ES2624827T3 - Método para la identificación, la selección y el análisis de células tumorales - Google Patents

Abstract

Un método para el diagnóstico de afecciones tumorales y/o del correspondiente estado de avance, que comprende las etapas de: a. El enriquecimiento de una muestra de un fluido orgánico obtenido a partir de un paciente, teniendo dicho fluido orgánico una elevada probabilidad de contener al menos una célula tumoral en circulación o una célula tumoral diseminada o porciones de las mismas en al menos una población de células que comprende al menos un tipo de células tumorales en circulación o células tumorales diseminadas o porciones de las mismas; b. La obtención de una muestra purificada a partir de dicho al menos un tipo de células tumorales en circulación o células tumorales diseminadas o porciones de las mismas; c. La realización de un análisis molecular sobre dicha muestra purificada, de tal forma que se destaque al menos una característica de dicha al menos una célula adecuada, para permitir dicho diagnóstico; estando dicho método caracterizado porque - dicha etapa de obtención de una muestra purificada se lleva a cabo mediante el aislamiento de una forma no manual de al menos una célula o una porción de una célula a partir de dicho al menos un tipo de células tumorales en circulación o células tumorales diseminadas o porciones de las mismas mediante la selección individual de células individuales o de porciones de células sobre la base de la evaluación de las imágenes de dichas células en un dispositivo microfluido, de forma que se obtenga una muestra purificada que tenga una pureza de al menos el 90 %; y - porque comprende la etapa de marcar las células tumorales en circulación o las células tumorales diseminadas o porciones de las mismas con al menos un anticuerpo conjugado con un marcador elegido entre el grupo que consiste en: - fluoróforos - cromógenos - microesferas (fluorescentes o no fluorescentes); reconociendo el anticuerpo, el antígeno CD45, la citoqueratina o la EpCAM.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la identificacion, la seleccion y el analisis de celulas tumorales Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere, en general, a metodos diagnosticos basados en la identificacion, el aislamiento y el posterior analisis de las celulas raras en circulacion o diseminadas. En particular, la invencion se refiere a metodos diagnosticos que encuentran aplicacion en el sector de la oncologla, y que por lo tanto implican la identificacion y el aislamiento de las celulas tumorales (CTC) o de las celulas tumorales diseminadas (DTC) en circulacion.

Estado de la tecnica

El diagnostico de numerosas afecciones patologicas, en particular el de los tumores, normalmente se lleva a cabo segun los metodos caracterizados, por un lado, por diferentes grados de invasividad, y por otro, por diferentes niveles de rendimiento en terminos de especificidad, sensibilidad y fiabilidad.

Algunos metodos de cribado se basan en analisis que aspiran a detectar la presencia de biomarcadores en el flujo sangulneo periferico (por ejemplo, CA-125, CEA, PSA) o en otros fluidos biologicos (por ejemplo, el ensayo de sangre oculta en las heces o el ensayo de ADN fecal). Sin embargo, dichos metodos se basan en una evaluation indirecta que depende de la concentration de un biomarcador y no en el analisis directo, por ejemplo, de un tejido tumoral. Consecuentemente, su sensibilidad y su especificidad no son particularmente altas

En el caso, considerado a modo de ejemplo, del cancer de prostata, una de las formas mas extendidas de cancer en la poblacion masculina (aproximadamente un cuarto de todos los casos de cancer, 300.000 nuevos casos al ano en Europa), esta extendido el cribado sobre la base de los parametros serologicos (la cantidad de PSA), pero tiene una sensibilidad y una especificidad bajas.

Algunos procedimientos mas invasivos, tales como una evaluacion rectal digital, pueden en algunos casos completar el cuadro cllnico, pero mas frecuentemente es necesario llevar a cabo una biopsia de prostata para tener un diagnostico mas preciso, en un aumento de la invasividad que da como resultado una creciente incomodidad para el paciente y un coste no despreciable para el sistema sanitario.

En otros contextos se producen unas situaciones similares, tales como en el cancer colorrectal, en el que el recurso es frecuentemente la evaluacion de sangre oculta las heces, o bien se realiza un analisis invasivo a traves de una colonoscopia, y posiblemente, una biopsia con muestras de tejidos tomada directamente del colon-recto.

Dado que, en este contexto, un diagnostico temprano permite normalmente un tratamiento mas eficaz, obviamente resulta de interes la evaluacion de la aparicion del cancer en una fase temprana y con un elevado grado de sensibilidad y de especificidad.

En este sentido, algunos estudios recientes (por ejemplo, Zieglschmid et al., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 42, 155-196 (2005)) sobre celulas tumorales en circulacion (CTC) han demostrado que, en el flujo sangulneo periferico, se encuentran celulas que derivan del tumor primario. A pesar de que son extremadamente raras, la posibilidad de identificarlas y de aislarlas constituye una alternativa potencialmente muy interesante frente a los metodos invasivos descritos previamente para la obtencion de muestras de tejido tumoral que va a ser caracterizado, posteriormente, con fines diagnosticos. Los cuerpos administrativos, tales como la FDA, ya han aprobado algunos sistemas de uso cllnico basados en las CTC para la evaluacion de pacientes que presentan metastasis.

Para la mayorla de los pacientes afectados por un cancer, de hecho, no es el tumor principal el que provoca la muerte en la medida en que, si es identificado en una etapa lo suficientemente temprana, puede ser eliminado quirurgicamente, mediante una radioterapia, una quimioterapia o mediante una combination de dichos metodos. Mas bien, la causa mas frecuente de muerte son las metastasis, es decir, las colonias tumorales originadas por celulas malignas que se desprenden del tumor principal y migran hacia otras zonas del cuerpo, incluso a una distancia considerable del sitio del tumor principal. Dado que son diflciles de identificar y de eliminar, frecuentemente es imposible tratar con exito todas las metastasis. Consecuentemente, desde el punto de vista cllnico, su formation debe ser considerada como el acontecimiento concluyente en el progreso natural de un cancer.

Consecuentemente, dado que se ha demostrado, en el caso del cancer de mama, del cancer de colon y del cancer de prostata, una correlation entre el numero de CTC y un aumento en el riesgo de un resultado no favorable de la enfermedad, parece evidente que la posibilidad de aislarlas, y mediante un analisis molecular, de obtener una imagen informativa completa de las mismas con importancia cllnica, tendrla unas repercusiones diagnosticas muy significativas.

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Ademas se ha demostrado que el analisis de las celulas tumorales diseminadas (DTC), es decir, de las celulas tumorales que pueden encontrarse en la medula osea o en los nodulos linfaticos, es, en ciertos contextos, incluso mas significativo que el analisis del tumor primario. Algunos grupos de investigation, por ejemplo, han apreciado (Klein et al., Tumour cell. 13(5), 441-53 (2008)) que la sobreexpresion de HER2, que puede ser detectada en una unica DTC pero no en el tumor primario, es una prueba predictiva de un riesgo de muerte muy elevado.

Adicionalmente, se sabe, por ejemplo, a partir de la patente n° EP1109938, que el analisis de multiples celulas individuales puede ser mas informativo en comparacion con el analisis de un conjunto de celulas. En particular, se ha averiguado (Klein et. al., Proc. Natnl. Acad. Sci. EE.UU. 96, 4494-4499 (1999)) que las diferentes DTC de un unico y mismo paciente tienen diferentes variaciones cromosomicas (perdidas y amplificaciones en diferentes sitios).

En el estado actual de la tecnica, para el aislamiento de las celulas tumorales diseminadas y en circulation, sin embargo, hay disponibles estrategias de una naturaleza fundamentalmente analltica que son muy complejas y laboriosas, que sin embargo, tienen unos rendimientos limitados y generan unas muestras que se distinguen por un bajo grado de pureza. Consecuentemente, dichas muestras de CTC o de DTC no son compatibles con algunos de los procedimientos diagnosticos mas refinados y fiables, tales como la secuenciacion. La limitada pureza determina de hecho un elevado riesgo de falsos positivos y de falsos negativos causados por fragmentaciones erroneas en las bases de la secuencia.

Se han llevado a cabo intentos (Nagrath et al., Nature, 450, 1235-1241 (2007)) para aislar las CTC mediante dispositivos microfluidos con una superficie interna recubierta con anticuerpos anti-EpCAM (expresadas en las celulas epiteliales pero no en los leucocitos) que son capaces de procesar volumenes de sangre del orden de mililitros, sin tener que recurrir a tratamientos previos que implican operaciones con un elevado riesgo de perdida de parte de las celulas de interes (por ejemplo, centrifugation, lavado e incubation). Sin embargo, dichos metodos han producido unos niveles de pureza con un promedio del 50 % - 60 %, que no resultan ser suficientes para llevar a cabo, proceso abajo, analisis para los cuales la pureza es crucial, tales como, por ejemplo, la evaluation de las variaciones en el numero de copias, la inestabilidad microsatelite, la perdida de heterocigosis (LoH), la expresion genica en la que es fundamental una mejor proportion entre senal y ruido (S/N) para aplicaciones diagnosticas, o la identification de nuevos farmacos, o de nuevo en el sector de la investigacion en celulas iniciadoras del cancer.

