ES2199236T3

ES2199236T3 - Ensayos tipo sandwich de acido nucleico en fase de solucion habiendo reducido el ruido de fondo.

Info

Publication number: ES2199236T3
Application number: ES95904290T
Authority: ES
Inventors: Michael S. Urdea; Timothy Fultz; Brian D. Warner; Mark Collins
Original assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Current assignee: Bayer AG; Bayer Corp
Priority date: 1993-12-08
Filing date: 1994-12-07
Publication date: 2004-02-16
Anticipated expiration: 2014-12-07
Also published as: DE69432709T2; ATE241017T1; HU221237B1; EP0731848B1; AU694468B2; WO1995016055A1; US5681697A; KR100327610B1; JP3802925B2; HUT74225A; US5635352A; JP2006020649A; KR960706566A; JP3892450B2; JP2004301849A; EP0731848A1; JP2006055170A; HU9601593D0; DE69432709D1; CA2178598A1

Abstract

SE PREVEN NUEVAS TECNICAS PARA REDUCIR SUSTANCIALMENTE LAS SEÑALES DE FONDO QUE SE ENCUENTRAN EN ENSAYOS DE HIBRIDACION EN FASE DE SOLUCION. LAS TECNICAS CONSISTEN EN ELIMINAR O REDUCIR SIGNIFICATIVAMENTE EL FENOMENO DE HIBRIDACION NO ESPECIFICA Y ENLACE NO ESPECIFICO, DE MODO QUE A EMITIR UNA SEÑAL DETECTABLE QUE SE PRODUCE SOLAMENTE EN PRESENCIA DEL POLINUCLEOTIDO DIANA DE INTERES. EN ALGUNAS VERSIONES, SE PREVEN METODOS PARA AUMENTAR LA SEÑAL QUE PUEDE DE OTRO MODO SER REDUCIDA EN LA REDUCCION DE RUIDO. TAMBIEN SE PREVEN KITS PARA LA REALIZACION DE LOS NUEVOS ENSAYOS.

Description

Ensayos tipo sándwich de ácido nucleico en fase de solución habiendo reducido el ruido de fondo.

Campo técnico

Esta invención está relacionada, en general, con la química del ácido nucleico y con ensayos de hibridación. Más en concreto, la invención está relacionada con métodos para la obtención de una señal más dependiente de la diana en ensayos de hibridación tipo sándwich en fase de solución, por medio de la minimización del ruido de fondo derivado, principalmente, de la hibridación no específica y/o la unión no específica. De forma adicional, la invención está relacionada con métodos para la compensación de la pérdida de la señal mientras se reduce el ruido de fondo. La invención está también relacionada con equipos conteniendo los reactivos necesarios para llevar a cabo los ensayos revelados.

Antecedentes

Los ensayos de hibridación del ácido nucleico son comúnmente utilizados en la investigación genética, la investigación biomédica y los diagnósticos clínicos. En un ensayo básico de hibridación del ácido nucleico el analito de hebra sencilla de ácido nucleico es hibridado con una sonda de hebra sencilla de ácido nucleico marcada, siendo detectados los dobles marcados resultantes. Han sido desarrolladas variaciones de este esquema básico con el fin de mejorar la precisión, facilitar la separación de los dobles a ser detectados de los materiales extraños, y/o amplificar la señal que es detectada.

La presente invención está dirigida a un método de reducción de las señales de fondo que se encuentran en los ensayos de hibridación tipo sándwich en fase de solución, que se derivan de fuentes diversas. Por lo general, el ruido de fondo -que es tratado por medio de las técnicas ahora reveladas- resulta de la interacción indeseada de varios componentes polinucleótidos que son utilizados en un ensayo dado, es decir, la interacción que da lugar a una señal que no corresponde a la presencia o cantidad del analito. La invención se muestra de utilidad en relación con cualquier número de formatos de ensayo en donde sean realizadas múltiples fases de hibridación con el fin de producir una señal detectable que se correlacione con la presencia o cantidad de un analito polinucleótido.

Uno de tales ensayos es descrito en detalle en la Patente U.S. de propiedad común nº 4.868.105 de Urdea et al. Ese ensayo comprende la utilización de un sistema de captura en dos partes, diseñado para unir el analito polinucleótido a un soporte sólido, y un sistema de marcaje en dos partes, diseñado para unir un marcador detectable al analito polinucleótido a ser detectado o cuantificado. El sistema de captura en dos partes comprende la utilización de sondas de captura unidas a un soporte sólido, y de moléculas extensoras de captura, las cuales se hibridan tanto con un segmento de las sondas captura como con un segmento del analito polinucleótido. El sistema de marcaje en dos partes comprende la utilización de moléculas extensoras de sonda marcadora, las cuales se hibridan con un segmento del analito polinucleótido, y de sondas marcadoras, que se hibridan con las moléculas extensoras de sonda marcadora, y contienen o se unen a un marcador detectable. Una ventaja de un sistema como este es que debe tener lugar una pluralidad de fases de hibridación para que el marcador sea detectado de manera que se correlacione con la presencia del analito, ya que deben tener lugar dos reacciones distintas de hibridación para la ``captura'' del analito y, de manera similar, deben tener lugar dos reacciones distintas de hibridación para el marcaje del analito. Sin embargo, existe un número de maneras en las que una señal detectable puede ser generada de tal forma que no se corresponda con la presencia o cantidad del analito, y éstas serán comentadas en detalle a continuación.

Otro ejemplo de un ensayo, en el que es útil la presente invención, es un método de amplificación de señal que es descrito en la Patente U.S. de propiedad común nº 5.124.246 de Urdea et al. En ese método la señal es amplificada a través de la utilización de multímetros de amplificación, polinucleótidos que son preparados para contener un primer segmento que se hibrida específicamente con el analito de ácido nucleico o con una hebra de ácido nucleico unida al analito, y una multiplicidad de segmentos secundarios que se hibridan específicamente con una sonda marcada. El grado de amplificación es teóricamente proporcional al número de iteraciones del segundo segmento. Los multímetros pueden ser lineales o ramificados. Los multímetros ramificados pueden tener la forma de un tenedor o de un peine, siendo los preferidos los multímetros tipo peine.

Es descrito en la Publicación de Patente Europea nº 70.685 -inventores M.J. Heller et al.- un enfoque que ha sido propuesto para incrementar la dependencia con la diana de la señal en un ensayo de hibridación. Esa referencia describe un ensayo de hibridación homogéneo, en el que tiene lugar una transferencia no radioactiva de energía entre sondas próximas; deben tener lugar dos sucesos distintos para que sea producida una señal generada por la diana, aumentando la precisión de la detección. Un segundo enfoque diseñado para aumentar la señal derivada de la presencia del analito es descrito en la Publicación de Patente Europea nº 361.983, inventor J.E. Stefano. El método descrito en la misma comprende la hibridación de dos secuencias de sonda (una es un ARN midivariante (MDV), la otra es una medio-ribozima), cada una de las cuales es complementaria de las secuencias presentes en un ARN diana. La ribozima así formada separa específicamente la cola de la sonda MDV, liberando la sonda MDV del soporte y aumentando su replicado. Queda aún un tercer enfoque para incrementar la especificidad en los ensayos de hibridación, descrito por Distefano et al., J. Am Chem. Soc. (1992) 114:11006-11007. Ese método comprende la utilización de regiones cortas de formación de doble hélice para incrementar la estabilidad de dos regiones cortas del ADN de triple hélice.

La Publicación de Patente Europea nº 552.931, inventores Hogan et al., describe un ensayo de hibridación de ácido nucleico utilizando un sistema de sonda que detecta regiones de ADN de doble hebra que sólo se forman en presencia de la secuencia diana.

La presente invención, que no depende de la detección de la presencia de regiones de doble hebra, está también diseñada para incrementar la precisión de la detección y cuantificación de analitos polinucleótidos en ensayos de hibridación. La invención aumenta tanto la sensibilidad como la especificidad de tales ensayos, por medio de la reducción de la incidencia de la generación de la señal que tiene lugar en ausencia de la diana, y no significa un incremento substancial ni de tiempo ni de coste en relación con las actuales configuraciones de ensayos. En ciertas realizaciones la invención es también efectiva a la hora de compensar la pérdida de señal que puede producirse cuando se reduce el ruido de fondo.

Las Publicaciones PCT núms. WO 93/13221, WO 93/13223 y WO 93/13227 revelan los ensayos de hibridación tipo sándwich en fase de solución utilizando las sondas chlamydiae, HIV y CMV, respectivamente.

Revelación de la Invención

Se proporcionan métodos y equipos para la detección de analitos de ácido nucleico en una muestra. Por lo general, los métodos son mejoras en la hibridación tipo sándwich, lo que comprende la unión del analito a un soporte sólido, el marcaje del analito, y la detección de la presencia del marcador en el soporte. Los métodos preferidos comprenden la utilización de multímetros de amplificación, los cuales permiten la unión de un número significativamente mayor de marcadores al complejo analito-sonda, aumentando la sensibilidad y especificidad del ensayo.

En un primer aspecto de la invención se proporciona un ensayo en el que son utilizadas dos o más moléculas ``extensoras de captura'' distintas, cada una de las cuales debe unirse al analito con el fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable.

Conforme a ello, la presente invención proporciona un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo: (a) la unión del analito de forma indirecta a un soporte sólido; (b) el marcaje del analito; (c) la detección de la presencia del marcador asociado al analito; y (d) la correlación de la presencia del marcador en el soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde son incorporadas al ensayo una primera molécula extensora de captura y una segunda molécula extensora de captura distinta, ambas debiendo hibridarse con el analito a fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable, comprendiendo cada una de dichas primera y segunda moléculas extensoras de captura un polinucleótido conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en una sonda de captura unida a un soporte sólido, y

en donde el segmento de unión al analito de la primera molécula extensora de captura es distinto del segmento de unión al analito de la segunda molécula extensora de captura y, además, en donde la sonda de captura contiene una primera secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la primera molécula extensora de captura, y una segunda secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la segunda molécula extensora de captura, de tal forma que las dos moléculas extensoras de captura distintas puedan unirse a una única sonda de captura, y

en donde la temperatura de fusión T_{m1} a la que el analito de ácido nucleico se disocia de la sonda de captura en el complejo híbrido formado por la sonda de captura, las moléculas extensoras de captura y el analito del ácido nucleico es, al menos, alrededor de 5ºC mayor que la temperatura de fusión T_{m2} de los complejos híbridos formados por la sonda de captura y las moléculas extensoras de captura.

En este aspecto, el ensayo es realizado en condiciones que favorecen la formación de complejos híbridos, en los que la molécula del analito se une a las sondas de captura. Esta técnica está basada en la estabilidad aumentada de los complejos de multicomponentes en relación con los complejos menos estables de dos componentes. Un método preferido para favorecer los complejos híbridos unidos al analito incluye el llevar a cabo una o más fases del ensayo a una temperatura entre T_{m1} y T_{m2}.

En otro aspecto de la invención se proporciona un ensayo en el que son utilizadas dos o más moléculas ``extensoras marcadoras'' distintas; según lo indicado con anterioridad, las moléculas extensoras marcadoras están uniendo sondas que se unen tanto al analito como a sondas marcadoras, bien directamente, como en la Patente U.S. nº 4.868.105, o indirectamente a través de multímetros de amplificación, como en la Patente U.S. nº 5.124.246.

Conforme a ello, la presente invención proporciona, de forma adicional, un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido teniendo sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura comprendiendo polinucleótidos que contienen un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, una primera molécula extensora marcadora que tiene un primer segmento, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento, capaz de hibridarse con un sistema de sonda marcadora, una segunda molécula extensora marcadora distinta que tiene un primer segmento, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento, capaz de hibridarse con un sistema de sonda marcadora, un sistema de sonda marcadora que comprende secuencias de ácido nucleico, capaces de hibridarse con los segundos segmentos de la primera molécula extensora marcadora y la segunda molécula extensora marcadora y la cual, directa o indirectamente, da lugar a una señal detectable;

(b) incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, las moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultanea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar un complejo híbrido unido al soporte;

(c) a continuación, separación opcional de los materiales que no se hayan unido al soporte sólido;

(d) seguidamente, puesta en contacto del complejo híbrido unido al soporte con el sistema de sonda marcadora bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un complejo híbrido marcado unido al soporte;

(e) a continuación, separación de los materiales que no se hayan unido al soporte sólido; y

(f) detección de la presencia del marcador en el complejo híbrido marcado unido al soporte; y

(g) correlación de la presencia del marcador en el tercer complejo híbrido unido al soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde las moléculas extensoras marcadoras están configuradas de tal forma que el complejo híbrido marcado unido al soporte de la fase (d) únicamente se formará cuando ambas moléculas extensoras marcadoras -primera y segunda- se hayan unido al analito, y

en donde la temperatura de fusión T_{m1} a la que el analito de ácido nucleico se disocia de la sonda de captura en el complejo híbrido formado por la sonda de captura, las moléculas extensoras de captura y el analito de ácido nucleico es, al menos, alrededor de 5ºC mayor que la temperatura de fusión T_{m2} de los complejos híbridos formados por la sonda de captura y las moléculas extensoras de captura.

En otro aspecto relacionado con la invención se proporciona un ensayo en el que la temperatura de fusión T_{m1} del complejo de multicomponentes formado por el analito y un multímetro de amplificación o sonda marcadora, mediado por dos o más moléculas extensoras marcadoras distintas, es, al menos, 5ºC mayor que la temperatura de fusión T_{m2} de cada uno de los complejos de dos componentes, formados por un multímetro de amplificación o sonda marcadora y una molécula extensora marcadora individual. En este aspecto, el ensayo es llevado a cabo en condiciones que favorecen la formación de complejos híbridos, en los que la molécula de analito se encuentra unida a los multímetros de amplificación o sondas marcadoras. Esta técnica está basada en la estabilidad aumentada de los complejos de multicomponentes en relación con los complejos mucho menos estables de dos componentes. Un método preferido a la hora de favorecer los complejos híbridos de analito-multímetro de amplificación incluye el llevar a cabo una o más fases del ensayo a una temperatura entre T_{m1} y T_{m2}.

En otro aspecto más de la invención los ensayos de amplificación son llevados a cabo con dos multímetros de amplificación distintos, los cuales están unidos por sondas marcadoras.

De esta forma, la invención proporciona, además, un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido teniendo sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tienen un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, una primera molécula extensora marcadora que tiene un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con un primer multímetro de amplificación, una segunda molécula extensora marcadora que tiene un primer segmento L-1a, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2a, capaz de hibridarse con un segundo multímetro de amplificación, un primer multímetro de amplificación que contiene una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con L-2, y una pluralidad de subunidades idénticas de oligonucleótido que contienen secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con un primer segmento de sonda marcadora, un segundo multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1a, capaz de hibridarse con L-2a, y una pluralidad de subunidades idénticas de oligonucleótido que contienen secuencias de ácido nucleico M-2a, capaces de hibridarse con un segundo segmento de sonda marcadora, y segmentos primero y segundo de sonda marcadora, capaces de hibridarse con multímetros de amplificación, y los cuales, cuando están presentes en multímetros de amplificación próximos, dan lugar a una señal detectable;

\newpage

(b) incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, las moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultanea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar un primer complejo híbrido unido al soporte;

(c) a continuación, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido;

(d) puesta en contacto del primer complejo híbrido unido al soporte bajo condiciones de hibridación con el multímetro de amplificación, con el fin de producir un segundo complejo híbrido unido al soporte;

(e) seguidamente, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido;

(f) puesta en contacto del segundo complejo híbrido unido al soporte con las sondas marcadoras bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un tercer complejo híbrido unido al soporte;

(g) a continuación, separación de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido; y

(h) observación de la presencia de una señal detectable, resultante de la interacción entre los segmentos primero y segundo de la sonda marcadora con el tercer complejo híbrido unido al soporte, en donde la presencia del marcador en el soporte indica la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde el primer segmento de la sonda marcadora es capaz de unirse con el primer multímetro de amplificación, y el segundo segmento de la sonda marcadora es capaz de unirse con el segundo multímetro de amplificación, de tal manera que el tercer complejo híbrido unido al soporte no se forma a menos que los multímetros de amplificación primero y segundo estén unidos por medio de sondas marcadoras, y

Como en los ensayos precedentes, la especificidad se ve aumentada como resultado de los equipos de sonda adicionales y de las fases adicionales de hibridación, las cuales deben tener lugar con el fin de que sea generada una señal detectable.

