 mM y 0,5 mM respectivamente, Sigma). Por ultimo, las protelnas se sometieron a dialisis de forma extensa contra tampon Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM. Las protelnas replegadas solubles se concentraron y despues se purificaron en una columna de exclusion por tamano Superdex 200 (Pharmacia, sistema AKTA).

Analisis Biacore. Se realizaron mediciones por resonancia de plasmon superficial en un aparato Biacore (Biacore). En todos los experimentos Biacore sirvio como el tampon de ejecucion el tampon HBS complementado con tensioactivo P20 al 0,05 %.

Inmovilizacion de protelnas. Las protelnas KIR2DL1 y KIR2DL3 recombinantes se inmovilizaron de forma covalente a los grupos carboxilo en la capa de dextrano en un chip detector CM5 (Biacore). La superficie del chip detector se activo con EDC/NHS (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida y N-hidroxisuccinimida, Biacore). Se inyectaron las protelnas en el tampon de acoplamiento (acetato 10 mM pH 4.5). La desactivacion de los grupos activados restantes se realizo utilizando etanolamina 100 mM pH 8 (Biacore).

Mediciones de la afinidad. Para las mediciones cineticas, se aplicaron diversas concentraciones del anticuerpo soluble (10-77 hasta 4x10'10 M) sobre la muestra inmovilizada. Las mediciones se realizaron a un caudal continuo de 20 pl/min. La superficie del chip detector se regenero en cada ciclo mediante la inyeccion de 5 pl de NaOH 10 mM pH 11.

Para el analisis de los datos se utilizo el programa BIAlogue Kinetics Evaluation (BIAevaluation 3.1, Biacore). Resultados

Analisis BIAcore del Acm DF200 que se une a KIR2DL1 y KIR2DL3 inmovilizados.

KD (10-9 M)

KIR2DL1

10,9 +/- 3,8

KIR2DL3

2,0 +/- 1,9

KD: Constante de disociacion

El analito soluble (40 pl a diversas concentraciones) se inyecto a un caudal de 20 pl/min en tampon HBS, en capas de dextrano que contenlan 500 o 540 unidades de reflectancia (UR), y 1000 o 700 UR de KIR2DL1 y KIR2DL3 respectivamente. Los datos son representativos de 6 experimentos independientes.

Ejemplo 2: Potenciacion de la ADCC utilizando una combinacion de Rituxan y Acm anti KIR

Preparacion de clones de NK humanos. Celulas mononucleares sangulneas empobrecidas en linfocitos T mediante selection inmunomagnetica anti CD3 (Miltenyi) negativa se sembraron en placas en condiciones de dilution limitante, se activaron con fitohemaglutinina (pHa) (Biochrom KG, Berlin, Alemania), y se cultivaron con interleucina (IL)-2 (Chiron B. V., Amsterdam, Paises Bajos) y celulas alimentadoras irradiadas. Las eficacias de

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clonacion fueron equivalentes en todos los donantes y variaron entre 1 en 5 y 1 en 10 linfocitos NK sembrados en placas. Los linfocitos NK clonados se exploraron para alorreactividad por citotoxicidad por liberacion 51Cr convencional frente a llneas celulares linfoblastoideas B transformadas con virus Epstein-Barr del tipo de HLA conocido a una proporcion de efector con respecto a la diana de 10:1. Los clones que presentaron una lisis de > 30 % se valoraron como alorreactivos. Como regla, los clones presentan una lisis ya sea de < 5 % o > 40 %.

Potenciacion de la ADCC mediada por Rituxan mediante un clon de linfocitos NK positivo para KIR2DL1

La actividad citolltica del clon de NK se evaluo mediante un ensayo de liberacion 51Cr de 4 h convencional, en el cual se probaron los linfocitos NK efectores en llneas celulares EBV positivas para Cw4 o Cw3 (CD20 positivas), conocidas por su sensibilidad a la lisis por linfocitos NK. Todos las dianas se utilizaron a 5000 celulas por pocillo en una placa de microtitulacion y la proporcion de efector (clon de linfocitos NK) con respecto a la diana se indica en la Figura 3. En determinados experimentos se anadio rituximab anti CD20 quimerico terapeutico (Rituxan, Idec) a 5 pg/ml a la mezcla efector diana. En determinados experimentos se anadio a la mezcla efector diana el anticuerpo EB6 (anti KIR2DL1) a 10 pg/ml.

