ES2625439T3 - Composiciones y métodos para la biosíntesis de 1,4-butanodiol y sus precursores - Google Patents

Composiciones y métodos para la biosíntesis de 1,4-butanodiol y sus precursores Download PDF

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Abstract

Organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene rutas biosintéticas de ácido 4- hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (1,4-BDO), comprendiendo dichas rutas ácidos nucleicos exógenos que codifican para a) una α-cetoglutarato deshidrogenasa, b) una semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, c) una 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, d) una 4-hidroxibutiril- CoA:acetil-CoA transferasa, o una butirato cinasa y una fosfotransbutirilasa, y e) una aldehído deshidrogenasa y una alcohol deshidrogenasa, o una aldehído/alcohol deshidrogenasa, en el que dichos ácidos nucleicos exógenos se expresan en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (1,4-BDO).

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y metodos para la biosmtesis de 1,4-butanodiol y sus precursores Antecedentes de la invencion
Esta invencion se refiere de manera general al diseno in silico de organismos y, mas particularmente a organismos que tienen capacidad de biosmtesis de 1,4-butanodiol.
El compuesto acido 4-hidroxibutanoico (4-hidroxibutanoato, 4-hidroxibutirato, 4-HB) es un acido carbox^lico de 4 carbonos que tiene potencial industrial como elemento estructural para diversos productos qmmicos de materia prima y especializados. En particular, 4-HB tiene potencial para servir como nuevo punto de entrada en la familia de productos qmmicos de 1,4-butanodiol, que incluye disolventes, resinas, precursores de poftmeros y productos qmmicos especializados. El 1,4-butanodiol (BDO) es un producto intermedio de poftmeros y disolvente industrial con un mercado global de aproximadamente 3 billones de lb/ano. BDO se produce actualmente a partir de precursores petroqmmicos, principalmente acetileno, anhftdrido maleico y oxido de propileno.
Por ejemplo, se hace reaccionar acetileno con 2 moleculas de formaldehftdo en la reaccion de smtesis de Reppe (Kroschwitz y Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York (1999)), seguido por hidrogenacion catalftica para formar 1,4-butanodiol. Se ha estimado que el 90% del acetileno producido en los EE.UU. se consume para la produccion de butanodiol. Alternativamente, puede formarse mediante esterificacion e hidrogenacion catalftica de antndrido maleico, que se deriva de butano. Posteriormente, puede transformarse adicionalmente el butanodiol; por ejemplo, mediante oxidacion para dar y-butirolactona, que puede convertirse adicionalmente en pirrolidona y N-metil-pirrolidona, o hidrogenolisis para dar tetrahidrofurano (figura 1). Estos compuestos tienen diversos usos como productos intermedios de poftmeros, disolventes y aditivos, y tienen un mercado combinado de casi 2 billones de lb/ano.
Resulta deseable desarrollar un metodo para la produccion de estos productos qmmicos mediante medios alternativos que no solo sustituyan materias primas basadas en petroleo por renovables, y que tambien usen procedimientos que requieran menos energfa y capital. El Departamento de Energfa ha propuesto 1,4-diacidos, y particularmente acido succmico, como productos intermedios clave producidos de manera biologica para la fabricacion de la familia de productos de butanodiol (Informe del DOE, “Top Value-Added Chemicals from Biomass”, 2004). Sin embargo, el acido succmico es costoso de aislar y purificar y requiere altas temperaturas y presiones para su reduccion catalftica para dar butanodiol.
El documento KR 20070096348 divulga la produccion de 1,4-BDO, transformado a partir de 4-HB, en un microorganismo recombinante que expresa enzimas heterologas.
Por tanto, existe una necesidad de medios alternativos para producir eficazmente cantidades comerciales de 1,4- butanodiol y sus precursores qmmicos. La presente invencion satisface esta necesidad y tambien proporciona ventajas relacionadas.
Sumario de la invencion
La invencion se define por el contenido de las reivindicaciones.
