ES2625272T3 - Utilización del promotor de la sacarosa sintasa de soja para incrementar el contenido en lípidos de las semillas vegetales - Google Patents
Utilización del promotor de la sacarosa sintasa de soja para incrementar el contenido en lípidos de las semillas vegetales Download PDFInfo
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Abstract
Una planta de soja o una semilla de soja que comprende una construcción de ADN recombinante que comprende al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: un polipéptido de la proteína 1 del desarrollo del óvulo (ODP1) que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 80% con la SEQ ID n.º 30 o la SEQ ID n.º 70, un polipéptido del cotiledón frondoso 1 (Lec1) y un polipéptido de FUSCA3, en donde al menos un polinucleótido está unido operativamente a un promotor de la sacarosa sintasa de soja o a un promotor de la sacarosa sintasa de Medicago truncatula, en donde la expresión de dicho polipéptido en la semilla de soja transgénica que comprende la construcción de ADN recombinante da lugar a un incremento del contenido de aceite en la semilla de soja transgénica cuando se compara con una semilla de soja de control que no comprende la construcción de ADN recombinante.
Description
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La SEQ ID n.º 80 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID n.º 79. La SEQ ID n.º 81 es la secuencia de nucleótidos predicha de la región del promotor de Medtr4g124660.2. La SEQ ID n.º 82 es la secuencia de nucleótidos del cebador directo oMDSP-1F. La SEQ ID n.º 83 es la secuencia de nucleótidos del cebador inverso oMDSP-1R. La SEQ ID n.º 84 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2434. La SEQ ID n.º 85 es la secuencia de nucleótidos real de la región del promotor de Medtr4g124660.2 utilizada en este
estudio. La SEQ ID n.º 86 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2446. La SEQ ID n.º 87 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2457. La SEQ ID n.º 88 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2461. La SEQ ID n.º 89 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2465. La SEQ ID n.º 90 es la secuencia de nucleótidos del miARNa GM-MFAD2-1B. La SEQ ID n.º 91 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia del miARNa* 396b-GM-MFAD2-1B. La SEQ ID n.º 92 es la secuencia de nucleótidos del miARNa GM-MFAD2-2. La SEQ ID n.º 93 es la secuencia de nucleótidos de la secuencia del miARNa* 159-GM-MFAD2-2. La SEQ ID n.º 94 es la secuencia de nucleótidos del precursor del miARN 159 del genoma de soja. La SEQ ID n.º 95 es la secuencia de nucleótidos del precursor del miARN 396b del genoma de soja. La SEQ ID n.º 96 es la secuencia de nucleótidos del precursor del miARNa 396b-fad2-1b/159-fad2-2. La SEQ ID n.º 97 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2109. La SEQ ID n.º 98 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2118. La SEQ ID n.º 99 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2120. La SEQ ID n.º 100 es la secuencia de nucleótidos de la construcción pKR2119. La SEQ ID n.º 101 es la secuencia de nucleótidos de los nts 1857-1880 de la SEQ ID n.º 81, que están delecionados
en la SEQ ID n.º 85. La SEQ ID n.º 102 es la secuencia de nucleótidos de una inserción de 25 pb entre los nts 2224 y 2225 de la SEQ ID n.º 81, que está presente en la SEQ ID n.º 85.
Descripción detallada
Tal y como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «un», «una», «la» y «el» incluyen la referencia en plural, a menos que el contexto lo dictamine claramente de otra manera. Así pues, por ejemplo, la referencia a «una planta» incluye a muchas de tales plantas; la referencia a «una célula» incluye una o varias células y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
En el contexto de esta descripción, se utilizan una serie de términos y abreviaturas. Se dan a conocer las definiciones que vienen a continuación.
Los términos «monocot» y «planta monocotiledónea» se utilizan indistintamente en la presente memoria. Una monocot de la presente invención incluye las gramíneas.
Los términos «dicot» y «planta dicotiledónea» se utilizan indistintamente en la presente memoria. Una dicot de la presente invención incluye las familias siguientes: Brassicaceae, Leguminosae y Solanaceae.
Los términos «complemento completo» y «complemento de longitud completa» se utilizan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a un complemento de una secuencia de nucleótidos dada, en donde el complemento y la secuencia de nucleótidos consisten en el mismo número de nucleótidos y son complementarios al 100%.
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cambios de una o varias bases nucleotídicas no afectan a la capacidad que tiene el fragmento de ácido nucleico para intervenir en la expresión génica o producir un fenotipo determinado. Estos términos también hacen referencia a modificaciones de los fragmentos de ácidos nucleicos de la presente invención, tal como la deleción o la inserción de uno o varios nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con respecto al fragmento sin modificar inicial. Por lo tanto, se sabe, como apreciarán los expertos en la técnica, que la invención abarca más que las secuencias específicas de ejemplo.
«Secuencias reguladoras» o «elementos reguladores» se utilizan indistintamente y hacen referencia a secuencias nucleotídicas localizadas delante (secuencias no codificantes en 5',) dentro, o después (secuencias no codificantes en 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras podrían incluir, pero sin limitarse a ellas, promotores, secuencias líderes de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento para la poliadenilación. En la presente memoria, los términos «secuencia reguladora» y «elemento regulador» se utilizan indistintamente.
«Promotor» hace referencia a un fragmento de ácido nucleico capaz de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.
«Promotor funcional en una planta» es un promotor capaz de controlar la transcripción en las células vegetales, tanto si su origen es o no de una célula vegetal.
A los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos celulares se les suele denominar «promotores constitutivos» la mayoría de veces.
La expresión constitutiva de alto nivel del gen candidato bajo el control del promotor 35S o UBI podría tener efectos pleiotrópicos, aunque la eficacia del gen candidato se podría estimar cuando está impulsado por un promotor constitutivo. El uso de los promotores específicos de tejido y/o específicos de estrés podría eliminar los efectos indeseables a la vez que conservaría la capacidad de mejora de la tolerancia a la sequía. Este efecto se ha observado en Arabidopsis (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnol. 17: 287-91).
«Promotor específico de tejido» y «promotor preferido de tejido» se utilizan indistintamente para hacer referencia a un promotor que se expresa predominantemente, pero no necesariamente de forma exclusiva, en un tejido u órgano, pero que también se podría expresar en una célula específica.
«Promotor regulado por el desarrollo» hace referencia a un promotor cuya actividad está determinada por los fenómenos del desarrollo.
Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN operativamente unida en respuesta a la presencia de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo, mediante compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas y/o del desarrollo. Los ejemplos de promotores inducibles o regulados incluyen, pero sin limitarse a ellos, promotores regulados por luz, calor, estrés, inundación o sequía, patógenos, fitohormonas, lesiones o sustancias químicas, tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o protectores.
Un promotor mínimo o basal es una molécula polinucleotídica que es capaz de reclutar, para que se le fije, la maquinaría de transcripción basal. Un ejemplo de maquinaria de transcripción basal en las células eucariotas es el complejo de la ARN polimerasa II y sus proteínas accesorias.
Los promotores vegetales de la ARN polimerasa II, como los de otros eucariotas superiores, están comprendidos por varios «elementos reguladores de la transcripción que actúan en cis» diferentes, o simplemente «elementos en cis», cada uno de los cuales parece conferir un aspecto diferente del control global de la expresión del gen. Los ejemplos de elementos que actúan en cis incluyen, pero sin limitarse a ellos, elementos tales como la caja TATA y la caja CCAAT o AGGA. El promotor puede dividirse grosso modo en dos partes; una parte proximal, denominada central (o corazón), y una parte distal. Se cree que la parte proximal es responsable de ensamblar correctamente el complejo de la ARN polimerasa II en la posición correcta, y de dirigir un nivel basal de transcripción, y también se la denomina «promotor mínimo» o «promotor basal». La parte distal del promotor se cree que contiene los elementos que regulan la expresión espaciotemporal. Además de las partes proximales y distales, también se han descrito otras regiones reguladoras que contienen elementos potenciadores y/o represores. Los últimos elementos se pueden encontrar a unas pocas kilopares de bases por delante del sitio de inicio de la transcripción, en los intrones, o incluso en el lado en 3' de los genes que regulan (Rombauts, S. et al. (2003) Plant Physiology 132: 1162-1176, Nikolov y Burley, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 15-22), Tjian y Maniatis (1994) Cell 77: 5-8; Fessele et al., 2002 Trends Genet 18: 6063, Messing et al., (1983) Genetic Engineering of Plants: an Agricultural Perspective, Plenum Press, NY, págs. 211227).
Cuando están unidos operativamente a una secuencia polinucleotídica heteróloga, un promotor controla la transcripción de la secuencia polinucleotídica unida.
«Unido operativamente» hace referencia a la asociación de fragmentos de ácidos nucleicos en un único fragmento,
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de tal manera que la función de uno está regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a un fragmento de ácido nucleico cuando es capaz de regular la transcripción de ese fragmento de ácido nucleico.
Se puede añadir una secuencia intrónica a la región sin traducir en 5', a la región codificante de la proteína, o a la región sin traducir en 3', para incrementar la cantidad de mensajero maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón ayustable en la unidad de transcripción en ambas construcciones de expresión vegetal y animal incrementa la expresión génica tanto del nivel de ARNm como de la proteína hasta 1000 veces. Buchman y Berg. Cell. Biol. 8: 4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987).
«Expresión» hace referencia a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expresión de un fragmento de ácido nucleico podría hacer referencia a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (p. ej., transcripción que da lugar al ARNm o al ARN funcional) y/o traducción del ARNm en una proteína precursora o madura.
«Sobreexpresión» hace referencia a que la producción de un producto génico en los organismos transgénicos supera los niveles de producción en un organismo de segregación nula (o no transgénico) del mismo experimento.
«Fenotipo» significa las características detectables de un organismo o célula.
«Introducido» en el contexto de introducir un fragmento de ácido nucleico (p. ej., una construcción de ADN recombinante) en una célula significa «transfección» o «transformación» o «transducción», e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el fragmento de ácido nucleico podría estar incorporado en el genoma de la célula (p. ej., cromosoma, plásmido, ADN mitocondrial o plastídico), convertido en un replicón autónomo, o de expresión transitoria (p. ej., ARNm transfectado).
Una «célula transformada» es cualquier célula en la que se ha introducido un fragmento de ácido nucleico (p. ej., una construcción de ADN recombinante).
«Transformación», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia tanto a la transformación estable como a la transformación transitoria.
«Transformación estable» hace referencia a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo hospedador que da lugar a la herencia genéticamente estable. Una vez que está transformado de forma estable, el fragmento de ácido nucleico está integrado de forma estable en el genoma del organismo hospedador y de cualquier generación posterior.
«Transformación transitoria» hace referencia a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, o en el orgánulo que contiene ADN, de un organismo hospedador que da lugar a la expresión del gen sin que haya herencia genéticamente estable.
«Alelo» es una de las diferentes formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma. Cuando los alelos presentes en un locus dado en una pareja de cromosomas homólogos de una planta diploide son iguales, dicha planta es homocigota en ese locus. Cuando en la planta son diferentes los alelos presentes en un locus dado en una pareja de cromosomas homólogos de una planta diploide, dicha planta es heterocigota en ese locus. Si un transgén está presente en uno de una pareja de cromosomas homólogos en una planta diploide, dicha planta es hemicigota en ese locus.
La terminología «cruzado», «cruce» o «cruzar» significa la fusión de gametos por polinización para producir una progenie (p. ej., células, semillas o plantas). El término abarca tanto los cruces sexuales (la polinización de una planta por otra) como la autofecundación (autopolinización, p. ej., cuando el polen y el óvulo son de la misma planta). El término «cruzamiento» hace referencia al acto de fusionar los gametos por polinización para producir la progenie.
Un «alelo favorable» es el alelo de un locus concreto que confiere o contribuye a un fenotipo deseable, p. ej., incremento de la digestibilidad de la pared celular o, como alternativa, es un alelo que permite la identificación de plantas con una disminución de la digestibilidad de la pared celular que puede retirarse de un programa o plantación de mejora genética («contraselección»). Un alelo favorable de un marcador es un alelo marcador que se segrega con el fenotipo favorable o, como alternativa, se segrega con el fenotipo desfavorable de planta, por lo que ofrece el beneficio de identificar las plantas.
«Construcción de ADN de supresión» es una construcción de ADN recombinante que, cuando se transforma o se integra de manera estable en el genoma de la planta, da lugar al «silenciamiento» de un gen deseado en la planta. El gen destinatario podría ser endógeno o transgénico a la planta. «Silenciamiento», tal y como se utiliza en la presente memoria con respecto al gen destinatario, hace referencia de manera general a la supresión de la cantidad de ARNm o proteína/enzima expresada por el gen destinatario, y/o el nivel de actividad enzimática o funcionalidad de la proteína. Los términos «supresión», «que suprime» y «silenciamiento», utilizados indistintamente en la presente memoria, incluyen disminuir, reducir, retroceder, descender, inhibir, eliminar o impedir. «Silenciamiento» o «silenciamiento génico» no especifica el mecanismo e incluye, pero sin limitación, antisentido, cosupresión, supresión vírica, supresión con horquilla, supresión con tallo y bucle, estrategias basadas en la iARN, y estrategias basadas en ARN pequeños.
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El gen del cotiledón frondoso 1 (LEC1) controla muchos aspectos diferentes de la embriogénesis. La mutación de lec1 es pleiotrópica, lo que sugiere que LEC1 tiene varias funciones en las últimas etapas del desarrollo del embrión. Por ejemplo, LEC1 es necesaria para aspectos específicos de la maduración de las semillas, inhibición de la germinación prematura, e interviene en la especificación de la identidad embrionaria de los órganos. Finalmente, LEC1 parece actuar sólo durante el desarrollo embrionario.
La patente de los EE.UU. n.º 6.235.975 describe los genes del cotiledón frondoso 1 y sus usos. Una solicitud pendiente de patente de los EE.UU. (solicitud de la patente de los EE.UU. n.º 11/899370) hace referencia a fragmentos de ácidos nucleicos aislados que codifican los factores de transcripción relacionados con Lec1. Las patentes de los EE.UU. n.os 7.294.759, 7.157.621, 7.888.560, 6.825.397 describen el uso de los genes de Lec1 para alterar el contenido de aceite de las plantas.
En Arabidopsis, se ha demostrado que Lec1 regula la expresión de los genes de la biosíntesis de los ácidos grasos y también se ha demostrado que Lec1 está implicado en el desarrollo embrionario (Mu et al., Plant Physiology (2008)
148: 1042-1054; Lotan et al. (1998) Cell, vol. 93, 1195-1205, 26 de junio; número de publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO/1998037184, y patentes de los EE.UU. n.os 6.235.975, 6.320.102, 6.545.201; publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO/2001064022, y patente de los EE.UU. 6.781.035, Braybrook, S. A. y Harada, J. J. (2008) Trends Plant. Sci. 13 (12): 1360-1385).
La solicitud de patente internacional WO 99/67405 describe los genes del cotiledón frondoso 1 y sus usos. El Lec1 de maíz, un homólogo del gen AtLEC1 que controla la embriogénesis de Arabidopsis, se ha demostrado que incrementa el contenido de aceite y la eficiencia de transformación en las plantas. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 03001902 y patente de los EE.UU. n.º 6.512.165.
Otros polipéptidos que influyen en el desarrollo de óvulos y embriones, y que estimulan el crecimiento celular, tales como Lec1, Kn1, WUSCHEL, Zwille y Aintegumeta (ANT), permiten incrementar la eficacia de transformación cuando se expresan en las plantas. Véase, por ejemplo, la solicitud de los EE.UU. n.º 2003/0135889. De hecho, un homólogo del Lec1 de maíz, del gen AtLEC1 que controla la embriogénesis de Arabidopsis, se ha demostrado que incrementa el contenido de aceite y la eficacia de transformación en las plantas. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 03001902 y la patente de los EE.UU. n.º 6.512.165.
Los homólogos de Lec1 pueden además identificarse mediante el uso de motivos de secuencia conservados, tales como la secuencia de aminoácidos que viene a continuación (dada en el código de una sola letra, en donde «x» que representa cualquier aminoácido) (número de solicitud de EE.UU. 60/301.913). Los aminoácidos subrayados en la siguiente secuencia son los que están conservados en Lec1, pero no se encuentran en las proteínas relacionadas con Lec1:
Los términos «FUS3», «FUSCA3» se utilizan indistintamente en la presente memoria. FUSCA3 es un factor de transcripción con un dominio B3 conservado de tipo VP1/ABI3 que tiene importancia funcional para la regulación de la maduración de las semillas en Arabidopsis thaliana. Controla la cronología del desarrollo en Arabidopsis a través de las hormonas giberelina y ácido abscísico, y se regula ella misma mediante el factor de transcripción Lec1 (Luerssen et al. (1998) Plant. J (1998) 15 (6): 755-7; Stone et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (20): 11806-11811; Lee et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (4): 2152-2156, patentes de los EE.UU. n.os US7511190 y US7446241, publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 1998021336, publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008157226, Braybrook, S. A. y Harada, J. J. (2008) Trends Plant Sci 13 (12): 1360-1385). La patente de los EE.UU. n.º US7612253 describe los métodos para modular los procedimientos relacionados con la citocinina en una planta mediante el uso de las proteínas con dominio B3 con una serie de homólogos de fusca3.
«Diacilglicerol aciltransferasa» o «DGAT» (también denominada «acil-CoA—diacilglicerol aciltransferasa» o «diacilglicerol O-aciltransferasa») (EC 2.3.1.20) es una proteína integral de la membrana que cataliza la última etapa enzimática de la producción de los triacilgliceroles en las plantas, hongos y mamíferos. Esta enzima es responsable de transferir un grupo acilo desde la acilcoenzima A a la posición sn-3 del 1,2-diacilglicerol («DAG») para formar el triacilglicerol («TAG»). La DGAT está asociada a la membrana y a las fracciones de cuerpos lipídicos en las plantas y los hongos, en particular en las semillas oleaginosas, donde contribuye al almacenamiento del carbono utilizado como reserva de energía. La DGAT se sabe que regula la estructura de los TAG y que dirige la síntesis de los TAG. Además, se sabe que la reacción de la DGAT es específica de la síntesis de aceite (Lardizabal et al., J. Biol. Chem. 276 (42): 38862-28869 (2001)).