La invención también abarca variaciones en los ensayos de hibridación tipo sándwich, en las que oligonucleótidos competidores son incorporados a los ensayos con el fin de unirse a las sondas de captura (reduciendo de esta forma la probabilidad de la hibridación no específica en el soporte sólido), y en donde son utilizadas sondas de captura más cortas (de nuevo, con el fin de reducir la probabilidad de la hibridación no específica en el soporte).

En consecuencia, la invención proporciona, además, un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo: (a) la unión del analito por medio de las moléculas extensoras de captura, directa o indirectamente, a sondas de captura unidas al soporte sólido; (b) el marcaje del analito; (c) la detección de la presencia del marcador asociado al analito en el soporte; y (d) correlación de la presencia del marcador en el soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde es incorporado al ensayo un oligonucleótido competidor, conteniendo una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con la sonda de captura unida al soporte sólido,

en donde las moléculas extensoras de captura están configuradas de tal forma que el marcador asociado al analito de la fase (c) se formará únicamente cuando ambas -una primera molécula extensora de captura y una segunda molécula extensora de captura distinta- se hayan unido al analito, y

En los métodos de la presente invención, la pérdida de señal -que puede resultar de las distintas técnicas aquí proporcionadas con el fin de reducir el ruido de fondo- puede ser compensada por medio de la utilización de moléculas preamplificadoras. Tales moléculas sirven como restos intermedios entre las moléculas extensoras marcadoras y los multímetros de amplificación, y están estructuradas para que se unan a una pluralidad de multímetros de amplificación. De esta forma, el número de sondas marcadoras por extensor marcador puede ser incrementado en gran medida.

Además, en los métodos para llevar a cabo un ensayo de hibridación conforme a la invención, puede ser combinada cada una de las técnicas mencionadas con anterioridad. Por ejemplo, la utilización de dos o más moléculas extensoras marcadoras distintas puede ser combinada con dos o más moléculas extensoras de captura distintas y multímetros de amplificación y sondas marcadoras, estructuradas de tal modo que las sondas marcadoras se unan a multímetros adyacentes.

Finalmente, la invención abarca equipos que contienen los reactivos necesarios para llevar a cabo los ensayos de hibridación tipo sándwich de la invención.

Breve Descripción de las figuras

Figura 1: diagrama de un ensayo de hibridación de ácido nucleico conforme a conocimientos previos.

Figuras 2 a 7: son ejemplos específicos de sucesos de hibridación productores de ruido.

Figuras 8, 9 y 10: son ejemplos del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, en los que son necesarias las moléculas extensoras de captura para unir una diana al soporte sólido. Las figuras 8 y 9 muestran diferentes formas en las que dos extensores de captura se unen a una única sonda de captura.

Figura 10: es un ejemplo del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, utilizando moléculas extensoras de captura múltiples que se unen a la misma o a diferentes sondas de captura, una por sonda.

Figura 11: es un ejemplo del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, utilizando moléculas extensoras marcadoras que forman una estructura cruciforme.

Figura 12: es un ejemplo del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, utilizando múltiples multímetros de amplificación y sondas marcadoras de unión.

Figura 13: es un ejemplo del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, utilizando múltiples multímetros de amplificación y múltiples sondas marcadoras de unión.

Figura 14: muestra las curvas de fusión de extensores de captura-diana marcada-sonda de captura y de extensores de captura marcados-sonda de captura, con un equilibrado de 2 horas.

Figura 15: es otro ejemplo del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, utilizando múltiples multímetros de amplificación y múltiples sondas marcadoras de unión.

Figura 16: es un ejemplo del ensayo mejorado de hibridación de ácido nucleico de la presente invención, combinando varios de los conceptos individuales aquí revelados.

Modos de llevar a cabo la invención Definiciones y nomenclatura

Antes de que la presente invención sea revelada y descrita en detalle, debe ser entendido que esta invención no se limita a formatos, materiales o reactivos específicos del ensayo, ya que los mismos pueden, desde luego, variar. Debe también entenderse que la terminología aquí utilizada lo es con el propósito de describir solo determinadas realizaciones y la intención es que no se limite a las mismas.

En esta especificación, y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que serán definidos para que tengan los siguientes significados:

Según son aquí utilizados, los términos ``polinucleótido'' y ``oligonucleótido'' serán genéricos de los polidesoxirribonucleótidos (conteniendo 2-desoxi-D-ribosa), de los polirribonucleótidos (conteniendo D-ribosa), de cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glicósido de una base de purina o pirimidina, y de otros polímeros que contengan columnas vertebrales no nucleotídicas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) y polímeros de ácido nucleico específicos de secuencia sintética, disponibles comercialmente en Antivirals Inc., Corvallis, Oregon, como polímeros Neugene™) o uniones no estándar, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el emparejamiento de bases y el amontonamiento de bases, como la que se encuentra en el ADN y en el ARN. No se intenta hacer distinción de longitud entre el término ``polinucleótido'' y ``oligonucleótido'', y estos términos serán utilizados de forma intercambiable. Estos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. De esta forma, estos términos incluyen al ADN de fibra doble y de fibra única, así como al ARN de fibra doble y de fibra única, e híbridos de ADN:ARN, y también incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en este campo, metilación, ``capuchones'', substitución de uno o más de los nucleótidos naturales resultantes por un análogo, modificaciones internucleótidas como, por ejemplo, aquéllas con uniones sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriesteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.), y con uniones con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquéllas conteniendo restos pendientes, como por ejemplo proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquéllas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquéllas que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquéllas que contienen alquiladores, aquéllas que tienen uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas sin modificar de polinucleótidos u oligonucleótidos.

Se apreciará que, conforme son aquí utilizados los términos ``nucleósido'' y ``nucleótido'', incluirán aquellos restos que contienen no sólo las conocidas bases purina y pirimidina, sinó también otras bases heterocíclicas que hayan sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o primidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otras heterocíclicas. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluirán modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, en donde son reemplazados uno o más de los grupos hidróxilo por grupos halógenos alifáticos, o funcionan como éteres, aminas o similares.

El término ``analito polinucleótido'' se refiere a una molécula de ácido nucleico de hebra única o doble, la cual contiene una secuencia nucleótida diana. Los analitos de ácido nucleico pueden resultar de una variedad de fuentes, por ejemplo, fluidos o sólidos biológicos, materias alimenticias, materias del medio ambiente, etc., y pueden ser preparados para los análisis de hibridación por medio de una variedad de métodos, por ejemplo, la adición de proteinasa K/SDS, sales caotrópicas, o similares, o extracción de fenol/cloroformo. El término ``analito polinucleótido'' es utilizado aquí de forma intercambiable con los términos ``analito'', ``analito de ácido nucleico'', ``diana'' y ``molécula diana''.

Conforme es aquí utilizado, el término ``región diana'' o ``secuencia nucleótida diana'' se refiere a una región de unión a la sonda, que se encuentra dentro de la molécula diana. El término ``secuencia diana'' se refiere a una secuencia con la que una sonda formará un híbrido estable bajo las condiciones deseadas.

Conforme es aquí utilizado, el término ``sonda'' se refiere a una estructura comprendida por un polinucleótido -según se define más arriba-, el cual contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico presente en la molécula diana. Las regiones de polinucleótido en las sondas pueden estar compuestas de ADN, y/o ARN, y/o análogos de nucleótido sintéticos.

Podrá apreciarse que no es necesario que las secuencias de unión sean perfectamente complementarias para proporcionar híbridos estables. En muchos casos los híbridos estables se formarán en donde menos de alrededor del 10% de las bases sean incompatibles, ignorando anillos de cuatro o más nucleótidos. Conforme a ello, el término ``complementario'', según es aquí utilizado, trata de referirse a un oligonucleótido que forma una pareja estable con su ``complemento'' bajo condiciones de ensayo, por lo general cuando existe alrededor de un 90% o más de homología.

Los términos ``multímetro de ácido nucleico'' o ``multímetro de amplificación'' son utilizados aquí para referirse a un polímero lineal o ramificado del mismo segmento repetidor de oligonucleótido de hebra única, o a diferentes segmentos de polinucleótido de hebra única, cada uno de los cuales contiene una región en donde puede unirse una sonda marcadora, es decir, contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico contenida dentro de una sonda marcadora; los segmentos de oligonucleótido pueden estar compuestos de ARN, ADN, nucleótidos modificados o combinaciones de los mismos. Al menos uno de los segmentos tiene una secuencia, longitud y composición que le permite unirse específicamente a una secuencia diana en una sonda marcadora; además, al menos uno de los segmentos tiene una secuencia, longitud y composición que le permite unirse específicamente a una secuencia diana en un extensor marcador o preamplificador. Lo usual es que tales segmentos contengan aproximadamente de 15 a 50 nucleótidos -preferiblemente de 15 a 30- y que tengan un contenido de GC en el rango de alrededor de un 20% a un 80%. El número total de segmentos de oligonucleótido en el multímetro estará, por lo general, en el rango de alrededor del 3 a 1.000, más usualmente en el rango de alrededor de 10 a 100, y lo más común es que sea de alrededor de 50. Los segmentos de oligonucleótido del multímetro pueden estar unidos de forma covalente directamente unos con otros por medio de enlaces de fosfodiéster, o por medio de agentes de unión interpuestos, como puentes de ácido nucleico, de aminoácido, de carbohidrato o de poliol, o por medio de otros agentes de cruzamiento que sean capaces de cruzar ácido nucleico o hebras modificadas de ácido nucleico. De forma alternativa, el multímetro puede estar compuesto por segmentos de oligonucleótido que no se encuentren enganchados de forma covalente, pero que estén enlazados de alguna otra forma, por ejemplo, por medio de hibridación. Un multímetro de este tipo es descrito, por ejemplo, en la Patente U.S. nº 5.175.270 de Nilsen et al. El lugar (es) de enlace puede estar en los extremos del segmento (bien en una orientación normal 3'-5', u orientado de forma aleatoria) y/o en uno o más nucleótidos internos en la hebra. En los multímetros lineales los segmentos individuales son enganchados extremo con extremo, con el fin de formar un polímero lineal. En uno de los tipos de multímetro ramificado, tres o más segmentos de oligonucleótido emanan de un punto de origen para formar una estructura ramificada. El punto de origen puede ser otro segmento de nucleótido o una molécula multifuncional a la que, al menos, pueden ser unidos de forma covalente tres segmentos. En otro tipo, existe un segmento de la columna vertebral del oligonucleótido con uno o más segmentos del oligonucleótido pendientes. Los multímetros de este último tipo son de estructura ``en forma de tenedor'', ``en forma de peine'' o combinaciones de ``tenedor'' y ``peine'', en donde los multímetros ``en forma de peine'', que aquí son los preferidos, son polinucleótidos que tienen una columna vertebral lineal con una multiplicidad de cadenas laterales que se extienden desde la columna vertebral. Lo normal es que los segmentos pendientes lo hagan de un nucleótido modificado u otros restos orgánicos que tengan grupos funcionales apropiados con los que los oligonucleótidos puedan ser conjugados, o unidos de otro modo. El multímetro puede ser lineal en su totalidad, totalmente ramificado, o una combinación de partes lineales y ramificadas. Lo usual es que en el multímetro haya, al menos, dos puntos de ramificación, más preferiblemente al menos tres, más preferible aún, en el rango de alrededor de 5 a 30, aunque en algunas realizaciones pueda haber más. El multímetro puede incluir uno o más segmentos de secuencias de doble hebra. Puede ser encontrada información adicional relacionada con la síntesis del multímetro y estructuras específicas del multímetro en la Patente U.S. de propiedad común nº 5.124.246 de Urdea et al.

La Publicación PCT nº WO 92/02526 describe los multímetros ramificados de tipo peine, los cuales son especialmente preferidos en relación con el presente método, y que están compuestos de una columna vertebral lineal y cadenas laterales pendientes; incluyendo la columna vertebral un segmento que proporciona un lugar de hibridación específico para el analito de ácido nucleico o para el ácido nucleico unido al analito, mientras que las cadenas laterales pendientes incluyen iteraciones de un segmento que proporciona lugares de hibridación específicos para una sonda marcada.

Un primer tipo del multímetro de polinucleótido preferido de tipo peine puede ser representado por la siguiente fórmula esquemática (I):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 3' -- S -- ( \hskip-2mm \+ XS') _{m}  --
(R _{n} ) -- S'' -- A -- 5'\cr  \+ \hskip1mm |\cr  \+
S'''\cr  \+ \hskip1mm |\cr 
\+ \hskip-1mm (R)   _{n} \cr 
\+ \hskip1mm |\cr  \+ E\cr  \+ \hskip1mm |\cr  \+
L\cr}

en donde S es un primer segmento espaciador de, al menos, alrededor de 15 nucleótidos -preferiblemente alrededor de 15 a 50 nucleótidos-, X es un nucleótido multifuncional que proporciona un lugar de ramificación, S' es un segmento espaciador del lugar de ramificación -de 0 a alrededor de 15 nucleótidos, preferiblemente de 0 a 10 nucleótidos-, m es un número entero igual a/o mayor que 15 -preferiblemente en el rango de 15 a 100-, R es una molécula ligadora de corte, n es 0 ó 1, S'' es un segundo segmento espaciador de alrededor de 0 a 10 nucleótidos -preferiblemente de 5 a 10 nucleótidos-, A es un segmento que es capaz de hibridarse específicamente con el analito de ácido nucleico o con el ácido nucleico unido al analito, S''' es un tercer segmento espaciador de 0 a 10 nucleótidos, E es una extensión de oligonucleótido de 5 a 10 nucleótidos, y L es un segmento que contiene de 2 a 10 iteraciones -preferiblemente de 3 a 6 iteraciones- de una secuencia nucleótida, que es capaz de hibridarse específicamente con una sonda de oligonucleótido marcada.

Un segundo tipo de realización preferida de estos multímetros de polinucleótido de tipo peine puede ser representada por medio de la siguiente fórmula esquemática (II):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 3' -- A -- S -- (S' -- \+ \hskip-1mm 
X') _{m}  -- S'' -- 5'\cr  \+ \hskip1mm |\cr 
\+ \hskip-1mm (R)   _{n} \cr 
\+ \hskip1mm |\cr  \+ S'''\cr  \+ \hskip1mm |\cr 
\+ E\cr  \+ \hskip1mm |\cr  \+
L\cr}

en donde A es un segmento que es capaz de hibridarse específicamente con el analito de ácido nucleico o con el ácido nucleico unido al analito, S es un primer segmento espaciador de, al menos, alrededor de 15 moléculas -preferiblemente alrededor de 15 a 50 moléculas-, X' es una molécula monomérica que proporciona un lugar de ramificación, S' es un segmento espaciador del lugar de ramificación de 0 a alrededor de 15 moléculas -preferiblemente de 0 a 10 moléculas-, m es un número entero igual a/o mayor que 15 -preferiblemente en el rango de 15 a 100-, S'' es un segundo segmento espaciador de alrededor de 0 a 10 moléculas -preferiblemente de 5 a 10 moléculas-, R es una molécula ligadora de corte, n es 0 ó 1, S''' es un tercer segmento espaciador de 0 a 10 moléculas, E es una extensión de oligonucleótido de 5 a 10 nucleótidos, y L es un segmento que contiene de 2 a 10 iteraciones -preferiblemente de 3 a 6 iteraciones- de una secuencia nucleótida que es capaz de hibridarse específicamente con una sonda de oligonucleótido marcada.

La columna vertebral completa del multímetro o la parte del mismo de S a S'', inclusive, y la parte de la cadena lateral excluyendo L, serán sintetizadas químicamente, en la forma usual, como una unidad íntegra, utilizando química automática de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida y equipo convencionales. En este aspecto, el segmento espaciador S sirve para espaciar la parte de la molécula que contiene los lugares de ramificación de la fase sólida (el extremo 3' de S es unido directa o indirectamente a la superficie de la fase sólida). En otras realizaciones, la columna vertebral al completo y las cadenas laterales pendientes, incluyendo L, pueden ser sintetizadas como una unidad íntegra.

Los nucleótidos modificados o el monómero ramificado designado como X o X' en la fórmula anterior, pueden ser un nucleótido multifuncional en el que se utiliza un grupo funcional para la extensión de la cadena lateral y los otros son utilizados para las uniones a la columna vertebral. Son descritos ejemplos de nucleótidos multifuncionales en EPA 883096976 (Serie U.S. nº 340.031). Estos nucleótidos modificados tienen, preferiblemente, la fórmula:

3

en donde R_{3} es hidrógeno, metilo, I, Br o F, R_{4} es hidrógeno o metilo, Z es seleccionado de entre el grupo consistente en:

4

5

6

7

8

9

en donde x e y pueden ser el mismo o diferente, y son números enteros en el rango de 1 a 8, inclusive. (Las designaciones ``(1)'' y ``(2)'' en el ligando Z indican la orientación del resto ligador de Z).