Similares consideraciones pueden extenderse a otros metodos cuyo enorme potencial diagnostico se ha destacado, que sin embargo, no pueden ser implantados concretamente dado que los procedimientos conocidos de enriquecimiento de muestras biologicas y aislamiento de una poblacion de celulas raras de los mismos no permiten la obtencion de unos niveles suficientes de pureza, si no es siguiendo una carga de trabajo analltico pesada y costosa, y consecuentemente, no hallan aplicacion en la practica medica. Por ejemplo, (Bonci et al. "The miR-15a- miR-16-1 cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities", 19 de octubre de 2008; doi:10.1038/nm.1880), incorporado en el presente documento como simple referencia con respecto a la parte pertinente, se ha demostrado recientemente que algunos microARN (miARN), es decir, fragmentos de ARN monocatenarios no codificantes, que contienen aproximadamente 22 nucleotidos, estan implicados directamente en el desarrollo y el progreso del cancer. A partir de un estudio de la expresion de miR-15a y de miR-16 en celulas de un tumor primario (cancer de prostata) mediante una PCR cuantitativa, se ha apreciado una considerable subregulacion del miARN en comparacion con el correspondiente tejido sano. Dicho dato ha sido confirmado mediante una hibridacion in situ (ISH). Ademas, se ha demostrado que la deletion del agrupamiento miR-15a-miR- 16 generalmente esta asociada con etapas avanzadas de la enfermedad, a pesar de que en algunos casos la subregulacion de estos miARN ya se ha registrado durante las etapas iniciales del desarrollo del cancer. Consecuentemente, desde un punto de vista diagnostico, la posibilidad de aislar las celulas tumorales y de evaluar si presentan una subregulacion de estos miARNs proporcionarla una indication precisa de lo avanzado del estado de la enfermedad, que es util para el medico tambien para la election de la forma de tratamiento mas apropiada.

Para proceder a consideraciones adicionales de naturaleza terapeutica, merece la pena recordar que algunas estrategias terapeuticas en el sector de la oncologla se basan en el uso de anticuerpos monoclonales que son capaces de tener una influencia directa sobre la supervivencia de las celulas tumorales, privandolas de las senales esenciales de proliferation extracelular, tales como las mediadas por factores de crecimiento a traves de sus receptores celulares. Por ejemplo, uno de los objetivos de interes, en este contexto, es el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFr). La union entre el factor de crecimiento epidermico (EGF) y el correspondiente receptor EGFr desencadeno una cascada de acontecimientos bioqulmicos celulares, que incluyen una autofosforilacion y una internalization del EGFr, que culmina en la proliferacion celular.

Se ha demostrado que tanto el EGF como el factor de crecimiento transformante a (TGF-a) se unen al EGFr y dan lugar a la proliferacion y el crecimiento celular del tumor. En muchos casos, el aumento en la expresion del EGFr ha estado acompanado por la production de TGF-a o de EGF por parte de las celulas tumorales, sugiriendo por tanto la implication de un control del crecimiento autocrino en el progreso del cancer. Consecuentemente, se ha propuesto el uso de anticuerpos contra el EGF, el TGF-a y el EGFr en el tratamiento de tumores en los que son expresados o sobreexpresados. Recientemente se ha demostrado, segun se describe en la solicitud de patente internacional publicada con el n° WO28112274, la presencia de una mutation en la que en el gen K-RAS o en el gen B-RAF de

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las celulas tumorales constituye una indicacion del hecho de que el tumor no respondera al tratamiento con un agente disenado para unirse a un polipeptido del EGFr.

Se comprendera que la posibilidad de detectar, partiendo de una muestra de celulas tumorales tomada a partir del paciente mediante un procedimiento no invasivo, la presencia de dicha mutacion, proporcionarla al medico una herramienta de enorme importancia para la evaluacion de si se procede con un tratamiento basado en el uso de un anticuerpo monoclonal anti-EGFr o si se rechaza, conociendo de antemano que no sera eficaz. Tambien en esta perspectiva, sin embargo, las metodologlas de enriquecimiento, identificacion y aislamiento de celulas raras en la sangre, o en algun fluido biologico, tales como las divulgadas en el documento WO 2008/131035A, en el documento WO 2007/147076A, en el documento WO 2007/147018A, en el documento US 2007/172903A1, en el documento US 2007/059683A1, en el documento US 2007/026415A1, en el documento US 2007/026413A1 y en el documento US 2006/223178A1, permiten la obtencion de una pureza suficiente para garantizar que el posterior analisis sera fiable (la exclusion de falsos positivos, de falsos negativos, etc.) y, en algunos casos, que puedan incluso realmente llevarse a cabo (por ejemplo, para los casos en los que, dado que la pureza es demasiado baja, la proporcion entre senal y ruido es demasiado baja como para obtener una lectura valida).

Sumario de la invencion

Consecuentemente, una aspiracion de la presente invencion es proporcionar un metodo para la identificacion, el aislamiento y el posterior analisis de celulas raras en circulacion o diseminadas obtenidas mediante una toma de muestras de naturaleza no invasiva que superara los inconvenientes de la tecnica conocida descrita previamente.

Consecuentemente, segun la presente invencion se proporcionan procedimientos con fines diagnosticos para ser llevados a cabo sobre una muestra de celulas de interes obtenida partiendo de un fluido organico tomado a partir de un paciente, que son identificadas y posteriormente aisladas hasta que se obtiene una pureza de al menos un 90 %, operando segun el metodo especificado en la Reivindicacion 1.

Preferiblemente, la etapa de aislar al menos una celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas, se lleva a cabo de forma que se obtenga una muestra de celulas tumorales o porciones de las mismas que tenga una pureza de al menos un 95 %. Aun mas preferentemente, la etapa de aislar al menos una celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas se lleva a cabo de forma que se obtenga una muestra de celulas tumorales o porciones de las mismas que tenga una pureza del 100 %.

En particular, segun una realizacion preferente de la presente invencion, la etapa de aislamiento de las celulas raras se lleva a cabo segun una tecnologla desarrollada por el presente solicitante y que se basa en el uso de un microchip de silicio que integra varios cientos de miles de electrodos de dimensiones micrometricas mediante la manipulacion de las celulas individuales, de forma que se alslan las celulas de interes con una pureza unitaria que las habilita para un analisis molecular. De esta forma, el metodo segun la invencion proporciona celulas con una elevada pureza, esta muy automatizado para la parte mas delicada del proceso (el aislamiento de las celulas individuales), y permite la implementacion de tecnicas anallticas con una elevada fiabilidad diagnostica y predictiva. A la luz de lo que se ha descrito previamente, surgira claramente el ambito innovador, a nivel diagnostico y terapeutico, de la presente invencion, que permite la mejora del tratamiento oncologico en las diferentes etapas del curso de la enfermedad, haciendo posible tanto un diagnostico temprano no invasivo que tiene un nivel de fiabilidad comparable con el de una biopsia, como un seguimiento sensible preciso en el curso del tratamiento con farmacos especlficos para el cancer, y/o en la fase postoperatoria con objeto de seguir la evolucion de la enfermedad y la calidad de la respuesta a los tratamientos cllnicos, tanto en la fase metastasica como en la etapa con adyuvante.

Segun la presente invencion, se procesa en primer lugar un fluido organico tomado de una forma no invasiva a partir de un paciente, mediante la realizacion de uno o mas pasos de enriquecimiento de las celulas de interes segun una o mas de las metodologlas conocidas en la materia, tales como Ficoll®, una lisis selectiva de los eritrocitos, una filtracion con filtros basados en el tamano de las celulas - obtenidas mediante un micromecanizado fotolitografico u otra tecnica, tal como membranas con surcos grabados, deplecion o enriquecimiento magnetico. Despues, las celulas enriquecidas son marcadas con anticuerpos especlficos para la identificacion de las celulas de interes y/o de las celulas contaminantes, etc.

En este contexto, mediante la expresion "fluido organico" o "fluido corporal" se hace referencia a un fluido obtenido partiendo de una muestra corporal en la que hay una elevada probabilidad de encontrar las celulas de interes. El fluido organico puede obtenerse a partir de una muestra corporal, tanto directamente - tal como, por ejemplo, del flujo sangulneo periferico, de la medula osea, la orina - como indirectamente, tal como, por ejemplo, mediante una tripsinizacion de un tejido procedente de un nodulo linfatico.

En este contexto, mediante la expresion "celulas de interes" se hace referencia a celulas, cuyas caracterlsticas, detectables mediante las apropiadas tecnicas de analisis, pueden proporcionar indicaciones de una naturaleza

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diagnostica o terapeutica sobre una afeccion patologica del paciente.

