ES2669190T3 - Uso de péptidos intestinales vasoactivos modificados en el tratamiento de la hipertensión - Google Patents

Uso de péptidos intestinales vasoactivos modificados en el tratamiento de la hipertensión Download PDF

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Abstract

Un péptido intestinal vasoactivo (VIP) que tiene preferencia de unión por el Receptor de Péptido Intestinal Vasoactivo 2 (VPAC2), para usar en terapia combinada con al menos un fármaco antihipertensivo seleccionado de un antagonista del receptor ß1, un inhibidor de la ACE y un bloqueador de canales de calcio para usar en el tratamiento de la hipertensión en un paciente, en donde el VIP comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 13 con la His N-terminal en la posición 2, una metionina N-terminal y un péptido de tipo elastina (ELP) en el C-terminal, en donde el ELP comprende al menos 90 repeticiones de la sec. con núm. de ident.: 3, y en donde el VIP demuestra una vida media prolongada en la circulación.

Description

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DESCRIPCION
Uso de péptidos intestinales vasoactivos modificados en el tratamiento de la hipertensión Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para tratar la hipertensión. Más particularmente, la presente invención se refiere al tratamiento de la hipertensión mediante el uso de una combinación de un péptido intestinal vasoactivo modificado (VIP) que tiene preferencia de unión por el receptor VPAC2 y al menos un fármaco antihipertensivo.
Antecedentes
La hipertensión es una condición médica prevalente que se caracteriza por una presión sanguínea anormalmente alta en las arterias. Aproximadamente 65 millones de adultos en los Estados Unidos son afectados por la hipertensión. Ver Egan y otros, 2010, JAMA 303(20): 2043-2050. La condición también afecta a niños y adolescentes. Clínicamente, la hipertensión se define como una presión sistólica de 140 mm Hg o más y una presión diastólica de 90 mm Hg o más. Si no se le da tratamiento, la presión arterial alta aumenta el riesgo de complicaciones cardiovasculares como aneurismas, ataques cardíacos, insuficiencia cardíaca, así como insuficiencia renal.
Los tratamientos actuales para la hipertensión incluyen cambios en el estilo de vida así como terapia con fármacos. Las principales clases de fármacos antihipertensivos incluyen, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), antagonistas del receptor p1 (antagonistas beta adrenérgicos), bloqueadores de los canales de calcio y diuréticos. Sin embargo, un número significativo de pacientes hipertensos son resistentes y no responden a dichos fármacos. En consecuencia, continúa existiendo la necesidad de nuevos métodos para el tratamiento de la hipertensión.
Los péptidos intestinales vasoactivos modificados y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se describen en WO2011/020091.
Resumen de la invención
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que un péptido vasoactivo modificado (VIP) que tiene una preferencia de unión por VPAC2 puede proporcionar un control de la presión arterial de acción prolongada, sinérgicamente con terapias antihipertensivas concomitantes. Por consiguiente, la presente invención, como se menciona en las reivindicaciones adjuntas, proporciona un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 y al menos un fármaco antihipertensivo para su uso en terapia combinada, y composiciones para el tratamiento de la hipertensión.
En un aspecto, la invención proporciona un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 para su uso en terapia combinada con al menos un fármaco antihipertensivo seleccionado de un antagonista del receptor p1, un inhibidor de la ACE y un bloqueador de los canales de calcio para su uso en el tratamiento de la hipertensión en un paciente, en donde el VIP comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 13
(MHSDAVFTDNYTRLRKOMAVKKYLNSILN) con la His del N-terminal en la posición 2, una metionina en el N-terminal, y un péptido de tipo elastina (ELP) en el C-terminal, en donde el ELP comprende al menos 90 repeticiones de la sec. con núm. de ident.: 3 (VPGXG), y en donde el VIP demuestra un tiempo prolongado de vida media en la circulación. La presente invención es para el uso en el tratamiento, por ejemplo, de hipertensión pulmonar, hipertensión esencial no controlada o hipertensión resistente. En algunas modalidades, el paciente presenta insuficiencia cardíaca crónica, y el VIP modificado es una terapia complementaria. En algunas modalidades, el paciente se somete a tratamiento para la hipertensión, incluyendo el tratamiento con uno o más de un antagonista del receptor p1, un inhibidor de ACE y un bloqueador de los canales de calcio.
En una modalidad, el VIP modificado induce vasorelajación en un paciente. En otra modalidad, el VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 induce la disminución de cualquiera de la presión sistólica, la presión diastólica y la presión arterial media.
El VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 puede administrarse mediante el uso de cualquier vía de administración adecuada, tal como por inyección subcutánea. En ciertas modalidades, el VIP modificado se administra aproximadamente una vez al día o aproximadamente una vez por semana. En una modalidad, donde el VIP modificado tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. ident.:14, el VIP modificado se administra en una dosis de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal. En otra modalidad, el VIP modificado se administra en una dosis de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 10 miligramos por kilogramo de peso corporal.
En una modalidad, el fármaco antihipertensivo y el VIP descrito se administran por separado. En una modalidad, el antagonista del receptor p1 es atenolol. En otra modalidad, el inhibidor de ACE es ramipril. En una modalidad adicional, el bloqueador de los canales de calcio es amlodipino.
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En diversas modalidades, se contempla que el co-tratamiento del VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 y el fármaco antihipertensivo produce ventajas sinérgicas, o efectos aditivos, o de cualquier otra manera ventajas terapéuticas inesperadas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 y al menos un fármaco hipertensivo que se selecciona de un antagonista del receptor p1, un inhibidor de ACE y un bloqueador de los canales de calcio, en donde la composición se formula para una dosis de una vez por día, o en donde la composición se formula para una dosis de una vez por semana.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión VIP modificado-ELP (M-VIP-ELP1-120, sec. con núm. de ident.: 14) que tiene Met en el N-terminal y 120 unidades de ELP1 (VPGXG, sec. con núm. de ident.: 3) fusionado al VIP en el C-terminal.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión VIP modificado-ELP (MAA-VIP-ELP1-120, sec. con núm. de ident.: 15) que tiene Met-Ala-Ala en el extremo N-terminal, que es activable al péptido VIP maduro natural, y 120 unidades de ELP1 (VPGXG, sec. con núm. de ident.: 3) fusionadas al VIP en el C-terminal.
La Figura 3 es un mapa del plásmido pPB1031, que codifica ELP1-120 para la producción conveniente de fusiones recombinantes.
La Figura 4 representa pPB1046 que codifica una proteína de fusión M-VIP-ELP1-120 (sec. con núm. de ident.: 23). Se muestran los cebadores (P0045, sec. con núm. de ident.: 16, P0048, sec. con núm. de ident.: 17 y P0065, sec. con núm. de ident.: 18) para la construcción del gen recombinante.
La Figura 5 representa pPB1047 que codifica una proteína de fusión MAA-VIP-ELP1-120 (sec. con núm. de ident.: 24). Se muestran los cebadores (P0066, sec. con núm. de ident.: 19, P0064, sec. con núm. de ident.: 20, P0067, sec. con núm. de ident.: 21) para la construcción del gen recombinante.
La Figura 6 muestra la actividad in vitro para el receptor VPAC2 de VIP nativo y las proteínas de fusión VIP-ELP PB1046 y PB1047.
La Figura 7 muestra la actividad in vitro para el receptor VPAC1 de VIP nativo y las proteínas de fusión VIP-ELP PB1046y P1047.
La Figura 8 muestra el efecto in vivo de PB1047 en la presión sanguínea de ratas. El panel de la izquierda muestra la presión arterial sistólica. El panel de la derecha muestra la presión arterial diastólica. VIP-ELP reduce la presión arterial durante un período de más de 12 horas.
La Figura 9 es un mapa del plásmido pPB1120, que codifica VIP-ELP1-120.
La Figura 10 muestra la actividad in vitro para el receptor VPAC1 de VIP nativo y las proteínas de fusión VIP-ELP PB1120 y PB1046.
La Figura 11 muestra la actividad in vitro para el receptor VPAC2 de VIP nativo y las proteínas de fusión VIP-ELP PB1120 y PB1046.
La Figura 12 muestra el perfil farmacocinético de la proteína de fusión VIP-ELP PB1120 en monos (n=3) después de una inyección subcutánea única de 3 mg/kg con ejes lineales. La Figura 12B muestra el perfil farmacocinético de la proteína de fusión VIP-ELP PB1120 con ejes semilogarítmicos.
Las Figuras 13A, 13B y 13C muestran el cambio promedio en la presión arterial sistólica, diastólica y media, respectivamente, durante intervalos de 3 horas en ratas inyectadas por vía subcutánea con PB1120 a una dosis de 0.1 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg. La Figura 13D muestra la frecuencia cardíaca promedio de las ratas en cuestión durante intervalos de 3 horas después de la administración de PB1120.
Las Figuras 14A, 14B y 14C muestran que el control sostenido de la presión sanguínea dependiente de la dosis con PB1046 (Vasomera™) es independiente de la función del receptor p adrenérgico en ratas espontáneamente hipertensas.
Las Figuras 15A, 15B y 15C muestran que la administración concomitante de PB1046 (Vasomera™) y los antihipertensivos - atenolol, amlodipino o ramipril da como resultado efectos terapéuticos potenciados.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención, como se menciona en las reivindicaciones adjuntas, se refiere a un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 y al menos un fármaco antihipertensivo para su uso en terapia combinada, y composiciones, para tratar la hipertensión. Más específicamente, la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 puede proporcionar un control sinérgico de la presión sanguínea con terapias antihipertensivas concomitantes. En consecuencia, la presente invención proporciona ventajas específicas para tratar la hipertensión, tales como el control sostenido de la presión sanguínea, una mejor eficacia del tratamiento y/o efectos secundarios reducidos. En algunas modalidades, el paciente tiene insuficiencia cardíaca congestiva, y el VIP es una terapia complementaria.
El péptido intestinal vasoactivo (VIP) es una hormona peptídica que contiene 28 residuos de aminoácidos. VIP exhibe una amplia variedad de acciones biológicas que incluyen, por ejemplo, vasodilatación sistémica, hipotensión, dilatación coronaria, broncodilatación y aumento del gasto cardíaco en animales y humanos. Más específicamente, VIP tiene un efecto beneficioso en la presión sanguínea y pulmonar y tiene un gran potencial como agente terapéutico para la hipertensión.