Este experimento mostro que Rituxan solo no media esencialmente ADCC mediante el clon de NK positivo para KIR2DL1 sobre la diana positiva para Cw4. La ADCC del clon positivo para KIR2DL1 se potencio en gran medida en presencia del anticuerpo anti KIR2DL1.

Ejemplo 3 - Potenciacion de la ADCC mediada por Campath mediante un clon de linfocitos NK positivo para KIR2DL1

En un experimento similar al descrito en el Ejemplo 2, se incubaron blastos PHA Cw4+ autologos en presencia de linfocitos NK mas alumtuzumab (Campath, Berlex), el anticuerpo EB6 (a 100 ug/ml), o Campath y EB6. Los resultados, mostrados en la Figura 4, muestran que la presencia de EB6 potencia excepcionalmente la capacidad de los linfocitos NK para Empobrecer las celulas autologas: en presencia de Campath solo se liso aproximadamente el 4 % de las celulas diana, mientras que en presencia de Campath mas EB6 se liso mas del 30 % de las celulas.

Referencias

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso de (a) un anticuerpo anti receptor de linfocitos NK (NKR) que se une a, e inhibe la actividad de un receptor KIR2DL inhibidor de un linfocito NK y de (b) un anticuerpo terapeutico al que puede unirse CD16 a traves de su region Fc y que empobrece celulas diana mediante ADCC, para la preparacion de un farmaco para el tratamiento de una enfermedad, en donde dicho anticuerpo anti NKR aumenta la eficacia de dicho anticuerpo terapeutico mediante la potenciacion de la ADCC, en donde dicho anticuerpo anti NKR se une a un determinante comun de los receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK.
2. 2. El uso de la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo terapeutico tiene una porcion Fc de IgG1 o de IgG3 humana.
3. 3. El uso de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho anticuerpo anti NKR comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
4. 4. El uso de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
5. 5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo terapeutico no esta conjugado con una fraccion radiactiva o toxica.
6. 6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo anti NKR es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico, o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
7. 7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo terapeutico es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico, o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
8. 8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo terapeutico es rituximab o alemtuzumab.
9. 9. El uso de la reivindicacion 8, en el que dicho anticuerpo terapeutico es rituximab y se administra a una dosificacion de menos de 375 mg/m2 por semana.
10. 10. El uso de la reivindicacion 8, en el que dicho anticuerpo terapeutico es alemtuzumab y se administra a una dosificacion de menos de 90 mg por semana.
11. 11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho anticuerpo anti NKR se une al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200, depositado con el n.° de registro CNCM I-3224.
12. 12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo anti NKR compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200, depositado con el n.° de registro CNCm I-3224, por la union a un receptor KIR en la superficie de un linfocito NK humano.
13. 13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho anticuerpo anti NKR es el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200, depositado con el n.° de registro CNCM I-3224, o un fragmento o un derivado del mismo.
14. 14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo terapeutico y dicho anticuerpo anti NKR se administran de forma simultanea a dicho sujeto.
15. 15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo anti NKR se administra a dicho sujeto dentro de una semana de la administracion de dicho anticuerpo terapeutico.
16. 16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha enfermedad es un cancer o una enfermedad infecciosa o inmunitaria.
17. 17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente evaluar la actividad o el numero de linfocitos NK en dicho sujeto, antes o despues de la administracion de dicho anticuerpo anti NKR.
18. 18. El uso de la reivindicacion 17, en el que dicha evaluacion de la actividad o del numero de linfocitos NK implica

    i) incubar linfocitos NK obtenidos de dicho sujeto antes de dicha administracion en presencia de una o mas celulas diana que reconoce dicho anticuerpo terapeutico, en presencia o ausencia de dicho anticuerpo anti NKR;

