ES2619564T3 - Un método de inducción de diferenciación de células madre cultivadas - Google Patents

Abstract

Un método de inducción de diferenciación de una célula madre en una célula progenitora nerviosa, que comprende: el paso (1) de la formación de agregados homogéneos de células madre en un medio libre de suero; y el paso (2) de cultivo en suspensión de los agregados homogéneos de células madre en un medio libre de suero al que se le ha añadido una preparación de membrana basal en un recipiente de cultivo no adhesivo a células.

Description

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En forma alternativa, las células progenitoras nerviosas, en particular las células progenitoras retinianas, obtenidas por medio del método de la presente invención pueden caracterizarse por marcadores celulares. Los marcadores de una célula progenitora nerviosa incluyen, pero no se limitan a, Rx, NCAM, Soxl, Bf1, nestina, Emx1, Pax6, Nkx2.1, y Gsh2. Los marcadores de una célula progenitora progenitora retiniana, en particular, incluyen Rx, Pax6, Chx10 (con la provisión de la coexpresión con Ki67) y similares.

Los marcadores celulares nerviosos incluyen, pero no se limitan a, TuJ1, tirosina hidroxilasa (TH), serotonina, MAP2, MAP2ab, NeuN, GABA, glutamatos, ChAT, VGluT1, GluR1, CamKII, Reelina, Telencefalina, Ctip2, Tbr1, Tbr2, Brn2, L7 y similares. Las células progenitoras nerviosas obtenidas por medio del método de la presente invención son positivas para Rx en una alta frecuencia de por lo menos 60% o más, preferiblemente 80% o más, más preferiblemente aproximadamente 80 a 90%.

De acuerdo con la presente invención, también es posible inducir la diferenciación de células madre en células retinianas a través de células progenitoras retinianas. En particular, las células retinianas obtenidas por medio de inducción de diferenciación por la presente invención se obtienen como un constituyente de un agregado celular que tiene una estructura laminar tridimensional que es extremadamente similar a la retina viva. Por lo tanto, las células retinianas de la presente invención pueden asumir una estructura laminar tridimensional que sea morfológicamente extremadamente similar a la retina viva, de modo que las neuronas específicas para las respectivas capas retinianas (en la presente memoria, éstas se describen como “neuronas específicas de la capa retiniana” de manera conjunta) se incluyan en el alcance de la invención.

Las células retinianas obtenidas por medio de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, todas las células que constituyen la retina; las células que constituyen las capas individuales retinianas (neuronas específicas de la capa retiniana) incluyen, por ejemplo, células fotorreceptoras, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares retinianas y similares. De acuerdo con la presente invención, estas células se pueden obtener de manera eficaz por medio de la inducción de diferenciación de una célula madre. El tipo de las células retinianas obtenidas por medio de la presente invención se pueden identificar por medio de un método conocido per se, por ejemplo, mediante la expresión de un marcador celular.

Los marcadores celulares retinianos incluyen, pero no se limitan a, Rx (células progenitoras retinianas), PAX6 (células progenitoras), nestina (expresada en células progenitoras neuronales hipotalámicas, pero no en células progenitoras retinianas), Soxl (expresado en el epitelio nervioso hipotalámico, pero no en la retina), Crx (células progenitoras de células fotorreceptoras) y similares. En particular, los marcadores de las neuronas específicas de la capa retiniana descritas con anterioridad incluyen, pero no se limitan a, Chx10 (células bipolares), L7 (células bipolares), Tuj1 (células ganglionares), Brn3 (células ganglionares), calretinina (células amacrinas), calbindina (células horizontales), rodopsina (células fotorreceptoras), recoverina (células fotorreceptoras), RPE65 (células epiteliales pigmentarias), Mitf (células epiteliales pigmentarias) y similares.

(3) Método de inducción de diferenciación de la presente invención

La presente invención proporciona un método de inducción de diferenciación de una célula madre en células progenitoras nerviosas, que comprenden el paso de la formación de agregados homogéneos de células madre en un medio libre de suero y el paso del cultivo en suspensión de los agregados homogéneos de células madre en un medio libre de suero al que se le ha añadido una preparación de membrana basal en un recipiente de cultivo no adhesivo a células.