Por ejemplo, el fluido corporal es sangre periferica, que puede ser extraida del paciente de una forma sustancialmente no invasiva, segun las metodologias de uso habitual, y las celulas de interes son celulas tumorales en circulacion (CTC).

Como ejemplo adicional, el fluido organico es sangre procedente de la medula osea, y las celulas de interes son celulas tumorales diseminadas (DTC).

El metodo de la invencion se caracteriza por tanto por el uso de un sistema microfluido que es capaz de seleccionar las celulas de forma individual a partir de la muestra enriquecida, y aislarlas de una forma automatica o semiautomatica, no manual. La etapa de aislar al menos una celula o una porcion de la celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas, se lleva a cabo mediante la captura de las celulas individuales, preferentemente cada una en un sitio especifico de una pluralidad de sitios del dispositivo microfluido, dispuestas en el dispositivo microfluido segun una matriz, y posteriormente, mediante la seleccion de las celulas individuales de entre las celulas capturadas, sobre la base de la evaluacion de las imagenes de dichas celulas.

En lo sucesivo en el presente documento, por razones de simplicidad, se usa el termino "celulas individuales", pero debe entenderse que este termino incluye una celula individual o un agregado individual de celulas en tanto en cuanto, en general, pueda suceder que las celulas de interes no estan presentes de forma aislada, sino unidas a una o mas de otras celulas, ya sean celulas tumorales o no tumorales. Adicionalmente, tambien debe entenderse la posibilidad del analisis de porciones de una celula, tal como de nucleos aislados.

A traves de dicho aislamiento de las celulas en el sistema microfluido, se obtiene un conjunto que contiene unicamente las celulas de interes, es decir, una muestra con una pureza igual al 100 %, que por lo tanto demuestra ser adecuada para ser sometida a una pluralidad de procedimientos de analisis molecular.

En el anteriormente mencionado sistema microfluido para la seleccion individual de celulas individuales, la seleccion se lleva a cabo sobre la base de las imagenes de las propias celulas.

Preferiblemente, dichas imagenes de las celulas son adquiridas en ausencia de flujo en el medio de suspension de las propias celulas.

Preferiblemente, dichas imagenes comprenden imagenes adquiridas en fluorescencia.

Por "dispositivo microfluido" se entiende, en el presente documento, un dispositivo disenado para manejar volumenes de hquido en un regimen de flujo laminar, en el que el espacio para contener el liquido durante el analisis tiene al menos una dimension menor de 1 mm.

Por "dispositivo capaz de seleccionar celulas individuales de forma individual" se tiene aqui un dispositivo que es capaz de llevar a cabo la seleccion de una o mas celulas individuales, una cada vez o simultaneamente, sobre la base de parametros evaluados individualmente sobre cada celula.

Por "aislamiento no manual" se entiende un movimiento de las celulas en el que la actividad manual del operador no es necesaria, tal como, por ejemplo, en el caso del movimiento por medio de jaulas dielectroforeticas moviles.

Por "aislamiento automatico" se entiende un movimiento de las celulas en el que la intervencion del operador no es necesaria, tal como, por ejemplo, en el caso del movimiento por medio de jaulas dielectroforeticas manejadas por un programa ejecutado de una forma sustancialmente no interactiva a traves de un microprocesador.

Por "aislamiento semiautomatico" se entiende un movimiento de las celulas en el que la interaccion con el operador permite ejercer un control indirecto sobre la manipulacion, tal como, por ejemplo, en el caso del movimiento, por ejemplo, por medio de jaulas dielectroforeticas, manejadas por un programa interactivo ejecutado a traves de un microprocesador.

Preferiblemente, la anteriormente mencionada seleccion se lleva a cabo de una forma automatica o semiautomatica.

Por "seleccion automatica" se entiende en el presente documento una seleccion de las celulas en la que la intervencion del juicio del operador no es necesaria, tal como, por ejemplo, en el caso en el que se determina de forma automatica con un clasificador automatico que celulas se corresponden efectivamente con las celulas tumorales de interes. Por ejemplo, esto podria llevarse a cabo con un clasificador de imagenes que procesa las imagenes adquiridas de las celulas, extrae las caracteristicas discriminativas de las mismas y las clasifica sobre la

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base de un algoritmo.

Por "seleccion semiautomatica" se entiende en el presente documento una seleccion de las celulas en la que es necesaria la intervencion del juicio del operador. Por ejemplo, esto podria llevarse a cabo con un sistema que adquiere las imagenes de las celulas, extrae las caracteristicas discriminativas de las mismas, y se las propone al operador para la decision final de si deben ser seleccionadas.

El analisis molecular de las celulas recuperadas es ejecutado preferentemente a traves de diferentes tecnicas - gracias a la elevada pureza de la muestra recuperada -:

- una secuenciacion (por ejemplo, para la identificacion de mutaciones);

- un analisis microsatelite (por ejemplo, con una PCR Fluorescente Cuantitativa, es decir, una QF-PCR);

- una hibridacion genomica comparativa (CGH);

- una CGH en matriz;

- una PCR de punto final;

- una PCR en tiempo real;

- un analisis de la metilacion:

° un analisis de la metilacion cuantitativo con pirosecuenciacion;

° una PCR de secuenciacion genomica con bisulfito (BSP);

° una PCR especifica de metilacion (MSP);

° un analisis de ADN combinado con restriccion de bisulfito (COBRA)

° una extension con cebadores oligonucleotidicos individuales sensibles a la metilacion (MS-SNuPE)

- un analisis de la expresion genica;

° una RT-PCR;

° una expresion genica de la celula individual;

° una PCR digital.

La etapa del analisis molecular comprende preferentemente la evaluacion de la presencia de mutaciones puntuales (de nucleotidos individuales). Las mutaciones puntuales (de nucleotidos individuales) preferentemente relativas al gen K-RAS y/o B-RAF y su presencia es un indice de la insensibilidad del paciente a un tratamiento predeterminado. La etapa de analisis molecular comprende preferentemente la evaluacion de la presencia de la hipermetilacion de genes supresores tumorales.

La etapa de analisis molecular comprende preferentemente la evaluacion de la presencia de deleciones y/o de duplicaciones.

La etapa de analisis molecular comprende preferentemente la evaluacion de la presencia de deleciones en la region del cromosoma 13q14 en las celulas tumorales de pacientes con sospecha de cancer de prostata.

La etapa de analisis molecular comprende preferentemente la evaluacion de la sobreexpresion de al menos uno de los genes BCL2, CCND1 y WNT3A en las celulas tumorales de pacientes con sospecha de cancer de prostata.

La etapa de enriquecimiento de la muestra de dicho fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas, comprende preferentemente al menos la etapa de llevar a cabo una seleccion positiva y/o negativa a traves de microesferas magneticas acopladas a anticuerpos, segun al menos una de las siguientes modalidades:

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a) CD45 negativo

b) CD45 y GPA negativos

c) CD45 y CD14 negativos

d) CD45, CD14 y GPA negativos

e) EpCAM positiva

f) CK positiva.

La etapa de enriquecimiento de la muestra del fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas comprende la etapa de tratamiento de la muestra de dicho fluido organico de forma que se separen las celulas con nucleo y se enriquezca posteriormente en celulas con nucleo.

La etapa de enriquecimiento de dicha muestra de dicho fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas, comprende preferentemente al menos la etapa de centrifugar dicha muestra de dicho fluido organico en un gradiente de densidad.

El metodo de la invention comprende la etapa de marcar las celulas tumorales en circulacion o las celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas, con al menos un anticuerpo conjugado con un marcador elegido entre el grupo que consiste en fluoroforos, cromogenos, (fluorescentes o no fluorescentes) microesferas, reconociendo el anticuerpo el antlgeno CD45, la citoqueratina o la EpCAM.

La al menos una etapa de enriquecimiento se lleva a cabo junto con la etapa de aislamiento en ese mismo dispositivo microfluido usado para la realization de la etapa de aislamiento.

Un dispositivo microfluido se usa equipado con una pluralidad de diferentes camaras, separadas entre si y conectadas hidraulicamente, delimitadas en al menos una cara por un unico chip o por una pluralidad de chips individuales.