Se han identificado dos familias diferentes de proteínas de DGAT. La primera familia de proteínas de DGAT («DGAT1») está relacionada con la acilcoenzima A: la colesterol aciltransferasa («ACAT») y se ha descrito en las patentes de los EE.UU. n.os 6.100.077 y 6.344.548. Una segunda familia de proteínas de DGAT («DGAT2») no está relacionada con la familia DGAT1 y se describe en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2004/011671 publicada el 5 de febrero de 2004. Otras referencias a los genes de DGAT y a su uso en las plantas incluyen la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 1998/055.631
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y la patente de los EE.UU. n.º 6.822.141.
«DGAT» y «diacilglicerol aciltransferasa» se utilizan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a cualquier miembro, o combinación, de las familias de proteínas de DGAT1 o DGAT2.
Se han descrito con anterioridad los genes de DGAT de plantas y hongos (patentes de los EE.UU. n.os 7.198.937 y 7.465.565, publicación de los EE.UU. n.º 20080295204, solicitudes de los EE.UU. n.os 12/470569 y 12/470517).
El término «ácidos grasos» hace referencia a ácidos alifáticos de cadena larga (ácidos alcanoicos) de diferente longitud de cadena, de aproximadamente C12 a C22 (aunque se conocen ácidos con una longitud de cadena más corta y más larga). Las longitudes de cadena predominantes están entre C16 y C22. La estructura de un ácido graso se representa por un sistema de notación simple de «X:Y», donde X es el número total de átomos de carbono (C) del ácido graso concreto e Y es el número de enlaces dobles.
Por lo general, los ácidos grasos se clasifican como saturados o insaturados. La terminología «ácidos grasos saturados» hace referencia a los ácidos grasos que no tienen «enlaces dobles» entre los carbonos de su esqueleto. En cambio, los «ácidos grasos insaturados» tienen «enlaces dobles» a lo largo de sus esqueletos carbonados (que están con más frecuencia en la configuración cis). Los «ácidos grasos monoinsaturados» tienen sólo un «enlace doble» en el esqueleto carbonado (p. ej., normalmente entre el 9.º y el 10.º átomo de carbono, como para el ácido palmitoleico (16:1) y el ácido oleico (18:1)), mientras que los «ácidos grasos poliinsaturados» (o «AGPI») tienen al menos dos enlaces dobles a lo largo del esqueleto carbonado (p. ej., entre el 9.º y el 10.º, y el 12.º y el 13.º átomos de carbono para el ácido linoleico (18:2); y entre el 9.º y el 10.º, el 12.º y el 13.º, y el 15.º y el 16.º para el ácido αlinolénico (18:3)).
Los «cuerpos lipídicos» hacen referencia a gotitas lipídicas a las que normalmente se fijan proteínas específicas y una monocapa de fosfolípidos. Estos orgánulos son sitios donde la mayoría de los organismos transportan o almacenan los lípidos neutros. Los cuerpos lipídicos se cree que surgen de microdominios del retículo endoplásmico que contienen enzimas de la biosíntesis de los TAG; y su síntesis y tamaño parecen estar controlados por componentes proteicos específicos.
«Lípidos neutros» hace referencia a los lípidos que se suelen hallar en los cuerpos lipídicos de las células como grasas y aceites de almacenamiento, y se denominan así porque, al pH celular, los lípidos no llevan grupos cargados. Por lo general, son completamente apolares, sin ninguna afinidad por el agua. Los lípidos neutros, por lo general, hacen referencia a mono-, di-y/o triésteres de glicerol con ácidos grasos, también denominados monoacilglicerol, diacilglicerol o TAG, respectivamente (o de forma colectiva, acilgliceroles). Debe producirse una reacción de hidrólisis para desprender los ácidos grasos libres a partir de los acilgliceroles.
El término «aceite» hace referencia a una sustancia lipídica que está líquida a 25ºC y normalmente está poliinsaturada. En cambio, el término «grasa» hace referencia a una sustancia lipídica que está sólida a 25ºC y normalmente está saturada.
Los términos «triacilglicerol», «aceite» y «TAG» se utilizan indistintamente en la presente memoria y hacen referencia a lípidos neutros compuestos por tres restos de acilo graso esterificados a una molécula de glicerol (y tales términos se utilizarán indistintamente a lo largo de la presente descripción en la presente memoria). Tales aceites pueden contener AGPI (ácidos grasos poliinsaturados) de cadena larga, así como ácidos grasos saturados e insaturados más pequeños y ácidos grasos saturados de cadena más larga. Así pues, «biosíntesis de aceite» hace referencia genéricamente a la síntesis de los TAG en la célula (publicación de las solicitudes de patente internacional en el marco del PCT n.os WO2005063988, WO2007087492, WO2007101273 y WO2007103738, patente de los EE.UU. n.º US7812216).
El contenido de aceite y proteínas en las semillas se puede determinar con espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIR, por su nombre en inglés) mediante los métodos familiares para el experto en la técnica (Agelet et al., (2012) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60 (34): 8314-8322). En la patente de los EE.UU. n.º 7.508.517 se ha descrito un aparato y los métodos para el análisis de las semillas por NIR de una en una y en conjunto. En la patente de los EE.UU. n.º 8.143.473 se dan a conocer otros métodos para el análisis de la composición de las semillas.
Medicago truncatula es una legumbre pequeña nativa de la región mediterránea que se utiliza en la investigación genómica. Esta especie se ha utilizado como organismo modelo para la biología de las legumbres porque tiene un genoma diploide pequeño, es autofertilizable, tiene un tiempo de generación rápido y produce muchas semillas, y se presta a la transformación genética.
El término «sacarosa sintasa» (SUS) hace referencia a una enzima del metabolismo de los glúcidos que cataliza la conversión reversible de sacarosa y difosfato de uridina (UDP) en UDP-glucosa y fructosa in vitro. La terminología «sacarosa sintasa 2 de soja» y «GmSuS» se utilizan indistintamente en la presente memoria. El gen de la sacarosa sintasa de soja es del locus genómico Glyma13g17420.
El término «germinación» hace referencia al proceso mediante el cual una semilla inactiva comienza a brotar y crecer para dar una plántula.
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«Germinación normal», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a una velocidad de germinación para la semilla de una planta transgénica que comprende la construcción de ADN recombinante que está dentro de al menos el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la velocidad de germinación observada, en las mismas condiciones, para una semilla de una planta de control correspondiente que no comprende la construcción de ADN recombinante.
En una realización de la presente invención, los «elementos reguladores de la transcripción que actúan en cis» de la secuencia promotora descrita en la presente memoria pueden estar unidos operativamente a «elementos reguladores de la transcripción que actúan en cis» de cualquier promotor heterólogo. Tal molécula promotora quimérica se puede manipular genéticamente para que tenga las propiedades reguladoras deseadas. En una realización de esta invención, un fragmento de la secuencia promotora descrita que puede actuar como una secuencia reguladora en cis o bien como una secuencia reguladora distal o como una secuencia potenciadora o una secuencia represora, se podría combinar con una secuencia reguladora en cis o reguladora distal o potenciadora o una secuencia represora o cualquier combinación de ellas de una secuencia promotora heteróloga.
En una realización relacionada, un elemento en cis del promotor descrito puede conferir una especificidad particular, tal como conferir una mejora a la expresión de moléculas polinucleotídicas operativamente unidas en determinados tejidos y, por lo tanto, también es capaz de regular la transcripción de moléculas polinucleotídicas operativamente unidas. En consecuencia, se puede utilizar como moléculas polinucleotídicas reguladoras cualquier fragmento, porción o región del promotor que comprende la secuencia polinucleotídica mostrada en la SEQ ID n.º 3.
Se pueden añadir los fragmentos de promotores que comprenden elementos reguladores, por ejemplo, fusionados al extremo en 5', o insertados dentro de otro promotor que tiene sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Fluhr et al., Science 232: 1106-1112, 1986; Ellis et al., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai et al., Plant. Mol. Biol. 15: 373-381, 1991; 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71, 1991).
Los elementos en cis se pueden identificar mediante una serie de técnicas, entre ellas el análisis de deleción, a saber, deleción de uno o varios nucleótidos desde el extremo en 5' o internos a un promotor; análisis de proteínas de fijación al ADN mediante la obtención de la impronta con la ADNasa I; interferencia de metilación; ensayos de cambio de movilidad en la electroforesis, obtención de la impronta genómica in vivo mediante PCR mediada por ligación; y otros ensayos convencionales; o por similitud de secuencias con motivos de elementos en cis conocidos mediante los métodos convencionales de comparación de secuencias. La estructura fina de un elemento en cis se puede estudiar con más detalle mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o varios nucleótidos o mediante otros métodos convencionales (véase, por ejemplo, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, págs. 397-422; y Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds. Cold Spring Harbor Press, 1995, págs. 233-300).
Los elementos en cis se pueden obtener mediante síntesis química o mediante clonación de promotores que incluyen tales elementos, y se pueden sintetizar con secuencias flanqueantes adicionales que contienen sitios para enzimas de restricción útiles para facilitar la manipulación posterior. Los fragmentos promotores pueden comprender también otros elementos reguladores, tales como los dominios potenciadores, que pueden además ser útiles para la construcción de moléculas quiméricas.
Los métodos para la construcción de los promotores quiméricos y variantes de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, la combinación de elementos de control de diferentes promotores, o la duplicación de porciones
o regiones de un promotor (véanse, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.os 4.990.607; 5.110.732; y 5.097.025). Los expertos en la técnica están familiarizados con los materiales de recursos estándares que describen condiciones específicas y los procedimientos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (p. ej., moléculas polinucleotídicas y plásmidos), así como la generación de organismos recombinantes y el escrutinio y el aislamiento de moléculas polinucleotídicas.
En una realización de la presente invención, se pueden modificar el promotor de la sacarosa sintasa de soja descrito en la presente memoria. Los expertos en la técnica pueden crear promotores que tengan variaciones en la secuencia polinucleotídica. La secuencia polinucleotídica del promotor de la presente invención que se muestra en la SEQ ID n.º 8 se podría modificar o alterar para realzar sus características de control. Como el experto en la técnica apreciará, la modificación o alteración de la secuencia promotora también se puede realizar sin afectar sustancialmente a la función promotora. Los métodos los conocen bien los expertos en la técnica. Las secuencias se pueden modificar, por ejemplo, mediante la inserción, deleción o remplazo de secuencias modelo en una estrategia de modificación de ADN mediante PCR.
La presente invención abarca los fragmentos funcionales y variantes de la secuencia promotora descrita en la presente memoria.
Un «fragmento funcional» en la presente memoria se define como cualquier subconjunto de nucleótidos contiguos de la secuencia promotora descrita en la presente memoria que puede realizar la misma función, o una función sustancialmente similar, que la secuencia promotora de longitud completa descrita en la presente memoria. Un
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terminador en 3' de la faseolina de judía (solicitud de patente internacional WO 2004/071467), en 3' en Myb2 de Glycine max (solicitud de los EE.UU. n.º 12/486793), en 3' del inhibidor de tripsina de kunitz de Glycine max (solicitud de patente internacional WO 2004/071467), en 3' de BD30 (también denominada P34) de Glycine max (solicitud de patente internacional WO 2004/071467), en 3' de la legumina A2 de Pisum sativum (solicitud de patente internacional WO 2004/071467) y en 3' de la albúmina 2S de Glycine max (solicitud de patente internacional WO 2004/071467).
Además, la solicitud de patente internacional WO 2004/071467 y patente de los EE.UU. n.º 7.129.089 describen la posterior unión a otros casetes individuales promotor/gen/terminador de la transcripción en combinaciones y orientaciones únicas, junto con casetes de marcadores de selección adecuados, para obtener la expresión fenotípica deseada. Aunque esto se realiza principalmente con diferentes sitios de enzimas de restricción, un experto en la técnica puede apreciar que se pueden utilizar numerosas técnicas para conseguir la combinación u orientaciones deseadas de promotor/gen/terminador de la transcripción. Al hacerlo, se puede conseguir cualquier combinación y orientación de los casetes de promotor/gen/terminador de la transcripción específicos de embrión. Un experto en la técnica puede también apreciar que estos casetes pueden estar localizados en fragmentos individuales de ADN o en varios fragmentos en los que la coexpresión de los genes es el resultado de la cotransformación de varios fragmentos de ADN.
Los alineamientos de secuencia y los cálculos del porcentaje de identidad se podrían determinar con muchos métodos de comparación diseñados para detectar las secuencias homólogas, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el programa Megalign® de la suite de programas informáticos de bioinformática LASER-GENE® (DNASTAR® Inc, Madison, WI). A menos que se mencione otra cosa, los alineamientos múltiples de las secuencias dadas a conocer en la presente memoria se realizaron con el método de alineamiento de Clustal V (Higgings y Sharp (1989) CABIOS.
5: 151-153) con los parámetros de defecto (PENALIZACIÓN DE HUECOS = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECOS = 10). Los parámetros por defecto para los alineamientos por pares y el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el método de Clustal V son KTUPLA = 1, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLA = 2, PENALIZACIÓN POR HUECOS = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después del alineamiento de las secuencias, con el programa de Clustal V, es posible obtener los valores de «porcentaje de identidad» y «divergencia» al ver la tabla de las «distancias entre las secuencias» en el mismo programa; a menos que se mencione otra cosa, los porcentajes de identidad y las divergencias proporcionadas y reivindicadas en la presente memoria se calcularon de esta manera.
Como alternativa, se puede utilizar el método de alineamiento de Clustal W. El método de alineamiento de Clustal W (descrito por Higgings y Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgings, D. G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)) se puede encontrar en el programa MegAlignTM v6.1 de la suite de programas informáticos para bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis). Los parámetros por defecto para el alineamiento múltiple en el programa MegAlignTM v6.1 de la suite de programas informáticos para bioinformática LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis) corresponden a PENALIZACIÓN DE HUECOS = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECOS = 0,2, Retraso de secuencias divergentes = 30%, Ponderación de la transición del ADN = 0,5, Matriz de ponderación para proteínas = serie de Gonnet, Matriz de ponderación para ADN = IUB. Para los alineamientos por pares, los parámetros por defecto son Alineamiento = Lento-Preciso, Penalización de huecos = 10,0, Longitud de huecos = 0,10, Matriz de ponderación para proteínas = Gonnnet 250 y Matriz de ponderación para ADN = IUB. Después del alineamiento de las secuencias con el programa Clustal W, es posible obtener los valores de «porcentaje de identidad» y de «divergencia» al ver la tabla de «distancias entre las secuencias» en el mismo programa.
La tecnología de clonación molecular y de ADN recombinante estándares que se utilizan en la presente memoria se conocen bien en la técnica y se describen con más detalle en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante, «Sambrook»).
Composiciones:
Una composición de la presente invención es una planta de soja o semilla de soja que comprende en su genoma cualquiera de las construcciones de ADN recombinante (que incluyen cualquiera de las construcciones de ADN de supresión) de la presente invención (tales como cualquiera de las construcciones explicadas más arriba). Las composiciones también incluyen cualquier progenie de la planta y cualquier semilla obtenida de la planta o de su progenie, en donde la progenie o semilla comprende dentro de su genoma la construcción de ADN recombinante (o la construcción de ADN de supresión). La progenie incluye las generaciones posteriores obtenidas por la autopolinización o exogamia de una planta. La progenie también incluye híbridos y consanguíneos.
En los cultivos propagados por semillas de híbridos, las plantas transgénicas maduras pueden autopolinizarse para producir una planta consanguínea homocigota. La planta consanguínea produce semillas que contienen la construcción de ADN recombinante (o la construcción de ADN de supresión) recién introducida. Estas semillas se pueden hacer crecer para producir plantas que mostrarían una alteración de su contenido de aceite o se pueden utilizar en un programa de mejora genética para producir semillas híbridas, que se pueden hacer crecer para
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producir plantas que mostrarían tal alteración del contenido de aceite.
La semilla y el grano modificados de la invención también se pueden obtener por cruces con las plantas transgénicas, mediante cruces entre transformantes biolísticos transgénicos independientes, mediante cruces de plantas con uno o varios alelos (incluidos los alelos mutantes) de genes que codifican las proteínas de la invención. Los cruces, que incluyen la introgresión de los locus transgénicos y mutantes dentro del germoplasma de élite para cruces y la adaptación (mejora) del germoplasma para cruces para la expresión de transgenes y alelos mutantes, puede facilitarse con métodos tales como mediante los cruces con selección asistida por marcadores.
Las realizaciones de la presente invención incluyen:
En una realización, una planta de soja o semilla de soja que comprende una construcción de ADN recombinante que comprende al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en un polipéptido de ODP1 que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 100% con la SEQ ID n.º 30 o la SEQ ID n.º 70, un polipéptido de Lec1 y un polipéptido de FUSCA3, en donde el al menos un polinucleótido está unido operativamente a un promotor de la sacarosa sintasa de Medicago truncatula o de soja, en donde la expresión de dicho polipéptido en la semilla de soja transgénica que comprende la construcción de ADN recombinante da lugar a un incremento del contenido de aceite en la semilla de soja transgénica cuando se compara con una semilla de soja de control que no comprende la construcción de ADN recombinante.
En otra realización, dicha planta de soja transgénica o semilla de soja trangénicas que comprende dicha construcción de ADN recombinante tiene una germinación normal cuando se compara con una semilla de soja de control que no comprende la construcción del ADN recombinante.
En otra realización, dicha semilla de soja transgénica que comprende dicha construcción de ADN recombinante tiene una velocidad de germinación que es al menos el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de la velocidad de germinación observada, en las mismas condiciones, cuando se compara con una semilla de soja de control que no comprende la construcción de ADN recombinante.
