ES2624478T3 - Péptidos intestinales vasoactivos modificados - Google Patents

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un péptido VIP que comprende (i) la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 13 con la His N-terminal en la posición 2, y (ii) una metionina N-terminal que aumenta la preferencia del péptido VIP para VPAC2 frente a VPAC1 y que tiene un péptido similar a la elastina (ELP) en el extremo C-terminal prolongando la fase de absorción desde un sitio de inyección y extendiendo la vida media circulatoria, el ELP que tiene de 75 a 130 unidades de VPGXG (sec. con núm. de ident.:3) donde la composición de X es Val, Ala y Gly en una relación de 5:2:3.

Description

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DESCRIPCION
Peptidos intestinales vasoactivos modificados Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a peptidos intestinales vasoactivos (VIP) y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos, que incluyen los VIP que tienen una vida media circulatoria extendida, y los VIP que tienen perfiles de union al receptor que difieren del peptido maduro no modificado.
Descripcion del archivo de texto presentado por via electronica
El contenido del archivo de texto presentado por via electronica adjunto se incorpora en la presente descripcion como referencia en su totalidad: Una copia en formato legible por computadora del Listado de Secuencias (nombre de archivo: PHAS_019_01US_SeqList_ST25.txt, fecha registrada: 4 de Agosto, 2010, tamano del archivo 44 kilobytes).
Antecedentes
El peptido intestinal vasoactivo (VIP) tiene una serie de efectos biologicos que incluyen con respecto a la hemostasia, el sistema inmunologico y el sistema nervioso. Ver, Delgado y otros, The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation, Pharmacol. Reviews 56(2):249-290 (2004).Por ejemplo, el VIP tiene un efecto beneficioso sobre la presion sangulnea y pulmonar y sobre una amplia variedad de afecciones inmunologicas e inflamatorias.VIP tiene un gran potencial como agente activo para la hipertension pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y asma, por mencionar algunos.
Existe al menos dos receptores para VIP, que incluyen VPAC1 y VPAC2.Estos receptores se unen tanto a VIP como a la molecula relacionada con el polipeptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) hasta cierto grado. Ambos receptores son miembros de la familia de receptores acoplados a la protelna G transmembrana 7.VPAC1 se distribuye, por ejemplo, en el CNS, hlgado, pulmon, intestino y linfocitos T.VPAC2 se encuentra, por ejemplo, en el CNS, pancreas, musculo esqueletico, corazon, rinon, tejido adiposo, testlculo y estomago.
La vida media corta del VIP hace que este peptido sea poco practico como agente farmaceutico. Ver Pozo D, y otros, Tuning immune tolerance with vasoactive intestinal peptide: A new therapeutic approach for immune disorders. Peptides 28(9):1833-1846 (2007).De hecho, los estudios han demostrado que la vida media del VIP en la sangre es menos de 2 minutos (Domschke y otros, 1978, Gut 19:1049-53; Burhol y otros, 1978, Scand J Gastroent 13:807-813).Ademas, la multitud de efectos biologicos de VIP puede complicar su desarrollo para cualquier indicacion particular. Por lo tanto, se necesitan versiones modificadas de VIP para hacer el agente terapeuticamente practico, por ejemplo, mediante la extension de la vida media y/o diseno de moleculas que tengan perfiles convenientes de union al receptor.
Resumen de la invencion
La presente invencion se define por las reivindicaciones.
La presente descripcion que comprende la invencion proporciona unas composiciones farmaceuticas que comprenden los VIP modificados. La descripcion que comprende la invencion proporciona ademas metodos para fabricar las moleculas VIP modificadas y el uso de los agentes VIP modificados para el tratamiento de los pacientes. De acuerdo con la descripcion que comprende la invencion, el VIP modificado exhibe una vida media o persistencia circulatoria extendida en el cuerpo, y/o union al receptor y/o potencia biologica comparable, y/o perfil de union al receptor alterado con respecto al VIP no modificado.
En un aspecto, la invencion proporciona moleculas de VIP modificadas y composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos. Las moleculas VIP modificadas se modifican de forma recombinante o qulmicamente en el extremo N- terminal mediante la adicion de uno o mas aminoacidos y/o por fusion a secuencias heterologas de aminoacidos, para proporcionar una vida media o persistencia circulatoria mas prolongada en el cuerpo, potencia biologica comparable, y/o un perfil de union al receptor modificado. Por ejemplo, en algunas modalidades, el VIP maduro de 28 aminoacidos, que comienza con una His N-terminal, comprende aminoacidos N-terminales adicionales, tales como un solo aminoacido en el extremo N-terminal (es decir, Met). En estas u otras modalidades, el VIP modificado contiene una fusion C-terminal con un peptido similar a la elastina (ELP) como se describe en la presente descripcion. Tales moleculas VIP modificadas muestran un aumento de la vida media circulatoria o persistencia en el cuerpo, y una preferencia de union alterada para VPAC2 sobre VPAC1.
Por ejemplo, un VIP se fusiona (por ejemplo, mediante medios recombinantes) al extremo N-terminal de un ELP. En la presente descripcion, la histidina del VIP maduro, natural puede estar en el extremo N-terminal. Tales agentes terapeuticos pueden requerir una dosificacion significativamente menos frecuente que la contrapartida no fusionada, tal como una dosificacion de aproximadamente 1-7 veces por semana (por ejemplo, dosis diaria o semanal).
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En una modalidad, la fusion VIP-ELP contiene una metionina en el extremo N-terminal con la His del producto VIP maduro natural en la posicion 2.Aun en otro caso, la molecula VIP-ELP comienza con metionina alanina alanina. Cuando se produce en bacterias, la primera metionina se pierde y el producto contiene Ala-Ala en el extremo N-terminal. Ala-Ala se elimina in vitro o in vivo mediante la accion de la peptidasa DPP-IV, dejando de esta manera el extremo N- terminal del VIP maduro natural. Estas construcciones que contienen aminoacidos adicionales en el extremo N-terminal exhiben una actividad significativamente diferente cuando se prueban para la actividad de union en los receptores VPAC1 y VPAC2.Por ejemplo, aunque ambas construcciones pueden activar el receptor VPAC2 con una EC50 similar, una construccion con metionina en el extremo N-terminal (y His en la posicion 2) es al menos 100 veces menos activa en el receptor VPAC1.
En varios casos, el VIP modificado de la invencion que tiene una Met en el extremo N-terminal tiene la ventaja de ser obtenible por medios recombinantes, tal como por produccion en E. coli u otro sistema de expresion, sin procesos de fabrication adicionales posterior a la expresion que expone el N-terminal del VIP natural o deseado.
En otros casos, el VIP puede modificarse qulmicamente, por ejemplo, mediante la adicion de uno o mas PEG u otras porciones qulmicas (por ejemplo, en o cerca del extremo N-terminal), como se describe en detalle en la presente descripcion.
En otros aspectos, la presente description proporciona polinucleotidos y vectores que codifican el VIP modificado de la invencion, as! como celulas huesped que contienen el mismo. Las celulas huesped pueden ser adecuadas para la produccion recombinante del VIP modificado, tal como celulas bacterianas o de levadura adecuadas para su uso con sistemas de expresion conocidos.
En otros aspectos, la invencion proporciona tratar, mejorar o prevenir una afeccion en un mamlfero. Tales condiciones incluyen una variedad de afecciones cardiovasculares, inmunologicas (por ejemplo, autoinmunes) y neurologicas. Por ejemplo, el VIP modificado puede usarse para ajustar el equilibrio entre efectores proinflamatorios y antiinflamatorios en un paciente, que incluyen un paciente que sufre de una enfermedad autoinmune o una afeccion inflamatoria. Las indicaciones ilustrativas del VIP modificado incluyen hipertension, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), diabetes, fibrosis miocardica, insuficiencia cardlaca, cardiomiopatla, artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y asma, entre otros.
Descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos de una protelna de fusion VIP-ELP modificada (M-VIP-ELP1-120, sec. con num. de ident.: 14) que tiene Met en el extremo N-terminal y 120 unidades ELP1 (VPGXG, sec. con num. de ident.:3) fusionado con el VIP en el extremo C-terminal.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoacidos de una protelna de fusion VIP-ELP modificada (MAA-VIP-ELP1-120, sec. con num. de ident.: 15) que tiene Met-Ala-Ala en el extremo N-terminal, que es activable con el peptido VIP maduro natural, y 120 unidades ELP1 (VPGXG, sec. con num. de ident.:3) fusionado con el VIP en el extremo C-terminal.
La Figura 3 es un mapa de plasmido de pPB1031, que codifica ELP1-120 para la produccion conveniente de fusiones recombinantes.
La Figura 4 representa pPB1046 que codifica una protelna de fusion M-VIP-ELP1-120 (sec. con nums. de ident.:39 y 40). Iniciadores (P0045, sec. con num. de ident.:31, P0048, sec. con num. de ident.:32, y P0065, sec. con num. de ident.:34) para la construccion del gen recombinante se muestran.
La Figura 5 representa pPB1047 que codifica una protelna de fusion MAA-VIP-ELP1-120 (sec. con nums. de ident.:41 y 42). Iniciadores (P0066, sec. con num. de ident.:35, P0064, sec. con num. de ident.:33, P0067, sec. con num. de ident.:36) para la construccion del gen recombinante se muestran.
La Figura 6 representa pPB1048 que codifica una protelna de fusion ELP1-120-VIP (sec. con nums. de ident.:43 y 44). Iniciadores para construir el gen recombinante (P0068, sec. con num. de ident.:37, P0069, sec. con num. de ident.:38) se muestran.
La Figura 7 es un analisis de gel NuPAGE Tris-Acetato al 10 % de protelnas de fusion purificada VIP-ELP, con o sin desnaturalizacion termica.
La Figura 8 muestra la actividad in vitro de las protelnas VIP nativa y de fusion VIP-ELP PB1046 y PB1047 para el receptor VPAC2.
La Figura 9 muestra la actividad in vitro de las protelnas VIP nativa y de fusion VIP-ELP PB1046 y PB1047 para el receptor VPAC1.
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La Figura 10 muestra el efecto in vivo de la protelna de fusion VIP-ELP sobre la presion arterial de la rata. El panel izquierdo muestra la presion arterial sistolica. El panel derecho muestra la presion arterial diastolica VIP-ELP reduce la presion arterial durante mas de 12 horas.
La Figura 11 es un mapa de plasmido de pPB1120 (sec. con num. de ident.:48), que codifica VIP-ELP1-120.
La Figura 12 muestra la actividad in vitro de las protelnas VIP nativa y de fusion VIP-ELP PB1120 y PB1046 para el receptor VPAC1.
La Figura 13 muestra la actividad in vitro de las protelnas VIP nativa y de fusion VIP-ELP PB1120 y PB1046 para el receptor VPAC2.
La Figura 14A muestra el perfil farmacocinetico de la protelna de fusion VIP-ELP PB1120 en monos (n = 3) despues de una sola inyeccion subcutanea de 3 mg/kg con ejes lineales. La Figura 14B muestra el perfil farmacocinetico de la protelna de fusion VIP-ELP PB1120 con ejes semilogarltmicos.
Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran el cambio promedio en la presion arterial sistolica, diastolica y media, respectivamente, durante intervalos de 3 horas en ratas inyectadas por via subcutanea con PB1120 a dosis de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg. La Figura 15D muestra la frecuencia cardlaca media de las ratas sujetos durante 3 horas despues de la administracion de PB1120.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona una composition farmaceutica que comprende los VIP modificados. La invention proporciona ademas el uso de los agentes VIP modificados para el tratamiento de pacientes. De acuerdo con la invencion, el VIP exhibe una vida media o persistencia circulatoria extendida en el cuerpo y puede exhibir una union al receptor o potencia biologica comparable, y/o perfil de union al receptor alterado con respecto al VIP no modificado. En varios casos, los compuestos de la invencion exhiben una frecuencia de dosificacion reducida en comparacion con sus homologos no modificados.