Para los multímetros de la Formula I, según se indica, el segmento espaciador S' es opcional y puede ser utilizado, si se desea, para espaciar cada lugar de ramificación de los lugares de ramificación laterales precedentes/siguientes, o una serie de lugares de ramificación adyacentes de series laterales de lugares de ramificación. El segundo segmento espaciador S'' es también opcional, y puede ser utilizado para espaciar la parte ramificada de la molécula del segmento A, a la que finalmente es unido el analito (por medio de una o más moléculas intermedias, como los extensores marcadores y los preamplificadores). Se ha descubierto que tal espaciado mejora la unión entre el analito y el multímetro. De igual forma, el tercer segmento espaciador S''' es opcional. Es, preferiblemente, poli-(T).

Para los multímetros de la Fórmula II, según se indica, el segmento espaciador S' es opcional, y puede ser utilizado, si se desea, para espaciar cada lugar de ramificación de los lugares de ramificación laterales precedentes/siguientes, o una serie de lugares de ramificación adyacentes de series laterales de lugares de ramificación. De igual forma, el segmento espaciador S''' es opcional. S, S', S'', y S''' pueden comprender moléculas nucleótidas o no nucleótidas. Un ejemplo de una molécula no nucleótida que puede ser utilizada en un segmento espaciador es la molécula ligadora de corte R, descrita más abajo.

El segmento A tiene una secuencia y longitud que le permite unirse específica y establemente a un ácido nucleico, como un extensor marcador o un preamplificador, el cual se encuentra unido al analito. Con el fin de obtener tal especificidad y estabilidad, el segmento A tiene, usualmente, una longitud de 15 a 50 nucleótidos -preferiblemente de 15 a 30-. La longitud y secuencia específicas de este segmento variarán, desde luego, dependiendo del ácido nucleico con el que se pretenda que se hibride.

El segmento E es una extensión de cadena lateral, que es sintetizada químicamente utilizando equipo y técnicas automáticas de síntesis de oligonucleótido en fase sólida. Usualmente tiene alrededor de 5 a 10 nucleótidos de longitud, y sirve como un lugar al que puede ser ligado enzimática o químicamente el segmento L.

El segmento L comprende iteraciones de un segmento oligomérico, que es capaz de hibridarse específica y establemente con una sonda de oligonucleótido marcada. Estos segmentos son también, por lo general, de entre 15 y 150 nucleótidos de longitud -preferiblemente de entre 15 y 120-. Cada segmento L contendrá usualmente entre 2 y 10 iteraciones del segmento -preferiblemente entre 3 y 6 iteraciones-. Algunas cadenas laterales puede que no incluyan un segmento L. Por lo general, al menos alrededor de un 50% de las cadenas laterales incluirán un segmento L -preferiblemente, al menos alrededor de un 70% de las cadenas laterales-.

Las moléculas ligadoras de corte (R) en la columna vertebral y/o cadenas laterales son opcionales, pero preferidas. Proporcionan lugares elegibles de corte, de tal forma que las muestras del polinucleótido grande tipo peine puedan ser cortadas para su análisis y caracterización. En este aspecto, se prefiere que existan lugares de corte en cada cadena lateral y lugares de corte adicionales justo en 5', o en el lugar más cercano de ramificación de 5' (para multímetros con la fórmula I), o donde la cadena lateral se junta con la columna vertebral (para multímetros con la fórmula II). Son descritos en EPA 883096976 ejemplos de moléculas ligadoras de corte que pueden ser incorporadas a los polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser ensamblados utilizando una combinación de síntesis directa de oligonucleótidos en fase sólida, métodos de ligación enzimática, y síntesis química en fase de solución, según es descrito en detalle en la Publicación PCT nº WO 92/02526.

Conforme se indica más arriba, puede ser utilizada también una molécula ``preamplificadora'', la cual sirve como un resto puente entre las moléculas extensoras marcadoras y los multímetros de amplificación. De esta forma es unido más amplificador y, por ello, más marcador, a cualquier complejo dado de sonda- diana. Las moléculas preamplificadoras pueden ser lineales o ramificadas y, usualmente, contienen en el rango de alrededor de 30 a 3000 nucleótidos. En la realización aquí preferida la molécula preamplificadora se une, al menos, a dos moléculas extensoras marcadoras diferentes, de tal forma que se ve incrementada la precisión total del ensayo (es decir, porque, de nuevo, se requiere una pluralidad de sucesos de hibridación para que se forme el complejo sonda-diana).

Según se utiliza aquí, una ``muestra biológica'' se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un individuo, incluyendo -aunque sin limitarse a ellos- por ejemplo: plasma, suero, fluido espinal, semen, fluido linfático, secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos, y también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro (incluyendo, pero sin limitarse a ellos: el medio condicionado resultante del crecimiento de células en medios de cultivo celular, células supuestamente infectadas por virus, células recombinantes, y componentes celulares). Los usos preferidos del presente método lo son en relación con la detección y/o cuantificación de: (a) ácidos nucleicos víricos, como el virus de la hepatitis B (``HBV''), el virus de la hepatitis C (``HCV''), el virus de la hepatitis D (``HDV''), el virus de la inmunodeficiencia humana (``HIV''), y los virus de la familia de los herpes, incluyendo el herpes zoster (varicela), los virus de herpes simple I y II, el citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr, y el virus recientemente aislado de herpes IV; y (b) ácidos nucleicos bacterianos, como la clamidia, la tuberculosis micobacteriana, etc.

Según se utiliza aquí, el término ``hibridación no específica'' es utilizado para referirse a aquellos acontecimientos en los que un segmento de un primer polinucleótido -el cual se intenta hibridar con un segmento de un segundo polinucleótido seleccionado-, en lugar de ello se hibrida con un tercer polinucleótido, provocando un resultado erróneo, es decir, dando lugar a una situación en donde puede ser detectado el marcador en ausencia de la molécula diana.

Según es utilizado aquí, el término ``unión no específica'' es utilizado para referirse a aquellos acontecimientos en los que un polinucleótido se une al soporte sólido por medio de una interacción -que puede ser directa o indirecta- que no implica hibridación.

Refiriéndonos ahora a la realización preferida representada en la Figura 1, se aplican los siguientes términos a los ensayos de hibridación descritos en la misma.

Las ``moléculas extensoras marcadoras (LEs)'', a las que también nos referimos aquí como ``extensores marcadores'', contienen regiones de complementariedad vis-a-vis entre el analito polinucleótido y el multímetro amplificador (``AMP''). Si es utilizado un preamplificador (no se muestra en la figura), las moléculas extensoras marcadoras se unirán a esta especie intermedia en lugar de directamente al multímetro amplificador. Si no se utiliza ni preamplificador ni amplificador, las moléculas extensoras marcadoras se unirán directamente a una secuencia de la sonda marcadora (``LP''). De esta forma, las moléculas extensoras marcadoras son cadenas de polinucleótido de hebra única, que tienen una primera secuencia de ácido nucleico L-1, complementaria de una secuencia del analito polinucleótido, y una segunda región que tiene una secuencia de reconocimiento del multímetro L-2, complementaria de un segmento M-1 de la sonda marcadora, del multímetro amplificador o del amplificador.

Las ``sondas marcadoras (LPs)'' están diseñadas para unirse al extensor marcador o, si es utilizado en el ensayo un multímetro de amplificación, a los segmentos repetidos del oligonucleótido del multímetro. Las LPs contienen un marcador o están estructuradas de tal forma que se unen a un marcador. De esta forma, las LPs contienen una secuencia de ácido nucleico L-3, complementaria de una secuencia de ácido nucleico M-2 presente en la sonda marcadora o en los segmentos repetidos del oligonucleótido del multímetro, y están unidas a un marcador, o estructuradas de tal forma que se unen a uno, lo cual proporciona, directa o indirectamente, una señal detectable.

Las ``moléculas extensoras de captura (CEs)'', también referidas aquí como ``extensores de captura'', se unen al analito polinucleótido y a las sondas de captura, los cuales, a su vez, están unidos a un soporte sólido. De esta forma, las moléculas extensoras de captura son cadenas de polinucleótido de hebra única, que tienen una primera región de secuencia de polinucleótido conteniendo una secuencia de ácido nucleico C-1, que es complementaria de una secuencia del analito, y una segunda región, no complementaria, que tiene una secuencia de reconocimiento de sonda de captura C-2. Las secuencias C-1 y L-1 no son secuencias idénticas ni complementarias, siendo cada una de ellas complementaria de secuencias físicamente distintas del analito.

Las ``sondas de captura (CPs)'' se unen a los extensores de captura y a un soporte sólido. De esta forma, según se muestra en la Figura 1, las sondas de captura tienen una secuencia de ácido nucleico C-3, complementaria de la secuencia C-2 de una CE, y se encuentran unidas de forma covalente (o estrechamente de otra forma) a un soporte sólido.

Por lo general, los ensayos de hibridación en fase de solución, llevados a cabo utilizando el sistema mostrado en la Figura 1, se realizan como sigue. El analito de ácido nucleico de hebra única es incubado bajo condiciones de hibridación con los extensores de captura y los extensores marcadores. El producto resultante es un complejo de ácido nucleico del analito polinucleótido unido a los extensores de captura y a los extensores marcadores. Este complejo puede ser añadido con posterioridad, bajo condiciones de hibridación, a una fase sólida que tenga unidas las sondas de captura a la superficie de la misma; sin embargo, en una realización preferida de esta invención, la incubación inicial es llevada a cabo en presencia de las sondas de captura unidas al soporte. El producto resultante comprende el complejo unido a la fase sólida por medio de las moléculas extensoras de captura y de las sondas de captura. A continuación, la fase sólida -con el complejo unido a la misma- es opcionalmente separada de los materiales que no se hayan unido. Seguidamente es añadido, de forma opcional, un multímetro de amplificación -preferiblemente un multímetro tipo peine, como el descrito más arriba- al complejo analito-sonda en fase sólida bajo condiciones de hibridación, con el fin de permitir al multímetro que se hibride con las LEs. Si se utilizan sondas preamplificadoras, el complejo de analito-sonda en fase sólida es incubado con las sondas preamplificadoras, bien junto con el multímetro de amplificación o, con anterioridad a la incubación con el multímetro de amplificación. A continuación, el complejo resultante en fase sólida es separado por medio de lavado de cualquier preamplificador y/o multímetro no unido al mismo. Después, las sondas marcadoras son añadidas bajo condiciones que permitan su hibridación con las LEs o, si fuera utilizado un multímetro de amplificación, con los segmentos repetidos de oligonucleótido del multímetro. Seguidamente, el complejo marcado resultante de ácido nucleico en fase sólida es lavado con el fin de separar los oligonucleótidos marcados no unidos, y se mide el marcador restante. Se debe tener en cuenta que los componentes representados en la Figura 1 no están necesariamente dibujados a escala y que los multímetros de amplificación, si se utilizan, contienen un número bastante superior de segmentos repetidos de oligonucleótido que los mostrados (conforme es explicado más arriba), cada uno de los cuales está diseñado para unirse a una sonda marcadora.

Como será apreciado por aquellos expertos en este campo, las técnicas de la presente invención pueden ser utilizadas junto con una amplia variedad de formatos de ensayo. Sin embargo, por razones de simplicidad, las técnicas presentes serán tratadas en los términos del ensayo de hibridación en fase de solución anteriormente citado, utilizando multímetros de amplificación, lo que representa la realización aquí preferida. De la Figura 2 a la 7 se muestran varias fuentes de ruido de fondo, las cuales pueden aparecer en un ensayo de este tipo. Se tomará nota de que cada una de estas figuras muestra una situación en donde el marcador será detectado en el soporte sólido en ausencia de la diana. En las Figuras 3, 4 y 5 las secuencias de nucleótido presentes en la molécula amplificadora, en el marcador extensor y en la sonda marcadora, respectivamente, se unen preferiblemente a la sonda de captura en lugar de a las secuencias deseadas. En las Figuras 2, 6 y 7 la sonda de captura se ha hibridado correctamente con la molécula extensora de captura, pero, a continuación, una molécula incorrecta se ha hibridado con el extensor de captura. En la Figura 2 el amplificador se ha hibridado directamente con el extensor de captura, en ausencia de la molécula diana, mientras que en las Figuras 6 y 7 la sonda marcadora y el extensor marcador se han hibridado directamente con el extensor de captura, dando lugar de nuevo a una situación en donde el marcador será detectado en ausencia del analito. Sin embargo se verá que pueden ser diseñados otros escenarios de hibridación y unión erróneos -es decir, ``no específicos''-, en donde es generada una señal en ausencia de la diana. Las técnicas de la invención están también dirigidas a estas otras fuentes potenciales de ruido de fondo.

El fin principal del presente método es la eliminación de un número de fuentes de ruido de fondo, por medio de la maximización de la interacción de las sondas extensoras de captura y extensoras marcadoras con la molécula diana, minimizando la interacción de las sondas de captura y las moléculas extensoras de captura con las sondas marcadoras, con las moléculas extensoras marcadoras y con los amplificadores, incrementando el número de sondas y/o fases de hibridación necesarias para dar lugar a una señal dependiente de la diana, y reduciendo la probabilidad de que restos incorrectos se unan a las sondas de captura unidas al soporte.

En una primera realización de la invención se proporciona un ensayo de hibridación, el cual se encuentra configurado de tal forma que la temperatura T_{m1} a la que la molécula diana ``se funde'' separándose de las sondas de captura unidas al soporte (definida como la temperatura a la que el 50% de las sondas de captura individuales que participan en los complejos de sonda de captura / extensor de captura / molécula diana, no se encuentran unidas ya a la molécula diana) es significativamente mayor que la temperatura T_{m2}, a la que una molécula individual extensora de captura ``se funde'' separándose de una única sonda de captura. Este procedimiento puede ser utilizado virtualmente en cualquier tipo de ensayo de hibridación en donde se utilicen sondas de captura y moléculas extensoras de captura, incluyendo una amplia gama de ensayos de hibridación en fase de solución, ensayos de amplificación, métodos de hibridación de filtro, ensayos relacionados con la reacción en cadena de la polimerasa (``PCR''), y similares. Un ejemplo de un ensayo de hibridación en el que es útil la técnica presente es el descrito en la Patente U.S. nº 4.868.105 de Urdea et al., o, preferiblemente, el descrito más arriba, junto con la configuración mostrada en la Figura 1 y descrita más arriba. Este método se base en el diseño y construcción de complejos híbridos tales que la temperatura de fusión T_{m1}, a la que el analito se disocia de la sonda de captura en el híbrido analito-extensor de captura-sonda de captura es, al menos, alrededor de 5ºC mayor -preferiblemente, al menos alrededor de 10ºC mayor- que la temperatura de fusión T_{m2}, a la que un extensor de captura se disocia de una sonda de captura en el híbrido extensor de captura-sonda de captura.

Se saca provecho de esta diferencia de estabilidad en el ensayo, por medio de la realización de, al menos, una de las fases del ensayo bajo condiciones restrictivas que favorezcan la formación del complejo T_{m1}, pero que entorpezcan la formación del complejo T_{m2}. La restricción puede se controlada al alterar un parámetro de fase que sea una variable termodinámica. Tales variables son de sobra conocidas en este campo, e incluyen la concentración de formamida, la concentración de sal, la concentración de sal caotrópica, el pH (concentración del ión de hidrógeno), el contenido de solvente orgánico, y la temperatura. El término ``sal caotrópica'' se refiere a una sal que actúa como un divisor de unión hidrofóbica, incluyendo los trihaloacetatos, el isotiocianato y el perclorato. Hamaguchi et al., J. Am. Chem. Soc. (1962) 84: 1329-1338. Uno de los controles restrictivos preferido es la temperatura: al menos una de las fases del ensayo es realizada a una temperatura de entre T_{m1} y T_{m2}, más preferiblemente a medio camino entre las dos temperaturas. Una fase preferida en la que se emplea esta restricción, es la fase inicial de hibridación en el ensayo, en la que la diana es incubada con las moléculas extensoras de captura y con las sondas de captura unidas al soporte. De esta forma, en una realización preferida, la fase inicial de hibridación es llevada a cabo a una temperatura que es mayor que la T_{m2}, pero inferior a la T_{m1}. Ya que las moléculas hibridadas no específicamente pueden unirse por medio de la sonda de captura y de las moléculas extensoras de captura (según se muestra en las Figuras 2, 6 y 7), este método reduce de forma significativa ciertos tipos de hibridación no específica.

