ES2619314T3

ES2619314T3 - Expresión génica y dolor

Info

Publication number: ES2619314T3
Application number: ES14179247.3T
Authority: ES
Inventors: Julien Mamet
Original assignee: Adynxx Inc
Current assignee: Adynxx Inc
Priority date: 2007-05-11
Filing date: 2008-05-12
Publication date: 2017-06-26
Anticipated expiration: 2028-05-12
Also published as: EP2818550B1; JP5890869B2; JP6306075B2; JP2016117775A; WO2008141308A2; EP2818550A1; US20160222382A1; PT2158316E; DK2158316T3; JP2016014070A; SI2158316T1; AU2008251320B2; US20110166212A1; JP2017148074A; US20140343132A1; AU2008251320A1; US8741864B2; EP2158316B1; WO2008141308A3; HK1205530A1

Abstract

Un oligonucleotido senuelo que comprende una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO:32, en donde el oligonucleotido senuelo comprende al menos un sitio de union al factor de transcripcion que se une a un factor de transcripcion KLF4.

Description

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y Scn9a en células PC12 mediante tratamientos independientes con cualquiera de la SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 42, o la SEQ ID NO.: 45. Se transfectaron los señuelos a 500 nM; se proporciona los valores como promedios ± SEM, se normalizaron los valores de expresión basándose en el nivel de expresión de Gapdh (unidades arbitrarias); *p < 0,1, **p< 0,05 para diferentes de cualquiera de la SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.:

5 15 o la SEQ ID NO.: 42.

Fig. 8. A. SEQ ID NO.: 42 en el día 1. Se evaluó la sensibilidad mecánica de las ratas en el día 1 posterior a la inyección CFA utilizando los filamentos de Von Frey de 2 fuerzas diferentes: 1 gramo y 6 gramos. Se evaluaron las condiciones de tratamiento del vehículo y la SEQ ID NO.: 42. B. SEQ ID NO.: 42 en el día 4. Se evaluó la sensibilidad mecánica de nuevo en el día 4 posterior a CFA. De nuevo, se evaluaron las condiciones de tratamiento del vehículo y la SEQ ID NO.: 42; se proporcionan los valores como promedios ± SEM n = 7.

Descripción detallada de la invención

15 Definiciones

"Unión", como se usa en el contexto de unión de los factores de transcripción a los oligonucleótidos señuelo, se refiere a una interacción directa (por ejemplo,

una unión no covalente entre el factor de transcripción y el oligonucleótido señuelo, incluyendo enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, etc.) entre un factor de transcripción y un oligonucleótido señuelo. De acuerdo con ello, un oligonucleótido que no se une a un factor de transcripción no interactúa directamente con dicho factor de transcripción.

"Crónico", se refiere a un periodo de tiempo que comprende meses (por ejemplo, al menos dos meses) o años.

25 "Compuestos" se refiere a oligonucleótidos bicatenarios, denominados también en el presente documento oligonucleótidos señuelo. Los compuestos descritos en el presente documento pueden contener uno o más centros quirales y/o dobles enlaces y, por tanto, pueden existir como estereoisómeros, tales como isómeros de doble enlace (es decir, isómeros geométricos), enantiómeros o diastereómeros. De acuerdo con ello, las estructuras químicas representadas gráficamente en el presente documento abarcan todos los posibles enantiómeros y estereoisómeros de los compuestos ilustrados incluyendo las formas estereoisoméricamente puras (por ejemplo, geométricamente puras, enantioméricamente puras o diastereoméricamente puras) y las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas. Las mezclas enantioméricas y estereoisoméricas se pueden resolver en sus enantiómeros o estereoisómeros componentes utilizando técnicas de separación o técnicas de síntesis quiral bien conocidas por los técnicos

35 expertos. Los compuestos pueden existir también en varias formas tautómeras incluyendo la forma enol, la forma ceto y sus mezclas. De acuerdo con ello, las estructuras químicas representadas gráficamente en el presente documento abarcan todas las posibles formas tautómeras de los compuestos. Los compuestos descritos en el presente documento incluyen compuestos marcados isotópicamente en el que uno o más átomos tienen una masa atómica diferente de la masa atómica que se encuentra convencionalmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a, 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 15N, 18O, 17O, etc. Los compuestos pueden existir en formas no solvatadas, así como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas y como N-óxidos. En general, los compuestos se pueden hidratar, solvatar como Nóxidos. Determinados compuestos pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. Todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados en el presente documento. Adicionalmente, deberá entenderse,

45 cuando se ilustran las estructuras parciales de los compuestos, que los paréntesis indican el punto de unión de la estructura parcial al resto de la molécula.