Las caracterlsticas y ventajas adicionales de la invencion surgiran claramente a partir de la siguiente description de algunos ejemplos de realizacion no limitantes de la misma, proporcionados con referencia a las figuras de los dibujos anexos.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que resume una realizacion del metodo de diagnostico no invasivo segun la presente invencion;

La Figura 2 es una ilustracion esquematica de un ejemplo del dispositivo para la implementation del metodo (o de la parte sustancial y caracterlstica del mismo) segun la invencion;

Las Figuras 3A, 3B y 3D muestran las imagenes adquiridas en el transcurso del cribado de las celulas tumorales en circulacion segun el metodo de la invencion;

Las Figuras 4A, 4B, 4C y 4D muestran una serie de electroferogramas obtenidos en el transcurso del analisis genetico de las celulas tumorales en circulacion identificadas y aisladas segun el metodo de la invencion;

La Figura 5 muestra las imagenes adquiridas en el transcurso del cribado de las celulas tumorales en circulacion seleccionadas y aisladas segun el metodo de la invencion a partir del flujo sangulneo periferico de pacientes afectados por un CRC metastasico;

Las Figuras 6 y 7 muestran, respectivamente, los espectros relativos a la detection de una mutation Gly2Val en KRAS de las CTC aisladas a partir del flujo sangulneo periferico de un paciente afectado por un CRC metastasico segun el metodo de la invencion;

La Figuras 8, 9 y 10 muestran, cada una, cinco imagenes adquiridas en el transcurso del cribado de una muestra enriquecida, dichas imagenes se refieren al contenido de cinco jaulas dielectroforeticas en un chip DEPArray™. Las celulas de cada figura se recuperaron conjuntamente y por separado a partir de las celulas de las otras figuras. La

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Figura 10 muestra celulas tumorales en circulacion segun el metodo de la invencion, y las Figuras 8 y 9 los correspondientes controles negativos (leucocitos normales).

Description detallada

El sujeto de la presente invencion es un metodo para la identification, el aislamiento y el posterior analisis de celulas raras, en particular de celulas tumorales en circulacion o de celulas tumorales diseminadas, obtenidas preferentemente mediante una toma de muestras de una naturaleza no invasiva.

Toma de muestras

Las muestras pueden obtenerse a partir de la circulacion periferica del paciente, o tambien a partir de la medula osea a traves de diversas tecnicas conocidas en el sector.

Enriquecimiento previo

La proportion de celulas tumorales en la muestra tomada puede ser enriquecida mediante el uso de diversos metodos, tales como, por ejemplo: una centrifugation en un gradiente de densidad, constituido por soluciones tales como, Ficoll® o Percoll®; un enriquecimiento mecanico, tal como filtros de diversos tipos; un enriquecimiento por medio de una separation a traves de una dielectroforesis a traves de un dispositivo provisto para este fin - un clasificador de celulas activadas por dielectroforesis (DACS); una lisis selectiva, tal como, por ejemplo, la lisis selectiva de los eritrocitos que no son de interes; una separacion inmunomagnetica, a traves de microesferas inmunomagneticas con una selection positiva (mediante el uso de microesferas unidas a anticuerpos especlficos para la poblacion que se va a recuperar) o con una seleccion negativa (la depletion de las poblaciones celulares que no son de interes), y en el que pueden acoplarse los dos tipos de seleccion con objeto de aumentar la especificidad del procedimiento; una FACS, con celulas marcadas con un anticuerpo fluorescente especlfico; una inmunoseparacion en fase solida, ventajosamente por medio de sistemas microfluidos que presentan las superficies recubiertas con anticuerpos especlficos para receptores epiteliales (tal como las EpCAM).

La mayorla de estos procedimientos pueden ser automatizados, y todos los procedimientos de clasificacion pueden estar precedidos por una separacion mediante una centrifugacion en un gradiente de densidad, o como alternativa, pueden ser aplicados sobre sangre completa.

En general, el proceso comienza con una dilution, pero esto no es estrictamente necesario para todas las tecnicas. Otras tecnicas de enriquecimiento

Una tecnica adicional bien conocida por las personas expertas en el ramo es la conocida como MACS, desarrollada por Miltenyi Biotech, o tambien Easy-sep, desarrollada por Stem-cell technologies.

Alternativamente, es posible el uso de microesferas paramagneticas con un tamano mayor, que no requieren el uso de una columna especial, pero tambien pueden usarse cuando se trabaja con pocillos o tubos de ensayo (tales como, por ejemplo, anti-Ep-CAM Dynabeads).

Para resumir, la etapa de enriquecimiento de la muestra en la poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales se lleva a cabo preferentemente a traves de un metodo que consiste en etapas sucesivas por medio de una seleccion de las celulas realizada sobre la base de al menos un parametro elegido entre el grupo que consiste en:

a. densidad de la masa;

b. morfologla;

c. propiedades electricas;

d. propiedades qulmicas;

e. propiedades mecanicas;

f. expresion de los antlgenos de superficie;

g. expresion de los antlgenos intracitosolicos;

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h. propiedades dielectricas;

i. propiedades magneticas;

l. propiedades geometricas (tamano, etc.); y

m. propiedades opticas.

o combinaciones de los mismos.

Ventajosamente, el enriquecimiento de las celulas tumorales se obtiene despues adicionalmente por medio de una segunda etapa, en la cual se lleva a cabo la seleccion positiva o negativa de las celulas a partir de las celulas mononucleadas recuperadas en la primera etapa. Obviamente, la segunda etapa de enriquecimiento puede comprender una seleccion realizada sobre la base de la capacidad para expresar o no un antlgeno especlfico, evaluada con una de las siguientes tecnicas:

a. MACS, es decir, clasificador de celulas activadas por magnetismo;

b. DACS, es decir, clasificador de celulas activadas por dielectroforesis;

c. FACS, es decir, clasificador de celulas activadas por fluorescencia.

Aislamiento de las celulas tumorales individuales

Despues, la muestra que contiene las celulas tumorales es insertada en un dispositivo microfluido que es capaz de seleccionar individualmente las celulas individuales y aislarlas de una forma automatica o semiautomatica no manual. Para este fin, es posible el uso de un aislamiento dielectroforetico (DEPArray, mediante el uso de, por ejemplo, las tecnicas descritas en el documento PCT/IB2007/000963 o en el documento PCT/IB2007/000751, o de nuevo en Manaresi et al., IEEE J. Solid-State Circuits, 38, 2297-2305 (2003) y en Romani et al., Proceedings of the International Solid State Circuit Conference, 1, 224-225 (2004)), o tambien de trampas opto-electronicas o de un aislamiento optoforetico o de nuevo, de pinzas laser (vease, por ejemplo, Reichle et al., Electrophoresis, 22, 272-82 (2002) o Fiedler et al., Anal. Chem., 70, 1909-15 (1998)).

La identification de las celulas de interes puede llevarse a cabo, por ejemplo, a traves de sensores:

- sensores externos;

- sensores opticos, tal como un microscopio de fluorescencia; o tambien

- sensores internos;

- sensores opticos, segun se divulga en las patentes n° WO2007049103 y WO2007010367, que describen un metodo integrado de identificacion de las celulas fluorescentes;

- sensores impedenciometricos, segun se divulga en las patentes n° WO2007049103 y WO2007010367, para la detection de las caracterlsticas impedenciometricas de las celulas.

La senal para la deteccion de las celulas tambien puede ser indirecta, tal como, por ejemplo, la presencia de una micromicroesfera acoplada a un anticuerpo, que a su vez esta acoplado a la celula. La presencia de una o mas microesferas acopladas a una celula puede ser detectada como ya se ha descrito previamente, por medio de sensores impedenciometricos o de sensores opticos (de campo claro o de fluorescencia).

Segun la invention, mediante la manipulation individual de las celulas tumorales individuales por medio de un dispositivo microfluido, preferentemente de una forma automatizada, las celulas tumorales contenidas en la muestra enriquecida tomadas previamente son aisladas para constituir una muestra que se va a analizar que tiene una pureza de al menos un 90 %.

Preferiblemente, las celulas tumorales son aisladas para constituir una muestra que se va a analizar que tiene una pureza mayor del 95 %. Incluso mas preferentemente, las celulas tumorales son aisladas para constituir una muestra que se va a analizar que tiene una pureza del 100 %.

Analisis genetico

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Sobre las celulas tumorales recuperadas segun la invention pueden llevarse a cabo diversos tipos de analisis que permiten la caracterizacion genetica o cromosomica de las mismas a diferentes niveles de resolution y sensibilidad, y segun el fin diagnostico del estudio, de acuerdo con lo que se ha descrito previamente.

Por ejemplo, es posible proceder a la secuenciacion de las CTC tomadas a partir de pacientes que presentan metastasis con objeto de detectar la presencia de mutaciones en el gen K-RAS.

En el caso del cancer de prostata, es posible evaluar la presencia de deleciones en las CTC por medio de una amplification del genoma completo de una celula individual.

De nuevo, en el caso de los canceres de origen primario desconocido (CUP) es posible la identification del tejido original a traves del perfil genetico y/o del perfil de expresion de las CTC, obteniendo por lo tanto una information que es fundamental para la election del tratamiento mas apropiado.

En el caso de las celulas tumorales diseminadas, es entonces posible llevar a cabo un analisis de la expresion genica de las CTC y/o de las DTC individuales con objeto de identificar los indicadores pronosticos y los potenciales objetivos terapeuticos.