Será fácilmente observado por un experto en la materia que, cuanto mayor es la diferencia de temperatura entre T_{m1} y T_{m2}, mayor es la ``eficiencia'' de esta técnica a la hora de eliminar el ruido de fondo. De esta forma, un experto en la materia reconocerá que los diferenciales de temperatura de menos de 10ºC, aún inferiores a 5ºC, también permitirían la reducción del ruido de fondo, aunque en una menor medida. Se podría incrementar la eficiencia en tales situaciones por medio del incremento del número de fases que utilizan condiciones restrictivas apropiadas, o repitiendo una única fase restrictiva.

El método es llevado a cabo, de forma preferente, utilizando, al menos, dos moléculas extensoras de captura distintas, cada una de las cuales se une a un segmento distinto del analito. Las moléculas extensoras de captura comprenden una primera secuencia de nucleótido complementaria de un segmento del analito, y una segunda secuencia de nucleótido complementaria de una sonda de captura. Este ensayo tiene dos realizaciones topológicas principales.

Una primera realización de esta configuración del ensayo, en la que son utilizadas dos moléculas extensoras de captura distintas, es mostrada en las Figuras 8 y 9. En esta realización, los dos extensores de captura distintos tienen unas primeras secuencias de nucleótido distintas, complementarias de segmentos del analito distintos pero próximos, y tienen también segundas secuencias de nucleótido distintas, complementarias de segmentos distintos de una única sonda de captura. ``CE1'' y ``CE2'' representan las dos moléculas de captura diferentes, posicionadas en una estructura cruciforme, de tal forma que cada molécula extensora se hibrida con segmentos de la diana próximos pero distintos, y con segmentos de una única sonda de captura próximos pero distintos.

Según se muestra en la Figura 9, la sonda de captura está estructurada de tal manera que contenga: (1) una primera secuencia de nucleótido C-1, la cual se une con una secuencia de nucleótido C-3 en el primer extensor de captura CE1; y (2) una secuencia de nucleótido distinta C-2, la cual se une con una secuencia de nucleótido C-4 en un segundo extensor de captura CE2. CE1 y CE2 se hibridan a continuación con segmentos distintos, que no se superponen, de la molécula del analito. Preferiblemente, las secuencias C-1, C-2, C-3 y C-4 son relativamente cortas, es decir, de menos de alrededor de 30 nucleótidos de longitud y, preferiblemente, en el rango de alrededor de 10 a 15 nucleótidos de longitud. C-1 y C-2 pueden ser directamente adyacentes, o estar separadas por una región espaciadora. Además, se prefiere que la unión de la sonda de captura con las moléculas extensoras de captura (es decir, C-1:C-3 y C-2:C-4) sea relativamente débil (T_{m} inferior a alrededor de 55º), mientras que la unión de las sondas de captura con la diana, por medio de moléculas extensoras de captura, sea mucho más fuerte (T_{m} superior a alrededor de 65º). Esto permite que la molécula diana se una al soporte sólido con una estabilidad mucho mayor -del orden de 100 a 1000 veces- que las moléculas extensoras de captura. Este método permite también la utilización de un número menor de sondas de captura, lo que a su vez reduce la probabilidad de hibridación no específica, como se muestra en las Figuras 3, 4 y 5. Se ven ejemplos de este ensayo en la sección experimental, en los Ejemplos 1 y 2.

Se apreciará por los expertos en la materia que la configuración de tipo cruciforme mostrada en la Figura 8 lo es sólo a efectos de dar un ejemplo, y que también son factibles configuraciones alternativas del ensayo que emplean dos o más moléculas extensoras de captura. El único requisito es que el ensayo esté estructurado de tal forma que la diana se una al soporte sólido a una temperatura de fusión mayor que la de los extensores de captura que se unen a la sonda de captura. También será apreciado por los expertos en la materia que la realización de la Figura 9 funciona igualmente bien en el caso de que C-1 y C-2 sean secuencias idénticas de sonda de captura, complementarias de secuencias idénticas C-3 y C-4 en los dos extensores de captura: en este caso, la sonda de captura contiene dos copias de la secuencia repetida C-1.

Una segunda realización de esta configuración del ensayo, en la que son utilizadas dos moléculas extensoras de captura distintas, se muestra en la Figura 10. En esta realización, dos o más (preferiblemente más de tres) extensores de captura distintos tienen primeras secuencias de nucleótido distintas, complementarias de segmentos del analito distintos pero próximos, y tienen también segundas secuencias de nucleótido, complementarias de un segmento de una sonda de captura. En esta realización sólo un extensor de captura se une por cada sonda de captura. Si todas las sondas de captura en el ensayo contienen una única secuencia que se une a los extensores de captura, entonces, los extensores de captura tendrán todos la misma segunda secuencia de nucleótido, complementaria del segmento de unión de la sonda de captura. De forma alternativa, el ensayo puede utilizar distintas sondas de captura que contengan secuencias múltiples que se unan a los extensores de captura, en cuyo caso los extensores de captura tendrán segundas secuencias de nucleótido distintas.

De esta forma, en la Figura 10, ``CE3'', ``CE4'' y ``CE5'' representan tres extensores de captura diferentes, de tal manera que cada extensor de captura contiene primeras secuencias de nucleótido distintas, que se hibridan con segmentos distintos de la diana. CE3 y CE4 contienen una segunda secuencia de nucleótido, C-6, la cual se une a una secuencia de nucleótido C-5 en una primera sonda de captura CP1; mientras que CE5 contiene una segunda secuencia de nucleótido diferente, C-8, la cual se une a una secuencia de nucleótido C-7 en la segunda sonda de captura CP2. Se verá fácilmente que en este ensayo puede ser utilizada cualquier combinación de dos o más de tales extensores de captura.

Otra variante de esta técnica comprende la utilización de dos o más moléculas extensoras marcadoras distintas, cada una de las cuales debe unirse con la diana, con el fin de que se una la sonda amplificadora. Este ensayo es llevado a cabo, básicamente, conforme se describe más arriba respecto a la Figura 1; sin embargo, según se indica, son incorporadas al ensayo al menos dos moléculas extensoras marcadoras distintas. Los extensores marcadores comprenden una primera secuencia de nucleótido, complementaria de un segmento del analito, y una segunda secuencia de nucleótido, complementaria de un multímetro de amplificación (o preamplificador, conforme se trata más abajo).

Esta configuración del ensayo, en la que se utilizan dos extensores marcadores distintos, se muestra en la Figura 11. En esta realización los dos extensores marcadores distintos tienen primeras secuencias de nucleótido distintas, complementarias de segmentos del analito distintos pero próximos, y tienen también segundas secuencias de nucleótido distintas, complementarias de segmentos distintos de un único multímetro de amplificación. ``LE1'' y ``LE2'' representan los dos extensores marcadores distintos, posicionados en una estructura cruciforme, de tal manera que cada molécula extensora se hibrida con segmentos de la diana próximos pero distintos, y con segmentos de un único multímetro de amplificación próximos pero distintos. Se ven ejemplos de este ensayo en la sección experimental, en el Ejemplo 2.

Según se muestra en la Figura 11, el multímetro de amplificación se encuentra estructurado de tal forma que contenga: (1) una primera secuencia de nucleótido C-1, la cual se une a una secuencia de nucleótido C-3 en el primer extensor marcador LE1; y (2) una secuencia de nucleótido distinta C-2, la cual se une a una secuencia de nucleótido C-4 en un segundo extensor marcador LE2. LE1 y LE2 se hibridan entonces con segmentos distintos, que no se superponen, de la molécula del analito. Preferiblemente, las secuencias C-1, C-2, C-3 y C-4 son relativamente cortas, es decir, de menos de alrededor de 30 nucleótidos de longitud y, preferiblemente, en el rango de alrededor de 10 a 15 nucleótidos de longitud. C-1 y C-2 pueden ser directamente adyacentes, o estar separadas por una región espaciadora. Además, se prefiere que la unión del multímetro de amplificación con las moléculas extensoras marcadoras (es decir, C-1:C-3 y C- 2:C-4) sea relativamente débil (T_{m} inferior a alrededor de 45º), mientras que la unión del multímetro de amplificación con la diana por medio de moléculas extensoras marcadoras sea mucho más fuerte (T_{m} superior a alrededor de 65º). Esto permite que la molécula diana se una al multímetro de amplificación con una estabilidad mucho mayor -del orden de 100 a 1000 veces- que las moléculas extensoras marcadoras. De nuevo, al igual que con el método precedente, en el que son utilizadas, al menos, dos moléculas extensoras de captura, la especificidad del ensayo se ve incrementada en virtud de las fases adicionales de hibridación, las cuales son necesarias para dar lugar a una señal dependiente de la diana.

Será apreciado por los expertos en la materia que las configuraciones de tipo cruciforme mostradas en la Figura 11 lo son sólo a efectos de dar un ejemplo, y que también son factibles configuraciones alternativas del ensayo que emplean dos o más moléculas extensoras marcadoras. El único requisito es que el ensayo esté estructurado de tal forma que la diana se una al multímetro de amplificación a una temperatura de fusión mayor que la de los extensores marcadores que se unen al multímetro de amplificación. También será apreciado por los expertos en la materia que esta realización funciona igualmente bien en el caso de que C-1 y C-2 sean secuencias idénticas del multímetro de amplificación, complementarias de secuencias idénticas C-3 y C-4 en los dos extensores marcadores: en este caso, el multímetro de amplificación contiene dos copias de la secuencia repetida C-1. Será apreciado además, que la descripción precedente podría ser utilizada con un preamplificador (según se trata más abajo), en donde los extensores marcadores interaccionan en estructura cruciforme con el preamplificador, en lugar de directamente con el multímetro de amplificación.

En otra realización de la invención el fenómeno de la generación de la señal independiente de la diana es tratado por medio del enlace de moléculas amplificadoras adyacentes, de tal forma que se reduzcan virtualmente todas las fuentes principales de ruido de fondo en el ensayo, incluyendo: la hibridación no específica de las moléculas extensoras marcadoras con las sondas de captura y con las moléculas extensoras de captura, la hibridación no específica de multímetros de amplificación con sondas de captura y con moléculas extensoras de captura, y la unión no específica de amplificadores. En esta realización son utilizados dos multímetros de amplificación distintos, designados como AMP1 y AMP2 en la Figura 12, así como dos moléculas extensoras marcadoras distintas, designadas como LE1 y LE2. Ni AMP1 ni AMP2 mantendrán el marcador a menos que estén a una distancia de enlace entre sí, de tal modo que existe una probabilidad mucho mayor de que los amplificadores se unan realmente a la molécula diana antes de que el marcaje tenga lugar. Esto se consigue al proporcionar sondas marcadoras que contengan: (1) una primera secuencia de ácido nucleico L-1, que contenga una secuencia de ácido nucleico complementaria de una región en las subunidades repetidas de oligonucleótido de AMP1; (2) una segunda secuencia de ácido nucleico L-2, que contenga una secuencia de ácido nucleico complementaria de una región en las subunidades repetidas de oligonucleótido de AMP2; y (3) un marcador detectable entre ambas. L-1, L-2 y las secuencias complementarias correspondientes en las sondas amplificadoras son seleccionadas de tal forma, que la temperatura de fusión del complejo formado por las sondas amplificadoras y por las sondas marcadoras es preferiblemente, al menos, alrededor de 10ºC superior que la temperatura de fusión del complejo formado por la sonda marcadora y un único multímetro amplificador. También se apreciará que tal configuración da lugar a las ventajas tratadas más arriba, con respecto a la utilización de sondas múltiples y las consecuentes fases de hibridación adicionales necesarias para dar lugar a una señal detectable.

En una variante de esta realización pueden ser utilizadas dos o más sondas marcadoras distintas, bien conteniendo dos tipos diferentes de marcadores -conforme se muestra en la Figura 13-, o conteniendo un segmento inactivo de un marcador, que es entonces activado al ser conjugado con una sonda marcadora en una molécula amplificadora adyacente. Ejemplos de esta realización de sonda multi-amplificadora / multi-marcadora incluyen aquéllos en donde las sondas marcadoras adyacentes contienen: (a) subunidades individuales, segmentos o porciones de una enzima, como la \beta-galactosidasa; (b) una enzima y una correspondiente coenzima (como una flavoenzima y la FADH, o una deshidrogenasa ligada a NAD y la NADH); o (c) enzimas que forman parte de un sistema de canalización o sistema de cascada, en donde el producto de una enzima es el sustrato para la segunda enzima (como el sistema de sintetasa de ácido graso). En cada caso, las dos sondas marcadoras contienen restos distintos, los cuales no producen el producto detectable, a menos que se acerquen por causa de la presencia de la diana y, de esta forma, por enlace del amplificador.

En una variante de todas las realizaciones anteriores, las moléculas preamplificadoras pueden ser utilizadas en todas las realizaciones precedentes, con el fin de incrementar la señal. Los preamplificadores son añadidos a la reacción del ensayo bien al mismo tiempo o con anterioridad a la adición de los multímetros de amplificación.

Según nos hemos referido con anterioridad, una causa principal del ruido de fondo -es decir, señales que son producidas y detectadas con independencia de la molécula diana- resulta de las sondas de captura unidas al soporte, y del hecho de que polinucleótidos, que no son moléculas extensoras de captura, puedan unirse al mismo. Realizaciones adicionales de la invención provienen de ser conscientes de esta situación. En primer lugar, soportes sólidos utilizados en ensayos de hibridación -como los descritos más arriba- son configurados de tal modo que las sondas de captura sean más cortas, usualmente inferiores a alrededor de 20 nt y, más usualmente, alrededor de 15 nt. En segundo lugar, son introducidos en el ensayo oligonucleótidos conteniendo secuencias que son idénticas a C-2 -conforme se muestra en la Figura 1-; tales oligonucleótidos funcionan como competidores en relación con las sondas de captura y, de este modo, reducen el número de lugares disponibles de hibridación en la sonda de captura (C-3 en la Figura 1). Esto se muestra en el Ejemplo 1.

\newpage

Experimental

La práctica de la presente invención utilizará, a menos que sea indicado de otro modo, técnicas convencionales de química orgánica sintética, bioquímica, biología molecular y similares, que se encuentran dentro de los rudimentos de esta ciencia. Tales técnicas son explicadas en su totalidad en la literatura existente. Ver, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds., 1984); y una serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

Debe entenderse que, mientras que la invención ha sido descrita junto con las realizaciones preferidas específicas de la misma, la descripción anterior, así como los ejemplos que siguen a continuación, tienen la intención de mostrar, y no por ello limitar, el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para aquéllos expertos en la ciencia a la que la invención se circunscribe.

En los ejemplos siguientes se ha hecho un esfuerzo para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben ser tenidos en cuenta algún error experimental y alguna desviación. A menos que se indique lo contrario, la temperatura viene dada en grados C y la presión es la presión atmosférica o cercana a ella.

Ejemplo 1 Ensayo de amplificación utilizando distintos extensores de captura en un formato ``Cruciforme''

Este ejemplo describe un ensayo de hibridación utilizando dos o más extensores de captura distintos, según se muestra en la Figura 8. El propósito de este trabajo experimental fue el reducir las señales de fondo causadas por la unión de la sonda extensora de captura al soporte sólido. Al reducir la habilidad de las sondas extensoras de captura de unirse al soporte, el polinucleótido diana se ve forzado a unirse por medio de sondas extensoras de captura múltiples, con el fin de estar unido de forma estable a la superficie sólida, dando lugar a un ruido de fondo en el ensayo tan bajo como el que se encuentra en un ensayo llevado a cabo sin sondas extensoras de captura (es decir, porque, esencialmente, ninguna molécula extensora de captura estaría unida al soporte). El trabajo experimental resumido en este ejemplo demuestra también que, cuando son añadidas moléculas capaces de unirse competitivamente a la sonda de captura inmovilizada, es posible reducir aún más el ruido de fondo, ya que se ve reducida de forma significativa la probabilidad de que las moléculas extensoras marcadoras o las sondas marcadoras se unan al soporte por medio de la sonda de captura inmovilizada.

Fue unida una sonda de captura, designada como CP2, a la superficie sólida. Fueron designados dos pares de moléculas extensoras de captura HCV. El primer segmento de cada par tenía una secuencia 5' complementaria de las últimas 16 nts de la sonda de captura CP2, y el segundo segmento de cada par tenía una secuencia 3' complementaria de las primeras 13 nts de CP2. De esta forma, los extensores pudieron unirse al soporte sólido conforme se muestra en la Figura 8. Pueden enlazar moléculas CP2 vecinas (como la diana en la Figura 10, la cual ha sido capturada por medio de CEs 3, 4 y 5 con dos moléculas CP diferentes), o pueden formar una figura cruciforme con una única CP2 (como la diana en la Figura 9, la cual se ha unido por medio de CEs 1 y 2 a la misma molécula CP). Ya que las sondas se encuentran diseñadas óptimamente con el fin de formar la figura cruciforme, y ya que la concentración de sonda de captura es mantenida baja, la forma cruciforme debería verse muy favorecida cinéticamente en el enlace de dos moléculas CP2 vecinas, y se supone que la forma cruciforme es la predominante en la distribución del equilibrio.