Peptido intestinal Vasoactivo
El peptido intestinal vasoactivo (VIP) es una hormona peptldica que contiene 28 residuos de aminoacidos y se produce en muchas areas del cuerpo humano que incluyen el intestino, pancreas y los nucleos supraquiasmaticos del hipotalamo en el cerebro.VIP exhibe una amplia variedad de acciones biologicas, que incluyen vasodilatation sistemica, hipotension, aumento del gasto cardlaco, estimulacion respiratoria, hiperglucemia, dilatation coronaria, broncodilatacion en animales y seres humanos.VIP ademas afecta el equilibrio del sistema inmunologico.
VIP tiene un efecto en varias partes del cuerpo. Con respecto al sistema digestivo, VIP puede inducir la relajacion del musculo liso (esflnter esofagico inferior, estomago, veslcula biliar), estimular la secretion de agua en el jugo pancreatico y la bilis, y causar la inhibicion de la secrecion de acido gastrico y la absorcion de la luz intestinal. Su papel en el intestino es estimular la secrecion de agua y electrolitos, as! como dilatar el musculo liso intestinal, dilatar los vasos sangulneos perifericos, estimular la secrecion de bicarbonato pancreatico e inhibir la secrecion gastrica estimulada por la gastrina. Estos efectos trabajan juntos para aumentar la motilidad. El VIP tiene la funcion de estimular la secrecion de pepsinogeno por las celulas principales.
VIP se ha encontrado en el corazon y tiene efectos significativos en el sistema cardiovascular. Causa vasodilatacion coronaria, ademas de tener un efecto inotropico y cronotropico positivo.
VIP es un peptido inmunomodulador util para tratar la inflamacion y la enfermedad autoinmune de tipo TH1 (Ver Delgado y otros, The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation, Pharmacol. Reviews 56(2):249-290 (2004)).VIP es util para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas (ver la patente de los Estados Unidos 5,972,883, que se incorpora en la presente description como referencia en su totalidad).VIP y su peptido relacionado estructuralmente polipeptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) tienen importantes efectos terapeuticos en la enfermedad reumatica inflamatoria cronica, tales como la osteoartritis (OA) y artritis reumatoide (RA) mediante la regulation negativa tanto de los componentes inflamatorios como autoinmunes de la enfermedad (Juarranz y otros, Vasoactive intestinal peptide modulates proinflammatory mediator synthesis in osteoarthritic and rheumatoid synovial cells, Rheumatology, 2004, 43:416-422).Ademas, el VIP participa en el mantenimiento de la tolerancia inmune regulando el equilibrio entre los efectores proinflamatorios y antiinflamatorios, o induciendo la aparicion de celulas T que tienen una actividad supresora frente a las celulas T autorreactivas (Pozo y otros, Tuning immune tolerance with vasoactive intestinal peptide:A new therapeutic approach for immune disorders, Peptide, 2007, 28(9):1833-1846).
El VIP maduro tiene 28 residuos de aminoacidos con la siguiente secuencia: HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN (sec. con num. de ident.: 13).El VIP resulta del procesamiento de la molecula precursora de 170 aminoacidos prepro-VIP (Se han descrito estructuras de VIP y analogos ilustrativos en las patentes de los Estados Unidos
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Un numero de mutaciones para mejorar la estabilidad de los peptidos contra proteasas, etc. se detallan en la literatura (ver Onune y otros, Physicochemical and pharmacological characterization of novel vasoactive intestinal peptide derivatives with improved stability, Eur.J.Pharm.Biopharm.2009). Estos peptidos VIP modificados tienen las secuencias de sec. con num. de ident.:21 (M17L, para evitar la oxidacion de Met), sec. con num. de ident.:22 (K15R, K20R y K21R, para aumentar la estabilidad proteolltica), y sec. con num. de ident.:23 (N24A y S25A, para aumentar la estabilidad proteolltica/termica).La presente invencion proporciona peptidos VIP modificados que incluyen una o mas de estas modificaciones, y con modificaciones VIP adicionales descritas en la presente descripcion. Ejemplos de moleculas VIP modificadas incluyen los peptidos VIP modificados de las sec. con nums. de ident. :14-15, 17-27, 40, 42, 44, y 50.
En una modalidad, un VIP modificado comprende la sec. con num. de ident.:13.Generalmente, los analogos funcionales de VIP incluyen fragmentos funcionales truncados en el extremo N o C terminal en 1 a 10 aminoacidos, que incluyen 1, 2, 3 o hasta 5 aminoacidos (con respecto a la sec. con num. de ident.:13).Estos analogos funcionales pueden contener de 1 a 5 inserciones, deleciones y/o sustituciones (colectivamente) de aminoacidos con respecto a la secuencia nativa (por ejemplo, sec. con num. de ident.:13), y reteniendo en cada caso la actividad del peptido (por ejemplo, a traves de la union a VPAC2 y/o VPAC1).Tal actividad puede confirmarse o ensayarse usando cualquier ensayo disponible, que incluyen un ensayo descrito en la presente descripcion, y que incluyen cualquier ensayo adecuado para determinar o cuantificar una actividad descrita en Delgado y otros, The Significance of Vasoactive Intestinal Peptide in Immunomodulation, Pharmacol. Reviews 56(2):249-290 (2004).En estas u otras modalidades, el componente VIP del VIP modificado de la invencion tiene una identidad de al menos aproximadamente 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 97 % con la secuencia madura nativa (sec. con num. de ident.:13).La determinacion de la identidad de secuencia entre dos secuencias (por ejemplo, entre una secuencia nativa y un analogo funcional) puede llevarse a cabo usando cualquier herramienta de alineacion, que incluyen Tatusova y otros, Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, fEmS Microbiol Leff.174:247-250 (1999).
En un aspecto, la presente invencion proporciona una molecula VIP modificada que tiene preferencia de receptor para VPAC2 o VPAC1, en comparacion con VIP no modificado (por ejemplo, un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de sec. con num. de ident.:13).Por ejemplo, el VIP modificado puede tener una preferencia de union relativa para VPAC2 sobre VPAC1 de al menos aproximadamente 2:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, Aproximadamente 500:1 o mas. En otras modalidades, el VIP modificado puede tener una preferencia de union relativa para VPAC1 sobre VPAC2 de al menos aproximadamente 2:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1 aproximadamente 500:1, o mas. Por ejemplo, en ciertos casos, el VIP modificado activa el receptor VPAC2 esencialmente como VIP humano maduro, no modificado, es decir, con una EC50 dentro de un factor de aproximadamente 2 de VIP humano maduro, no modificado, (sec. con num. de ident.:13).Sin embargo, este mismo VIP modificado es 50 o 100 veces o mas menos efectivo que VIP humano, maduro, no modificado, en la activacion del receptor VPAC1.
Tales moleculas VIP modificadas pueden contener regiones N-terminales modificadas, tales como una adicion de 1 a aproximadamente 500 aminoacidos a la histidina N-terminal de VIP, que puede incluir la secuencia heterologa de aminoacidos de mamlfero. Por ejemplo, el VIP modificado puede contener una sola metionina en el lado N-terminal de la histidina N-terminal natural del VIP maduro. Esta molecula ademas se prepara convenientemente en E. coli u otro sistema de expresion bacteriana, ya que la metionina no se eliminara por E colicuando el aminoacido adyacente es histidina. Alternativamente, el aminoacido N-terminal puede ser cualquiera de los aminoacidos de origen natural, a saber, alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistelna, acido glutamico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina y prolina.
La secuencia adicional anadida al N-terminal de VIP puede ser de cualquier secuencia, que incluyen secuencias biologicamente activas y biologicamente inertes de 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 20, 1 a aproximadamente 10 y 1 a aproximadamente 5 aminoacidos.
El extremo N-terminal del VIP modificado puede tener la estructura M-N, donde M es metionina, y N es el extremo N de la molecula VIP (por ejemplo, sec. con num. de ident.: 14, FIGURA 1). Esta metionina soporta la traduccion de la protelna en una celula huesped bacteriana o eucariotica. Asl, el VIP modificado puede hacerse en un sistema biologico, que incluyen sistemas de expresion bacteriano y levadura (por ejemplo, E. coli). Aunque la metionina a veces puede eliminarse por metionina aminopeptidasa (MA) en sistemas de expresion bacteriana, la histidina (H) es uno de los residuos menos favorecidos en la posicion 2 para MA.
Aun en otros casos, el extremo N-terminal se modifica por fusion con una protelna heterologa de mamlfero, tal como una protelna de mamlfero efectiva para extender la vida media de moleculas terapeuticas. Tales secuencias pueden ser secuencias de mamlferos, tales como secuencias de albumina, transferrina o Fc de anticuerpo. Tales secuencias se describen en Ver la patente de los Estados Unidos num. 7,238,667 (particularmente con respecto a los conjugados de albumina), la patente de los Estados Unidos num. 7,176,278 (particularmente con respecto a los conjugados de transferrina), y la patente de los Estados Unidos num. 5,766,883.
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En otros casos, el VIP es activable por una peptidasa o proteasa, tal como una peptidasa o proteasa endogena. Tales secuencias activables se describen en la Solicitud Internacional Num. PCT/US2009/068656. Como se usa en la presente descripcion, los terminos "peptidasa" y "proteasa" son intercambiables. Por ejemplo, el VIP puede disenarse para ser activable por una dipeptidil peptidasa. Las dipeptidil peptidasas ilustrativas incluyen dipeptidil peptidasa-1 (DPP-I), dipeptidil peptidasa-3 (DPP-III), dipeptidil peptidasa-4 (DPP-IV), dipeptidil peptidasa-6 (DPP-VI), dipeptidil peptidasa-7 DPP-VII), dipeptidil peptidasa-8 (dPp-VI 11), dipeptidil peptidasa-9 (DpP-IX), dipeptidil peptidasa-10 (DpP-X). Se conocen secuencias de sustrato para tales dipeptidasas.
El extremo N-terminal de un VIP activable puede tener la estructura Z-N, donde Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ejemplo, Z se elimina por exposition a dipeptidasa) y N es el extremo N-terminal de VIP.El VIP activable puede tener una secuencia N-terminal con la formula M-X-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser, y N es el N-terminal del analogo VIP o VIP. De esta manera, M y X seran sensibles a, y se eliminaran por una celula huesped (por ejemplo, E. coli.), y/o una dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), posteriormente. Alternativamente, la secuencia N-terminal del VIP activable puede ser X1-X2-N, donde X1 es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es el N- terminal de VIP.X1-X2 es un sustrato para dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), y la digestion con dipeptidasa expondra N, el extremo N-terminal deseado del VIP o el analogo VIP (por ejemplo, sec. con num. de ident.: 15, FIGURA 2).En tales modalidades, la protelna puede producirse mediante la expresion de una construction que codifica M-X1-X2-N (donde M es metionina) en una celula huesped (por ejemplo, E. coli.), ya que Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro en la segunda position indicaran la elimination de Met, dejando de esta manera X1-X2 en el extremo N-terminal, que puede activarse por una dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV) in vivo. Tales moleculas VIP activables, que se activan para poseer el extremo N-terminal VIP maduro natural, no muestran preferencia de receptor.
En otro caso, el extremo N-terminal del VIP activable modificado puede tener la estructura M-Z-N, donde M es metionina, Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ejemplo, Z se elimina por exposicion a dipeptidasa) y N es un N- terminal no histina de un VIP activo (VIP modificado. Por ejemplo, el VIP activable modificado puede tener una secuencia N-terminal con la formula M-X-N donde M es metionina; X es Pro, Ala o Ser; y N es un N-terminal no His del VIP activo. De esta manera, M y X seran sensibles a, y eliminaran por una celula huesped (por ejemplo, E. coli.), y/o una dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), posteriormente. Alternativamente, la secuencia N-terminal del VIP activable puede ser X1-X2-N, donde X1 es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; y N es un N-terminal no His del VIP activo. X1-X2 es un sustrato para la dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), y la digestion con dipeptidasa expondra N, el extremo N-terminal no His deseado del VIP.
