JPH06511155A - ギャップを有する２′修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

キャップ付き２′修飾オリゴヌクレオチド発明の分野 本発明は、ＲＮａｓｅＨを始動させるオリゴヌクレオチドおよび高分子を合成し 、反対鎖の鎖開裂に使用することに関するものである。本発明は、オリゴヌクレ オチドの少なくとも若干のヌクレオチドがヌクレアーゼ耐性となるように官能化 され、オリゴヌクレオチドの少な（とも若干のヌクレオチドが相補鎖への該オリ ゴヌクレオチドのハイブリッド形成を高める置換基を含み、かつオリゴヌクレオ チドの少なくとも若干のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペン トフラノシル糖部分を含む、オリゴヌクレオチドを包含する。これらのオリゴヌ クレオチドおよび高分子は、療法、診断に、および研究試薬として有用である。 発明の背景 大部分の疾病状態を含めて、哺乳動物の大部分の身体状態が蛋白質により影響さ れることは周知である。これらの蛋白質は、直接に作用して、またはそれらの酵 素機能によって、動物およびヒトの多くの疾病に大幅に関与している。古典的な 療法は一般にそれらの蛋白質との相互作用に注目し、それらが疾病を引き起こす 機能または疾病を増強する機能を緩和する努力を行ってきた。しかし最近では、 蛋白質合成を指示するメンセンンヤーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）または他の細胞内Ｒ ＮＡとの相互作用によって、それらの蛋白質の実際の産生を緩和する試みがなさ れている。一般にこのような療法の目的は、望ましくない蛋白質産生に導（遺伝 子発現を阻害するか、または他の形で調節することである。 アンチセンス法は、比較的短いオリゴヌクレオチドを一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖 ＤＮＡと相補的ハイブリッド形成させ、これによりこれらの細胞内核酸の正常な 本質的機能を混乱させるものである。ハイブリッド形成は、ワトソンークリック 塩基対を介した、ＲＮＡまたはＤＮＡへのオリゴヌクレオチドの複素環式塩基の 配列特異的水素結合である。このような塩基対は、互いに相補的であると言われ る。 核酸の機能を混乱させる自然の事象は、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）がＯｌｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳ：＾ｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇ ｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ＣＲＣブレス社、フロリダ州ポカレイトン（ １９８９）　、に述べているように、２種類のものであると考えられる。 第１はハイブリッド形成の阻害である。これは、オリゴヌクレオチド系の阻害剤 が標的液酸に結合し、従って単純な立体障害によって必須蛋白質（大部分の場合 リポソーム）が核酸に結合するのを阻害する、終結事象を意味する。メチルホス ホネートオリゴヌクレオチド（参照：たとえばミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、＾ｎ ｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１９８７．２．１１７）および α−アノマーオリゴヌクレオチドは、ハイプリント形成阻害により核酸の機能を 混乱させると考えられる２種類の最も広範に研究されているアンチセンス剤であ る。 オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成阻害の程度を判定する際には、個々のハ イブリッド形成したコンプレックスの融解温度を測定することにより、オリゴヌ クレオチドが相補的核酸に結合する相対的能力を比較することができる。二重ら せんの特徴的な物理的特性である融解温度（Ｔ、）は、コイル形（ハイブリッド 形成していないもの）に対してらせん形（ハイブリッド形成したもの）が５０％ 存在する温度（℃）を表す。Ｔ、、はＵＶスペクトルを用いてハイブリッドの形 成および破壊（融解）を判定することにより測定される。ハイブリッド形成に際 して起こる塩基の重なりに伴って、ＵＶ吸収の減少（淡色効果）が生じる。従っ て、ＵＶ吸収の減少はＴ、がより高いを示す。Ｔ７が高いほど、鎖の結合強度は 大きい。非ワトソンークリック塩基対合、すなわち不適性塩基対合は、Ｔ、に対 して強い不安定化作用をもつ。 アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する第２の種類の終結事象は、細胞内ＲＮ ａｓｅＨによる標的ＲＮＡの酵素開裂を伴うものである。このようなＲＮａｓｅ Ｈ開裂のメカニズムは、２′　−デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドが 標的ＲＮＡにハイブリッド形成することを必要とする。生じたＤＮＡ−ＲＮＡ二 重らせんはＲＮａｓｅＨ酵素を活性化し；この活性化された酵素がＲＮＡ鎖を開 裂させる。ＲＮＡ鎖の開裂は、ＲＮＡの正常な機能を破壊する。ボスホロチオエ ートオリゴヌクレオチドは、この種類の終結事象により作動するアンチセンス剤 の顕著な一例である。ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨの活性化に有用 であるには、ＲＮａｓｅＨ活性化に十分な期間、細胞内で耐えるために、オリゴ ヌクレオチドがヌクレアーゼに対して妥当な程度に安定でなければならない。 ワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）らの幾つかの最近の文献が、さらにＲＮａｓｅＨとオ リゴヌクレオチドの相互作用につき述べている。特に興味深いのは下記のもので ある；　（１）ダグレ（Ｄａｇｌｅ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　１９９０．１８，４７５１　：　（２）ダグレ（Ｄａｇｌｅ）ら 、　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐａ＋ｅｎ ｔ　１９９１．１．１１　；　（３j エダー（Ｅｄｅｒ）ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１９９１．２６６、 ６４７２　；および（４）ダグレ（Ｄａｇｌｅ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９９１．１９．１８０５゜これらの報文中でワルダ ーらは、非修飾ホスホジエステル−ヌクレオチド間結合および修飾ホスホロチオ エート−ヌクレオチド間結合の両方を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドは細胞性Ｒ Ｎａ　ｓ　ｅＨの基質であると述べている。それらは基質であるので、ＲＮａｓ ｅＨによる標的ＲＮＡの開裂を活性化する。しかし彼らはさらに、アフリカッメ ガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚においてはホスホジエステル結合およびホスホロ チオエート結合は両方ともエキソヌクレアーゼ分解をも受けると述べている。こ のようなヌクレアーゼ分解はＲＮａｓｅＨ活性化に用いられるオリゴヌクレオチ ドを急速に減少させるので、不利である。 文献（１）、（２）および（４）に記載されるように、それらのオリゴヌクレオ チドをヌクレアーゼ分解に対して安定化し、なおかつＲＮａｓｅＨ活性化をもた らすために、ワルダーらはホスホルアミデート、アルキルホスホネートまたはホ スホトリエステル結合のセクション間に位置する短いホスホジエステル結合ヌク レオチドのセクションを含む２′−デオキシオリゴヌクレオチドを作成した。 ホスホルアミデートを含むオリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼに対しては 安定化されたが、文献（４）中で彼らは、各ホスホルアミデートがホスホルアミ デートを含むオリゴヌクレオチドのＴ１測定値を１．６℃低下させると述べてい る。このようなＴ７値の低下は、オリゴヌクレオチドとその標的鏡開のハイブリ ッド形成が望ましくない減少を生じることを示唆する。 池の文献著者らは、このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとその標的鏡開 のハイブリッド形成の減損が及ぼす可能性のある作用について解説している。 サイソンーベーモアラ７．　（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら、　ＥＭ ＢＯＪｏｕｒｎａｌ　１９９１．１０．１１１１は、オリゴヌクレオチドが細胞 性ＲＮａｓｅＨの基質であったとしても、ｍＲＮＡへのハイブリッド形成は弱い のでＲＮａｓｅＨによる開裂効率は低いということを観察している。彼らは、オ リゴヌクレオチドの３′末端にアクリジン置換基を導入することによりオリゴヌ クレオチドがエキソヌクレアーゼから保護されるとも述べている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡ鎖の開裂 は有用であることは認められているが、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 およびハイブリッド形成の忠実度も極めて重要である。これまで、ＲＮａｓｅＨ を活性化し、一方では同時にハイブリッド形成性を維持または向上させ、かつヌ クレアーゼ耐性を付与しつる方法または材料については、このような方法および 材料が以前から要望されていたにもかかわらず当技術分野において示唆されてい ない。従ってこのような方法および材料に対する以前からの要望が残されている 。 発明の目的 本発明の目的は、標的鎖とのハイブリッド形成に際してＲＮａｓｅＨを活性化し 、かつヌクレアーゼ分解に抵抗するオリゴヌクレオチドを提供することである。 本発明の他の目的は、ＲＮａｓｅＨを活性化し、ヌクレアーゼ分解を阻害し、か つオリゴヌクレオチドと標的鎖との間の向上した結合親和性を備えたオリゴヌク レオチドを提供することである。 さらに他の目的は、特に疾病状態の動物の身体状態をアッセイするための研究お よび診断の方法および材料を提供することである。 他の目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡの活性を調節することにより疾病を治療するた めの療法ならびに研究の方法および材料を提供することである。 発明の詳細な説明 本発明の１形態によれば、ヌクレオチド単位の配列から形成されるオリゴヌクレ オチドが提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌ クレアーゼ耐性を増大させるように官能化されたヌクレオチド単位少な（とも１ 個を含む。さらにオリゴヌクレオチドの少な（とも若干のヌクレオチド単位は標 的ＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるために置換基で官能化本 発明の好ましいオリゴヌクレオチドにおいては、結合親和性を高めるために置換 基で官能化されたヌクレオチド単位は、２′−置換基を含むように官能化される 。より好ましい形態においては、２′−置換基がフルオロ、Ｃｌ−９アルコキシ 、Ｃ１−９アミノアルコキシであり、これにはアミノプロポキシ、アリルオキシ 、Ｃ，−Ｃ，−アルキル−イミダゾールおよびポリエチレングリコールが含まれ る。好ましいアルコキノ置換基にはメトキン、エトキシおよびプロポキシが含ま れる。好ましいアミノアルコキン単位はアミノプロポキシである。好ましいアル キル−イミダゾールは１−プロピル−３−（イミダゾリル）である。 増大したヌクレアーゼ耐性をもつ本発明のある種の好ましいオリゴヌクレオチド においては、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド単位がホスホロチオエートま たはホスホロジチオエート−ヌクレオチドである。他の好ましいオリゴヌクレオ チドにおいては、３′末端ヌクレオチド単位が２′　もしくは３′置換基または これら両者で官能化されている。 オリゴヌクレオチドには、相補的核酸鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を 高める置換基を保有する、複数のヌクレオチド単位が含まれる。ある種の好まし い形態においては、それらの置換基を保有するヌクレオチド単位を第１ヌクレオ チド単位サブ配列および第２ヌクレオチド単位サブ配列に分けることができ、２ ′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル構造が第１ヌクレオチド単位 サブ配列と第２ヌクレオチド単位サブ配列の間のオリゴヌクレオチド内に位置す る。それらの介在ヌクレオチド単位がすべて２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒ。 −ペントフラノシル単位であることが好ましい。 本発明の他の好ましいオリゴヌクレオチドにおいては、結合親和性を高める置換 基を保有するヌクレオチド単位は、オリゴヌクレオチドの３′または５′末端の うち一方または両方に位置する。置換基で置換されたヌクレオチド単位が１−約 ８個あってもよい。好ましくは少なくとも５個の連続したヌクレオチド単位が本 発明は、α−ヌクレオシド、β−ヌクレオシド（２′　−デオキシ−ｅｒｙｔｈ ｒｏ−ペントフラノシル　β−ヌクレオシドを含む）、４′　−チオヌクレオシ ド、および炭素環式ヌクレオシドから選ばれる複数の結合ヌクレオシドから形成 された高分子をも提供する。これらのヌクジオシトは相補的核酸にハイブリッド 形成しうる配列の結合により連結されている。これらの結合は帯電リン結合、中 性リン結合、および非リン結合から選ばれる。結合したヌクジオシトの配列は少 な（とも２領域に分けられる。第１ヌクジオシト領域には下記の種類のヌクレオ シドが含まれる：帯電および中性３’　−５’　リン結合により結合したα−ヌ クレオシド；帯電および中性２’　−５’　リン結合により結合したα−ヌクレ オシド；非リン結合により結合したα−ヌクレオシド：帯電および中性３’　− ５’　リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド：帯電および中性２’　 −５’　リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；非リン結合により結 合した４′−チオヌクレオシド；帯電および中性３’　−５’　リン結合により 結合した炭素環式ヌクレオシド；帯電および中性２’　−５’　リン結合により 結合した炭素環式ヌクレオシド；非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシ ド；帯電および中性２′−５′　リン結合により結合したβ−ヌクレオシド；非 リン結合により結合したβ−ヌクレオシド。第２ヌクジオシト領域は、生理的ｐ Ｈにおいて負の電荷をもつ帯電３’　−５’　リン結合により結合した２′−デ オキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル　β−ヌクレオシドからなる。好ま しい形態においては、高分子はこの２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフ ラノシル　β−ヌクレオシドを少なくとも３個、好ましくはこの２′−デオキシ −ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル　β−ヌクレオシドを少なくとも５個含む 。他の好ましい形態においては、第３ヌクンオシド領域があり、そのヌクジオシ トは第１領域につき選ばれるものから選ばれる。好ましい形態においては、第２ 領域が第１領域と第３領域の間に位置する。 好ましい帯電リン結合には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロ ジチオエート、ホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合が含まれる：ホ スホジエステルおよびホスホロチオエート結合が特に好ましい。好ましい中性リ ン結合には、アルキルおよびアリールホスホネート、アルキルおよびアリ−ルホ スホロアミダイト、アルキルおよびアリールホスホトリエステル、ノーイドロジ エンホスホネート、ならびにボラノホスフヱート結合が含まれる。好ましい非リ ン結合には、ペプチド結合、ヒドラジン結合、ヒドロキシアミン結合、カルバメ ート結合、モルホリン結合、カーボネート結合、アミド結合、オキシメチレンイ ミン結合、ヒドラジド結合、シリル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合、 スルホン結合、スルフィド結合、スルホネート結合、スルホンアミド結合、ホル ムアセクール結合、チオホルムアセタール結合、オキシム結合、およびエチレン グリコール結合が含まれる。 本発明は、それぞれヌクジオシトおよび核酸塩基から選ばれる複数の結合した単 位から形成される高分子をも提供する。ヌクジオシトには、α−ヌクレオシド、 β−ヌクレオシド（２′　−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル　β −ヌクレオシドを含む）、４′　−チオヌクレオシド、および炭素環式ヌクレオ シドが含まれる。核酸塩基には、プリン−９−イルおよびピリミジン−１−イル 複素環式塩基が含まれる。これらの単位のヌクジオシトおよび核酸塩基は、その 配列が相補的核酸にハイブリッド形成しつる配列の結合により互いに連結されて おり、結合した単位の配列は少なくとも２領域に分けられる。これらの結合は帯 電３′−５′　リン結合、中性３’　−５’　リン結合、帯電２’　−５’　リ ン結合、中性２′−５′　リン結合、および非リン結合から選ばれる。