Fue utilizado en este ejemplo un formato de ensayo de hibridación tipo sándwich de ácido nucleico en fase de solución para amplificación de señal. La amplificación de señal es generada por medio de un multímetro de ADN ramificado (amplificador), el cual posee un primer segmento (E') que se hibrida con un segmento de las sondas extensoras marcadoras, y hasta quince iteraciones de un segmento (F), en donde el segmento F se hibrida con tres oligonucleótidos marcados. El ácido nucleico diana es unido al soporte sólido por medio de una sonda de captura inmovilizada y una sonda extensora de captura que se hibrida con ambos, con la sonda de captura y con la diana. El multímetro amplificador es unido a la diana inmovilizada por medio de una sonda extensora marcadora, la cual se hibrida con ambas, con la diana y con el multímetro amplificador. Fueron también utilizadas dos sondas competidoras para la reducción del ruido de fondo. Estas sondas se unen a la sonda de captura.

Las sondas extensoras de captura, las sondas extensoras marcadoras y las sondas competidoras, conforme son utilizadas en este ensayo, fueron las siguientes.

Secuencia (5' - - -> 3') Sondas extensoras de captura (el segmento que se une a la sonda de captura inmovilizada se encuentra subrayado):

1:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 1)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTC.

\newpage

2:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 2)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCTCWTTCCGGCGATTCCGGTGTACTCACCGGTTC.

3:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 3)

GTATTGAGCGGGTTKMTCCAAGAAAGGACCCGGTCGGCTCTGGGAC.

4:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 4)

GCATAGAGTGGGTTWATCCAAGAAAGGACCCAGTCGGCTCTGGGAC.

5:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 5)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGCAGTCTTGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAG.

6:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 6)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGTGATCTTGCGGGGGCGTGCCCAAATCTCCAG.

7:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 7)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAG.

8:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 8)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGCAGTCTTGCGGGGGCACGCCCAAATGGCTGG.

9:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 9)

TTTCAGCAATCAGGTGTTCAGTGATCTCGCGGGGGCACGCCCAAATTTCTGG.

10:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 10)

ACAAGGCCTTTCGCGACCCAACACTACTCGGCTTCGGCTCTGGGAC.

11:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 11)

ACAAGGCCKTTCGCAACCCAACGCTACTMGGCTTCGGCTCTGGGAC.

Sondas extensoras marcadoras utilizadas (la secuencia que se hibrida con el multímetro amplificador se encuentra subrayada):

12:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 12)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTC.

13:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 13)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTATGGCTAGGCGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGT.

14:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 14)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTKCCTGGAGGCTGTACGASACTSGTACTAGCGCC.

15:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 15)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGG.

16:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 16)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACC.

17:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 17)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTGTGCTCATGKTGCACGGTCTACGAGACCTCCC.

\newpage

Sondas competidoras (estas secuencias se hibridan con la sonda de captura inmovilizada):

18:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 18)

TCGGCTCTGGGAC.

19:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 19)

CAGCAATCAGGTGTTC.

Las placas utilizadas para el ensayo fueron recubiertas como sigue: fueron compradas tiras removawell de Blanco Microlito 1 (placas de microtítulo de poliestireno, 96 pocillos/placa) de Dynatech Inc..

Cada pocillo fue rellenado con 250 \mul de 1N HCl e incubado a temperatura ambiente de 15 a 20 minutos. A continuación, las placas fueron lavadas 1 vez con 1 x PBS y los pocillos aspirados para eliminar el líquido. Los pocillos fueron rellenados después con 250 \mul de 1N NaOH e incubados a temperatura ambiente de 15 a 20 minutos. Las placas fueron lavadas de nuevo 3 veces con 1 x PBS y los pocillos aspirados para retirar el líquido.

Fue comprado Poli(phe-lys) de Sigma Chemicals, Inc.. Este polipéptido tiene una proporción molar de 1:1 de phe:lys y un promedio m.w. de 47.900 gm/mol. Tiene una longitud media de 309 aminoácidos y contiene 155 aminas/molécula. El polipéptido fue mezclado con 2M de NaCl/1 x PBS para una concentración final de 0,1 mg/mL (pH 6,0). Fueron añadidas 200 \mul de esta solución a cada pocillo. La placa fue envuelta en plástico para prevenir su secado e incubada a 30ºC durante toda la noche. La placa fue lavada después 3 veces con 1 x PBS y los pocillos aspirados para retirar el líquido.

A las 250 OD_{260} unidades/ml del siguiente oligonucleótido (Sonda de Captura CP2): 5'-XGTCCCAGAGCCGAGAACACCTGATTGCTG-3' (SEC. ID Nº: 20) (X es la cadena larga amina del nucleótido modificado (N^{4} - (6-aminocaproilo-2-aminoetilo) derivado de 5-metilcitidina)) en 50 mM de fosfato sódico pH 7,8, fueron añadidos 180 mg de suberato de bis(sulfosuccinimidil) (BS^{3}). Esta mezcla fue removida e incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. Fue utilizada una columna de filtración en gel (Pharmacia Sephadex G-25, NAP-25) equilibrada con 10 mM de fosfato sódico, pH 6,5, para purificar el oligonucleótido activado. La mezcla de reacción del oligonucleótido activado fue aplicada a la columna, permitiendo su filtrado. El eludido fue recogido y guardado para su utilización en la siguiente fase. La concentración del eludido fue ajustada a 3,7 x 10^{-2} OD_{260} unidades/ml, utilizando para la dilución 50 mM de fosfato sódico pH 7,8.

Fueron añadidas a cada pocillo 100 \mul del oligonucleótido activado conteniendo el eluente, y los pocillos fueron incubados a 4ºC de 12 a 18 horas. La placa fue lavada después 2 veces con 1 x PBS y los pocillos aspirados para retirar el líquido.

Fueron añadidas a cada pocillo 250 \mul de O,2 N NaOH conteniendo 0,1 wt.% de SDS. La placa fue envuelta en plástico e incubada a 65ºC durante 60 minutos. A continuación, la placa fue lavada 3 veces con 1 x PBS y los pocillos aspirados para retirar el líquido.

Fueron añadidas a cada pocillo 100 \mul de 50 mM de fosfato sódico pH 7,8 con 0,4 mg/ml de BS^{3}, permitiendo su incubación con la placa de 12 a 18 horas. Seguidamente, la placa fue lavada 2 veces con 1 x PBS y 1 vez con agua. Las placas fueron almacenadas en contenedores de plástico con desecante a 4ºC. El multímetro amplificador fue preparado como sigue:

Todas las síntesis químicas de oligonucleótidos fueron llevadas a cabo en un sintetizador automático de ADN (Applied Biosystems, Inc., (ABI) modelo 380 B). Fue utilizada química fosforamidita del tipo \beta-cianoetilo, incluyendo 5'-fosforilación, que empleó reactivo PHOSTEL™ (DMT-O-CH_{2}CH_{2}-(SO_{2})-CH_{2}CH_{2}-O-P (N (iPr)_{2}) (-O-CH_{2}CH_{2}CN), en donde DMT es dimetoxitritil e iPr es isopropil). Fueron utilizados protocolos ABI estándar, excepto cuando se indica. Donde se indica que fue utilizado un múltiplo de un ciclo (por ejemplo, ciclo 1,2) fue utilizado el múltiplo de la cantidad estándar de amidita recomendado por ABI en el ciclo especificado.

Primeramente fue preparado un cuerpo tipo peine con la estructura siguiente:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{

3'-TCCGTATCCTGGGCACAGT _{18} (TT\+ \hskip-2,5mm X') _{14}   -  5'\cr
 \+ \hskip-2mm |\cr 
 \hskip5,4cm (
\+ \hskip-2,5mm GTCAGTp  -  5') _{15} \cr}

en donde X' es un monómero de ramificación y p es un fosfato.

La porción del cuerpo tipo peine a lo largo de las 14 repeticiones (TTX') fue sintetizado por primera vez utilizando 33,8 mg de recipiente poroso controlado por timidina derivada de aminopropilo (CPG) (2000 \ring{A}, 7,4 micromoles de timidina por gramo soporte), con un protocolo de 1,2 ciclos. El nucleótido de la zona de ramificación tenía la fórmula:

10

La concentración de monómeros de \beta-ciano-etilfosforamidita para la síntesis del cuerpo tipo peine (sin incluir las extensiones de cadenas laterales) fue de 0,1 M para A, C, G y T, y de 0,15 M para el monómero de zona de ramificación X'. La destritilación fue realizada con un 3% de ácido tricloroacético en cloruro de metileno, utilizando paso de flujo escalonado mientras duró la desprotección.

Fue sintetizada una extensión de cadena lateral de seis bases con la fórmula 3'-GTCAGTp en cada zona de ramificación del monómero, como sigue. Fueron sintetizadas dos extensiones de cadena lateral en la zona de ramificación X' terminal. Para retirar el grupo levulínico fue introducida una solución de 0,5 M de hidrato de hidracina en ácido acético piridina/glacial (1:1 v/v), y mantenida en contacto con el soporte CPG durante 90 minutos con renovación del líquido cada 15 minutos, seguido de un lavado extensivo con ácido acético pirimidina/glacial (1:1 v/v) y, después, con acetonitrilo. Después de la desprotección, fueron añadidas las extensiones de cadena lateral de seis bases utilizando un ciclo 6,4.

En estas síntesis la concentración de fosforamiditas fue de 0,1 M (excepto 0,2 M de reactivo de fosforilación Phostel™).

La destritilación fue llevada a cabo con una solución del 3% de ácido tricloroacético en cloruro de metileno, utilizando paso de flujo continuo, seguido de una solución de aclarado de tolueno/clorometano (1:1 v/v). Las cadenas de polinucleótido ramificadas fueron retiradas de los soportes sólidos de forma automática en el sintetizador de ADN. La solución de hidróxido de amonio fue recogida en viales de Wheaton con tapón de rosca de 4 ml, y calentada a 60ºC durante 12 horas para retirar todos los grupos protectores de bases. Después de su enfriamiento a temperatura ambiente, el solvente fue retirado en una evaporadora Speed-Vac y el residuo disuelto en 100 \mul de agua. Fueron también producidas, utilizando el sintetizador automático, las cadenas laterales y una plantilla/ligador de ligadura con las siguientes estructuras:

Cadena lateral:

3'-GATGCG (TTCATGCTGTTGGTGTAG)_{3}-5' (p) (SEC. ID Nº: 21).

Plantilla de ligadura para la unión de la extensión de cadena lateral:

3'-CGCATCACTGAC-5' (p) (SEC. ID Nº: 22).

El cuerpo tipo peine en bruto fue purificado por medio de un método estándar de gel de poliacrilamida (7% con 7 M de urea y 1X de tampón corriente TBE).

Las cadenas laterales fueron ligadas al cuerpo tipo peine como sigue. El cuerpo tipo peine (4 pmol/\mul), las cadenas laterales (93,75 pmol/\mul), y la plantilla de ligadura de la cadena lateral (75 pmol/\mul), fueron combinados en 1 mM de ATP/ 5 mM de DTT/ 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0/ 10 mM de MgCl_{2}/ 2mM de espermidina. La mezcla fue calentada en un baño de agua a 95ºC y, después, fue enfriada lentamente hasta por debajo de 35ºC en un periodo de 1 hora. Las concentraciones de los componentes de la mezcla fueron ajustadas a 2 mM de ATP, 10 mM de DTT, 14% de glicol polietileno, siendo añadidas a continuación 0,2 unidades/\mul de la ligasa de ADN T4. La mezcla fue incubada de 16 a 24 horas a 23ºC. El ADN fue precipitado en NaCl/etanol y resuspendido en agua. Los productos ligadores fueron purificados seguidamente por medio de electrofóresis en gel de poliacrilamida.

El ensayo de hibridación fue realizado como sigue:

Fue preparado como diana un transcripto de nucleótido 615 sintético utilizando un vector pGEM (Promega) conteniendo los nucleótidos 54-668 del clon HCV J1 y polimerasa SP6 ARN. El objetivo no era el control negativo.

La preparación de la muestra consistió en distribuir en cada pocillo 200 \mul de 2 mg/ml de proteinasa K en 0,07 M de Tris-HCl, pH 8,0 / 0,7 M de LiCl / 0,06 M de fosfato sódico / 0,06 M de EDTA, pH 7,0 / 0,7% de SDS / 50 fmol de sondas extensoras de captura (cada una) / 200 fmol de sondas extensoras marcadoras (cada una) / 5000 fmol de sondas competidoras (cada una). Diferentes experimentos de control contuvieron varias combinaciones de las sondas, según se indica en la tabla de resultados más abajo. Las placas fueron agitadas para mezclar los contenidos en el pocillo, cubiertas e incubadas durante 16 horas a 63ºC.

Después de otro periodo de 10 minutos a temperatura ambiente, los contenidos de cada pocillo fueron aspirados para eliminar todo el fluido, y los pocillos fueron lavados 2 veces con tampón de lavado (0,1% de SDS / 0,015 M de NaCl / 0,0015 M de citrato sódico). El multímetro amplificador fue añadido a continuación a cada pocillo (50 \mul de 0,7 fmol/\mul de solución en 0,48 M de NaCl / 0,048 M de citrato sódico / 0,1% de SDS / 0,5% de ``reactivo bloqueador'' tratado con pirocarbonato de dietilo (una fracción purificada de leche en polvo seca, Boehringer Mannheim, catálogo nº 1096 176). Después de cubrir las placas y agitarlas para el mezclado de los contenidos en los pocillos, las placas fueron incubadas durante 30 minutos a 45ºC.

Después de un periodo adicional de un minuto a temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados según se describe más arriba.

Fue añadida a continuación a cada pocillo la sonda marcadora fosfatasa alcalina, revelada en EP 883096976
(50 \mul/pocillo de 2,66 fmol/\mul). Después de su incubación a 45ºC durante 15 minutos, y 1 minuto a temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados tres veces, como más arriba y, después, tres veces con 0,015 M de NaCl / 0,0015 M de citrato sódico.

Fue utilizado dioxetano producido por una enzima (Schaap et al., Tet. Lett. 28: 1159-1162 (1987) y EPA Pub. nº 0254051), obtenido de Lumigen, Inc.. Fueron añadidas 50 \mul de Lumiphos 530 (Lumigen) a cada pocillo. Los pocillos fueron pinchados ligeramente de tal forma que el reactivo cayera al fondo y removidos lentamente con el fin de distribuir el reactivo de forma uniforme por el fondo. Los pocillos fueron cubiertos e incubados a 37ºC de 20 a 40 minutos.

Las placas fueron después leídas en un luminómetro Dynatech ML 1000. El rendimiento fue dado como la integral completa de la luz producida durante el periodo de medición de 250 ms.

TABLA 1

Línea	Extensor de captura	Competidor	Diana	Unidades luz relativas (Std Dev)
1	No	No	No	0,47 (0,08)
2	Si	No	No	0,47 (0,10)
3	Si	Si	No	0,34 (0,01)
4	Si	No	Si	38,0 (2,2)
5	Si	Si	Si	40,2 (7,1)

Con los extensores no cruciformes, usualmente el control ``sin extensor de captura'' tiene alrededor de 2 veces menor ruido de fondo que la muestra de control que contiene los extensores de captura. Esto es debido a que las moléculas (LEs, AMP, y marcador) se unen a las CEs. Sin embargo, una comparación de la línea 1 con la línea 2 muestra que el ruido de fondo con extensores de captura cruciformes es el mismo que el ruido de fondo sin los extensores de captura cruciformes. Una comparación de las líneas 1, 2 y 3 muestra que, con el competidor, es posible la reducción de los ruidos de fondo por debajo del nivel del control sin extensor de captura. Presumiblemente esto es debido al bloqueo de las uniones de los extensores marcadores con las sondas de captura. Una comparación entre las líneas 4 y 5 muestra que los competidores no anulan la unión a la diana. La unión a la diana no se ve afectada por los competidores, debido a que a la diana se le unen más estrechamente por medio de CEs múltiples, lo cual es mucho más fuerte que la unión de sondas extensoras individuales o competidores individuales.