Ejemplos de realizaciones preferidas de la invencion

A modo de ejemplo no limitante, a continuation se describe una realization preferente del metodo segun la presente invencion, siguiendo el diagrama de flujo representado en la Figura 1.

Muestra de partida

En una muestra de 17 ml de sangre completa tomada a partir de un donante voluntario varon se introdujeron mediante una adicion 2.000 celulas pertenecientes a la llnea celular de cancer de mama MCF7.

Enriquecimiento preliminar

La realizacion preferente de la invencion contempla un proceso que consiste en etapas sucesivas.

(a) FICOLL®. La muestra se trato con un anticoagulante (por ejemplo, EDTA) y se transfirio, preferentemente en las siguientes 8 h, a un tubo de ensayo esteril de 50 ml hecho de polipropileno. A partir de esto se extrajo un volumen de 50 pl, que se uso para el recuento de los globulos blancos sangulneos (WBC) y de los globulos rojos sangulneos (RBC) mediante el uso de un contador Coulter.

Despues la muestra se diluyo a 1:4 con PBS y EDTA (2 mM) que tiene un pH de 7,2.

Se estratifico de forma precisa un volumen (< 30 ml) de sangre diluida en 15 ml de Ficoll-Hypaque (densidad = 1,077 g/ml).

Despues la muestra se centrlfugo a 654 g durante 30 min a 22 °C en una centrlfuga de rotor inclinado (sin freno).

El plasma se extrajo con una pipeta (del tipo Pasteur) - pero tambien puede usarse un pipeteador automatico - teniendo cuidado de no interferir en la capa de linfocitos de la interfase. La capa fue recogida cuidadosamente con un cuentagotas y transferida a un tubo de ensayo conico esteril de 50 ml de polipropileno.

El tubo de ensayo se lleno con PBS y EDTA (2 mM), se agito y se centrlfugo a 300 g durante 10 min a 10 °C.

Se rechazo la portion del sobrenadante.

El tubo de ensayo se lleno con PBS y EDTA (2 mM), y se agito de nuevo y se centrlfugo a 300 g durante 10 min a 10 °C. Se extrajo la porcion de sobrenadante.

A partir de la muestra se recogio el sedimento de celulas (es decir, el complejo de las celulas mononucleadas del flujo sangulneo periferico, las PBMNC), para ser resuspendido en 5 ml de tampon. A partir de esto se tomo una allcuota de 50 pl para llevar a cabo el recuento de los WBC con un Coulter.

El tubo de ensayo se lleno con tampon, se agito y se centrifugo a 200 g durante 10 min a 10 °C. Se rechazo la porcion del sobrenadante.

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Una alternativa al Ficoll® como primera etapa de enriquecimiento previo para la eliminacion de los eritrocitos esta representada por la lisis selectiva de los eritrocitos, que explota las propiedades quimicas de las celulas.

(b) DEPLECION EN CD45 MEDIANTE MACS

El sedimento de celulas se resuspendio en 80 pl de tampon para un total de 107 celulas.

Se anadio una cantidad de 20 pl de microesferas de anti-CD45 para un total de 107 celulas. Siguieron las etapas de agitacion y de incubacion durante 15 min a 4 °C.

Las celulas se lavaron rellenando el tubo de ensayo con tampon y centrifugando a 300 g durante 10 min a 10 °C.

La porcion de sobrenadante se rechazo y el sedimento de celulas se resuspendio en 500 pl de tampon para un total de 108 celulas.

La columna MACS de tipo LS (Miltenyi) se posiciono en el interior del campo magnetico de un separador MACS adecuado, segun las indicaciones proporcionadas por el fabricante.

Se posiciono un prefiltro en cada columna.

Tanto el prefiltro como la columna se prepararon mediante un aclarado con 3 ml de tampon.

Se aplico la suspension de celulas a la columna (o al prefiltro).

El tubo de ensayo que contenia la suspension de celulas, ahora vacio, se lleno con 9 ml de tampon.

Se recogieron las celulas no marcadas y la columna se lavo mediante la adicion, tres veces, de 3 ml de tampon, tomando cada vez del tubo de ensayo rellenado en la etapa previa.

La columna se retiro del separador y se coloco en un tubo de ensayo.

Se introdujo una cantidad de 5 ml de tampon en la columna mediante el uso de una pipeta.

La fraccion que contiene las celulas marcadas magneticamente fue inmediatamente expulsada a continuacion mediante la manipulacion del embolo.

Para reducir el numero de celulas contaminantes adicionales, es posible el uso de un coctel de deplecion con microesferas magneticas adicionales funcionalizadas con anticuerpos que reconocen los antigenos presentes selectivamente en las celulas que se van a deplecionar, tales como, por ejemplo, microesferas anti-GPA (para la eliminacion de los eritrocitos residuales del Ficoll).

Para reducir aun mas el numero de celulas contaminantes, es posible llevar a cabo un segundo pase en una columna magnetica.

(c) FIJACION Y MARCAJE

Las celulas post-MACS se centrifugaron a 300 g durante 10 min; el sedimento se resuspendio en 40 pl de tampon.

La muestra se transfirio a un tubo de ensayo de 1,5 ml. A esto se anadieron 760 pl de paraformaldehido al 4 % recien preparado, seguido de una incubacion durante 20 min a la temperatura ambiente.

Despues de una centrifugacion a 0,2 r.c.f. durante 5 min en la microcentrifuga, se extrajo la fraccion de sobrenadante.

Esto fue seguido por un lavado con 1 ml de PBS, una centrifugacion a 0,2 r.c.f. durante 5 min en la microcentrifuga, y de nuevo se aspiro la fraccion del sobrenadante.

A esto se anadieron 100 pl de PBS/BSA al 3 % (tampon de bloqueo).

La muestra se incubo durante 10 min a la temperatura ambiente.

Despues de una centrifugacion adicional a 0.2 r.c.f. durante 5 min en la microcentrifuga, seguido de la aspiracion de

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la fraccion del sobrenadante, la tincion se llevo a cabo con EpCAM-FITC y CD45-PE (Miltenyi, segun el protocolo recomendado por el fabricante).

Para completar el proceso se llevo a cabo un lavado final con 1.000 gl de Super Buffer (Hepes 400 mM, BSA al 1 %) y 1 gl de Hoechst 33324 diluido con agua (100 gg/ml) y la muestra se agito vorticialmente.

La muestra se sometio a un control de calidad para verificar la intensidad de la fluorescencia del marcador y la concentracion total de celulas. Una parte de la muestra marcada se resuspendio en un volumen mlnimo de tampon especlfico, util para la manipulation dielectroforetica, y se cargo en un dispositivo para el control de calidad de la muestra y se controlo bajo un microscopio de fluorescencia: se aprecio la intensidad de la fluorescencia de las celulas en los diferentes canales y se realizo el recuento de las celulas marcadas con Hoechst 33324 (celulas con nucleo totales). Si la concentracion de celulas era mayor que la optima para una apropiada operation del dispositivo para el aislamiento de las celulas individuales, la siguiente etapa era la dilution de la muestra para obtener la concentracion deseada.

Aislamiento

Las celulas as! obtenidas se insertan despues en el chip DEPArray® CONV600K (fabricado por Silicon BioSystems, vease, por ejemplo, el documento n° WO0069525) para la manipulacion dielectroforetica y el aislamiento de las celulas tumorales. El dispositivo como un todo esta ilustrado en la Figura 2.

La muestra se sometio a un cribado, una identification y una selection, una clasificacion y una recuperation de las celulas tumorales.

Las celulas enjauladas fueron cribadas de una forma automatica o manual en el microscopio con 3 canales de fluorescencia diferentes (es decir, en 3 longitudes de onda diferentes). La observation en el canal DAPI (donde por "canal DAPI" se entiende la excitation y la emision UV en el azul, que por lo tanto se usa para la visualization de Hoechst 33324) permite la identificacion de las celulas con nucleo (positivas), mientras que la observacion en los canales de EpCAM y de CD45 permite la diferenciacion entre las celulas tumorales (DAPI+, Ep-CAM+ y CD45-, con una morfologla compatible), los linfocitos (DAPI+, EpCAM-, CD45+) y las senales falsas (DAPI+, EpCAM+ y CD45+ o tambien DAPI-, Ep-CAM+ y CD45+, o DAPI+, EpCAM+ y CD45- con una morfologla incompatible con las celulas tumorales).

Las Figuras 3 A-B-C muestran las imagenes adquiridas en el transcurso del cribado de la muestra en el DEPArray® CONV600K. Mas en particular, la Figura 3A muestra las imagenes de tres celulas tumorales en los tres canales tomados en consideration. La Figura 3B muestra las imagenes de una celula falsa en los tres canales tomados en consideration. La Figura 3C muestra las imagenes de dos linfocitos en los tres canales tomados en consideracion.