第１領域 には、非リン結合により結合した核酸塩基、および非糖−締結基（ｔｅｔｈｅｒ ｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）を介してリン酸結合に結合した核酸塩基、ならびに下記よ り選ばれるヌクジオシトが含まれる・帯電および中性３’　−５’　リン結合に より結合したα−ヌクレオシド；帯電および中性２’　−５’　リン結合により 結合したα−ヌクレオシド：非リン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電 および中性３’　−５’　リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；帯 電および中性２’　−５’　リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド； 非リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；帯電および中性３’　−５ ’　リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；帯電および中性２’　−５ ’　リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；非リン結合により結合した 炭素環式ヌクレオシド；帯電および中性２’−５’結合により結合したβ−ヌク レオシド、非リン結合により結合したβ−ヌクレオシド。第２領域には、３’　 −５’　リン結合が生理的ｐＨにおいて負の電荷をもつ帯電３’−５’　リン結 合により結合した２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル　β−ヌ クレオシドのみが含まれる。 ある種の好ましい形態においては、第１領域は非リン酸結合、たとえばペプチド 結合により結合した、少なくとも２個の核酸塩基を含む。好ましい形態において は、高分子は第１領域につき上記に述べたものと同じ基から選ばれる第３領域を 含む。好ましい形態においては、第２領域が第１領域と第３領域の間に位置する 。 本発明は、それぞれヌクジオシトおよび核酸塩基から選ばれる複数の結合した単 位を含む高分子をも提供する。ヌクジオシトはα−ヌクレオシド、β−ヌクレオ シド、４′−チオヌクレオシド、および炭素環式ヌクジオシトから選ばれ、核酸 塩基はプリン−９−イルおよびピリミジン−１−イル複素環式塩基から選ばれる 。これらの単位のヌクジオシトおよび核酸塩基は、その配列が相補的核酸にハイ ブリッド形成しつる配列の結合により互いに連結されている。結合した単位の配 列は少なくとも２領域に分けられる。これらの結合は帯電リン結合、中性リン結 合、または非リン結合から選ばれる。第１領域には下記のものが含まれる：帯電 および中性３’　−５’　リン結合により結合したα−ヌクレオシド：帯電およ び中性２’　−５’　リン結合により結合したα−ヌクレオシド：非リン結合に より結合したα−ヌクジオシト；帯電および中性３’−５’　リン結合により結 合した４′−チオヌクレオシド、帯電および中性２’　−５’　リン結合により 結合した４′−チオヌクレオシド：非リン結合により結合した４′−チオヌクレ オシド；帯電および中性リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド：非リン 結合により結合した炭素環式ヌクレオノド：帯電および中性３’　−５’　リン 結合により結合したβ−ヌクレオシド；帯電および中性２’　−５’　リン結合 により結合したβ−ヌクレオシド；非リン結合により結合したβ−ヌクレオシド 。第２領域には、非リン結合により結合した核酸塩基、および非糖−締結部分を 介してリン酸結合に結合した核酸塩基が含まれる。 本発明の好ましい核酸塩基には下記のものが含まれる：アデニン、グアニン、シ トシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン 、６−メチルおよび他のアルキルアデニン、２−プロピルおよび他のアルキルア デニン、５−ハロウラノル、５−ハロントシン、６−アザウラシル、６−アザジ トンンおよび６−アザチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウ ラノル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８− チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニンおよび他の８置換アデニ ン、ならびに８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、 ８−チオールアルキルグアニン、８−ヒドロキシルアデン、および他の８置換グ アニン、池のアザおよびデアザウラシル、他のアザおよびデアザチミジン、他の アザおよびデアザノトンン、池のアザおよびデアザアデニン、他のアザおよびデ アザグアニン、または５−トリフルオロメチルウラシル、および５−トリフルオ ロメチルン。 本発明は、望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生物の治療方法をも 提供する。これらの方法は、相補的核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌ クレオチドの配列を有し、かつ少なくとも１個のヌクレオチドがヌクレアーゼに 対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化され、かつ 相補的核酸鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそれに配 置された置換基を有し、かつ複数のヌクレオチドが２′−デオキシーｅｒｙｔｈ ｒｏ領域：−ペントフラノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、該生物を 接触させることを含む。 さらに本発明によれば、相補的核酸鎖に特異的に７）イブ１ルソド形成しつるヌ クレオチドの配列を有し、かつ少なくとも１個のヌクレオチドがヌクレアーゼに 対するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化され、かつ 複数のヌクレオチドが相補的核酸鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を 高めるためにそれに配置された置換基を有し、かつ複数のヌクレオチドが２′− デオキ／−ｅｒｙｔｈｒ○−ベントフラノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチ ドを薬剤学的に有効な量で含有する組成物が提供される。この組成物はさら１こ 薬剤学的に許容しつる希釈剤またはキャリヤーを含有する。 さらに本発明によれば、配列特異性核酸のインビトロ修飾方法であって、相補的 核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しつるヌクレオチドの配列を有し、かつ少な くとも１個のヌクレオチドがヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドのヌクレ アーゼ耐性を高めるために官能化され、かつ複数のヌクレオチドが相補的核酸鎖 に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそれに配置された置換 基を有し、かつ複数のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペント フラノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、ＲＮａｓｅＨ酵素および上記 核酸を含有する被験溶液を接触させることを含む方法が提供される。 また、生物においてハイブリッド形成およびＲＮａｓｅＨ酵素活性化を同時に増 大させる方法であって、相補的核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しつるヌクレ オチドの配列を有し、かつ少なくとも１個のヌクレオチドがヌクレアーゼに対す るオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化され、かつ複数 のヌクレオチドが相補的核酸鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高め るためにそれに配置された置換基を有し、かつ複数のヌクレオチドが２′−デオ キシーｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと 、該生物を接触させることを含む方法も提供される。 図面の簡単な説明 本発明は図面と関連づけるとより良く理解されるであろう。 第１図は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび対照化合物の用量応答活性を示す グラフであり： 第２図は、本発明のオリゴヌクレオチドおよび対照化合物の用量応答活性を示す 棒グラフである。 発明の詳細な説明 本発明の目的に従って、増大したヌクレアーゼ耐性、相補鎖に対する増大した結 合親和性を兼ね備え、かつＲＮａｓｅＨに対する基質である、新規なオリゴヌク レオチドおよび高分子が提供される。本発明のオリゴヌクレオチドおよび高分子 は複数のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは核酸塩基サブユニツトから組み立て られる。本発明のオリゴヌクレオチドおよび高分子は、オリゴヌクレオチドのヌ クレアーゼ耐性を高めるために官能化されたヌクレオチド、ヌクレオシドまたは 核酸塩基単位を少なくとも１個含む。さらに本発明の特定の形態においては、少 なくとも若干のヌクレオチドまたはヌクジオシト単位が、相補的核酸鎖に対する オリゴヌクレオチドまたは高分子の結合親和性を高める置換基を保有する。さら に少なくとも若干のヌクレオチド単位が２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペン トフラノシル基をそれらの糖部分として含む。 上記のガイドラインに関連して、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド単 位、あるいはサブユニットと呼ばれるものはそれぞれ、″天然′または′合成″ 部分のいずれであってもよい。従って本発明に関してまずたとえば′オリゴヌク レオチド″という語は、複数の結合したヌクレオチド単位から形成されるポリヌ クレオチドを意味する。ヌクレオチド単位は固有のヌクレオシド間ホスホジエス テル結合により互いに結合する。ヌクレオチド単位は天然の塩基およびペントフ ラノシル糖基から形成される。従って″オリゴヌクレオチド″という語は事実上 、天然種または天然のヌクレオチド単位から形成される合成種を包含する。 本発明のオリゴヌクレオチドは修飾されたサブユニットをも含むことができる。 修飾は、ヌクレオチドの塩基部分、ヌクレオチドの糖部分、または１つのヌクレ オチドを次のものに連結する結合に行うことができる。さらにヌクレオノド単位 はヌクレオシド間リン酸結合に代わる連結基を介して結合することもできる。こ の種類の高分子はオリゴヌクレオノドとして認識されている。これらのオリゴヌ クレオシドにおいて、結合には一〇　Ｃ８２ＣＨ２０−結合（すなわちエチレン グリコール結合）、および下記の米国特許出願明細書に示される他の新規な結合 が含まれる：出願番号５６６．８３６．１９９０年８月１３日出願、名称：新規 なヌクレオシド類似体；出願番号７０３，６１９．１９９１年５月２１日出願、 名称：主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体；および出願番号９０３，１６ ０．１９９２年６月２４日出願、名称　異種原子によるオリゴヌクレオチド結合 。 池の修飾は糖に、塩基に、またはヌクレオチドのリン酸基に行うことができる。 代表的な修飾は下記に示されている；米国特許出願明細書：出願番号４６３．　 ３５８．１９９０年１月１１日出願、名称：ＲＮＡ活性を検出および調節するた めの組成物および方法：出願番号５６６．９７７．１９９０年８月１３日出願、 名称：遺伝子発現を検出および調節する糖修飾されたオリゴヌクレオチド：出願 番号５５８．６６３．１９９０年７月２７日出願、名称：新規なポリアミン結合 オリゴヌクレオチド、出願番号５５８，８０６．１９９１年７月２７日出願、名 称：遺伝子発現を検出および調節する、ヌクレアーゼ耐性のピリミジン修飾オリ ゴヌクレオチド、ならびに国際特許出願０３９１１００２４３号明細書、１９９ １年１月１１日出願、名称：ＲＮＡ活性を検出および調節するための組成物およ び方法。これらはすべて本出願と同一出願人によるものである。上記特許出願明 細書それぞれの記載を本明細書に参考として引用する。 従ってオリゴヌクレオチドという語は、天然の構造体、ならびに天然の塩基、天 然の糖および天然のホスホジエステル結合と同様に機能する、非天然または″修 飾された′構造体−−修飾された糖部分、修飾された塩基部分、または修飾され た糖結合部分を含むｍ−を包含するものとする。従ってオリゴヌクレオチドは、 変化した塩基部分、変化した糖部分、または変化した糖量結合を有しつる。これ らの例には下記のものが含まれる。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート 、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、ホスホロチ オエート、およびホスホロジチオエート型のヌクレオシド間結合など、ホスホジ エステル型のヌクレオシド間結合の代わりに用いられるもの；デアザまたはアザ プリンおよびピリミジンなど、天然のプリンおよびピリミジン塩基の代わりに用 いられるもの；５位または６位に置換基をもつピリミジン塩基；２．６または８ 位に、変化した、または置き換えた置換基をもつプリン塩基：あるいは２′位に 置換基をもつ糖、糖の水素原子１個もしくは２個以上の置換体、または炭素環式 もしくは非環式の糖類似体。それらは本発明の精神と一致する他の修飾を含んで もよい。それらのオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド（または天 然の系列に沿った合成オリゴヌクレオチド）と機能的に互換性であるが、天然構 造体との相異点を１または２以上もつものであると述べるのが最も良い。これら のオリゴヌクレオチドはすべて、それらが目的とするＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の構 造を効果的に模倣する機能をもつ限り、本発明に包含される。 本発明の好ましい１形態においては、ヌクレアーゼ耐性はホスホロチオエート型 のヌクレオシド間結合を用いることにより達成される。本発明者らはワルダー（ ｆａｌｄｅｒ）ら（前掲）の報告と異なり、ホスホンエステル結合からホスホロ チオエート結合へのヌクレオシド間結合の修飾が種々の３′−エキソヌクレアー ゼを含有するウシ胎仔血清などの系中でヌクレアーゼ耐性をもっことを見出した 。 プリル（Ｂｒｉｌｌ）ら、Ｊ、＾ＩＩ１．　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　１９９１． １１３．３９７２は、ホスホロンチオエートオリゴヌクレオチドもヌクレアーゼ 耐性を示すことを最近報告している。彼らは、ホスホロジチオエートオリゴヌク レオチドが相補的デオキシオリゴヌクレオチドと結合し、ＲＮａｓｅＨを刺激し 、かつＩａｃリプレッサーおよびｃｒ。 リプレッサーの結合を刺激することも報告している。これらの特性からみて、ホ スホロジチオエート結合も本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高 めるのに有用であろう。 ヌクレアーゼ耐性はさらに、オリゴヌクレオチドの３′末端にドデカノール基を 結合させるサイソンーベーモララス（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏｒａｒａｓ）ら （前掲）の方法により、オリゴヌクレオチドの３′末端に基を導入することによ って達成することができる。増大したヌクレアーゼ耐性を付与するための他の適 切な基には下記のものが含まれるニステロイド分子および他の脂質、リポータ− 分子、コンジュゲート、および非芳香族親油性分子：非環式炭化水素、飽和およ び不飽和脂肪酸、ろう、テルペンを含む、ならびに脂肪族多環式炭化水素：アダ マンクンおよびバックミシスターフラーレン類（ｂｕｃｋｍｉｎｓｔｅｒｆｕｌ ｌｅｒｒｅｎｅｓ）を含む。ステロイド分子ＳＤＷこの目的に特に有用なものは 、コール酸、デオキシコール酸およびデヒドロコール酸を含む胆汁酸である。他 のステロイドには、コルチゾン、ジゴキンゲニン、テストステロン、およびコレ ステロール、さらにカチオン性ステロイド、たとえばコルチゾン環の３位に二重 結合を介して結合したトリメチルアミノメチルヒドラジド基をもつコルチゾンが 含まれる。特に有用なレポーター分子は、ビオチンおよびフルオレセイン染料で ある。これらの基を３′末端ヌクレオチドの２′　ヒドロキシ基または３′　ヒ ドロキシ基に直接に、または適宜なコネクターを用いて、下記に記載の方法で結 合させることができる：米国特許出願第７８２．３７４号明細書、１９９１年１ ０月２４日出願、名称：改良された取り込み特性その他の特性を備えたオリゴヌ クレオチド誘導体、本出願と同一の出願人、その内容全体を本明細書に参考とし て引用する。 本発明化合物の５′末端に官能基を結合させることも、ヌクレアーゼ耐性に寄与 しつる。それらの基には、有益な薬力学的または薬動力学的特性を示すアクリジ ン基（これはインターカレーター（挿入剤）としても作用する）または他の基が 含まれる。本発明に関して薬力学的特性を示す基には、オリゴヌクレオチドの取 り込みを向上させ、分解に対するオリゴヌクレオチドの耐性を高め、および／ま たはＲＮＡとの配列特異性ハイブリッド形成を増強する基が含まれる。