Ejemplo 2 Ensayo de amplificación utilizando múltiples extensores marcadores en un formato ``Cruciforme''

Este ejemplo describe un ensayo de hibridación utilizando dos extensores marcadores diferentes, según se muestra en la Figura 11. El objetivo de este trabajo experimental fue el de reducir las señales de fondo causadas por la unión de los extensores marcadores al soporte sólido o al extensor de captura o moléculas sonda de captura, es decir, el tipo de ruido de fondo que es generado cuando un extensor marcador se une al soporte de una manera que no es mediada por la diana. Una vez que el extensor marcador se encuentra unido, el preamplificador, el multímetro amplificador y las sondas marcadoras (en este experimento fueron utilizadas sondas marcadoras de fosfatasa alcalina) pueden unirse y generar una señal que no sea dependiente de la presencia de la diana. Por medio de la reducción de la habilidad de las sondas extensoras marcadoras de unirse al multímetro amplificador de forma individual, el preamplificador se ve forzado a unirse por medio de múltiples sondas extensoras marcadoras, con el fin de que esté unido de forma estable a la superficie. Un preamplificador no permanecería unido a un único extensor marcador durante las condiciones de hibridación del ensayo. Los extensores marcadores están diseñados de tal manera que los dos extensores marcadores necesarios para facilitar la unión del multímetro amplificador están situados próximos entre sí cuando se encuentran unidos a la secuencia diana. Un único extensor marcador hibridado no se unirá de forma eficiente al preamplificador bajo las condiciones de la reacción. De esta forma, la unión al preamplificador se ve únicamente favorecida en presencia de la diana.

Una sonda sintética de captura de oligonucleótido llamada PSCP (ver Secuencia nº 41) fue unida a las placas. Fue diseñado un equipo de sondas extensoras marcadoras HCV. Cada extensor marcador contiene una secuencia (T) complementaria de la diana, además de una o dos secuencias adicionales (escogidas de entre las secuencias A, B, C o D), que se unen a una sonda preamplificadora. Este preamplificador contiene secuencias (A' y B', o C' y D') que se unen a las LEs y 8 repetidos de una secuencia (E') que se une al multímetro amplificador.

Se utilizó en este ejemplo un formato de ensayo de hibridación tipo sándwich de ácido nucleico en fase de solución para amplificación de una señal. La amplificación de la señal es generada por medio de un multímetro ramificado de ADN (amplificador), el cual está diseñado para tener un primer segmento (E) que se hibrida con un segmento del preamplificador (E'), y hasta quince iteraciones de un segmento (F), en donde el segmento F se hibrida hasta con tres oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina. El ácido nucleico diana se encuentra unido al soporte sólido por medio de sondas de captura y de una pluralidad de extensores de captura que se hibridan con ambas, con las sondas de captura y con la diana. Las sondas extensoras de captura, las sondas extensoras marcadoras y las sondas preamplificadoras son utilizadas en este ensayo como sigue.

20:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 23)

TCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTCCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG.

21:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 24)

ATGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGTCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG.

22:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 25)

TCCTGGAGGCTGCACGACRCTCATACTAACGCCCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG.

23:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 26)

CGCAGACCACTATGGCTCTYCCGGGAGGGGGGGCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG.

24:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 27)

TCRTCCYGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCTCTTGGAAAGAAAGTGAAGTG.

Las sondas extensoras marcadoras utilizadas (la secuencia que se hibrida con la diana se encuentra subrayada, las secuencias, según están abreviadas más arriba, se encuentran encerradas en paréntesis):

25:

\hskip0,5cm

(A-T) (SEC ID Nº: 28)

CTGAGTTTCTGGCTCGCATTGAGCGGGTTDATCCAAGAAAGGACCCGG.

26:

\hskip0,5cm

(B-T-C) (SEC ID Nº: 29)

ACTGAGTCAGTCAGTCAGCAGTCTYGCGGGGGCACGCCCAARTCTCCAGGAAAGTTTGAATATG.

27:

\hskip0,5cm

(A-T-D) (SEC ID Nº: 30)

CTGAGTTTCTGGCTCACAAGGCCTTTCGCAACCCAACACTACTCGGCTACCTACCTACCTACCT.

28:

\hskip0,5cm

(B-T-C) (SEC ID Nº: 31)

AGTCAGTCAGTCAGTCGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCGAAAGTTTGAATATG.

29:

\hskip0,5cm

(A-T-D) (SEC ID Nº: 32)

CTGAGTTTCTGGCTCYGTGCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCTCCCACCTACCTACCTACCT.

30:

\hskip0,5cm

(B-T-C) (SEC ID Nº: 33)

AGTCAGTCAGTCAGTCGTTACGTTTGKTTYTTYTTTGRGGTTTRGGAWTGAAAGTTTGAATATG.

31:

\hskip0,5cm

(T-D) (SEC ID Nº: 34)

CGGGAACTTRACGTCCTGTGGGCGRCGGTTGGTACCTACCTACCTACCT.

Las sondas extensoras marcadoras utilizadas para el experimento de control fueron (la secuencia que se hibrida con la diana se encuentra subrayada):

: HCV.33.13 (SEC ID Nº: 35)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCARGTAAACTCCACCRACGATCTGRCCRCCRCC.

:HCV.33.14 (SEC ID Nº: 36)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTRCGCACACCCAAYCTRGGGCCCCTGCGCGGCAA.

:HCV.33.15 (SEC ID Nº: 37)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTAGGTTGCGACCGCTCGGAAGTCTTYCTRGTCGC.

:HCV.33.16A (SEC ID Nº: 38)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTRCGHRCCTTGGGGATAGGCTGACGTCWACCTCG.

:HCV.33.16B (SEC ID Nº: 39)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTRCGHRCCTTGGGGATAGGTTGTCGCCWTCCACG.

:HCV.33.17 (SEC ID Nº: 40)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTYCCRGGCTGRGCCCAGRYCCTRCCCTCGGRYYG.

:HCV.33.18 (SEC ID Nº: 41)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTBSHRCCCTCRTTRCCRTAGAGGGGCCADGGRTA.

:HCV.33.19 (SEC ID Nº: 42)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGCCRCGGGGWGACAGGAGCCATCCYGCCCACCC.

:HCV.33.20 (SEC ID Nº: 43)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCCGGGGGTCYGTGGGGCCCCAYCTAGGCCGRGA.

:HCV.33.21 (SEC ID Nº: 44)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTATCGATGACCTTACCCAARTTRCGCGACCTRCG.

:HCV.33.22 (SEC ID Nº: 45)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCCCCATGAGRTCGGCGAAGCCGCAYGTRAGGGT.

\newpage

32:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 46)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGCATTGAGCGGGTTDATCCAAGAAAGGACCCGG.

33:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 47)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTAGCAGTCTYGCGGGGGCACGCCCAARTCTCCAG.

34:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 48)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTACAAGGCCTTTCGCAACCCAACACTACTCGGCT.

35:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 49)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGGGGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACC.

36:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 50)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTYGTGCTCATGRTGCACGGTCTACGAGACCTCCC.

37:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 51)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTGTTACGTTTGKTTYTTYTTTGRGGTTTRGGAWT.

38:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 52)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTCGGGAACTTRACGTCCTGTGGGCGRCGGTTGGT.

Las sondas preamplificadoras utilizadas (la secuencia E' se encuentra subrayada, los puntos de comienzo y final para A', B', C' y D' son indicados con letras minúsculas, las secuencias restantes son para espaciado):

39:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 53)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCCGTGG
ATGTTTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTG
TCGCGTAGTGACTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTb'-CATATTC
AAACTTTC-b'a'-GAGCCAGAAACTCAGT-a'.

40:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 54)

AGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCCGTGG
ATGTTTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTG
TCGCGTAGTGACTGAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTAGGCATAGGACCCGTGTCTTTTTTd'-AGGTAGG
TAGGTAGGT-d'c'-GACTGACTGACTGACT-c'.

Las placas utilizadas para el ensayo fueron recubiertas conforme se describe más arriba, excepto cuando en lugar de la secuencia de ADN CP2, se une a la placa la secuencia PSCP.

PSCP:

41:

\hskip0,5cm

(SEC ID Nº: 55)

5'- XCA CTT CAC TTT CTT TCC AAG AG-3'

El multímetro amplificador fue preparado conforme se describe más arriba. El ensayo de hibridación fue llevado a cabo como sigue:

Fue preparada una curva estándar de HCV por medio de la dilución de un título alto de una muestra de virus de la hepatitis C en suero humano HCV negativo, y añadiendo 50 \mul de alícuotas de diluciones -correspondientes a un rango de entre 1.500 y 19.500 equivalentes virales- a pocillos de platos de microtítulos preparados conforme se describe más arriba.

La preparación de la muestra consistió en añadir 150 \mul de Tampón P-K (3,3 mg/ml de proteinasa K en 58 mM de Tris-HCl, pH 8,0 / 0,6 M de NaCl / 0,06 M de citrato sódico / 12 mM de EDTA, pH 8,0 / 1,3% de SDS / 16 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado / 7% de formamida / 100 fmol de sondas extensoras de captura / 400 fmol de sondas extensoras marcadoras) a cada pocillo. El experimento de control utilizó 50 fmol/pocillo de sondas extensoras de captura, 160 fmol/pocillo de sondas extensoras marcadoras en el mismo tampón. Las placas fueron agitadas para mezclar los contenidos en el pocillo, cubiertas e incubadas durante 16 horas a 63ºC. El experimento de control fue dejado a 63ºC durante la fase de ``preamplificación''.

Después de un período adicional de 10 minutos a temperatura ambiente, los contenidos de cada pocillo fueron aspirados para retirar todo el líquido, y los pocillos lavados dos veces con tampón de lavado (0,1% de SDS / 0,015 M de NaCl / 0,0015 M de citrato sódico). A continuación fueron añadidas las sondas preamplificadoras (100 fmol en 50 \mul 0,75 M de NaCl / 0,075 M de citrato sódico / 0,1% de SDS / 0,5% de reactivo bloqueador -como más arriba, Boehringer Mannheim, catálogo nº 1096 176-) a cada pocillo (excepto al de control). Las placas fueron agitadas, cubiertas e incubadas a 53ºC durante 30 minutos.

Seguidamente, las placas fueron enfriadas y lavadas conforme se describe más arriba. El multímetro amplificador fue añadido entonces a cada pocillo (85 fmol en el mismo tampón utilizado para las sondas preamplificadoras). El experimento de control utilizó 30 fmol/pocillo de multímetro amplificador en el mismo tampón. Después de cubrir las placas y agitarlas para mezclar los contenidos en los pocillos, las placas fueron incubadas durante 30 minutos a 53ºC.

Después de un período adicional de 10 minutos, a temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados conforme se describe más arriba.

La sonda marcadora fosfatasa alcalina, revelada en EP 883096976, fue añadida a continuación a cada pocillo (125 fmol en 50 \mul 0,75 M de NaCl / 0,075 M de citrato sódico / 0,1% de SDS / 0,5% de reactivo bloqueador -como más arriba, Boehringer Mannheim, catálogo nº 1096 176-). Después de su incubación a 53ºC durante 15 minutos, y 10 minutos a temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados dos veces, conforme más arriba, y después tres veces con 0,015 M de NaCl / 0,0015 M de citrato sódico.

Fue utilizado como el substrato luminiscente un dioxetano producido por una enzima (Schaap et al., Tet. Lett. (1987) 28: 1159-1162 y EPA Pub. nº 0254051), obtenido de Lumigen, Inc.. Fueron añadidas 50 \mul de Lumiphos 530 (Lumigen) a cada pocillo. Los pocillos fueron cubiertos, agitados durante 30 segundos e incubados a 37ºC durante 25 minutos.

A continuación, las placas fueron leídas en un luminómetro Dynatech ML 1000. El rendimiento fue dado como la integral completa de la luz producida durante el periodo de lectura de 250 milisegundos.

Los resultados se muestran en la siguiente Tabla.

Concentración de la diana	Con preamplificadores	Sin preamplificadores
	(Unidades luz relativas)	(Unidades luz relativas)
1	3,87 (\pm0,26)	1,58 (\pm0,15)
2	1,64 (\pm0,15)	0,80 (\pm0,09)
3	1,08 (\pm0,16)	0,61 (\pm0,09)
0	0,63 (\pm0,05)	0,43 (\pm0,04)

El ensayo llevado a cabo con sondas preamplificadoras tuvo un mayor valor para la señal menos el ruido en cada una de las concentraciones del analito, comparado con el ensayo llevado a cabo sin las sondas preamplificadoras.

Ejemplo 3 Sondas de captura multidentadas

En este ejemplo, las mediciones de T_{m} fueron llevadas a cabo en micropocillos conteniendo la sonda de captura xt1* (ver PCT Publicación nº WO 92/02526 citada aquí con anterioridad, y EPA 883096976). Los extensores de captura y la sonda de captura xt1* fueron los siguientes:

extensores de captura HCV con cola xt1 (5' - -> 3'; los dominios funcionales de las sondas están separados por puntos):

:HCV.33.1.XT1: (SEC ID Nº: 56)

TCCTCACAGGGGAGTGATTCATGGTGGAGTGTC.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG.

\newpage

:HCV.33.2.XT1: (SEC ID Nº: 57)

ATGGCTAGACGCTTTCTGCGTGAAGACAGTAGT.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG.

:HCV.33.3.XT1: (SEC ID Nº: 58)

GCCTGGAGGCTGCACGRCACTCATACTAACGCC.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG.

:HCV.33.4.XT1: (SEC ID Nº: 59)

CGCAGACCACTATGGCTCTYCCGGGAGGGGGGG.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG.

:HCV.33.5.XT1: (SEC ID Nº: 60)

TCRTCCYGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTC.CTTCTTTGGAGAAAGTGGTG.

sonda de captura xt1*: (SEC ID Nº: 61)

CACCACTTTCTCCAAAGAAG.

Las sondas extensoras de captura y el ARN diana de HCV fueron marcados con P-32. Para la determinación de la T_{m} de la sonda de captura-extensor de captura, los extensores de captura marcados fueron equilibrados con pocillos con xt1* a diferentes temperaturas, o en presencia de distintos niveles de formamida desnaturalizante. Fue utilizado el equilibrado de dos horas o el de toda la noche. Para la determinación de la T_{m} de la sonda de captura-diana-extensores de captura, los extensores de captura fueron hibridados con la diana marcada con P-32. A continuación, el complejo diana-extensores de captura fue equilibrado con los pocillos con sonda de captura, dos horas o durante toda la noche, a distintas temperaturas. Las muestras fueron sacadas de los micropocillos a temperatura ambiente y fue determinado el porcentaje de unión. Fueron determinadas la T_{m} o la C_{m} como los puntos medios de las curvas con porcentaje de unión contra la temperatura o el porcentaje de formamida. Para convertir C_{m} (formamida) en T_{m} (no formamida), fue utilizado el hecho de que cada porcentaje de formamida baja la T_{m} en 0,7 grados.

Las curvas de fusión de la sonda de captura xt1*-diana marcada-extensores de captura y de la sonda de captura xt1*-extensores de captura marcados, con un equilibrado de 2 horas, se muestran en la Figura 14. Las temperaturas de fusión en un 20% de formamida y 0,6 M de LiCl son: 50 grados para xt1*-extensores de captura y 60 grados para xt1*-diana-extensores de captura. Estos números corresponden a valores de T_{m} de 64 y 74 grados en ausencia de formamida. La Figura 14 muestra que el 36% de la diana y sólo el 2% de los extensores de captura se encuentran unidos a 55 grados en un 20% de formamida. Esto es una diferencia de 18 veces, basada en la captura de la diana por medio de múltiples extensores de captura.

Una persona experta en esta ciencia podrá apreciar que la diferencia en T_{m} entre el complejo sonda de captura-extensor de captura-diana y el complejo sonda de captura-extensor de captura puede verse incrementada más allá de 10 grados. Al reducir la T_{m'} de la sonda de captura-extensor de captura, se magnificará el efecto de la unión multidentada.

Ejemplo 4 Ensayo de hibridación utilizando dos amplificadores

De los ejemplos anteriores se deduce que las sondas pueden ser diseñadas de tal forma que se requieran múltiples iteraciones (dos o más) con el fin de conseguir un complejo estable bajo las condiciones del ensayo. La intención es que el término iteraciones múltiples no sea limitador en ningún sentido. Han sido mostrados dos tipos de iteraciones múltiples: sondas múltiples formando una unión cruciforme (4 ramificaciones), y extensores de captura múltiples uniéndose de forma simultanea con múltiples sondas de captura en un soporte sólido, lo que da como resultado que la T_{m} en el soporte sólido-diana sea de 10 a 20 grados mayor que la T_{m} de un híbrido único de sonda de captura-extensor de captura.