La descripcion proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que tiene al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehftdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico (4-HB). Tambien se proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), las rutas incluyen al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, aldehftdo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehftdo/alcohol deshidrogenasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (BDO). Adicionalmente, se proporciona un metodo para la produccion de 4-HB. El metodo incluye cultivar un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que incluye al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4- hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico (4-HB). Ademas, se proporciona un metodo para la produccion de BDO. El metodo incluye cultivar un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural, que comprende un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4- butanodiol (BDO), incluyendo las rutas al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato
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deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4- hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-hidroxibutirato cinasa, fosfotranshidroxibutirilasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehndo/alcohol deshidrogenasa durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO). Los productos 4-HB y/o BDO pueden secretarse al medio de cultivo.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquematico que muestra un punto de entrada de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) en la lmea de productos de la familia de productos qmmicos de 1,4-butanodiol (BDO), y la comparacion con rutas de smtesis qmmica a partir de materias primas petroqmmicas. Las flechas negras continuas muestran rutas de smtesis qmmica; las flechas azules discontinuas muestran una ruta biosintetica para dar 4-HB y posteriores etapas de conversion para dar productos qmmicos de la familia de BDO.
La figura 2 es un diagrama esquematico que muestra rutas bioqmmicas para dar 4-hidroxibutirato (4-HB) y para la produccion de 1,4-butanodiol. Las primeras 5 etapas son endogenas para E. coli, mientras que el resto pueden expresarse de manera heterologa. Las enzimas que catalizan las reacciones biosinteticas son: (1) succinil-CoA sintetasa; (2) semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA; (3) a-cetoglutarato deshidrogenasa; (4) glutamato:succinato semialdehndo transaminasa; (5) glutamato descarboxilasa; (6) semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA; (7) 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa; (8) a-cetoglutarato descarboxilasa; (9) 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa; (10) butirato cinasa; (11) fosfotransbutirilasa; (12) aldehndo deshidrogenasa; (13) alcohol deshidrogenasa.
La figura 3 es un diagrama esquematico que muestra la biosmtesis de homoserina en E. coli.
La figura 4 muestra un diagrama esquematico de una biorruta de homoserina predicha a partir de L-homoserina para dar 4-HB. La etapa 1 es una amoniaco liasa deducida (clase EC 4.3.1) con una ArxnG estimada de 12 kJ/mol. La etapa 2 es una oxidorreductasa deducida (clase EC 1.3.1) con una ArxnG estimada de -59 kJ/mol.
La figura 5 muestra un diagrama esquematico para la ruta de E. coli endogena para la conversion de aspartato en succinato por medio de fumarato. Esta ruta muestra una qmmica similar a la biorruta de homoserina predicha.
La figura 6 muestra un diagrama esquematico que ilustra los paralelismos entre las rutas biosinteticas de (A) homoserina y (B) succinil-CoA para dar BDO.
La figura 7 es un diagrama esquematico que muestra las rutas bioqmmicas para dar acetoacetato en E. coli.
La figura 8 es un diagrama esquematico que muestra una ruta bioqmmica a partir de acetoacetato para dar BDO por medio de semialdehndo succmico.
La figura 9 es un diagrama esquematico que muestra un esquema de reaccion de D-lisina-5,6-aminomutasa.
La figura 10 es un diagrama esquematico que muestra una ruta para dar acetoacetato a partir de acetil-CoA. Las enzimas son: (1) piruvato-formiato liasa, (2) piruvato deshidrogenasa, (3) acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferasa, (4) acetil-CoA C-acetil transferasa, (5) fosfotransacetilasa y (6) acetato cinasa. La enzima 7 representa la ruta de multiples etapas de acetoacetato a BDO en la figura 8.
La figura 11 muestra la produccion de 4-HB en medio mmimo de glucosa usando cepas de E. coli que albergan plasmidos que expresan diversas combinaciones de genes de la ruta de 4-HB. (a) Concentracion de 4-HB en caldo de cultivo; (b) concentracion de succinato en caldo de cultivo; (c) DO de cultivo, medida a 600 nm. Las agrupaciones de barras representan los puntos de tiempo de 24 horas, 48 horas y 72 horas (si se mide). Los codigos a lo largo del eje de las X indican la combinacion de cepa/plasmido usada. El primer mdice se refiere a la cepa huesped: 1, MG1655 lacIQ; 2, MG1655 AgabD lacIQ; 3, MG1655 AgabD AaldA lacIQ. El segundo mdice se refiere a la combinacion de plasmidos usada: 1, pZE13-0004-0035 y pZA33-0036; 2, pZE13-0004-0035 y pZA33-0010n; 3, pZ13-0004-0008 y pZA33-0036; 4, pZ13-0004-0008 y pZA33-0010n; 5, vectores de control pZE13 y pZA33.