(3-1) El paso de la formación de agregados homogéneos de células madre en un medio libre de suero [paso (1)]

“Formación de agregados homogéneos de células madre” se refiere a la formación de manera cualitativa de agregados homogéneos de células madre al permitir “un número dado de células madre dispersas para agregar con rapidez” al permitir que las células madre se ensamblen y formen agregados de células madre y el cultivo de los agregados (cultivo de agregado), haciendo referencia en particular a la promoción de la epitelización de las células derivadas de células madre al permitir que “las células se agreguen con rapidez”. Por lo tanto, de acuerdo con lo utilizado en la presente memoria, el término “permitir que las células se agreguen con rapidez” se refiere a la formación con alta reproducibilidad una estructura similar al epitelio en las células producidas por permitir que las células madre se agreguen en forma homogénea.

Se puede emplear cualquier método para formar agregados homogéneos de células madre, en la medida que se formen agregados homogéneos de células madre al permitir que “las células se agreguen con rapidez”, y una estructura similar al epitelio de las células producidas a partir de las células madre se forme con una alta reproducibilidad. Tales métodos incluyen, por ejemplo, un método en donde las células se encierran en pequeños espacios mediante el uso de una placa con pocillos pequeños (una placa de 96 pocillos), microporos o similar, un método en donde las células se agregan por medio de centrifugación durante un tiempo corto mediante el uso de pequeños tubos centrífugos, y similares.

Se puede utilizar cualquier incubador para formar agregados, en la medida que permita que los agregados homogéneos de células madre se formen al permitir que “las células se agreguen con rapidez”; los expertos en la técnica son capaces de determinar la elección de acuerdo con sea apropiado. Tales incubadores incluyen, por

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preferiblemente aproximadamente 37ºC. La concentración de CO2 es, por ejemplo, aproximadamente 1 a 10%, preferiblemente aproximadamente 5%. Mientras tanto, cuando las células progenitoras retinianas se van a inducir por diferenciación, y teniendo en cuenta la alta demanda de oxígeno por ende, la concentración de O2 es, por ejemplo, 20 a 70%, preferiblemente 20 a 50%, más preferiblemente 20 a 40%. El tiempo de cultivo en este paso no está particularmente limitado, y es normalmente 48 horas o más, preferiblemente días o más.

Después del cultivo en suspensión, los agregados se pueden mantener tal cual o se tratan con dispersión (p. ej., un tratamiento con tripsina/EDTA), y las células se pueden cultivar de manera adicional bajo condiciones adhesivas (de aquí en adelante, descritas como “cultivo de adhesión” si se requiere). Si se lleva a cabo un cultivo de adhesión, es preferible que se utilice un incubador adhesivo a células, por ejemplo, un incubador recubierto con una matriz extracelular y similares (p. ej., poli D-lisina, laminina, entactina, fibronectina). Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO2, la concentración de O2 y el tiempo de cultivo en el cultivo de adhesión se pueden determinar con facilidad por los expertos en la técnica.

En el cultivo en suspensión y el cultivo de adhesión, se puede utilizar en combinación un inductor de diferenciación conocido. Por ejemplo, cuando las células progenitoras nerviosas se van a inducir por diferenciación a partir de una célula madre embrionaria, se puede utilizar en combinación un inductor de diferenciación conocido en células progenitoras nerviosas. Los ejemplos de tales inductores de diferenciación incluyen NGF [Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 552(1994)], ácido retinoico [Dev. Biol., 168, 342(1995); J. Neurosci., 16, 1056(1996)], un factor inhibidor de BMP [Nature, 376, 333-336(1995)], IGF [Genes & Development, 15, 3023-8(2003)], inhibidor de Nodal, inhibidor de Wnt [Nature Neurosci. 8, 288-296(2005)], Activina (Proc Natl.Acad.Sci. Estados Unidos, 9 de agosto de 2005; 102(32) 11331-6), y similares. En la presente invención, cuando se utilizan laminina y entactina como preparación de membrana basal, se utilizan deseablemente Nodal y Activina como inductores de diferenciación conocidos.