Despues se llevo a cabo la seleccion de las celulas mediante la seleccion de las jaulas que contienen las celulas que han sido positivas en DAPI (celulas con nucleo), positivas en EpCAM y negativas en CD45. Se identificaron dieciseis celulas en el chip, algunas de las cuales eran dobles. Finalmente se recuperaron quince celulas, algunas de las cuales eran dobles, en unos pocos microlitros (< 40 gl) en un tubo de PCR de 0,2 ml.

El analisis final se llevo a cabo mediante el uso de un Applied Biosystems Minifiler Kit.

En las Figuras 4 A-B-C-D se proporcionan los resultados del analisis de los fragmentos (QF-PCR) llevado a cabo mediante el uso de un Minifiler Kit. En los cuatro canales de fluorescencia tomados en consideracion se analizaron diferentes microsatelites. Puede apreciarse como en ningun caso habla restos de contamination por alelos procedentes del sujeto varon en cuya sangre se introdujeron las celulas tumorales mediante una adicion.

Como una alternativa al anticuerpo anti-EpCAM, es posible el uso de un tipo diferente de anticuerpo, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que reconozca uno o mas tipos de citoqueratina, que no sea expresado en las celulas sangulneas.

Alternativamente, es posible el uso de un anticuerpo que sea mas caracterlstico del cancer (especlfico tumoral), tal como, por ejemplo:

- para la prostata, el antlgeno especlfico prostatico (PSA);

- para el pulmon, el factor de transcription tiroideo 1 (TTF-1);

- para la mama, el receptor del factor de crecimiento epidermico humano 2 (HER2/neu)

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Posibilidades de aplicacion

La obtencion de una muestra de CTC que tenga una pureza del 100 %, siguiendo un procedimiento automatizable de seleccion y aislamiento, hace posible rutas diagnosticas para una pluralidad de afecciones que, de otro modo, no podrlan ser analizadas de una forma exacta, fiable y precisa.

Ejemplo 1 Evaluacion no invasiva de mutaciones (por ejemplo, en el gen K-RAS) en pacientes con cancer.

A continuacion se describe el caso del aislamiento de CTC a partir del flujo sangulneo periferico de pacientes afectados de cancer colorrectal metastasico (mCRC).

Se extrajo una muestra de 7,5 ml de flujo sangulneo periferico del paciente en tubos Vacutainer con anticoagulante de EDTA (Beckton Dickinson). La muestra fue analizada con un contador Coulter (Beckman Coulter) y presentaba 42 x 106 leucocitos (WBC) y 43,95 x 109 eritrocitos (RBC). Las PBMC se aislaron despues a traves de una centrifugacion (en Ficoll 1077). Las PBMC recuperadas (16,5 x 106 sobre la base del recuento con el contador Coulter) se lavaron en PBS con BSA y EDTA (Running Buffer, Miltenyi) y se seleccionaron a traves de una depletion con microesferas magneticas conjugadas con anticuerpos anti-CD45 y anti-GPA (Miltenyi) segun las instrucciones del fabricante. Las celulas resultantes (fraction negativa para CD45 y GPA) se fijaron con PFA al 2 % en PBS durante 20 min a la temperatura ambiente (TA). Esto fue seguido por un lavado con PBS y una incubation en PBS/BSA al 3 % (tampon de bloqueo), durante 10 min a la temperatura ambiente. Despues de un aclarado con PBS, se llevo a cabo el marcaje de CD45 con 10 |jl de anticuerpo anti-CD45 conjugado con PE (Miltenyi) en 100 |jl de tampon de analisis Miltenyi (RB) durante 10 min a 4 °C. La reaction fue bloqueada mediante la adicion de 1 ml de RB, una centrifugacion y la extraction de la portion del sobrenadante. Despues, las celulas se permeabilizaron con 90 jl de InsidePerm (Miltenyi) y se marcaron simultaneamente con 10 jl de anticuerpo anti-CK conjugado con FITC- durante 10 min a la temperatura ambiente. La reaccion fue finalizada mediante la adicion de 1 ml de Inside Perm, una centrifugacion y la elimination de la fraccion de sobrenadante. El sedimento se resuspendio en tampon optimizado para la manipulation de celulas fijadas y permeabilizadas con dielectroforesis - Hepes (400 mM) + BSA (al 2 %) en agua (SB) - y DAPI (1 mg/ml) y, se lavo con SB y se resuspendio para su inyeccion en el chip DEPArray™ CONV600K (con 100.000 jaulas dielectroforeticas). En el chip habla presentes aproximadamente 16.000 celulas. Despues de un cribado de DAPI/FITC/PE, se identificaron las CTC. La Figura 5 contiene imagenes de las CTC (indicadas por una fecha blanca) seleccionadas y aisladas por medio del metodo de la invention, siendo dichas imagenes apropiadamente procesadas de forma que se destacara la fluorescencia en los tres canales respectivos: AcMc anti-CK conjugados con FITC (Miltenyi) en el canal verde; AcMc anti-CD45 conjugados con PE (Miltenyi) en el canal rojo; y un marcaje con DAPI del ADN para la identification de los nucleos en el canal azul.

Deberla apreciarse como es posible distinguir claramente entre los diversos tipos de posibles acontecimientos a partir de un analisis de las imagenes procesadas, mientras que en un analisis menos refinado que no esta basado en las imagenes, sino solo en la intensidad de la fluorescencia global, las imagenes podrlan ser rechazadas como falsos positivos.

Por ejemplo, la jaula con el ID 382 contiene un par de CTC. Estas estaban evidentemente ya unidas al comienzo, dado que la probabilidad de que dos de las tres CTC presentes terminen en una misma jaula es despreciable. Sin el analisis de imagen, este acontecimiento podrla haber sido rechazado dado que, en general, los agrupamientos de celulas pueden dar lugar a senales falsas de fluorescencia, dado que el anticuerpo - por ejemplo, anti-CK - queda atrapado de una forma no especlfica. La recuperation de las dos celulas ID382 tiene por lo tanto una pureza del 100 % (y es compatible con la mayorla de los analisis moleculares).

La jaula con el ID 11439 indica un acontecimiento DAPI+/CK+/CD45+. Sin el analisis de imagen, dicho acontecimiento podrla haber sido rechazado como falso, pero en su lugar, dado que la imagen hace posible la detection de la distribution de fluorescencia en el acontecimiento, es posible interpretar el dato como haciendo referencia a una jaula DAPI+/CK+/CD45-CTC (indicada por una flecha blanca) junto con otras tres celulas CK con nucleo, dos de las cuales son CD45+. El contenido de dicha jaula puede ser recuperado por separado. Mediante el uso de un sistema basado en jaulas dielectroforeticas moviles, puede llevarse a cabo la segregation en las jaulas individuales de las celulas que inicialmente comparten la misma jaula mediante la aplicacion de los apropiados patrones de jaulas. Si no es posible la segregacion de las CTC de las demas celulas contaminantes de la jaula, es posible en cualquier caso recuperar el contenido de la jaula, asociando a dicha recuperacion la information de la presencia de contaminantes. Esto es una ventaja adicional de la tecnica segun la invencion. La pureza de las celulas recuperadas esta indicada abajo, y esto debe tenerse en cuenta en el analisis posterior. En el caso en cuestion, la celula podrla por lo tanto recuperarse junto con las otras tres (con una pureza del 25 %), o tambien ser separada y recuperada individualmente para obtener una recuperacion pura del 100 % (si se alsla individualmente), o tambien del 50 % si se alsla junto con un contaminante, o del 90 % si se alsla junto con un contaminante y otras nueve CTC adicionales, sin contaminantes posiblemente presentes en otras jaulas (no en este caso).

La jaula con el ID 5007 muestra un acontecimiento que, sobre la base de la fluorescencia total, parecerla similar al de la ID 11439 dado que es un acontecimiento DAPI+/CK+/CD45+. Sin embargo, sobre la base de la imagen, es

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posible determinar como este es un acontecimiento falso en tanto en cuanto esta unido a un agrupamiento que ha atrapado los anticuerpos anti-CK.

La jaula con el ID 13103 muestra un acontecimiento que, sobre la base de la fluorescencia total, parecerla similar al de la ID 11439 dado que es un acontecimiento DAPI+/CK+/CD45+. Sin embargo, sobre la base de la imagen, es posible determinar como este es un acontecimiento falso en tanto en cuanto esta unido a una celula doble positiva individual con una senal CD45+ (no CTC).

Las jaulas con el ID 8614 muestran un acontecimiento CK+/CD45- pero DAPI-, no clasificado como CTC. La jaula con el ID 7796 muestra un acontecimiento de control (dos globulos blancos sangulneos) que comprende dos celulas que no son clasificadas como CTC, debido a que son CK-, y una es tambien CD45+.

Las celulas de interes pueden por lo tanto ser aisladas u otra cosa, dependiendo del proposito del experimento, en terminos de pureza de la muestra y segun la facilidad de separacion de la celula desde un aglomerado de celulas en el que esta comprendida. En este sentido, la selection basada en las imagenes es particularmente eficaz para la exclusion de falsos positivos y de falsos negativos.