Los mismos conceptos se hacen extensibles a los amplificadores múltiples. Se muestra un diseño de sonda viable en la Figura 15. En este ejemplo dos amplificadores de ADN ramificados se encuentran unidos a dos extensores marcadores. El Amp1 está unido al extensor marcador LE1 por medio de una secuencia híbrida estable X. El Amp2 está unido al extensor marcador LE2 por medio de una secuencia híbrida estable Y. LE1 y LE2 no tienen porque ser contiguos, pero ambos tienen que estar unidos a regiones de la misma molécula diana que no se superpongan. El Amp1 contiene secuencias de ramificación B y F, y el Amp2 contiene las secuencias de ramificación D y G. En este ejemplo, una sonda marcada por una enzima contiene las secuencias Bc y Dc, mientras que una sonda activadora contiene las secuencias Fc y Gc. En la Figura 15 los extensores marcadores forman híbridos estables con la diana y con sus amplificadores respectivos. Todos los híbridos restantes mostrados (relativos a B, D, F, G) están diseñados para que sean demasiado débiles para formar híbridos estables a la temperatura de la hibridación. Los híbridos débiles están diseñados para tener temperaturas de fusión de alrededor de 10 a 20 grados por debajo de la temperatura de hibridación del ensayo. También es aceptable un diseño con temperaturas de fusión de 5 grados por debajo de la temperatura del ensayo. La diferencia preferida es de 10-20 grados, ya que esto puede incrementar la unión específica a la diana de 100 a 1000 veces.

De esta forma, por ejemplo, cuando una sonda marcada por una enzima se une a la secuencia B, ésta se disocia rápidamente, a menos que la secuencia D se encuentre también cerca. Una vez que una sonda se une a ambos -al AMP1 y al AMP2-, la configuración se vuelve más fija en el espacio, favoreciendo cinéticamente el siguiente suceso de unión. La sonda activadora se une con independencia de la sonda marcada, pero de una forma similar. La unión de la sonda activadora se ve cinéticamente -aunque no termodinámicamente- favorecida por la unión de la sonda marcada al AMP1 y al AMP2, y viceversa.

La sonda(s) activadora puede tener muchas formas. Pueden (1) activar a las enzimas directamente o (2) activar las enzimas indirectamente al suprimir la inhibición, o (3) pueden activar la detección del producto de la reacción enzimática. Como un ejemplo del método (3) la enzima, en la sonda marcada por la enzima, podría ser la fosfatasa alcalina, y los activadores podrían ser un polímero fluorado similar en su composición y estructura al descrito por Schaap et al., en Clinical Chemistry 35: 1863-1864 (1989). En presencia de este polímero, el rendimiento lumínico del dioxetano desfosforilado se vio incrementado 400 veces. Lo ideal es que los activadores luminiscentes intercalen las sondas marcadas por la enzima, de tal forma que el dioxetano liberado por la enzima tenga una mayor probabilidad de transferir energía a la fluoresceína o a otros intensificadores luminiscentes para la emisión eficaz de luz dependiente de la diana. Las condiciones escogidas para la fase de detección favorecerían un periodo de vida muy corto del dioxetano, reduciendo la eficiencia de detección del dioxetano en ausencia de una diana marcada por el intensificador. Al retirar los polímeros de fluoresceína -u otros intensificadores luminiscentes- de la masa de mezcla del substrato de dioxetano fosforilado, se hará que la señal sea mucho más dependiente de la diana. Incluso una fosfatasa alcalina unida no específicamente al soporte sólido, que parte un dioxetano fosforilado, probablemente no será detectada, a menos que sobreviva lo suficiente para difundirse hasta la diana. Por medio de este método incluso el ruido de fondo se convierte en un tipo de señal (es decir, se precisará la presencia de la diana para ver la mayor parte del ruido).

Las sondas activadoras podrían ser también activadores enzimáticos o restos que anulen la inhibición enzimática. La enzima podría tener dos o más subunidades. Lo ideal sería que estuviera construida de tal forma que la afinidad natural de las subunidades se viera reducida o eliminada. En lugar de los aminoácidos responsables de la asociación natural, habría secuencias muy cortas de oligonucleótidos (secuencia H en una subunidad y la secuencia complementaria Hc en la otra subunidad) que no pueden formar un híbrido estable por sí mismas, pero que serían capaces de asociar las dos subunidades inactivas y, de esta manera, formar un complejo activo si las subunidades fueran mantenidas cercanas una a la otra por medio de una molécula diana, uniendo ambas subunidades a diferentes ramas de dos amplificadores diferentes, como en la Figura 15.

Un ejemplo de activación por medio de la supresión de la inhibición enzimática sería el siguiente. El oligonucleótido marcado sería unido de forma covalente a ambas, a la fosfatasa alcalina y a la teofilina, o a otro inhibidor enzimático no competitivo. La sonda activadora contendría un anticuerpo anti-teofilina con una Ka mucho mayor que la teofilina de 1/Ki para la fosfatasa alcalina. La oligosonda conteniendo el anticuerpo de anti-teofilina sería añadida en presencia de suficiente desnaturalizante reversible, de tal forma que el activador no se uniera al inhibidor de la enzima. Ejemplos de tales desnaturalizantes reversibles incluyen la formamida y la urea, los cuales son tolerados muy bien por la fosfatasa alcalina. Las fases de lavado eliminarían el desnaturalizante junto con el exceso de sondas activadoras y marcadas. En cuyo momento, el anticuerpo anti-teofilina unido a la diana, en virtud de su proximidad, se uniría a la teofilina porque Ka>>1/Ki y, de esta forma, elimina la inhibición de la fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina unida al soporte sólido permanecería inhibida por la teofilina ligada a la sonda marcada, porque el anticuerpo anti-teofilina unido no específicamente no se encuentra lo suficientemente cerca para eliminar la inhibición.

Puede ser también construido un sistema en tres partes, en el que los amplificadores de ADN ramificados, con al menos tres secuencias cortas -de tal forma que sean acercadas dos subunidades enzimáticas (cuya afinidad natural entre sí haya sido reducida o eliminada)-, a su vez, se encuentren rodeados por activadores luminiscentes. Además, pueden ser utilizados un amplificador de ADN ramificado que lleve una subunidad de una enzima y otro amplificador de ADN ramificado (unido a otro extensor marcador) que lleve la otra subunidad, o un activador. Además, es igualmente posible el utilizar amplificadores lineales conteniendo muchas secuencias consecutivas diferentes para servir de soporte a las moléculas puente. Tales amplificadores lineales pueden ser fácilmente preparados por medio de ligado, conforme es expuesto con anterioridad.

Ejemplo 5 Un ensayo de hibridación combinando los conceptos

El propósito de la presente invención es reducir el ruido de fondo en los ensayos de hibridación. Por medio de la reducción drástica de la unión de los extensores de captura al soporte sólido, se reduce el ruido de fondo causado por moléculas que se unen a los extensores de captura. Al unir un amplificador por medio de dos extensores marcados, se reduce el ruido de fondo, porque un extensor marcador que se une bien al soporte sólido o a cualquier molécula unida al soporte sólido (incluidos la sonda de captura y los extensores de captura) no se encuentra marcado de forma efectiva. De forma similar, un amplificador que se une al soporte en ausencia de la diana, no está marcado de forma efectiva si éste forma un híbrido con la sonda marcada que tenga una T_{m} de 10-20 grados por debajo de la temperatura del ensayo. De igual forma, una sonda marcada que se une al soporte sólido, o a cualquier molécula unida al soporte sólido, es detectada de forma ineficaz si esa sonda marcada no es activada por sus cofactores u otras subunidades. Los activadores de luminiscencia pueden incrementar el rendimiento lumínico más de cien veces (Schaap et al., supra). Si el activador es retirado de la solución del sustrato y, en lugar de ello, es unido a la diana, hay una oportunidad significativa de reducción del ruido en el ensayo de hibridación.

El presente ejemplo describe cómo utilizar estos conceptos en un único ensayo. La utilización de cualquiera de los conceptos da como resultado una disminución detectable en el ruido de fondo. La utilización de todos ellos puede, en principio, hacer que el ruido de fondo sea indetectable, permitiendo la utilización de señales de amplificación más fuertes con el fin de incrementar la sensibilidad. Se muestra en la Figura 16 un diseño de sonda viable que combina estos conceptos. Los extensores de captura y los extensores marcadores pueden ser diseñados para hibridarse simultáneamente con la diana en forma cruciforme. La T_{m} de la región de unión a la diana de los extensores está diseñada para que sea superior a alrededor de 10 grados más estable que la de los híbridos con las secuencias V y W, y X e Y. La T_{m} del complejo diana-sonda de captura está diseñada para que sea alrededor de 10 grados más estable que la del complejo sonda de captura-extensor de captura. Durante la hibridación puede ser incluido un gran exceso molar de las secuencias "V" y "W", con el fin de reducir aún más la unión del extensor de captura al soporte sólido (especialmente en el caso de que sea introducida una fase de enfriamiento después de la hibridación). Conforme es mostrado con anterioridad, las secuencias "V" y "W" no tienen efecto en la unión a la diana.

Después de que la captura es completada, se realiza un ciclo opcional de lavado con el fin de eliminar las sondas sobrantes. A continuación, conforme se muestra en la Figura 16, son añadidas sondas marcadas por una enzima que contienen secuencias cortas Bc y Dc, y una sonda activadora opcional conteniendo secuencias Fc y Gc, y la hibridación es llevada a cabo a una temperatura aproximadamente 20 grados mayor que las T_{m}s de los híbridos con secuencias B, D, F, G. Por ejemplo, las T_{m}s de las secuencias B, D, F, y G podrían estar diseñadas para ser de 35 grados, mientras que la temperatura de hibridación podría ser de 50 grados, y las T_{m}s de los complejos formados por AMP1 y AMP2 podrían ser de 55 a 60 grados. De forma alternativa, la hibridación podría ser realizada a aproximadamente 37 grados en presencia de suficiente desnaturalizante de proteína, para (1) reducir o prevenir de forma eficiente la asociación del activador con la enzima y, (2) reducir o prevenir de forma eficiente la unión de la sonda marcada y/o del activador a sólo un amplificador (es decir, incrementar la temperatura de hibridación efectiva a, aproximadamente, 50 grados).

Preferiblemente, la ingeniería proteínica sería utilizada para minimizar interacciones entre la enzima y el activador(s) enzimático. Finalmente, el soporte sólido es lavado y se realiza la detección. El substrato preferido sería un dioxetano fosforilado. No estaría presente en esta mezcla del substrato ningún intensificador, ya que lo ideal es que los intensificadores se encuentren unidos a la diana. Es decir, o el activador de la Figura 16 es en sí mismo un activador luminiscente, o son incluidos activadores luminiscentes en la hibridación con los activadores de la enzima y las sondas de oligonucleótido marcadas por la enzima.

Claims

1. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo: (a) la unión del analito indirectamente a un soporte sólido; (b) el marcaje del analito; (c) la detección de la presencia del marcador asociado al analito; y (d) correlación de la presencia del marcador en el soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra

en donde son incorporadas al ensayo una primera molécula extensora de captura y una segunda molécula extensora de captura distinta, debiendo ambas hibridarse con el analito, con el fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable, comprendiendo cada una de dichas primera y segunda moléculas extensoras de captura un polinucleótido que contiene un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en una sonda de captura unida a un soporte sólido,

en donde el segmento de unión al analito de la primera molécula extensora de captura es distinto del segmento de unión al analito de la segunda molécula extensora de captura y, además, en donde la sonda de captura contiene una primera secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la primera molécula extensora de captura, y una segunda secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la segunda molécula extensora de captura, de tal forma que dos moléculas extensoras de captura distintas puedan unirse a una única sonda de captura, y,

en donde la temperatura de fusión T_{m1}, a la que el analito de ácido nucleico se disocia de la sonda de captura en el complejo híbrido formado por la sonda de captura, las moléculas extensoras de captura y el analito de ácido nucleico es, al menos, alrededor de 5ºC superior a la temperatura de fusión T_{m2} de los complejos híbridos formados por la sonda de captura y las moléculas extensoras de captura.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en donde al menos una de las fases es llevada a cabo bajo condiciones restrictivas, las cuales favorecen la formación del complejo T_{m1}, pero dificultan la formación del complejo T_{m2}.

3. El ensayo de la reivindicación 2, en donde la restricción es controlada por medio del control de, al menos, un parámetro de fase, seleccionado del grupo consistente en: la concentración de formamida, la concentración de sal caotrópica, la concentración de sal, el pH (concentración del ión de hidrógeno), el contenido de solvente orgánico, y la temperatura.

4. El ensayo de la reivindicación 3, en donde, al menos, una fase es llevada a cabo a una temperatura mayor que T_{m2} y menor que T_{m1}.

5. El ensayo de la reivindicación 2, en donde, al menos, una fase comprende la fase (a).

6. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tengan un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, moléculas extensoras marcadoras que tengan un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con un sistema de sonda marcadora, un sistema de sonda marcadora comprendiendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con L-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura -debiendo hibridarse, al menos dos de ellas, con el analito, con el fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable-, con las moléculas extensoras marcadoras y con las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, para formar un complejo híbrido unido al soporte;

(e) a continuación, separación de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido;

(g) correlación de la presencia del marcador en el complejo híbrido unido al soporte con la presencia de ácido nucleico en la muestra,

en donde la temperatura de fusión T_{m1}, a la que el analito de ácido nucleico se disocia de la sonda de captura en el complejo híbrido formado por la sonda de captura, las moléculas extensoras de captura y el analito de ácido nucleico es, al menos, alrededor de 5ºC mayor que la temperatura de fusión T_{m2} de los complejos híbridos formados por la sonda de captura y las moléculas extensoras de captura.

7. El ensayo de la reivindicación 6, en donde el sistema de sonda marcadora comprende (i) un multímetro de amplificación conteniendo la secuencia de ácido nucleico M-1 y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas que contienen secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y (ii) sondas marcadoras que contienen una secuencia de ácido nucleico L-3, la cual es capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, da lugar a una señal detectable, y en donde la fase (d) del ensayo comprende las siguientes fases:

(d_{1}) puesta en contacto del complejo híbrido unido al soporte bajo condiciones de hibridación con el multímetro de amplificación, con el fin de producir un segundo complejo híbrido unido al soporte;

(d_{2}) a continuación, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido; y

(d_{3}) seguidamente, puesta en contacto del segundo complejo híbrido unido al soporte con las sondas marcadoras bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un complejo híbrido marcado unido al soporte.

8. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tengan un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, moléculas extensoras marcadoras que tengan un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico P-1 en una sonda preamplificadora, una sonda preamplificadora que tenga la secuencia de ácido nucleico P-1 y que sea capaz de unirse con una pluralidad de multímetros de amplificación por medio de secuencias de ácido nucleico P-2, multímetros de amplificación que contengan una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con P-2, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas que contengan secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y sondas marcadoras que contengan una secuencia L-3, la cual sea capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura -debiendo hibridarse, al menos dos de ellas, con el analito, con el fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable-, con las moléculas extensoras marcadoras y con las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, para formar un primer complejo híbrido unido al soporte;

(d) puesta en contacto del primer complejo híbrido unido al soporte bajo condiciones de hibridación con la sonda preamplificadora y con el multímetro de amplificación, con el fin de producir un segundo complejo híbrido unido al soporte;

(e) a continuación, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido;

(f) puesta en contacto del segundo complejo híbrido unido al soporte con las sondas marcadoras bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un tercer complejo híbrido marcado unido al soporte;

(g) a continuación, separación de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido;

(h) detección de la presencia del marcador en el tercer complejo híbrido unido al soporte; y

(i) correlación de la presencia del marcador en el tercer complejo híbrido unido al soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

9. El ensayo de las reivindicaciones 6, 7 u 8, en donde, al menos una de las fases, es llevada a cabo bajo condiciones restrictivas que favorezcan la formación del complejo T_{m1}, pero que dificulten la formación del complejo T_{m2}.

10. El ensayo de la reivindicación 9, en donde la restricción es controlada por medio del control de, al menos, un parámetro de fase, seleccionado del grupo consistente en: la concentración de formamida, la concentración de sal caotrópica, la concentración de sal, el pH (concentración del ión de hidrógeno), el contenido de solvente orgánico, y la temperatura.

11. El ensayo de la reivindicación 10, en donde, al menos, una de las fases es llevada a cabo a una temperatura mayor que T_{m2} y menor que T_{m1}.