Existen al menos dos receptores para VIP, que incluyen el Receptor de Péptido Intestinal Vasoactivo 1 (VPAC1) y el Receptor de Péptido Intestinal Vasoactivo 2 (VPAC2). Estos receptores se unen tanto al VIP como a la molécula relacionada: polipéptido activador de la adenilato ciclasa pituitaria (PACAP). Ambos receptores son miembros de la familia de receptores de siete dominios transmembranales acoplados a proteína G. VPAC1 se distribuye, por ejemplo, en el sistema nervioso central (CNS), hígado, pulmón, intestino y linfocitos T. VPAC2 se encuentra, por ejemplo, en el CNS, el páncreas, el músculo esquelético, el corazón, el riñón, el tejido adiposo, los testículos y el estómago.
Sin embargo, la corta vida media de VIP provoca que el péptido natural sea poco práctico como agente farmacéutico. Ver Pozo D, y otros, Peptides 28(9):1833-1846 (2007). De hecho, estudios han demostrado que la vida media de VIP en la sangre es de menos de dos minutos (Domschke y otros, 1978, Gut 19: 1049-53; Burhol y otros, 1978, Scand J Gastroent 13: 807-813). Además, la variedad de efectos biológicos de VIP puede complicar su desarrollo para cualquier indicación particular.
En diversas modalidades que se describen en la presente descripción, se proporcionan métodos para tratar la hipertensión en un paciente, que comprenden administrar una cantidad eficaz de un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 y uno o más fármacos antihipertensivos, o administrar un VIP que tiene preferencia de unión por VPAC2 a un paciente que se somete a tratamiento con uno o más de los siguientes: antagonista del receptor p1, un inhibidor de ACE y un bloqueador de los canales de calcio. Las formas de hipertensión tratables con la presente invención incluyen hipertensión pulmonar, hipertensión esencial no controlada e hipertensión resistente.
La hipertensión pulmonar es una enfermedad relativamente rara pero altamente mortal caracterizada por hipertensión arterial pulmonar progresiva y aumento del engrosamiento de las arterias y arteriolas pulmonares más pequeñas, que culmina en insuficiencia del ventrículo derecho (RV) (Said y otros, 2007, Circulation 115: 1260-8). VIP se relaciona con la circulación pulmonar y sistémica. Con respecto al lecho vascular pulmonar y sus alteraciones en la hipertensión pulmonar, VIP relaja el músculo liso vascular pulmonar de varias especies de mamíferos, in vitro, neutraliza o atenúa las acciones de la endotelina y otros vasoconstrictores, reduce la vasoconstricción pulmonar hipóxica e inhibe la proliferación del músculo liso vascular pulmonar de pacientes con hipertensión pulmonar. Además, VIP es un cotransmisor del sistema fisiológico no adrenérgico, no colinérgico de relajación del músculo liso vascular pulmonar.
La hipertensión esencial no controlada es la presión arterial consistentemente más alta de lo normal cuando no puede encontrarse una causa para la presión arterial alta. La hipertensión esencial es el tipo de hipertensión más prevalente, que afecta del 90-95% de los pacientes hipertensos (Carretero y otros, 2000, Circulation 101: 329-35). Las concentraciones de VIP disminuyen en ratas hipertensas esenciales propensas a ataques cerebrales (Mori y otros, 1993, Jpn Heart J. 34: 785-94) y el uso de VIP de humano con liposomas estabilizados estéricamente puede normalizar la presión arterial sistémica en hámster espontáneamente hipertensos (Onyuksel y otros, 2006, Peptides 27: 2271-5).
La hipertensión resistente es una forma de presión arterial alta que no responde al tratamiento (por ejemplo, la presión arterial permanece alta incluso cuando se administra una combinación de medicamentos). Las causas del control deficiente de la presión arterial son numerosas. Las causas más probables son la sobrecarga de volumen debido al consumo excesivo de sodio, la intolerancia a los medicamentos, el incumplimiento y la hipertensión secundaria. (Graves JW, 2000, Mayo Clin Prac 75: 278-84).
Los tratamientos actuales para la hipertensión incluyen cambios en el estilo de vida así como terapia con fármacos. De los tratamientos no farmacológicos para la hipertensión, la reducción de peso y la restricción de sal se consideran los más exitosos. Sin embargo, existen varios fármacos disponibles para aquellos pacientes cuya presión arterial no puede mantenerse en un intervalo aceptable mediante tratamientos no farmacológicos. Las principales clases de fármacos antihipertensivos incluyen, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), antagonistas del receptor p1 (antagonistas beta adrenérgicos), bloqueadores de los canales de calcio y diuréticos.
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Los inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE) bloquean la producción de angiotensina II, una hormona que normalmente causa vasoconstricción. Como resultado, los vasos sanguíneos se dilatan y la presión arterial se reduce. Además, la angiotensina II estimula la liberación de aldosterona, una hormona responsable de la retención de sodio. En consecuencia, los inhibidores de la ACE también disminuyen la presión arterial al imitar el efecto de los diuréticos. Los ejemplos de inhibidores de la ACE incluyen, por ejemplo, enalapril, captopril, fosinopril, lisinopril, moexipril, perindopril, quinapril, ramipril y trandolapril.
Los antagonistas del receptor p1 (antagonistas beta adrenérgicos) bloquean la unión de la norepinefrina y la epinefrina (adrenalina) a los receptores beta en los nervios, reduciendo de esta manera la frecuencia cardíaca. Como resultado, el corazón late más lentamente y con menos fuerza y la presión arterial se reduce. Además, los antagonistas del receptor p1 también causan vasodilatación, reduciendo aún más la presión arterial. Los ejemplos de antagonistas del receptor p1 incluyen acebutolol, atenolol, bisoprolol, metoprolol, nadolol, nebivolol y propranolol.
Los bloqueadores de los canales de calcio evitan que el calcio ingrese a las células musculares del corazón y los vasos sanguíneos, lo que reduce la presión arterial. Más específicamente, los bloqueadores de los canales de calcio relajan y dilatan los vasos sanguíneos al afectar las células musculares en las paredes arteriales. Los bloqueadores de los canales de calcio incluyen, por ejemplo, amlodipino, diltiazem, felodipina, isradipina, nicardipina, nifedipina, nisoldipina y verapamilo.
Los diuréticos provocan que el cuerpo excrete agua y sal. Esto conduce a una reducción en el volumen plasmático, disminuyendo de esta manera la presión arterial sistémica. Los diuréticos incluyen, por ejemplo, furosemida, hidroclorotiazida y espironolactona.
Todos los fármacos antihipertensivos mencionados anteriormente tienen efectos secundarios. Además, un número significativo de pacientes hipertensos son resistentes y no responden a dichos fármacos. La presente invención se basa en el descubrimiento de que puede obtenerse un aumento en eficacia del tratamiento y/o una reducción de los efectos secundarios a través del co-tratamiento con un péptido intestinal vasoactivo modificado con preferencia de unión por VPAC2 y uno de los fármacos más antihipertensivos tales como un inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina (ACE), un antagonista beta adrenérgico y un bloqueador de los canales de calcio.
El péptido vasoactivo intestinal (VIP) es una hormona peptídica que contiene 28 residuos de aminoácidos y se produce en muchas áreas del cuerpo humano, incluidos el intestino, el páncreas y los núcleos supraquiasmáticos del hipotálamo en el cerebro. VIP exhibe una amplia variedad de acciones biológicas en animales y humanos que incluyen vasodilatación sistémica, hipotensión, aumento del gasto cardíaco, estimulación respiratoria, hiperglucemia, dilatación coronaria, broncodilatación. VIP también afecta el equilibrio del sistema inmune.
VIP tiene un efecto en varias partes del cuerpo. Con respecto al sistema digestivo, VIP puede inducir relajación del músculo liso (esfínter esofágico inferior, estómago, vesícula biliar), estimular la secreción de agua en el jugo pancreático y la bilis, y causar la inhibición de la secreción y absorción de ácido gástrico desde la luz intestinal. Su función en el intestino es estimular la secreción de agua y electrolitos, así como dilatar el músculo liso intestinal, dilatar los vasos sanguíneos periféricos, estimular la secreción de bicarbonato pancreático e inhibir la secreción de ácido gástrico estimulada por gastrina. Estos efectos contribuyen mutuamente a aumentar la motilidad. VIP tiene la función de estimular la secreción de pepsinógeno por las células principales.
El VIP se ha encontrado en el corazón y tiene efectos significativos en el sistema cardiovascular. Causa vasodilatación coronaria, así como también tiene un efecto inotrópico y cronotrópico positivo.
El VIP maduro tiene 28 residuos de aminoácidos con la siguiente secuencia: HSDAVFTDNYTRLRKOMAVKKYLNSILN (sec. con núm. de ident.: 22). VIP se obtiene a partir del procesamiento de la molécula precursora de 170 aminoácidos prepro-VIP. Las estructuras de VIP y los análogos ilustrativos se describen en las Patentes de Estados Unidos núms. 4,835,252, 4,939,224, 5,141,924, 4,734,400, 4,605,641, 6,080,837, 6,316,593, 5,677,419, 5,972,883, 6,489,297, 7,094,755, y 6,608,174.
Varias mutaciones para mejorar la estabilidad del péptido ante las proteasas etc.se detallan en la literatura (ver Onune y otros, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2009). Estos péptidos VIP modificados pueden tener una sustitución M17L para prevenir la oxidación de Met, una o más sustituciones seleccionadas entre K15R, K20R y K21R para aumentar la estabilidad proteolítica, y/o una sustitución seleccionada entre N24A y S25A para aumentar la estabilidad proteolítica/térmica.
Los péptidos VIP modificados que incluyen una o más de estas modificaciones, y con modificaciones VIP adicionales se describen en la presente descripción.
En diversas modalidades que se describen en la presente descripción, se proporciona un VIP modificado (por ejemplo, que comprende la sec. con núm. de ident.: 13) (o un análogo funcional como se describió en la presente descripción). Generalmente, los análogos funcionales de VIP incluyen fragmentos funcionales truncados en el extremo N o C en 1 a
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10 aminoácidos, que incluyen 1, 2, 3 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos (con respecto a la sec. con núm. de ident.: 13). Tales análogos funcionales pueden contener de 1 a 5 inserciones de aminoácidos, deleciones y/o sustituciones (colectivamente) con respecto a la secuencia nativa (por ejemplo, sec. con núm. de ident.: 22), y en cada caso reteniendo la actividad del péptido (por ejemplo, a través de la unión a VPAC2). Dicha actividad puede confirmarse o ensayarse mediante el uso de cualquier ensayo disponible, que incluye un ensayo descrito en la presente descripción, e incluyendo cualquier ensayo adecuado para determinar o cuantificar una actividad descrita en Delgado y otros, 2004, Pharmacol. Revisiones 56(2):249-290. En estas u otras modalidades, el componente VIP del VIP modificado tiene al menos aproximadamente 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 97% de identidad con la secuencia madura nativa (sec. con núm. de ident.: 13 ). La determinación de la identidad de secuencia entre dos secuencias (por ejemplo, entre una secuencia nativa y un análogo funcional) puede realizarse usando cualquier herramienta de alineamiento, incluyendo la que se describe en Tatusova y otros, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250.