"Modulación del nivel de expresión génica" se refiere a cualquier cambio en el nivel de expresión génica incluyendo una inducción o activación (por ejemplo, un aumento en la expresión génica), una inhibición o supresión (por ejemplo, una disminución en la expresión génica), o una citoquina (por ejemplo, prevención de la regulación en exceso o de la regulación en defecto de un gen que se produce ordinariamente en respuesta a un estímulo, tal como un estímulo inducido por dolor).

"Señalización nociceptiva" se refiere a mecanismos moleculares y celulares implicados en la detección de un

55 estímulo nocivo o de un estímulo potencialmente perjudicial, que conduce a la percepción del dolor, incluyendo la síntesis y liberación de neurotransmisores, la señalización inducida por neurotransmisores, despolarización de la membrana, y episodios de señalización intracelulares e intercelulares relacionados.

"Oligonucleótido" se refiere a cualquier polímero que contiene ácido nucleico bicatenario generalmente aproximadamente menor de 200 nucleótidos (o 100 pares de bases) e incluyendo, pero no de forma limitativa, ADN, ARN y ARN-ADN híbridos. El término abarca secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases de ADN y ARN conocidos, pero no de forma limitativa, 2,6-diaminopurina, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, ácido uracil-5-oxiacético, N6-isopenteniladenina, 1metiladenina, metiléster del ácido N-uracil-5-oxiacético, queosina, 2-tiocitosina, 5-bromouracilo, metilfosfonato, 65 fosforoditioato, ormacetal, 3'-tioformacetal, estructura principal de nitróxido, sulfona, sulfamato, derivados de morfolino, derivados de "ácido nucleico bloqueado" (LNA), y/o derivados de ácido nucleico peptídico (PNA). En

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oligonucleótidos señuelo descritos en el presente documento pueden unirse, por ejemplo, a polímeros de polietilenglicol, péptidos (por ejemplo, un dominio de translocación de la proteína) o proteínas que mejoran el efecto terapéutico de los oligonucleótidos señuelo. Dichos oligonucleótidos señuelo modificados pueden atravesar preferentemente la membrana celular.

5 Los oligonucleótidos señuelo se pueden proporcionar como sales, hidratos, solvatos, o derivados de N-óxidos. Los oligonucleótidos señuelo se pueden proporcionar en solución (por ejemplo, una solución salina que tiene un pH fisiológico) o en forma liofilizada. Los oligonucleótidos señuelo se pueden proporcionar en liposomas.

Uno o más oligonucleótidos señuelo se pueden proporcionar en un kit. El kit puede incluir una instrucción, por ejemplo, para usar dicho uno o más oligonucleótidos señuelo. Dicha instrucción puede describir uno o más de los métodos divulgados en el presente documento, por ejemplo, un método para prevenir o tratar el dolor, un método para modular la expresión génica en una célula, un método para modular la señalización nociceptiva en una célula, un método para modular la degradación de las proteínas en una célula, etc. Los oligonucleótidos señuelo

15 proporcionados en un kit se pueden proporcionar en forma liofilizada. Un kit que comprende uno o más oligonucleótidos señuelo liofilizados puede comprender además una solución (por ejemplo, una solución salina farmacéuticamente aceptable) que se puede usar para resuspender dichos uno o más de los oligonucleótidos señuelo.

Los oligonucleótidos bicatenarios descritos en el presente documento pueden prepararse mediante métodos convencionales conocidos en la materia y de esta manera están también comprendidos en el ámbito del técnico experto.