Todavla en otro caso, el extremo N-terminal de un VIP activable modificado puede tener la estructura M-Z-S-N, donde M es metionina; Z es un sustrato para una dipeptidasa (por ejemplo, Z se elimina por exposicion a dipeptidasa); N es el N- terminal de VIP maduro (His); y S es uno o mas aminoacidos que seran expuestos despues de la digestion con dipeptidasa, y que proporcionan un VIP modificado como se describio previamente. Por ejemplo, el VIP activable modificado puede tener una secuencia N-terminal con la formula M-X-S-N donde M es metionina, X es Pro, Ala o Ser; N es el N-terminal del VIP maduro; y S es uno o mas aminoacidos que seran expuestos despues de la digestion con dipeptidasa, y proporcionaran preferencia de receptor. Alternativamente, la secuencia N-terminal del VIP activable puede ser X1-X2-S-N, donde x1 es Gly, Ala, Ser, Cys, Thr, Val o Pro; X2 es Pro, Ala o Ser; N es un N-terminal no His de VIP; y S es uno o mas aminoacidos que seran expuestos despues de la digestion con dipeptidasa.X1-X2 es un sustrato para la dipeptidasa (por ejemplo, DPP-IV), y la digestion con dipeptidasa expondra a S.
En estos o en otros casos, las modificaciones qulmicas de N-terminal al extremo N-terminal de VIP pueden proporcionar preferencia al receptor.La modification qulmica de las protelnas y sus metodos son bien conocidos en la tecnica. Las modificaciones qulmicas ilustrativas no limitativas son PEGilacion, metilglioxalacion, alquilacion reductora, oxidation de acido performico, succinilacion, aminoetilacion y lipidacion (Clifton, New Protein Techniques, New Jersey:Humana Press, 1985.ISBX.0-89603-126-8,Volumen 3 de Methods in Molecular Biology).Los grupos qulmicos, tales como la PEGilacion, pueden unirse por modificaciones de los grupos cistelna, metionina, histidina, lisina, arginina, triptofano, tirosina, carboxilo se han descritos anteriormente (ver Lundblad, Techniques in Protein Modification, CRC Press, 1995).
Fusiones a Pollmeros Bioelasticos
En algunos casos, el VIP de la invention contiene un componente de pollmero bioelastico N-terminal y/o C-terminal. Un "pollmero bioelastico" puede exhibir una transition inversa con la temperatura.Los pollmeros bioelasticos son conocidos y descritos en, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos num. 5,520,672 de Urry y otros. Los pollmeros bioelasticos pueden ser polipeptidos que comprenden unidades elastomericas de pentapeptidos, tetrapeptidos y/o nonapeptidos (por ejemplo "peptidos similares a elastina"). Los pollmeros bioelasticos que pueden usarse para llevar a cabo la presente invencion se exponen en la Patente de Estados Unidos num. 4,474,851, que describe una serie de unidades repetitivas de tetrapeptidos y pentapeptidos que pueden usarse para formar un pollmero bioelastico .Los pollmeros bioelasticos especlficos ademas se describen en la Patente de los Estados Unidos nums. 4,132,746; 4,187,852; 4,500,700; 4,589,882; y 4,870,055. Todavla otros ejemplos de pollmeros bioelasticos se exponen en la Patente de los Estados Unidos num. 6,699,294, Patente de los Estados Unidos num. 6,753,311, y Patente de los Estados Unidos num. 6,063,061.
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En un caso, los polimeros bioelasticos son polipeptidos de formula general (VPGXG) m donde X es cualquier aminoacido (por ejemplo, Ala, Leu, Phe) y m es de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, o aproximadamente 50 a aproximadamente 180.En casos ilustrativos, m es 60, 90, 120, 150, o 180.La frecuencia de los diversos aminoacidos como el cuarto aminoacido puede cambiarse, asi como la identidad de X
Por ejemplo, los polimeros bioelasticos pueden comprender unidades elastomericas repetitivas seleccionadas de pentapeptidos y tetrapeptidos bioelasticos, donde las unidades repetitivas comprenden residuos de aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en residuos de aminoacido hidrofobicos y glicina y donde las unidades repetitivas existen en una conformation que tiene un giro beta de la formula:
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en donde R1-R5 representan cadenas laterales de residuos de aminoacidos 1-5 y m es 0 cuando la unidad repetitiva es un tetrapeptido o 1 cuando la unidad repetitiva es un pentapeptido. Las unidades repetitivas nonapeptido consisten generalmente en tetra y pentapeptidos secuenciales. Los residuos de aminoacidos hidrofobicos se seleccionan de alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. En muchos casos, el primer residuo de aminoacido de la unidad repetitiva es un residuo de valina, leucina, isoleucina o fenilalanina; el segundo residuo de aminoacido es un residuo de prolina; el tercer residuo de aminoacido es un residuo de glicina; y el cuarto residuo de aminoacido es glicina o un residuo muy hidrofobico tal como triptofano, fenilalanina o tirosina. Ejemplos particulares incluyen el tetrapeptido Val-Pro-Gly-Gly, el tetrapeptido GGVP, el tetrapeptido GGFP, el tetrapeptido GGAP, el pentapeptido es Val-Pro-Gly-Val-Gly, el pentapeptido GVGVP, el pentapeptido GKGVP, el pentapeptido GVGFP, el pentapeptido GFGFP, el pentapeptido GEGVP, el pentapeptido GfGvp y el pentapeptido GVGIP. Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos num. 6,699,294.
En una modalidad, el VIP de la invention contiene un componente ELP C-terminal. El componente ELP comprende o consiste en unidades de peptidos estructurales o secuencias que se relacionan con o derivan de la proteina de elastina. Tales secuencias son utiles para mejorar las propiedades de las proteinas terapeuticas en una o mas de la biodisponibilidad, dosis terapeuticamente efectiva y/o frecuencia de administration, action biologica, compatibilidad de la formulation, resistencia a la proteolisis, solubilidad, vida media u otra medida de persistencia en el cuerpo posterior a la administracion, y/o velocidad de elimination del cuerpo. Ver, por ejemplo, el documento de patente WO 2008/030968.
Cuando el ELP se situa en el extremo C-terminal de VIP, pueden realizarse modificaciones adicionales en el extremo N- terminal de VIP, tal como la adicion de uno o mas aminoacidos, como se describio anteriormente. En casos alternativos, no existen tales modificaciones en el extremo N-terminal de VIP.
El componente ELP se construye a partir de unidades estructurales de tres a aproximadamente veinte aminoacidos, o en algunas modalidades, de cuatro a diez aminoacidos, tales como cinco o seis aminoacidos. La longitud de las unidades estructurales individuales, en un componente ELP particular, puede variar o puede ser uniforme. En ciertas modalidades, el componente ELP se construye de un motivo politetra, polipenta, polihexa, polihepta, poliocta y polinonapeptido de unidades estructurales repetitivas. Las unidades estructurales ilustrativas incluyen unidades definidas por la sec. con nums. de ident.:1-12 (ver mas abajo), que pueden emplearse como unidades estructurales repetitivas, que incluyen unidades repetitivas en tandem, o pueden emplearse en alguna combination, para crear un ELP efectivo para mejorar las propiedades del componente terapeutico. Asi, el componente ELP puede comprender o consistir esencialmente en unidades estructurales seleccionadas de las sec. con nums. de ident.:1-12, como se define mas abajo.
El componente ELP, que comprende tales unidades estructurales, puede ser de tamanos diversos. Por ejemplo, el componente ELP puede comprender o consistir esencialmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 unidades estructurales, o en ciertas modalidades de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 unidades estructurales, o en ciertas modalidades de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 unidades estructurales, o de
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aproximadamente 75 a aproximadamente 130 unidades estructurales, que incluyen una o una combinacion de unidades definidas por las sec. con nums. de ident.:1-12. El componente ELP puede comprender aproximadamente 120 unidades estructurales, tales como repeticiones de unidades estructurales definidas la por sec. con num. de ident.:3 (definido mas abajo). Asl, el componente ELP puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 residuos de aminoacidos, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 600 residuos de aminoacidos, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 residuos de aminoacidos, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 residuos de aminoacidos.
En algunos casos, el componente ELP, o en algunos casos el agente terapeutico, tiene un tamano de menos de aproximadamente 150 kDa o menos de aproximadamente 100 kDa o menos de aproximadamente 55 kDa o menos de aproximadamente 50 kDa o menos de aproximadamente 40 kDa, o de menos de aproximadamente 30 o 25 kDa.
En algunos casos, el componente ELP en el estado sin transicion puede tener una forma extendida, relativamente no estructurada y no globular para escapar de la filtracion renal. En tales modalidades, los agentes terapeuticos de la invention tienen un peso molecular menor que el corte generalmente reconocido para la filtracion a traves del rinon, tal como menos de aproximadamente 60 kD, o en algunas modalidades menos de aproximadamente 55, 50, 45 , 40, 30 o 25 kDa y, sin embargo, persistir en el cuerpo al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 100 veces mas que una contraparte terapeutica desacoplada (por ejemplo, no fusionada o no conjugada).
En estos u otros casos, el componente ELP no impacta esencial o significativamente en la action biologica del peptido terapeutico. Asl, el VIP con fusion de ELP de la presente invencion puede exhibir una potencia (accion biologica) que es la misma o similar a su contrapartida no fusionada. El VIP con fusion de ELP de la presente invencion puede exhibir una potencia o nivel de accion biologica (por ejemplo, como se prueba in vitro o in vivo) de 10-100 % de la exhibida por la contrapartida no fusionada en el mismo ensayo. En varias modalidades, el VIP (activado) con la fusion de ELP de la presente invencion puede presentar una potencia o nivel de accion biologica (por ejemplo, como se prueba in vitro o in vivo)de al menos 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % o mas de la exhibida por la contrapartida no fusionada.
En ciertos casos, el componente ELP experimenta una transicion de la fase inversa reversible. Es decir, los componentes ELP se desordenan estructuralmente y son altamente solubles en agua por debajo de una temperatura de transicion (Tt), pero exhiben una sostenida (intervalo de 2-3°C) transicion de fase de desorden a orden cuando la temperatura se eleva por encima de la Tt, conduciendo a la desolvatacion y agregacion de los componentes ELP. Por ejemplo, el ELP forma pollmeros insolubles, cuando alcanza un tamano suficiente, que puede facilmente eliminarse y aislarse de la solution por centrifugation. Tal transicion de fase es reversible, y los ELP insolubles aislados pueden completamente resolubilizarse en solucion tampon cuando la temperatura regresa por debajo de la Tt de los eLp. Asl, los agentes terapeuticos de la invencion pueden, en algunas modalidades, separarse de otras protelnas contaminantes con alta pureza usando procedimientos de ciclaje de transicion inverso, por ejemplo, utilizando la solubilidad dependiente de la temperatura del agente terapeutico o la adicion de sal al medio. Pueden usarse ciclos sucesivos de transicion de fase inversa para obtener un alto grado de pureza. Ademas de la temperatura y la fuerza ionica, otras variables ambientales utiles para modular la transicion inversa de los agentes terapeuticos incluyen pH, la adicion de solutos y disolventes inorganicos y organicos, ionization o modification qulmica de cadena lateral y presion.
En algunos casos, el componente ELP no experimenta una transicion de fase inversa reversible, o no experimenta una transicion de ese tipo en un Tt biologicamente relevante, y asl las mejoras en las propiedades biologicas y/o fisiologicas de la molecula (como se describio en otra parte en la presente description), puede ser enteramente o esencialmente independiente de cualesquiera propiedades de transicion de fase. Sin embargo, tales propiedades de transicion de fase pueden impartir ventajas practicas adicionales, por ejemplo, con relation a la recuperation y purification de tales moleculas.