En un aspecto, se proporciona una molécula VIP modificado que tiene preferencia de receptor por VPAC2, en comparación con VIP no modificado. (por ejemplo, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 22). Por ejemplo, el VIP modificado puede tener una preferencia relativa de unión por VPAC2 sobre VPAC1 de al menos aproximadamente 2:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 500:1 o más. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el VIP modificado activa el receptor VPAC2 sustancialmente como el VIP maduro de humano, no modificado, es decir, con una EC50 dentro de un factor de aproximadamente 2 del VIP maduro de humano, no modificado (sec. con núm. de ident.: 22). Sin embargo, este mismo VIP modificado es 50 o 100 veces o más, menos efectivo que el VIP maduro de humano no modificado, en la activación del receptor VPAC1.
Dichas moléculas VIP modificadas pueden contener regiones N-terminales modificadas, tales como una adición de 1 a aproximadamente 500 aminoácidos a la histidina N-terminal del VIP, que puede incluir una secuencia de aminoácidos heteróloga de mamífero. Por ejemplo, el VIP modificado puede contener una sola metionina en el lado N-terminal de la histidina N-terminal natural del VIP maduro. Esta molécula también se prepara convenientemente en E. coli u otro sistema de expresión bacteriano, ya que la metionina no se eliminará por E coli cuando el aminoácido adyacente es histidina. Alternativamente, el aminoácido N-terminal puede ser cualquiera de los aminoácidos naturales, específicamente alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina y prolina.
La secuencia adicional añadida al extremo N-terminal del VIP puede ser de cualquier secuencia, que incluye secuencias biológicamente activas y biológicamente inertes de 1 a aproximadamente 100, 1 a aproximadamente 50, 1 a aproximadamente 20, 1 a aproximadamente 10, y 1 a aproximadamente 5 aminoácidos.
El extremo N del VIP modificado puede tener la estructura M-N, donde M es metionina y N es el extremo N de la molécula VIP (por ejemplo, sec. con núm. de ident. 14, FIGURA 1). Esta metionina permite la traducción de la proteína en una célula huésped bacteriana o eucariota. Por lo tanto, el VIP modificado puede producirse en un sistema biológico, que incluye sistemas de expresión bacterianos y de levadura (por ejemplo, E. coli). Si bien la metionina en ocasiones puede eliminarse por la metionina aminopeptidasa (MA) en sistemas de expresión bacterianos, la histidina (H) es uno de los residuos menos favorables en la posición 2 para MA.
Aún en otras modalidades más, el extremo N se modifica a través de la fusión con una proteína heteróloga de mamífero, tal como una proteína de mamífero efectiva para prolongar la vida media de las moléculas terapéuticas. Dichas secuencias pueden ser secuencias de mamífero, tales como albúmina, transferrina o secuencias de Fc de anticuerpos. Dichas secuencias se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 7,238,667 (particularmente con respecto a los conjugados de albúmina),en la patente de Estados Unidos núm. 7,176,278 (particularmente con respecto a los conjugados de transferrina), y en la patente de Estados Unidos núm. 5,766,883.
En estas u otras modalidades, las modificaciones químicas al N-terminal del VIP pueden proporcionar preferencia por un receptor. La modificación química de proteínas y los métodos de esta se conocen bien en la técnica. Las modificaciones químicas ilustrativas no limitativas son PEGilación, metilglioxalación, alquilación reductiva, oxidación con ácido perfórmico, succinilación, aminoetilación y lipidación (Clifton, New Protein Techniques, Nueva Jersey: Humana Press (1985) ISBX. 0-89603-126-8. Volumen 3 de Methods in Molecular Biology). Los grupos químicos, como la PEGilación, pueden unirse mediante modificaciones de los grupos cisteína, metionina, histidina, lisina, arginina, triptófano, tirosina y carboxilo, y se han descrito previamente (ver Lundblad, Techniques in Protein Modification, CRC Press (1995)).
Fusiones a Polímeros Bioelásticos
En algunas modalidades, el VIP de la descripción contiene un componente polimérico bioelástico N-terminal y/o C- terminal. Un "polímero bioelástico" puede exhibir una transición inversa con la temperatura. Los polímeros bioelásticos son conocidos y se describen en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos núm. 5.520.672 de Urry y otros. Los polímeros bioelásticos pueden ser polipéptidos que comprenden unidades elastoméricas de pentapéptidos, tetrapéptidos y/o nonapéptidos (por ejemplo" péptidos similares a elastina"). Los polímeros bioelásticos que pueden usarse se exponen en la Patente de Estados Unidos núm. 4.474.851, que describe un número de unidades repetidas de tetrapéptido y pentapéptido que pueden usarse para formar un polímero bioelástico. Los polímeros bioelásticos
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específicos también se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 4,132,746;4,187,852;4,500,700;4,589,882; y 4,870,055. Otros ejemplos adicionales de polímeros bioelásticos se exponen en la patente de Estados Unidos núm. 6,699,294, la patente de Estados Unidos núm. 6,753,311, y la patente de Estados Unidos núm. 6,063,061.
En una modalidad, los polímeros bioelásticos son polipéptidos de fórmula general (VPGXG)m donde X es cualquier aminoácido (por ejemplo, Ala, Leu, Phe) y m es de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, o aproximadamente 50 a aproximadamente 180. En modalidades ilustrativas de la descripción, m es 60, 90, 120, 150 o 180. La frecuencia de varios aminoácidos como el cuarto aminoácido puede cambiarse, así como también la identidad de X.
Por ejemplo, los polímeros bioelásticos pueden comprender unidades elastoméricas repetidas que se seleccionan entre pentapéptidos y tetrapéptidos bioelásticos, donde las unidades repetidas comprenden residuos de aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste en aminoácidos hidrófóbicos y residuos de glicina y donde las unidades repetidas existen en una conformación que tiene un giro beta de la fórmula:
Rj R2
imagen1
o r3
en donde R1-R5 representan cadenas laterales de los residuos de aminoácidos 1-5, y m es 0 cuando la unidad repetida es un tetrapéptido o 1 cuando la unidad repetida es un pentapéptido. Las unidades repetidas de nonapéptido generalmente consisten en tetrapéptidos y pentapéptidos secuenciales. Los restos de aminoácidos hidrofóbicos se seleccionan entre alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. En muchos casos, el primer residuo de aminoácido de la unidad que repetida es un residuo de valina, leucina, isoleucina o fenilalanina; el segundo residuo de aminoácido es un residuo de prolina; el tercer residuo de aminoácido es un residuo de glicina; y el cuarto residuo de aminoácido es glicina o un residuo muy hidrófobo tal como triptófano, fenilalanina o tirosina. Los ejemplos particulares incluyen el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly, el tetrapéptido GGVP, el tetrapéptido GGFP, el tetrapéptido GGAP, el pentapéptido Val-Pro-Gly-Val-Gly, el pentapéptido GVGVP, el pentapéptido GKGVP, el pentapéptido GVGFP, el pentapéptido GFGFP, el pentapéptido GEGVP, el pentapéptido GFGVP y el pentapéptido GVGIP. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,699,294.
En ciertas modalidades ilustrativas, el VIP contiene un componente ELP N-terminal y/o C-terminal. El componente ELP comprende o consiste en unidades peptídicas estructurales o secuencias relacionadas con, o derivadas de, la proteína elastina. Dichas secuencias son útiles para mejorar una o más de las propiedades de las proteínas terapéuticas ya sea la biodisponibilidad, dosis terapéutica efectiva y/o frecuencia de administración, acción biológica, compatibilidad de formulación, resistencia a la proteólisis, solubilidad, vida media u otra medida de persistencia en el cuerpo subsecuente a la administración, y/o velocidad de eliminación del cuerpo. Ver, por ejemplo, la Publicación Internacional de Patente de Estados Unidos núm. WO 2008/030968.
Cuando el ELP se posiciona en el extremo C de VIP, pueden realizarse modificaciones adicionales en el N-terminal del VIP, tal como la adición de uno o más aminoácidos, tal como se describió anteriormente. En modalidades alternativas, no existen tales modificaciones en el N-terminal del VIP.
El componente ELP se construye a partir de unidades estructurales de tres a aproximadamente veinte aminoácidos, o en algunas modalidades, de cuatro a diez aminoácidos, tales como cinco o seis aminoácidos. La longitud de las unidades estructurales individuales, en un componente ELP particular, puede variar o puede ser uniforme. En ciertas modalidades, el componente ELP está compuesto por un motivo de politetra, polipenta, polihexa, polihepta, poliocta y polinonapeptido unidades estructurales repetidas. Las unidades estructurales ilustrativas incluyen unidades que se definen por las sec. con núms. de ident.: 1-12 (ver a continuación), que pueden emplearse como unidades estructurales repetidas, que incluyen unidades repetidas en tándem, o pueden emplearse en alguna combinación, para crear un ELP efectivo para mejorar las propiedades del componente terapéutico. Por lo tanto, el componente ELP puede comprender o consistir esencialmente en unidad(es) estructural(es) seleccionada(s) de las sec. con núms. de ident.: 1-12, como se define más abajo.
El componente ELP, que comprende tales unidades estructurales, puede ser de diferentes tamaños. Por ejemplo, el componente ELP puede comprender o consistir esencialmente en de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 unidades estructurales, o en ciertas modalidades de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 unidades estructurales, o en ciertas modalidades de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 unidades estructurales, o de aproximadamente 75 a aproximadamente 130 unidades estructurales, incluyendo una o una combinación de unidades definidas por las sec. con núms. de ident.: 1-12. El componente ELP puede tener aproximadamente 120 unidades
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estructurales, tales como repeticiones de unidades estructurales definidas por las sec. con núms. de ident.: 3 (definidas más abajo). Así, el componente ELP puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 residuos de aminoácidos, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 600 residuos de aminoácidos, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 residuos de aminoácidos, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 residuos de aminoácidos.