Composiciones farmacéuticas

25 Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más oligonucleótidos señuelo, preferiblemente, preferentemente, en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de un vehículo farmacéuticamente aceptable, de manera que se proporcione una forma de administración correcta a un paciente. Cuando se administra a un paciente, los oligonucleótidos señuelo y los portadores farmacéuticamente aceptables son preferiblemente estériles. El agua es un vehículo preferido cuando los oligonucleótidos señuelo se administran por vía intravenosa. Los sueros salinos y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden utilizar como vehículos líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, cal, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico,

35 leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones farmacéuticas, si se desea, también pueden incluir cantidades poco importantes de agentes mojantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Además, también se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de forma convencional usando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares farmacéuticamente aceptables, que facilitan el procesamiento de los compuestos descritos en el presente documento para obtener preparaciones que se pueden utilizar

45 farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Las presentes composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, aglomerados, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación continua, supositorios, aerosoles, pulverizadores, suspensiones, o cualquier otra forma adecuada para su uso. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se han descrito en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, Philadelphia College of Pharmacy and Science, 19ª Edición, 1995).

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en la forma de comprimidos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes, o elixires, por ejemplo.

55 Las composiciones administradas por vía oral pueden incluir uno o más agentes opcionales, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartame o sacarina, agentes aromatizantes tales como piperita, aceite de gaulteria, o agentes colorantes de cereza y agentes conservantes, para proporcionar una preparación farmacéuticamente sabrosa. Además, ya sea en forma de comprimido o de píldora, las composiciones se pueden revestir para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal, proporcionando de esta manera una acción sostenida durante un periodo de tiempo prolongado. Las composiciones orales pueden incluir vehículos convencionales tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Dichos vehículos son, preferiblemente, de calidad farmacéutica.

Para preparaciones líquidas orales tales como, por ejemplo, suspensiones, elíxires y soluciones, los portadores,

65 excipientes o diluyentes adecuados incluyen agua, solución salina, alquilenglicoles (por ejemplo, propilenglicol), polialquilenglicoles (por ejemplo, polietilenglicol), aceites, alcoholes, tampones ligeramente ácidos entre pH 4 y pH 6

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compararon entre sí.

El tratamiento con oligonucleótido señuelo consiste en transfectar uno o más oligonucleótidos señuelo (en paralelo o en secuencia a un intervalo temporal aún por determinar) de las secuencias seleccionadas entre las SEQ ID NO.: 15 45 a líneas de células neuronales, DRG, y/o neuronas de la espina dorsal. Las líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, células PC12 (diferenciadas según NGF o no diferenciadas), células SH-SY5Y, células Weri, HeLa, HEK293, F-11, NS20Y, y ND7/23, o cualquier otra línea celular que exprese uno o más genes que se puedan seleccionar (por ejemplo, ACCN13, BDKPB12, BDNF, CACNA1GH, CALCA, GRIN1, GRM1, GRM5, HTR13, NTRK1, P2RX3, PLC, PRKC, etc.). Se aplica(n) una o más transfecciones al mismo conjunto de células, incluyendo 10 o sin incluir los mismos (o conjunto de) oligonucleótidos señuelo. Las células, tanto las líneas celulares como las neuronas primarias, se recogieron un tiempo después del tratamiento con el oligonucleótido señuelo (por ejemplo, 24

o 48 horas después del tratamiento). La eficacia de la transfección se midió siguiendo la captación de un oligonucleótido señuelo marcado, posiblemente con un colorante tal como fluoresceína. La eficacia se proporciona en forma de porcentaje de células totales que contienen el oligonucleótido señuelo marcado.

15 Las células cultivadas se recogieron después del tratamiento con oligonucleótido señuelo y se extrajo su ARN. El ARN se transformó en ADNc mediante transcripción inversa. La cantidad de ADNc de cada gen seleccionado, que refleja la cantidad de ARNm endógeno, se midió mediante PCR. La misma cantidad de producto de reacción de la PCR se cargó en un gel de agarosa saturado con bromuro de etidio o cualquier otro agente adecuado para la

20 detección del ADN. La detección del ADN se lleva a cabo bajo una lámpara UV o cualquier otro dispositivo adecuado, y las imágenes de los genes se analizaron mediante un programa informático de cuantificación. La cantidad de ADN producido en cada reacción de la PCR se normalizó con respecto a la cantidad de ADN producido en las reacciones de la PCR de control de los genes constitutivos (por ejemplo, ACTB, GAPDH) que reflejan la cantidad total de ARN presente inicialmente en las células. La comparación de la relación entre los valores de la

25 señal frente al control para cada gen, con y sin tratamiento(s) con oligonucleótido señuelo proporcionará una medición relativa del impacto de cada oligonucleótido señuelo sobre el nivel de expresión de los genes.