En la practica de la presente invencion, el componente ELP funciona para estabilizar o mejorar de otro modo el componente VIP en la composition terapeutica.Despues de la administration de la construction VIP-ELP acoplada al paciente necesitado el agente terapeutico VIP, el componente VIP y el ELP permanecen acoplados entre si mientras que el VIP es terapeuticamente activo, por ejemplo, para el tratamiento o la profilaxis de un estado patologico o afeccion fisiologica, u otra intervention terapeutica.
En ciertos casos, los componentes ELP pueden formarse de unidades estructurales, que incluyen pero no limitado a:
(a) el tetrapeptido Val-Pro-Gly-Gly, o VPGG (sec. con num. de ident.: 1);
(b) el tetrapeptido Ile-Pro-Gly-Gly, o IPGG (sec. con num. de ident.:2);
(c) el pentapeptido Val-Pro-Gly-X-Gly (sec. con num. de ident.:3), o VPGXG, donde X es cualquier residuo de aminoacido natural o no natural, y donde X opcionalmente varla entre repeticiones polimericas u oligomericas;
(d) el pentapeptido Ala-Val-Gly-Val-Pro, o AVGVP (sec. con num. de ident.:4);
(e) el pentapeptido Ile-Pro-Gly-X-Gly, o IPGXG (sec. con num. de ident.:5), donde X es cualquier residuo de aminoacido natural o no natural, y donde X opcionalmente varla entre repeticiones polimericas u oligomericas;
(e) el pentapeptido Ile-Pro-Gly-Val-Gly, o IPGVG (sec. con num. de ident.:6);
(f) el pentapeptido Leu-Pro-Gly-X-Gly, o LPGXG (sec. con num. de ident.:7), donde X es cualquier residuo de aminoacido natural o no natural, y donde X opcionalmente varla entre repeticiones polimericas u oligomericas;
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(g) el pentapeptido Leu-Pro-Gly-Val-Gly, o LPGVG (sec. con num. de ident.:8);
(h) el hexapeptido Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly, o VAPGVG (sec. con num. de ident.:9);
(l) el octapeptido Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly, o GVGVPGVG (sec. con num. de ident.: 10);
(j) el nonapeptido Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly, o VPGFGVGAG (sec. con num. de ident.:11); y
(k) los nonapeptidos Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly, o VPGVGVPgG (sec. con num. de ident.: 12).
Tales unidades estructurales definidas por las sec. con nums. de ident.: 1-12 pueden formar unidades estructurales de repeticion, o pueden usarse en combinacion para formar un componente ELP de acuerdo con la invention. En algunas modalidades, el componente ELP se forma enteramente (o casi completamente) de una o una combinacion de (por ejemplo, 2, 3 o 4) unidades estructurales seleccionadas de sec. con nums. de ident.:1-12.En otras modalidades, se forma al menos 75 %, o al menos 80 %, o al menos 90 % del componente ELP a partir de una o una combinacion de unidades estructurales seleccionadas de sec. con nums. de ident.:1-12, y que pueden presentarse como unidades repetitivas.
En algunos casos, los componentes ELP contienen unidades de repeticion, que incluyen unidades repetitivas en tandem, del pentapeptido Val-Pro-Gly-X-Gly (sec. con num. de ident.:3), donde X es como se definio anteriormente, y donde el porcentaje de Val-Pro-Gly-X-Gly (sec. con num. de ident.:3) unidades de pentapeptido tomadas con respecto a todo el componente ELP (que puede comprender unidades estructurales distintas de VPGXG (sec. con num. de ident.:3)) es mayor que aproximadamente 75 %, o mayor que aproximadamente 85 %, o mayor que aproximadamente 95 % del componente ELP. El componente ELP puede contener motivos que tienen una repeticion de 5 a 15 unidades (por ejemplo, aproximadamente repeticion de 10 unidades o aproximadamente de 12 unidades) del pentapeptido de sec. con num. de ident.:3, con el residuo huesped X que varla entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades estructurales dentro de cada repeticion. Los residuos huespedes pueden seleccionarse independientemente, tal como a partir de los aminoacidos V, I, L, A, G y W (y pueden seleccionarse de manera que conserven una propiedad de transition de fase inversa deseada).Los motivos ilustrativos incluyen VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde los residuos huespedes son V (que pueden presentarse en de 40 % y 60 % de unidades estructurales), G (que puede presentarse en 20 % a 40 % de unidades estructurales y A (que pueden presentarse en 10 % a 30 % de unidades estructurales).El propio motivo de repeticion puede repetirse, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 veces, tal como aproximadamente 8 a 15 veces (por ejemplo, aproximadamente 12 veces), para crear un componente ELP ilustrativo. El componente ELP como se describe en este parrafo puede construirse, por supuesto, a partir de cualquiera de las unidades estructurales definidas por las sec. con nums. de ident.:1-12, o una de sus combinaciones. Un componente ELP ilustrativo se muestra en la Figura 1 fusionado al extremo C-terminal de VIP.
En algunos casos, las unidades de ELP pueden formar una estructura de giro p que proporciona una propiedad similar a la elastina (por ejemplo, transicion de fase inversa).Secuencias peptldicas ilustrativas adecuadas para crear una estructura de giro p se describen en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US96/05186, que se incorpora en la presente description como referencia en su totalidad.Por ejemplo, el cuarto residuo (X) en la secuencia de pentapeptido de elastina, VPGXG (sec. con num. de ident.:3), puede alterarse sin eliminar la formation de un giro p.
En ciertos casos, los componentes ELP incluyen repeticiones polimericas u oligomericas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde el residuo huesped X es cualquier aminoacido.X puede ser un aminoacido de origen natural o de origen no natural. En algunas modalidades, X se selecciona de alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistelna, acido glutamico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina. En algunas modalidades, X es un aminoacido natural distinto de la prolina o cistelna.
El residuo huesped X (por ejemplo, con respecto a la sec. con num. de ident.:3, u otra unidad estructural de ELP) puede ser un aminoacido no clasico (no codificado geneticamente).Ejemplos de aminoacidos no clasicos incluyen:D-isomeros de los aminoacidos comunes, acido 2,4-diaminobutlrico, acido a-amino isobutlrico, acido A-aminobutlrico, Abu, acido 2- amino butlrico, Y-Abu, £-Ahx, acido 6-amino hexanoico, Aib, acido 2-amino isobutlrico, acido 3-amino propionico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, acido cisteico, t-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoroaminoacidos, aminoacidos disenados tales como p-metil aminoacidos, Ca-metil aminoacidos, Na-metil aminoacidos, y aminoacidos analogos en general.
La selection de X puede ser independiente en cada unidad estructural de ELP (por ejemplo, para cada unidad estructural definida en la presente descripcion que tiene un residuo huesped X).Por ejemplo, X puede seleccionarse independientemente para cada unidad estructural como un aminoacido que tiene una cadena lateral cargada positivamente, un aminoacido que tiene una cadena lateral cargada negativamente, o un aminoacido que tiene una cadena lateral neutra, que incluyen en algunas modalidades, una cadena lateral hidrofobica.
Aun en otros casos, los componentes ELP pueden incluir repeticiones polimericas u oligomericas de los pentapeptidos VPGXG (sec. con num. de ident.:3), IPGXG (sec. con num. de ident.:5) o LPGXG (sec. con num. de ident.:7), o una de sus combinaciones, donde X es como se definio anteriormente.
En cada caso, las unidades estructurales, o en algunos casos las repeticiones polimericas u oligomericas, de las secuencias de ELP pueden separarse por uno o mas residuos de aminoacidos que no eliminan el efecto total de la
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molecula, es decir, como se describio al impartir ciertas mejoras al componente terapeutico. En ciertos casos, uno o mas de tales aminoacidos tampoco eliminan o afectan esencialmente las propiedades de transicion de la fase del componente ELP (con relacion a la delecion de uno o mas aminoacidos).
La estructura de los componentes ELP resultantes puede describirse usando la notacion ELPk [XiYj-n], donde k designa una unidad de repeticion ELP particular, las letras mayusculas entre corchetes son codigos de aminoacidos de una letra y sus subindices correspondientes designan la relacion relativa de cada residuo huesped X en las unidades estructurales (donde sea aplicable), y n describe la longitud total del ELP en numero de las repeticiones estructurales. Por ejemplo, ELP1 [V5A2G3-I0] designa un componente ELP que contiene 10 unidades repetitivas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde X es valina, alanina y glicina en una relacion relativa de 5:2:3; ELP1 [K1V2F1- 4] designa un componente ELP que contiene 4 unidades repetitivas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde X es lisina, valina y fenilalanina en una relacion relativa de 1:2:1; ELP1 [K1V7F1-9] designa un polipeptido que contiene 9 unidades repetitivas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde X es lisina, valina, y fenilalanina en una relacion relativa de 1:7:1; eLp1 [V1A8G7-10] designa un componente ELP que contiene 10 unidades repetitivas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde X es valina, alanina, y glicina en una relacion relativa de 1:8:7; ELP1 [V-5] designa un polipeptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde X es exclusivamente valina; ELP1 [V-20] designa un polipeptido que contiene 20 unidades repetitivas del pentapeptido VPGXG (sec. con num. de ident.:3), donde X es exclusivamente valina; ELP2 [5] designa un polipeptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapeptido AVGVP (sec. con num. de ident.:4); ELP3 [V-5] designa un polipeptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapeptido IPGXG (sec. con num. de ident.:5), donde X es exclusivamente valina; ELP4 [V-5] designa un polipeptido que contiene 5 unidades repetitivas del pentapeptido LPGXG (sec. con num. de ident.:7), donde X es exclusivamente valina. Tales componentes ELP como se describen en este parrafo pueden usarse en relacion con la presente invencion para aumentar las propiedades terapeuticas del componente terapeutico.
Ademas, la Tt es una funcion de la hidrofobicidad del residuo huesped. Asl, variando la identidad de los residuos de huesped y sus fracciones molares, pueden sintetizarse los ELP que exhiben una transicion inversa durante un intervalo de 0-100°C.Asl, la Tt a una longitud de ELP dada puede disminuirse incorporando una fraccion mayor de residuos huesped hidrofobicos en la secuencia de ELP. Los ejemplos de residuos huesped hidrofobicos adecuados incluyen valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptofano y metionina. Ademas puede usarse tirosina, que es moderadamente hidrofobica. Por el contrario, la Tt puede aumentarse incorporando residuos, tales como los seleccionados del grupo que consiste en: acido glutamico, cistelna, lisina, aspartato, alanina, asparagina, serina, treonina, glicina, arginina y glutamina; preferentemente seleccionado de alanina, serina, treonina y acido glutamico.
El componente ELP en algunos casos se selecciona o disena para proporcionar una Tt (bajo condiciones fisiologicas) en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 80°C, tal como de aproximadamente 35 a aproximadamente 60°C, o de aproximadamente 38 a aproximadamente 45°C. En algunas modalidades, la Tt es mayor que aproximadamente 40°C o mayor que aproximadamente 42°C, o mayor que aproximadamente 45°C, o mayor de aproximadamente 50°C. La temperatura de transicion, en algunas modalidades, esta por encima de la temperatura corporal del sujeto o paciente (por ejemplo, >37°C) permaneciendo de ese modo soluble in vivo, o en otras modalidades, la Tt esta por debajo de la temperatura corporal (por ejemplo, < 37°C) para proporcionar ventajas alternativas, tales como la formation in vivo de un farmaco de liberation lenta para la liberation sostenida del agente terapeutico. Ver, por ejemplo, el documento de patente num. US 2007/0009602.