En algunas modalidades, el componente ELP, o en algunos casos el agente terapéutico, tiene un tamaño menor a aproximadamente 150 kDa, o menor a aproximadamente 100 kDa, o menor a aproximadamente 55 kDa, o menor a aproximadamente 50 kDa, o menor a aproximadamente 40 kDa, o menor a aproximadamente 30 o 25 kDa.
En algunas modalidades, el componente ELP en el estado no transicionado puede tener una forma extendida, relativamente no estructurada y no globular para evadir la filtración del riñón. En tales modalidades, los agentes terapéuticos de la invención tienen un peso molecular menor que el límite de corte que se reconoce generalmente para la filtración a través del riñón, tal como menor a aproximadamente 60 kDa, o en algunas modalidades menor a aproximadamente 55, 50, 45, 40, 30 o 25 kDa y, sin embargo, persiste en el cuerpo al menos en 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces o 100 veces más que una contraparte terapéutica desacoplada (por ejemplo, sin fusionar o sin conjugar).
En estas u otras modalidades, el componente ELP no tiene un impacto sustancial o significativo en la acción biológica del péptido terapéutico. De este modo, el VIP fusionado a ELP de la presente invención puede mostrar una potencia (acción biológica) que es igual o similar a su contraparte no fusionada. El VIP fusionado a ELP de la presente invención puede exhibir una potencia o nivel de acción biológica (por ejemplo, como se ha probado in vitro o in vivo) de 10-100% de la exhibida por la contraparte no fusionada en el mismo ensayo. En diversas modalidades, el VIP (activado) fusionado a ELP de la presente invención puede mostrar una potencia o nivel de acción biológica (por ejemplo, como se ha probado in vitro o in vivo) de al menos 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% o más del exhibido por la contraparte no fusionada.
En ciertas modalidades, el componente ELP experimenta una transición inversa de fase reversible. Es decir, los componentes ELP son desordenados estructuralmente y altamente solubles en agua por debajo de una temperatura de transición (Tt), pero exhiben una transición aguda de fase de desorden a orden (intervalo de 2-3°C) cuando la temperatura se eleva por encima de la Tt, lo que lleva a la desolvatación y agregación de los componentes ELP. Por ejemplo, el ELP forma polímeros insolubles, cuando alcanzan un tamaño suficiente, que pueden eliminarse fácilmente y aislarse de la solución mediante centrifugación. Dicha transición de fase es reversible, y los ELP insolubles aislados pueden resolubilizarse completamente en solución tampón cuando la temperatura se devuelve por debajo de la Tt de los ELP. Por lo tanto, los agentes terapéuticos de la invención pueden, en algunas modalidades, separarse de otras proteínas contaminantes con alta pureza mediante el uso de procedimientos de ciclación de transición inversa, por ejemplo, utilizando la solubilidad dependiente de la temperatura del agente terapéutico, o adición de sal al medio. Se pueden usar ciclos sucesivos de transición inversa de fase para obtener un alto grado de pureza. Además de la temperatura y la fuerza iónica, otras variables ambientales útiles para modular la transición inversa de los agentes terapéuticos incluyen el pH, la adición de solutos y disolventes inorgánicos y orgánicos, la ionización o modificación química de la cadena lateral, y la presión.
En ciertas modalidades, el componente ELP no experimenta una transición inversa de fase reversible, o no experimenta dicha transición en una Tt biológicamente relevante, y por lo tanto las mejoras en las propiedades biológicas y/o fisiológicas de la molécula (como se describe en otra parte de la presente descripción), puede ser total o sustancialmente independiente de cualquier propiedad de transición de fase. Sin embargo, tales propiedades de transición de fase pueden proporcionar ventajas prácticas adicionales, por ejemplo, en relación con la recuperación y purificación de tales moléculas.
En la práctica de la presente invención, el componente ELP funciona para estabilizar o de otro modo mejorar el componente VIP en la composición terapéutica. Después de la administración de la construcción acoplada VIP-ELP al paciente que necesita el agente terapéutico VIP, el componente VIP y el ELP permanecen acoplados entre sí mientras que el VIP es terapéuticamente activo, por ejemplo, para el tratamiento y/o mejora de la hipertensión.
En ciertas modalidades de la descripción, el (los) componente(s) ELP pueden estar formados por unidades estructurales, que incluyen pero no se limitan a:
(a) el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly o VPGG (sec. con núm. de ident.: 1);
(b) el tetrapéptido Ile-Pro-Gly-Gly o IPGG (sec. con núm. de ident.: 2);
(c) el pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (sec. con núm. de ident.: 3), o VPGXG, donde X es cualquier residuo de aminoácido natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;
(d) el pentapéptido Ala-Val-Gly-Val-Pro o AVGVP (sec. con núm. de ident.: 4);
(e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-X-Gly, o IPGXG (sec. con núm. de ident.: 5), donde X es cualquier residuo de aminoácido natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;
(e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-Val-Gly o IPGVG (sec. con núm. de ident.: 6);
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(f) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-X-Gly, o LPGXG (sec. con núm. de ident.: 7), donde X es cualquier residuo de aminoácido natural o no natural, y donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas;
(g) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-Val-Gly, o LPGVG (sec. con núm. de ident.: 8);
(h) el hexapéptido Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly, o VAPGVG (sec. con núm. de ident.: 9);
(i) el octapéptido Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly, o GVGVPGVG (sec. con núm. de ident.: 10);
(j) el nonapéptido Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly, o VPGFGVGAG (sec. con núm. de ident.: 11); y
(k) los nonapéptidos Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly, o VPGVGVPGG (sec. con núm. de ident.: 12).
Tales unidades estructurales que se definen por las sec. con núms. de ident.: 1-12 pueden formar unidades repetidas estructurales, o pueden usarse en combinación para formar un componente ELP. En algunas modalidades de la descripción, el componente ELP está formado completamente (o casi en su totalidad) de una o una combinación de (por ejemplo, 2, 3 o 4) unidades estructurales que se seleccionan de las sec. con núms. de ident.: 1-12. En otras modalidades, al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 90% del componente de ELP se forma a partir de una o una combinación de unidades estructurales seleccionadas de sec. con núm. de ident.: 1-12, y que pueden estar presentes como unidades repetidas.
En ciertas modalidades, el (los) componente(s) ELP contienen unidades repetidas, que incluyen unidades repetidas en tándem, del pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es como se definió anteriormente, y donde el porcentaje de unidades de pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (sec. con núm. de ident.: 3) tomadas con respecto a todo el componente ELP (que puede comprender unidades estructurales distintas de VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3)) es mayor que aproximadamente el 75%, o mayor que aproximadamente el 85%, o mayor que aproximadamente el 95% del componente ELP. El componente ELP puede contener motivos que tienen una repetición de 5 a 15 unidades (por ejemplo, aproximadamente 10 unidades o aproximadamente 12 unidades de repetición) del pentapéptido de sec. con núm. ident.: 3, con el residuo huésped X variando entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades estructurales dentro de cada repetición. Los residuos huéspedes pueden seleccionarse independientemente, tal como entre los aminoácidos Val, Ile, Leu, Ala, Gly y Trp (y pueden seleccionarse de manera que retengan una propiedad de transición inversa de fase deseada). Los motivos ilustrativos incluyen VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde los residuos huéspedes son Val (que puede estar presente en 40% a 60% de las unidades estructurales), Gly (que puede estar presente en 20% a 40% de las unidades estructurales) y Ala (que puede estar presente en 10% a 30% de las unidades estructurales). El propio motivo de repetición puede repetirse, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 veces, así como de aproximadamente 8 a 15 veces (por ejemplo, aproximadamente 12 veces), para crear un componente de ELP ilustrativo. El componente ELP como se describió en este párrafo, puede por supuesto construirse a partir de cualquiera de las unidades estructurales definidas por las sec. con núms. de ident.: 1-12, o combinaciones de las mismas. Un ejemplo de componente ELP se muestra en la Figura 1 fusionado al C-terminal del VIP.
En algunas modalidades, las unidades ELP pueden formar una estructura de giro p que proporciona una propiedad similar a la elastina (por ejemplo, transición inversa de fase). Ejemplos de secuencias peptídicas adecuadas para crear una estructura de giro p se describen en la Publicación Internacional de Patente núm. WO 1996/032406. Por ejemplo, el cuarto residuo (X) en la secuencia del pentapéptido de elastina, VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), puede alterarse sin eliminar la formación de un giro p.
En ciertas modalidades, los componentes de ELP incluyen repeticiones poliméricas u oligoméricas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde el residuo huésped X es cualquier aminoácido. X puede ser un aminoácido que se produce de forma natural o no natural. En algunas modalidades, X se selecciona entre alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. En algunas modalidades, X es un aminoácido natural diferente de prolina o cisteína.
El residuo huésped X (por ejemplo, con respecto a la sec. con núm. de ident.: 3, u otra unidad estructural ELP) puede ser un aminoácido no clásico (no codificado genéticamente). Los ejemplos de aminoácidos no clásicos incluyen: D- isómeros de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido A-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, Y-Abu, £-Ahx, ácido 6-amino hexanoico, Aib, Ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t- butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos diseñados tales como p-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general.
La selección de X puede ser independiente en cada unidad estructural de ELP (por ejemplo, para cada unidad estructural definida en la presente descripción que tiene un residuo huésped X). Por ejemplo, X puede seleccionarse independientemente para cada unidad estructural como un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada positivamente, un aminoácido que tiene una cadena lateral cargada negativamente, o un aminoácido que tiene una cadena lateral neutra, que incluye en algunas modalidades, una cadena lateral hidrofóbica.
En aún otras modalidades, el (los) componente(s) ELP pueden incluir repeticiones poliméricas u oligoméricas de los pentapéptidos VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), IPGXG (sec. con núm. de ident.: 5) o LPGXG (sec. con núm. de ident.: 7), o una combinación del mismo, donde X es como se definió anteriormente.
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En cada modalidad, las unidades estructurales, o en algunos casos repeticiones poliméricas u oligoméricas, de las secuencias ELP pueden separarse por uno o más residuos de aminoácidos que no eliminan el efecto global de la molécula, es decir, al impartir ciertas mejoras al componente terapéutico como se describe en la presente descripción.
En ciertas modalidades, como uno o más aminoácidos tampoco eliminan o afectan sustancialmente las propiedades de transición de fase del componente ELP (con respecto a la eliminación de uno o más aminoácidos).