La cantidad del inductor de diferenciación a utilizar en combinación no está particularmente limitada y aquéllos con experiencia ordinaria en la técnica pueden preparar una cantidad adecuada que induzca una diferenciación deseada. Cuando se utilizan Nodal y Activina para la inducción de diferenciación de células progenitoras retinianas, En general se añade Nodal a una solución de cultivo a una concentración de 50 ng/ml-4000 ng/ml, preferiblemente 200 ng/ml-2000 ng/ml, y en general se añade Activina a una solución de cultivo a una concentración de 20 ng/ml2000 ng/ml, preferiblemente 50 ng/ml-500 ng/ml. La solución de cultivo deseablemente se intercambia a diario. Por medio de la adición de un inductor de diferenciación además de las preparaciones de membrana basal mencionadas con anterioridad cuando se lleva a cabo un cultivo flotante de agregados, el método de inducción de diferenciación que se va a describir a continuación se puede llevar a cabo de manera más eficaz.

El momento de la adición de un inductor de diferenciación no está particularmente limitado, y se pueden añadir desde la etapa inicial de inducción de diferenciación o en un punto de tiempo adecuado. Cuando se utilizan Nodal y Activina para el objeto mencionado con anterioridad, pueden añadirse un día después del comienzo del cultivo y añadirse de manera continua durante 7 a 10 días de allí en adelante.

De acuerdo con el método y combinación del cultivo en suspensión descrito con anterioridad del cultivo en suspensión y el cultivo de adhesión, se pueden obtener células progenitoras nerviosas de una célula madre al fijar la duración del cultivo y similares de acuerdo con sea apropiado. En particular en el paso (2), cuando los agregados homogéneos de células madre se cultivan en suspensión en presencia de una preparación de membrana basal durante varios días a varias decenas de días (p. ej., a 12 días para las células ES de ratón, 20 a 40 días para las células ES humanas), la autoformación de una pluralidad de estructuras ópticas de protrusión con forma de copa como se muestra en la Fig. 3 (de aquí en adelante, esta estructura se describe como “tejido con forma de copa óptica”) se observa en el agregado de células madre [de aquí en adelante, del paso (2), en particular el paso de permitir que un tejido con forma de copa óptica se autoforme en el agregado se describe como “paso (2’)”].

La identidad de las células progenitoras retinianas obtenida por medio del método o combinación del cultivo en suspensión descrito con anterioridad del cultivo en suspensión y el cultivo de adhesión se puede confirmar por la presencia o ausencia de la expresión de un gen marcador y similar o la forma y similares de las células o tejido como índice, que se pueden combinar de acuerdo con se requiera. La elección del gen marcador para las células progenitoras retinianas y cómo analizar su expresión son como se describió en (2) con anterioridad.

El tejido con forma de copa óptica obtenido de este modo no sólo simplemente de manera morfológica tiene una protrusión con forma de copa óptica en el agregado, sino que también exhibe un alto nivel de expresión del marcador Rx de la célula progenitora retiniana de las células que constituyen el tejido. También se observa en la parte externa de la protrusión una capa de células epiteliales pigmentarias retinianas que expresan Pax6. Esta estructura de tejido con forma de copa óptica es extremadamente similar a la estructura del tejido de copa óptica en la génesis de un organismo vivo. Por lo tanto, de acuerdo con el método de la presente invención, es posible producir no sólo células progenitoras nerviosas (preferiblemente células progenitoras retinianas), sino también un tejido con forma de copa óptica autoensamblado, a partir de una célula madre.

Debido a que el tejido con forma de copa óptica obtenido se autoforma como una protrusión del agregado, es posible obtener una masa altamente pura de células progenitoras retinianas por medio de la separación de la

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protrusión. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para la separación o la identificación de una masa de células progenitoras retinianas, que comprende los pasos (1) y (2’) descritos con anterioridad.

Una masa de células progenitoras retinianas se puede obtener por medio del corte del tejido con forma de copa óptica autoformado del agregado de manera física y morfológica. Por lo tanto, este método hace posible separar con facilidad la masa de células progenitoras retinianas. Debido a que este método obvia la operación de confirmación de la posición de las células progenitoras retinianas mediante el uso de un marcador de célula progenitora retiniana y similares en la obtención de las células progenitoras retinianas por medio del cultivo en suspensión de agregados de células madre, una masa de células progenitoras retinianas se puede obtener con facilidad por medio de simplemente el corte de la masa celular formada como una protrusión en el agregado.