Los experimentos de control con oligonucleótidos bicatenarios incorrectamente emparejados (por ejemplo, la SEQ ID NO.: 43 hibridada con la SEQ ID NO.:46, denominada a partir de ahora en el presente documento como la SEQ ID

30 NO.: 43/46), mezclados, y/o mutados, se lleva a cabo en paralelo para garantizar que los efectos medidos son específicos de cada oligonucleótido señuelo. Se puede medir la viabilidad celular después del tratamiento con oligonucleótido señuelo.

Se puede utilizar la misma solución con los fármacos contra el dolor actuales, tales como los fármacos 35 antiinflamatorios no esteroideos o coxibs para compararlos con los oligonucleótidos señuelo.

En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos señuelo producen un efecto sobre el modelo o modelos de expresión, que incluye, pero sin limitación, una inhibición y/o una inducción de uno o más gen(es) que pueden estar implicados en la señalización nociceptiva y/o la percepción del dolor en un paciente. En determinadas realizaciones,

40 el gen o genes inhibidos pueden codificar factores pro-dolor, como receptores de los mediadores proinflamatorios, y los genes activados pueden codificar factores anti-dolor, como receptores opioides.

Hibridación de la hebra

45 Para oligonucleótidos señuelo que consisten en un par de hebras complementarias, las hebras complementarias se hibridan, a concentración equimolar, en un tampón salino, por ejemplo, Tris-EDTA (TE). El procedimiento convencional incluye mantener la solución de ambas hebras a una temperatura de desnaturalización elevada (por ejemplo, 100 ºC) durante un periodo de tiempo que puede variar dependiendo de las hebras complementarias, seguido por una disminución lenta de la temperatura (por ejemplo, 0,3-1 ºC /min) hasta que la solución alcanza una

50 temperatura de hibridación baja (por ejemplo, 20 ºC). La hibridación correcta de las hebras complementarias se puede verificar mediante cualquier técnica convencional adecuada, incluyendo, pero sin restricción a analizar muestras de oligonucleótidos hibridaos al lado de los no hibridados en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Para los oligonucleótidos señuelo que sean autohibridables, se sigue sustancialmente el mismo protocolo.

55 Cultivo celular

Células DRG y/o de la espina dorsal se pueden recoger de un animal (por ejemplo, un mamífero, tal como una rata o un ratón) y las neuronas se disocian en fresco, usando colagenasa (por ejemplo, colagenasa de tipo II) a 37 ºC. Las células aisladas de esta forma se pueden sembrar en placas Petri adecuadas (por ejemplo, revestidas con

60 colágeno). Las neuronas se mantuvieron en un medio de cultivo celular adecuado (por ejemplo, DMEM). Las líneas celulares se descongelaron y se mantuvieron en medio adecuado y placas Petri de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Las células se incubaron normalmente a 37 ºC, CO2 al 5 %. Las líneas celulares se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.

65 La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deberán tomarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

5 Los oligonucleótidos señuelo de la invención incluyen, pero no se limitan a, las secuencias presentadas en la Tabla

1. En general, el oligonucleótido señuelo se genera mediante hibridando la secuencia proporcionada en la tabla con una secuencia complementaria. Para generar un oligonucleótido bicatenario emparejado de forma incorrecta, la secuencia proporcionada en la tabla se puede hibridar con una secuencia que solamente sea parcialmente complementaria. Por ejemplo, la SEQ ID NO.:43 se puede hibridar con la SEQ ID NO.:46 para producir una 10 secuencia emparejada incorrectamente, SEQ ID NO.:43/46, descrita en los siguientes Ejemplos.