La estructura de los componentes ELP resultantes puede describirse utilizando la notación ELPk [XiYj-n], donde k designa una unidad de repetición ELP particular, las letras capitales entre corchetes son códigos de aminoácidos de una sola letra y sus subíndices correspondientes designan la relación relativa de cada residuo huésped X en las unidades estructurales (cuando corresponda), y n describe la longitud total del ELP en número de repeticiones estructurales. Por ejemplo, ELP1 [V5A2G3-10] designa un componente ELP que contiene 10 unidades repetidas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es valina, alanina y glicina en una relación relativa de 5:2:3; ELP1 [K1V2F1-4] designa un componente ELP que contiene 4 unidades repetidas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es lisina, valina y fenilalanina en una relación relativa de 1:2:1; ELP1 [K1V7F1-9] designa un polipéptido que contiene 9 unidades repetidas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es lisina, valina y fenilalanina en una relación relativa de 1:7:1; ELP1 [V1A8G7-10] designa un componente ELP que contiene 10 unidades repetidas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es valina, alanina y glicina a una relación relativa de 1: 8: 7; ELP1 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetidas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es exclusivamente valina; ELP1 [V-20] designa un polipéptido que contiene 20 unidades repetidas del pentapéptido VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), donde X es exclusivamente valina; ELP2 [5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetidas del pentapéptido AVGVP (sec. con núm. de ident.: 4); ELP3 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetidas del pentapéptido IPGXG (sec. con núm. de ident.: 5), donde X es exclusivamente valina; ELP4 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades repetidas del pentapéptido LPGXG (sec. con núm. de ident.: 7), donde X es exclusivamente valina. Tales componentes ELP como se describe en este párrafo pueden usarse para aumentar las propiedades terapéuticas del componente terapéutico.
Además, el Tt es una función de la hidrofobicidad del residuo huésped. Por lo tanto, variando la identidad del residuo(s) huésped(s) y su(s) fracción(es) molar(es), pueden sintetizarse ELP que exhiban una transición inversa en un rango de 0-100 °C. De este modo, la Tt a una longitud de ELP dada puede reducirse incorporando una fracción más grande de residuos huéspedes hidrofóbicos en la secuencia de ELP. Los ejemplos de residuos huéspedes hidrofóbicos adecuados incluyen valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptófano y metionina. También puede usarse tirosina, que es moderadamente hidrofóbica. Por el contrario, la Tt puede aumentarse incorporando residuos, como los que se seleccionan del grupo que consiste en: ácido glutámico, cisteína, lisina, aspartato, alanina, asparagina, serina, treonina, glicina, arginina y glutamina; preferiblemente seleccionado entre alanina, serina, treonina y ácido glutámico.
El componente ELP en algunas modalidades se selecciona o diseña para proporcionar una Tt (en condiciones fisiológicas) que varía de aproximadamente 10°C a aproximadamente 80°C, así como de aproximadamente 35°C a aproximadamente 60°C, o de aproximadamente 38°C a aproximadamente 45°C. En algunas modalidades, la Tt es mayor que aproximadamente 40°C o mayor que aproximadamente 42°C, o mayor que aproximadamente 45°C, o mayor que aproximadamente 50°C. La temperatura de transición, en algunas modalidades, está por encima de la temperatura corporal del sujeto o paciente (por ejemplo, > 37°C) permaneciendo así soluble in vivo, o en otras modalidades, la Tt está por debajo de la temperatura corporal (por ejemplo, < 37°C) para proporcionar ventajas alternativas, tales como formación in vivo de un depósito de fármaco para la liberación sostenida del agente terapéutico. Ver, por ejemplo, la publicación de Patente de Estados Unidos núm. US 2007/0009602.
La Tt del componente ELP puede modificarse variando la longitud de la cadena ELP, ya que la Tt generalmente aumenta al disminuir el peso molecular (MW). Para polipéptidos que tienen un peso molecular > 100.000, la escala de hidrofobicidad desarrollada por Urry y otros (Publicación Internacional de Patente núm. WO 1996/032406) proporciona un medio para predecir la Tt aproximada de una secuencia ELP específica. Sin embargo, en algunas modalidades, la longitud del componente ELP puede mantenerse relativamente pequeña, mientras se mantiene una Tt objetivo, incorporando una fracción mayor de residuos huéspedes hidrofóbicos (por ejemplo, residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas) en la secuencia ELP. Para polipéptidos que tienen un peso molecular de <100.000, la Tt puede predecirse o determinarse mediante la siguiente función cuadrática: Tt = M0+ M1X + M2X2 donde X es el MW de la proteína de fusión, y Mü= 116.21; M-f -1.7499; M2= 0.010349.
Mientras que la Tt del componente ELP, y por lo tanto del componente ELP acoplado a un componente terapéutico, se ve afectada por la identidad y la hidrofobicidad del residuo huésped, X, las propiedades adicionales de la molécula también pueden verse afectadas. Tales propiedades incluyen, pero no se limitan a, solubilidad, biodisponibilidad, persistencia, vida media, potencia y seguridad de la molécula.
En la sección de Ejemplos más abajo, se ve que el agente VIP acoplado a ELP retiene una cantidad significativa de la actividad biológica del VIP nativo, con relación a las formas de VIP no fusionadas. Adicionalmente, se muestra que los ELP exhiben vidas medias largas. De forma correspondiente, los ELP pueden usarse de acuerdo con la invención para aumentar sustancialmente (por ejemplo, en más del 10%, 20%, 30%, 50%, 100%, 200% o más, en modalidades específicas) la vida media de VIP, en forma conjugada con un ELP, en comparación con la vida media de la forma libre (no conjugada) del agente terapéutico. El VIP modificado que tiene una vida media circulatoria prolongada puede
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administrarse de 1 a aproximadamente 10 veces por semana, tal como de 1 a aproximadamente 5 veces por semana, o de 1 a aproximadamente 3 veces por semana. El VIP modificado o la composición farmacéutica que lo comprende puede administrarse aproximadamente una vez al día, o aproximadamente cada dos días, o aproximadamente cada tres días, o aproximadamente una vez a la semana (es decir, una dosificación semanal).
Una proteína de fusión VIP producida de manera recombinante, de acuerdo con ciertas modalidades de la invención, incluye el componente de fusión (por ejemplo, ELP) y un VIP o un análogo de VIP asociados entre sí a través de fusión genética. Por ejemplo, la proteína de fusión puede generarse mediante la traducción de un polinucleótido que codifica VIP o un análogo de VIP clonado en marco con el componente ELP.
En ciertas modalidades, el componente ELP y VIP o un análogo de VIP pueden fusionarse mediante el uso de un péptido de enlace de varias longitudes para proporcionar una mayor separación física y permitir una mayor movilidad espacial entre las porciones fusionadas, y así maximizar la accesibilidad de VIP o un análogo de VIP, por ejemplo, para unirse a su receptor correspondiente. El péptido de enlace puede consistir en aminoácidos que son flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un péptido de enlace flexible puede incluir aminoácidos que tienen cadenas laterales relativamente pequeñas, y que pueden ser hidrofílicos. Sin limitación, el péptido de enlace flexible puede comprender residuos de glicina y/o serina. Los péptidos de enlace más rígidos pueden contener, por ejemplo, cadenas laterales de aminoácidos con mayor impedimento estérico, tales como (sin limitación) tirosina o histidina. El péptido de enlace puede tener menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10 o 5 residuos de aminoácidos. El péptido de enlace puede unirse covalentemente a y entre el VIP o un análogo de VIP y un componente ELP, por ejemplo, a través de fusión recombinante.
El péptido de enlace o péptido separador puede ser escindible por proteasa o no escindible. A manera de ejemplo, los separadores peptídicos escindibles incluyen, sin limitación, una secuencia peptídica reconocida por proteasas (in vitro o in vivo) de tipo variable, tal como Tev, trombina, factor Xa, plasmina (proteasas de sangre), metaloproteasas, catepsinas y proteasas que se encuentran en otros compartimentos corporales. En algunas modalidades que emplean péptidos de enlace escindibles, la proteína de fusión puede ser inactiva, menos activa o menos potente que una fusión, que luego se activa tras la escisión del separador in vivo. Alternativamente, cuando el agente terapéutico es suficientemente activo como una fusión, puede emplearse un separador no escindible. El separador no escindible puede ser de cualquier tipo adecuado, que incluye, por ejemplo, residuos separadores no escindibles que tienen la fórmula [(Gly)n-Ser]m, donde n es de 1 a 4, inclusivo, y m es de 1 a 4, inclusivo. Alternativamente, podría emplearse una secuencia ELP corta diferente a la cadena principal del ELP en lugar de un péptido de enlace o separador, mientras se logra el efecto necesario.
En aún otras modalidades de la descripción, el agente terapéutico es una fusión recombinante que tiene un componente terapéutico flanqueado en cada extremo por un componente ELP. Al menos uno de dichos componentes ELP puede unirse mediante un separador escindible, de manera que el componente terapéutico es inactivo, pero se activa in vivo mediante la eliminación proteolítica de un único componente ELP. Siendo la fusión ELP única resultante activa y con una vida media mejorada (u otra propiedad descrita en la presente descripción) in vivo.
En otras modalidades, se proporcionan conjugados químicos de un VIP o un análogo de VIP y el componente ELP. Los conjugados pueden prepararse acoplando químicamente un componente ELP a VIP o un análogo de VIP mediante cualquier número de métodos bien conocidos en la técnica (Ver, por ejemplo, Nilsson y otros, 2005, Ann Rev. Biophys Bio Structure 34: 91-118). En algunas modalidades, el conjugado químico puede formarse al unir covalentemente el VIP o un análogo de VIP al componente ELP, directamente o a través de un motivo de enlace corto o largo, a través de uno o más grupos funcionales en el componente proteico terapéutico, por ejemplo, grupos amina, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo, para formar un conjugado covalente. Pueden usarse diversos péptidos de enlace convencionales, por ejemplo, Diisocianatos, diisotiocianatos, carbodiimidas, ésteres bis (hidroxisuccinimida), ésteres de maleimida-hidroxisuccinimida, glutaraldehído y similares.
Los separadores químicos no peptídicos pueden ser adicionalmente de cualquier tipo adecuado, incluidos, por ejemplo, los péptido de enlace funcionales descritos en Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, publicado por Academic Press, Inc, 1995, y los especificados en Cross-Linking Reagents Technical Handbook, disponible en Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois). Los separadores químicos ilustrativos incluyen enlazadores homobifuncionales que pueden unirse a grupos amina de Lys, así como también enlazadores heterobifuncionales que pueden unirse a Cys en un extremo, y a Lys en el otro extremo.