(3-3) El paso de cultivo en suspensión del tejido con forma de copa óptica formado en un caldo de cultivo de órganos [paso (3)]

Éste es un paso en donde el tejido con forma de copa óptica obtenido en el paso (2’) se cultiva en suspensión en un caldo de cultivo de órganos.

En este paso, el tejido con forma de copa óptica autoformado en el paso (2’) se cultiva en suspensión en un caldo de cultivo de órganos. El tejido con forma de copa óptica utilizado puede ser el agregado de células madre que contiene el tejido con forma de copa óptica; el tejido con forma de copa óptica formado como una protrusión del agregado de células madre se puede cortar de manera física y morfológica, y ésta se puede cultivar en suspensión en un caldo de cultivo de órganos. Cuando se ha cortado el tejido con forma de copa óptica, todo el agregado de células madre se puede manejar como una masa de células progenitoras retinianas positivas para Rx; por lo tanto, es posible inducir la diferenciación de células progenitoras retinianas de manera más eficaz para producir el tejido retiniano y las neuronas específicas de la capa retiniana.

El tejido con forma de copa óptica se puede cortar mediante el uso de cualquier método; es posible cortar el tejido de un agregado de células madre mediante el uso de micropinzas y similares.

Si bien el caldo de cultivo de órganos utilizado para cultivar el tejido con forma de copa óptica no está particularmente limitado, preferiblemente se utiliza un caldo de cultivo de órganos en uso común para la inducción de células retinianas. Los ejemplos incluyen (1) DMEM/F12/N2 + 0,5 µM de ácido retinoico, (2) 66% E-MEM-HEPES + 33% HBSS + 1% de suplemento de FCS+N2 + 5,75 mg/ml de glucosa + 200 mM de L-glutamina + 20 ng/ml de aFGF + 20 ng/ml de bFGF + 20nM de Shh + 1 mM de ácido retinoico + 100 de mM de taurina, o (3) G-MEM + 5% de KSR + suplemento de N2 + 0,1 mM de aminoácidos no esenciales + 1 mM de piruvato + 0,1 de mM 2mercaptoetanol + 1 mM de ácido retinoico + 100 mM de taurina y similares.

El tejido con forma de copa óptica se cultiva en un caldo de cultivo de órganos. El incubador utilizado en el cultivo en suspensión del tejido con forma de copa óptica puede ser el mismo que el incubador utilizado en el paso (2) descrito con anterioridad. Otras condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO2 y la concentración de O2 en el momento de tejido con forma de copa óptica cultivo en suspensión se pueden fijar de acuerdo con sea apropiado. La temperatura de cultivo no está particularmente limitada, y es, por ejemplo, aproximadamente 30 a 40ºC, preferiblemente aproximadamente 37ºC. La concentración de CO2 es, por ejemplo, aproximadamente 1 a 10%, preferiblemente aproximadamente 5%. Mientras tanto, La concentración de O2 es, por ejemplo, 20 a 70%, preferiblemente 20 a 60%, más preferiblemente 30 a 50%, cuando las células progenitoras retinianas se van a inducir por diferenciación, y por ende teniendo en cuenta el alto requerimiento de oxígeno.

El tiempo de cultivo en este paso no está particularmente limitado, y es normalmente 48 horas o más, preferiblemente 7 días o más.

El tejido con forma de copa óptica autoformado en el paso (2’) se autoinduce a un tejido retiniano a través de este paso. Por lo tanto, por medio del cultivo en suspensión del tejido con forma de copa óptica autoformado en el paso (2’) en un caldo de cultivo de órganos, un tejido retiniano o una población celular que constituye el tejido retiniano se autoinduce in vitro. En consecuencia, la presente invención proporciona un método de producción de un tejido retiniano in vitro por medio de la autoformación de tejido retiniano y un método de producción de una población celular que constituye el tejido retiniano. Aquí, “in vitro” simplemente se refiere a no estar en un organismo vivo.