La figura 12 muestra la produccion de 4-HB a partir de glucosa en cepas de E. coli que expresan a-cetoglutarato descarboxilasa a partir de Mycobacterium tuberculosis. Las cepas 1-3 contienen pZE13-0032 y pZA33-0036. La cepa 4 solo expresa los vectores vados pZE13 y pZA33. Las cepas huesped son las siguientes: 1 y 4, MG1655 lacIQ; 2, MG1655 AgabD lacIQ; 3, MG1655 AgabD AaldA lacIQ. Las barras se refieren a la concentracion a las 24 y 48 horas.
La figura 13 muestra la produccion de BDO a partir de 4-HB 10 mM en cepas de E. coli recombinantes. Las posiciones numeradas corresponden a experimentos con MG1655 lacIQ que contiene pZA33-0024, que expresa cat2 de P. gingivalis, y los siguientes genes expresados en pZE13: 1, ninguno (control); 2, 0002; 3, 0003; 4, 0003n; 5,
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0011; 6, 0013; 7, 0023; 8, 0025; 9, 0008n; 10, 0035. Los numeros de genes se definen en la tabla 6. Para cada posicion, las barras se refieren a las condiciones aerobias, microaerobias y anaerobias, respectivamente. Se crearon condiciones microaerobias sellando los tubos de cultivo pero sin evacuarlos.
La figura 14 muestra el espectro de masas de 4-HB y BDO producidos mediante MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035- 0002 pZA33-0034-0036 que se hizo crecer en medio mmimo M9 suplementado con glucosa sin marcar 4 g/l (a, c, e y g), glucosa marcada uniformemente con 13C (b, d, f y h). (a) y (b), fragmento caractenstico de masa 116 de BDO derivatizado, que contiene 2 atomos de carbono; (c) y (d), fragmento caractenstico de masa 177 de BDO derivatizado, que contiene 1 atomo de carbono; (e) y (f), fragmento caractenstico de masa 117 de 4-HB derivatizado, que contiene 2 atomos de carbono; (g) y (h), fragmento caractenstico de masa 233 de 4-HB derivatizado, que contiene 4 atomos de carbono.
La figura 15 es un diagrama de flujo de procedimiento esquematico de bioprocedimientos para la produccion de y- butirolactona. El panel (a) ilustra la fermentacion de alimentacion discontinua con separacion discontinua y el panel (b) ilustra la fermentacion de alimentacion discontinua con separacion continua.
Descripcion detallada de la invencion
Esta invencion se refiere al diseno y a la produccion de celulas y organismos que tienen capacidades de produccion biosintetica para acido 4-hidroxibutanoico (4-HB), y-butirolactona y 1,4-butanodiol. En una realizacion, la invencion usa modelos estequiometricos in silico del metabolismo de Escherichia coli que identifican disenos metabolicos para la produccion biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO). Los resultados descritos en el presente documento indican que pueden disenarse rutas metabolicas y modificarse por ingeniena genetica de manera recombinante para lograr la biosmtesis de 4-HB y productos posteriores tales como 1,4-butanodiol en Escherichia coli y otras celulas u organismos. La produccion biosintetica de 4-HB, por ejemplo, para los disenos in silico puede confirmarse mediante la construccion de cepas que tienen el genotipo metabolico disenado. Estas celulas u organismos modificados por ingeniena genetica de manera metabolica tambien pueden someterse a evolucion adaptativa para aumentar adicionalmente la biosmtesis de 4-HB, incluyendo en condiciones que se aproximan al crecimiento maximo teorico.