En ciertas modalidades, los componentes ELP relativamente pequeños (por ejemplo, componentes ELP de menos de aproximadamente 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, o 10 kDa), que no experimentan transición a temperatura ambiente (o la temperatura del cuerpo humano, por ejemplo, Tt >37°C) están químicamente acoplados o entrecruzados. Por ejemplo, dos componentes ELP relativamente pequeños, que tienen las mismas o diferentes propiedades, pueden estar químicamente acoplados. Tal acoplamiento, en algunas modalidades, puede tener lugar in vivo, mediante la adición de un único residuo de cisteína en o alrededor del extremo C-terminal del ELP. Tales componentes ELP pueden fusionarse cada uno a uno o más componentes terapéuticos, para aumentar la actividad o avidez en el objetivo.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un VIP modificado con preferencia de unión por VPAC2 y al menos un fármaco antihipertensivo, junto con un portador, diluyente o
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excipiente aceptable farmacéuticamente. Dichas composiciones farmacéuticas son efectivas para tratar o mejorar la hipertensión, como se describe en la presente descripción.
Se contempla que cada uno de los agentes terapéuticos se puede administrar per se así como también en diversas formas que incluyen ésteres, sales y otros derivados fisiológicamente funcionales de los mismos aceptables farmacéuticamente. Se contempla además que los agentes terapéuticos pueden formularse únicamente, o junto con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, el VIP modificado con preferencia de unión por VPAC2 y el uno o más fármacos antihipertensivos puede administrarse como una única formulación o como formulaciones de separación.
Las formulaciones del agente terapéutico incluyen aquellas adecuadas para la administración parenteral así como no parenteral. Las modalidades de administración ilustrativas incluyen oral, bucal, tópica, nasal, pulmonar, subcutánea, intramuscular e intravenosa, entre otras. Se prefieren formulaciones adecuadas para la administración parenteral.
Las formulaciones que comprenden el agente terapéutico de la presente invención pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitaria y pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Dichos métodos generalmente incluyen la etapa de poner los agentes terapéuticos en asociación con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. Típicamente, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con un portador líquido o un portador sólido finamente dividido o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto en las formas de dosificación y la formulación deseada.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral comprenden convenientemente una preparación estéril aceitosa o acuosa de los ingredientes terapéuticos, que preferentemente es isotónica con la sangre del receptor, (por ejemplo, solución salina fisiológica). Dichas formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el agente terapéutico a la circulación o a uno o más órganos. Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosis unitaria o multidosis.
Además de los ingredientes mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir además uno o más ingredientes accesorios que se seleccionan entre diluyentes, tampones, agentes aromatizantes, disgregantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluidos antioxidantes) y similares.
Aunque un experto en la técnica puede determinar la dosis deseable en cada caso (incluyendo una dosis unitaria para administración de depósito), una dosis adecuada del agente terapéutico que tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 14 debe estar en un rango de aproximadamente 1 microgramo (|jg) a aproximadamente 100 miligramos (mg) por kilogramo de peso corporal del receptor, o en un intervalo de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, o en un intervalo de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal. La dosis deseada puede presentarse como una dosis o dos o más subdosis administradas a intervalos apropiados a lo largo del período de dosificación (por ejemplo, una semana, dos semanas, etc.). Estas subdosis pueden administrarse en formas de dosificación unitarias, por ejemplo, que contienen de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 500 mg, o de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 200 mg, o de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 mg de ingrediente activo por unidad de dosis de forma unitaria. Alternativamente, si la condición del receptor así lo requiere, las dosis pueden administrarse como una infusión continua.
Por supuesto, el modo de administración y las formas de dosificación afectarán la cantidad terapéutica del agente peptídico terapéutico activo que es conveniente y eficaz para una aplicación de tratamiento dada. Por ejemplo, las dosificaciones administradas por vía oral pueden ser al menos dos veces, por ejemplo, 2-10 veces, los niveles de dosificación usados en los métodos de administración parenteral. Las formulaciones de depósito también permitirán que se libere significativamente más agente terapéutico, de manera que el agente tendrá una liberación sostenida a lo largo del tiempo.
De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, el VIP puede administrarse de 1 a aproximadamente 10 veces por semana, tal como de 1 a aproximadamente 5 veces por semana, o de 1 a aproximadamente 3 veces por semana. El VIP modificado o la composición farmacéutica que la comprende puede administrarse aproximadamente una vez al día, o aproximadamente cada dos días, o aproximadamente cada tres días, o aproximadamente una vez a la semana.
En ciertas modalidades, el VIP modificado se administra por vía parenteral, tal como mediante inyección subcutánea o intramuscular. La administración puede ser una dosis unitaria del VIP modificado como se describe en la presente descripción.
El VIP modificado, cuando se administra por vía parenteral, puede administrarse una vez al día, o una o dos veces por semana, o de una a cinco veces por mes. En estas modalidades, el VIP modificado puede administrarse como un péptido de fusión soluble, que persiste en la circulación, como se describe en la presente descripción, para proporcionar una actividad sostenida con una administración relativamente infrecuente. El VIP modificado puede administrarse como un fármaco de depósito, como también se describe en la presente descripción, para proporcionar una liberación
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sostenida de péptido de fusión en la circulación a lo largo del tiempo. Véasela solicitud de Patente de Estados Unidos núm. 2007/0009602.
La presente descripción proporciona métodos para tratar y/o mejorar la hipertensión en un paciente. En ciertos aspectos, la invención es para uso en terapia combinada, mediante la cual se administra un péptido intestinal vasoactivo modificado con preferencia de unión por VPAC2 a un paciente sometido a terapia con uno o más fármacos antihipertensivos tales como un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un antagonista del receptor p1, y/o un bloqueador de los canales de calcio.
La coadministración del VIP modificado y uno o más fármacos antihipertensivos puede realizarse mediante la administración concomitante de una sola formulación o de formulaciones separadas, por ejemplo, una formulación de VIP modificado y una formulación de uno o más fármacos antihipertensivos. La coadministración no requiere que los agentes terapéuticos se administren simultáneamente. La administración de formulaciones separadas se considera "concomitante" si el momento de su administración es tal que las actividades farmacológicas del VlP modificado y uno o más fármacos antihipertensivos se solapan en el tiempo, ejerciendo de esta manera un efecto combinado antihipertensivo en el paciente. En consecuencia, el VIP modificado con preferencia de unión por VPAC2 puede administrarse antes, al mismo tiempo o después de la administración de uno o más fármacos antihipertensivos. La coadministración tampoco requiere que los agentes terapéuticos se administren por la misma vía de administración. Por el contrario, cada agente terapéutico puede efectuarse mediante cualquier vía apropiada. Por ejemplo, el VIP modificado puede administrarse por vía subcutánea mientras que el bloqueador de los canales de calcio puede administrarse por vía oral.
La administración conjunta del VIP modificado con preferencia de unión por VPAC2 y uno o más fármacos antihipertensivos proporciona efectos beneficiosos derivados de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos. Se contempla que un VIP que tenga preferencia de unión por VPAC2 puede proporcionar un control de la presión arterial de acción prolongada sinérgicamente con terapias antihipertensivas concomitantes. Por consiguiente, la invención proporciona ventajas específicas tales como el control sostenido de la presión arterial, mejor eficacia del tratamiento y/o efectos secundarios reducidos.
La presente invención se ilustra además por los ejemplos siguientes, los cuales no deben interpretarse como limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Clonación de construcciones VIP-ELP
La secuencia de ADN para el péptido VIP es como se describe en Simoncsits y otros (Eur. J. Biochem. 1988, 178(2):343-350), excepto que el residuo 17 era la metionina nativa y no tenía ninguna de las extensiones C-terminales descritas.
Se hicieron dos variantes iniciales, una con una metionina en el extremo N-terminal, dado el codón de inicio ATG requerido, (PB1046) y una con el tripéptido MAA en el extremo N-terminal (PB1047). La metionina en PB1046 normalmente es eliminada por la metionina aminopeptidasa (MA) pero como la histidina es el segundo residuo y uno de los aminoácidos menos favorables en esta posición para la MA, la metionina no se elimina. La metionina en PB1047 se eliminó para dejar AA, que luego puede eliminarse in vitro o in vivo mediante DPPIV para dar la histidina como el residuo N-terminal. La secuencia de ADN VIP se clonó en el vector pPB1031 (ver la Figura 3) que porta la secuencia de ADN de ELP1-120 para proporcionar un casete de expresión bajo el control del promotor T7.
Los oligonucleótidos sintéticos P0045, P0048, P0064 y P0065 se hibridaron juntos, se digirieron con la enzima de restricción Xbal y se ligaron en el plásmido pPB1031 que se había digerido con las enzimas de restricción Xbal/Kpnl para dar el plásmido de expresión pPB1046 (ver Figura 4).
Los oligonucleótidos sintéticos P0066, P0064, P0067 y P0065 se hibridaron juntos, se digirieron con la enzima de restricción Xbal y se ligaron en el plásmido pPB1031 que se había digerido con las enzimas de restricción Xbal/Kpnl para dar el plásmido de expresión pPB1047 (ver Figura 5).
Ejemplo 2
Actividad de la proteína de fusión VIP modificado-ELP in vitro
Para medir la actividad biológica in vitro y la potencia de las proteínas de fusión VIP o VIP-ELP, se utilizó un bioensayo basado en células. El ensayo mide el aumento en la concentración de monofosfato de adenosina cíclico intracelular (cAMP) en respuesta al tratamiento con proteínas de fusión VIP o VIP-ELP en células de ovario de hámster chino (CHO) diseñadas para expresar ya sea el Receptor Peptídico Intestinal Vasoactivo humano 2 (VPAC2) o el Receptor Péptido Intestinal Vasoactivo humano 1 (VPAC1). Ambas proteínas de fusión VIP y VIP-ELP pueden estimular la producción de
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cAMP en estas células, lo que indica que las proteínas de fusión conservan la capacidad de unirse y activar al receptor. Ya que la cantidad de acumulación de AMPc en las células después de la unión y activación del ligando mediado por el receptor es directamente proporcional a la cantidad de péptido intacto o proteína de fusión presente, el ensayo puede usarse para determinar la bioactividad y la potencia relativa.