本発明に 関して薬動力学的特性を示す基には、オリゴヌクレオチドの取り込み、分布、代 謝または分泌を向上させる基が含まれる。 さらにヌクレアーゼ耐性は、前記の一〇　ＣＨ２ＣＨ２０−結合、および同様な 米国特許出願第５６６．８３６．７０３．６１９および９０３．１６０号明細書 に示される結合を用いた場合に付与されると予想される。これらの種類の結合は ヌクレアーゼの天然の基質である天然のリン酸エステルを含む主鎖を用いないか らである。ホスホロチオエートその他のヌクレアーゼ耐性−ヌクレオチド間結合 を用いることにより本発明のオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性が付与され た場合、それらの結合はそれぞれのヌクレオチド間部位にあるであろう。他の形 態においては、すべてではないヌクレオチド間結合が修飾されてホスホロチオエ ートその他のヌクレアーゼ耐性結合になるであろう。 本発明者は、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット上に置換 基を導入することにより本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めうるこ とを見出した。好ましい置換基は２′置換基、すなわち本発明のオリゴヌクレオ チドのヌクレオチドサブユニットの糖部分の２′位に位置する置換基である。 現在好ましい置換基には、２′−フルオロ、２′−アルコキシ、２′−アミノア ルコキシ、２′−アリルオキシ、２′　−イミダゾール−アルコキシ、および２ ′−ポリ（エチレンオキシド）が含まれるが、これらに限定されない。アルコキ シおよびアミノアルコキシ基は、一般に低級アルキル基、特にＣ１−Ｃ９アルキ ルを含む。ポリ（エチレングリコール）は構造式（ＯＣＲ２ＣＨＪ　−０−アル キルのものである。特に好ましい置換基は、２′−フルオロ、２′　−メトキシ 、２′　−エトキシ、２′−プロポキシ、２′−アミノプロポキン、２′　−イ ミダゾールプロポキシ、２′−イミダゾールブトキシ、および２′−アリルオキ シ基である。 結合親和性は、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチド単位中に特 定の修飾された塩基を用いることによって高めることもできる。このような修飾 された塩基には、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６および０−６１１換 プリン（２−アミノプロピルアデニンが含まれる）が含まれる。他の修飾された ピリミジンおよびプリン塩基が、相補的核酸鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親 和性を高めるものと期待される。 ２′−置換基の使用は、本発明の置換オリゴヌクレオチドの結合親和性を高める 。公表された研究：カワサキおよびクック（Ｋａｗａｓａｋｉ、　Ｃｏｏｋ）ら 、２’　−ｄＲＩＢＯ−Ｆ修飾オリゴヌクレオチドの合成および生物物理学的研 究、核酸療法に関する会議、フロリダ州クリアウォーター、１９９１年１月１３ 日、において、本発明者はオリゴヌクレオチドの置換されたヌクレオチド単位当 たり１．６℃の結合親和性増大を報告した。これはオリゴヌクレオチドのヌクレ オチド５個上に置換基として２′−デオキシ−２′−フルオロ基をもっ１５ｍｅ ｒ　ホスホジエステルオリゴヌクレオチドについては、非置換オリゴヌクレオチ ドに匹敵する。 １１個のオリゴヌクレオチドがこの２′−デオキシ−２′−フルオロ基をもつ場 合、結合親和性は置換ヌクレオチド単位当たり１．８℃増大した。 この同じ研究において、１５ｍｅｒ　ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを対 応するホスホロチオエート類似体に誘導した。１５ｍｅｒ　ホスホジエステルオ リゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体と比較すると、ホスホロチオ エート類似体は１５ｍｅｒ　ホスホジエステルオリゴヌクレオチドの結合親和性 の約６６％の結合親和性をもつにすぎなかった。言い換えると、オリゴヌクレオ チドをそのホスホロチオエート類似体に誘導した際に結合親和性が失われた。 しかし２′−デオキシ−２′−フルオロ置換基が１５ｍａｒ　ホスホジエステル オリゴヌクレオチドのヌクレオチドのうち１１個に導入されると、１５ｍｅｒホ スホジエステルオリゴヌクレオチドをそのホスホロチオエート類似体に誘導する ことにより見られた低下が大幅に克服された。この化合物、すなわち１１個のヌ クレオチドが２′−デオキシ−２′−フルオロ基で置換されたｌ　５ｍｅ　ｒ　 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにおいては、結合親和性は置換基当たり ２゜５℃増大した。この研究においては、被験オリゴヌクレオチドに対して相補 的なＲＮＡ標的のＲＮａｓｅＨ酵素開裂を始動させる２′−デオキシ−ｅｒｙｔ ｈｒｏ−ペントフラノシル糖を有するヌクレオチドの連続した配列を含有させる 試みは行わなかった。 標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ酵素開裂を始動させるためには、本発明のオリゴヌク レオチドはＤＮＡタイプのセグメントであるセグメントまたはサブ配列を保有し なければならない。言い換えると、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド サブユニットのうち少なくとも若干が２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペント フラノシル糖部分をもたなければならない。本発明者は、本発明のオリゴヌクレ オチドが標的ＲＮＡとハイブリッド形成する際にＲＮａｓｅＨ活性を始動させる ためには、３個以上の連続した結合２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフ ラノシル含有ヌクレオチドサブユニットを含むサブ配列が必要であるらしいとい うことを見出した。現在では、本発明のオリゴヌクレオチド中に５個以上の連続 した２′−デオキシーｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブ ユニットを含むことが好ましい。少なくとも７個の連続した２′−デオキシーｅ ｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットの使用が特に好 ましい。 ＲＮａｓｅｌ−１の作用メカニズムは、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重らせんの認識、およ びこれに続（この二重らせんのＲＮＡの開裂である。前記の背景の章で述べたよ うに、他の当業者はＤＮＡ鎖にヌクレアーゼ安定性を付与するために、修飾され たＤＮＡ鎖を用いた。これを行うために彼らは、向上したヌクレアーゼ安定性を 付与するが、ハイブリッド形成性を損なう修飾リン酸結合を用いた。理論に拘束 されたくはないが、本発明者はオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは 他の高分子にヌクレアーゼ安定性を付与し、特定の場合には相補鎖への結合の増 大をも付与する特定のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を確認した。これ らには下記のものが含まれる：帯電および中性３’　−５’　リン結合により結 合したα−ヌクレオシド１帯電および中性２’　−５’　リン結合により結合し たα−ヌクレオシド：非リン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電および 中性３′−５′　リン結合により結合した４′〜チオヌクレオシド；帯電および 中性２′−５′　リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；非リン結合 により結合した４′−チオヌクレオシド；帯電および中性リン結合により結合し た炭素環式ヌクレオシド；非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド：帯 電および中性３′−５′　リン結合により結合したβ−ヌクレオシド；帯電およ び中性２’−５’リン結合により結合したβ−ヌクレオシド；ならびに非リン結 合により結合したβ−ヌクレオシド。それらにはさらに、リン酸結合に非糖−締 結基を介して結合するか、または非リン酸結合に結合した核酸塩基が含まれる。 この場合も特定の理論に拘束された（はないが、本発明者はＲＮａｓｅＨがＲＮ Ａ鎖を認識し、かつ開裂させるために満たさなければならない基準を見出した。 これらのうち第１は、開裂部位のＲＮＡ鎖はそのヌクレオシドが負の電荷を保有 するリン酸結合を介して結合していなければならないということである。さらに 開裂部位の糖はβ−ペントフラノシル糖でなければならず、かつ２′エンド配座 でなければならない。この基準に適合する唯一のヌクレオシド（ヌクレオチド） は、２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル　β−ヌクレオシドの ホスホンエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオ エートおよびホスホロジセレネートーヌクレオチドである。 上記の基準からみて、２′エンド配座であることが示された特定のヌクレオシド （たとえばシクロペンチルヌクレオシド）ですら、それらはペントフラノシル糖 を含まないのでＲＮａｓｅＨ活性を始動させないであろう。モデル作成によって 、オリゴヌクレオチド　４′−チオヌクレオシドはエンベロープ形配座ではある が、２′エンド配座ではないので、それらもＲＮａｓｅＨ活性を始動させないで あろうということが示された。さらにα−ヌクレオシドはβ−ペントフラノシル 糖と反対の配置をもつので、それらもＲＮａｓｅＨ活性を始動させないてあろう 。 リン酸結合に非糖−締結基を介して、または非リン酸結合を介して結合した核酸 塩基も、２′エンド配座のβ−ペントフラノシル糖をもつという基準を満たさな い。従ってそれらはＲＮａｓｅＨ活性を始動させないと思われる。 ここで用いるαおよびβヌクレオシドには、リボフラノシル、デオキシリボフラ ノノル（２′　−デオキシーｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）、およびアラ ビノフラノシル−ヌクレオシドが含まれる。４′−チオヌクレオシドは、ペント フラノシル環の４′環酸素原子がイオウで置換されたヌクレオシドである。炭素 環式ヌクレオシドは、環酸素が炭素原子で置換されたヌクレオシドである。炭素 環式ヌクレオシドには、適宜な核酸塩基が結合したシクロプロピル、シクロブチ ル、シクロベンチルおよびシクロヘキシル環（Ｃ８−Ｃｓ−炭素環式）が含まれ る。 上記のαおよびβヌクレオシド、４′−チオヌクレオシドおよび炭素環式ヌクレ オシドは、それらの複素環式塩基部分にさらに官能基を、また本発明の高分子中 のヌクレオシドの結合に用いられていない糖または炭素環部分の炭素原子上にさ らに官能基を含むことができる。たとえば置換基をプリン複素環の１．２．３． ６．７または８位、ピリミジン複素環の２．３．４．５、または６位に置くこと ができる。プリンおよびピリミジン複素環のデアザおよびアザ類似体を選ぶこと ができ、または２′置換された糖誘導体を選ぶことができる。これらの種類の置 換基はすべてヌクレオシドの技術分野で知られている。 α−ヌクレオノドがオリゴヌクレオチドに導入された；ガグノー（Ｇａｇｎｏｒ ）ら。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９８７．１５．１０４１９ により報告されるように、それらはＲＮａｓｅ　Ｈ分解を支持しない。炭素環に より修飾されたオリゴヌクレオチドが多数の研究者により合成され、それにはパ ーポスト（Ｐｅｒｂｏｓｔ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ ｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　１９８８． １６５．７４２　；サジ（Ｓａｇｉ）らA　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９９０．１８．２１３３　；お よびゼムゾ（Ｓｚｅｍｚｏ）ら、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　１ ９９０．３１．１４６３が含まれる。４′−チオヌクレオシドは少なくとも２５ 年前から知られている。最近、４′−チオリボフラノースを経由する改良された 合成法がセフリスト（Ｓｅｃｒｉｓｔ）らにより報告されている・第１０回国際 ラウンドテーブル、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの生物学的評価、 １９９２年９月１６−２０日、報文のアブストラクト、アブストラクト２１、な らびに国際特許出願公開Ｕ３９１１０２７３２号明細書。 オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−シュボレート（ｓｕｇｇｏｒａ ｔｅ）に導入するためには、αおよびβヌクレオシド、４′−チオヌクレオシド および炭素環式ヌクレオシドを５′位において（または炭素環式ヌクレオシドに ついては５′位に相当する位置）ジメトキントリチル基でブロックし、次いで３ ′位においてトリチル化およびホスフィチル化法によりホスフィチル化する：０ １ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ、　Ａ　Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｆ、　）編 ；　Ｔｈｅ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ　５ｅｒｉｅｓ、Ｉ　ＲＬブ レス、ニューヨーク、１９９１に報告。オリゴヌクレオチドへの導入はＤＮＡ合 成装置、たとえばＡＢ１３８０　Ｂ型合成装置を用い、エックスタイン（Ｅｃｋ ｓｔｅｉｎ）　（前掲）に示される合成プロトコールにより、ホスホジエステル 、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネートの形 成に適した化学を採用して行われるであろう。 ボラノホスフエート結合したオリゴヌクレオチドは、国際特許出願公開０８１０ ６９４９号明細書に記載の方法により製造される。ホスホロチオエートおよびホ スホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、セレノ部分を導入するための試 薬３Ｈ−１，２−ベンゾチアセレノ−３−オールを用いて、それらのチオ相当物 質と同様な方法で製造される。この試薬は、セレノチオホスフェートを対応する Ｈ−ホスホノチェートジエステルから、ストウィンスキー（Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ ）らの報告に従って製造するためにも有用である　第１０回国際うウンドテーブ ル：ヌクレオ／ド、ヌクレオチドおよびそれらの生物学的評価、１９９２年９月 １６−２０日、報文のアブストラクト、アブストラクト８０゜ホスホン酸水素結 合したオリゴヌクレオチドーーならびにアルキルおよびアリールホスホネート、 アルキルおよびアリールホスホトリエステル、ならびにアルキルおよびアリール ホスホルアミデート結合したオリゴヌクレオチドーーは、国際特許出願公開Ｕ３ ８８１０３８４２号明細書に記載の方法により製造される。この特許出願明細書 は、ホスホロチオエートおよびホスホロチオエート結合したオリゴヌクレオチド の製造についても述べている。 非リン酸主鎖には、カーポネ−１・、カルバメート、シリル、スルフィド、スル ホン、スルホキシド、スルホネート、スルホンアミド、ホルムアセクール、チオ ホルムアセタール、オキシム、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、 ジスルフィド、アミド、尿素およびペプチド結合が含まれる。ヌクレオシドがカ ーボネート結合により連結されたオリゴヌクレオシドは、たとえばマーテス（Ｍ ｅｒｔｅｓ）ら、　Ｊ、　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、　１９６９．１２．１５４、およ び後に他の人々が記載したものに従って製造される。ヌクレオシドがカルバメー ト結合により連結されたオリゴヌクレオシドは、最初にゲイト（Ｇａｉｔ）ら、 　Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　１１９７４，１６８４、および後に他 の人々が記載したものに従って製造される。ヌクレオシドがシリル結合により連 結されたオリゴヌクレオシドは、オシルビー（Ｏｇｉｌｖｉｅ）ら、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　１９８５．２６．４１５９、およびＮｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９８ｇ、　１６．４５８３の記載に従 って製造される。ヌクレオシドがスルフィド結合ならびに付随するスルホキシド およびスルホン結合により連結されたオリゴヌクレオシドは、ンユナイダー（Ｓ ｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９９０ ．３１．３３５、および他の刊行物、たとえば国際特許出願公開Ｕ５８９１０２ ３２３号明細書の記載に従って製造される。 ヌクレオシドがスルホネート結合により連結されたオリゴヌクレオシドは、ミュ ージッキ（Ｍｕｓｉｃｋｉ）ら、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　１９９１．