La Tt del componente ELP puede modificarse variando la longitud de la cadena ELP, ya que la Tt aumenta generalmente con el PM decreciente. Para polipeptidos que tienen un peso molecular > 100.000, la escala de hidrofobicidad desarrollada por Urry y otros, (documento de patente PCT/US96/05186, que se incorpora en la presente description como referencia en su totalidad) proporciona un medio para predecir la Tt aproximada de una secuencia ELP especlfica. Sin embargo, en algunas modalidades, la longitud del componente ELP puede mantenerse relativamente pequena, manteniendo al mismo tiempo una Tt objetivo, incorporando una fraccion mayor de residuos huespedes hidrofobicos (por ejemplo, residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales hidrofobas) en la secuencia ELP. Para los polipeptidos que tienen un peso molecular <100.000, la Tt puede predecirse o determinarse mediante la siguiente funcion cuadratica: Tt = M0 + M1X + M2X2 donde X es el PM de la protelna de fusion, y M0 = 116,21; M1 = -1,7499; M2 = 0,010349.
Mientras la Tt del componente ELP, y por lo tanto del componente ELP acoplado a un componente terapeutico, se afecta por la identidad y la hidrofobicidad del residuo huesped, X, ademas pueden afectarse las propiedades adicionales de la molecula. Tales propiedades incluyen, pero no se limitan a solubilidad, biodisponibilidad, persistencia, vida media, potencia y seguridad de la molecula.
En la section de Ejemplos mas abajo, se ve que el agente VIP acoplado a ELP retiene una cantidad significativa de la actividad biologica del VIP nativo, con relacion a las formas no fusionadas de VIP. Ademas, se demuestra que los ELP exhiben largas vidas medias. De manera correspondiente, pueden usarse los ELP de acuerdo con la invencion para aumentar esencialmente (por ejemplo, en mas de 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 100 %, 200 % o mas, en modalidades especlficas) la vida media de VIP, segun se conjuga con un ELP, en comparacion con la vida media de la forma libre (no conjugada) del agente terapeutico. El VIP modificado que tiene vida media circulatoria extendida puede administrarse de
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1 a aproximadamente 10 veces por semana, tal como de 1 a aproximadamente 5, o de 1 a aproximadamente 3 veces por semana. La composicion VIP o composition farmaceutica modificada que comprende la misma puede administrarse aproximadamente una vez al dla, o aproximadamente cada dos dlas, o aproximadamente cada tercer dla, o aproximadamente una vez a la semana (es decir, una vez por semana).
Conjugation y Acoplamiento
Una protelna de fusion VIP producida de forma recombinante, de acuerdo con ciertos casos de la description incluye el componente de fusion (por ejemplo, ELP) y un VIP o un analogo de VIP asociado entre si por fusion genetica. Por ejemplo, la protelna de fusion puede generarse mediante la traduction de un polinucleotido que codifica VIP o un analogo de VIP clonado en el marco con el componente ELP.
En algunos casos, el componente ELP y VIP o un analogo de VIP pueden fusionarse usando un peptido enlazador de varias longitudes para proporcionar una mayor separation flsica y permitir una mayor movilidad espacial entre las porciones fusionadas, y as! maximizar la accesibilidad de VIP o un analogo de VIP, por ejemplo, para unirse a su receptor afln. El peptido enlazador puede consistir en aminoacidos que son flexibles o mas rlgidos. Por ejemplo, un enlazador flexible puede incluir aminoacidos que tienen cadenas laterales relativamente pequenas, y que pueden ser hidrofllicas. Sin limitation, el enlazador flexible puede comprender residuos de glicina y/o serina. Los enlazadores mas rlgidos pueden contener, por ejemplo, cadenas laterales de aminoacidos mas estericamente obstaculizantes, tales como (sin limitacion) tirosina o histidina. El enlazador puede ser menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10 o 5 residuos de aminoacidos. El enlazador puede unirse covalentemente a y entre VIP o un analogo de VIP y un componente ELP, por ejemplo, a traves de fusion recombinante.
El enlazador o espaciador de peptido puede ser escindible por proteasa o no escindible. A manera de ejemplo, los espaciadores de peptidos escindibles incluyen, sin limitacion, una secuencia de peptidos reconocida por proteasas (in vitro o in vivo) de tipo variable, tales como Tev, trombina, factor Xa, plasmina (proteasas de la sangre), metaloproteasas, catepsinas (por ejemplo, GFLG, sec. con num. de ident.:47, etc.), y proteasas encontradas en otros compartimentos corporales. En algunas modalidades que emplean enlazadores escindibles, la protelna de fusion puede ser inactiva, menos activa o menos potente como una fusion, que se activa despues de la escision del espaciador in vivo. . Alternativamente, puede emplearse cuando el agente terapeutico es suficientemente activo como un espaciador de fusion, no escindible. El espaciador no escindible puede ser de cualquier tipo adecuado, que incluyen, por ejemplo, porciones de espaciador no escindible que tienen la formula [(Gly)n-Ser]m, donde n es de 1 a 4, inclusive, y m es de 1 a 4, inclusive. Alternativamente, podrla emplearse una secuencia corta de ELP diferente de la cadena principal de ELP en lugar de un enlazador o espaciador, mientras se logra el efecto necesario.
Aun en otros casos, el agente terapeutico es una fusion recombinante que tiene un componente terapeutico flanqueado en cada extremo por un componente de ELP. Al menos uno de dichos componentes eLp puede unirse a traves de un espaciador escindible, de manera que el componente terapeutico es inactivo, pero se activa in vivo por elimination proteolltica de un solo componente ELP. Siendo activa la fusion ELP sola resultante, y que tiene una vida media mejorada (u otra propiedad descrita en la presente descripcion) in vivo.
En otros casos, la presente descripcion proporciona conjugados qulmicos de un VIP o un analogo de VIP y el componente ELP. Los conjugados pueden hacerse acoplando qulmicamente un componente ELP a VIP o un analogo de VIP por cualquier numero de metodos bien conocidos en la tecnica (Ver por ejemplo Nilsson y otros, 2005, Ann Rev Biophys Bio Structure 34:91-118).En algunos casos, el conjugado qulmico puede formarse al unir covalentemente VIP o un analogo de VIP al componente de ELP, directamente o a traves de una portion del enlazador corto o largo, a traves de uno o mas grupos funcionales sobre el componente protelnico terapeutico, por ejemplo, amina, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo, para formar un conjugado covalente. Pueden usarse varios enlazadores convencionales, por ejemplo, diisocianatos, diisotiocianatos, carbodiimidas, esteres de bis (hidroxisuccinimida), esteres de maleimida- hidroxisuccinimida, glutaraldehldo y similares.
Los espaciadores qulmicos no peptldicos pueden ser adicionalmente de cualquier tipo adecuado, que incluyen, por ejemplo, los enlazadores funcionales descritos en Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, publicado por Academic Press, Inc., 1995, y los especificados en CrossLinking Reagents Technical Handbook, disponibles de Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois), cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad. Los espaciadores qulmicos ilustrativos incluyen ligandos homobifuncionales que pueden unirse a grupos amina de Lys, as! como enlazadores heterobifuncionales que pueden unirse a Cys en un extremo, y a Lys en el otro extremo.
En algunos casos, los componentes ELP relativamente pequenos (por ejemplo, componentes ELP de menos de aproximadamente 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, o 10 kDa), que no hacen transition a temperatura ambiente (o temperatura del cuerpo humano, por ejemplo, Tt >37°C), se acoplan o reticulan qulmicamente. Por ejemplo, dos componentes ELP relativamente pequenos, que tienen las mismas o diferentes propiedades, pueden acoplarse qulmicamente. Tal acoplamiento, en algunos casos, puede tener lugar in vivo, mediante la adicion de un solo residuo de cistelna en o alrededor del extremo C-terminal de ELP. Tales componentes ELP pueden fusionarse cada uno a uno o mas componentes terapeuticos, para aumentar la actividad o avidez en el objetivo.
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Polinucleotidos, Vectores, Celulas Huespedes y Metodos de Produccion
En otro aspecto, la descripcion proporciona polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica el VIP modificado de la invencion.Tales polinucleotidos pueden adicionalmente comprender, ademas secuencias que codifican VIP o analogos de VIP y secuencias de fusion, uno o mas elementos de control de expresion. Por ejemplo, el polinucleotido puede comprender uno o mas promotores o mejoradores de la transcripcion, sitios de union ribosomicos, senales de terminacion de la transcripcion y senales de poliadenilacion, como elementos de control de la expresion. El polinucleotido puede insertarse dentro de cualquier vector adecuado, el cual puede contenerse dentro de cualquier celula huesped adecuada para la expresion, tal como E. coli.
Generalmente, un vector que comprende el polinucleotido puede introducirse en una celula para la expresion del agente terapeutico. El vector puede permanecer episomal o volverse integrado cromosomicamente, siempre que pueda transcribirse el inserto que codifica el agente terapeutico. Los vectores pueden construirse mediante la tecnologla de ADN recombinante estandar. Los vectores pueden ser plasmidos, fagos, cosmidos, fagemidos, virus o cualquier otro tipo conocido en la tecnica, que se usan para replicacion y expresion en celulas procarioticas o eucariotas. Un experto en la tecnica apreciara que una amplia variedad de componentes conocidos en la tecnica (tales como elementos de control de expresion) pueden incluirse en tales vectores, que incluyen una amplia variedad de senales de transcripcion, tales como promotores y otras secuencias que regulan la union de la ARN polimerasa sobre el promotor. Cualquier promotor conocido por ser efectivo en las celulas en las que se expresara el vector puede usarse para iniciar la expresion del agente terapeutico. Los promotores adecuados pueden ser inducibles o constitutivos.
En ciertos casos, el VIP modificado se expresa a partir de E. coli u otro sistema de expresion bacteriano. E. coli generalmente no eliminara la metionina de N-terminal durante la expresion, de manera que la molecula VIP modificada mantiene la especificidad del receptor. Pueden emplearse otros sistemas de expresion de acuerdo con la invencion, que incluyen sistemas de expresion de levadura, sistemas de expresion de celulas de mamlfero y sistemas de baculovirus.
La protelna terapeutica, cuando se emplean secuencias de fusion de ELP, puede recuperarse por ciclaje de temperatura inversa. Especlficamente, como se describio anteriormente, el componente ELP experimenta una transicion de fase inversa reversible. Es decir, los componentes ELP se desordenan estructuralmente y son altamente solubles en agua por debajo de una temperatura de transicion (Tt), pero exhiben una sostenida (intervalo de 2-3°C) transicion de fase de desorden a orden cuando la temperatura se eleva por encima de la Tt, conduciendo a la desolvatacion y agregacion de los componentes ELP. Por ejemplo, el ELP forma pollmeros insolubles, cuando alcanza un tamano suficiente, que puede facilmente eliminarse y aislarse de la solucion por centrifugacion. Tal transicion de fase es reversible, y los ELP insolubles aislados pueden completamente resolubilizarse en solucion tampon cuando la temperatura regresa por debajo de la Tt de los ELP. Asl, los agentes terapeuticos de la invencion pueden, en algunas modalidades, separarse de otras protelnas contaminantes con alta pureza usando procedimientos de ciclaje de transicion inverso, por ejemplo, utilizando la solubilidad dependiente de la temperatura del agente terapeutico o la adicion de sal al medio. Pueden usarse ciclos sucesivos de transicion de fase inversa para obtener un alto grado de pureza. Ademas de la temperatura y la fuerza ionica, otras variables ambientales utiles para modular la transicion inversa de los agentes terapeuticos incluyen pH, la adicion de solutos y disolventes inorganicos y organicos, ionizacion o modificacion qulmica de cadena lateral y presion.
Composiciones farmaceuticas y Metodos de Administracion
La presente invencion proporciona ademas composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad efectiva del VIP modificado de la invencion (como se describio anteriormente) junto con un portador, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable. Tales composiciones farmaceuticas son efectivas para tratar o mejorar, por ejemplo, enfermedad autoinmune o inflamatoria, como se describe en la presente descripcion.
Los agentes terapeuticos de la invencion pueden administrarse per se asl como en varias formas que incluyen esteres, sales y otros derivados fisiologicamente funcionales farmaceuticamente aceptables de estos. En tales formulaciones farmaceuticas, los agentes terapeuticos pueden usarse exclusivamente, o juntos (que incluyen formulados con) otros ingredientes terapeuticos, tales como agentes antiinflamatorios o inmunosupresores.