Como se muestra en la Fig. 4, el tejido retiniano en un organismo vivo tiene una estructura en donde las células nerviosas están dispuestas en orden en una estructura de láminas de cinco capas regulares para permitir que la luz incidental a través de la córnea y la lente sea recibida por células fotorreceptoras superficiales y se convierta en una señal eléctrica, para transmitir información en el orden de las células bipolares y las células ganglionares nerviosas, y finalmente transmitir la señal al cerebro. El tejido retiniano autoformado por medio del método de la presente invención no es un simple ensamblaje de células retinianas, sino que sorprendentemente tiene una estructura que es morfológicamente extremadamente similar al tejido retiniano vivo.

El tejido retiniano autoformado por la presente invención tiene una estructura de cinco láminas autoformada a partir de células nerviosas en disposición regular en el mismo orden que en el tejido retiniano de un organismo vivo. Las cinco capas están configuradas por diferentes tipos de células retinianas (células fotorreceptoras, células

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tejidos perdidos debido a cirugía oftalmológica (p. ej., después de retinoplastia para el desprendimiento de retina) y similares (p. ej., cirugía de trasplante de retina).

Cuando se utilizan células obtenidas por medio del método de la presente invención (p. ej., células progenitoras nerviosas) como fármaco terapéutico para una enfermedad basada en un trastorno de las células, es preferible que las células se trasplanten al sujeto después de aumentar la pureza de las células.

Se puede utilizar cualquier método de separación celular de conocimiento público para la purificación celular. Tales métodos incluyen, por ejemplo, un método que utiliza un citómetro de flujo [véase, por ejemplo, Antibodies -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibodies: principles and practice, Tercera edición, Acad. Press (1993), Int. Immunol., 10, 275 (1998)], el método de panoramización [véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies: principles and practice, Tercera edición, Acad. Press (1993), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press (1996), J. Immunol., 141, 2797 (1988)], y fraccionamiento celular sobre la base de diferencias de densidad de sacarosa [véase, por ejemplo, Soshiki Baiyou no Gijyutsu (3ra edición), Asakura Shoten (1996)].

El método para aumentar la pureza celular comprende el paso del cultivo de células obtenidas por medio de la inducción de diferenciación de las células madre descritas con anterioridad (p. ej., células progenitoras nerviosas) en un medio que contiene un agente anticancerígeno. Por ende, las células indiferenciadas se pueden eliminar, haciendo posible obtener células diferenciadas de mayor pureza, que son más adecuadas para uso farmacéutico. Por lo tanto, por medio de un tratamiento con un agente anticancerígeno, las células distintas de las células diferenciadas deseadas, por ejemplo, las células indiferenciadas, se pueden eliminar.

Aquí, el agente anticancerígeno se ejemplifica por medio de mitomicina C, 5-fluorouracilo, adriamicina, Ara-C, metotrexato y similares. Estos agentes anticancerígenos preferiblemente se utilizan a concentraciones que son más citotóxicas para las células indiferenciadas que para las células inducidas por diferenciación. En forma específica, el cultivo con estos agentes anticancerígenos se puede llevar a cabo de acuerdo con los procedimientos de cultivo descritos con anterioridad para determinar concentraciones óptimas. Por ejemplo, un método es útil en donde las células se cultivan en un incubador de CO2 aireado con 5% de dióxido de carbono gaseoso a 37ºC durante varias horas, durante 2 horas, mediante el uso de un medio que contiene estos agentes anticancerígenos a concentraciones un centésimo a un tiempo el intervalo de concentraciones para organismos vivos especificados en la Farmacopea Japonesa.

Aquí se puede utilizar cualquier medio que permita el cultivo de las células inducidas por diferenciación. En forma específica, los medios mencionados con anterioridad y similares son útiles.

En la terapia de trasplante, el rechazo de injertos debido a diferencias del antígeno de histocompatibilidad a menudo es problemático, cuyo problema, sin embargo, se puede resolver mediante el uso de una célula madre que tiene el núcleo de una célula somática trasplantado a la misma, o una célula madre que tiene un gen modificado en el cromosoma de la misma.