En otra realización, el promotor de la sacarosa sintasa de soja comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID n.º 8, (b) una secuencia de ácido nucleico con una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID n.º 8, (c) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la SEQ ID n.º 8 en condiciones rigurosas; y (d) una secuencia de ácido nucleico que comprende un fragmento funcional de (a), (b) o (c).
En otra realización, el promotor de la sacarosa sintasa de soja es un alelo de SEQ ID n.º 8.
En otra realización, el promotor de la sacarosa sintasa de soja difiere de la SEQ ID n.º 8 en al menos un modo como se describe en la figura 4.
En otra realización, el promotor de la sacarosa sintasa de Medicago truncatula comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID n.º 81 o SEQ ID n.º 85, (b) una secuencia de ácido nucleico con una identidad de secuencia de al menos el 95% con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID n.º 81 o SEQ ID n.º 85, (c) una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la SEQ ID n.º 81 o la SEQ ID n.º 85 en condiciones rigurosas; y (d) una secuencia de ácido nucleico que comprende un fragmento funcional de (a), (b) o (c).
En otra realización, el promotor de la sacarosa sintasa de Medicago truncatula es un alelo de SEQ ID n.º 81 o SEQ ID n.º 85.
En otra realización, el promotor de la sacarosa sintasa de Medicago truncatula difiere de la SEQ ID n.º 81 en al menos una de las siguientes maneras: el nt 67 es una T, el nt 489 es una C, los nts 553 a 555 (TTG) están delecionados, el nt 629 es una A, el nt 649 es una C, el nt 715 es una A, el nt 784 es una C, el nt 800 es una G, el nt 893 es una G, el nt 1166 es una A, el nt 1535 está delecionado (T), el nt 1700 es una G, el nt 1718 es una C, los nt imagen13 1857 a 1880 están delecionados ( , SEQ ID n.º 101), el nt 1953 es una G, el nt 2038 imagen14 está delecionado (A), hay una inserción de 25 pb entre los nts 2224 y 2225 ( ; SEQ ID n.º 102), se inserta una A entre los nts 2225 y 2226, el nt 2421 es una G, se inserta una C entre los nts 2734 y 2735, y el nt 2881 es una T.
En otra realización, dicha semilla de soja o planta de soja transgénica comprende dicha construcción de ADN recombinante, que codifica un polipéptido de ODP1 que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 80%, 85%, 90%, 95% o 100% con la SEQ ID n.º 30 o la SEQ ID n.º 70.
El polipéptido de ODP1 puede ser un alelo de SEQ ID n.º 30 o SEQ ID n.º 70.
El polipéptido de ODP1 podría comprender dos dominios APETALA2 (AP2).
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alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1
Identificación y clonación del promotor de la sacarosa sintasa de soja
El gen de la sacarosa sintasa 2 de Arabidopsis ya se ha descrito con anterioridad (publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2010/114989) y las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se presentan en la SEQ ID n.º 1 y la SEQ ID n.º 2, respectivamente. Se identificó un homólogo de soja del gen de la sacarosa sintasa 2 de Arabidopsis al realizar búsquedas con BLAST (herramienta de búsqueda por alineamiento local básico; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993)) por la similitud con las secuencias contenidas en el proyecto del genoma de soja, conjunto de genes «Glyma1.01» del DoE Joint Genome Institute. En concreto, la secuencia de aminoácidos de la sacarosa sintasa 2 de Arabidopsis (SEQ ID n.º 2) se utilizó con el algoritmo TBLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) con los parámetros por defecto, excepto la opción de Filtro que se puso en OFF.
El homólogo de la soja para el gen de la sacarosa sintasa 2 de Arabidopsis identificado correspondió a Glyma13g17420 y la predicción de la secuencia genómica, del ADNc, de la CDS y los correspondientes aminoácidos de Glyma se presentan en las SEQ ID n.os 3-6, respectivamente.
Las genotecas de ADNc de soja se prepararon de soja en desarrollo (p. ej., la genoteca de ADNc sdp3c), los clones se secuenciaron y la secuencia se analizó tal como se describe en la patente de los EE.UU. n.º 7.157.621. Una búsqueda similar con TBLASTN contra las secuencias de estas genotecas de ADNc de soja identificaron un ADNc (EST sdp3c.pk014.n18) con un extremo en 5' que difería del predicho en la secuencia del ADNc de Glyma13g17420 (SEQ ID n.º 4) en que el intrón estaba ayustado de manera diferente. La secuencia para el extremo 5' de la EST sdp3c.pk014.n18 que se había secuenciado se presenta en la SEQ ID n.º 7. La CDS de sdp3c.pk014.n18 parece ser la misma que para Glyma13g17420 (SEQ ID n.º 5). El homólogo de soja para el gen de la sacarosa sintasa 2 de Arabidopsis presentado en la SEQ ID n.º 5 se denominó GmSus.
En la base de datos de Glyma se identificó como una región promotora una región del ADN genómico delante del codón de inicio de GmSus (SEQ ID n.º 5) mediante búsquedas con BLAST, y la secuencia se presenta en la SEQ ID n.º 8. La figura 1 muestra un esquema de la región del promotor de GmSus.
La región del promotor de GmSus identificada codifica la UTR en 5' del ADNc del transcrito (pb 2101 a 3191 de la SEQ ID n.º 8), así como un intrón (pb 2134 a 3168 de la SEQ ID n.º 8). La región de la UTR en 5' y el intrón se incluyeron como parte de la región del promotor, ya que contenía una caja AW (AW2 en la figura 1) desde el pb 2662 al 2675 de la SEQ ID n.º 8 dentro del intrón. Otra caja AW (AW1 en la figura 1) aparece desde el pb 616 al pb 629 de la SEQ ID n.º 8. Las cajas AW consisten en la secuencia de nucleótidos [CnTnG](n)7[CG] (SEQ ID n.º 78), donde n es cualquier nucleótido, y las cajas AW son sitios de fijación importantes para factores de transcripción, tales como wri1 en Arabidopsis (Maeo, K. et al. (2009) Plant Journal 60 (3): 476-487).
El ADN genómico se aisló de las hojas de plantas 93B86 de soja de aproximadamente 4 semanas de edad mediante el uso del minikit para plantas DNEASY® (Qiagen, Valencia, CA) y siguiendo el protocolo del fabricante. La región del promotor de GmSus (SEQ ID n.º 8) se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de 93B86 mediante el uso de los oligonucleótidos GmSuSyProm-5 (SEQ ID n.º 9) y Gm-SuSyProm-5 (SEQ ID n.º 10) con la ADN polimerasa de alta fidelidad PHUSIONTM (n.º de cat. F553S, Finnzymes Oy, Finlandia), y siguiendo el protocolo del fabricante. El fragmento de ADN resultante se clonó en el vector de clonación pCR®-BLUNT® con el uso del kit de clonación para PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), siguiendo el protocolo del fabricante, para producir el pLF284 (SEQ ID n.º 11).
El fragmento EcoRI de pLF284 (SEQ ID n. º 11), que contiene la región del promotor de GmSuS (denominada GmSuSPro) se clonó en el sitio EcoRI de pNEB193 (New England BioLabs, Beverly, MA) para producir el pKR1963 (SEQ ID n.º 12).
El plásmido pKR1543, que está descrito previamente en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2011/079005 (publicada el 30 de junio de 2011), se digirió con NotI/XbaI y el fragmento que contenía el terminador de Leg, descrito previamente en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2004/071467 (publicada el 26 de agosto de 2004) se clonó en el fragmento NotI/XbaI de pKR1963 (SEQ ID n.º 12), que contiene el GmSusPro, para producir el pKR1964 (SEQ ID n.º 13).
El fragmento BsiWI de pKR1964 (SEQ ID n.º 13), que contiene el GmSusPro, se clonó en el sitio BsiWI de pKR325, previamente descrito en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2004/071467, para producir el pKR1965 (SEQ ID n.º 14). El plásmido pKR1965 contiene un sitio NotI flanqueado por GmSusPro y el terminador de Leg, así como el gen de la higromicina B fosfotransferasa [Gritz, L. y Davies, J. (1983) Gene 25: 179-188], flanqueado por el promotor de T7 y el terminador de la transcripción, un origen de replicación bacteriano (ori) para la selección y replicación en E. coli, y el gen de la higromicina B fosfotransferasa, flanqueado por el promotor 35S [Odell et al., (1985) Nature 313: 810-812] y el terminador de transcripción en 3' de NOS [Depicker et al., (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-570] (casete 35S/hpt/NOS3') para la selección en la soja. De este
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modo, los polinucleótidos (p. ej., regiones codificantes de proteína) flanqueados por los sitios NotI se pueden clonar en el sitio NotI de pKR1965 (SEQ ID n.º 14) y expresarlos en la soja.
Ejemplo 2
Clonación de los homólogos de Lec1, Fusca3 y ODP1 en soja
GmLec1 desde el ADNc:
Se preparó la genoteca de ADNc se2 de soja, procedente de las semillas de soja (Glycine max L.) en desarrollo recogidas 13 días después de la floración (DDF), se secuenciaron los clones de ADNc y la secuencia se analizó como está descrito en la patente de los EE.UU. n.º 7.157.621.
Se identificó un clon de ADNc (se2.11d12) de la genoteca de ADNc se2 con homología al factor de transcripción cotiledón frondoso (LEAFY COTYLEDON1; Lec1) (Lotan, T. et al. (1998) Cell 93(7): 1195-1205).
El clon de ADNc se secuenció completamente mediante los métodos descritos en la patente de los EE.UU. n.º
7.157.621 y su secuencia se presenta en la SEQ ID n.º 15. Este clon parece tener 2 clones de ADNc independientes insertados en él, pero la secuencia de 38-718 pb es idéntica al 100% a la secuencia codificante de lec1b (n.º de acceso del NCBI EU088289.1 GI:158525282) y a la CDS de Glyma17g00950 sobre la base de una comparación con BLAST. La secuencia codificante del clon se2.11d12, que corresponde a la de Glyma17g00950 se muestra en la SEQ ID n.º 16 y la secuencia de aminoácidos codificada se muestra en la SEQ ID n.º 17.
Un clon de ADNc distinto (se1.pk0042.d8) identificado de la genoteca de ADNc se1, procedente de semillas de soja (Glycine max L.) en desarrollo recogidas de 6 a 10 DDF y descrito en la patente de los EE.UU. n.º 7.157.621 también contenía un homólogo de lec1, según se determinó mediante el análisis con BLAST. La secuencia del inserto completo de se1.pk0042.d8 se muestra en la SEQ ID n.º 18. La secuencia del clon de ADNc se1.pk0042.d8 es idéntica al 99% a la secuencia codificante de lec1a (n.º de acceso del NCBI EU088288.1 GI:158525280) e idéntico al 100% a la CDS de Glyma07g39820 basado en una comparación con BLAST. La secuencia codificante del clon se1.pk0042.d8 parece tener 2 nt menos del ATG, pero se muestra en la SEQ ID n.º 19 con el inicio correcto en comparación con Glyma07g39820. La secuencia de aminoácidos codificada correspondiente se muestra en la SEQ ID n.º 20.
El ADN se preparó también de una alícuota de la genoteca de ADNc se2 mediante el uso del kit de minipreparación QIAprep® Spin (Qiagen Inc., Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADN de la genoteca de ADNc se utilizó como molde en una reacción de PCR que utiliza los oligonucleótidos SA275 (SEQ ID n.º 21) y SA276 (SEQ ID n.º 22) con la ADN polimerasa Taq de la marca «Platinum» (Life Technologies) siguiendo el protocolo del fabricante. El fragmento de PCR se clonó con el kit de clonación pCR®8/GW/TOPO® TA (Invitrogen Corporation) para producir el plásmido Glyma17g00950/pCRB/GW/TOPO (SEQ ID n.º 23). La CDS del producto de la PCR contenida en Glyma17g00950/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID n.º 23), denominado GmLec1, se presenta en la SEQ ID n.º 24 y la correspondiente secuencia de aminoácidos de GmLec1 se presenta en la SEQ ID n.º 25. Se debe observar que la CDS y la secuencia de aminoácidos de GmLec1 son diferentes que las que corresponden a Glyma17g00950 o bien a Glyma07g39820. En la figura 2 se muestra un alineamiento que compara las secuencias de aminoácidos de Glyma17g00950 (SEQ ID n.º 17), Glyma07g39820 (SEQ ID n.º 20) y GmLec1 (SEQ ID n.º 25).
El gen de GmLec1 se amplificó por PCR a partir de Glyma17g00950/pCRB/GW/TOPO (SEQ ID n.º 23) con los oligonucleótidos Gmlec-5 (SEQ ID n.º 26) y Gmlec-3 (SEQ ID n.º 27) con la ADN polimerasa de alta fidelidad PHUSIONTM (n.º de cat. F553S, Finnzymes Oy, Finlandia), siguiendo el protocolo del fabricante. El fragmento de PCR se clonó en el vector de clonación pCR®-BLUNT® con el uso del kit de clonación para PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), siguiendo el protocolo del fabricante, para producir el pLF275 (SEQ ID n.º 28).
Fragmento NotI que contiene la GmODP1:
La ODP de soja (GmODP1) se describe en la patente de los EE.UU. n.º 7.157.621. La clonación de GmODP1 con los sitios NotI flanqueantes en el plásmido KS334 está descrito previamente en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2010/114989 (publicada el 7 de octubre de 2010). Se debe observar que hay un error tipográfico en el mapa de KS334 (SEQ ID n.º 14 en la solicitud de patente internacional WO 2010/114989) y que debe haber 3 nucleótidos más (TGA) en la posición 1237 para formar un codón de parada y terminar la CDS en KS334. La CDS y la secuencia de aminoácidos de GmODP1 de la solicitud de patente internacional WO 2010/114989 se presentan aquí en la SEQ ID n.º 29 y en la SEQ ID n.º 30, respectivamente.
GmFusca3-1 y GmFusca3-2 por PCR a partir del ADNc:
Basándose en el análisis con BLAST de la base de datos de secuencias del genoma de soja, se identificó Glyma16g05480 con homología al factor de transcripción Fusca3 (Luerssen, H. et al. (1998) Plant Journal, 15 (6): 755-764). La predicción de la CDS y la secuencia de aminoácidos de Glyma16g05480 según se predijo en la base de datos de Glyma se muestran en la SEQ ID n.º 31 y la SEQ ID n.º 32, respectivamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
El ADN preparado de una alícuota de la genoteca de ADNc se2 (descrita más arriba) se utilizó como molde en una reacción de PCR con los oligonucleótidos SA278 (SEQ ID n.º 33) y SA279 (SEQ ID n.º 34), con la ADN polimerasa Taq de la marca «Platinum» (Life Technologies), siguiendo el protocolo del fabricante. El fragmento de PCR se clonó con el kit de clonación pCR®8/GW/TOPO® TA (Invitrogen Corporation) para producir el plásmido Glyma16g05480/pCR8/GW/TOPO (SEQ ID n.º 35). Se secuenció el inserto de ADNc en Glyma16g05480/pCRB/GW/TOPO (SEQ ID n.º 35) y la secuencia se presenta en la SEQ ID n.º 36.
El inserto de ADNc (SEQ ID n.º 36) se analizó con BLAST y se halló que era diferente de lo que se había predicho para Glyma16g05480 (SEQ ID n.º 31). La secuencia tampoco codificó una CDS perfecta, ya que se encontraron codones de parada prematuros en el interior. La comparación de la secuencia del inserto de ADNc con la secuencia del genoma en Glyma reveló que el extremo 3' del inserto de ADNc era idéntico al 100% a la secuencia codificante predicha de Glyma19g27340. La CDS predicha y la correspondiente secuencia de aminoácidos de Glyma19g27340 de la base de datos de Glyma se presentan en la SEQ ID n.º 37 y la SEQ ID n.º 38, respectivamente.
El inserto de ADNc es mayor que la CDS predicha para Glyma19g27340 (SEQ ID n.º 38) y tiene 1193 pb adicionales en el extremo 5'. Otra comparación del inserto de ADNc con la secuencia genómica delante de la CDS de Glyma19g27340 (SEQ ID n.º 37) revela una identidad del 100%, con la excepción de un solo nucleótido que viene del oligonucleótido SA278 (SEQ ID n.º 33). La secuencia completa del ADN genómico, de la base de datos del genoma de soja, secuencia arriba y que incluye Glyma19g27340, se presenta en la SEQ ID n.º 39.
El inserto de ADNc (SEQ ID n.º 36) no codificó una CDS completa y se determinó que la secuencia del ADNc contenía una secuencia de intrón sin ayustar, o bien que estaba presente un codón de inicio alternativo. La secuencia completa del inserto de ADNc (denominado GmFusca3-2), que podría contener intrones, se amplificó por PCR con los oligonucleótidos GmFusca3-1-5 (SEQ ID n.º 40) y GmFusca3-3 (SEQ ID n.º 41) con la ADN polimerasa de alta fidelidad PHUSIONTM (n.º de cat. F553S, Finnzymes Oy, Finlandia), siguiendo el protocolo del fabricante.
El fragmento de PCR se clonó en el vector de clonación pCR®-BLUNT® con el kit de clonación para PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), siguiendo el protocolo del fabricante, para producir el pLF283 (SEQ ID n.º 42).
El ADNc de longitud completa del producto de PCR resultante para GmFusca3-2 se muestra en la SEQ ID n.º 43 y es idéntico al ADNc original (SEQ ID n.º 36) salvo en que el nucleótido 17 se ha cambiado de C a T para concordar con el predicho en la secuencia del ADN genómico de Glyma19g27340. Una posible CDS ayustada, así como la correspondiente secuencia de aminoácidos codificada, de GmFusca3-2 se muestran en la SEQ ID n.º 44 y la SEQ ID n.º 45, respectivamente.
Una segunda secuencia de ORF más corta contenida dentro del inserto de ADNc (SEQ ID n.º 36), denominada GmFusca3-1, se amplificó por PCR con los oligonucleótidos GmFusca3-2-5 (SEQ ID n.º 46) y GmFusca3-3 (SEQ ID n.º 41) con la ADN polimerasa de alta fidelidad PHUSIONTM (n.º de cat. F553S, Finnzymes Oy, Finlandia), siguiendo el protocolo del fabricante.