En este ejemplo, se probó la actividad de las proteínas de fusión VIP-ELP PB1046 y PB1047. La construcción PB1046 contiene VIP con una Met en el N-terminal y la construcción PB1047 contiene VIP con Ala-Ala en su extremo N-terminal. Ambas construcciones tienen ELP (1-120) en su C-terminal. En el primer experimento, se probó la actividad de las construcciones usando células CHO que expresan el receptor de VIP VPAC2. Después de 30 minutos de incubación de diversas concentraciones de las proteínas de fusión con la célula, las células se lisaron y la cantidad de cAMP producida se midió mediante el uso de un kit comercial. PB1047 se trató con DPP-IV antes de la adición a las células. La Figura 6 muestra los resultados. Como se muestra, la proteína de fusión VIP modificado PB1046 es algo más activa que la proteína VIP nativa, mientras que PB1047 es menos activa.
La actividad de PB1046 y PB1047 también se probó utilizando células CHO que expresan el receptor VIP VPAC1. Después de 30 minutos de incubación de diversas concentraciones de las proteínas de fusión con células CHO, se lisaron las células y se midió la cantidad de cAMP producida usando un kit comercial. PB1047 se trató con DPP-IV antes de la adición a las células. La Figura 7 muestra los resultados. Esta vez, la proteína de fusión VIP modificado PB1046 es mucho menos activa que la proteína VIP nativa, mientras que la actividad relativa de PB1047 contra VIP nativa es aproximadamente la misma que en la prueba para el receptor VPAC2. Estos resultados sugieren que PB1046 activa selectivamente el receptor VPAC2 en comparación con el receptor VPAC1.
Ejemplo 3
Efecto en la presión arterial de la Proteína de Fusión VIP-ELP
La actividad de la proteína de fusión VIP modificado-ELP PB1047 también se probó in vivo. Específicamente, se probaron los efectos de la proteína de fusión VIP-ELP sobre la presión arterial. Ratas espontáneamente hipertensas se trataron subcutáneamente con PB1047 (10 mg/kg) o tampón control y sus presiones sanguíneas se midieron en varios puntos después de la administración de la proteína de fusión. Se usaron cinco animales por cada grupo y los gráficos muestran el promedio y la desviación estándar. PB1047 redujo significativamente la presión arterial sistólica y diastólica en estos animales durante al menos 12 horas después de la administración (ver la Figura 8), lo que indica que la proteína de fusión VIP-ELP es activa y puede usarse potencialmente como productos farmacéuticos en el tratamiento de enfermedades relacionadas con VIP.
Ejemplo 4
Clonación, Expresión y Análisis de una Proteína de Fusión VIP-ELP Adicional, PB1120
La secuencia de ADN VIP se clonó en el vector pPB1120 (véase la Figura 9) que porta la secuencia de ADN de ELP1- 120 para proporcionar un casete de expresión bajo el control del promotor T7. Luego, la cepa de E. coli de producción BLR se transformó con el plásmido pPB1120 y se cultivó en un medio rico tal como se describió anteriormente. Las muestras del péptido de fusión VIP-ELP1-120 resultante, PB1120, se purificaron y analizaron mediante SDS-PAGE.
La actividad del péptido de fusión PB1120 se probó in vitro. La actividad se probó mediante el uso de un ensayo que utiliza células cHo que expresan el receptor VIP (VPAC1) como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. Como demuestra la Figura 10, PB1120 era aproximadamente 1.4 veces menos activo para el receptor VPAC1 que el péptido VIP nativo. En comparación, la construcción PB1046 que contiene un residuo de metionina N-terminal fue aproximadamente 11 veces menos activa que el péptido VIP nativo. En el transcurso de múltiples experimentos, PB1120 fue de cualquier manera de entre 1.4 a 6 veces menos activo que el péptido VIP nativo para el receptor péptido VPAC1.
La Figura 11 ilustra la actividad de PB1120 para el receptor VPAC2. Al igual que los resultados observados para el receptor VPAC1, PB1120 muestra una actividad ligeramente menor (~1.5 veces menor) que el péptido VIP nativo para VPAC2. Sin embargo, en contraste con los resultados observados con VPAC1, PB1046 fue equipotente para VPAC2 en comparación con el péptido nativo. En el transcurso de múltiples experimentos, PB1120 fue de cualquier manera de entre 1.5 a 7 veces menos activo que el péptido VIP nativo para el receptor péptido VPAC2.
Ejemplo 5
Perfil farmacocinético de la proteína de fusión VIP modificado-ELP PB1120
Además de los ensayos de potencia biológica descritos anteriormente, también se examinó el perfil farmacocinético de la proteína de fusión VIP-ELP PB1120. Monos recibieron inyecciones subcutáneas (SC) únicas (dosificación de 3 mg/kg) de PB1120 y se midieron diariamente las concentraciones de fármaco en plasma en el transcurso de una semana. Se usaron tres animales y los gráficos muestran el promedio y la desviación estándar. Más de la mitad de la
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dosis inicial de PB1120 permaneció en la circulación hasta el día 4 (ver Figuras 12A y 12B, que ilustran las concentraciones plasmáticas medias de PB1120 después de la administración SC usando ejes lineales y semi- logarítmicos, respectivamente).
En base a estos datos, parece existir una fase de absorción prolongada después de la administración subcutánea de PB1120, consistente con una absorción lenta desde el sitio de administración. La vida media de eliminación aparente (t1^), basada en la disminución de las concentraciones plasmáticas, varió de 9.9 a 45.8 h y probablemente refleja la lenta absorción en lugar de la verdadera eliminación. Estos datos indican que la proteína de fusión VIP-ELP tiene una vida media drásticamente prolongada en comparación con la VIP nativa y puede administrarse potencialmente a intervalos prolongados (por ejemplo, puede administrarse una vez al día, aproximadamente cada dos días, aproximadamente cada tres días, o aproximadamente una vez a la semana).
Ejemplo 6
Efectos de la proteína VIP modificado-ELP PB1120 en la presión arterial
Para medir los efectos de la proteína de fusión VIP modificado-ELP PB1120 sobre la presión arterial sistólica, diastólica y media, las ratas recibieron inyecciones únicas, subcutáneas de 0.1 mg/kg, 1 mg/kg o 5 mg/kg de PB1120 y evaluadas en intervalos de 3 horas. Las Figuras 13A, 13B, y 13C muestran el cambio promedio en la presión arterial sistólica, diastólica y media, respectivamente. La figura 13D muestra la frecuencia cardíaca promedio durante 3 horas después de la administración de PB1120. Como demuestran las Figuras 13A-C, las ratas a las que se les inyectó 1 mg/kg o 5 mg/kg de PB1120 mostraron reducciones significativas en la presión arterial sistólica, diastólica y media 9 horas después de la inyección, lo que indica que la proteína de fusión VIP-ELP PB1120 puede administrarse potencialmente con el fin de tratar o prevenir la hipertensión en individuos afectados.
Ejemplo 7:
El control de la presión arterial con VPAC2-VIP selectivo es independiente de la función p-AR
El péptido intestinal vasoactivo natural (VIP) desencadena una vasodilatación potente al activar los receptores VPAC1 y VPAC2 acoplados a proteína G; sin embargo, la utilidad clínica de VIP es limitada debido a su corta vida media y los efectos secundarios mediados por VPAC1. Aquí, se probaron los efectos de PB 1046 (Vasomera™) cuando se administró como un bolo SQ de dosis única a ratas conscientes espontáneamente hipertensas (SHR).
Las ratas SHR (351 ± 4 g, n = 8) fueron instrumentadas para el seguimiento de la presión arterial telemétrica y la monitorización del ECG. A través de un diseño Cuadrado Latino, se evaluaron los efectos de Vasomera (1, 3 y 9 mg/kg SQ) así como del vehículo (VEH, SQ). Finalmente, se analizó Vasomera™ (9 mg/kg SQ) durante el bloqueo concomitante del receptor p-adrenérgico (BB, atenolol 20 mg/kg/día PO). Se midieron los cambios en la presión arterial media (MAP) y la frecuencia cardíaca (HR).
Vasomera™ indujo disminuciones dependientes de la dosis en la presión arterial que se mantuvieron durante hasta 12 horas después de la dosificación (ver Figura 14A). Por ejemplo, a 9 mg/kg (177 nmol/kg), Vasomera™ redujo la MAP en 16 ± 3% (154 ± 5 mmHg frente a 184 ± 6 en VEH @ + 6 h, P <0.05). Concomitantemente, Vasomera™ desencadenó cardioaceleración moderada (370 ± 15 latidos por minuto a 9 mg/kg vs. 322 ± 10 latidos por minuto en VEH @ + 2 h, P <0.05). Notablemente, el bloqueo del receptor p-adrenérgico atenuó los efectos cronotrópicos de Vasomera™ (308 ± 3 bpm @ +2h) mientras preservaba/potenciaba la vasorelajación (MAP: 131 ± 3 mmHg @ + 6hr) (ver Figuras 14B y 13C). No se observaron efectos clínicos adversos.
Estos datos sugieren que Vasomera™ puede proporcionar control de la presión arterial de acción prolongada sinérgicamente con terapias concomitantes (como el bloqueo de los receptores p-adrenérgicos) y puede representar un nuevo agente terapéutico complementario para pacientes hipertensos resistentes/no controlados.
Ejemplo 8:
Control de la presión arterial con VPAC2-VIP selectivo junto con antihipertensivo
Se analizaron los efectos hemodinámicos de Vasomera™ cuando se administró como un bolo SQ de dosis única a ratas conscientes espontáneamente hipertensas (SHR) pretratadas con tres antihipertensivos comunes.
Se usaron ratas SHR (351 ± 4 g, n = 8) para el seguimiento telemétrico de la BP y ECG. Primero, se analizaron tanto Vasomera™ (9 mg [177 nmol]/kg, SQ) como el placebo (VEH) en animales no tratados. Luego, se evaluaron los efectos de Vasomera™ durante el bloqueo oral concomitante del receptor p-adrenérgico (+BB, atenolol 20 mg/kg/día), bloqueo de los canales de calcio (+CCB, amlodipino 5 mg/kg/día) e inhibición de la ACE (+ACE, ramipril 1 mg/kg/día). La presión arterial media (MAP) y la frecuencia cardíaca (HR) se midieron/promediaron durante 24 horas tanto antes como después de la dosificación.