12. El ensayo de la reivindicación 9, en donde, al menos, una fase comprende la fase (b).

13. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, una primera molécula extensora de captura que comprenda un polinucleótido conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, una segunda molécula extensora de captura distinta que comprenda un polinucleótido conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, moléculas extensoras marcadoras que tengan un primer segmento
L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, un multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con L-2, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, y sondas marcadoras conteniendo una secuencia L-3, la cual es capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar un primer complejo híbrido unido al soporte;

(f) puesta en contacto del segundo complejo híbrido unido al soporte con las sondas marcadoras, bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un tercer complejo híbrido marcado unido al soporte;

(g) a continuación, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido;

en donde las moléculas extensoras de captura están configuradas de tal forma que el segundo complejo híbrido unido al soporte de la fase (b) únicamente se formará cuando ambas moléculas extensoras de captura -primera y segunda- se hayan unido al analito, y

14. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, una primera molécula extensora de captura que comprenda un polinucleótido conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, una segunda molécula extensora de captura distinta que comprenda un polinucleótido conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, moléculas extensoras marcadoras que tengan un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico P-1 en una sonda preamplificadora, una sonda preamplificadora que tenga la secuencia de ácido nucleico P-1 y que sea capaz de unirse a una pluralidad de multímetros de amplificación por medio de secuencias de ácido nucleico P-2, multímetros de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con P-2, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y sondas marcadoras conteniendo una secuencia L-3, la cual es capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

en donde las moléculas extensoras de captura están configuradas de tal forma que el primer complejo híbrido unido al soporte de la fase (b) únicamente se formará cuando ambas moléculas extensoras de captura -primera y segunda- se hayan unido al analito, y

15. El ensayo de la reivindicación 13, en donde la sonda de captura contiene una primera secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la primera molécula extensora de captura, y una segunda secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la segunda molécula extensora de captura, de tal forma que dos moléculas extensoras de captura puedan unirse a una única sonda de captura.

16. El ensayo de la reivindicación 14, en donde la sonda de captura contiene una primera secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la primera molécula extensora de captura, y una segunda secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con el segmento de unión al soporte de la segunda molécula extensora de captura, de tal forma que dos moléculas extensoras de captura puedan unirse a una única sonda de captura.

17. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que comprendan polinucleótidos conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, una primera molécula extensora marcadora que tenga un primer segmento, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento, capaz de hibridarse con un sistema de sonda marcadora, una segunda molécula extensora marcadora distinta que tenga un primer segmento, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento, capaz de hibridarse con un sistema de sonda marcadora, un sistema de sonda marcadora comprendiendo secuencias de ácido nucleico, capaces de hibridarse con los segundos segmentos de la primera molécula extensora marcadora y la segunda molécula extensora marcadora y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, las moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar un complejo híbrido unido al soporte;

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(e) a continuación, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido; y

(g) correlación de la presencia del marcador en el tercer complejo híbrido marcado unido al soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

18. El ensayo de la reivindicación 17, en donde el sistema de sonda marcadora comprende (i) un multímetro de amplificación conteniendo las secuencias de ácido nucleico capaces de hibridarse con los segundos segmentos de la primera molécula extensora marcadora y la segunda molécula extensora marcadora, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y (ii) sondas marcadoras conteniendo una secuencia de ácido nucleico L-3, que es capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, da lugar a una señal detectable, y en donde la fase (d) del ensayo comprende las siguientes fases:

19. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que comprendan polinucleótidos conteniendo un segmento de unión al analito, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en el analito, y un segmento de unión al soporte, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico presente en las sondas de captura, una primera molécula extensora marcadora que tenga un primer segmento, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento, capaz de hibridarse con una sonda preamplificadora, una segunda molécula extensora marcadora distinta que tenga un primer segmento, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento, capaz de hibridarse con una sonda preamplificadora, teniendo las sondas preamplificadoras un primer segmento, capaz de hibridarse con una molécula extensora marcadora, y un segundo segmento, capaz de unirse a una pluralidad de multímetros de amplificación, multímetros de amplificación que contengan una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con las moléculas extensoras marcadoras y que contenga una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, y sondas marcadoras conteniendo una secuencia que sea capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, las moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar un primer complejo híbrido unido al soporte;

(i) correlación de la presencia del marcador en el tercer complejo unido al soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde las moléculas extensoras marcadoras están configuradas de tal forma que el segundo complejo híbrido unido al soporte de la fase (d) únicamente se formará cuando ambas moléculas extensoras marcadoras -primera y segunda- se hayan unido al analito, y

20. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tengan un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, una primera molécula extensora marcadora que tenga un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con un primer multímetro de amplificación, una segunda molécula extensora marcadora que tenga un primer segmento L-1a, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2a, capaz de hibridarse con un segundo multímetro de amplificación, un primer multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con L-2, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, un segundo multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1a, capaz de hibridarse con L-2a, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2a, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y sondas marcadoras capaces de hibridarse con los multímetros de amplificación y que, directa o indirectamente, den lugar a una señal detectable;

(d) puesta en contacto del primer complejo híbrido unido al soporte bajo condiciones de hibridación con los multímetros de amplificación, con el fin de producir un segundo complejo híbrido unido al soporte;

en donde las sondas marcadoras contienen un primer segmento de ácido nucleico, que es capaz de hibridarse con el primer multímetro de amplificación, y un segundo segmento de ácido nucleico, que es capaz de hibridarse con el segundo multímetro de amplificación, de tal forma que el tercer complejo híbrido unido al soporte no se formará a menos que los multímetros de amplificación primero y segundo estén unidos por medio de las sondas marcadoras, y

21. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tengan un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, una primera molécula extensora marcadora que tenga un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con un primer multímetro de amplificación, una segunda molécula extensora marcadora que tenga un primer segmento L-1a, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2a, capaz de hibridarse con un segundo multímetro de amplificación, un primer multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con L-2, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con un primer segmento de sonda marcadora, un segundo multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1a, capaz de hibridarse con L-2a, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2a, capaces de hibridarse con un segundo segmento de sonda marcadora, y segmentos primero y segundo de sonda marcadora, capaces de hibridarse con multímetros de amplificación y que, cuando se hayan presentes en multímetros de amplificación próximos, den lugar a una señal detectable;

(g) a continuación, separación opcional de los materiales que no se encuentren unidos al soporte sólido; y

(h) detección de la presencia de una señal detectable resultante de la interacción entre los segmentos primero y segundo de la sonda marcadora en el tercer complejo híbrido unido al soporte, en donde la presencia del marcador en el soporte indica la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde el primer segmento de sonda marcadora es capaz de unirse con el primer multímetro de amplificación, y el segundo segmento de sonda marcadora es capaz de unirse con el segundo multímetro de amplificación, de tal forma que el tercer complejo híbrido unido al soporte no se forma a menos que los multímetros de amplificación -primero y segundo- estén unidos por medio de las sondas marcadoras, y

22. El ensayo de la reivindicación 21, en donde el primer segmento de sonda marcadora comprende un primer fragmento de enzima, y el segundo segmento de sonda marcadora comprende un segundo fragmento de enzima, y en donde los fragmentos primero y segundo de enzima son fragmentos complementarios de enzima, que se encuentran inactivos a menos que sean acercados por medio de la presencia de la diana.

23. El ensayo de la reivindicación 21, en donde el primer segmento de sonda marcadora comprende una enzima, y el segundo segmento de sonda marcadora comprende un cofactor de la enzima, y en donde la enzima y el cofactor se encuentran inactivos a menos que sean acercados por medio de la presencia de la diana.

24. El ensayo de la reivindicación 21, en donde el primer segmento de sonda marcadora comprende una enzima, y el segundo segmento de sonda marcadora comprende un activador luminiscente o fluorescente, en donde la enzima cataliza la formación de un producto, y el activador intensifica la detección del producto.

25. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo: (a) la unión del analito, por medio de moléculas extensoras de captura, directa o indirectamente, a una sonda de captura unida a un soporte sólido; (b) marcaje del analito; (c) detección de la presencia del marcador asociado con el analito en el soporte; y (d) correlación de la presencia del marcador en el soporte con la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde es incorporado al ensayo un oligonucleótido competidor conteniendo una secuencia de ácido nucleico, la cual es capaz de hibridarse con la sonda de captura unida al soporte sólido,

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en donde las moléculas extensoras de captura están configuradas de tal forma que el marcador asociado al analito de la fase (c) únicamente se formará cuando ambas moléculas extensoras de captura, una primera molécula extensora de captura y una segunda molécula extensora de captura distinta, se hayan unido al analito, y

26. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tengan un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, un oligonucleótido competidor conteniendo una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las sondas de captura, moléculas extensoras marcadoras que tengan un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con un sistema de sonda marcadora, un sistema de sonda marcadora comprendiendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con L-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, el oligonucleótido competidor, las moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar (i) un primer complejo híbrido de extensor de captura, analito de ácido nucleico y extensor marcador, y (ii) un segundo complejo híbrido unido al soporte, de sonda de captura y oligonucleótido competidor;

(d) seguidamente, puesta en contacto del primer complejo híbrido unido al soporte con el sistema de sonda marcadora bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un tercer complejo híbrido marcado unido al soporte; y

(f) detección de la presencia del marcador en el complejo híbrido marcado unido al soporte, en donde la presencia del marcador en el soporte indica la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde, en la fase (b), al menos dos moléculas extensoras de captura distintas y/o al menos dos moléculas extensoras marcadoras distintas deben hibridarse con el analito, con el fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable, y

27. El ensayo de la reivindicación 26, en donde el sistema de sonda marcadora comprende (i) un multímetro de amplificación conteniendo la secuencia de ácido nucleico M-1, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas que contienen secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y (ii) sondas marcadoras conteniendo una secuencia de ácido nucleico L-3, la cual es capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, da lugar a una señal detectable, y en donde la fase (d) del ensayo comprende las siguientes fases:

(d_{1}) puesta en contacto del primer complejo híbrido unido al soporte bajo condiciones de hibridación con el multímetro de amplificación, con el fin de producir un tercer complejo híbrido unido al soporte;

(d_{3}) seguidamente, puesta en contacto del segundo complejo híbrido unido al soporte con las sondas marcadoras bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un cuarto complejo híbrido marcado unido al soporte.

28. Un ensayo de hibridación tipo sándwich para la detección de la presencia de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) proporcionar un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo, moléculas extensoras de captura que tengan un primer segmento C-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento C-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en las sondas de captura, oligonucleótidos competidores conteniendo, al menos, una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con las sondas de captura, moléculas extensoras marcadoras que tengan un primer segmento L-1, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico en el analito, y un segundo segmento L-2, capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico P-1 en una sonda preamplificadora, una sonda preamplificadora que tenga la secuencia de ácido nucleico P-1, y sea capaz de unirse a una pluralidad de multímetros de amplificación por medio de una secuencia de ácido nucleico P-2, multímetros de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico M-1, capaz de hibridarse con P-2, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas conteniendo secuencias de ácido nucleico M-2, capaces de hibridarse con sondas marcadoras, y sondas marcadoras conteniendo una secuencia L-3, que es capaz de hibridarse con M-2 y que, directa o indirectamente, de lugar a una señal detectable;

(b) la incubación del analito de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación con las moléculas extensoras de captura, los oligonucleótidos competidores, las moléculas extensoras marcadoras y las sondas de captura en el soporte sólido, simultánea o secuencialmente en cualquier orden, con el fin de formar (i) un primer complejo híbrido unido al soporte de sonda de captura, extensor de captura, analito de ácido nucleico y extensor marcador, y (ii) un segundo complejo híbrido unido al soporte de sonda de captura y oligonucleótido competidor;

(d) puesta en contacto del primer complejo híbrido unido al soporte bajo condiciones de hibridación con la sonda preamplificadora y con los multímetros de amplificación, con el fin de producir un tercer complejo híbrido unido al soporte;

(f) puesta en contacto del tercer complejo híbrido unido al soporte con las sondas marcadoras bajo condiciones de hibridación, con el fin de producir un cuarto complejo híbrido marcado unido al soporte;

(h) detección de la presencia del marcador en el cuarto complejo híbrido unido al soporte, en donde la presencia del marcador en el soporte indica la presencia del analito de ácido nucleico en la muestra,

en donde, en la fase (b), al menos dos moléculas extensoras de captura distintas y/o, al menos, dos moléculas extensoras marcadoras distintas, deben hibridarse con el analito, con el fin de que el ensayo de como resultado una señal detectable, y

29. Un equipo para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo;

(b) una primera molécula extensora de captura, capaz de hibridarse con las sondas de captura y con segmentos predeterminados del analito de ácido nucleico;

(c) una segunda molécula extensora de captura distinta, capaz de hibridarse con las sondas de captura y con segmentos del analito de ácido nucleico distintos de aquéllos a los que se une la primera molécula extensora de captura;

(d) moléculas extensoras marcadoras capaces de hibridarse con segmentos del analito de ácido nucleico distintos de aquéllos a los que se unen las moléculas extensoras de captura primera y segunda;

(e) un sistema de sonda de marcadora conteniendo una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las moléculas extensoras marcadoras y que proporciona, directa o indirectamente, una señal detectable

en donde las sondas de captura comprenden una sonda que tiene una primera secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con la primera molécula extensora de captura, y una segunda secuencia de unión al extensor de captura, capaz de hibridarse con la segunda molécula extensora de captura, y

30. El equipo de la reivindicación 29, en donde el sistema de sonda marcadora comprende (f) un multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las moléculas extensoras marcadoras, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas; y (g) sondas marcadoras diseñadas para hibridarse con las subunidades de oligonucleótido idénticas, y que proporcionan, directa o indirectamente, una señal detectable.

31. Un equipo para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo;

(b) moléculas extensoras de captura, capaces de hibridarse con las sondas de captura y con segmentos predeterminados del analito de ácido nucleico;

(c) una primera molécula extensora marcadora, capaz de hibridarse con segmentos predeterminados del analito de ácido nucleico;

(d) una segunda molécula extensora marcadora, capaz de hibridarse con segmentos del analito de ácido nucleico distintos de aquéllos a los que se une la primera molécula extensora marcadora;

(e) una sonda preamplificadora opcional, capaz de unirse a las moléculas extensoras marcadoras y a una pluralidad de multímetros de amplificación;

(f) un multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las moléculas extensoras marcadoras o con la sonda preamplificadora, y una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas, y;

(g) sondas marcadoras diseñadas para hibridarse con las subunidades de oligonucleótido idénticas, y que proporcionan, directa o indirectamente, una señal detectable,

en donde las moléculas extensoras marcadoras están configuradas de tal forma que un complejo híbrido marcado unido al soporte sólo se formará cuando ambas moléculas extensoras marcadoras -primera y segunda- se hayan unidas al analito, y

32. Un equipo para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo;

(e) un primer multímetro de amplificación conteniendo (i) una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con una segunda molécula extensora marcadora, y (ii) una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas;

(f) un segundo multímetro de amplificación conteniendo (i) una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con la segunda molécula extensora marcadora, y (ii) una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas; y

(g) sondas marcadoras conteniendo una primera secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las subunidades de oligonucleótido del primer multímetro de amplificación, y una segunda secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las subunidades de oligonucleótido del segundo multímetro de amplificación, y que proporcionan, directa o indirectamente, una señal detectable,

33. Un equipo para la detección de un analito de ácido nucleico en una muestra, comprendiendo:

(a) un soporte sólido que tenga sondas de captura unidas al mismo;

(c) un oligonucleótido competidor, conteniendo una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse con las sondas de captura;

(d) moléculas extensoras marcadoras, capaces de hibridarse con segmentos del analito de ácido nucleico distintos de aquéllos a los que se unen las moléculas extensoras de captura;

(e) una sonda preamplificadora opcional, capaz de unirse con las moléculas extensoras marcadoras y con una pluralidad de multímetros de amplificación;

(f) un multímetro de amplificación conteniendo una secuencia de ácido nucleico, capaz de hibridarse con las moléculas extensoras marcadoras o con la sonda preamplificadora, y con una pluralidad de subunidades de oligonucleótido idénticas; y

(g) sondas marcadoras diseñadas para hibridarse con las subunidades de oligonucleótido idénticas que proporcionan, directa o indirectamente, una señal detectable,

en donde las moléculas extensoras de captura y/o las moléculas extensoras marcadoras están configuradas de tal forma que un complejo híbrido marcado unido al soporte sólo se formará cuando ambas moléculas extensoras de captura y/o moléculas extensoras marcadoras -primera y segunda- se hayan unido al analito, y