El fragmento de PCR resultante, que contiene Fusca3-1, se clonó en el vector de clonación pCR®-BLUNT® con el kit de clonación para PCR ZERO BLUNT® (Invitrogen Corporation), siguiendo el protocolo del fabricante, para producir el pLF282 (SEQ ID n.º 47).
La secuencia completa contiene intrones sin ayustar y la secuencia codificante, así como la correspondiente secuencia de aminoácidos codificada de GmFusca3-1, se muestran en la SEQ ID n.º 48 y 49, respectivamente.
En la figura 3 se muestra un alineamiento que compara las secuencias de aminoácidos de Glyma16g05480 (SEQ ID n.º 32) y Glyma19g27340 (SEQ ID n.º 38), según está predicha en la base de datos de Glyma, junto con la secuencia ayustada predicha de GmFusca3-2 (SEQ ID n.º 45) y de GmFusca3-1 (SEQ ID n.º 49).
Ejemplo 3
Expresión de GmLec1, GmODP1, GmFusca-3-1 y GmFusca3-2 en los embriones de soja bajo el control del promotor de GmSus
El fragmento NotI de pLF275 (SEQ ID n.º 28), que contiene GmLec1, el fragmento NotI de KS334, que contiene GmODP1, el fragmento NotI de pLF282 (SEQ ID n.º 47), que contiene GmFusca3-1, y el fragmento NotI de pLF283 (SEQ ID n.º 42), que contiene GmFusca3-2, se clonaron en el sitio NotI de pKR1965 (SEQ ID n.º 14) para producir pKR1968 (SEQ ID n.º 50), pKR1971 (SEQ ID n.º 51), pKR1969 (SEQ ID n.º 52) y pKR1970 (SEQ ID n.º 53), respectivamente. De este modo, los factores de transcripción correspondientes se pudieron expresar tras el promotor de la sacarosa sintasa de soja (GmSusPro). Se utilizó como control negativo el plásmido pKR278, descrito previamente en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935 (publicada el 13 de octubre de 2009) y que no contiene ningún factor de transcripción, pero que tiene el marcador de selección por higromicina.
El ADN de los plásmidos pKR1968 (SEQ ID n.º 50), pKR1971 (SEQ ID n.º 51), pKR1969 (SEQ ID n.º 52), pKR1970 (SEQ ID n.º 53) y pKR278 se preparó para el bombardeo de partículas en el cultivo con la suspensión embriogénica
de soja y se transformó exactamente como está descrito previamente en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. Se inició el cultivo con la suspensión embriogénica de soja, se hizo crecer, se mantuvo y se bombardeó, y los transformantes biolísticos se seleccionaron y se hicieron madurar en el medio SHaM también exactamente como está descrito en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 1 se resumen los genes, los plásmidos y los números de experimento del sistema modelo («ESM»).
Tabla 1
- Resumen de los genes, los plásmidos y los experimentos
- Experimento
- Plásmido Gen SEQ ID n.º
- nt
- aa
- ESM 2863
- pKR1968 GmLec1 24 25
- ESM 2864
- pKR1969 GmFusca3-1 48 49
- ESM 2865
- pKR1970 GmFusca3-2 44 45
- ESM 2866
- pKR1971 GmODP1 29 30
- ESM 2867
- pKR278 Control con el vector vacío – –
Aproximadamente de 10 a 20 embriones maduros de cada uno de los aproximadamente 30 transformantes biolísticos por experimento de bombardeo se liofilizaron, se molieron, se les midió el contenido de aceite por RMN y
10 se les evaluó el perfil de ácidos grasos por análisis de FAME-GC exactamente como está descrito en la publicación de la solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. Los resultados para el contenido de aceite y el perfil de ácidos grasos para cada transformante biolístico, así como la media de todos los transformantes biolísticos (Med.) y la media para los 5 mejores transformantes biolíticos que tienen el contenido de aceite más alto (Med5mejor.) se muestran en la tabla 2.
15 En la tabla 2, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En la tabla 2, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% de aceite), y el contenido de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un % en peso de los ácidos grasos totales.
Tabla 2
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmLec1, GmFusca3-1, GmFusca3-2, GmODP1 o control con el vector vacío
- % de aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2863-3
- 9,9 15,6 7,0 17,9 48,3 11,2
- 2863-21
- 9,3 14,7 8,8 18,5 46,5 11,5
- 2863-24
- 8,6 15,5 7,9 17,1 46,1 13,4
- 2863-13
- 8,2 17,1 5,9 16,3 46,4 14,4
- 2863-6
- 7,7 15,3 8,6 18,9 44,0 13,3
- 2863-29
- 7,6 15,8 9,0 19,1 42,3 13,8
- 2863-11
- 7,4 15,8 8,1 18,4 44,2 13,5
- 2863-30
- 7,1 15,9 5,7 20,5 43,8 14,1
- 2863-23
- 7,1 16,5 6,3 21,0 42,1 14,1
- 2863-7
- 6,8 15,9 7,8 16,2 45,5 14,6
- 2863-22
- 6,6 15,7 7,7 18,4 43,9 14,3
- 2863-25
- 6,4 14,6 6,5 20,6 43,1 15,2
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmLec1, GmFusca3-1, GmFusca3-2, GmODP1 o control con el vector vacío
- % de aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2863-5
- 6,4 16,7 6,2 19,0 43,2 15,0
- 2863-19
- 6,2 16,2 5,7 20,4 42,7 15,1
- 2863-8
- 6,1 15,9 9,7 18,7 41,6 14,2
- 2863-14
- 5,9 15,8 8,3 16,9 44,1 14,9
- 2863-10
- 5,8 17,2 7,1 17,4 43,9 14,5
- 2863-2
- 5,7 16,7 5,7 19,8 41,9 16,0
- 2863-1
- 5,6 17,0 6,1 20,1 41,9 14,9
- 2863-9
- 5,3 16,6 8,7 18,9 41,5 14,3
- 2863-26
- 5,3 15,2 8,3 16,4 43,9 16,2
- 2863-28
- 5,3 17,2 4,5 14,9 46,3 17,1
- 2863-27
- 5,0 17,5 5,6 12,9 48,1 16,0
- 2863-4
- 5,0 16,9 5,6 18,9 42,4 16,2
- 2863-20
- 4,9 16,3 6,0 20,1 42,4 15,2
- 2863-16
- 4,7 17,9 5,0 14,1 45,9 17,1
- 2863-17
- 4,2 18,1 4,1 12,7 46,1 19,1
- 2863-15
- 3,2 19,3 4,6 15,1 42,2 18,8
- 2863-12
- 3,2 17,6 5,1 15,3 43,5 18,5
- 2863-18
- 2,5 17,3 5,6 17,0 37,8 22,4
- Med.
- 6,1 16,5 6,7 17,7 43,9 15,3
- Med5mejor.
- 8,7 15,6 7,6 17,7 46,2 12,7
- 2864-10
- 7,6 14,9 6,2 16,4 46,5 15,9
- 2864-15
- 7,6 15,0 9,2 18,6 44,3 12,9
- 2864-25
- 7,5 15,9 5,5 20,3 44,1 14,2
- 2864-12
- 7,3 17,3 4,9 13,4 49,8 14,5
- 2864-18
- 7,2 15,2 8,6 18,1 44,5 13,6
- 2864-6
- 6,9 15,3 8,7 18,6 42,7 14,8
- 2864-26
- 6,8 16,2 7,3 16,9 45,1 14,5
- 2864-7
- 6,8 14,8 8,1 17,8 43,8 15,4
- 2864-28
- 6,2 17,6 4,5 11,2 50,4 16,4
- 2864-19
- 6,0 15,6 9,4 18,8 41,6 14,6
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmLec1, GmFusca3-1, GmFusca3-2, GmODP1 o control con el vector vacío
- % de aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2864-1
- 5,9 17,1 6,8 14,7 46,3 15,2
- 2864-17
- 5,8 16,8 6,9 22,0 41,4 12,9
- 2864-2
- 5,8 16,6 5,0 20,7 43,4 14,5
- 2864-9
- 5,7 17,2 5,8 12,7 47,1 17,2
- 2864-22
- 5,6 16,6 6,3 13,8 47,3 16,0
- 2864-4
- 5,6 16,0 7,6 22,1 40,6 13,8
- 2864-27
- 5,0 15,8 10,0 20,8 39,2 14,3
- 2864-3
- 4,9 17,4 6,5 20,7 39,8 15,6
- 2864-11
- 4,6 15,4 5,3 17,4 44,2 17,8
- 2864-30
- 4,4 17,4 6,7 15,2 43,2 17,5
- 2864-29
- 4,1 17,2 6,8 15,5 42,0 18,5
- 2864-8
- 4,0 16,9 4,9 18,4 42,1 17,7
- 2864-31
- 3,8 18,1 4,9 13,5 44,4 19,1
- 2864-14
- 3,7 17,1 5,5 18,5 42,4 16,5
- 2864-24
- 3,6 17,4 5,8 18,8 39,7 18,4
- 2864-5
- 3,5 16,2 7,7 19,0 43,6 13,5
- 2864-21
- 3,3 16,4 4,6 14,4 44,2 20,4
- 2864-13
- 2,9 17,6 6,0 18,6 38,8 19,1
- 2864-23
- 2,6 18,4 5,1 13,3 41,7 21,5
- 2864-20
- 2,5 17,9 4,7 13,5 41,8 22,2
- 2864-16
- 2,1 16,0 6,2 13,2 43,9 20,6
- Med.
- 5,1 16,5 6,5 17,0 43,5 16,4
- Med5mejor.
- 7,5 15,7 6,9 17,3 45,9 14,2
- 2865-7
- 7,6 16,5 5,6 20,1 45,0 12,7
- 2865-24
- 5,9 17,6 4,1 13,9 50,5 13,9
- 2865-29
- 5,6 17,1 4,1 14,5 47,8 16,6
- 2865-14
- 5,1 16,1 6,2 19,6 42,5 15,6
- 2865-27
- 5,1 19,3 4,0 13,7 48,2 14,8
- 2865-23
- 5,0 18,9 4,1 15,8 45,9 15,3
- 2865-8
- 4,9 16,9 6,2 16,1 47,5 13,3
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmLec1, GmFusca3-1, GmFusca3-2, GmODP1 o control con el vector vacío
- % de aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2865-25
- 4,8 18,3 4,1 15,2 46,6 15,8
- 2865-21
- 4,7 18,4 4,4 15,3 47,0 14,9
- 2865-1
- 4,5 18,9 4,2 14,4 46,8 15,8
- 2865-13
- 4,3 19,3 4,1 14,5 47,9 14,3
- 2865-12
- 4,3 17,1 4,8 15,8 43,0 19,3
- 2865-20
- 4,1 16,8 4,1 14,6 47,6 16,9
- 2865-28
- 3,6 18,4 5,6 20,2 42,1 13,7
- 2865-18
- 3,4 19,2 4,7 14,9 45,0 16,2
- 2865-11
- 3,3 16,8 5,5 18,2 45,1 14,5
- 2865-30
- 3,0 15,5 5,3 15,5 43,3 20,5
- 2865-6
- 2,9 17,2 5,5 18,1 41,2 18,1
- 2865-15
- 2,9 19,2 4,2 13,2 44,7 18,6
- 2865-5
- 2,8 18,6 4,6 12,2 44,1 20,5
- 2865-22
- 2,4 19,8 5,1 15,6 43,4 16,0
- 2865-10
- 2,3 18,0 5,4 19,2 42,8 14,6
- 2865-9
- 2,1 19,4 4,4 12,0 41,1 23,1
- 2865-2
- 2,0 18,7 4,4 13,3 43,8 19,8
- 2865-3
- 1,9 18,0 5,5 16,0 43,0 17,4
- 2865-19
- 1,6 17,9 5,3 14,0 42,7 20,1
- 2865-4
- 1,4 17,9 4,5 11,7 44,5 21,5
- 2865-16
- 1,3 18,2 5,5 12,9 41,0 22,3
- 2865-17
- 1,1 17,7 5,4 17,9 37,3 21,7
- Med.
- 3,6 18,0 4,9 15,5 44,5 17,2
- Med5mejor.
- 5,9 17,3 4,8 16,4 46,8 14,7
- 2866-10
- 9,8 19,0 6,3 19,8 44,6 10,3
- 2866-23
- 9,6 15,5 6,2 22,1 45,2 11,0
- 2866-12
- 8,4 13,5 7,0 23,3 45,1 11,1
- 2866-13
- 8,1 16,0 5,6 21,6 44,2 12,6
- 2866-5
- 8,1 16,7 5,7 24,3 42,5 10,8
- 2866-1
- 7,8 15,6 7,1 26,0 40,1 11,2
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmLec1, GmFusca3-1, GmFusca3-2, GmODP1 o control con el vector vacío
- % de aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2866-9
- 6,6 15,5 8,5 29,6 36,0 10,4
- 2866-3
- 6,6 15,4 8,9 28,9 37,0 9,7
- 2866-7
- 6,6 15,7 8,9 20,0 42,2 13,1
- 2866-18
- 6,5 15,8 8,7 20,3 42,7 12,5
- 2866-6
- 6,3 16,0 7,7 18,7 43,2 14,4
- 2866-26
- 5,6 15,9 6,9 22,9 43,0 11,3
- 2866-29
- 5,6 16,4 6,3 22,9 40,7 13,7
- 2866-21
- 5,5 15,7 7,8 27,2 38,5 10,8
- 2866-20
- 5,4 16,4 7,3 25,0 38,6 12,7
- 2866-11
- 5,2 17,6 6,1 22,8 40,5 12,9
- 2866-4
- 4,7 16,6 6,5 22,7 40,0 14,2
- 2866-8
- 4,7 15,8 7,6 29,4 36,1 11,1
- 2866-16
- 4,6 14,5 9,2 30,6 35,2 10,5
- 2866-27
- 4,5 17,6 6,7 18,8 44,8 12,1
- 2866-15
- 4,5 17,0 6,2 24,2 37,8 14,8
- 2866-24
- 4,4 17,3 4,9 13,1 50,6 14,1
- 2866-30
- 3,7 16,7 5,8 18,5 46,1 12,9
- 2866-2
- 3,7 16,6 5,9 21,3 39,6 16,6
- 2866-31
- 3,6 18,1 4,8 14,6 48,6 14,0
- 2866-19
- 3,5 19,3 4,8 13,9 47,3 14,7
- 2866-28
- 3,5 17,1 6,7 19,9 42,8 13,5
- 2866-17
- 3,4 18,0 5,0 16,2 46,2 14,6
- 2866-14
- 3,3 18,7 5,3 15,0 45,1 15,8
- 2866-22
- 2,5 17,2 5,2 13,8 48,3 15,5
- 2866-25
- 2,0 17,8 5,3 17,1 43,8 16,1
- Med.
- 5,4 16,6 6,6 21,4 42,5 12,9
- Med5mejor.
- 8,8 16,2 6,2 22,2 44,3 11,2
- 2867-5
- 7,6 17,2 5,7 14,5 48,9 13,7
- 2867-24
- 6,2 17,9 5,1 13,1 48,6 15,3
- 2867-18
- 6,0 17,9 5,7 14,5 45,0 16,8
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmLec1, GmFusca3-1, GmFusca3-2, GmODP1 o control con el vector vacío
- % de aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2867-19
- 5,7 16,1 7,1 18,1 43,2 15,5
- 2867-20
- 5,5 16,8 5,8 13,3 49,6 14,5
- 2867-29
- 5,4 16,2 6,4 22,4 40,3 14,7
- 2867-2
- 5,2 16,4 7,7 16,6 45,3 14,0
- 2867-15
- 5,1 16,8 5,8 20,0 43,1 14,4
- 2867-7
- 5,0 16,7 6,5 15,4 47,9 13,5
- 2867-28
- 4,9 16,9 6,6 14,2 46,7 15,6
- 2867-13
- 4,8 16,8 6,4 23,9 37,7 15,2
- 2867-26
- 4,8 16,2 7,4 17,8 46,2 12,5
- 2867-1
- 4,7 15,8 8,5 18,7 44,3 12,7
- 2867-16
- 4,7 16,1 7,7 18,2 43,4 14,7
- 2867-30
- 4,6 16,2 6,2 22,5 40,6 14,6
- 2867-11
- 4,6 17,5 6,4 21,6 40,4 14,1
- 2867-25
- 4,6 17,1 7,2 16,5 44,2 15,1
- 2867-23
- 4,4 16,5 7,0 15,5 46,7 14,4
- 2867-14
- 4,2 18,2 6,0 15,2 44,5 16,0
- 2867-6
- 4,2 16,1 6,5 25,8 37,5 14,2
- 2867-9
- 4,2 17,0 6,5 15,3 46,3 14,9
- 2867-8
- 4,1 16,2 5,2 18,7 42,1 17,9
- 2867-10
- 4,0 17,1 5,5 19,4 42,6 15,3
- 2867-27
- 4,0 17,1 6,6 26,4 35,6 14,4
- 2867-21
- 3,8 16,3 6,1 21,2 43,5 12,9
- 2867-17
- 3,4 17,7 6,6 15,9 43,8 16,0
- 2867-12
- 3,4 17,3 7,0 20,9 39,3 15,5
- 2867-31
- 3,4 16,5 7,4 17,9 43,5 14,7
- 2867-4
- 3,2 18,2 4,8 11,0 47,6 18,4
- 2867-22
- 3,0 16,9 6,3 22,0 39,2 15,6
- 2867-3
- 2,3 17,9 5,8 13,6 46,0 16,6
- Med.
- 4,5 16,9 6,4 18,1 43,7 14,9
- Med5mejor.