Tabla 1

Secuencias de oligonucleótidos (5'-3'): SEQ ID NO.:

GGCTTATGCAAATTCGAATGCAAATTTGTCG: SEQ ID NO.: 1

CTAAGCCCACGTGACCATTGGCCAGGTGACCAGATC: SEQ ID NO.: 2

GTTATGCGTGGGCGATAATGCGGGGGCGTTATAG: SEQ ID NO.: 3

GCCTCCCTGAGCTCATTGACGTATCTCGG: SEQ ID NO.: 4

CGAATATGACTGAGAATGACTCAGATTTGC: SEQ ID NO.: 5

GGTTCTATGATTTTGGAATCGGATTGTGCAAAGAAGC: SEQ ID NO.: 6

GCTTCAGGATGTCCATATTAGGAGATCTTGTTCG: SEQ ID NO.: 7

GGCCACAGGATGTAGGATGTCCATATTAGGATGC: SEQ ID NO.: 8

GTTCTCTAAAAATAAAAGGCTAAAAATAAAAGTCG: SEQ ID NO.: 9

ATTAGGGGCGGGGTCCGGGGCGGGGTATTA: SEQ ID NO.: 10

GTTATGGCGGGGCGGGGCGGGGCCGGGCGGTTTAC: SEQ ID NO.: 11

GGCAATGTGGTTTTAGTGTGGTTTTACGG: SEQ ID NO.: 12

GCCGTTTGGGGTCATAGAACCACAGGAACCACACGG: SEQ ID NO.: 13

CATTGCCCGGAAATGGACCGGATGTAATTTCC: SEQ ID NO.: 14

GTTCTTGGAAAAT AAAT GGAAAAT AGTGGAAAAT AAG TCG: SEQ ID NO.: 15

CGTTCCCACTTCCTGCGACCACTTCCTGCCGGG: SEQ ID NO.: 16

CTGCACCTATAAATGGCCTATAAATGGGGATGC: SEQ ID NO.: 17

GCTTATTTCGCGGAAGGTTTCCCGGAAGTGGCG: SEQ ID NO.: 18

GCTGTGCCTTATCTCTTTGGGATAACTGGCG: SEQ ID NO.: 19

GCTTAATGAATAAGAGGAAAAATG CATG CTGG: SEQ ID NO.: 20

GTTCTGAGATTGCACGATGAGATTTCACAGTCG: SEQ ID NO.: 21

GTCCCGCATAAATAATGGCATCCTTAATCGCG: SEQ ID NO.: 22

GTGCAGGCAAGAGTAGAGACAGGCAAGAGTAGATGC: SEQ ID NO.: 23

CCGCCAATAATTAATTATTAAGGCC: SEQ ID NO.: 24

GCTTCGTTCCATTTCCGGTCTCGGTTTCCCCATTC: SEQ ID NO.: 25

GCTGCTGTGGAATATCGACCTGTGGAATATCGTG: SEQ ID NO.: 26

GCCGTATAAATGTGCTATAAAAGTTTTAAGACCGTGC: SEQ ID NO.: 27

GCCGTATAAATGTGCTATAAAAGCCGTGC: SEQ ID NO.: 28

ATGCTGCGCTTTTCTCCAATCTGCGG: SEQ ID NO.: 29

CGTTCTCCGATTGGTCACGGACTCTCCGATTGGTCACGGC: SEQ ID NO.: 30

GCGCACCCCAGCCTGGCTCACCCACGCG: SEQ ID NO.: 31

GATCCTTTGCCTCCTTCGATCCTTTGCCTCCTTCAAG: SEQ ID NO.: 32

GGTGTTT G GGAGAGCTTTGGGAGGATACG: SEQ ID NO.: 33

GCTAAT CACTCAG CATTTCGGTGAG GGAAGTGAAAG: SEQ ID NO.: 34

CCTTTCAGCACCACGGACAGCGCCAGCTTCAGCACCACGGACAGCGCCTCG: SEQ ID NO.: 35

GGATCGAACATGGAGTCAGTGAGAAATCAGGATCGG: SEQ ID NO.: 36

GGATCGAAGCCGGAGTCAAGGAGGCCCCTGATCGG: SEQ ID NO.: 37

CCGAAAGGACAAAGGTCAAGTCGAAAGGACAAAGGTCAG: SEQ ID NO.: 38

CGGGAGAAAATTCGGGAACGTTCAAGAATTGTCGG: SEQ ID NO.: 39

GTTATGCGTGGGCGTAGATGCGGGGGCGTTATAG: SEQ ID NO.: 40

GATGCGTGGGCGTAGG: SEQ ID NO.: 41

GTATGCGTGGGCGGTGGGCGTAG: SEQ ID NO.: 42

GTTATGCGTTTGTAGATGCTTTCGTTATAG: SEQ ID NO.: 43

GTTATGCGTGGGCGATATAG: SEQ ID NO.: 44

GATGCGTGGGCGTTGACGTGGAAAATGC: SEQ ID NO.: 45

CTATTTCGAAACGATCTACATTGGCATAAC: SEQ ID NO.: 46

CGTTCCCACTTCCTGCGACCGG: SEQ ID NO.: 47

GGGTGAAGGCAAGAGTAGAGCGGCGG: SEQ ID NO.: 48

CGTTCTCCGATTGGTCACGCG: SEQ ID NO.: 49

GTACTCCCTTTGCCTCCTTCAACCGG: SEQ ID NO.: 50