５５．４ ２３１、およびＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ１９９１．３２．２３ ８５の記載に従って製造される。ヌクレオシドがスルホンアミド結合により連結 されたオリゴヌクレオシドは、キルシエンバウム（Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍ） ら、第５回サンディエゴ会議：核酸・最先端業績、ポスターアブストラクト２８ ．１９９０年１１月１４−１６日の記載に従って製造される。ヌクレオシドがホ ルムアセクールにより連結されたオリゴヌクレオシドは、マツツウーシ（Ｍａｔ ｔｅｕｃｃｉ）、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９９０．３１ ．２３８５、およびベーネマン（Ｖｅｅｎｅａ＋ａｎ）ら、　Ｒｅｃｕ■ ｉｔ　ｄｅｓ　Ｔｒａｖ、　Ｃｈｉｉ、　１９９０．１０９．４４９、ならびに 国際特許出願公開Ｕ８９０１０６１１０号明細書の記載に従って製造される。ヌ クレオシドがチオホルムアセタールにより連結されたオリゴヌクレオシドは、マ ツツウーシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら、Ｊ、＾ｌ。 Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１９９１．１１３．７７６７　；マッツウーシ（Ｍａｔ ｔｅｕｃｃｉ）ら、　Ｎｕｃｌｅｓｉｅｄｓ　＆　Ｎｕｃｌ■B ｔｉｄｅｓ　１９９１．１０．２３１、および上記の国際特許出願公開Ｕ８９０ １０６１１０号明細書の記載に従って製造される。 ヌクレオシドがオキシム、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンおよびアミド結合に より連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許出願第７０３．６１９号明細書 、１９９１年５月２１日出願、ならびに関連の国際特許出願ＵＳ９２１０４２９ ２およびＵ３９２１０４３０５号明細書、ならびに本発明者自身および共同研究 者により発表された対応する方法：バッスール（Ｖａｓｓｅｕｒ）ら、　Ｊ、　 Ａ＋ｉ、　ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ。 １９９２、１１４．４００６、およびデパート（Ｄｅｂａｒｔ）ら、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９９２，３３．２６４５の記載に従って製 造される。ヌクレオシドがモルホリン結合により連結されたオリゴヌクレオシド は、米国特許第５．０３４，５０６号明細書の記載に従って製造される。 本発明に用いるのに適した池の非リン酸結合には、２個の隣接異種原子を１個ま たは２個のメチレン部分と共に含む結合が含まれる。ヌクレオシドがこのような 結合により連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許出願第９０３．１６０号 明細書、１９９２年６月２４日出願、の記載に従って製造される。その記載全体 を本明細書に参考として引用する。 核酸塩基が非リン酸結合により連結され、この非リン酸結合がペプチド結合であ る構造単位は、国際特許出願ＥＰ１０１２１９号明細書の方法により製造される 。それらの構造単位を製造する際に用いるのに適した核酸塩基には下記のものが 含まれる：アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒ ボキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよ び他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアル キル誘導体、５−ハローウラシルおよびシトシン、６−アザ−ウラシル、シトシ ンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８− ハロ、アミノ、チオール、チオールアルキル、ヒドロキシおよび他の８置換され たアデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５置換されたウ ラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンならびに池の核酸塩基、たとえば米 国特許第３，６８７，８０８号明細書の記載のもの。 ペプチド結合には、アミド結合により連結した５、６および７原子の長さの主鎖 が含まれる。エステル、アミドおよびヒドラジド結合を含む他の同様な非リン酸 主鎖は、国際特許出願公開ＵＳ８６１００５４４および０３８６１００５４５号 明細書の方法により製造される。 前記の核酸塩基に関して示した複素環式塩基を含む他のびおよびβヌクレオシド 、４′−チオヌクレオシド、ならびに炭素環式ヌクレオシドを製造し、そしてそ れぞれのαおよびβヌクレオシド、４′−チオヌクレオシド、ならびに炭素環式 ヌクレオシドに導入することができる。 非糖−締結基には、３，４−ジヒドロキシブチル（参照：オーガスチンズ（＾Ｕ ｇｕｓｔｙｎｓ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９ ９１．１９．２５８７）およびジヒドロキシプロポキンメチル（シュナイダ−（ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、　１９９０． １１２．４５３）、ならびに他の直鎖、たとえばＣ＋　Ｃ＋。アルキル、アルケ ニルおよびアルキニルが含まれる。３．４−ジヒドロキシブチルおよびジヒドロ キシプロピルメチル型の非糖−締結基は、β−ペントフラノシル糖の非環式フラ グメントであるが、それらはＲＮａｓｅＨ活性化を始動する作用をもたないであ ろう。非糖−締結基として好ましいものは、３．４−ジヒドロキシブチル基であ る。ジヒドロキシプロピルメチルはハイブリッド形成に際してオリゴヌクレオチ ド類似体中に用いた場合、それと相補的核酸鎖との間の融解温度の抑制を示した からである。 天然核酸の正常な３’−５’ホスホジエステル結合は、隣接ヌクレオシドのそれ ぞれの糖量に３個の異種原子（−０−Ｐ−０−）をもつ。５′メチレン基（隣接 ヌクレオシドの３′側ヌクレオシドの５’　ＣＨ２）も含めると、これらのホス ホジエステル結合した核酸は４原子の長さの結合を介して連結していると見るこ とができる。 ２本のβ−オリゴヌクレオチド鎖は互いに逆平行極性でハイブリッド形成し、一 方α−オリゴヌクレオチド鎖はβ−オリゴヌクレオチド鎖と平行極性でハイブリ ッド形成するであろう。ある形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドはα −ヌクレオチドから形成された領域、およびβ−ヌクレオチドから形成された他 の領域をもつであろう。これら２領域が領域間結合を介して連結する。これらの オリゴヌクレオチドが対応する核酸の相補的β鎖に結合し、かつα領域の平行極 性をβ領域の逆平行極性と同時に維持するためには、本発明のオリゴヌクレオチ ドのαおよびβ領域間に３’−３’連結または５’−５’連結が形成されなけれ ばならない。３’−３’連結（５′　メチレン部分を含まない）は３原子の長さ の結合を与え、一方５’−５′連結（２個の５′メチレン部分を含む）は５原子 の長さの結合を与える。 隣接するαおよびβ領域間に４原子の長さの結合が望まれる本発明の形態につい ては、対称結合性のヌクレオシドまたはヌクレオシドスロゲートを用いると、そ れぞれの隣接ヌクレオシド対間に４原子の長さの結合が得られるであろう。この ような対称結合性のヌクレオシドスロゲートの例は３．３−ビス−ヒドロキシメ チルシクロブチルヌクレオシドである：水出願人の米国特許出願第８０８．　２ ０１号明細書、１９９１年１２月１３日出願、名称：シクロプチルオリゴヌクレ オチドスロゲート；その記載全体を本明細書に参考として引用する。 ４原子間隔を達成するための他の適切な結合には、核酸塩基がω（オメガすなわ ち最後）位に連結した一群の１−ヒドロキシル−２−ヒドロキシルメチル−アル カ−ω−イル型の部分が含まれるであろう。この型の結合の例は９−（１−ヒド ロキシル−２−メチルヒドロキシル−ペンタ−５−イル）アデニン、９−　（１ −ヒドロキシル−２−メチルヒドロキシル−ペンタ−５−イル）グアニン、１− （１−ヒドロキシル−２−メチルヒドロキシル−ペンタ−５−イル）ウリジン、 １−（１−ヒドロキシル−２−メチルヒドロキシル−ペンタ−５−イル）シトシ ン、ならびに対応する３、４および７原子類似体であり、この場合はペンチル基 の代わりにプロピル、ブチルまたはヘキシル基が用いられる。他の例には、４′ −ヒドロキシルメチル基で置換されたペントフラノシル糖を有するヌクレオシド が含まれる。この場合、５′　ヌクレオシドへの結合は正常な５′−ヒドロキシ ル部分を介した正常な結合であり、これに対し３′ヌクレオシドへの結合は正常 な３′−ヒドロキシル基によるものではな（，４′−ヒドロキシルメチル部分に よるものである。シクロブチルヌクレオシドと同様に、脂環式部分または４′− 置換ヌクレオシド部分についても、本発明のオリゴヌクレオチドの隣接領域間に ４原子の長さの結合が達成される。 上記の場合と同様に、異なる型の部分から形成された高分子の隣接領域を含む本 発明の形態において、高分子の２隣接領域それぞれの間に目的とする長さの連結 を形成することができる。対称連結は、隣接領域を形成する異なる型の部分の両 方に対して共有結合を形成しつる連結部分を選ぶことにより達成される。この連 結部分は、連結部分と異なる型の部分との間に得られる原子の鎖が同じ長さであ るように選ばれる。 本発明のオリゴヌクレオチドまたは高分子は、好ましくは約１０−約３０のヌク レオチドまたは核酸塩基サブユニットからなる。これらのオリゴヌクレオチドま たは高分子が約１５−約２５のサブユニットからなることが、より好ましい。 自明のとおり、サブユニットは隣接サブユニットにホスホロチオエートその他の 結合により適宜結合した塩基と糖の組み合わせ、または隣接サブユニットにリン もしくは非リン結合により適宜結合した核酸塩基と適宜な締結部である。この語 は゛単位′という語と互換性をもって用いることができる。先に詳述したように 、ＲＮａｓｅＨ活性化を始動させるためには、オリゴヌクレオチドまたは高分子 の配列全長内に３以上、好ましくは５以上連続した２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈ ｒｏ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブユニットのサブ配列がある。 現在好ましいのは、オリゴヌクレオチドまたは高分子内で２′−デオキシ−ｅｒ ｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブ配列のいずれの側にもオリ ゴヌクレオチドまたは高分子の他のヌクレオシドサブユニットが位置する状態で 、２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブユ ニットをオリゴヌクレオチドまたは高分子の主配列内に導入することである。 本発明のある形態においては、残りのヌクレオチドサブユニットがそれぞれ結合 親和性の増大のために２′−置換基を含む場合、２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒ ｏ−ベントフラノノル含有ヌクレオチドサブ配列は、２′−置換基を含む第１サ ブ配列のヌクレオチドサブユニットと２′−置換基を含む第２サブ配列のヌクレ オシドサブユニットとの間に位置するであろう。他の構造も可能であり、これに は本発明のオリゴヌクレオチドの３′または５′末端のいずれにも２′−デオキ シーｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル含有ヌクレオチドサブ配列が位置するも のが含まれる。 本発明の化合物は診断、療法に、ならびに研究用試薬およびキットとして用いる ことができる。それらは、有効量の本発明オリゴヌクレオチドを薬剤学的に許容 しうる適宜な希釈剤またはキャリヤーと混合することにより、薬剤組成物中に用 いることができる。それらはさらに、望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病 を伴う生物を治療するために使用しつる。望ましくない蛋白質をコードする核酸 と特異的にノゾブリッド形成しうる配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドと、 その生物を接触させることができる。 このような療法処置は、単細胞性の原核生物および真核生物から多細胞性の真核 生物に及ぶ多様な生物に実施することができる。その遺伝、代謝または細胞性制 御の基本的部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写またはＲＮＡ−蛋白質翻訳を利用する 生物はいずれも、このような療法および／または予防処置に対して感受性である 。多様な生物、たとえば細菌、酵母、原生動物、藻類、すべての植物、および温 血動物を含めたすべての高等動物形態を、この療法で治療することができる。 さらに、多細胞性真核生物のそれぞれの細胞もそれらの細胞活性の内在部分とし てＤＮＡ−ＲＮＡ転写およびＲＮＡ−蛋白質翻訳を含むので、このような療法お よび／または診断法はそれらの細胞集団に対しても実施することができる。さら に真核細胞の多（の細胞小器官、たとえばミトコンドリアおよび葉緑体も、転写 および翻訳のメカニズムを含む。従って単細胞、細胞集団または細胞小器官も本 発明の療法または診断用オリゴヌクレオチドで治療しつる生物の定義に包含させ ることができる。本明細書中で用いる療法とは、疾病状態の完治、生物、たとえ ば細菌性、原生動物性もしくは池の感染生物の死滅、または異常型の、もしくは 有害な細胞増殖もしくは発現の制御を包含するものとする。 例示のために、本発明の化合物をｒａｓ−ルシフェラーゼのトランス活性化によ るｒａｓ−ルシフェラーゼ融合系に用いた。米国特許出願第０７／７１５．１９ ６号明細書（１９９１年６月１４日出願、名称：ＲＡＳ癌遺伝子のアンチセンス 阻害、本出願と同一出願人、その内容全体を本明細書に参考として引用する）に 記載されるように、ｒａｓ癌遺伝子は原形質膜の内面に位置する関連蛋白質をコ ードする遺伝子群の員子である。ｒａｓ蛋白質はアミノ酸レベルで高度に保存さ れ、ＧＴＰに高い親和性および特異性で結合し、かっＧＴＰａｇｅ活性をもっこ とが示されている。ｒａｓ遺伝子産物の細胞機能は分かっていないが、それらの 生化学的特性、およびそれらとＧＴＰ結合蛋白質、またはＧ蛋白質として知られ ている一群のシグナル形質導入性蛋白質との著しい配列相同性は、ｒａｓ遺伝子 産物が原形質膜を越える細胞外シグナルの形質導入に関連する基本的な細胞性制 御機能において基礎的な役割を果たすことを示唆する。 Ｈ−ｒａｓｌに−ｒａｓおよびＮ−ｒａｓと表示される３種類のｒａｓ遺伝子が 哺乳動物ゲノム内に確認されている。哺乳動物ｒａｓ遺伝子はそれらのコード配 列内の単一点突然変異によりトランスフォーメーション誘導性を獲得する。天然 のｒａｓ癌遺伝子内の突然変異は、コドン１２．１３および６１に局在する。 ヒト腫瘍において最も一般的に検出される活性化ｒａｓ突然変異はＨ−ｒａｓ遺 伝子のコドン１２内にあり、その場合ＧＧＣからＧＴＣへの塩基の変化がｒａｓ 蛋白質産物のＧＴＰａｇｅ制御ドメインにおけるグリシンからバリンへの置換を 生じる。１個のアミノ酸の変化が正常なｒａｓ蛋白質機能の制御を失わせ、正常 に制御された細胞蛋白質を継続的に活性なものに変換すると考えられる。このよ うな正常なｒａｓ蛋白質機能の制御解除が正常な増殖から悪性増殖へのトランス フォーメーションに関与すると思われる。 以下の実施例および方法は本発明の例示であり、本発明を限定するためのもので はない。 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成： 非置換および置換オリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡ合成装置（アプライド・バ イオシステムズ、モデル３８０Ｂ）でヨウ素による酸化を伴う標準ホスホルアミ デート化学により合成した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては 、ホスファイト結合の段階的チェーンヨン（ｔｈ　ｉ　ａ　ｔ　１ｏｎ）のため に、標準酸化ボトルの代わりにアセトニトリル中における３Ｈ−１，２−ベンゾ ジチオール−３−オン　１．１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液を用いた。チェージ ョン待ち段階を６８秒に延長し、次いでキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラ ムから開裂させ、濃水酸化アンモニウム中で５５℃（１８時間）において脱ブロ ッキングしたのち、オリゴヌクレオチドを１５Ｍ　ＮａＣ１溶液から２．５容量 のエタノールで２回沈殿させることにより精製した。２０％アクリルアミド、８ Ｍ尿素、４５４ｍＭ）リス−硼酸緩衝液、ｐＨ＝７．０、中で分析用ゲル電気泳 動を行った。オリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートは、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動から８０％以上が全長物質であると判定された。 実施例２ 中心βオリゴヌクレオチド領域をフランキングするαオリゴヌクレオチド領域を 含むオリゴヌクレオチド Ａ、非対称３’　−３’　および５’−５’結合を含むα−β混合オリゴヌクレ オチド １５ｍｅｒの製造のために、第１領域である４ヌクレオチド長さのαオリゴヌク レオチドを、ＤＮＡ合成装置でガグノー（Ｇａｇｎｏｒ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９ｇ７．