Por medio de la inducción de diferenciación mediante el uso de una célula madre que tiene el núcleo de una célula somática trasplantado a la misma, se pueden obtener células progenitoras nerviosas, células progenitoras retinianas, células del sistema nervioso, neuronas específicas de la capa retiniana y similares del individuo que es el donante de la célula somática. Las células de tal individuo no sólo son eficaces en los medicamentos de trasplante tal como son, sino que también son útiles como material de diagnóstico para determinar si un fármaco existente es eficaz en el individuo. Además, por medio del cultivo de células inducidas por diferenciación durante un largo periodo, es posible determinar su susceptibilidad al estrés oxidativo y la senescencia. Por medio de la comparación de sus funciones o la duración de la vida con las de células de otros individuos, es posible evaluar los riesgos individuales de contraer enfermedades neurodegenerativas y otras. Estos datos de evaluación son útiles para proporcionar un método profiláctico eficaz para las enfermedades diagnosticadas como de desarrollo en altas incidencias en el futuro.

Las células inducidas por diferenciación a partir de una célula madre por medio del método de la presente invención, por ejemplo, células progenitoras nerviosas, células progenitoras retinianas, células del sistema nervioso, neuronas específicas de la capa retiniana y similares se pueden trasplantar a un sitio de enfermedad de un paciente por medio de un método conocido per se [véase, p. ej., Nature Neuroscience, 2, 1137(1999)].

(5) Formación de la red nerviosa retiniana

La presente invención proporciona un método de permitir que una red nerviosa retiniana se autoforme in vitro, que comprende los pasos (1), (2’) y (3). De acuerdo con este método, es posible permitir que un agregado celular obtenido por medio del método SFEBq modificado forme una red nerviosa retiniana en el mismo sin que se convierta en una masa de células nerviosas desordenada.

La construcción de una red nerviosa retiniana en los agregados celulares in vitro se puede confirmar, por ejemplo, por medio de la observación de excitación eléctrica por estimulación de la luz [Homma et al., (2009), J. Neurosci. Res. 87 (9)2175-2182] o análisis de imágenes con liberación de calcio como índice. Aquí, “in vitro” se refiere a no

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estar en un organismo vivo.

En la red nerviosa retiniana autoformada por medio del método de la presente invención, una elevación de Ca2+ (oscilación de calcio) sincronizada o no sincronizada con células circundantes se observa repetidamente en muchas células. Por lo tanto, la red nerviosa retiniana formada por medio del método de la presente invención preferiblemente puede estar acompañada de una activación espontánea sincronizada. Aquí, “activación” se refiere a una actividad excitatoria debido a despolarización de células nerviosas, y “activación espontánea” se refiere a la ocurrencia espontánea de la activación. Por lo tanto, la red nerviosa retiniana formada por medio del método de la presente invención puede causar actividades nerviosas similares a la retina viva en un cierto aspecto.

Se proporciona un producto de cultivo de acuerdo con lo obtenido por medio del método de la presente invención, en forma específica un agregado celular que constituye la red nerviosa retiniana descrita con anterioridad. Este producto de cultivo (agregado celular) ha formado una red nerviosa retiniana que es extremadamente similar a la red nerviosa retiniana en un organismo vivo, de modo que se pueda utilizar para el cribado de fármacos terapéuticos para enfermedades basadas en trastornos de células del sistema nervioso, por ejemplo, células retinianas, cribado para fármacos terapéuticos para lesiones celulares debido a otras causas, o pruebas de toxicidad de las mismas y similares. Aquí, los ejemplos de enfermedades basadas en trastornos de células retinianas incluyen intoxicación por mercurio orgánico, retinopatía de cloroquina, degeneración pigmentaria de la retina, degeneración macular senil, glaucoma, retinopatía diabética, retinopatía neonatal, y similares.

Este producto de cultivo (agregado celular) también se puede utilizar como un fármaco terapéutico para enfermedades basadas en trastornos de las células de la retina, un fármaco terapéutico para lesiones celulares debido a otras causas y similares.

(6) Formación de la estructura de tejido retiniano

La presente invención proporciona un método de permitir que la estructura estérica del tejido retiniano se autoforme in vitro, que comprende los pasos (1), (2’) y (3). De acuerdo con este método, es posible formar la estructura estérica del tejido retiniano en un agregado celular obtenido por medio del método SFEBq modificado sin que se convierta en una masa de células nerviosas desordenada. Más preferiblemente, es posible imitar el proceso inicial de la histogénesis retiniana con el autoensamblaje en curso en la misma secuencia que la formación retiniana hallada en el primordio de la copa óptica.