- 6,2 17,2 5,9 14,7 47,1 15,2
En la tabla 3 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil medio de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos en cada experimento. En la tabla 3 se describe el contenido medio de
32
5
10
15
20
25
30
(denominada aquí GmDGAT1cAll y denominada GM-DGAT1c9c10c11 en la solicitud de patente internacional WO 2009/143397) bajo el control del promotor de la β-conglicinina de soja específico de semilla. La CDS y la secuencia de aminoácidos de GmDGAT1cAll de la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2009/143397 se presenta en la SEQ ID n.º 54 y en la SEQ ID n.º 55, respectivamente.
El fragmento SbfI de pKR1968 (SEQ ID n.º 50), que contiene GmLec1, el fragmento SbfI de pKR1971 (SEQ ID n.º 51), que contiene GmODP1, y el fragmento SbfI de pKR1969 (SEQ ID n.º 52), que contiene GmFusca3-1, se clonaron en el sitio SbfI de pKR1520 para producir pKR2098 (SEQ ID n.º 56), pKR2100 (SEQ ID n.º 57) y pKR2099 (SEQ ID n.º 58), respectivamente. De este modo, los factores de transcripción correspondientes se pudieron expresar detrás del promotor de la sacarosa sintasa de soja (GmSusPro) y coexpresar con GmDGAT1cAll (SEQ ID n.º 54).
El ADN de los plásmidos pKR2098 (SEQ ID n.º 56), pKR2100 (SEQ ID n.º 57) y pKR2099 (SEQ ID n.º 58), y pKR1520, se prepararon para el bombardeo de partículas en el cultivo con la suspensión embriogénica de soja y se transformó exactamente como está descrito previamente en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. Se inició el cultivo con la suspensión embriogénica de soja, se le hizo crecer, se mantuvo y fue bombardeado, y los transformantes biolísticos se seleccionaron y se hicieron madurar en el medio SHaM también exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 5 se muestra un resumen de los genes, los plásmidos y los números de experimento del sistema modelo.
Tabla 5
- Resumen de genes, plásmidos y experimentos
- Experimento
- Plásmido Gen11,2 Gen2 Gen2 de SEQ ID n.º
- nt
- aa
- ESM 2984
- pKR1520 GmDGAT1cAll - - -
- ESM 2985
- pKR2098 GmDGAT1cAll GmLec1 24 25
- ESM 2986
- pKR2099 GmDGAT1cAll GmFusca3-1 48 49
- ESM 2987
- pKR2100 GmDGAT1cAll GmODP1 29 30
- 1Secuencia de nucleótidos del gen1 de SEQ ID n.º 54 2Secuencia de aminoácidos del gen1 de SEQ ID n.º 55
Se liofilizaron y se molieron aproximadamente de 10 a 20 embriones madurados de cada uno de los aproximadamente 30 transformantes biolísticos por experimento de bombardeo, y se les midió el contenido de aceite por RMN y se les evaluó el perfil de ácidos grasos por análisis de FAME-GC exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 6 se muestran los resultados para el contenido de aceite y el perfil de ácidos grasos para cada transformante biolístico, así como la media de todos los transformantes biolísticos (Med.) y la media de los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto (Med5mejor.).
En la tabla 6, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En la tabla 6, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% Aceite), y el contenido de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
Tabla 6
- Resumen del contenido de aceite y del perfil de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2984-2
- 9,32 14,46 7,12 32,85 36,23 9,34
- 2984-29
- 8,43 14,33 8,26 31,62 36,64 9,15
- Resumen del contenido de aceite y del perfil de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2984-4
- 7,63 14,70 7,20 28,72 37,99 11,39
- 2984-24
- 6,86 15,52 6,84 26,74 41,07 9,83
- 2984-6
- 6,60 16,94 5,65 20,30 36,75 20,36
- 2984-8
- 6,46 14,45 7,54 32,53 36,10 9,38
- 2984-25
- 6,41 14,93 7,19 29,25 37,09 11,54
- 2984-11
- 5,86 15,32 6,32 26,67 37,50 14,20
- 2984-30
- 5,56 16,39 6,21 23,04 40,99 13,37
- 2984-12
- 5,34 15,83 6,18 24,45 38,38 15,16
- 2984-18
- 4,61 16,78 5,59 18,05 44,53 15,06
- 2984-19
- 4,56 15,38 6,88 29,28 35,27 13,19
- 2984-7
- 4,27 15,56 5,73 29,14 35,31 14,26
- 2984-16
- 4,25 16,44 5,84 21,69 40,16 15,87
- 2984-31
- 4,20 15,22 6,04 22,50 39,87 16,37
- 2984-28
- 4,19 15,76 6,15 26,96 36,72 14,41
- 2984-1
- 3,87 15,78 6,82 29,12 35,13 13,15
- 2984-27
- 3,75 16,05 6,67 25,82 36,68 14,78
- 2984-21
- 3,36 15,93 6,97 25,76 37,04 14,31
- 2984-5
- 3,25 16,04 5,34 21,85 38,82 17,95
- 2984-13
- 3,21 16,28 7,58 22,99 38,11 15,03
- 2984-3
- 3,20 16,80 5,81 23,71 36,80 16,88
- 2984-14
- 3,04 16,70 6,74 23,50 38,30 14,76
- 2984-20
- 3,00 16,68 6,75 21,83 38,83 15,92
- 2984-23
- 2,94 16,67 7,14 26,96 34,93 14,31
- 2984-15
- 2,71 16,89 5,36 17,26 40,57 19,92
- 2984-26
- 2,65 17,07 5,53 23,87 35,64 17,88
- 2984-10
- 2,58 17,16 5,07 19,58 39,15 19,05
- 2984-9
- 2,53 18,99 4,57 20,90 37,35 18,19
- 2984-22
- 2,52 17,24 5,35 18,79 40,42 18,21
- 2984-17
- 2,45 17,21 5,61 21,36 38,97 16,85
- Med.
- 4,50 16,11 6,32 24,74 37,98 14,84
- Med5mejor.
- 7,77 15,19 7,02 28,04 37,73 12,01
- Resumen del contenido de aceite y del perfil de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2985-1
- 11,32 14,05 6,20 33,72 38,52 7,52
- 2985-9
- 10,54 13,39 8,11 35,06 35,71 7,73
- 2985-23
- 10,18 14,30 6,93 32,93 37,45 8,38
- 2985-28
- 9,87 13,71 6,71 37,57 34,84 7,18
- 2985-19
- 9,39 14,42 6,81 31,25 38,24 9,29
- 2985-17
- 9,11 14,57 6,32 28,39 40,70 10,01
- 2985-24
- 8,94 14,19 7,08 34,90 35,61 8,21
- 2985-11
- 8,04 14,90 7,13 31,07 37,27 9,63
- 2985-18
- 7,57 16,08 5,19 18,95 46,29 13,50
- 2985-29
- 7,29 15,24 7,14 28,32 38,60 10,70
- 2985-25
- 7,25 13,74 7,43 37,53 34,10 7,20
- 2985-14
- 6,88 15,20 6,96 31,79 36,42 9,62
- 2985-6
- 6,67 14,97 6,56 28,93 38,71 10,84
- 2985-30
- 6,46 15,96 6,53 16,84 45,97 14,70
- 2985-27
- 6,36 15,33 6,64 26,34 40,21 11,48
- 2985-5
- 6,25 15,60 5,96 24,88 40,29 13,26
- 2985-15
- 6,17 16,85 5,42 25,02 40,57 12,15
- 2985-26
- 5,94 15,84 6,33 27,64 38,09 12,10
- 2985-3
- 5,86 15,48 6,40 24,48 39,93 13,71
- 2985-2
- 5,12 16,34 5,90 22,18 40,69 14,90
- 2985-12
- 5,10 16,51 6,55 23,07 38,63 15,25
- 2985-13
- 5,05 16,32 6,07 18,51 45,20 13,89
- 2985-31
- 4,75 17,38 6,33 21,32 40,38 14,60
- 2985-4
- 4,41 17,06 5,10 18,20 42,54 17,10
- 2985-21
- 4,38 15,99 6,41 19,61 42,79 15,19
- 2985-22
- 4,28 17,00 6,07 23,15 40,43 13,36
- 2985-10
- 3,71 16,56 5,93 24,73 39,45 13,32
- 2985-16
- 3,29 16,62 5,38 20,23 38,80 18,97
- 2985-7
- 3,26 16,95 6,46 21,87 40,53 14,19
- 2985-8
- 2,84 16,88 5,26 19,34 39,99 18,54
- Resumen del contenido de aceite y del perfil de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2985-20
- 2,46 20,08 5,07 16,79 39,65 18,41
- Med.
- 6,41 15,73 6,33 25,95 39,57 12,42
- Med5mejor.
- 10,26 13,97 6,95 34,10 36,95 8,02
- 2986-13
- 12,08 14,11 7,29 29,76 40,57 8,26
- 2986-14
- 9,48 15,35 7,22 27,69 39,56 10,19
- 2986-21
- 8,96 14,52 6,68 31,53 38,85 8,42
- 2986-2
- 8,49 15,69 7,16 27,15 39,78 10,22
- 2986-7
- 8,22 14,73 6,70 37,98 32,64 7,96
- 2986-17
- 8,13 15,65 6,55 22,13 44,57 11,09
- 2986-12
- 7,93 16,01 5,59 25,79 41,51 11,10
- 2986-1
- 7,87 14,34 7,24 32,35 37,08 8,99
- 2986-5
- 7,56 15,06 6,12 33,97 36,01 8,85
- 2986-16
- 7,53 15,36 6,91 32,19 36,34 9,21
- 2986-3
- 7,43 15,21 5,16 17,26 46,98 15,39
- 2986-24
- 7,13 15,93 6,26 20,01 45,26 12,54
- 2986-18
- 6,79 15,97 6,13 20,41 44,98 12,50
- 2986-19
- 6,73 15,83 6,33 21,92 42,56 13,35
- 2986-6
- 6,48 13,40 8,25 44,98 27,01 6,36
- 2986-23
- 6,25 15,99 6,28 22,04 42,68 13,01
- 2986-15
- 6,04 16,04 6,23 23,80 41,36 12,57
- 2986-20
- 5,98 17,17 5,96 23,94 41,44 11,49
- 2986-25
- 5,94 16,05 6,56 19,97 43,82 13,61
- 2986-27
- 5,80 14,18 6,40 27,22 39,60 12,60
- 2986-29
- 5,51 16,00 5,04 21,20 43,39 14,37
- 2986-9
- 5,48 15,77 6,72 19,81 42,90 14,79
- 2986-4
- 5,42 16,95 5,97 19,96 44,57 12,56
- 2986-10
- 4,95 16,33 6,66 23,74 39,55 13,72
- 2986-30
- 4,65 16,25 6,37 21,89 42,77 12,73
- 2986-11
- 4,51 15,98 6,52 27,94 37,95 11,61
- 2986-8
- 4,36 17,29 5,63 20,77 40,92 15,40
- Resumen del contenido de aceite y del perfil de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 2986-26
- 4,06 17,21 5,52 20,73 43,19 13,36
- 2986-22
- 3,96 16,46 6,26 28,71 37,50 11,08
- 2986-28
- 3,28 17,67 5,64 20,27 41,54 14,88
- Med.
- 6,57 15,75 6,38 25,57 40,56 11,74
- Med5mejor.
- 9,45 14,88 7,01 30,82 38,28 9,01
- 2987-20
- 12,17 14,93 6,81 34,83 36,56 6,87
- 2987-5
- 11,26 13,58 7,25 31,24 39,66 8,27
- 2987-29
- 10,88 15,09 7,40 36,20 34,60 6,71
- 2987-16
- 10,57 14,09 7,46 33,87 36,42 8,16
- 2987-23
- 8,79 15,14 7,81 35,32 33,79 7,94
- 2987-13
- 8,68 16,00 5,65 23,11 43,90 11,35
- 2987-2
- 8,53 15,23 7,36 33,83 34,58 9,01
- 2987-28
- 7,93 13,55 9,78 40,08 29,47 7,12
- 2987-19
- 7,92 15,16 6,44 19,87 46,41 12,13
- 2987-4
- 7,37 14,91 6,56 26,12 41,57 10,84
- 2987-27
- 6,45 15,89 7,07 25,71 39,42 11,91
- 2987-17
- 6,31 16,71 6,26 22,14 42,71 12,17
- 2987-22
- 6,29 15,56 6,52 23,53 42,86 11,53
- 2987-15
- 5,95 15,59 6,35 21,63 43,38 13,05
- 2987-9
- 5,93 15,88 5,83 22,21 41,06 15,02
- 2987-14
- 5,81 17,54 6,82 32,38 32,46 10,79
- 2987-1
- 5,67 16,70 5,59 20,52 44,56 12,64
- 2987-26
- 5,61 15,98 6,41 24,77 39,04 13,80
- 2987-30
- 5,53 15,96 6,26 23,42 40,36 13,99
- 2987-3
- 5,30 16,46 6,34 24,45 40,62 12,12
- 2987-10
- 4,79 15,82 7,19 26,35 39,72 10,92
- 2987-25
- 4,67 15,89 7,76 29,34 36,64 10,37
- 2987-6
- 4,66 15,68 6,62 27,99 36,93 12,80
- 2987-8
- 4,54 16,20 6,11 26,29 38,62 12,78
- 2987-21
- 4,52 14,91 8,32 35,11 32,32 9,34
En la tabla 10, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En la tabla 10, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% Aceite), y el contenido de ácidos grasos por cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico
(18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
Tabla 10
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3017-13
- 13,72 12,08 6,15 29,99 44,30 7,48
- 3017-18
- 13,14 12,08 5,73 33,42 40,61 8,16
- 3017-25
- 12,64 14,47 5,31 17,82 51,29 11,11
- 3017-22
- 12,36 13,29 6,21 27,79 42,62 10,09
- 3017-32
- 11,14 13,46 6,07 27,14 44,74 8,59
- 3017-4
- 10,76 14,14 5,79 28,40 41,94 9,73
- 3017-9
- 10,70 14,87 5,23 22,81 46,72 10,38
- 3017-16
- 10,57 14,79 5,38 21,80 47,42 10,60
- 3017-8
- 10,57 14,81 6,29 25,54 43,89 9,48
- 3017-17
- 9,48 12,33 5,89 32,24 42,96 6,58
- 3017-19
- 9,41 14,20 5,91 23,85 44,80 11,25
- 3017-2
- 9,39 15,20 5,37 22,87 44,49 12,07
- 3017-23
- 9,03 12,09 8,97 39,60 32,75 6,59
- 3017-14
- 9,02 15,29 6,03 23,78 43,09 11,81
- 3017-5
- 8,89 14,78 7,68 24,09 41,71 11,74
- 3017-3
- 8,41 15,15 6,32 28,80 40,19 9,54
- 3017-1
- 8,40 15,50 6,15 21,90 42,45 14,00
- 3017-29
- 8,14 14,99 6,72 28,17 39,30 10,83
- 3017-15
- 8,01 14,83 6,92 25,24 41,34 11,66
- 3017-34
- 7,99 14,61 6,89 25,68 43,83 8,99
- 3017-10
- 7,93 14,62 7,49 27,24 40,62 10,03
- 3017-7
- 7,52 14,57 6,61 29,19 39,82 9,81
- 3017-30
- 7,50 14,61 7,04 26,97 42,70 8,68
- 3017-27
- 7,36 14,34 8,91 30,81 37,02 8,92
- 3017-21
- 7,25 14,12 8,58 30,87 37,73 8,69
- 3017-28
- 6,63 14,82 6,95 29,47 38,94 9,82
- 3017-24
- 5,99 14,96 9,85 31,34 35,56 8,29
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3017-6
- 5,98 15,91 6,64 25,13 40,68 11,64
- 3017-20
- 5,86 14,84 6,67 26,23 42,46 9,80
- 3017-26
- 5,72 13,98 10,16 35,42 32,62 7,83
- 3017-11
- 5,58 13,20 7,63 37,58 34,02 7,57
- 3017-31
- 5,33 14,05 8,45 32,66 35,81 9,03
- 3017-33
- 4,70 14,90 8,12 32,46 34,61 9,91
- 3017-12
- 4,49 14,94 6,07 26,27 40,63 12,09
- Med.
- 8,52 14,32 6,89 28,02 40,99 9,79
- Med5mejor.
- 12,60 13,08 5,90 27,23 44,71 9,09
- 3018-29
- 16,95 11,61 5,42 32,58 43,67 6,72
- 3018-17
- 15,19 10,65 6,96 38,09 38,24 6,06
- 3018-22
- 14,87 9,66 7,05 48,08 30,24 4,98
- 3018-16
- 14,51 11,46 6,52 38,75 37,38 5,88
- 3018-27
- 14,00 11,39 6,00 39,98 36,40 6,23
- 3018-4
- 12,90 11,32 6,54 34,78 40,20 7,16
- 3018-19
- 12,26 13,06 5,28 31,71 42,04 7,90
- 3018-2
- 11,72 11,57 4,94 32,05 42,96 8,48
- 3018-20
- 11,65 10,89 5,08 38,25 37,85 7,93
- 3018-11
- 11,47 12,37 6,68 38,24 355,18 7,54
- 3018-13
- 10,84 11,85 7,36 41,64 33,08 6,06
- 3018-30
- 10,41 14,51 5,98 25,16 44,25 10,11
- 3018-7
- 10,03 10,84 7,56 46,85 29,72 5,03
- 3018-8
- 10,00 15,36 5,09 20,72 48,63 10,22
- 3018-15
- 9,81 12,34 8,07 39,27 32,70 7,63
- 3018-25
- 9,80 12,45 5,76 33,67 41,00 7,11
- 3018-9
- 9,32 14,09 5,71 22,46 49,20 8,54
- 3018-28
- 9,21 12,94 8,87 34,67 34,39 7,72
- 3018-12
- 9,21 15,40 5,47 24,61 43,40 11,11
- 3018-23
- 9,19 15,47 8,14 27,57 38,98 9,83
- 3018-24
- 9,06 14,64 7,51 27,12 41,56 9,17
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3018-5
- 8,97 14,06 5,23 26,34 45,06 9,31
- 3018-18
- 8,95 12,56 6,73 37,59 34,39 8,73
- 3018-3
- 8,27 12,99 6,84 34,06 38,34 7,77
- 3018-26
- 8,00 15,82 5,74 22,39 45,62 10,43
- 3018-21
- 5,99 13,63 8,88 34,58 34,47 8,44
- 3018-1
- 5,98 15,00 8,98 30,75 35,25 10,01
- 3018-10
- 5,72 14,11 7,29 36,00 35,14 7,46
- 3018-6
- 5,49 14,13 6,87 27,10 41,60 10,29
- 3018-14
- 4,49 14,47 6,75 36,34 34,50 7,93
- Med.