１５．１０４１９の方法により、 またはＤＮＡ合成装置で実施例１の一般的プロトコールを用いて製造する。製造 は５′方向から３′方向へ行われる。末端３′ヒドロキシル基を脱保護する。７ ヌクレオチド長さのＤＮＡオリゴヌクレオチドの正常β領域を、遊離ヒドロキシ ル基を末端にして３′から５′方向に付加する。 次いでさらに４ヌクレオチド長さのαヌクレオチド領域を３′から３′方向に付 加する。得られた１５ｍｅｒである混合α−β−αオリゴヌクレオチドは第１α 領域とβ領域の間に３原子３’−３’結合を含み、かつ第２α領域とβ領域の間 に５原子５’−５’結合を含む。 Ｂ、非対称３’−３’および５’−５’結合を含むα−β混合オリゴヌクレオチ ド 実施例２−Ａの方法を反復し、ただし中間β領域を普通の酸化段階の代わりにチ ェーンヨン段階によるホスホロチオエート領域として付加する。チェージョンは ビューケージ試薬（Ｂｅａｕｃａｇｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ）　、すなわち実施例１ の１，２−ベンゾジチオール−３−オン　１．１−ジオキシドを用いて行われる 。 Ｃ０対称４原子結合を含むα−β混合オリゴヌクレオチド１７ｍａｒの製造のた めに、第１領域である４ヌクレオチド長さのαオリゴヌクレオチドをガグノー（ （ｉａｇｎｏｒ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９ ８７．１５．１０４１９の方法により製造する。製造は５′方向から３′方向へ 行われる。末端３′　ヒドロキシル基を脱保護する。単一ヌクレオシドスロゲー ト単位である１α−チミジル−３β−ヒドロキシメチル−３α−メトキシトリチ ルオキシメチル−シクロブタンアミダイト（前記の米国特許出願８０８，２０１ 号明細書に従って製造）を、普通の様式で実施例１によりα−オリゴヌクレオチ ド領域の末端３′　ヒドロキシル基土に縮合させる。このシクロプチルチミジン ヌクレオシドスロゲートのトリチル（ｔｒｉｔｙｌ）−ヒドロキシル基ブロッキ ング基を脱ブロッキングする。 ７ヌクレオチド領域のホスホロチオエート　２′−デオキシ−β−ヌクレオチド 配列を合成装置で付加する。高分子のＤＮＡ領域が完成した時点で、２−ヒドロ キシ上の正常ホスホルアミダイトとして活性化された１α−チミジル−２β−ヒ ドロキシ−３α−メトキシトリチルオキシメチルシクロブタン単位を、成長しつ つある高分子に上記１α−チミジル−３β−ヒドロキシメチル−３α−メトキシ トリチルオキシメチル−シクロブタン部分の場合と同じ様式で縮合させる。ヌク レオチドスロゲート単位のトリチル−ブロッキング基の脱ブロッキング後に、さ らに４ヌクレオチド長さのαヌクレオチド領域を付加して高分子を完成させる。 得られた高分子の脱ブロッキング、支持体からの分離、および精製を普通の様式 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グする２′−置換オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド配列５’　 ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＧＣＣ３’の１５ｍｅｒ　ＲＮＡ標的を、 普通の方法でＲＮＡプロトコールを用いてＤＮＡ合成装置により製造した。２′ −デオキシ領域をフランキングする領域に２’　−０−置換ヌクレオチドを含む 一連のホスホロチオエート−相補的オリゴヌクレオチドを、文献から既知の製法 により製造された２′−〇−置換ヌクレオチド前駆物質、すなわち２′−〇−メ チル体を用いて、あるいは国際特許出願ＵＳ９１１０５７２０号または米国特許 出願第５６６．９７７もしくは９１８，３６２号明細書の方法により製造する。 ２′−〇−置換ヌクレオチドはそれらの５′−〇−ジメトキシトリチルー３′　 −ホスホルアミダイトとして、普通の方法でＤＮＡ合成装置により付加される。 相補的オリゴヌクレオチドは５’　ＣＧＣＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　Ａ ＣＧ　Ｃ３’の配列をもつ。２’　−０−ｆｌ換基はこれらのオリゴヌクレオチ ドのＣＧＣおよびＣＧ領域内に位置していた。以下の２′−〇−置換基を用いる 　２′−フルオ０．２’−０−メチル；２’−０−プロピル；２’−０−アリル ：２’−０−アミノプロポキシ：　２’　−０−（メトキシエトキシエチル）： ２′−〇−イミダゾールブトキシ：および２′−〇−イミダゾールプロポキシ。 さらに、同じ配列をホスホジエステルおよびホスホロチオエートの両方で製造す る。 合成後に、被験化合物および標的化合物を融解分析に用いて、それらのＴ、、お よびヌクレアーゼ耐性を上記で引用した国際特許出願ＵＳ９１１０５７２０号明 細書中のプロトコールにより測定する。被験化合物はＲＮａｓｅＨの基質ではな いのに対し、対応する標的配列は基質であることが認められた。これらの被験配 列はホスホジエステル型類似体と比較してヌクレアーゼ安定性であり、かつ標的 に対する増大した結合親和性をもつ。 実施例４ 中心２′−デオキシ　３’　−５’　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド 領域をフランキングする２’　−５’　ホスホジエステル　オリゴヌクレオチド 領域を含むオリゴヌクレオチド ２０ｍａｒオリゴヌクレオチドの製造のために、２’−５’結合を含むＲＮＡヌ クレオチド６個の第１領域を、キールゼク（Ｋｉｅｒｚｅｋ）ら、　Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９９２．２０．１６８５の方法で、こ の文献の一般的プロトコールを用いてＤＮＡ合成装置により製造する。２’−５ ’結合領域が完成した時点で、８ヌクレオチド長さの２′−デオキシホスホロチ オエート　３’−５’結合ＤＮＡオリゴヌクレオチドの領域を付加する。次いで さらに６ヌクレオチド長さの２’−５’結合領域を付加して、混合２′−５’お よび３’−５’結合を含むオリゴヌクレオチドを完成させる。 実施例５ 中心２′−デオキシ　３’　−５’　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド 領域をフランキングする、ホスホジエステル結合により結合したシクロプチルス ロゲート　ヌクレオシド領域を含む高分子 ２０ｍａｒオリゴヌクレオチドの製造のために、ホスホジエステル結合により結 合したシクロプチルスロケートヌクレオチド６個の第１領域を、米国特許出願第 ８０８．２０１号明細書の例３８の方法で、この明細書の一般的プロトコールを 用いてＤ　Ｎ　Ａ合成装置により製造する。この領域が完成した時点で、８ヌク レオチド長さの２′−デオキシホスホロチオエート　３’−５’結合ＤＮＡオリ ゴヌクレオチド領域を付加する。次いでさらにシクロプチルスロゲート　ヌクレ オチド６個の領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例６ 中心２′　−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキ ングする、ホスホジエステル結合により結合した炭素環式スロゲートヌクレオシ ド領域を含む高分子 炭素環式ヌクレオシドをボルトヴイノヒ（Ｂｏｒｔｗｉｃｋ）ら、　Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ　１９９２，４８．５７１に引用された総説文献法により製造する 。得られた炭素環式ヌクレオシドをジメトキントリチルーブロンキング基により 普通の方法てブロッキングする０対応するホスホルアミダイトが、米国特許出願 第８０８．２０１号明細書の例３８の方法で、シクロプチルスロゲートの代わり に炭素環式ヌクレオシドを用いて製造される。１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドの 製造のために、ホスホジエステル結合により結合した炭素環式ヌクレオノド４個 の第１領域を、実施例１のプロトコールによりＤＮＡ合成装置で製造する。この 領域が完成した時点で、８ヌクレオチド長さの２′−デオキシホスホロチオエー ト３’−５’結合ＤＮＡオリゴヌクレオチドを付加する。さらに炭素環式ヌクレ オチド４個の領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例７ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グする４′−チオヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド実施例６の様式で 、４′−チオヌクレオチドの領域を国際特許出願０３９１１０２７３２号明細書 の方法により製造する。次いで正常２′−デオキシホスホロチオエートヌクレオ チドの領域を付加したのち、さらに４′−チオヌクレオチドの領域を付加する。 実施例８ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グする、ペプチド核酸領域を含む高分子ペプチド核酸の第１領域を国際特許出願 ＥＰ１０１２１９号明細書の方法により製造する。ペプチド核酸はＣ末端からＮ 末端の方向に、アミン基が保護された七ツマ−を用いて製造される。第１ペプチ ド領域が完成したのち、末端アミンのブロッキング基を除去し、得られたアミン をバッスール（ｖａｓｓｅｕｒ）ら、Ｊ、＾ｖａ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１ ９９２．１１４．４００６の方法により製造された３’　−Ｃ−（ホルミル）− ２’　。 ３′−ジデオキシ−５′−トリチルヌクレオチドと反応させる。このアミンとＣ −ホルミルヌクレオシドの縮合はバッスール（Ｖａｓｓｅｕｒ）　（前掲）の条 件で行われ、中間体オキシム結合が得られる。オキシム結合をバッスール（Ｖａ ｓｓｅｕｒ）（前掲）のアルキル化条件でＨＣＨＯ／ＮａＢＨｓＣＮ／ＡｃＯＨ による還元条件下に還元して、ペプチド核酸にメチルアルキル化アミン結合を介 して結合したヌクレオシドを得る。次いでこのヌクレオシドから実施例１のプロ トコールにより内部２′−チオキシホスホロチオエートヌクレオチド領域を続け る。第２ペプ千ド領域のペプチド合成は、この第２領域の第１ペプチド核酸のカ ルボキシル末端とＤＮＡ領域の最後のヌクレオシドの５′　ヒドロキシとを反応 させ、次いでそのヌクレオトド上のジメトキシトリチル−ブロッキング基を除去 することにより行われる。結合はピリジン中でＤＥＡを介して行われ、ペプチド とヌクレオシドの間にエステル結合が形成される。次いで国際特許出願ＥＰ１０ １２１９号明細書の方法によりペプチド合成を続けて、第２ペプチド核酸領域を 完成させる。 実施例９ 中心２′　−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキ ングする２′−置換オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド実施例３ により２’　−〇−メチル置換ヌクレオチドを用いてフランキング領域を製造し 、中心領域にセレノ部分を導入するために３８−１．２−ベンゾチアセレノ−３ −オールで酸化することにより、オリゴヌクレオチドを製造するニストウインス キー（Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ）ら、第１０回国際ラウンドテーブル：ヌクレオシド 、ヌクレオチドおよびそれらの生物学的評価、１９９２年９月１６−２０日、報 文のアブストラクト、アブストラクト２０゜実施例１０ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グする２′−置換オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチド実施例３に より２′−０−アミノプロポキシ置換ヌクレオチドを用いてフランキング領域を 製造し、ビートン（Ｂｅａ　ｔｏｎ　）ら、第５章、オリゴヌクレオチドホスホ ロジチオエートの合成、１０９頁、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ 　Ａｎａｌｏｇｓ、　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　ｘ、、クス タイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、　Ｆ、　）編；　Ｔｈｅ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐ ｐｒｏａｃｈ　５ｅｒｉｅｓ、Ｔ　ＲＬブレス、ニューヨーク、１９９１、の方 法により内部ホスホロジチオエート領域を製造して、オリゴヌクレオチドを製造 する。 実施例１１ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするボラノホスフェート結合オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオチ ド 実施例３により、国際特許出願公開ＵＳ１０６９４９号明細書の方法でフランキ ングポラノホスフエート領域を製造し、実施例１の方法で中心２′−デオキシポ スホロチオエート領域を製造して、オリゴヌクレオチドを製造する。 実施例１２ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グする、２′−置換メチルホスホネート結合したオリゴヌクレオチド領域を含む オリゴヌクレオチド メチルホスホネート結合のフランキングの製造のために、実施例３により２−フ ルオロヌクレオシドを製造し、次いでヌクレオチドに変換する：ミラー（Ｍｉｌ ｌｅｒ）ら、第６章、オリゴ−２′−デオキシリポヌクレオシドメチルポスボネ ートの合成、１３７頁、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌ ｏｇｓ、＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｘツクスタイン（Ｅｃｋ ｓｔｅｉｎ、　Ｆ、　）編；　Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ 　５ｅｒｉｅｓＳＩ　ＲＬプレス、ニューヨーク、１９９１、の方法による。中 心の内部ホスホロチオエート領域を実施例１により製造し、次いでさらに２’　 −０−置換メチルホスボネート領域を付加する。 実施例１３ 中心２′−デオキシホスホジエステルチミジン　オリゴヌクレオチド領域をフラ ンキングする、２′−置換メチルホスホトリエステル結合したオリゴヌクレオチ ド領域を含むオリゴヌクレオチド メチルホスホトリエステル結合のフランキング領域の製造のために、実施例３に より２−フルオロヌクレオシドを製造し、次いでミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｒｔｙ　１９７７、１６．１９８８の方法によりヌクレオチド に変換する。７個の連続チミジンヌクレオチド残基を含む中心の内部ホスホジエ ステル領域を実施例１により製造し、次いでさらに２’　−〇−置換メチルホス ホトリエステル領域を付加する。 実施例１４ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするヒドロキシルアミン　オリゴヌクレオシド領域を含む高分子メチルヒドロ キシルアミン結合およびホスホジエステル結合により交互に結合したヌクレオシ ドの第１フランキング領域をバッスール（Ｖａｓｓｅｕｒ）　（前掲）の方法で 製造する。中心２’　−０−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド 領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフ ランキング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例１５ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするヒドラジン結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子メチルヒドラジン結 合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域を国際特許出願０３９２ １０４２９４号明細書の例の方法で製造する。中心２′−〇−デオキシホスホロ チオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加し、次いでさ らに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させ る。 実施例１６ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするメチルスルフェニル結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子メチルスル フェニル結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域を国際特許出 願０３９２１０４２９４号明細書の例の方法で製造する。中心２′−〇−デオキ シホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加し 、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子 を完成させる。 実施例１７ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするエタンジイルイミノ結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子１．２−エ タンジイルイミノ結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域を国 際特許出願０３９２１０４２９４号明細書の例の方法で製造する。 