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    ii) evaluar el efecto de dicho anticuerpo anti NKR sobre la capacidad de dichos linfocitos NK para empobrecer dichas celulas diana;

    en el que una deteccion de que dicho anticuerpo anti NKR potencia la capacidad de dichos linfocitos NK para empobrecer dichas celulas diana indica que dicho anticuerpo anti NKR es adecuado para su uso en dicho metodo y dicho metodo es adecuado para su uso con dicho sujeto.
19. 19. Una composicion farmaceutica que comprende:

    (a) un anticuerpo terapeutico al que puede unirse CD 16 a traves de su region Fc y que empobrece celulas diana mediante ADCC, (b) un anticuerpo anti receptor de linfocitos NK (NKR) que se une a, e inhibe la actividad de un receptor KIR2DL inhibidor de un linfocito NK y (c) un vehlculo farmaceuticamente aceptable, en el que dicho anticuerpo anti NKR se une a un determinante comun de los receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK.
20. 20. La composicion de la reivindicacion 19, en la que dicho anticuerpo terapeutico tiene una porcion Fc de IgG1 o de IgG3 de primate humano o no humano.
21. 21. La composicion de las reivindicaciones 19 o 20, en la que dicho anticuerpo anti NKR comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
22. 22. La composicion de las reivindicaciones 19 o 20, en la que dicho anticuerpo anti NKR es un anticuerpo monoclonal o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
23. 23. La composicion de las reivindicaciones 19 a 22, en la que dicho anticuerpo anti NKR es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico, o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
24. 24. La composicion de las reivindicaciones 19 a 23, en la que dicho anticuerpo terapeutico es un anticuerpo monoclonal o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
25. 25. La composicion de la reivindicacion 24, en la que dicho anticuerpo terapeutico es un anticuerpo humano, humanizado o quimerico, o comprende un fragmento de union a antlgeno del mismo.
26. 26. La composicion de las reivindicaciones 24 o 25, en la que dicho anticuerpo no esta conjugado con una fraccion radiactiva o toxica.
27. 27. La composicion de las reivindicaciones 19 a 26, en la que dicho anticuerpo terapeutico es rituximab o alemtuzumab.
28. 28. La composicion de la reivindicacion 19, en la que dicho anticuerpo anti NKR se une al mismo epltopo que el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200, depositado con el n.° de registro CNCM I-3224.
29. 29. La composicion de la reivindicacion 19, en la que dicho anticuerpo anti NKR compite con el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200, depositado con el n.° de registro CNCM 1-3224, por la union a un receptor KIR en la superficie de un linfocito NK humano.
30. 30. La composicion de la reivindicacion 19, en la que dicho anticuerpo anti NKR es el anticuerpo monoclonal DF200 producido por el hibridoma DF200, depositado con el n.° de registro CNCM 1-3224, o un fragmento o un derivado del mismo.
31. 31. Uso de un anticuerpo anti receptor de linfocitos NK (NKR) que bloquea un receptor KIR2DL inhibidor de un linfocito NK, en donde dicho anticuerpo anti NKR se une a un determinante comun de los receptores humanos KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3, e inhibe la inhibicion mediada por KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 de la citotoxicidad de linfocitos NK, para la preparacion de un farmaco para aumentar la eficacia de un tratamiento que implica la administracion a un sujeto de un anticuerpo terapeutico al que puede unirse CD16 a traves de su region Fc y que empobrece celulas diana en dicho sujeto mediante ADCC, en donde la administracion de dicho anticuerpo terapeutico se administra a dicho sujeto antes, de forma simultanea o despues de una cantidad terapeuticamente eficaz de dicho anticuerpo anti NKR y en donde dicho anticuerpo anti NKR aumenta la eficacia de dicho tratamiento mediante la potenciacion de la ADCC en dicho sujeto.