Tal como se describe en el presente documento, las caractensticas de biosmtesis de 4-HB de las cepas disenadas las hacen geneticamente estables y particularmente utiles en bioprocedimientos en continuo. Se identificaron estrategias de diseno de cepas separadas con la incorporacion de diferentes capacidades de reaccion no nativas o heterologas en E. coli que condujeron a rutas metabolicas de produccion de 4-HB y 1,4-butanodiol a partir de o bien semialdetudo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa y semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, o bien glutamato:semialdetndo succmico transaminasa. Se identificaron disenos metabolicos in silico que dieron como resultado la biosmtesis de 4-HB tanto en E. coli como en especies de levadura a partir de cada una de estas rutas metabolicas. El producto intermedio de 1,4-butanodiol, y-butirolactona, puede generarse en cultivo mediante ciclacion espontanea en condiciones a pH<7,5, particularmente en condiciones acidas, tales como por debajo de pH 5,5, por ejemplo, pH<7, pH<6,5, pH<6, y particularmente a pH<5,5 o inferior.
Las cepas identificadas mediante el componente computacional de la plataforma pueden ponerse en produccion real disenando mediante ingeniena genetica cualquiera de las alteraciones metabolicas predichas que conducen a la produccion biosintetica de 4-HB, 1,4-butanodiol u otro producto intermedio y/o productos posteriores. En aun una realizacion adicional, pueden someterse adicionalmente cepas que muestran produccion biosintetica de estos compuestos a evolucion adaptativa para aumentar adicionalmente la biosmtesis de producto. Los niveles de biosmtesis de producto proporcionados tras la evolucion adaptativa tambien pueden predecirse mediante el componente computacional del sistema.
Tal como se describe en el presente documento, se construyeron organismos microbianos para expresar una ruta biosintetica de 4-HB que codifica para las etapas enzimaticas desde succinato hasta 4-HB y hasta 4-HB-CoA. La expresion conjunta de succinato coenzima A transferasa, semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD y 4-hidroxibutirato coenzima A transferasa en un organismo microbiano huesped dio como resultado una produccion significativa de 4-HB en comparacion con organismos microbianos huesped que caredan de una ruta biosintetica de 4-HB. Segun la invencion, se generaron organismos microbianos productores de 4-HB que usaron a-cetoglutarato como sustrato introduciendo acidos nucleicos que codificaban para a-cetoglutarato descarboxilasa y 4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD.
Segun la invencion, se construyeron organismos microbianos que conteman una ruta biosintetica de 1,4-butanodiol (BDO) que biosintetizaban BDO cuando se cultivaban en presencia de 4-HB. La ruta biosintetica de BDO consistfa o bien en un acido nucleico que codificaba para una aldetudo/alcohol deshidrogenasa multifuncional o bien acidos nucleicos que codificaban para una aldehudo deshidrogenasa y una alcohol deshidrogenasa. Para soportar el crecimiento sobre sustratos de 4-HB, estos organismos microbianos productores de BDO tambien expresaban 4- hidroxibutirato CoA transferasa o 4-butirato cinasa junto con fosfotranshidroxibutirilasa. Segun la invencion, se
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generaron organismos microbianos que sintetizaban BDO mediante expresion exogena de acidos nucleicos que codificaban para una ruta biosintetica de 4-HB funcional y una ruta biosintetica de BDO funcional. La ruta biosintetica de 4-HB consistfa en 4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD y 4-hidroxibutirato coenzima A transferasa. La ruta de BDO consistfa en una aldelddo/alcohol deshidrogenasa multifuncional.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “que no se produce de manera natural”, cuando se usa con referencia a un microorganismo u organismo microbiano de la invencion, signifique que el organismo microbiano tiene al menos una alteracion genetica que no se encuentra normalmente en una cepa que se produce de manera natural de la especie a la que se hace referencia, incluyendo cepas de tipo natural de la especie a la que se hace referencia. Las alteraciones geneticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen acidos nucleicos expresables que codifican para polipeptidos metabolicos, otras adiciones de acido nucleico, deleciones de acido nucleico y/u otra alteracion funcional del material genetico microbiano. Tal modificacion incluye, por ejemplo, regiones codificantes y fragmentos funcionales de las mismas, para polipeptidos heterologos, homologos o tanto heterologos como homologos para la especie a la que se hace referencia. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresion de un gen u operon. Los polipeptidos metabolicos a modo de ejemplo incluyen enzimas dentro de una ruta biosintetica de 4-HB y enzimas dentro de una ruta biosintetica para una familia de compuestos de BDO.