La autoformación de la estructura estérica del tejido retiniano en el agregado celular in vitro se puede confirmar, por ejemplo, por medio de la expresión de los marcadores celulares retinianos de capa específica tales como Chx10, Tuj1, caltetinina, calbindina, y rodopsina, análisis morfológico microscópico de luz o electrónico, imágenes en vivo de las células transferidas por GFP y similares. Aquí, “in vitro” tiene el mismo significado que el anterior.

Se proporciona el producto de cultivo obtenido por medio del método de la presente invención, en forma específica un agregado de células que constituye la estructura estérica del tejido retiniano. El producto de cultivo tiene una estructura que es morfológicamente extremadamente similar a la retina viva, de modo que se pueda utilizar para el cribado de fármacos terapéuticos para enfermedades basadas en trastornos de células del sistema nervioso, en particular células progenitoras retinianas y células retinianas, cribado para fármacos terapéuticos para lesiones celulares debido a otras causas, o pruebas de toxicidad de las mismas y similares. Aquí, las enfermedades basadas en trastornos de células progenitoras retinianas o células retinianas incluyen, por ejemplo, intoxicación por mercurio orgánico, retinopatía de cloroquina, degeneración pigmentaria de la retina, degeneración macular senil, glaucoma, retinopatía diabética, retinopatía neonatal, y similares.

(7) Método de cribado

Se proporciona un método de cribado de sustancia de prueba que comprende el uso de un producto de cultivo. En particular, un producto de cultivo tiene una red nerviosa ya formada que es extremadamente similar a la red nerviosa viva, y también tiene un tejido retiniano ya formado que es extremadamente similar a la protrusión histogenética de la retina, de modo que se pueda aplicar para el cribado de fármacos terapéuticos para enfermedades basadas en trastornos de células del sistema nervioso, por ejemplo, células progenitoras retinianas y células retinianas, cribado para fármacos terapéuticos para lesiones celulares debido a otras causas, o pruebas de toxicidad de las mismas, y el desarrollo de un nuevo método terapéutico para enfermedades de los sistemas nerviosos y similares.

Aquí, “una sustancia de prueba” se ejemplifica por medio de sustancias cuya eficacia como fármacos terapéuticos para enfermedades de los sistemas nerviosos ha de determinarse y sustancias que son fármacos terapéuticos para otras enfermedades cuyas influencias (p. ej., la toxicidad) en los nervios se deben determinar. La sustancia puede ser cualquiera de los compuestos de bajo peso molecular, compuestos de alto peso molecular, proteínas, ácidos nucleicos (ADN, ARN y similares), virus y similares. Tales sustancias se pueden elegir de acuerdo con sea apropiado por los expertos en la técnica.

De aquí en adelante se describe la presente invención en más detalle por medio de los siguientes Ejemplos Comparativos y los Ejemplos, que, sin embargo, son para fines ilustrativos únicamente y nunca limitan el alcance de la invención.

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Ejemplos

Ejemplo comparativo 1: Inducción de diferenciación altamente eficaz en células progenitoras de la corteza cerebral por medio del método SFEBq

(Método)

Se cultivaron células EB5 de células ES de ratón (derivadas de E14) o células de una línea celular derivada deE14 en donde el gen de Venus, que es una GFP (proteína fluorescente verde) modificada, que se habían sometido a “knock-in” en el gen Bf1 del marcador del nervio cerebral como una diferenciación de nervios informada por una recombinación homóloga (de aquí en adelante descrita como “células Bf1/mES-Venus”) como se describió en la bibliografía (Watanabe et al., Nature Neuroscience, 2005), y como se utilizó en los experimentos.