中心２′−〇−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施例 ３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領 域を付加して、高分子を完成させる。 実施例１８ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするメチレンホスホネート結合オリゴヌクレオチド領域を含むオリゴヌクレオ チド メチレンホスホネート結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域 を国際特許出願０３９２１０４２９４号明細書の例の方法で製造する。中心２′ −０−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法 により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加 して、高分子を完成させる。 実施例１９ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするニトリロメチリジン結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子ニトリロメ チリジン結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域を米国特許出 願第９０３，１６０号明細書の例の方法で製造する。中心２′−０−デオキシホ スホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加し、次 いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完 成させる。 実施例２０ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするカーボネート結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子カーボネート結合 により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をメルテス（Ｍｅｒｔｅｓ ）ら、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　ＣｈｅＩｌｌ、　１９６９．１２．１５４の方法で製 造する。中心２′−〇−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域 を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフラン キング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２１ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするカルバメート結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子カルバメート結合 により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をゲイ）　（Ｇａｉｔ）ら 、　Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　１１９７４，１６８４の方法で製造 する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を 実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキ ング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２２ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするノリル結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子ノリル結合により結合し たヌクレオシドの第１フランキング領域をオシルビー（Ｏｇｉｌｖｉｅ）ら、　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９８８．１６．４５８３の 方法で製造する。中心２′−〇−チオキ／ホスホロチオエート　オリゴヌクレオ チド領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含 むフランキング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２３ 中心２′　−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキ ングするスルフィド、スルホキシドおよびスルホン結合オリゴヌクレオシド領域 を含む高分子 スルフィド、スルホキシドおよびスルホン結合により結合したヌクレオシドの第 １フランキング領域を７ユナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、　Ｔｅｔｒａｈ ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９９０、３１．３３５の方法で製造する。中心 ２’　−〇−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド領域を実施例３の 方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を 付加して、高分子を完成させる。 実施例２４ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするスルホネート結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子スルホネート結合 により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をミューノッキ（Ｍｕｓｉ ｃｋｉ）ら、　１．Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、１９９１．５５．４２３１の方法で製造 する。中心２′−〇−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を 実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキ ング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２４ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするスルホンアミド結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子スルホンアミド 結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をキルシェンバウム（ Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍ）ら、第５回サンディエゴ会議；核酸：最先端業績、 ポスターアブストラクト２８．１９９０年１１月１４−１６日の方法で製造する 。中心２′−〇−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施 例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング 領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２５ 中心２′　−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキ ングするホルムアセクール結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子ホルムアセ タール結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をマツツウーシ （Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）　、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９ ９０゜３１．２３８５、またはベーネ７　ン（Ｖｅｅｎｅｍａｎ）ら、　Ｒｅｃ ｕｅｉｌ　ｄｅｓ　Ｔｒａｖ、　Ｃｈｉｓ、　１９９０．１０９．４４９の方法 で製造する。中心２’　−０−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチ ド領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含む フランキング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２６ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするチオホルムアセクール結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子チオホル ムアセタール結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域をマンツ ウーシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）　、ら、Ｊ、＾ｔｓ、　ＣｈｅＩｌ、　Ｓａｃ、 　１９９１．１１３．７７６７　；　７　ッツウーン（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）ら 、　Ｎｕｃｌｅｓｉｅｄｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　１９９１．１０．２ ３１の方法で製造する。中心２′−Ｏ−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌ クレオチド領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と同じ結 合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２７ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするモルホリン結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子モルホリン結合によ り結合したヌクレオシドの第１フランキング領域を米国特許第５．０３４，５０ ６号明細書の方法で製造する。中心２’　−〇−デオキシホスホロチオエート　 オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域 と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２８ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするアミド結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子アミド結合により結合し たヌクレオシドの第１フランキング領域を米国特許出願第７０３．６１９号明細 書、１９９１年５月２１日出願、および関連の国際特許出願ＵＳ９２１０４３０ ５号明細書の方法で製造する。中心２′−〇−デオキシホスホロチオエート　オ リゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加し、次いでさらに第１領域と 同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子を完成させる。 実施例２９ 中心２′−チオキシホスホジエステル　オリゴヌクレオチド領域をフランキング するエチレンオキシド結合オリゴヌクレオシド領域を含む高分子エチレンオキシ ド結合により結合したヌクレオシドの第１フランキング領域を国際特許出願ＵＳ ９１１０５７１３号明細書の方法で製造する。３ヌクレオチド長さの中心２′− 〇−デオキシホスホジエステル　オリゴヌクレオチド領域を実施例１の方法によ り付加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して 、高分子を完成させる。 実施例３０ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グする３、４−ジヒドロキシブチル結合核酸塩基領域を含む高分子３．４−ジヒ ドロキシブチル結合により結合した核酸塩基の第１フランキング領域をオーガス チンズ（＾ｕｇｕｓｔｙｎｓ）ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｉ？ｅｓｅ ａｒｃｈ　１９９１．１９．２５８７の方法で製造する。中心２′−〇−デオキ シホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付加し 、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高分子 を完成させる。 実施例３１ 中心２′−デオキシホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド領域をフランキン グするジヒドロキジプロポキシメチル結合核酸塩基領域を含む高分子ジヒドロキ シプロポキシメチル結合により結合した核酸塩基の第１フランキング領域をシュ ナイダ−（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、Ｊ、＾ｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　１９ ９０．１１２．４５３の方法で製造する。９ヌクレオチド長さの中心２′−〇− デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチド領域を実施例３の方法により付 加し、次いでさらに第１領域と同じ結合を含むフランキング領域を付加して、高 分子を完成させる。 処理ｌ Ｒａ５−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の組み立てこの研究で述べたｒａｓ− ルシフェラーゼレポーター遺伝子をＰＣＲ法により組み立てた。オリゴヌクレオ チドプライマーが、突然変異（コドン１２）および非突然変異（野生型）ヒ）Ｈ −ｒａｓ遺伝子双方のエキソン１の５−′領域をＰＣＲクローン化するためのプ ライマーとして用いるために合成された。Ｈ−ｒａＳ遺伝子鋳型はアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣＮｏ、４１０００および４１００ １）、マリーランド州ベテスダ、から入手された。 オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー ５ｌ−ＡＣＡ−ＴｒＡ−ＴＧＣ−ＴＡＧ−ＣＴＴ−ＴＴｒ−ＧＡＧ−ＴＡＡ−Ａ ＣＴ−ＴＧＴ−ＧＧＧ−ＧＣＡ−ＧＧＡ−ＧＡＣ−αゴーＧＴ−３’　（センス ）、配列番号・＝７．および５１−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＴＧＡ−ＡＧＣ−ＴＴＣ− ＴＧＧ−ＡＴＧ−ＧＴＣ−ＡＧＣ−ＧＣ−：Ｉ’（７７チセ：ｚス）、　配列番 号：８゜が、突然変異および非突然変異Ｈ−ｒａｓ遺伝子を鋳型として用いる標 準ＰＣＲ反応に使用された。これらのプライマーは、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄｌ 　Ｉ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位によりフランキングされた、正常および突 然変異Ｈ−ｒａＳの配列−５３から＋６５まで（翻訳開始部位に対して）に相当 する１４５塩基対のＤＮＡ産物を産生ずると予想される。ＰＣＲ産物を標準法に よりゲル精製し、沈殿させ、洗浄し、そして水に再懸濁した。 ハエ（Ｐ、ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子のクローン化に用いられるＰ ＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物がアミノ末端メチオニン残基−−これらは２個の アミノ酸、すなわちアミノ末端リシン残基、およびこれに続くロイシン残基で置 き換えられるｍ−以外の全長蛋白質をコードするように設計された。ルシフェラ ーゼ遺伝子のクローン化に用いたオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーはであり 、ルシフェラーゼリポータ−遺伝子を含む市販のプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌ ｕｃ）（クローンチク）を鋳型として用いる標準ＰＣＲ反応に使用された。 これらのプライマーは、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＢｓ５ＨＩＩ制限工ンドヌクレア ーゼ部位によりフランキングされたルシフェラーゼ遺伝子に相当する約１．９ｋ ｂの産物を産生すると予想された。このフラグメントを標準法によりゲル精製し 、沈殿させ、洗浄し、そして水に再懸濁した。 ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合リポータ−遺伝子のアセンブリーを完成させるため に、ｒａｓおよびルシフェラーゼＰＣＲ産物を適宜な制限エンドヌクレアーゼに より消化し、ステロイド誘導性マウス乳癌ウィルスプロモーターＭＭＴＶを含む 発現ベクター内へ、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＬＨｉｎｄｌＩＩ、およびＢ ｓ５ＨＩＩを用いて３部すゲーションによりクローン化した。