Una modificacion metabolica se refiere a una reaccion bioqmmica que se altera con respecto a su estado que se produce de manera natural. Por tanto, microorganismos que no se producen de manera natural que tienen modificaciones geneticas en acidos nucleicos que codifican para polipeptidos metabolicos o fragmentos funcionales de los mismos. A continuacion se describen modificaciones metabolicas a modo de ejemplo tanto para E. coli como para organismos microbianos de levaduras.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “aislado”, cuando se usa con referencia a un organismo microbiano, signifique un organismo que esta sustancialmente libre de al menos un componente tal como se encuentra en la naturaleza el organismo microbiano al que se hace referencia. El termino incluye un organismo microbiano que se retira de algunos o todos los componentes tal como se encuentra en su entorno natural. El termino tambien incluye un organismo microbiano que se retira de algunos o todos los componentes tal como se encuentra el organismo microbiano en entornos que no se producen de manera natural. Por tanto, un organismo microbiano aislado esta parcial o completamente separado de otras sustancias tal como se encuentra en la naturaleza o tal como se hace crecer, se almacena o subsiste en entornos que no se producen de manera natural. Los ejemplos espedficos de organismos microbianos aislados incluyen microbios parcialmente puros, microbios sustancialmente puros y microbios cultivados en un medio que no se produce de manera natural.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que los terminos “microbiano”, “organismo microbiano” o “microorganismo” signifiquen cualquier organismo que existe como celula microscopica que se incluye dentro de los dominios de arqueas, bacterias o eucariotas. Por tanto, se pretende que el termino abarque celulas u organismos procariotas o eucariotas que tienen un tamano microscopico e incluyen bacteria, arqueas y eubacterias de todas las especies asf como microorganismos eucariotas tales como levaduras y hongos. El termino tambien incluye cultivos celulares de cualquier especie que puede cultivarse para la produccion de un producto bioqmmico.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “acido 4-hidroxibutanoico” signifique un derivado de 4-hidroxilo de acido butmco que tiene la formula qmmica C4H8O3 y una masa molecular de 104,11 g/mol (126,09 g/mol para su sal de sodio). El compuesto qmmico acido 4-hidroxibutanoico tambien se conoce en la tecnica como 4-HB, 4-hidroxibutirato, acido gamma-hidroxibutmco o GHB. Se pretende que el termino, tal como se usa en el presente documento, incluya cualquiera de las diversas formas de sal del compuesto e incluye, por ejemplo, 4- hidroxibutanoato y 4-hidroxibutirato. Los ejemplos espedficos de formas de sal para 4-HB incluyen 4-HB de sodio y 4-HB de potasio. Por tanto, los terminos acido 4-hidroxibutanoico, 4-HB, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutanoato, acido gamma-hidroxibutmco y GHB asf como otros nombres reconocidos en la tecnica se usan de manera sinonima en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “monomerico”, cuando se usa con referencia a 4-HB, signifique 4-HB en una forma no polimerica o no derivatizada. Los ejemplos espedficos de 4-HB polimerico incluyen poli-(acido 4-hidroxibutanoico) y copolfmeros, por ejemplo, de 4-HB y 3-HB. Un ejemplo espedfico de una forma derivatizada de 4-HB es 4-HB-CoA. En la tecnica tambien se conocen otras formas de 4-HB polimericas y otras formas derivatizadas de 4-HB.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “y-butirolactona” signifique una lactona que tiene la formula qmmica C4H6O2 y una masa molecular de 86,089 g/mol. El compuesto qmmico y-butirolactona tambien se conoce en la tecnica como GBL, butirolactona, 1,4-lactona, 4-butirolactona, lactona del acido 4- hidroxibutmco y lactona del acido gamma-hidroxibutmco. Se pretende que el termino tal como se usa en el presente documento incluya cualquiera de las diversas formas de sal del compuesto.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “1,4-butanodiol” signifique un derivado de alcohol del alcano butano, que lleva dos grupos hidroxilo, que tiene la formula qmmica C4H10O2 y una masa