Los portadores deben ser farmaceuticamente aceptables en el sentido de que son compatibles con los otros ingredientes de la formulacion y no son indebidamente perjudiciales para el receptor de estos.
Las formulaciones del agente terapeutico incluyen aquellas adecuadas para la administracion parenteral asl como no parenteral. Las modalidades de administracion ilustrativas incluyen oral, bucal, topica, nasal, subcutanea, intramuscular e intravenosa, entre otras. Se prefieren formulaciones adecuadas para la administracion parenteral.
Las formulaciones que comprenden el agente terapeutico de la presente invencion pueden presentarse convenientemente en formas de dosificacion unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. Tales metodos incluyen generalmente la etapa de poner los agentes terapeuticos en asociacion con un portador que constituye uno o mas ingredientes accesorios. Tlpicamente, las formulaciones se
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preparan al poner uniformemente e Intimamente el agente terapeutico en asociacion con un portador llquido, un portador solido finamente dividido, o ambos, y despues, si es necesario, moldear el producto en formas de dosificacion de la formulacion deseada.
Las formulaciones adecuadas para la administracion parenteral comprenden convenientemente una preparacion esteril acuosa del agente terapeutico, que es preferentemente isotonico con la sangre del receptor (por ejemplo, solucion salina). Tales formulaciones pueden incluir agentes de suspension y agentes espesantes u otros sistemas de micropartlculas que se disenan para dirigir el agente terapeutico a la circulacion o a uno o mas organos. Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosis unitaria o multidosis.
Ademas de los ingredientes mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invencion pueden incluir ademas uno o mas ingredientes accesorios seleccionados de diluyentes, tampones, agentes saborizantes, desintegrantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (que incluyen antioxidantes) y similares.
Aunque un experto en la tecnica puede determinar la dosis deseable en cada caso (que incluyen una dosis unitaria para la administracion de liberacion lenta), una dosis adecuada del agente terapeutico para el logro del beneficio terapeutico, puede estar, por ejemplo, en una intervalo de aproximadamente 1 microgramo (pg) a aproximadamente 100 miligramos (mg) por kilogramo de peso corporal del receptor, o en un intervalo de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, o en un intervalo de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal. La dosis deseada puede presentarse como una dosis o dos o mas subdosis administradas a intervalos apropiados durante todo el perlodo de dosificacion (por ejemplo, una semana, dos semanas, etc...).Estas subdosis pueden administrarse en formas de dosificacion unitarias, por ejemplo, que contienen de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 200 mg, o de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 100 mg de ingrediente activo por forma de dosificacion unitaria. Alternativamente, si la afeccion del receptor as! lo requiere, las dosis pueden administrarse como una infusion continua.
El modo de administracion y las formas de dosificacion afectaran por supuesto la cantidad terapeutica del agente terapeutico activo peptldico que es deseable y efectivo para una aplicacion de tratamiento dado. Por ejemplo, las dosis administradas oralmente pueden ser al menos dos veces, por ejemplo, 2-10 veces, los niveles de dosificacion usados en los metodos de administracion parenteral. Las formulaciones de liberacion lenta ademas permitiran que se suministre significativamente mas agente terapeutico, de manera que el agente tenga una liberacion sostenida durante el tiempo.
El VIP que circula en el plasma de individuos normales proviene de las fibras nerviosas que contienen VIP en el tracto gastrointestinal y ademas refleja el exceso de peptidos de los nervios vasculares (Cugini y otros, 1991, Reg Pept 34:141 -8).Al igual que la mayorla de las protelnas vasoactivas, VIP tiene una vida media relativamente corta. La vida media del VIP en la sangre es menos de 2 minutos (Domschke y otros, 1978, Gut 19:1049-53; Burhol y otros, 1978, Scand J Gastroent 13:807-813).Una ventaja de los VIP modificados descritos en la presente descripcion es la vida media extendida o la persistencia en el cuerpo. De acuerdo con ciertos casos de la invencion, el VIP se puede administrarse de 1 a aproximadamente 10 veces por semana, tal como de 1 a aproximadamente 5, o de 1 a aproximadamente 3 veces por semana. La composicion VIP o composition farmaceutica modificada que comprende la misma puede administrarse aproximadamente una vez al dla, o aproximadamente cada dos dlas, o aproximadamente cada tercer dla, o aproximadamente una vez a la semana.
En ciertas modalidades, el VIP modificado se administra por via parenteral, tal como por inyeccion subcutanea o intramuscular. La administracion puede ser una dosis unitaria del VIP modificado como se describe en la presente descripcion.
El VIP modificado, cuando se administra por via parenteral, puede administrarse una vez al dla, o una o dos veces por semana, o de una a cinco veces al mes. En estas modalidades, el VIP modificado puede administrarse como un peptido de fusion soluble, que persiste en la circulacion, como se describe en la presente descripcion, para proporcionar actividad sostenida con una administracion relativamente infrecuente. El VIP modificado puede administrarse como farmaco de liberacion lenta, como ademas se describe en la presente descripcion, para proporcionar una liberacion sostenida del peptido de fusion en la circulacion durante el tiempo. Ver el documento de patente US 2007/0009602, que se incorpora en la presente descripcion como referencia.
Metodos de Uso
En otros aspectos, la descripcion que comprende la invencion proporciona tratar, mejorar o prevenir una afeccion en un mamlfero. Tales afecciones incluyen una variedad de afecciones cardiovasculares, inmunologicas (por ejemplo, autoinmunes) y neurologicas. Por ejemplo, el VIP modificado puede usarse para ajustar el equilibrio entre efectores proinflamatorios y antiinflamatorios en un paciente, que incluyen un paciente que sufre de una enfermedad autoinmune o una afeccion inflamatoria. Las indicaciones ilustrativas para el VIP modificado incluyen hipertension, fibrosis miocardica, insuficiencia cardlaca, cardiomiopatla, diabetes, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), artritis, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), enfermedad de Parkinson, traumatismo cerebral y asma.
La invencion proporciona as! un metodo para tratar una variedad de afecciones, que incluyen afecciones caracterizadas
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por autoinmunidad o inflamacion. El metodo comprende administrar una cantidad efectiva del VIP modificado de la invencion a un paciente necesitado.
Hipertension
En varias modalidades descritas en la presente descripcion, la presente invencion proporciona metodos para tratar o prevenir la hipertension en un paciente necesitado, que comprende administrar una cantidad efectiva del VIP modificado. Las formas de hipertension tratables con los VIP modificados de la presente invencion incluyen hipertension pulmonar, hipertension esencial no controlada e hipertension resistente.
La hipertension pulmonar es una enfermedad relativamente rara, pero altamente mortal, caracterizada por hipertension arterial pulmonar progresiva y aumento del engrosamiento de las arterias y arteriolas pulmonares mas pequenas, culminando en el fallo del ventrlculo derecho (RV) (Said y otros, 2007, Circulation 115:1260-8).VIP se ha relacionado con la circulation pulmonar y sistemica. Con respecto al lecho vascular pulmonar y sus alteraciones en la hipertension pulmonar, el VIP relaja el musculo liso vascular pulmonar de varias especies de mamlferos in vitro, neutraliza o atenua las acciones de la endotelina y otros vasoconstrictores, reduce la vasoconstriction pulmonar hipoxica e inhibe la proliferation musculo liso vascular pulmonar de pacientes con hipertension pulmonar. Ademas, VIP es un cotransmisor del sistema fisiologico no adrenergico, no colinergico de la relajacion del musculo liso vascular pulmonar. Ademas, se ha observado que los nervios que contienen VIP, normalmente abundantes en la arteria pulmonar, estan ausentes en las arterias pulmonares de pacientes con hipertension pulmonar, y la inhalation del peptido tiene un efecto terapeutico beneficioso sobre estos pacientes (Petkov y otros, 2003, J. Clin /nvest.111:1339-1346).Por ultimo, los estudios han demostrado que la terapia de reemplazo de VIP en ratones VIP-/- es capaz de prevenir o al menos retardar la progresion de los principales cambios patologicos en la hipertension pulmonar (Said y otros, 2007, Circulation 115:1260-8).Asl, puede esperarse que la aplicacion de VIP a pacientes con hipertension pulmonar resulte en una mejora sustancial de los parametros hemodinamicos y pronosticos de la enfermedad (Petkov y otros, 2003, J. Clin /nvest.111:1339-1346).
La hipertension esencial no controlada es la presion arterial que es consistentemente mas alta de lo normal cuando no se puede encontrar ninguna causa para la presion arterial alta. La hipertension esencial es el tipo de hipertension mas prevalente, que afecta al 90-95 % de los pacientes hipertensos (Carretero y otros, 2000, Circulation 101:329-35) y los expertos creen que se causa por varios factores no descubiertos. Las concentraciones de VIP se disminuyen en ratas hipertensivas esenciales, propensas a un accidente cerebrovascular (Mori y otros, 1993, Jpn Heart J. 34:785-94) y el uso de VIP humano con liposomas estabilizados estericamente puede normalizar la presion arterial sistemica en hamsteres espontaneamente hipertensos (Onyuksel y otros, 2006, Peptides 27:2271-5).
La hipertension resistente es una forma de presion arterial alta que no responde al tratamiento (es decir, la presion arterial sigue siendo alta incluso cuando se administra una combination de farmacos).Las causas del mal control de la presion arterial son numerosas. Las causas mas probables son la sobrecarga de volumen debido al exceso de ingesta de sodio, la intolerancia a los medicamentos, el incumplimiento y la hipertension secundaria (Graves JW, 2000, Mayo Clin Prac 75:278-84).Como potente vasodilatador sistemico, el VIP tiene utilidad para el tratamiento y la prevention de la hipertension en pacientes que producen las caracterlsticas de la hipertension resistente.
Enfermedad cardlaca
En casos adicionales, la presente descripcion que comprende la invencion proporciona metodos para tratar o prevenir enfermedades del corazon en un paciente necesitado, que comprende administrar una cantidad efectiva del VIP modificado. Las formas de enfermedad cardlaca tratables con los VIP modificados de la presente invencion incluyen fibrosis miocardica, insuficiencia cardlaca y cardiomiopatla.
Los cambios en la slntesis y secretion de VIP en el corazon parecen desempenar un papel en la patogenesis de varias enfermedades, tales como la insuficiencia cardlaca y la fibrosis miocardica (Dvorakova MC, 2005, Drug News Perspect.18:387-91).Por ejemplo, la concentration de VIP se disminuye significativamente tanto en tejidos de pacientes con cardiomiopatla como en tejido cardlaco de modelos animales de insuficiencia cardlaca (Unverferth y otros, 1986, J. Lab Clin Med 108:11-16).Ademas, la degradation del VIP se aumenta en los corazones con fibrosis y, consecuentemente, disminuye la concentracion de VIP de miocardio. Asl, VIP disminuido parece ser un factor importante en la patogenesis de la enfermedad (Ye y otros, 2003, Acta Physiol Scand 179:353-60) y las concentraciones de VIP disminuidas se asocian con un empeoramiento progresivo de la insuficiencia cardlaca. El uso del inhibidor de vasopeptidasa omapatrilat, que se sabe que disminuye la velocidad de aclaramiento metabolico de VIP, resulto en una disminucion de la presion arterial sistolica, asl como una disminucion de la fibrosis miocardica en comparacion con el control (Ye y otros, 2004, Eur J Pharmacol 485:235-42).Ademas se informo un efecto protector del VIP en el miocardio isquemico y reperfundido (Kalfin y otros, 1994, J Pharmacol Exp Ther 268:952-8).Por lo tanto, puede esperarse que la aplicacion de los VIP modificados de la presente invencion tenga un efecto beneficioso en una variedad de afecciones patologicas, que incluyen insuficiencia cardlaca, cardiomiopatla y fibrosis miocardica.