得られたクローン には、ホタルルシフェラーゼ遺伝子とインフレームで融合したＨ−ｒ　ａ　ｓ　 ５’側配列（−５３から＋６５まで）が挿入されている。得られた発現ベクター は、ステロイド誘導性ＭＭＴＶプロモーターの制御下で発現されるｒａｓ−ルシ フェラーゼ融合生成物をコードする。 処理２ プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション：トランスフェクションは 、グリーンバーブ（Ｇｒｒｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、　Ｅ、　）　、　Ｃｕｒｒｅｎ ｔ　Ｐｒｏｔ。 ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（アウスユーベル（Ａ ｕｓｕｂｅｌ）ら編）、ジョン・ワイリー・アンド・センス、ニューヨーク、の 記載に従って、下記の点を変更して行われた。ＨｅＬａ細胞を６０ｍｍの皿に５ Ｘ１０５細胞／皿で接種した。合計１０μｇのＤＮＡをそれぞれの皿に添加し、 このうち９μｇはｒａｓ−ルシフェラーゼリポータ−プラスミドであり、１μｇ は構成性ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）プロモーターの制御下でラットグルココ ルチコイドレセプターを発現するベクターであった。１６−２０時間後に、３ｍ Ｍ　ＥＧＴＡを含有するトリス緩衝−生理的食塩水［５０ｍＭトリス−ＣＩ　（ ｐＨ７，５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ］で洗浄することにより、リン酸カルシウ ム−ＤＮＡ共沈物を除去した。次いで１０％ウシ胎仔血清を補充した新鮮な培地 を細胞に添加した。この時点で、デキサメタシンによるリポータ−遺伝子発現の 活性化の前に、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで予備処理した。 処理３ 細胞のオリゴヌクレオチド処理ニ プラスミドトランスフェクションの直後に、３７℃に予熱したオブチ（Ｏｐｔｉ ）−ＭＥＭ　（ジブコ）で細胞を数回洗浄した。１０ｕｇ／ｍｌのＮ−［１−（ ２゜３−ンオレイルオキシ）プロピル］　−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウ ムクロリド（ＤＯＴＭＡ）（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、マリーラン ド州ガイザースバーグ）を含有するオブチーＭＥＭ　２ｍｌをそれぞれの皿に添 加し、オリゴヌクレオチドを直接に添加し、３７℃で４時間インキュベートした 。次いでオブチ−ＭＥＭを除去し、オリゴヌクレオチドを含有する適宜な増殖培 地と交換した。この時点で、細胞を最終濃度０．　２μＭのデキサメタシンで処 理することにより、リポータ−遺伝子発現を活性化した。ステロイド処理の１２ −１６時間後に細胞を採取した。 処理４ ルシフェラーゼのアッセイ グリーンバーブ（Ｇｒｒｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、　Ｅ、　）、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　 Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ盾■■ （アウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編）、ジョン・ワイリー・アンド・セン ス、ニューヨーク、の記載に従って、ルシフェラーゼを細胞から界面活性剤トリ トン（Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１００で細胞溶解することにより抽出した。ダイ ナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＬ１００Ｏルミノメータ−を用いて、ルシフェリ ン（シグマ）を６２５μＭになるように添加した際のピークルミネセンスを測定 した。 それぞれの抽出につき、データがアッセイの直線範囲内で採集されることを保証 するために種々の量の抽出物を用いて多数回、ルシフェラーゼアッセイを実施し た。 処理５ ｒａｓ−ルシフェラーゼ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチドによる阻 害 活性Ｈ−ｒａｓのコドン−１２点の突然変異を標的とする一連のアンチセンスホ スホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体を、上記の例に記載したｒａｓ−ル シフェラーゼリポータ−遺伝子系を用いて試験した。これらは基本配列およびそ の基本配列の類似体からなる。基本配列は、前記の米国特許出願０７／７１５゜ １９６号明細書に報告された既知の活性のものである。この基本配列およびその 類似体の両方において、ヌクレアーゼ耐性を付与するためにヌクレオチドサブユ ニットはそれぞれホスホロチオエート結合を含んでいた。類似体にはそれぞれ、 ２′−〇−メチル置換基および２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ベントフラノ シル糖を含むヌクレオチドサブユニットが導入されていた。これらの類似体にお いて、２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル糖を含むサブユニッ トのサブ配列は、２′−〇−メチル置換されたサブユニットのサブ配列により両 側をフランクされていた。これらの類似体は２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ− ペントフラノシル糖を含むヌクレオチドのサブ配列の長さに関して互いに異なっ ていた。これらのサブ配列の長さは、全ヌクレオチド１−９個でヌクレオチド２ 個ずつ異なっていた。２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌク レオチドサブ配列は、活性ｒａｓのコドン−１２点突然変異の点突然変異を中心 としていた。 これらのオリゴヌクレオチド（すべてホスホロチオエート類似体）の塩基配列、 配列参照番号および配列番号を第１表に示す。この表中で′”′で確認されるヌ クレオチドは２′−〇−メチル置換基を含み、ｄ、ｄで確認される残りのヌクレ オチドは２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチドであ る。 第１表 オリゴヌクレオチド　配列　配列 参照番号　番号 第１図は、細胞を第１表のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで処理した場 合の用量応答データを示す。オリゴヌクレオチド２５７ｏは突然変異体（活性） Ｈ−ｒａｓ　ＲＮＡのコドン−１２点突然変異を標的とする。他のヌクレオチド は種々の長さの内部２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレ オチドとの結合親和性を高めるために２’　−０−メチル置換基を含む。対照オ リゴヌクレオチドは２０塩基の長さのランダムなホスポロチオエートオリゴヌク レオチド類似体である。結果はオリゴヌクレオチドで処理されていないトランス フェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性に対する％として表される。 この図が示すように、細胞を漸増濃度のオリゴヌクレオチド２５７ｏで処理する と、突然変異形のｒａｓ−ルシフェラーゼを発現する細胞におけるｒａｓ−ルシ フェラーゼ活性の用量依存性阻害が生じた。オリゴヌクレオチド２５７ｏは、正 常形と比較して突然変異体形のｒａｓ−ルシフェラーゼに対して約３倍の選択性 を示す。 第１図にさらに見られるように、オリゴヌクレオチド３９８ｏ、３９８５および ３９８４はオリゴヌクレオチド２５７ｏが示したより大きなｒａｓ−ルシフェラ ーゼ活性阻害を示した。最大の阻害は、７ヌクレオチド長さの２′−デオキシ− ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチドのサブ配列を含むオリゴヌクレ オチド３９８５により示された。５ヌクレオチド長さの２′−デオキシ−ｅｒｙ ｔｈｒｏ−ベントフラノシルヌクレオチドのサブ配列を含むオリゴヌクレオチド ３９８０がその次に大きな阻害を示し、９ヌクレオチド長さの２′−デオキシ− ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチドのサブ配列を含むオリゴヌクレ オチド３９８４がそれに続いた。 第２図は、棒グラフの形であること以外は第１図と同様な結果を示す。第２図に はさらにオリゴヌクレオチド３９７５およびオリゴヌクレオチド３９７９の活性 が示される。これらのオリゴヌクレオチドは、それぞれ１および３ヌクレオチド 長さの２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチドのサブ 配列を含む。第２図から明らかなように、２′　−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ− ベントフラノシルヌクレオチド１個または３個のサブ配列はいずれも有意の活性 を示さなかった。３ヌクレオチドのサブ配列オリゴヌクレオチド３９７９につい ては、最高濃度の用量において測定可能な活性が示された。 オリゴヌクレオチド２５７０と比較したオリゴヌクレオチド３９８０．３９８５ および３９８４の活性の増大は、それらの化合物上に位置する２′−〇−メチル 置換基によりこれらの化合物に付与された結合親和性の増大、および２′−デオ キシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチドのサブ配列がヌクレオチ ドの主配列内に導入されたことによりこれらの化合物に付与されたＲＮａｓｅ■ １活性化に起因する。本発明の活性化合物と対称的に、活性オリゴヌクレオチド ２５７０．３９８０．３９８５および３９８４のものと等しいが、本発明の活性 オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート結合の代わりにホスホジエステル結合 を含む配列が活性を示さなかった点に注目すると興味深い。これは、これらのホ スホジエステル化合物がそれらのホスホジエステル化合物を分解するヌクレアー ゼに対する基質であり、従ってそれらが潜在的にＲＮａｓｅＨを活性化するのを 阻止することに起因する。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ・１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー、直鎖状 アンチセンス：ｙｅｓ 配列 ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ１７配列番号＝２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数・１本鎖 トポロジー・直鎖状 アンチセンス：ｙｅｓ 配列： ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ１７配列番号＝３ 配列の長さ：１７ 配列の型、核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： ＣＣＡＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣ１７配列番号：１０ 配列の長さ＝３３ 配列の型：核酸 鎖の数＝１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス＝ｎ。 配列： ＡＣＧＣＡＴＣＴＧＧ　ＣＧＣＧＣＣＧＡＴＡ　ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴ　ＣＧ＾ 　３３配列番号：１１ 配列の長さ：１６ 配列の型、核酸 鎖の数＝１本鎖 トポロジー：直鎖状 アンチセンス：ｙｅｓ 配列： ＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＧＣＧ　１６配列番号：１２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数＝１本鎖 トポロジー・直鎖状 アンチセンス：ｙｅｓ 配列： ＣＧＣ＾＾＾＾Ａ＾＾＾＾＾ＣＧＣ１６酊清半　％ 平成６年８月ｑ日

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌクレオチド単位の配列を含むオ リゴヌクレオチドであって： 少なくとも１個のヌクレオチド単位が該オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 を高めるために官能化されており；少なくとも１個のヌクレオチド単位が上記の 核酸鎖への該オリゴヌクレオチドの結合親和性を高める置換基を保有し；かつ複 数のヌクレオチド単位が２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル糖 部分を有し、これらの２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌク レオチド単位がヌクレオチド単位の配列内に連続して位置するオリゴヌクレオチ ド。
2. ２．結合親和性を高めるための置換基が２′−置換基からなる、請求の範囲第１ 項に記載のオリゴヌクレオチド。
3. ３．２′−置換基がフルオロ、Ｃ１−Ｃ９アルコキシ、Ｃ１−Ｃ９アミノアルコ キシ、アリルオキシ、イミダゾールアルコキシおよびポリ（エチレングリコール ）である、請求の範囲第２項に記載のオリゴヌクレオチド。
4. ４．ヌクレオチド単位がそれぞれホスホロチオエートまたはホスホロジチオエー トーヌクレオチドである、請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
5. ５．オリゴヌクレオチドの３′末端ヌクレオチド単位が該ヌクレオチド単位の２ ′または３′位のうち少なくとも−方にヌクレアーゼ耐性修飾基を含む、請求の 範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
6. ６．複数のヌクレオチド単位が核酸鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を高 める置換基を保有し、これらの置換基保有ヌクレオチドが第１ヌクレオチド単位 サブ配列および第２ヌクレオチド単位サブ配列に分けられ；かつ複数の２′−デ オキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル−ヌクレオチド単位が、ヌクレオチ ド単位の配列内で第１ヌクレオチド単位サブ配列と第２ヌクレオチド単位サブ配 列の間に位置する、請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
7. ７．複数のヌクレオチド単位が相補的核酸鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和 性を高める置換基を保有し；かつ 置換基を保有するこれらのヌクレオチドの少なくとも−部が該オリゴヌクレオチ ドの３′末端または５′末端のうち−方に連続して位置する、請求の範囲第１項 に記載のオリゴヌクレオチド。
8. ８．少なくとも５個のヌクレオチド単位が２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペ ントフラノシル糖部分を有し、これら少なくとも５個の２′−デオキシ−ｅｒｙ ｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチド単位がヌクレオチド単位の配列内に連 続して位置する、請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
9. ９．１−約８個のヌクレオチド単位が相補鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親和 性を高める置換基を保有し、置換基を保有するこれらのヌクレオチド単位がヌク レオチド単位の配列内に連続して位置する、請求の範囲第１項に記載のオリゴヌ クレオチド。
10. １０．１−約８個のヌクレオチド単位が相補鎖へのオリゴヌクレオチドの結合親 和性を高める置換基を保有し、置換基を保有するこれらのヌクレオチド単位がヌ クレオチド単位の配列内に連続して位置し；かつ少なくとも５個のヌクレオチド 単位が２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル糖部分を有し、これ ら少なくとも５個の２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル−ヌク レオチド単位がヌクレオチド単位の配列内に連続して位置する、 請求の範囲第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
11. １１．核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるホスホロチオエートヌクレオチ ドの配列を含むオリゴヌクレオチドであって：複数のヌクレオチドが上記の核酸 鎖への該オリゴヌクレオチドの結合親和性を高める置換基を保有し；かつ 複数のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル糖部 分を有する オリゴヌクレオチド。
12. １２．結合親和性を高めるための置換基が２′−置換基からなる、請求の範囲第 １１項に記載のオリゴヌクレオチド。
13. １３．２′−置換基がフルオロ、Ｃ１−Ｃ９アルコキシ、Ｃ１−Ｃ９アミノアル コキシまたはアリルオキシである、請求の範囲第１２項に記載のオリゴヌクレオ チド。