- 10,14 13,02 6,64 33,38 38,85 8,06
- Med5mejor.
- 15,10 10,95 6,39 39,49 37,19 5,98
- 3019-27
- 11,11 15,22 4,66 23,96 46,19 9,97
- 3019-23
- 10,06 12,24 5,28 27,99 43,63 10,86
- 3019-4
- 9,83 11,43 6,94 43,16 32,24 6,23
- 3019-7
- 9,77 11,22 6,15 37,45 37,56 7,62
- 3019-15
- 9,16 12,50 6,60 39,08 34,52 7,30
- 3019-20
- 8,67 16,44 5,12 19,31 46,64 12,49
- 3019-12
- 8,22 12,27 7,06 38,86 33,71 8,10
- 3019-17
- 8,07 16,60 5,47 26,70 40,57 10,66
- 3019-11
- 7,78 13,40 6,26 31,75 38,36 10,22
- 3019-24
- 7,76 13,56 5,79 34,04 37,79 8,82
- 3019-19
- 7,21 15,81 5,83 21,60 43,54 13,23
- 3019-6
- 7,07 12,94 6,45 33,73 37,02 9,86
- 3019-13
- 7,07 14,26 5,42 35,78 36,24 8,30
- 3019-3
- 6,94 13,72 5,57 39,86 33,47 7,39
- 3019-2
- 6,84 13,36 6,58 30,96 38,13 10,97
- 3019-10
- 6,80 14,81 6,49 26,45 41,18 11,07
- 3019-5
- 6,73 14,48 4,78 28,73 40,26 11,76
- 3019-30
- 6,52 13,40 6,23 36,19 35,51 8,67
- 3019-21
- 6,47 15,74 7,75 24,42 40,60 11,49
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3019-14
- 6,27 15,39 7,18 23,21 41,62 12,59
- 3019-1
- 5,93 15,61 7,27 23,55 41,13 12,44
- 3019-29
- 5,69 14,67 5,72 22,51 41,63 15,48
- 3019-18
- 5,54 14,58 4,85 36,76 35,78 8,04
- 3019-16
- 5,48 16,00 5,62 25,73 40,35 12,29
- 3019-22
- 4,63 16,81 6,03 20,42 43,23 13,51
- 3019-9
- 4,21 16,90 4,07 24,22 41,43 13,38
- 3019-8
- 3,87 16,96 5,46 20,23 40,10 17,23
- 3019-26
- 3,83 16,75 6,65 24,01 38,72 13,86
- 3019-28
- 3,44 16,98 5,19 21,93 42,09 13,81
- 3019-25
- 3,05 17,10 5,38 19,21 39,89 18,42
- Med.
- 6,80 14,71 5,93 28,73 39,44 11,20
- Med5mejor.
- 9,99 12,52 5,93 34,33 38,83 8,40
- 3020-4
- 18,24 11,66 5,14 42,44 35,63 5,13
- 3020-2
- 17,99 14,04 5,23 40,23 35,32 5,18
- 3020-16
- 15,32 14,60 4,66 32,03 41,59 7,12
- 3020-10
- 14,86 10,19 6,05 44,43 33,95 5,39
- 3020-28
- 14,26 10,64 6,90 41,20 36,44 4,81
- 3020-21
- 13,75 14,84 4,76 25,37 45,76 9,26
- 3020-11
- 13,00 11,26 6,37 35,10 39,89 7,39
- 3020-20
- 12,26 14,91 4,81 33,19 38,68 8,40
- 3020-24
- 12,06 13,49 4,95 39,62 34,81 7,13
- 3020-27
- 12,02 13,37 7,85 37,87 34,44 6,48
- 3020-14
- 11,70 13,88 5,89 42,81 31,65 5,78
- 3020-22
- 11,32 15,05 4,24 22,49 47,99 10,22
- 3020-30
- 11,08 14,99 5,43 26,34 43,96 9,28
- 3020-18
- 10,19 15,53 5,47 35,57 35,97 7,47
- 3020-23
- 9,71 12,39 6,38 45,44 29,30 6,49
- 3020-25
- 9,68 12,55 6,81 44,02 30,15 6,47
- 3020-1
- 9,37 12,21 6,23 39,89 34,65 7,02
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3020-26
- 8,60 12,44 6,36 38,32 34,56 8,31
- 3020-12
- 8,48 14,01 6,49 37,51 34,00 8,00
- 3020-3
- 8,29 12,29 6,92 33,60 38,01 9,18
- 3020-17
- 8,17 14,81 5,14 23,98 44,24 11,83
- 3020-6
- 7,46 12,93 7,35 40,18 31,90 7,64
- 3020-13
- 7,39 15,19 6,69 24,53 41,62 11,98
- 3020-19
- 7,34 15,34 6,88 24,47 40,59 12,72
- 3020-8
- 6,50 15,65 7,96 25,19 39,40 11,79
- 3020-7
- 6,15 17,20 6,39 29,08 37,37 9,96
- 3020-15
- 5,63 15,85 7,51 27,81 36,66 12,17
- 3020-9
- 5,34 14,05 6,54 43,17 27,99 8,25
- 3020-29
- 4,63 18,01 6,17 32,09 33,33 10,39
- 3020-5
- 3,67 15,71 7,21 28,74 34,84 13,49
- Med.
- 10,15 13,97 6,16 34,56 36,82 8,49
- Med5mejor.
- 16,13 12,23 5,60 40,07 36,59 5,53
En la tabla 11 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil medio de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos de cada experimento. En la tabla 11, el contenido medio de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido αlinolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 11 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr%) en comparación con el experimento de control, en donde la Med.Incr% se calcula como la Med.Aceite para ese experimento menos la Med.Aceite para el experimento de control dividido por la Med.Aceite para el experimento de control expresada como un porcentaje.
Tabla 11
- Resumen de la media del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- ESM
- Vector (gen) Med.Aceite Incr.% 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3017
- pKR1256 (n/a) 8,5 0% 14,3 6,9 28,0 41,0 9,8
- 3018
- pKR2082 (GmLec1) 10,1 19% 13,0 6,6 33,4 38,8 8,1
- 3019
- pKR2083 (GmFusca3-1) 6,8 –20% 14,7 5,9 28,7 39,4 11,2
- 3020
- pKR2084 (GmODP1) 10,1 19% 14,0 6,2 34,6 36,8 8,5
10 En la tabla 12 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil medio de ácidos grasos de los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto para cada experimento. En la tabla 12, la media de aceite para los 5 transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto se describe por un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite de los 5 mejores), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y 15 ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 12 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr% de los 5 mejores) en comparación con el
Tabla 13
- Resumen de genes, plásmidos y experimentos
- Experimento
- Plásmido Gen SEQ ID n.º
- nt
- aa
- ESM 3053
- pKR2114 ZmODP1 69 70
- ESM 3054
- pKR2121 ZmLec1 64 65
- ESM 3055
- pKR278 Control con el vector vacío - -
Aproximadamente 10-20 embriones madurados de cada uno de los aproximadamente 30 transformantes biolísticos por experimento de bombardeo se liofilizaron, se molieron, se les midió el contenido del aceite por RMN, y se les evaluó el perfil de ácidos grasos por análisis de FAME-GC exactamente como está descrito en la publicación de
5 solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 14 se muestran los resultados para el contenido de aceite y el perfil de ácidos grasos para cada transformante biolístico, así como la media de todos los transformantes biolísticos (Med.) y la media de los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto (Med5mejor.).
En la tabla 14, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En
10 la tabla 14, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% Aceite), y el contenido de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
Tabla 14
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan ZmLec1, ZmODP1 o control con el vector vacío
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3053-21
- 10,6 16,6 4,4 17,1 50,6 11,3
- 3053-1
- 9,8 17,0 4,8 18,0 48,8 11,4
- 3053-31
- 9,4 15,6 4,8 17,5 50,2 11,9
- 3053-25
- 9,2 16,1 4,8 20,6 47,3 11,3
- 3053-20
- 8,9 16,9 4,6 19,9 47,5 11,1
- 3053-7
- 8,6 16,4 4,4 19,6 45,9 13,6
- 3053-27
- 8,5 17,1 3,4 15,4 50,8 13,2
- 3053-18
- 8,3 15,6 5,6 17,1 49,2 12,5
- 3053-23
- 8,2 15,9 4,9 17,1 49,3 12,8
- 3053-11
- 8,1 16,8 5,1 21,1 44,9 12,1
- 3053-29
- 8,1 17,0 5,2 19,0 47,2 11,6
- 3053-12
- 8,0 16,6 6,1 21,5 43,2 12,5
- 3053-5
- 7,9 17,1 5,1 20,5 43,9 13,4
- 3053-2
- 7,8 15,8 3,8 16,9 49,8 13,7
- 3053-10
- 7,7 17,0 5,6 21,4 44,8 11,2
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan ZmLec1, ZmODP1 o control con el vector vacío
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3053-13
- 7,6 17,4 4,8 19,2 45,3 13,3
- 3053-3
- 7,4 15,7 6,1 19,5 46,6 12,2
- 3053-15
- 7,3 15,5 5,5 19,1 46,6 13,2
- 3053-6
- 6,8 16,5 5,2 20,5 44,0 13,7
- 3053-17
- 6,8 16,7 5,8 24,7 41,9 10,9
- 3053-4
- 6,7 17,7 4,7 16,1 47,7 13,7
- 3053-24
- 6,7 16,3 7,1 24,6 39,8 12,2
- 3053-26
- 6,7 16,4 5,9 16,6 45,9 15,2
- 3053-16
- 6,5 17,3 5,3 19,5 44,8 13,1
- 3053-19
- 6,5 17,8 5,2 20,9 43,3 12,8
- 3053-9
- 6,3 18,2 5,1 20,8 43,4 12,5
- 3053-28
- 6,2 16,6 5,8 17,9 45,2 14,5
- 3053-14
- 6,0 16,8 6,4 25,0 39,9 11,8
- 3053-8
- 6,0 17,4 5,6 18,7 44,9 13,5
- 3053-30
- 5,7 17,2 6,7 26,7 38,3 11,1
- 3053-22
- 3,7 17,0 5,4 19,2 44,0 14,5
- Med.
- 7,5 16,7 5,3 19,7 45,6 12,6
- Med5mejor.
- 9,6 16,4 4,7 18,6 48,9 11,4
- 3054-11
- 9,1 15,9 5,4 21,9 45,3 11,5
- 3054-6
- 8,6 16,7 5,1 19,0 47,5 11,8
- 3054-25
- 8,3 16,2 5,7 21,0 44,4 12,7
- 3054-26
- 8,2 17,0 5,1 22,1 43,5 12,3
- 3054-7
- 7,8 15,6 6,8 17,6 48,0 12,0
- 3054-27
- 7,8 16,5 5,0 21,1 44,3 13,1
- 3054-10
- 7,4 15,9 3,4 15,5 50,0 15,3
- 3054-16
- 7,2 15,3 5,9 19,1 47,4 12,3
- 3054-17
- 7,1 16,3 4,9 21,8 42,5 14,4
- 3054-21
- 7,0 16,1 6,2 19,9 45,0 12,7
- 3054-4
- 6,9 15,8 5,3 18,6 46,9 13,4
- 3054-28
- 6,4 15,8 5,4 20,2 44,7 13,8
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan ZmLec1, ZmODP1 o control con el vector vacío
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3054-19
- 6,4 16,1 5,8 18,1 45,9 14,1
- 3054-13
- 5,9 16,4 6,0 22,9 41,9 12,9
- 3054-9
- 5,7 16,2 5,1 18,3 46,4 14,0
- 3054-1
- 5,3 17,7 5,2 22,0 41,6 13,5
- 3054-24
- 5,1 16,2 5,7 21,6 42,7 13,8
- 3054-5
- 4,9 15,7 5,0 18,3 44,5 16,5
- 3054-14
- 4,9 15,5 5,2 25,7 39,2 14,4
- 3054-12
- 4,9 16,9 5,4 22,7 41,1 13,9
- 3054-22
- 4,5 16,6 6,5 32,2 33,4 11,3
- 3054-8
- 4,2 17,0 4,7 17,0 42,4 19,0
- 3054-23
- 4,2 18,3 5,3 21,8 40,4 14,1
- 3054-20
- 4,2 19,1 5,2 20,0 38,4 17,3
- 3054-18
- 4,1 15,8 7,7 26,9 38,9 10,7
- 3054-15
- 2,7 17,0 6,9 25,3 38,1 12,7
- 3054-2
- 2,6 17,7 6,5 26,6 36,5 12,8
- 3054-3
- 2,5 16,5 5,7 21,5 39,4 16,9
- Med.
- 5,9 16,5 5,6 21,4 42,9 13,7
- Med5mejor.
- 8,4 16,3 5,6 20,3 45,7 12,1
- 3055-29
- 6,4 16,3 6,9 17,3 46,2 13,3
- 3055-30
- 5,8 16,5 6,8 18,5 45,1 13,2
- 3055-3
- 5,7 16,2 7,6 17,8 44,5 13,8
- 3055-28
- 5,7 16,3 7,1 26,5 38,7 11,5
- 3055-12
- 5,5 17,0 5,9 17,1 45,3 14,7
- 3055-19
- 5,5 15,1 6,1 17,5 46,3 15,0
- 3055-15
- 5,3 17,2 7,1 18,0 43,4 14,3
- 3055-25
- 5,2 16,2 8,0 17,3 44,7 13,7
- 3055-13
- 5,2 16,5 7,3 16,7 45,1 14,5
- 3055-4
- 5,2 17,6 6,3 23,3 39,3 13,4
- 3055-20
- 4,7 16,9 6,0 16,8 44,5 15,8
- 3055-24
- 4,4 18,0 5,2 21,0 41,3 14,5
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan ZmLec1, ZmODP1 o control con el vector vacío
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3055-11
- 4,2 18,5 5,4 20,8 39,9 15,4
- 3055-17
- 4,1 17,8 5,7 23,8 37,5 15,2
- 3055-7
- 4,1 17,8 5,0 18,8 42,9 15,4
- 3055-16
- 3,9 18,1 6,7 21,4 39,1 14,7
- 3055-27
- 3,8 17,3 6,7 17,7 42,6 15,7
- 3055-21
- 3,7 19,1 4,7 19,4 39,7 17,1
- 3055-22
- 3,6 18,0 5,0 19,6 41,6 15,8
- 3055-23
- 3,6 18,6 4,5 17,7 39,5 19,6
- 3055-1
- 3,6 17,9 5,8 16,0 42,6 17,8
- 3055-8
- 3,5 17,6 5,4 19,3 40,8 16,9
- 3055-5
- 3,4 18,9 5,7 24,8 36,9 13,6
- 3055-2
- 3,3 17,9 3,5 16,4 43,1 19,0
- 3055-6
- 3,3 18,6 5,5 21,5 38,9 15,5
- 3055-9
- 3,0 19,1 4,3 16,4 40,4 19,9
- 3055-14
- 2,5 18,1 4,8 20,9 37,3 18,8
- 3055-18
- 2,4 18,2 4,3 16,0 39,9 21,6
- 3055-10
- 2,2 19,1 4,6 18,3 37,1 21,0
- 3055-26
- 2,1 18,7 5,0 21,2 38,3 16,8
- Med.
- 4,2 17,6 5,8 19,3 41,4 15,9
- Med5mejor.
- 5,8 16,5 6,9 19,4 43,9 13,3
En la tabla 15 se muestra un resumen que compra el contenido medio de aceite y el perfil medio de los ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos de cada experimento. En la tabla 15, el contenido medio de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido αlinolénico (18:3)] se describe como un porcentaje del peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 15 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr%) en comparación con el experimento de control, donde Med.Incr% se calcula como la Med.Aceite para ese experimento menos la Med.Aceite para el experimento de control dividida por la Med.Aceite para el experimento de control expresada como un porcentaje.
Tabla 15
- Resumen de la media del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos que expresan ZmLec1, ZmODP1 o control con el vector vacío
- ESM
- Vector (gen) Med.Aceite Med.Incr% 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3053
- pKR2114 (ZmODP1) 7,5 80% 16,7 5,3 19,7 45,6 12,6
- 3054
- pKR2121 (ZmLec1) 5,9 41% 16,5 5,6 21,4 42,9 13,7
- 3055
- pKR278 (Control) 4,2 0% 17,6 5,8 19,3 41,4 15,9
evaluó el perfil de ácidos grasos por análisis de FAME-GC exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 18 se muestran los resultados para el contenido de aceite y el perfil de ácidos grasos para cada transformante biolístico, así como la media de todos los transformantes biolísticos (Med.) y la media de los 5 mejores transformantes biolísticos que
5 tienen el contenido de aceite más alto (Med5mejor.).