Vasomera™ indujo disminuciones potentes en la presión arterial que se mantuvieron durante hasta 12 horas después de la dosificación (ver Figura 15A). En promedio, Vasomera™ redujo la MAP en un 9 ± 1% (188 ± 6 a 171 ± 5 mmHg, P <0.05). La vasorelajación de Vasomera™ se conservó/mejoró en ratas pretratadas con atenolol (-14 ± 1%, P <0.05), amlodipino (-13 ± 2%, P <0.05), y/o ramipril (- 9 ± 2%, P <0.05) (ver Figura 15B). Vasomera™ desencadenó 5 cardioaceleración moderada en ratas no tratadas (+8 ± 1%, 355 ± 6 a 384 ± 8 lpm, P <0.05); dicha cronotropía se atenuó bajo el bloqueo del receptor p-adrenérgico (+6 ± 1%, 278 ± 2 a 294 ± 2 bpm), pero no se vio afectada por amlodipino o ramipril (ver Figura 15C). En todos los casos, las frecuencias cardíacas fueron más bajas que en los controles, y no se observaron efectos clínicos adversos.
10 Estos resultados demuestran que la administración concomitante de Vasomera™ con terapias antihipertensivas concomitantes (por ejemplo, bloqueo de receptores p-adrenérgicos) puede proporcionar un mejor control de la presión arterial de acción prolongada y efectos secundarios reducidos.
A menos que se especifique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos en la presente descripción tienen el 15 mismo significado que el conocido comúnmente por aquellos con experiencia en la técnica a la que pertenece esta invención.

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un péptido intestinal vasoactivo (VIP) que tiene preferencia de unión por el Receptor de Péptido Intestinal Vasoactivo 2 (VPAC2), para usar en terapia combinada con al menos un fármaco antihipertensivo seleccionado de un antagonista del receptor p1, un inhibidor de la ACE y un bloqueador de canales de calcio para usar en el tratamiento de la hipertensión en un paciente, en donde el VIP comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 13 con la His N-terminal en la posición 2, una metionina N-terminal y un péptido de tipo elastina (ELP) en el C-terminal, en donde el ELP comprende al menos 90 repeticiones de la sec. con núm. de ident.: 3, y en donde el VIP demuestra una vida media prolongada en la circulación.
  2. 2. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha hipertensión se selecciona de hipertensión pulmonar, hipertensión esencial no controlada e hipertensión resistente.
  3. 3. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo induce vasorelajación.
  4. 4. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo induce la disminución de al menos una de presión sistólica, presión diastólica y presión arterial media.
  5. 5. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho componente peptídico de tipo elastina comprende repeticiones de VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3), en donde X se selecciona independientemente de V, Ay G.
  6. 6. El péptido para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde X es V, A y G en una relación de aproximadamente V5, A2, y G3, opcionalmente en donde dicho componente peptídico de tipo elastina comprende 120 unidades repetidas de VPGXG (sec. con núm. de ident.: 3)
  7. 7. El péptido para usar de acuerdo con 1-6, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 14.
  8. 8. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicho antagonista del receptor p1 es Atenolol, o en donde dicho inhibidor de ACE es Ramipril; o en donde dicho bloqueador de los canales de calcio es Amlodipino.
  9. 9. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo y dicho fármaco antihipertensivo se administran por separado.
  10. 10. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo se administra por vía parenteral, opcionalmente en donde dicho péptido intestinal vasoactivo se administra por vía subcutánea.
  11. 11. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo se administra aproximadamente una vez al día, o en donde dicho péptido intestinal vasoactivo se administra aproximadamente una vez por semana.
  12. 12. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dicho péptido intestinal
    vasoactivo tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 14 y se administra a una dosis de
    aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 100 miligramos por kilogramo de peso corporal,
    opcionalmente, en donde dicho péptido intestinal vasoactivo se administra a una dosis de aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 10 miligramos por kilogramo de peso corporal.
  13. 13. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la administración conjunta de dicho péptido intestinal vasoactivo y dicho fármaco antihipertensivo produce efectos sinérgicos.
  14. 14. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dicho paciente es un paciente humano.
  15. 15. Una composición farmacéutica que comprende un péptido intestinal vasoactivo para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y 10-12, en donde la composición se formula para una dosificación de una vez al día, o en donde la composición se formula para una dosificación de una vez por semana.
  16. 16. Una composición farmacéutica que comprende el VIP para usar de acuerdo con cualquiera de las
    reivindicaciones 1-7, 10-12 y 15, en donde el VIP se administra a un paciente que está siendo tratado con uno o más de los fármacos antihipertensivos, y en donde se logra una disminución sinérgica en la presión arterial.
    FIGURA 1
    Sec. con núm. de ¡dent: 14
    M-VIP ELP1-120 (M añadida ai N-terminal del VIP)
    MHSDAVFTDNYTRLRKOMAVKKYLNSILN
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGfiG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGWP (Sec. con núm de dent. 14)
    ELP1-120 « (VPGXGVjo Donoe X - V,G,Aa
    VPGVG VPGVG VPGQG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    Sec. con núm. de ¡dent: 15
    MAA-VIP ELP1-120 (antes del procesamiento, MAA añad da al N-terminal del V1P)
    MAAHSDAVFTONYTRIRKOMAVKKYLNSILN
    VPGVG VPGVG VPGSG VPG&G VPQVG VPGVG VPGVG VPGQG VPG&G VFGQG
    VPGVQ VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGVG VPGVG VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGVG vpen/R vpftftG vpga« vpoug vpgvg VPGVG VPGGG VPGAG VPGGG
    VPGWP (Sec. con núm. de ¡dent: 15)
    ELP1-120 = (VPGXG>!jo Donde X = VsGjAj
    imagen1
    FIGURA 4
    XbaI47
    imagen2
    1
    Xbal
    -+---------
    P0045
    aatCCTCTA GAAATAATTT
    taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt attatgctga gtgatatccc cttaacactc gcctattgtt aaggggagat ctttattaaa
    GAGAT CTTTATTAAA < P0048
    Ndel -+---
    P0064
    CTGTTTTCA CTGACAACTA
    P0045 >
    TGTTTAACTT TAAGAAGGAG ATATACATAT GCACTCTGAC G €1 tgtttaactt taagaaggag atatacatat gcactctgac gctgctctca ctgacaacta acaaattgaa attcttcctc tatatgtata cgtgagactg cgacaaaagt gactgttgat ACAAATTGAA ATTCTTCCTC TATATGTATA CGTGAGACTG CGACAAAAGT GACTGTTGAT
    P0048
    »............mVIP...............>
    m h s d avf t d n
    P0064 >
    CACTCGTCTG CGTAAACAGA TGGCTGTTAA AAAGTACCTG AACTCTATCC TGAACGTAC 121 cactcgtctg cgtaaacaga tggctgttaa aaagtacctg aactctatcc tgaacgtacc gtgagcagac gcatttgtct accgacaatt tttcatggac ttgagatagg acttgcatgg G
    P0048
    TGAGCAGAC GCATTTGTCT ACCGACAATT TTTCATGGAC TTGAGATAGG ACTT3
    < P0065

    >...............................................................mvip.....................................................»»..

    ytrl rlcq mau k k y 1 nsi lnv
    1E1 ggacgtgggt gttccaggcg tgggtgctcc ggatgacgat gtgccgggcg caggtattcc cccgcaccca caaggcccgc acccacaagg cccaccgcca cacggcccgc gtccacaagg

    »...........................ELP1-120...........................>
    pgvg vpg vgv pggg vpg agv
    FIGURA S
    Xba[ 47
    imagen3
    1
    61
    taatacgact cactataggg attatgctga gngatanccc
    TGTTTAACTT TAAGAAGGAG tgtttaactt taagaaggag acaaattgaa attcttcctc ACAAATTGAA ATTCTTCCTC
    gaattgtgag cggataacaa
    cttaacactc gcctattgtt
    Ndel
    P0066 >
    ATATACATAT GGCGGCCCAC atatacatat ggcggcccac tatatgtata ccgccgggtg TATATGTATA CCGCCGGGTG poo67
    »..................
    m a a h
    P0066
    CTA GAAATAATTT ttcccctcta gaaataattt aaggggagat ctttattaaa TTTATTAAA < P0067
    P0064
    CTG TTTTCACTGñ
    TCTGACG
    tctgacgctg ttttcactga agactgcgac aaaagtgact AGACTGCGAC AAAAGTGACT
    .mVIP.........................................>
    s d a v f t
    P0064
    CAACTACACT CGTCTGCGTA AACAGATGGC TGTTAAAAAG TACCTGAACT CTATCCTGAA 121 caactacact cgtctgcgta aacagatggc tgttaaaaag tacctgaact ctatcctgaa gttgatgtga gcagacgeat ttgtctaccg acaatctttc atggacttga gataggactt GTTGATG P0067
    TGA GCA3ACGCAT TTGTCTACCG ACAATTTTTC ATGGAC'TTGA GATAGGACTT
    < P0065
    > .............................mVIP..............................>
    d n y t rlr k q m a v k k yin sil
    P0065
    G
    PÜ064 >
    CGTAC
    181 cgtaccgggc gtgggtgttc cgggcgtggg tgttccgggt ggcggtgtgc cgggcgcagg gcatggcccg cacccacaag gcccgcaccc acaaggccca ccgccacacg gcccgcgtcc
    > BlVIP
    n
    »...........................3LP1-120..........................>
    vpg vgv pgv gvpg ggv pga
    cAMP pMol
    FIGURA 6
    imagen4
    CAMP (jMol
    imagen5
  17. 0.001
    aoi
    VP Fft v - ÍA - DVíl ♦ Íx/D*8 U D: A
    (| PÍ104J 11 cunt miración vv lUtulto^o modo) Q, j
    ( P61046 (C contMtndán wt RnJUdo medio) (1224
    O Péfrtídu # (V** comadracián « Rndtodo mrdki) 0,366
    B C D RA2
    1.73 2.66 6.87 I
    a% 1 Me+082.72e+06 0.993 2.15 0379 6.32 0.997
    Prealón arteria aHdtcatrrvn Hg)
    FIGURA 8
    imagen6
    imagen7
    Control
    VIP-ELP
    imagen8
    RFU
    VIPR1
    imagen9
    O P®ptldO VIP Q PB1120 ^ PB1046
    PfU
    VIPR2
    imagen10
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    imagen14
    Cambio promedio en la Presión
    Arterial Media en intervalos de 3 h
    Vehículo
    PB1120 O.lmgi'kg SC
    PB1120 1mg/kg SC
    PB1120 5mg.'kg SC
    Tiempo transcurrido (h)
    imagen15
    Frecuencia cardiaca promedio en intervalos de 3 h
    Vehículo
    PE 1120 0.1mg.kg SC
    PE 1120 Im^kgSC
    PE 1120 omgkg SC
    Tiempo transcurrido <h)
    imagen16
    imagen17
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