14. １４．さらに複数の、２′−置換基を保有するヌクレオチド；オリゴヌクレオチ ド内で２′−置換基を保有するヌクレオチド基の間に位置する２′−デオキシ− ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルヌクレオチドを含む、請求の範囲第１２項に 記載のオリゴヌクレオチド。
15. １５．置換基を保有するヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３′末端または５ ′末端のうち−方に位置する、請求の範囲第１１項に記載のオリゴヌクレオチド 。
16. １６．核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるホスホロチオエートヌクレオチ ドの配列を含むオリゴヌクレオチドであって：第１部分のヌクレオチドが２′− デオキシ−２′−フルオロ、２′−メトキシ、２′−エトキシ、２′−プロポキ シ、２′−アミノプロポキシ、または２′−アリルオキシ−ペントフラノシル糖 部分を有し；かつ他の部分のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ− ペントフラノシル糖部分を含む オリゴヌクレオチド。
17. １７．第１部分のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの３′末端または５′末端 のいずれかに位置する、請求の範囲第１６項に記載のオリゴヌクレオチド。
18. １８．２′−デオキシ−２′−フルオロ、２′−メトキシ、２′−エトキシ、２ ′−プロポキシ、２′−アミノプロポキシ、または２′−アリルオキシ−ペント フラノシル糖部分を有する追加部分のヌクレオチドを含み；かつ他の部分のヌク レオチドがヌクレオチド内で第１部分のヌクレオチドと追加部分のヌクレオチド の間に位置する、請求の範囲第１７項に記載のオリゴヌクレオチド。
19. １９．望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生物の治療方法であって 、該蛋白質をコードする核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌクレオチド の配列を有し、少なくとも１個のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのヌクレア ーゼ耐性を高めるために官能化され、複数のヌクレオチドが上記の核酸鎖に対す るオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそれに配置された置換基を有 し、かつ複数のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノ シル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、該生物を接触させることを含む方法 。
20. ２０．ヌクレオチドがそれぞれホスホロチオエートーヌクレオチドである、請求 の範囲第１９項に記載の方法。
21. ２１．置換基が２′−置換基である、請求の範囲第１９項に記載の方法。
22. ２２．２′−置換基がフルオロ、アルコキシ、アミノアルコキシまたはアリルオ キシである、請求の範囲第２１項に記載の方法。
23. ２３．薬剤学的に有効な量の、核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌクレ オチドの配列を有し、少なくとも１個のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのヌ クレアーゼ耐性を高めるために官能化され、複数のヌクレオチドが相補的核酸鎖 に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそれに配置された置換 基を有し、複数のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラ ノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチド；および薬剤学的に許容しうる希釈剤 またはキャリヤーを含む薬剤組成物。
24. ２４．配列特異性核酸のインビトロ修飾方法であって、核酸鎖に特異的にハイブ リッド形成しうるヌクレオチドの配列を有し、少なくとも１個のヌクレオチドが オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高めるために官能化され、複数のヌク レオチドが相補的核酸鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるため にそれに配置された置換基を有し、かつ複数のヌクレオチドが２′−デオキシ− ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、ＲＮ ａｓｅＨおよび上記核酸を含有する被験溶液とを接触させることを含む方法。
25. ２５．生物においてハイブリッド形成およびＲＮａｓｅＨ活性化を同時に増大さ せる方法であって、相補的核酸鎖に特異的にハイブリッド形成しうるヌクレオチ ドの配列を有し、少なくとも１個のヌクレオチドがオリゴヌクレオチドのヌクレ アーゼ耐性を高めるために官能化され、複数のヌクレオチドが相補的核酸鎖に対 するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めるためにそれに配置された置換基を 有し、かつ複数のヌクレオチドが２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラ ノシル糖部分を有するオリゴヌクレオチドと、該生物を接触させることを含む方 法。
26. ２６．相補的核酸にハイブリッド形成しうる配列で共有結合により結合した複数 のヌクレオシドを含む高分子であって：ヌクレオシドがα−ヌクレオシド、２′ −デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルβ−ヌクレオシドを含むβ−ヌ クレオシド、４′−チオヌクレオシド、および炭素環式ヌクレオシドから選ばれ ；該結合が帯電リン結合、中性リン結合、または非リン結合から選ばれ；かつ 結合したヌクレオシドの配列が少なくとも２つのヌクレオシド領域を含み； その第１領域が、帯電および中性３′−５′リン結合により結合したα−ヌクレ オシド、帯電および中性２′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド、 非リン結合により結合したα−ヌクレオシド、帯電および中性３′−５′リン結 合により結合した４′−チオヌクレオシド、帯電および中性２′−５′リン結合 により結合した４′−チオヌクレオシド、非リン結合により結合した４′−チオ ヌクレオシド、帯電および中性３′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌク レオシド、帯電および中性２′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌクレオ シド、非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド、帯電および中性２′− ５′リン結合により結合したβ−ヌクレオシド、非リン結合により結合したβ− ヌクレオシドから選ばれるヌクレオシドを含み；かつその第２領域が、生理的ｐ Ｈにおいて負の電荷をもつ帯電３′−５′リン結合により結合した２′−デオキ シ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルβ−ヌクレオシドからなる 高分子。
27. ２７．第２領域が少なくとも３個の２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフ ラノシルβ−ヌクレオシドを含む、請求の範囲第２６項に記載の高分子。
28. ２８．第２ヌクレオシド領域が第１ヌクレオシド領域と第３ヌクレオシド領域の 間に位置し、この第３ヌクレオシド領域が、帯電および中性３′−５′リン結合 により結合したα−ヌクレオシド、帯電および中性２′−５′リン結合により結 合したα−ヌクレオシド、非リン結合により結合したα−ヌクレオシド、帯電お よび中性３′−５′リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド、帯電およ び中性２′−５′リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド、非リン結合 により結合した４′−チオヌクレオシド、帯電および中性３′−５′リン結合に より結合した炭素環式ヌクレオシド、帯電および中性２′−５′リン結合により 結合した炭素環式ヌクレオシド、非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシ ド、帯電および中性２′−５′リン結合により結合したβ−ヌクレオシド、非リ ン結合により結合したβ−ヌクレオシドから選はれるヌクレオシドを含む、請求 の範囲第２６項に記載の高分子。
29. ２９．帯電リン結合が、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチ オエート、ホスホロセレネートまたはホスホロジセレネート結合を含む、請求の 範囲第２６項に記載の高分子。
30. ３０．帯電リン結合が、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートである、請 求の範囲第２６項に記載の高分子。
31. ３１．中性リン結合が、アルキルおよびアリールホスホネート、アルキルおよび アリールホスホロアミダイト、アルキルおよびアリールホスホトリエステル、ハ イドロジェンホスホネート、ならびにボラノホスフェート結合を含む、請求の範 囲第２６項に記載の高分子。
32. ３２．非リン結合が、ペプチド結合、ヒドラジン結合、ヒドロキシアミン結合、 カルバメート結合、モルホリン結合、カーボネート結合、アミド結合、オキシメ チレンイミン結合、ヒドラジド結合、シリル結合、スルフィド結合、ジスルフィ ド結合、スルホン結合、スルホキシド結合、スルホネート結合、スルホンアミド 結合、ホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、オキシム結合、およ びエチレングリコール結合を含む、請求の範囲第２６項に記載の高分子。
33. ３３．第１ヌクレオシド領域が帯電または中性３′−５′リン結合により結合し たα−ヌクレオシド少なくとも２個を含む、請求の範囲第２６項に記載の高分子 。
34. ３４．相補的核酸にハイブリッド形成しうる配列で共有結合により結合した複数 の単位を含む高分子であって： 該単位がヌクレオシドおよび核酸塩基から選ばれ；ヌクレオシドがα−ヌクレオ シド、２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフランシルβ−ヌクレオシドを 含むβ−ヌクレオシド、４′−チオヌクレオシド、および炭素環式ヌクレオシド から選ばれ；核酸塩基がプリン−９−イルおよびピリミジン−１−イル複素環式 塩基から選ばれ； 該結合が帯電３′−５′リン結合、中性３′−５′リン結合、帯電２′−５′リ ン結合、中性２′−５′リン結合、または非リン結合から選ばれ；かつ結合した 単位の配列が少なくとも２つの領域に分けられ：その第１領域が、非リン結合に より結合した核酸塩基、および非糖−締結基を介してリン酸結合に結合した核酸 塩基、ならびに帯電および中性３′−５′リン結合により待合したα−ヌクレオ シド；帯電および中性２′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド；非 リン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電および中性３′−５′リン結合 により結合した４′−チオヌクレオシド；帯電および中性２′−５′リン結合に より結合した４′−チオヌクレオシド；非リン結合により結合した４′−チオヌ クレオシド；帯電および中性３′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌクレ オシド；帯電および中性２′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシ ド；非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；帯電および中性２′−５ ′結合により結合したβ−ヌクレオシド；非リン結合により結合したβ−ヌクレ オシドから選ばれるヌクレオシドを含み；かつ その第２領域が、生理的ｐＨにおいて負の電荷をもつ帯電３′−５′リン結合に より結合した２′−デオキシ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシルβ−ヌクレオ シドを含む 高分子。
35. ３５．第１領域が、非リン結合により結合した核酸塩基少なくとも２個を含む、 請求の範囲第３４項に記載の高分子。
36. ３６．非リン結合がペプチド結合である、請求の範囲第３５項に記載の高分子。
37. ３７．第２領域が第１領域と第３領域の間に位置し、この第３領域が、非リン結 合により結合した核酸塩基、および非糖−締結部分を介してリン酸結合に結合し た核酸塩基、ならびに帯電および中性３′−５′リン結合により結合したα−ヌ クレオシド、帯電および中性２′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシ ド、非リン結合により結合したα−ヌクレオシド、帯電および中性３′−５′リ ン結合により結合した４′−チオヌクレオシド、帯電および中性２′−５′リン 結合により結合した４′−チオヌクレオシド、非リン結合により結合した４′− チオヌクレオシド、帯電および中性３′−５′リン結合により結合した炭素環式 ヌクレオシド、帯電および中性２′−５′リン結合により結合した炭素環式ヌク レオシド、非リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド、帯電および中性２ ′−５′リン結合により結合したβ−ヌクレオシド、非リン結合により結合した β−ヌクレオシドから選はれるヌクレオシドを含む、請求の範囲第３５項に記載 の高分子。
38. ３８．核酸塩基がアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチ ン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよび他のアルキルアデ ニン、２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシルおよびシト シン、６−アザウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラ シル）、４−チオウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオールアルキル、 ヒドロキシルおよび他の８置換アデニンおよびグアニン、または５−トリフルオ ロメチルウラシルおよびシトシンから選はれる、請求の範囲第３５項に記載の高 分子。
39. ３９．相補的核酸にハイブリッド形成しうる配列で共有結合により結合した複数 の単位を含む高分子であって： 該単位がヌクレオシドおよび核酸塩基から選はれ；ヌクレオシドがα−ヌクレオ シド、β−ヌクレオシド、４′−チオヌクレオシド、および炭素環式ヌクレオシ ドから選はれ；核酸塩基がプリン−９−イルおよびピリミジン−１−イル複素環 式塩基から選ばれ； 該結合が帯電リン結合、中性リン結合、または非リン結合から選ばれ；かつ 結合した単位の配列が少なくとも２つの領域に分けられ：その第１領域が、帯電 および中性３′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド；帯電および中 性２′−５′リン結合により結合したα−ヌクレオシド；非リン結合により結合 したα−ヌクレオシド；帯電および中性３′−５′リン結合により結合した４′ −チオヌクレオシド，帯電および中性２′−５′リン結合により結合した４′− チオヌクレオシド；非リン結合により結合した４′−チオヌクレオシド；帯電お よび中性リン結合により結合した炭素環式ヌクレオシド；非リン結合により結合 した炭素環式ヌクレオシド；帯電および中性３′−５′リン結合により結合した β−ヌクレオシド；帯電および中性２′−５′結合により結合したβ−ヌクレオ シド；非リン結合により結合したβ−ヌクレオシドから選ばれるヌクレオシドを 含み：かつその第２領域が、非リン結合により結合した核酸塩基、および非糖− 締結部分を介してリン酸結合に結合した核酸塩基を含む高分子。
40. ４０．非リン酸結合がペプチド結合である、請求の範囲第３８項に記載の高分子 。
41. ４１．複数の第１領域を含む、請求の範囲第３８項に記載の高分子。
42. ４２．複数の第２領域を含む、請求の範囲第３８項に記載の高分子。
43. ４３．複数の第１領域を含む、請求の範囲第４１項に記載の高分子。
44. ４４．望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生物の治療方法であって 、該生物を請求の範囲第３４項に記載の化合物と接触させることを含む方法。
45. ４５．薬剤学的に有効な量の請求の範囲第３４項に記載の化合物、および薬剤学 的に許容しうる希釈剤またはキャリヤーを含む薬剤組成物。
46. ４６．配列特異性核酸のインビトロ修飾方法であって、ＲＮａｓｅＨおよび上記 核酸を含有する被験溶液を請求の範囲第３４項に記載の化合物と接触させること を含む方法。
47. ４７．望ましくない蛋白質産生を特色とする疾病を伴う生物の治療方法であって 、該生物を請求の範囲第３９項に記載の化合物と接触させることを含む方法。
48. ４８．薬剤学的に有効な量の請求の範囲第３９項に記載の化合物、および薬剤学 的に許容しうる希釈剤またはキャリヤーを含む薬剤組成物。