Diabetes Mellitus Tipo 2
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En casos adicionales, la presente descripcion proporciona metodos para tratar o prevenir la diabetes en un paciente necesitado, que comprende administrar una cantidad efectiva del VIP modificado. Especlficamente, los VIP modificados de la presente invencion tienen utilidad para el tratamiento y prevencion de la diabetes mellitus tipo 2.
Los estudios han demostrado que el contenido de VIP del antro gastrico y duodeno de ratas diabeticas es significativamente menor que el de ratas normales (Gozes y otros, 2004, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18:623- 640).Los bajos niveles tisulares de VIP en el tracto gastroduodenal pueden contribuir en parte a la motilidad intestinal anormal observada en pacientes diabeticos (Adeghate y otros, 2001, Arch Phys Bioc 109:246-51).VIP estimula la secrecion de insulina de celulas de insulinoma, islotes pancreaticos de raton y pancreas perfundido de rata.La activacion de VPAC1 se ha implicado en la elevacion de la produccion de glucosa (Gozes y otros, 2004, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18:623-640), mientras que el receptor VPAC2 de VIP se expresa en las celulas p de los islotes pancreaticos y su activacion provoca una elevacion del AMP clclico y la estimulacion de la secrecion de insulina (DeSouza y otros, 2009, Nature Reviews 8:361-7).Ademas, el VIP estimula la secrecion de glucagon en seres humanos, resultando la liberacion de glucosa del hlgado. En conjunto, estos estudios revelan que el VIP tiene amplios efectos directos sobre el metabolismo de la glucosa. Como consecuencia, puede esperarse que VIP y las formas modificadas de VIP, tales como los peptidos de fusion descritos en la presente descripcion, sean una terapia util para el tratamiento y la prevencion de la diabetes tipo 2.
Preferencia de Receptor VPAC2
En algunas modalidades, tales como donde el VIP modificado tiene una mayor preferencia por VPAC2 en comparacion con VIP no modificado, el VIP modificado puede reducir las respuestas inflamatorias, tales como las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado, en un paciente. En algunas de tales modalidades, el VIP modificado reduce el desarrollo de celulas T autorreactivas. En estas modalidades, el paciente puede tener una o mas afecciones definidas por inflamacion del tipo TH1 o autoinmunidad TH1, tales como artritis (que incluye RA), Enfermedad Inflamatoria Intestinal (por ejemplo, Enfermedad de Crohn), diabetes tipo 1, esclerosis multiple, rechazo de trasplante, slndrome de Sjogren, pancreatitis, uveoretinitis, queratitis y choque septico.
Preferencia de Receptor VPAC1
En algunas modalidades, tales como donde el VIP modificado tiene una mayor preferencia por VPAC1 en comparacion con VIP no modificado, el VIP modificado puede promover respuestas inflamatorias TH1, tales como respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado, en unos pacientes. En estas modalidades, el paciente puede tener una o mas afecciones asociadas con la inmunidad de TH2, tales como asma o enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD). La COPD es una enfermedad inflamatoria cronica de las vlas respiratorias, que afecta tantos como 8% de los individuos en las naciones industrializadas. Existe un aumento en el numero de mujeres y hombres que padecen COPD. La hipertension pulmonar es un slntoma comun de obstruction cronica del flujo de aire, pero los mecanismos precisos de aumento de la resistencia vascular son poco claros. Las posibles causas de la hipertension pulmonar en la COPD incluyen la destruction enfisematosa del lecho capilar, la remodelacion de los vasos pulmonares y la vasoconstriction pulmonar hipoxica.
VIP es una de las moleculas mas abundantes que se encuentran en el tracto respiratorio. Debido a sus propiedades antiinflamatorias y broncodilatadoras, se ha propuesto como un tratamiento novedoso para la COPD y el asma. Aunque la regulation positiva de VPAC1 es dominante, tanto VPAC1 como VPAC2 son necesarios para la serialization anti inflamatoria optima (Burian y otros, 2010, Peptides 31:603-8).En consecuencia, puede esperarse que el tratamiento con VIP y formas modificadas de VIP, tales como los peptidos de fusion descritos en la presente descripcion, ayuden a disminuir la inflamacion cronica en el pulmon de pacientes con COPD y asma.
La presente invencion se ilustra ademas por los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
donation de las construcciones VIP-ELP
La secuencia de ADN del peptido VIP fue como se describio en Simoncsits y otrosfSvnthesis. cloning and expression in Escherichia coli of artificial genes coding for biologically active elongated precursors of the vasoactive intestinal polypeptide, Eur.J.Biochem.1988, 178(2):343-350, que se incorpora en la presente descripcion como referencia en su totalidad, excepto que el residuo 17 fue la metionina nativa y no tenia ninguna de las extensiones C-terminales descritas (Ver sec. con num. de ident.: 16).
Se prepararon dos variantes iniciales, una con una metionina en el extremo N-terminal, debido al codon de inicio ATG requerido, (PB1046, sec. con num. de ident.: 17) y uno con el tripeptido MAA en el extremo N-terminal (PB1047, sec. con num. de ident.: 18). La metionina sobre PB1046 normalmente se eliminarla por metionina aminopeptidasa (MA), pero como la histidina es el segundo residuo y uno de los aminoacidos menos favorecidos en esta position para mA, la
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metionina no se elimina.La metionina sobre PB1047 se elimino para dejar AA, que despues puede eliminarse in vitro o in vivo por DPPIV para dar la histidina como residuo N-terminal. La secuencia de aDn de VIP se clono en el vector pPB1031 (ver la Figura 3) que porta la secuencia de ADN de ELP1-120 para dar un casete de expresion bajo el control del promotor T7.
Los oligonucleotidos sinteticos P0045 (sec. con num. de ident.:31), P0048 (sec. con num. de ident.:32), P0064 (sec. con num. de ident.:33) y P0065 (sec. con num. de ident.:34) se alinearon juntos, se digirieron con la enzima de restriccion Xbal y se ligaron en el plasmido pPB1031 que se habla digerido con las enzimas de restriccion Xbal/Kpnl para dar el plasmido de expresion pPB1046 (ver la Figura 4).
Los oligonucleotidos sinteticos P0066 (sec. con num. de ident.:35), P0064 (sec. con num. de ident.:33), P0067 (sec. con num. de ident.:36) y P0065 (sec. con num. de ident.:34) se alinearon juntos, se digirieron con la enzima de restriccion Xbal y se ligaron en el plasmido pPB1031 que se habla digerido con las enzimas de restriccion Xbal/Kpnl para dar el plasmido de expresion pPB1047 (ver la Figura 5).
Ademas, y suponiendo que el extremo N-terminal no fue un requisito absoluto para la actividad, ademas se hizo una fusion C-terminal (ver la Figura 6).Los oligonucleotidos sinteticos P0068 (sec. con num. de ident.:37) y P0069 (sec. con num. de ident.:38) se alinearon juntos y se ligaron en el plasmido pPB1031 que se habla digerido con las enzimas de restriccion BglI/NheI para dar el plasmido de expresion pPB1048.
Ejemplo 2
Expresion de las construcciones VIP-ELP
La cepa de produccion E.coli BLR (Novogen) se transformo con los plasmidos pB1046, pPB1047 y pPB1048 y se cultivo en medio rico en frascos de agitacion a 37 °C durante la noche. Los sedimentos de las celulas se resuspendieron en tampon TE pH 8,0, se lisaron a traves de un microfluidizador (Microfluidics), se centrifugaron para eliminar el material insoluble y el producto se purifico a partir del lisado soluble resultante mediante "transicion" (ref) con la adicion de NaCl a 3M. Las muestras se tomaron a traves de otras dos rondas de transicion para dar las muestras purificadas finales. Estos se analizaron mediante SDS-PAGE y se encontro que PB1046 y PB1047 daban dos bandas (ver la Figura 7).Asumiendo esto fue como resultado de la proteolisis, los cultivos se crecieron de nuevo, pero esta vez, antes de la lisis, se calentaron a 60°C durante 15 minutos. El analisis con gel NuPAGE Tris-Acetato al 10 % indico que la proteolisis habla sido inhibida (ver la Figura 7).
La proteolisis fue, muy probablemente, dentro del peptido y probablemente cerca de la union del peptido y ELP ya que no se observo ruptura en la fusion C-terminal de PB1048.Es posible prevenir la proteolisis mediante la desnaturalizacion termica de las proteasas antes de la lisis de las celulas, lo que tenderla a implicar proteasas periplasmicas en lugar de una proteasa citosolica, o una proteasa citosolica que se activo o se comporta de manera diferente tras la lisis.
Ejemplo 3
Actividad de la protelna de fusion VIP-ELP modificada in vitro
Para medir la actividad biologica in vitro y la potencia de las protelnas de fusion VIP o VIP-ELP, se uso un bioensayo basado en celulas. El ensayo mide el aumento de la concentracion intracelular de monofosfato clclico de adenosina (cAMP) en respuesta al tratamiento con protelnas VIP o de fusion VIP-ELP en celulas de ovario de hamster chino (CHO) que se han manipulado para expresar ya sea el Receptor 2 del Peptido Intestinal Vasoactivo humano (VPAC2) o el Receptor 1 del Peptido Intestinal Vasoactivo humano (VPAC1).Tanto las protelnas VIP como de fusion VIP-ELP pueden estimular la produccion de cAMP en estas celulas, lo que indica que las protelnas de fusion retienen la capacidad de unirse y activar el receptor. Dado que la cantidad de acumulacion de cAMP en las celulas despues de la union y activacion del ligando mediada por receptor es directamente proporcional a la cantidad de peptido intacto o protelna de fusion presente, el ensayo puede usarse para determinar la bioactividad y la potencia relativa.
En este ejemplo, se probo la actividad de las protelnas de fusion VIP-ELP PB1046 y PB1047.La construccion PB1046 contiene VIP con una Met en el extremo N-terminal y la construccion PB1047 contiene VIP con Ala-Ala en su extremo N- terminal. Ambas construcciones tienen ELP (1-120) en su extremo C-terminal. En el primer experimento, se probo la actividad de las construcciones usando celulas CHO que expresan el receptor VPAC2 de VIP. Despues de 30 minutos de incubacion de varias concentraciones de las protelnas de fusion con la celula, se lisaron las celulas y se midio la cantidad de cAMP producido usando un kit comercial.PB1047 se trato con DPP-IV antes de la adicion a las celulas. La Figura 8 muestra el resultado. Como se muestra, la protelna de fusion VIP modificada PB1046 es algo mas activa que la protelna VIP nativa, mientras que PB1047 es menos activa.
La actividad de PB1046 y PB1047 ademas se probo usando celulas CHO que expresan el receptor VPAC1 de VIP. Despues de 30 minutos de incubacion de varias concentraciones de las protelnas de fusion con celulas CHO, se lisaron las celulas y se midio la cantidad de cAMP producido usando un kit comercial.PB1047 se trato con DPP-IV antes de la adicion a las celulas. La Figura 9 muestra el resultado. Esta vez, la protelna de fusion VIP modificada PB1046 es mucho
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menos activa que la protelna VIP nativa, mientras que la actividad relativa de PB1047 frente al VIP nativo es aproximadamente la misma que en el ensayo para el receptor VPAC2.Estos resultados sugieren que PB1046 activa selectivamente el receptor VPAC2 sobre el receptor VPAC1.
Ejemplo 4
Efecto de la protelna de fusion VIP-ELP en la presion arterial
La actividad de la protelna de fusion VIP-ELP modificada PB1047 ademas se probo in vivo. Especlficamente, se probaron los efectos de la protelna de fusion VIP-ELP en la presion arterial. Ratas espontaneamente hipertensas se trataron por via subcutanea con PB1047 (10 mg/kg) o control de tampon y sus presiones arteriales se midieron en varios puntos despues de la administracion de la protelna de fusion. Se usaron cinco animales para cada grupo y los graficos muestran el promedio y la desviacion estandar.PB1047 redujo significativamente la presion arterial sistolica y diastolica en estos animales durante al menos 12 horas despues de la administracion (ver la Figura 10), lo que indica que la protelna de fusion VIP-ELP es activa y puede usarse potencialmente como farmacos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con VIP.