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forskolina parecen implicar una red transcripcional que incluye los tres genes tempranos inmediatos Egr1, Creb/Atf y Nfat. Si la actividad de uno solo de estos factores se inhibe mediante una de las secuencias señuelo de los inventores, se pierde la regulación. Esto representa una ventaja terapéutica potencial importante del enfoque de señuelos, ya que la expresión de un gen dado puede quedar inhibida sin necesidad de tener como diana todos los

5 factores de transcripción implicados en su regulación.

En su conjunto, estos experimentos demuestran que las secuencias señuelo de los inventores tienen el potencial de inhibir en paralelo un gran número de genes del dolor, una propiedad única para la terapia del dolor.

10 Ejemplo 6: Oligonucleótidos señuelo compuestos

Teniendo en cuenta que se aplica determinado nivel de redundancia entre las actividades de los factores de transcripción, los inventores desarrollaron una secuencia señuelo compuesta, SEQ ID NO.: 45, para la inhibición en paralelo de EGR1, CREB/ATF y NFAT. El interés de dicha secuencia es la inhibición simultánea de los tres 15 principales genes tempranos inmediatos implicados en la plasticidad neuronal y que integran rugas de señalización complementarias fundamentales para la sensación de dolor. Las quinasas de señalización como las rutas MAPK/ERK, que se activan mediante numerosos receptores metabotrópicos del dolor (por ejemplo, los receptores de NGF NTRK1/NGFR), movilizan EGR1, mientras que las rutas de señalización del calcio movilizadas mediante los canales del calcio -y catiónicos- activan CREB y NFAT. La secuencia de la SEQ ID NO.: 45 incluye, en orden, de 5' a

20 3', sitios de unión al factor de transcripción para EGR1, CREB/ATF y NFAT, seleccionado cada uno de ellos de los elementos de respuesta individual de la SEQ ID NO.: 3 (EGR1), SEQ ID NO.: 4 (CREB/ATF), y la SEQ ID NO.: 15 (NFAT).

Las propiedades de unión de la SEQ ID NO.: 45 para cada factor se muestran en la figura 7A, B. Los experimentos

25 de competición ELISA en paralelo con la SEQ ID NO.: 41 y la SEQ ID NO.: 45 muestran que la afinidad de enlace relativa de esta secuencia compuesta para EGR1 es tan alta como el oligonucleótido señuelo SEQ ID NO.: 41. Además, la inhibición de la actividad de hEGR1 en células HL60 inducida por el tratamiento con la SEQ ID NO.: 45 concuerda con la inhibición inducida por la SEQ ID NO.: 41 (Fig. 7C), teniendo ambos curvas dosis-respuestas solapantes. Estos resultados son consistentes con las observaciones anteriores de los inventores de que la eficacia

30 celular estaba directamente vinculada con la afinidad relativa medida en los experimentos ELISA. Finalmente, otros experimentos de competición ELISA muestran que, además de unirse a hEGR1, la SEQ ID NO.: 45 también se une específicamente a los factores hCREB/hATF y hNFAT (Fig. 7B).