En la tabla 18, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En la tabla 18, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% Aceite), y el contenido de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
10 Tabla 18
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con ZmLec1 o ZmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3006-28
- 15,46 12,83 5,81 34,01 40,95 6,41
- 3006-10
- 13,29 13,49 5,69 33,99 39,36 7,48
- 3006-19
- 13,12 13,84 4,51 27,42 44,84 9,38
- 3006-2
- 12,10 14,43 5,55 26,44 45,18 8,41
- 3006-3
- 11,99 13,03 5,65 32,35 40,09 8,88
- 3006-23
- 11,96 14,84 4,66 27,88 44,12 8,50
- 3006-24
- 11,49 13,02 7,30 33,49 38,56 7,64
- 3006-27
- 10,87 14,01 6,32 32,49 39,31 7,87
- 3006-1
- 10,85 13,82 6,53 31,04 40,49 8,12
- 3006-26
- 10,22 15,49 5,13 22,72 46,85 9,81
- 3006-20
- 10,19 15,49 4,65 21,58 47,28 11,01
- 3006-4
- 10,05 15,67 3,93 18,28 50,17 11,96
- 3006-25
- 10,04 14,35 7,08 27,96 41,52 9,09
- 3006-8
- 9,93 15,02 6,90 27,71 40,94 9,43
- 3006-6
- 9,51 17,52 4,38 17,94 48,66 11,51
- 3006-31
- 9,37 15,55 3,98 17,39 49,82 13,27
- 3006-7
- 9,27 16,20 5,90 23,30 43,50 11,10
- 3006-14
- 9,15 15,87 5,43 22,58 45,39 10,72
- 3006-21
- 8,75 15,23 5,32 20,46 47,62 11,38
- 3006-11
- 8,72 17,05 3,64 17,79 48,24 13,28
- 3006-15
- 8,65 13,41 8,25 39,07 32,68 6,60
- 3006-16
- 8,49 15,51 5,18 21,14 47,31 10,87
- 3006-30
- 8,48 14,77 6,08 23,92 44,56 10,66
- 3006-29
- 7,97 16,89 5,40 23,91 42,01 11,78
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con ZmLec1 o ZmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3006-18
- 7,43 15,84 5,42 21,80 45,40 11,55
- 3006-5
- 7,32 15,87 6,10 24,44 43,06 10,53
- 3006-12
- 6,59 17,85 6,26 27,20 38,06 10,62
- 3006-9
- 6,18 15,71 5,60 23,23 43,00 12,46
- 3006-17
- 6,14 15,66 6,81 24,98 41,52 11,03
- 3006-13
- 5,87 14,57 7,04 26,12 42,22 10,05
- 3006-22
- 3,13 15,44 7,76 28,15 37,39 11,26
- Med.
- 9,44 15,11 5,75 25,83 43,23 10,08
- Med5mejor.
- 13,19 13,52 5,44 30,84 42,08 8,11
- 3009-9
- 20,60 13,13 4,48 34,94 41,26 6,19
- 3009-8
- 17,21 13,31 6,15 30,24 43,29 7,01
- 3009-16
- 14,42 14,15 6,13 37,01 35,96 6,75
- 3009-6
- 14,40 11,74 5,79 33,69 42,37 6,41
- 3009-21
- 13,69 12,95 6,41 33,22 40,13 7,30
- 3009-3
- 12,99 13,56 7,47 30,41 40,69 7,88
- 3009-17
- 12,27 14,37 6,80 37,81 34,41 6,60
- 3009-13
- 11,12 13,78 8,03 37,56 33,72 6,91
- 3009-10
- 10,93 15,78 4,90 19,06 48,61 11,64
- 3009-28
- 10,85 14,55 4,65 19,63 49,88 11,29
- 3009-23
- 10,26 13,71 7,05 43,30 29,99 5,96
- 3009-26
- 9,92 15,60 5,79 27,33 41,87 9,40
- 3009-4
- 9,70 15,82 5,24 30,04 40,64 8,26
- 3009-29
- 9,49 14,37 6,20 25,89 43,74 9,79
- 3009-22
- 9,45 14,05 7,25 33,34 37,01 8,35
- 3009-18
- 9,39 14,78 5,41 22,88 46,23 10,70
- 3009-24
- 9,25 15,44 6,43 24,34 43,37 10,42
- 3009-5
- 9,18 14,95 4,74 20,21 48,01 12,10
- 3009-25
- 8,97 16,10 5,17 19,54 47,70 11,50
- 3009-7
- 8,86 15,62 5,05 18,50 49,05 11,77
- 3009-20
- 8,85 13,87 7,36 33,99 36,25 8,52
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con ZmLec1 o ZmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3009-1
- 8,19 15,06 5,35 21,07 45,91 12,61
- 3009-19
- 8,17 15,69 5,67 25,02 42,23 11,40
- 3009-2
- 8,02 15,11 4,98 20,67 46,58 12,66
- 3009-14
- 7,85 16,77 5,76 22,50 43,11 11,87
- 3009-31
- 7,61 14,88 6,38 26,16 42,38 10,21
- 3009-27
- 7,21 14,74 7,83 19,47 46,43 11,52
- 3009-30
- 7,14 15,23 6,04 23,66 44,16 10,90
- 3009-15
- 6,68 15,08 6,35 25,94 42,57 10,05
- 3009-11
- 6,55 16,25 5,89 25,36 40,89 11,61
- 3009-12
- 5,05 16,55 4,32 16,91 46,12 16,09
- Med.
- 10,14 14,74 5,97 27,09 42,41 9,80
- Med5mejor.
- 16,06 13,06 5,79 33,82 40,60 6,73
- 3010-18
- 16,30 12,38 4,54 30,86 44,74 7,48
- 3010-19
- 15,93 11,72 4,75 34,72 40,70 8,10
- 3010-2
- 15,70 12,48 4,09 32,28 42,54 8,61
- 3010-5
- 15,57 12,17 5,61 36,18 37,99 8,04
- 3010-30
- 15,40 12,66 4,52 33,89 41,29 7,64
- 3010-25
- 14,61 13,34 3,96 28,41 45,46 8,83
- 3010-3
- 13,94 12,74 5,10 31,91 40,89 9,36
- 3010-1
- 13,90 14,34 4,49 27,04 45,95 8,17
- 3010-17
- 13,68 13,09 5,03 29,39 42,66 9,83
- 3010-8
- 13,63 11,75 4,35 34,60 40,51 8,79
- 3010-26
- 13,55 13,37 4,79 34,23 38,78 8,83
- 3010-22
- 13,34 13,06 4,26 30,03 43,97 8,68
- 3010-14
- 13,34 12,48 4,51 34,89 39,12 9,00
- 3010-29
- 13,07 12,82 5,22 37,70 35,65 8,61
- 3010-13
- 12,65 12,55 4,52 31,75 41,68 9,50
- 3010-15
- 12,56 13,30 4,27 30,08 43,03 9,32
- 3010-16
- 11,56 12,03 4,99 35,16 38,47 9,35
- 3010-27
- 11,52 11,81 5,35 34,44 38,57 9,83
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con ZmLec1 o ZmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3010-9
- 11,26 13,73 3,97 23,11 48,56 10,63
- 3010-6
- 10,10 14,78 4,56 18,36 50,94 11,36
- 3010-4
- 9,97 15,52 4,40 20,60 47,99 11,49
- 3010-23
- 9,77 12,37 5,58 34,07 38,25 9,73
- 3010-24
- 9,49 14,30 3,96 17,14 51,54 13,07
- 3010-31
- 9,02 16,48 4,12 20,22 46,66 12,52
- 3010-21
- 8,57 15,25 4,48 25,46 43,10 11,71
- 3010-7
- 8,39 15,82 3,19 15,07 51,22 14,70
- 3010-28
- 8,01 16,07 3,92 17,45 49,89 12,67
- 3010-10
- 7,89 13,83 4,40 18,47 48,61 14,68
- 3010-11
- 7,60 18,93 3,83 18,45 44,69 14,10
- 3010-12
- 7,58 16,09 5,28 21,85 44,01 12,77
- 3010-20
- 6,35 13,92 5,13 17,60 49,14 14,20
- Med.
- 11,75 13,72 4,55 27,59 43,76 10,37
- Med5mejor.
- 15,78 12,28 4,70 33,59 41,45 7,98
En la tabla 19 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil medio de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos de cada experimento. En la tabla 19, el contenido medio de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido αlinolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 3 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr%) en comparación con el experimento de control, en donde la Med.Incr% se calcula como la Med.Aceite para ese experimento menos la Med.Aceite para el experimento de control dividido por la Med.Aceite para el experimento de control expresada como un porcentaje.
Tabla 19
- Resumen de la media del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos que expresan GmDGAT1cAll con ZmLec1 o ZmODP1
- ESM
- Vector (Gen2) Med.Aceite Med.Incr% 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3006
- pKR1520 (n/a) 9,4 0% 15,1 5,8 25,8 43,2 10,1
- 3009
- pKR2122 (ZmODP1) 10,1 7% 14,7 6,0 27,1 42,4 9,8
- 3010
- pKR2123 (ZmLec1) 11,8 25% 13,7 4,6 27,6 43,8 10,4
10 En la tabla 20 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil de ácidos grasos de los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto para cada experimento. En la tabla 20, la media de aceite para los 5 transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto se describe como un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite de los 5 mejores), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido α
15 linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 4 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr% de los 5 mejores) en comparación con el experimento de control, en donde la Med.Incr% se calcula como la Med.Aceite para ese experimento menos la Med.Aceite para el experimento de control dividido por la Med.Aceite para el experimento de control expresada como un porcentaje.
Tabla 22
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con ZmLec1 o ZmODP1
- Transf. biol.
- % Aceite 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3073-30
- 9,2 13,5 5,6 30,6 40,0 10,3
- 3073-28
- 7,8 17,0 3,7 18,8 45,8 14,8
- 3073-14
- 7,6 13,4 6,1 33,1 36,5 11,0
- 3073-15
- 6,9 16,0 5,7 22,3 42,1 13,9
- 3073-20
- 6,7 16,0 6,0 24,0 40,8 13,2
- 3073-1
- 6,6 14,2 6,5 32,6 36,1 10,6
- 3073-11
- 6,5 17,5 4,7 17,9 44,3 15,6
- 3073-10
- 6,4 14,1 6,6 27,9 38,3 13,1
- 3073-7
- 6,3 17,0 4,5 20,9 41,5 16,1
- 3073-24
- 6,2 14,7 6,1 28,7 38,0 12,5
- 3073-18
- 6,2 17,1 5,4 20,1 43,2 14,2
- 3073-29
- 6,1 17,3 5,3 20,4 41,0 16,0
- 3073-22
- 6,0 14,5 5,4 27,1 39,4 13,5
- 3073-5
- 6,0 14,1 5,2 18,1 45,0 17,6
- 3073-3
- 5,7 18,6 5,3 24,1 38,6 13,4
- 3073-2
- 5,7 16,5 5,5 21,5 41,3 15,1
- 3073-23
- 5,5 16,3 4,7 19,7 43,6 15,8
- 3073-6
- 5,5 17,1 6,0 24,7 38,9 13,4
- 3073-8
- 5,4 17,3 5,0 20,1 41,7 15,9
- 3073-17
- 5,3 15,4 5,2 22,3 43,6 13,4
- 3073-13
- 5,1 14,9 7,0 29,9 36,7 11,5
- 3073-16
- 4,6 16,8 6,4 24,7 38,1 14,0
- 3073-25
- 4,5 16,4 5,7 22,9 39,6 15,5
- 3073-4
- 4,4 15,7 5,1 29,8 35,6 13,8
- 3073-27
- 4,3 15,3 5,9 22,0 38,2 18,6
- 3073-19
- 4,3 16,6 6,5 23,5 38,9 14,5
- 3073-21
- 3,9 16,9 5,1 21,2 39,4 17,4
- 3073-26
- 3,8 17,1 4,7 18,8 39,5 19,8
- 3073-12
- 3,6 16,2 4,5 18,3 42,6 18,4
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con ZmLec1 o ZmODP1
- Transf. biol.
- % Aceite 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3073-9
- 3,0 17,5 4,9 21,4 38,6 17,6
- Med.
- 5,6 16,0 5,5 23,6 40,2 14,7
- Med5mejor.
- 7,6 15,2 5,4 25,7 41,0 12,6
- 3076-4
- 18,8 11,3 4,4 34,3 43,9 6,1
- 3076-2
- 15,4 12,3 6,7 34,0 40,5 6,5
- 3076-15
- 13,2 11,1 6,3 38,9 37,5 6,2
- 3076-12
- 12,1 11,2 7,6 32,5 41,3 7,4
- 3076-28
- 11,7 12,2 7,0 29,9 42,3 8,6
- 3076-5
- 11,4 13,4 6,9 29,0 41,6 9,0
- 3076-3
- 11,2 11,2 9,2 30,4 41,5 7,7
- 3076-13
- 11,0 11,7 5,3 33,7 41,4 7,9
- 3076-9
- 11,0 12,4 7,9 26,5 44,0 9,2
- 3076-26
- 10,5 13,9 5,3 38,1 36,0 6,8
- 3076-29
- 10,5 13,7 7,6 30,7 39,6 8,3
- 3076-10
- 10,2 14,1 6,0 29,8 41,2 9,0
- 3076-25
- 10,1 12,1 7,2 34,6 37,5 8,5
- 3076-27
- 9,2 13,7 6,1 34,0 39,3 7,0
- 3076-18
- 8,9 14,4 7,2 22,4 44,4 11,7
- 3076-24
- 8,9 13,7 7,8 26,8 42,1 9,7
- 3076-22
- 8,8 12,7 7,2 27,3 42,3 10,5
- 3076-8
- 8,8 14,1 7,0 26,1 41,6 11,1
- 3076-23
- 8,7 14,0 4,5 31,4 40,1 10,0
- 3076-11
- 8,3 15,1 6,6 17,9 47,5 13,0
- 3076-31
- 8,3 15,1 6,6 21,3 44,2 12,8
- 3076-21
- 8,1 13,4 6,6 32,2 39,9 7,9
- 3076-1
- 7,8 13,5 7,6 30,2 39,2 9,5
- 3076-17
- 7,7 15,5 4,8 17,9 47,4 14,4
- 3076-20
- 7,1 15,8 5,5 16,3 47,0 15,4
- 3076-16
- 6,8 14,9 5,6 23,8 43,2 12,4
- 3076-7
- 6,7 14,6 7,2 24,9 41,5 11,8
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con ZmLec1 o ZmODP1
- Transf. biol.
- % Aceite 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3076-14
- 6,2 15,8 5,4 19,1 45,3 14,5
- 3076-6
- 6,1 15,8 7,3 20,6 43,6 12,7
- 3076-19
- 4,6 15,9 6,0 20,4 44,1 13,5
- 3076-30
- 3,5 16,0 6,2 21,1 43,7 13,1
- Med.
- 9,4 13,7 6,5 27,6 42,1 10,1
- Med5mejor.
- 14,2 11,6 6,4 33,9 41,1 7,0
- 3076-16
- 15,5 11,5 6,7 35,0 39,4 7,3
- 3076-10
- 13,9 11,9 6,6 33,8 40,4 7,2
- 3076-21
- 12,6 10,2 8,2 41,9 33,0 6,7
- 3076-3
- 12,0 10,2 7,0 42,9 33,1 6,7
- 3076-23
- 11,5 11,7 8,0 37,1 36,9 6,2
- 3076-12
- 11,4 12,3 6,5 32,8 39,3 9,0
- 3076-26
- 10,9 12,2 5,6 30,5 42,0 9,7
- 3076-27
- 10,9 13,6 6,0 28,9 41,5 9,9
- 3076-22
- 10,7 11,8 6,4 38,3 35,3 8,2
- 3076-24
- 10,7 12,8 6,6 31,8 39,1 9,7
- 3076-5
- 10,4 11,0 4,1 37,1 40,6 7,2
- 3076-9
- 10,3 15,2 5,7 21,6 46,5 10,9
- 3076-17
- 10,0 13,3 6,8 34,7 36,8 8,5
- 3076-6
- 9,7 10,9 7,6 44,8 30,5 6,2
- 3076-13
- 9,6 15,1 5,8 20,8 47,5 10,8
- 3076-4
- 9,2 14,6 8,0 26,1 42,0 9,3
- 3076-15
- 8,9 13,7 4,6 33,1 36,7 12,0
- 3076-20
- 8,1 14,8 6,0 27,2 39,7 12,3
- 3076-11
- 7,5 12,7 6,3 36,7 35,1 9,2
- 3077-1
- 6,8 15,3 6,0 28,5 38,6 11,5
- 3076-25
- 6,7 15,8 5,2 22,8 43,0 13,3
- 3076-8
- 6,5 15,9 6,1 21,6 45,0 11,4
- 3076-7
- 5,3 17,1 7,4 28,9 36,6 10,1
- 3076-19
- 4,4 15,0 4,0 17,9 48,6 14,5
truncatula MTSusPro
El fragmento NotI de KS334, que contiene GmODP1, se clonó en el sitio NotI de pKR2457 (SEQ ID n.º 87) para producir el pKR2461 (SEQ ID n.º 88). De este modo, la GmODP1 se pudo expresar detrás del promotor de la sacarosa sintasa de Medicago truncatula (MTSusPro).
5 El plásmido pKR278, previamente descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935, y que no contiene ningún factor de transcripción, se utilizó como un control negativo.
El ADN de los plásmidos pKR2461 (SEQ ID n.º 88) y pKR278 se preparó para el bombardeo de partículas en el cultivo con la suspensión embriogénica de soja y se transformó exactamente como está descrito previamente en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. Se inició el cultivo con la
10 suspensión embriogénica de soja, se le hizo crecer, se mantuvo y fue bombardeado, y los transformantes biolísticos se seleccionaron y se hicieron madurar en el medio SHaM también exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 25 se muestra un resumen de los genes, los plásmidos y los números de experimento del sistema modelo (ESM).
Tabla 25
- Resumen de genes, plásmidos y experimentos
- Experimento
- Plásmido Gen SEQ ID n.º
- nt
- aa
- ESM 3405
- pKR2461 GmODP1 29 30
- ESM 3408
- pKR278 Control con el vector vacío - -
15 Se liofilizaron aproximadamente 10-20 embriones maduros de cada uno de los aproximadamente 30 transformantes biolísticos por experimento de bombardeo, se molieron, se les midió el contenido de aceite por RMN, y se les evaluó el perfil de ácidos grasos mediante análisis de FAME-GC exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 26 se muestran los resultados para el contenido de aceite y el perfil de ácidos grasos para cada transformante biolístico, así como la
20 media de todos los transformantes biolísticos (Med.) y la media para los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto (Med5mejor.).