Ejemplo 5
Protelnas de fusion VIP-ELP adicionales
El tratamiento con DPP IV de PB1047 resulto en la eliminacion tanto de AA como HS del extremo N-terminal, y la inactivacion del peptido. Por lo tanto, se construyo el plasmido pPB1064, donde el extremo N-terminal se cambio a MAAHG, sec. con num. de ident.:45, en lugar de MAAHS, sec. con num. de ident.:46, porque HG es mas resistente a DPP IV que HS.
Ademas se construyo el plasmido pPB1056, que codifica un VIP con un enlazador de carga opuesta (sec. con num. de ident.:20) basado en la VPGXG, sec. con num. de ident.:3, repeticion antes de ELP.
Ejemplo 6
Clonacion, Expresion y Analisis de una Protelna de Fusion VIP-ELP Adicional, PB1120
La secuencia de ADN de VIP se clono en el vector pPB1120 (sec. con num. de ident.:48) (ver la Figura 11) que lleva la secuencia de ADN de ELP1-120 para dar un casete de expresion bajo el control del promotor T7.A continuacion, la cepa de produccion E. coli BRL se transformo con el plasmido pPB1120 y se cultivo en medio rico como se describio anteriormente. Se purificaron muestras del peptido de fusion VIP-ELP1-120 resultante, PB1120, y se analizaron a traves de SDS-PAGE.
La actividad del peptido de fusion PB1120 se probo in vitro. La actividad se probo usando un ensayo utilizando celulas CHO que expresan el receptor de VIP (VPAC1) como se describio anteriormente en el Ejemplo 3.Como muestra la Figura 12, PB1120 fue aproximadamente 1,4 veces menos activo que el peptido VIP nativo en el receptor VPAC1.Por comparacion, la construccion PB1046 que contiene un residuo de metionina N-terminal fue aproximadamente 11 veces menos activo que el peptido VIP nativo. En el transcurso de experimentos multiples, PB1120 estuvo aproximadamente desde 1,4 a 6 veces menos activo que el peptido VIP nativo en el receptor VPAC1.
La Figura 13 ilustra la actividad de PB1120 para el receptor VPAC2.Al igual que los resultados observados para el receptor VPAC1, PB1120 muestra ligeramente menos actividad (-1,5 veces menos) que el peptido VIP nativo para VPAC2.Sin embargo, a diferencia de los resultados observados con VPAC1, PB1046 fue equipotente para VPAC2 en comparacion con el peptido nativo. En el transcurso de experimentos multiples, PB1120 fue aproximadamente desde 1,5 a 7 veces menos activo que el peptido VIP nativo en el receptor VPAC2.
Ejemplo 7
Perfil farmacocinetico de la protelna de fusion VIP-ELP modificada PB1120
Ademas de los ensayos de potencia biologica descritos anteriormente, ademas se examino el perfil farmacocinetico de la protelna de fusion VIP-ELP PB1120.A los monos se les administro una sola inyeccion subcutanea (SC) (dosificada a 3 mg/kg) de PB1120 y las concentraciones plasmaticas de farmaco se midieron diariamente a lo largo de una semana. Se usaron tres animales y los graficos muestran el promedio y la desviacion estandar. Mas de la mitad de la dosis inicial de PB1120 permanecio en la circulacion al dla 4 (ver las Figuras 14A y 14B, que ilustran las concentraciones plasmaticas medias de PB1120 despues de la administracion SC usando ejes lineales y semilogarltmicos, respectivamente).
Basandose en estos datos, parece haber una fase de absorcion prolongada despues de la administracion subcutanea de PB1120, consistente con una absorcion lenta desde el sitio de administracion. La vida media de eliminacion aparente
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(tA), basada en la decadencia de las concentraciones plasmaticas, oscilo de 9,9 a 45,8 h y probablemente refleja la absorcion lenta en lugar de la verdadera eliminacion. Estos datos indican que la proteina de fusion VIP-ELP tiene una vida media dramaticamente extendida en comparacion con VIP nativo y puede administrarse potencialmente a intervalos extendidos (por ejemplo, puede administrarse aproximadamente una vez al dia, aproximadamente cada dos dias, aproximadamente cada tercer dia, o aproximadamente una vez por semana).
Ejemplo 8
Efectos de la Proteina de Fusion VIP-ELP Modificada PB1120 en la Presion Arterial
Para medir los efectos de la proteina de fusion VIP-ELP modificada PB1120 en la presion arterial sistolica, diastolica y media, se administro a las ratas inyecciones subcutaneas solas de 0,1 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/Kg de PB1120 y se evaluaron durante intervalos de 3 horas. Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran el cambio promedio en la presion arterial sistolica, diastolica y media, respectivamente. La Figura 15D muestra la frecuencia cardiaca promedio durante intervalos de 3 h a continuacion de la administracion de PB1120.Como demuestran las Figuras 15A-C, las ratas inyectadas con 1 mg/kg o 5 mg/kg de PB1120 mostraron reducciones significativas en la presion arterial sistolica, diastolica y media 9 horas despues de la inyeccion, lo que indica que la proteina de fusion VIP-ELP PB1120 puede administrarse potencialmente para el proposito de tratar o prevenir la hipertension en individuos afectados.
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientificos en la presente description tienen el mismo significado que el conocido comunmente por los expertos en la tecnica a la que pertenece esta invention. Aunque cualquiera de los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripcion pueden usarse en la practica o las pruebas de la presente invencion, los materiales y metodos preferidos se describen en la presente descripcion.

Claims (15)

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    Reivindicaciones
    1. Una composicion farmaceutica que comprende un peptido VIP que comprende (i) la secuencia de aminoacidos de la sec. con num. de ident.: 13 con la His N-terminal en la posicion 2, y (ii) una metionina N-terminal que aumenta la preferencia del peptido VIP para VPAC2 frente a VPAC1 y que tiene un peptido similar a la elastina (ELP) en el extremo C-terminal prolongando la fase de absorcion desde un sitio de inyeccion y extendiendo la vida media circulatoria, el ELP que tiene de 75 a 130 unidades de VPGXG (sec. con num. de ident.:3) donde la composicion de X es Val, Ala y Gly en una relacion de 5:2:3.
  2. 2. La composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 1, en donde el peptido VIP tiene una preferencia de union relativa para VPAC2 sobre VPAC1 de al menos 2:1 o al menos 50:1.
  3. 3. La composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la composicion se formula para la administracion parenteral.
  4. 4. La composicion de conformidad con la reivindicacion 3, en donde la composicion se formula para la administracion subcutanea, intramuscular o intravenosa.
  5. 5. La composicion de conformidad con la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4 para su uso en un metodo para tratar la hipertension, insuficiencia cardlaca, fibrosis miocardica o reducir las respuestas inflamatorias en un sujeto, el metodo que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion.
  6. 6. La composicion para su uso en el tratamiento de la hipertension de conformidad con la reivindicacion 5, en donde el sujeto tiene hipertension seleccionada de hipertension pulmonar, hipertension esencial no controlada e hipertension resistente.
  7. 7. La composicion para su uso en el tratamiento de respuestas inflamatorias de conformidad con la reivindicacion 5, en donde el sujeto tiene una respuesta inflamatoria seleccionada de respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado, desarrollo de celulas T autorreactivas y una afeccion definida por inflamacion de tipo TH1 o autoinmunidad TH1.
  8. 8. La composicion para su uso de conformidad con la reivindicacion 7, en donde el sujeto tiene una afeccion definida por inflamacion del tipo TH1 o autoinmunidad TH1 seleccionada de artritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, diabetes tipo 1, esclerosis multiple, rechazo de trasplantes, slndrome de Sjogren, pancreatitis, uveoretinitis, queratitis y choque septico.
  9. 9. La composicion para su uso de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde en el metodo la composicion se administra de una a tres veces por semana, o se administra diariamente.
  10. 10. La composicion farmaceutica de conformidad con la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4 para su uso como un medicamento.
    sec. con num. de ident.: 14 M-VIP ELP1-120 (M anadido al extremo N-terminal de VIP) MHSDAVFTONYTRIRKOMAVKKYLNSILN
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGWP (sec.con num. de ident.: 14)
    ELP1-120 = (VPGXG)uo donde X = V5GjA2
    sec. con num. de ident.: 15
    MAA-VIP ELP1-120 (antes del procesamiento, MAA anadido al extremo N-terminal de VIP)
    MAAHSDAVFTDNYTRLRKOMAVKKYLNSILN
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGWP (sec.con num. de ident.:15)
    ELP1-120 = (VPGXG)ijo donde X = VjGjA?
    imagen1
    imagen2
    PPB1046
    6975 bps
    a
    rvip
    PM MOB
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    AAttCTCTA OAAATAATTT
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    TGATAAC
    i i 11
    tatcctgaae
    egg
    gca
    acgggccgga tccgaactcg
    a
    IJiCC
    geeg
    aggectaage
    imagen5
    NuPAGE Tris-Acetato al 10%
    M. Marcadores de Peso Mol.
    1.
    PB1046
  11. 2.
    PB1046 Calentado*
  12. 3.
    PB1047
  13. 4.
    PB1047 Calentado*
  14. 5.
    PB1048
    6
    PB1048 Calentado*
    M. Marcadores de Peso Mol.
    Micromol de cAMP
    imagen6
    Ajuste 4-P: y - (A - 0)/( 1 ♦ <x/C)AB ) ♦ O; A
    • VIP Peptido (VIP2: concentration vs Resultado medio 0.269 ■ PB1046 (A2: concentration vs Resultado medio) 0.248
    A PB1047 (C2: concentration vs Resultado medio) 0.232
    a
    C fi fi*z
    Q.8S9
    >6 2 >4.3 0999
  15. 0.909
    9. S3 IS 1 0.999
    1.19
    77.3 >5 1
    Micromol de cAMP
    imagen7

    Ajuste 4-P: y - (A • 0)/( 1 ♦ («/C)^8 ) + 0: A B

    • PB1047 (B: concentration vs Re&ultado medio) 0-182 1.73

    ■ PB1046 (C: concentration vs Resultado medio) 0.224 0.96

    OPeptido VIP (VIP: concentration vs Resultado medio) 0.386 2.15

    C Q

    2 66 6.87 1

    1.88e*082.72e+06 0.993 0.379 6.32 0.997
    Pres ion arterial sistolica (mm Hg)
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    Concent racion(nM)
    □ PB1120
    Q PeptidoVIP
    PB1046
    imagen11
    VSP R2
    mo ■
    £QG-
    1000
    Concentracion(nM)
    Q Peptido UIP
    ;' : PB1120
    PBtC46
    imagen12
    imagen13
    sistolica durante intervalos de 3 Hrs
    Vehiculo
    -m- PB1120 0 1mg/kg SC
    PB1120 Img/kg SC
    PB1120 5mg/kg SC
    -10
    Tiempo transcurrldo (hr)
    imagen14
    diastolica durante intervalos de 3 Hrs.
    Vehicu o
    PB1120 0 1mo/kg SC
    PB1120 1mg/kg SC
    PB1120 5mg/kg SC
    10-.
    10
    -20
    Tiempo transcurrido (hr)
    imagen15
    media durante intervalos de 3 Hrs.
    Vehiculo
    PB1120 0 1mg/kg SC
    PB1120 Img/kg SC
    PB1120 5mg/kg SC
    10-
    Tiempo transcurrido (hr)
    imagen16
    Frecuencia cardiaca promedio
    durante interva os de 3 Hrs.
    ■wo
    Vehfculo
    ♦ PB1120 0 1mg/kg SC
    P1120 1rr>g/kg SC
    P1120 5mg/kg SC
    aw
    Tiempo transcurrido (hr)
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