Como alternativa al Ficoll®, es posible el uso de una tecnica basada en la lisis selectiva de los globulos rojos sangulneos (RBC). En este caso, en la muestra sigue habiendo en el primer caso tambien granulocitos. Despues de dicha elimination de los RBC, las celulas tumorales pueden ser adicionalmente enriquecidas a traves de una seleccion inmunomagnetica positiva (por ejemplo, con microesferas magneticas acopladas a anticuerpos anti- EpCAM), o de una seleccion inmunomagnetica negativa (por ejemplo, a traves de microesferas magneticas acopladas a anticuerpos anti-CD45 o a un coctel con anticuerpos anti-CD45 y con otros anticuerpos contra los antlgenos que no estan presentes en las CTC). En cualquier caso, las pocas CTC presentes se obtienen en una muestra que contiene decenas de miles o cientos de miles de leucocitos.

El aislamiento de las CTC a partir del flujo sangulneo periferico es asimismo compatible con los procedimientos de enriquecimiento y marcaje aprobados por la FDA, tales como el sistema Veridex CellSearch™. En este caso, el sistema CellSearch tambien puede usarse para llevar a cabo el marcaje y el enriquecimiento de una forma automatizada (con la maquina AutoPrep). Con este sistema se obtienen las pocas CTC presentes (con un rendimiento optimo de aproximadamente el 90 %) de una muestra, normalmente con unicamente unos pocos miles de leucocitos contaminantes (valores tlpicos de 1.000-5.000). El Cell-Search AutoPrep representa un excelente sistema de enriquecimiento, y tiene su principal limitation en el hecho de que se basa en una seleccion inmunomagnetica positiva para la EpCAM. Consecuentemente, en algunos tipos de tumores, en los que las CTC no sobreexpresan la EpCAM, serla posible encontrar unicamente unas pocas CTC. En dichos casos, la seleccion negativa es mas indicada para la detection de las celulas CD45+.

La deteccion del estado de mutation del gen K-RAS tiene una considerable importancia cllnica, dado que se ha demostrado que algunas mutaciones del K-RAS estan relacionadas con la ineficacia de los tratamientos basados en anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor EGFr. Dichas mutaciones activan, de hecho, cascada abajo, el mecanismo de proliferation celular a pesar de la inhibition cascada arriba del EGFr. Los tratamientos con Cetuximab y Panitumumab ya estan indicados unicamente para los pacientes con el KRAS natural. La posibilidad de identificar la mutacion en las CTC proporciona la posibilidad de no tener que recurrir a una biopsia, en particular en todos aquellos casos en los que la biopsia no es posible o es muy compleja de realizar. Incluso cuando hay disponibles tejidos extraldos quirurgicamente, la posibilidad de analizar las CTC es interesante en cualquier caso. Los tumores son intrlnsecamente inestables desde el punto de vista genetico, y las metastasis pueden derivar de celulas ubicadas en sitios distintos al del tumor primario; consecuentemente, las CTC pueden reflejar mejor el perfil molecular de las celulas que estan experimentando metastasis.

Con objeto de verificar la posibilidad de detectar las mutaciones del K-RAS a partir de las CTC, se analizaron las CTC procedentes del flujo sangulneo periferico de pacientes afectados por cancer colorrectal metastasico (mCRC). Siguiendo el procedimiento de enriquecimiento descrito anteriormente, se identificaron y aislaron las CTC con la DEPArray™. La pureza del 100 % permite la deteccion de la posible presencia de la mutacion a traves de la secuenciacion: despues de la amplification previa de las copias iniciales, por ejemplo con una PCR con cebadores internos, se lleva a cabo la secuenciacion mediante el uso de las tecnicas conocidas.

En el caso en cuestion, se llevo a cabo el analisis cascada abajo mediante el uso de la tecnica DOP-PCR con el kit Omniplex producido por Sigma. Despues de la amplificacion, el producto fue analizado con un secuenciador de electroforesis capilar fabricado por Applied Biosystems.

La Figura 6 muestra un ejemplo de deteccion de una mutacion en una de las muestras analizadas, que se corresponde con una mutacion de glicina a valina en el codon 12 (en la Figura 7 se muestra el correspondiente control negativo).

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Ejemplo 2 - Evaluation en las CTC de las deleciones (por ejemplo, en el cancer de prostata) a traves de la amplification del genoma completo de una celula individual y una CGH en matriz. En este caso, se lleva a cabo ventajosamente el aislamiento de las celulas individuales que van a ser recuperadas en diferentes pocillos. De esta forma, el analisis tiene en cuenta la heterogeneidad de la poblacion, y no solo proporciona la media sino tambien multiples senales relativas a cada celula, de forma que es mas facil la identification de las mutaciones presentes unicamente en algunas de las celulas tumorales.

Ejemplo 3 - Identification no invasiva del tejido original en tumores CUP, a traves del perfil genetico y/o del perfil de expresion de las CTC.

Ejemplo 4 - Analisis de la expresion genica en celulas tumorales diseminadas (DTC) individuales para la identification de los indicadores pronosticos y de los potenciales objetivos terapeuticos. Tambien en este caso, se lleva a cabo ventajosamente el aislamiento de las celulas individuales que van a ser recuperadas en diferentes pocillos. De esta forma, el analisis tiene en cuenta la heterogeneidad de la poblacion, y no solo proporciona la media sino tambien multiples senales para cada pocillo, de forma que es mas facil la identification de las mutaciones presentes unicamente en algunas de las celulas tumorales.

Ejemplo 5 - Como ya se ha mencionado, en general, debe entenderse que lo que se ha dicho anteriormente relativo al "aislamiento de celulas" tambien se aplica al "aislamiento de porciones de una celula", tal como, por ejemplo, el nucleo. De hecho, esto permite en cualquier caso, para ciertos tipos de information biomolecular, la obtencion de una information significativa (por ejemplo, mediante la evaluation del ADN genomico contenido en el nucleo).

En el ejemplo del aislamiento de un nucleo, la selection de las celulas puede llevarse a cabo a traves de tecnicas que marcan de una forma distinguible los nucleos de las celulas tumorales (CTC o DTC) con respecto a las celulas no tumorales, tal como, por ejemplo, una FISH. En este caso, la presencia de multiples senales revela la presencia de duplicaciones en el ADN genomico (una caracterlstica de las celulas tumorales que en general no esta presente en las celulas normales).

En particular, en el ejemplo del cancer de mama, es de interes la evaluation de la duplication de la region genomica relativa al gen HER2, ubicado normalmente en el cromosoma 17. Por lo tanto, se aplican dos tipos de sondas, una para el centromero del cromosoma 17, y una para el gen HER2. Si la proportion gen/cromosoma es mayor de dos, la celula es considerada de forma convencional positiva en la prueba. Dicha information tiene implicaciones, por ejemplo, en el uso de farmacos tales como, Trastuzumab (Herceptin) que presentan eficacia unicamente en el caso de una sobreexpresion del correspondiente receptor HER2. No solo el recuento, sino tambien la identification y el aislamiento de dichas celulas en una forma purificada, permiten la adquisicion de information adicional sobre las caracterlsticas geneticas del tumor.

Ejemplo 6

La presencia de variaciones en el numero de copias (CNV) en el ADN constituye una caracterlstica tlpica de un tumor. Para la evaluation de nuevos farmacos, es de considerable interes ser capaces de evaluar las CNV con objeto de asociarlas al curso de la enfermedad, y potencialmente, a las areas del genoma en las que las CNV tienen una influencia significativa sobre el curso de la enfermedad (tanto en el caso de un pronostico favorable como en el caso de un pronostico desfavorable). Esta information puede ser de ayuda en la identification de los genes que podrlan ser objetivos para la action farmacologica. Adicionalmente, en la fase de diagnostico del cancer, puede ser posible despues la identification de una forma mlnimamente invasiva, del perfil de CNV de las CTC del paciente con objeto de orientar el tratamiento sobre la base de la experiencia adquirida.

Para demostrar la posibilidad de determinar las CNV, se separaron y aislaron pequenas muestras de CTC y, consecuentemente, pequenas muestras de control negativo.

A partir de un paciente que padece un cancer de mama metastasico (mBrCa), se obtuvo una muestra de 7,5 ml de sangre periferica y se puso en un tubo CellSave (Veridex). La muestra fue enriquecida y marcada con anticuerpos fluorescentes (anti-CK conjugados con PE, anti-CD45 conjugados con APC) y DAPI, con el CellSearch AutoPrep, segun el procedimiento habitual. Se extrajeron las celulas enriquecidas del cartucho Veridex y se resuspendieron en un volumen reducido. Dicha muestra se inyecto en el chip DEPArray™ A300K (Silicon Biosystems S.p.A.) - con 307.200 electrodos y varias jaulas programables, normalmente entre 19.200 y 76.800. Despues del barrido, se aislaron dos controles negativos con cinco celulas, dos muestras con cinco CTC, una muestra con una unica CTC.