Los inventores investigaron el impacto de la SEQ ID NO.: 45 sobre la expresión de los genes del dolor en células

35 PC12 (tabla 2). El uso de una secuencia compuesta proporciona dos ventajas: (i) un efecto potencialmente aditivo sobre el número y tipo de genes inhibidos; y (ii) potencialmente mayor inhibición de genes concretos que solamente quedan parcialmente inhibidos por oligonucleótidos señuelo específicos de factores de transcripción únicos. El efecto aditivo se ilustró para la SEQ ID NO.: 45 mediante la inhibición diferencial entre el señuelo compuesto, NFAT, y el señuelo EGR1. Por ejemplo, La SEQ ID NO.: 42 no inhibe la expresión inicial de Grm5, mientras que tanto la SEQ ID

40 NO.: 15 (NFAT) como la SEQ ID NO.: 45 (señuelo compuesto) lo hacen. Análogamente, en dolencias de tipo dolor, la SEQ ID NO.: 15 (NFAT) no evita la regulación exceso de Scn9a tras el tratamiento con NGF y forskolina, mientras que la SEQ ID NO.: 42 (EGR1) y la SEQ ID NO.: 45 (señuelo compuesto) lo hacen.

El efecto de intensidad aparece fuertemente en la regulación de la expresión de los genes Bdrkb2 y Scn9a, como se

45 muestra en la Fig. 7D. Cuando un gen queda inhibido por al menos dos factores de transcripción que son diana de la secuencia compuesta, la intensidad de la inhibición es más fuerte que la inhibición transmitida por las secuencias individuales. Por ejemplo, la expresión inicial de Bdrkb2 queda individualmente inhibida mediante un factor de 5 mediante la SEQ ID NO.: 4 y la SEQ ID NO.: 15, mientras queda inhibida por un factor de 10 mediante el oligonucleótido señuelo compuesto, SEQ ID NO.: 45.

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fluorescentes observadas con un microscopio de fluorescencia.

Reacciones de transcripción inversa semicuantitativa y en cadena de la polimerasa (sqRT-PCR)

5 El ARN total se extrajo de las células usando el kit RNeasy Plus (Qiagen, EE.UU.) que garantiza la eliminación del ADN genómico durante la extracción del ARN. Cantidades equivalentes de ARN se sometieron a transcripción inversa para obtener ADNc para cada condición, usando tanto el kit de síntesis First-strand cDNA (GE healthcare, NJ, EE.UU.) o el sistema Superscript 1st strand (Invitrogen, CA, EE.UU.) y un dieciseisavo de cada RT se utilizó en la reacción de la PCR. La PCR se realizó con 20 µl totales usando la mezcla maestra de Promega (Promega, WI, 10 EE.UU.) con los siguientes ciclos: 95 ºC 1 min, 55 ºC 1 min, 72 ºC 1 min (25 ciclos para los genes constitutivos ACTB y Gapdh, 35 ciclos para el resto de genes para la detección de material en el intervalo de detección lineal y antes de la saturación de la señal). Todos los cebadores utilizados (véase la Tabla 3) se han descrito anteriormente.

Tabla 3

Cebador: Secuencia 5'·3' SEQ ID NO.:

hACTB S: AAGAGAGGCATCCTCACCCT SEQ ID NO.: 54

hACTB AS: TACATGGCTGGGGTGTTGAA SEQ ID NO.: 55

hBCL2 S: GGAAGTGAACATTTCGGTGAC SEQ ID NO.: 56

hBCL2 AS: GCCTCTCCTCACGTTCCC SEQ ID NO.: 57

hCDK5R1 S: GCCGTACAGAACAGCAAGAA SEQ ID NO.: 58

hCDK5R1 AS: GTCGGCATTTATCTGCAGCA SEQ ID NO.: 59

rBdkrb2 S: GAACATCTTTGTCCTCAGC SEQ ID NO.: 60

rBdkrb2 AS: CCGTCTGGACCTCCTTGAAC SEQ ID NO.: 61

rBdnf S: GGCTTTGATGAGACCGGGTTCCCT SEQ ID NO.: 62

rBdnf AS: GTAGGCCAAGTTGCCTTGTCCGT SEQ ID NO.: 63

rCacnalb S: ATGCTGTTCTTCATCTACGC SEQ ID NO.: 64

rCacnalb AS: TTGTCCATGATCACAGCAAC SEQ ID NO.: 65

rEgr1 S: AGATGATGCTGCTGAGCAAC SEQ ID NO.: 66

rEgr1 AS: AGTAAATGGGACTGCTGTCG SEQ ID NO.: 67

rGapdh S: CCGCTGATGCCCCCATGTTTGTGAT SEQ ID NO.: 68

rGapdh AS: GGCATGTCAGATCCACAACGGATAC SEQ ID NO.: 69

rGch1 S: CCACGCCATGCAGTTCTTCACCA SEQ ID NO.: 70

rGch1 AS: AGGCTGCAAGGCTTCTGTGATGGC SEQ ID NO.: 71

rGrm5 S: GTGGCGGAGGCAGAGGAGAGC SEQ ID NO.: 72

rGrm5 AS: GTGGCCGCGGTGGACAACAT SEQ ID NO.: 73

rHtr3a S: AATCAGGGCGAGTGGGAGC SEQ ID NO.: 74

rHtr3a AS: GAGGACAGCTCTTGCAAGAGGC SEQ ID NO.: 75

rNos1 S: GAATACCAGCCTGATCCATGGAAC SEQ ID NO.: 76

rNos1 AS: TCCTCCAGGAGGGTGTCCACCGCA SEQ ID NO.: 77

rP2rx3 S: TGGCGTTCTGGGTATTAAGATCGG SEQ ID NO.: 78

rP2rx3 AS: CAGTGGCCTGGTCACTGGCGA SEQ ID NO.: 79

rCdk5rl S: GCTCTGCAGGGATGTTATCTCC SEQ ID NO.: 80

rCdk5rl AS: CTTCTTGTCCTCCTGACCACTC SEQ ID NO.: 81

rPnmt S: CAGACTTCTTGGAGGTCAACCTG SEQ ID NO.: 82

rPnmt AS: TTATTAGGTGCCACTTCGGGTG SEQ ID NO.: 83

rScn9a S: TTCATGACCTTGAGCAACCC SEQ ID NO.: 84

rScn9a AS: TCTCTTCGAGTTCCTTCCTG SEQ ID NO.: 85

S= sentido directo, AS = sentido contrario, h = ser humano, r = rata.

15 12,5 µl de cada reacción de la PCR se detectó en gel de agarosa al 1 % (Invitrogen, CA, EE.UU.) con bromuro de etidio (Fisher Scientific, PA, EE.UU.). Las imágenes de las bandas del gel se capturaron con un sistema de obtención de imágenes de gel FluorChem SP (Alpha Innotech, CA, EE.UU.) y se analizaron usando el programa informático Image J (NIH, MD, EE.UU.). Los niveles de expresión se normalizaron con respecto a los niveles de 20 ACTB para los experimentos con HL60 y con respecto a los niveles de Gapdh para los experimentos con PC12. La significación estadística se midió con el test de la t de Student bilateral. Las curvas dosis-respuesta se ajustaron a la ecuación de descomposición exponencial.

Experimentos ELISA con factor de transcripción 25 La afinidad y la especificidad de las secuencias señuelo por sus factores de transcripción diana se midió con los kits colorimétrico de ELISA (inmunoensayo enzimático) para factor de transcripción (Panomics, CA, EE.UU.). En resumen, las secuencias señuelo diseñadas acopladas a biotina se incubaron durante 30 minutos con extractos de proteínas nucleares procedentes de células K-562 estimuladas con TPA que expresaban los factores de 30 transcripción diana (Activemotif, CA, EE.UU.). Las mezclas de proteínas y secuencias señuelo se cargaron en placas

Claims

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