En la tabla 26, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En la tabla 26, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% Aceite), y el contenido de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido
25 linoleico (18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
Tabla 26
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmODP1 o el control con el vector vacío
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3405-6
- 8,75 16,15 4,56 19,73 47,20 12,35
- 3405-8
- 8,42 16,90 4,13 17,50 47,66 13,81
- 3405-28
- 7,82 14,81 4,74 17,99 48,88 13,57
- 3405-22
- 7,51 18,94 4,47 15,69 48,33 12,57
- 3405-10
- 7,45 15,90 6,32 23,41 42,44 11,94
- 3405-26
- 7,21 15,84 4,56 22,97 43,57 13,06
- 3405-18
- 7,20 14,51 6,66 21,47 44,01 13,35
- 3405-16
- 7,13 15,65 6,57 26,47 38,88 12,44
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan GmODP1 o el control con el vector vacío
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3405-17
- 7,03 13,38 5,55 27,10 42,71 11,25
- 3405-30
- 7,03 14,99 5,89 23,63 42,16 13,33
- 3405-23
- 7,00 16,99 6,17 25,64 39,15 12,05
- 3405-25
- 6,98 15,91 6,33 23,96 40,73 13,06
- 3405-15
- 6,71 16,58 4,53 19,49 44,44 14,96
- 3405-9
- 6,46 15,62 6,43 25,38 39,38 13,19
- 3405-5
- 6,33 15,53 6,65 26,24 37,94 13,64
- 3405-3
- 6,11 15,99 6,55 24,56 40,56 12,35
- 3405-12
- 6,03 16,60 6,28 21,03 42,76 13,32
- 3405-4
- 5,96 16,88 5,00 20,83 45,03 12,27
- 3405-14
- 5,39 17,58 5,60 23,24 38,95 14,64
- 3405-1
- 5,27 15,57 5,81 24,92 42,12 11,58
- 3405-29
- 5,13 15,38 6,49 29,95 36,53 11,65
- 3405-11
- 4,82 15,71 6,72 26,72 37,89 12,96
- 3405-13
- 4,46 16,99 4,21 14,27 46,23 18,30
- 3405-27
- 4,39 17,63 4,01 16,00 44,45 17,91
- 3405-2
- 4,26 17,24 5,13 18,15 43,89 15,59
- 3405-19
- 4,02 16,78 4,03 17,55 41,47 20,17
- 3405-7
- 3,80 17,47 5,41 19,24 39,73 18,15
- 3405-20
- 3,40 16,52 5,91 23,70 37,76 16,12
- 3405-21
- 3,17 15,01 5,54 19,70 42,96 16,79
- 3405-24
- 3,05 16,87 5,46 21,12 40,50 16,05
- Med.
- 5,94 16,20 5,52 21,92 42,28 14,08
- Mejores5
- 7,99 16,54 4,85 18,87 46,90 12,85
- 3408-3
- 8,19 15,10 6,50 25,26 40,59 12,56
- 3408-6
- 6,36 15,50 5,91 22,56 43,40 12,62
- 3408-4
- 4,84 16,08 8,02 33,94 30,43 11,53
- 3408-2
- 4,61 16,26 5,09 15,84 44,05 18,76
- 3408-9
- 4,39 18,15 4,52 21,48 38,24 17,63
- 3408-7
- 4,23 16,44 6,11 26,28 34,96 16,22
suspensión embriogénica de soja y se transformó exactamente como está descrito previamente en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. Se inició el cultivo con la suspensión embriogénica de soja, se le hizo crecer, se mantuvo y fue bombardeado, y los transformantes biolísticos se seleccionaron y se hicieron madurar en el medio SHaM también exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 29 se muestra un resumen de los genes, los plásmidos y los números de experimento del sistema modelo.
Tabla 29
- Resumen de genes, plásmidos y experimentos
- Experimento
- Plásmido Gen11,2 Gen2 Gen2 SEQ ID n.º
- nt
- aa
- 3013
- pKR1256 YLDGAT2 - - -
- 3410
- pKR2465 YLDGAT2 GmODP 29 30
- 1Secuencia de nucleótidos del gen1 de SEQ ID n.º 59 2Secuencia de aminoácidos del gen1 de SEQ ID n.º 60
Se liofilizaron aproximadamente 10-20 embriones madurados de cada uno de los aproximadamente 30 transformantes biolísticos por experimento de bombardeo, se molieron, el contenido de aceite se midió por RMN y el
10 perfil de ácidos grasos se evaluó mediante análisis de FAME-GC exactamente como está descrito en la publicación de solicitud de patente internacional en el marco del PCT n.º WO 2008/147935. En la tabla 30 se muestran los resultados para el contenido de aceite y el perfil de ácidos grasos para cada transformante biolístico, así como la media de todos los transformantes biolísticos (Med.) y la media de los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto (Med5mejor.).
15 En la tabla 30, los resultados están ordenados en función del contenido de aceite, desde el más alto al más bajo. En la tabla 30, el contenido de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (% Aceite), y el contenido de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales.
Tabla 30
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3410-13
- 12,84 14,00 7,52 38,62 33,00 6,86
- 3410-14
- 12,65 13,74 7,78 39,15 32,53 6,79
- 3410-10
- 10,91 12,35 7,43 39,29 33,65 7,28
- 3410-7
- 9,54 12,20 6,76 43,82 30,17 7,05
- 3410-12
- 9,24 13,10 6,50 31,48 38,65 10,27
- 3410-2
- 8,13 15,47 7,18 25,92 40,37 11,06
- 3410-1
- 7,71 15,31 7,93 26,95 38,07 11,74
- 3410-18
- 7,33 15,77 7,72 24,84 38,95 12,72
- 3410-20
- 7,21 15,86 6,26 24,01 40,70 13,17
- 3410-11
- 6,69 15,83 6,90 24,91 39,65 12,71
- 3410-22
- 6,00 19,18 7,02 21,20 38,22 14,38
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3410-9
- 5,81 17,73 4,70 16,30 42,22 19,05
- 3410-3
- 5,60 16,69 6,26 22,27 38,26 16,51
- 3410-24
- 5,33 16,38 5,35 25,80 38,16 14,30
- 3410-6
- 5,21 12,97 6,87 31,30 37,10 11,77
- 3410-21
- 5,12 16,93 7,01 21,80 35,00 19,27
- 3410-8
- 5,04 15,87 6,20 24,22 39,68 14,03
- 3410-17
- 5,03 18,12 5,35 21,09 40,85 14,59
- 3410-16
- 4,96 15,07 6,42 23,73 38,66 16,12
- 3410-23
- 4,43 17,11 5,88 21,63 38,75 16,63
- 3410-4
- 3,46 17,68 5,71 17,57 42,30 16,72
- 3410-19
- 3,42 17,88 5,24 19,63 40,96 16,29
- 3410-15
- 3,39 15,10 4,93 18,06 40,91 21,00
- 3410-5
- 2,70 16,45 5,58 19,40 37,47 21,10
- Med.
- 6,57 15,70 6,44 25,96 38,10 13,81
- Med5mejor.
- 11,04 13,08 7,20 38,47 33,60 7,65
- 3413-17
- 9,79 12,44 4,66 37,55 35,95 9,40
- 3413-28
- 9,55 14,97 5,89 21,69 46,18 11,27
- 3413-29
- 9,00 13,79 5,32 33,06 37,80 10,03
- 3413-6
- 8,59 13,37 4,79 31,02 38,32 12,51
- 3413-27
- 7,50 14,37 7,30 30,67 36,18 11,47
- 3413-12
- 7,46 12,90 6,09 34,45 35,44 11,12
- 3413-13
- 7,03 13,39 6,70 29,70 36,93 13,28
- 3413-25
- 6,77 17,27 6,84 23,25 40,01 12,62
- 3413-26
- 6,76 16,17 4,52 23,89 39,80 15,62
- 3413-24
- 6,70 16,57 4,20 22,35 42,27 14,61
- 3413-19
- 6,33 15,79 6,91 26,12 38,09 13,09
- 3413-21
- 5,99 18,60 5,10 20,36 40,78 15,15
- 3413-9
- 5,71 14,86 3,99 24,64 39,24 17,28
- 3413-23
- 5,54 16,32 4,11 20,13 41,63 17,81
- 3413-2
- 5,39 15,11 4,09 24,74 39,50 16,56
- Resumen del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmODP1
- % Aceite
- 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3413-20
- 5,26 16,83 4,30 21,17 40,63 17,06
- 3413-11
- 5,23 15,29 5,65 26,43 37,27 15,35
- 3413-14
- 5,11 16,70 4,60 22,63 38,10 17,97
- 3413-18
- 4,61 16,73 3,82 18,75 41,48 19,21
- 3413-16
- 4,18 16,62 3,71 20,39 37,95 21,32
- 3413-15
- 4,12 16,87 4,46 19,87 41,60 17,20
- 3413-22
- 3,57 17,47 3,58 15,47 41,65 21,83
- 3413-5
- 3,56 16,90 3,88 17,62 39,90 21,71
- 3413-3
- 3,24 16,90 4,34 17,33 41,69 19,73
- 3413-7
- 2,97 16,31 5,25 18,53 37,52 22,39
- 3413-10
- 2,96 17,36 3,86 14,13 41,16 23,49
- 3413-8
- 2,93 16,62 5,51 23,68 39,11 15,09
- 3413-4
- 2,88 18,11 3,68 14,51 41,08 22,62
- 3413-1
- 2,28 16,97 5,10 20,71 38,28 18,94
- Med.
- 5,55 15,92 4,91 23,27 39,50 16,41
- Med5mejor.
- 8,89 13,79 5,59 30,80 38,89 10,93
En la tabla 31 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil medio de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos de cada experimento. En la tabla 31, el contenido medio de aceite se describe como un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2) y ácido αlinolénico (18:3)] se describe como un porcentaje en peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 31 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr%) en comparación con el experimento de control, en donde la Med.Incr% se calcula como la Med.Aceite para ese experimento menos la Med.Aceite para el experimento de control dividido por la Med.Aceite para el experimento de control expresada como un porcentaje.
Tabla 31
- Resumen de la media del contenido de aceite y de los perfiles de ácidos grasos para todos los transformantes biolísticos que expresan YLDGAT2 con GmODP1
- ESM
- Vector (gen) Med.Aceite Med.Incr% 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3
- 3413
- pKR1256 (n/a) 5,55 0% 15,70 6,44 25,96 38,10 13,81
- 3410
- pKR2465 (GmODP1) 6,57 18% 14,0 6,2 34,6 36,8 8,5
10 En la tabla 32 se muestra un resumen que compara el contenido medio de aceite y el perfil medio de ácidos grasos de los 5 mejores transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto para cada experimento. En la tabla 32, la media de aceite para los 5 transformantes biolísticos que tienen el contenido de aceite más alto se describe como un porcentaje del peso seco total (Med.Aceite de los 5 mejores), y el contenido medio de ácidos grasos para cada ácido graso [ácido palmítico (16:0), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2)
15 y ácido α-linolénico (18:3)] se describe como un porcentaje del peso de los ácidos grasos totales. En la tabla 12 también se muestra el cambio del contenido de aceite (Med.Incr% de los 5 mejores) en comparación con el experimento de control, en donde la Med.Incr% se calcula como la Med.Aceite para ese experimento menos la Med.Aceite para el experimento de control dividido por la Med.Aceite para el experimento de control expresada
expresión del miARNa precursor 396b-fad2-1b/159-fad2-2, se consideraron transgénicas. Las que tenían aproximadamente menos del 30% del contenido de ácido oleico se consideraron semillas null.
A cada transformante biolístico se le determinó el contenido medio de aceite de todas las semillas transgénicas y todas las semillas null. A continuación, el contenido medio de aceite de la semilla null se sustrajo del contenido
5 medio de aceite de la semilla transgénica, y la diferencia se describe en la tabla 35 (Med.Aceite∆%). La diferencia del contenido medio de proteínas entre la semilla transgénica y la null se determinó de igual forma, y se muestra en la tabla 35 (Med.Pro∆%). La suma de la Med.Aceite∆% y la Med.Pro∆% (Med.Proceite∆%) se muestra también en la tabla 35. Para un número representativo de transformantes biolísticos de cada construcción, se germinaron al menos 24 semillas en el suelo y la tasa de germinación se determinó 10 días después de haberlas plantado.
10 En la tabla 35 también se muestran el nombre del experimento (Exp.), el gen que se expresa (Gen) y el nombre del transformante biolístico (Transf. biolíst.).
Tabla 35
- Resumen de la diferencia del contenido medio de aceite y proteínas entre la semilla T1 transgénica y la null para los transformantes biolísticos de soja que expresan GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- Exp.
- Gen Transf. biolíst. Med.Aceite∆% Med.Pro∆% Med.Proceite∆% Germinación%
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.10.3 1,3 2 3,3 78
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.4.1 1,2 1,5 2,7 71
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.1.2 1 1,6 2,6 49
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.6.3 1 1,5 2,5 20
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.3.2 0,7 1,7 2,5
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.4.3 1 1,3 2,3 57
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.8.1 –0,5 2,7 2,2
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.1.2 0,5 1,5 2 49
- Aceite 108
- GmFusca3-1 8798.9.4 0,3 0,2 0,5
- Aceite 109
- GmODP1 8810.5.1 1,9 2,4 4,3 99
- Aceite 109
- GmODP1 8787.3.3 1,2 1,9 3,1 95
- Aceite 109
- GmODP1 8787.12.2 0,4 2,4 2,8 90
- Aceite 109
- GmODP1 8787.10.1 1,4 0,9 2,2 87
- Aceite 109
- GmODP1 8787.4.1 0,7 1,4 2
- Aceite 109
- GmODP1 8787.8.4 1,1 0,8 1,9
- Aceite 109
- GmODP1 8787.10.5 –0,2 1,8 1,7
- Aceite 109
- GmODP1 8787.7.3 1,3 0,4 1,7 79
- Aceite 109
- GmODP1 8787.3.2 0,3 0,8 1,1
- Aceite 109
- GmODP1 8787.1.1 –0,2 1 0,8 85
- Aceite 109
- GmODP1 8787.6.4 0,2 0,4 0,7
- Aceite 109
- GmODP1 8787.12.3 1,7 –1 0,6 95
- Resumen de la diferencia del contenido medio de aceite y proteínas entre la semilla T1 transgénica y la null para los transformantes biolísticos de soja que expresan GmLec1, GmFusca3-1 o GmODP1
- Exp.
- Gen Transf. biolíst. Med.Aceite∆% Med.Pro∆% Med.Proceite∆% Germinación%
- Aceite 109
- GmODP1 8787.11.4 0 0,5 0,5 94
- Aceite 109
- GmODP1 8787.6.3 –1,5 0,5 –1 83
- Aceite 110
- GmLec1 8781.6.1 1 2 2,9 33
- Aceite 110
- GmLec1 8781.2.2 0,9 1,8 2,8 91
- Aceite 110
- GmLec1 8781.2.3 1,2 1,5 2,8 81
- Aceite 110
- GmLec1 8781.10.5 0,9 1,9 2,8 81
- Aceite 110
- GmLec1 8781.3.6 0,8 1,5 2,3 32
- Aceite 110
- GmLec1 8781.12.2 0,7 1,3 2 69
- Aceite 110
- GmLec1 8781.11.1 0,3 0,5 0,7
En la tabla 35 se demuestra que el contenido medio de aceite y proteínas se incrementa cuando GmFusca3-1, GmODP1 o GmLec1 están sobreexpresadas en la soja bajo el control del promotor de GmSus cuando se compara con la media de la semilla null. Se incrementan el aceite y las proteínas hasta 2,9 a 4,3 puntos en estos transformantes biolísticos. En la tabla 35 también se demuestra que la frecuencia de germinación de las semillas T1
5 de los transformantes biolísticos con un incremento significativo de proteína y aceite debido a la expresión de los factores de transcripción ODP1, LEC1 y Fusca3 puede llegar a ser del 99%, 91% y 78%, respectivamente.
Se plantaron las semillas T1 de los transformantes biolísticos que se segregan como copia única (fenotipo altoleico:Null = 3:1), las plantas se hicieron crecer exactamente como las plantas T0 y se obtuvieron las semillas T2. A las semillas T2 de estos transformantes biolísticos se les analizó el contenido de ácido oleico, aceite y proteínas 10 exactamente como está descrito en la presente memoria y en la tabla 36 se muestran los resultados para el Aceite
109.
Para cada transformante biolístico, se determinó el contenido medio de aceite de todas las semillas T2 homocigotas transgénicas y de todas las semillas null. El contenido medio de aceite de la semilla null se sustrajo entonces del contenido medio de aceite de la semilla transgénica T2 homocigota y la diferencia se describe en la tabla 36
15 (Med.Aceite∆%). La diferencia del contenido medio de proteínas entre la semilla transgénica homocigota T2 y la semilla null se determinó de igual forma y se muestra en la tabla 36 (Med.Pro∆%). La suma de la Med.Aceite∆% y la Med.Pro∆% (Med.Proceite∆%) también se muestra en la tabla 36.
Tabla 36
- Resumen de la diferencia del contenido medio de aceite y de proteína entre la semilla T2 null y transgénica homocigota para los transformantes biolísticos de soja que expresan GmODP1
- Exp.
- Gen Transf. biolístico Med.Aceite∆% Med.Pro∆% Med.Proceite∆%
- Aceite 109
- GmODP1 8787.10.1 1,8 2,8 4,7
- Aceite 109
- GmODP1 8787.7.3 1,3 2,9 4,2
- Aceite 109
- GmODP1 8810.5.1 1,5 1,5 3,0
En la tabla 36 se muestra que el contenido medio de aceite y de proteína se incrementa cuando la GmODP1 está
20 sobreexpresada en la soja bajo el control del promotor de GmSus cuando se compara con la media de la semilla null. La proteína y el aceite llegan a incrementarse hasta 3,0 a 4,7 puntos en estos transformantes biolísticos con una única copia.
Ejemplo 14
Identificación de los promotores específicos de semilla para impulsar la expresión de los factores de transcripción en
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