Las Figuras 8 y 9 ilustran las celulas recuperadas, respectivamente, en una primera y una segunda recuperation con cinco leucocitos cada una (DAPI+/CD45+/CK-) como control negativo para la detection de las CNV. La Figura 10 ilustra las cinco CTC recuperadas por separado, que forman el sujeto del analisis de las CNV.

Despues de una selection y un aislamiento llevados a cabo mediante el uso del metodo segun la invention, y dado

que ahora hay disponible una muestra con un grado de pureza mayor del 90 % (en el caso en cuestion, del 100 % para la recuperacion de las CTC ilustradas en la Figura 10), es posible llevar a cabo un analisis con exito basado en la amplification del genoma total, segun una metodologla ilustrada en el documento n° EP1109938, una PCR mediada por ligation, seguido de una hibridacion genomica comparativa en metafase (CGH) o una CGH en matriz 5 que, con muestras con una pureza inferior, serlan imposibles o intrlnsecamente poco fiables en tanto en cuanto la senal detectada serla demasiado debil o confusa en presencia de celulas no tumorales.

Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para el diagnostico de afecciones tumorales y/o del correspondiente estado de avance, que comprende las etapas de:

   a. El enriquecimiento de una muestra de un fluido organico obtenido a partir de un paciente, teniendo dicho fluido organico una elevada probabilidad de contener al menos una celula tumoral en circulacion o una celula tumoral diseminada o porciones de las mismas en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas;

   b. La obtencion de una muestra purificada a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas;

   c. La realizacion de un analisis molecular sobre dicha muestra purificada, de tal forma que se destaque al menos una caracterlstica de dicha al menos una celula adecuada, para permitir dicho diagnostico;

   estando dicho metodo caracterizado porque

   - dicha etapa de obtencion de una muestra purificada se lleva a cabo mediante el aislamiento de una forma no manual de al menos una celula o una porcion de una celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas mediante la seleccion individual de celulas individuales o de porciones de celulas sobre la base de la evaluation de las imagenes de dichas celulas en un dispositivo microfluido, de forma que se obtenga una muestra purificada que tenga una pureza de al menos el 90 %; y

   - porque comprende la etapa de marcar las celulas tumorales en circulacion o las celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas con al menos un anticuerpo conjugado con un marcador elegido entre el grupo que consiste en:

   - fluoroforos

   - cromogenos

   - microesferas (fluorescentes o no fluorescentes);

   reconociendo el anticuerpo, el antlgeno CD45, la citoqueratina o la EpCAM.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicha etapa de aislamiento de al menos una celula o una porcion de una celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas se realiza de forma que se obtenga una muestra diagnostica que tenga una pureza de al menos el 95 %.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 2, caracterizado porque dicha etapa de aislamiento de al menos una celula o una porcion de una celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas se realiza de forma que se obtenga una muestra diagnostica que tenga una pureza del 100 %; seleccionandose dicho dispositivo microfluido entre en el grupo que consiste en:

   dispositivos microfluidos de aislamiento dielectroforetico;

   dispositivos microfluidos de trampas opto-electronicas;

   dispositivos microfluidos de aislamiento optoforetico;

   dispositivos microfluidos de pinzas de laser.
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado porque dicho sistema microfluido selecciona dichas celulas o porciones de las mismas de una forma automatica o semiautomatica.
5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha seleccion individual de dichas celulas se lleva a cabo sobre la base de los parametros de dichas celulas evaluados en ausencia de flujo de dicho fluido organico.
6. 6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dichas imagenes comprenden

   imageries fluorescentes.
7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha seleccion individual de dichas celulas se lleva a cabo adicionalmente sobre la base de propiedades impedenciometricas.
8. 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de 5 aislamiento de al menos una celula o una porcion de celula a partir de dicho al menos un tipo de celulas tumorales

   en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas se realiza mediante la captura de las celulas individuales, preferentemente cada una en un sitio especlfico de una pluralidad de sitios de dicho dispositivo microfluido dispuestos en el dispositivo microfluido segun una matriz, y posteriormente, mediante la seleccion de las celulas individuales de entre las celulas capturadas, sobre la base de al menos un parametro que puede ser 10 detectado por medio de un sensor interno o externo del dispositivo microfluido.
9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de enriquecimiento de dicha muestra de dicho fluido organico comprende una seleccion de celulas realizada sobre la base de al menos un parametro elegido entre el grupo que consiste en:

   a. densidad de la masa;

   15 b. morfologla;

   c. propiedades electricas;

   d. propiedades qulmicas;

   e. propiedades mecanicas;

   f. expresion de los antlgenos de superficie;

   20 g. expresion de los antlgenos intracitosolicos;

   h. propiedades dielectricas;

   i. propiedades magneticas;

   l. propiedades opticas;

   m. propiedades geometricas;

   25 o combinaciones de los mismos.
10. 10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de enriquecimiento de dicha muestra de dicho fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas comprende la etapa de tratamiento de dicha muestra de dicho fluido organico de forma que se separen las celulas

    30 con nucleo y se enriquezca posteriormente en celulas con nucleo.
11. 11. El metodo segun la reivindicacion anterior, caracterizado porque dicha etapa de enriquecimiento de dicha muestra de dicho fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas comprende al menos la etapa de centrifugacion de dicha muestra de dicho fluido organico en un gradiente de densidad.

    35 12. El metodo segun la reivindicacion 10, caracterizado porque dicha etapa de enriquecimiento de dicha muestra

    de dicho fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas comprende al menos la etapa de llevar a cabo una lisis selectiva de los eritrocitos.
12. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de 40 enriquecimiento de dicha muestra de dicho fluido organico en al menos una poblacion de celulas que comprende al menos un tipo de celulas tumorales en circulacion o celulas tumorales diseminadas o porciones de las mismas comprende al menos la etapa de llevar a cabo una seleccion positiva y/o negativa a traves de microesferas magneticas acopladas a anticuerpos segun al menos una de las siguientes modalidades:

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    a) CD45 negativo

    b) CD45 y GPA negativos

    c) CD45 y CD14 negativos

    d) CD45, CD14 y GPA negativos

    e) EpCAM positiva

    f) CK positiva.
13. 14. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha al menos una etapa de enriquecimiento se lleva a cabo junto con dicha etapa de aislamiento en ese mismo dicho dispositivo microfluido usado para llevar a cabo la etapa de aislamiento.
14. 15. El metodo segun la reivindicacion anterior, caracterizado porque se usa un dispositivo microfluido equipado con una pluralidad de diferentes camaras, separadas entre si y conectadas hidraulicamente, delimitadas en al menos una cara por un unico chip o por una pluralidad de chips individuales.
15. 16. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha etapa de analisis molecular se lleva a cabo por medio de un procedimiento seleccionado entre:

    - una secuenciacion;

    - un analisis microsatelite;

    - una hibridacion genomica comparativa (CGH);

    - una CGH en matriz;

    - una PCR de punto final;

    - una PCR en tiempo real;

    - un analisis de la metilacion:

    ° un analisis de la metilacion cuantitativo con pirosecuenciacion;

    ° una PCR de secuenciacion genomica con bisulfito (BSP);

    ° una PCR especlfica de metilacion (MSP);

    ° un analisis de ADN combinado con restriccion de bisulfito (COBRA)

    ° una extension con cebadores oligonucleotldicos individuales sensibles a la metilacion (MS-SNuPE)

    - un analisis de la expresion genica;

    ° una RT-PCR;

    ° una expresion genica de la celula individual;

    ° una PCR digital.
16. 17. El metodo segun la reivindicacion 16, caracterizado porque dicha etapa de analisis molecular comprende la evaluacion de la presencia de mutaciones puntuales (de nucleotidos individuales).
17. 18. El metodo segun la reivindicacion 17, caracterizado porque dichas mutaciones puntuales (de nucleotidos individuales) son relativas al gen K-RAS y/o B-RAF y su presencia es un Indice de insensibilidad del paciente a un tratamiento predeterminado.
18. 19. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dicha etapa de analisis molecular comprende la evaluacion de la presencia de una hipermetilacion en genes supresores tumorales.
19. 20. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dicha etapa de analisis molecular comprende la evaluacion de la presencia de deleciones y/o de duplicaciones.

    5 21. El metodo segun la reivindicacion 20, caracterizado porque dicha etapa de analisis molecular comprende la

    evaluacion de la presencia de deleciones en la region del cromosoma 13q14 en las celulas tumorales de pacientes con sospecha de cancer de prostata.
20. 22. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dicha etapa de analisis molecular comprende la evaluacion de la sobreexpresion de al menos uno de dos genes BCL2, CCND1 y WNT3A 10 en las celulas tumorales de pacientes con sospecha de cancer de prostata.