El medio para el cultivo de mantenimiento utilizado fue un medio G-MEM (Invitrogen) suplementado con 1% de suero fetal de ternera, 10% de KSR (Reemplazo de Suero Knockout; Invitrogen), 2 mM de glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 1 mM de ácido pirúvico, 0,1 mM de 2-mercaptoetanol y 2000 U/ml de LIF. Para la inducción de la diferenciación de nervios por cultivo en suspensión, se monodispersaron las células ES mediante el uso de 0,25% de tripsina-EDTA (Invitrogen), y se suspendieron en 150 µl del medio de diferenciación en una placa de cultivo de 96 pocillos no adhesiva a las células (una placa esferoide SUMILON, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) a 3x103 células por pocillo para permitir que los agregados se formen con rapidez, después de lo cual se incubó la placa a 37ºC, 5% de CO2 durante 7 días (método SFEBq; Fig. 1A).

El medio de diferenciación utilizado en esta operación fue un medio libre de suero preparado por medio de la adición de 10% de KSR, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 0,1 mM de 2-ME, 250 µg/ml de Dkk-1 humano recombinante, y 1 µg/ml de Lefty-1 humano recombinante a un medio G-MEM (véase Watanabe et al., Nature Neuroscience, 2005).

Se recuperaron las masas de agregados en un plato de plástico no adhesivo de 6 cm (3,5 ml del medio de diferenciación), y se continuaron cultivando en suspensión durante 3 días (10 días en total), después de lo cual se analizó el estado de diferenciación por medio de inmunotinción fluorescente. Los resultados se muestran en la Fig. 1.

(Resultados)

El análisis de inmunotinción reveló que 10 días después del comienzo del cultivo de diferenciación, aproximadamente 70% de las células en el agregado expresado el marcador específico del cerebro Bf1, con el 90% de las células positivas para Bf1 expresaron el marcador específico de corteza cerebral Emx1. También cuando las Bf1/células mES-Venus diferenciadas se analizaron mediante la expresión de Venus-GFP, aproximadamente 70% de las células fueron positivas, la mayoría de las cuales expresaron Emx1 (Fig. 1A). Por lo tanto, el método SFEBq permite que las células de la corteza cerebral (células progenitoras) se induzcan por diferenciación con alta eficacia cuando se utiliza el medio de diferenciación descrito con anterioridad. Cuando se utiliza un método convencional en donde agregados de células ES se forman de manera gradual mediante el uso de un plato de cultivo de 10 cm (Watanabe et al., Nature Neuroscience, 2005), Las células positivas para Bf1 representaron hasta 30%, de las cuales menos del 40% se volvieron positivas para el marcador de la corteza cerebral Emx1. La presencia de una estructura similar al epitelio con polaridad en los agregados se confirmó mediante la expresión de N-cadherina (Ncad), CD-133, laminina y similares (Fig. 1B a G; Dapi muestra el núcleo), observación microscópica electrónica de la morfología de la unión apretada (Fig. 1H, entre paréntesis), unión adherente (Fig. 1I, entre paréntesis) y similares, formación de rosetas (Fig. 1J, Fig. 1K, la línea punteada indica una roseta), la expresión de los marcadores de polaridad y los marcadores de diferenciación (Fig. 1L a O, la línea punteada indica una roseta, el asterisco indica un lumen) y similares.

Por lo tanto, el método SFEBq, comparado con el método convencional, promueve la diferenciación de células ES en el cerebro, en particular en la corteza cerebral, de manera más eficaz.

Ejemplo comparativo 2: Producción in vitro de neuronas cerebrales a partir de células progenitoras de la corteza cerebral inducidas por medio del método SFEBq

(Método)

Los agregados obtenidos por medio de cultivo de diferenciación continuado durante 12 días por medio del método descrito en el Ejemplo comparativo 1 se dispersaron de manera enzimática (kit de disociación de tejido neural SUMILON), se sembraron sobre una placa de cultivo recubierta con Poli-D-lisina/laminina/fibronectina a 5x104 células/cm2, y se cultivaron mediante el uso de un medio DMEM/F12 suplementado con un suplemento 1xN2 y 10 ng/ml de FGF2 durante 2 días. Posteriormente, se cultivaron adicionalmente las células mediante el uso de un medio Neurobasal (suplementados con un suplemento B27) + 50 ng/ml de BDNF + 50 ng/ml de NT3 durante 6 días. Las propiedades de la neurona diferenciada se analizaron por medio de un método de inmunotinción fluorescente. Los resultados se muestran en la Fig. 2.

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Claims (1)

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