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molecular de 90,12 g/mol. El compuesto qmmico 1,4-butanodiol tambien se conoce en la tecnica como BDO y es un producto intermedio qmmico o precursor para una familia de compuestos denominada en el presente documento familia de compuestos de BDO, algunos de los cuales se muestran a modo de ejemplo en la figura 1.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “tetrahidrofurano” signifique un compuesto organico heterodclico correspondiente al analogo completamente hidrogenado del compuesto aromatico furano que tiene la formula qmmica C4H8O y una masa molecular de 72,11 g/mol. El compuesto qmmico tetrahidrofurano tambien se conoce en la tecnica como THF, tetrahidrofurano, 1,4-epoxibutano, oxido de butileno, oxido de ciclotetrametileno, oxaciclopentano, oxido de dietileno, oxolano, furanidina, hidrofurano, oxido de tetra-metileno. Se pretende que el termino tal como se usa en el presente documento incluya cualquiera de las diversas formas de sal del compuesto.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “CoA” o “coenzima A” signifique un cofactor organico o grupo prostetico (parte no proteica de una enzima) cuya presencia se requiere para la actividad de muchas enzimas (la apoenzima) para formar un sistema enzimatico activo. La coenzima A funciona en determinadas enzimas de condensacion, actua en la transferencia de acetilo u otro grupo acilo y en la smtesis y oxidacion de acidos grasos, oxidacion de piruvato y en otra acetilacion.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino “sustancialmente anaerobio”, cuando se usa con referencia a una condicion de cultivo o crecimiento, signifique que la cantidad de oxfgeno es inferior a aproximadamente el 10% de saturacion para oxfgeno disuelto en medios lfquidos. Tambien se pretende que el termino incluya camaras selladas de medio lfquido o solido mantenido con una atmosfera de menos de aproximadamente el 1% de oxfgeno.
Los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion pueden contener alteraciones geneticas estables, lo cual se refiere a microorganismos que pueden cultivarse durante mas de cinco generaciones sin perdida de la alteracion. Generalmente, las alteraciones geneticas estables incluyen modificaciones que persisten mas de 10 generaciones, particularmente las modificaciones estables persistiran mas de aproximadamente 25 generaciones, y mas particularmente, las modificaciones geneticas estables seran de mas de 50 generaciones, incluyendo indefinidamente.
Los expertos en la tecnica entenderan que las alteraciones geneticas, incluyendo las modificaciones metabolicas mostradas a modo de ejemplo en el presente documento, se describen con referencia a genes de E. coli y de levadura y sus correspondientes reacciones metabolicas. Sin embargo, dada la secuenciacion del genoma completo de una amplia variedad de organismos y el alto nivel de experiencia en el campo de la genomica, los expertos en la tecnica podran aplicar facilmente las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento esencialmente a todos los demas organismos. Por ejemplo, las alteraciones metabolicas de E. coli mostradas a modo de ejemplo en el presente documento pueden aplicarse facilmente a otras especies incorporando el mismo acido nucleico codificante, o uno analogo, de una especie distinta de la especie a la que se hace referencia. Tales alteraciones geneticas incluyen, por ejemplo, alteraciones geneticas de homologos de especies, en general, y en particular, desplazamientos de genes ortologos, paralogos o no ortologos.
Un ortologo es un gen o genes que estan relacionados mediante descendencia vertical y son responsables de sustancialmente las mismas o identicas funciones en diferentes organismos. Por ejemplo, la epoxido hidrolasa de raton y la epoxido hidrolasa humana pueden considerarse ortologos para la funcion biologica de hidrolisis de epoxidos. Los genes estan relacionados mediante descendencia vertical cuando, por ejemplo, comparten similitud de secuencia de cantidad suficiente como para indicar que son homologos, o estan relacionados mediante evolucion a partir de un ancestro comun. Los genes tambien pueden considerarse ortologos si comparten una estructura tridimensional pero no necesariamente similitud de secuencia, de una cantidad suficiente para indicar que han evolucionado a partir de un ancestro comun hasta el grado de que la similitud de secuencia primaria no es identificable. Los genes que son ortologos pueden codificar para protemas con una similitud de secuencia de aproximadamente el 25% al 100% de identidad de secuencia de aminoacidos. Tambien puede considerarse que los genes que codifican para protemas que comparten una similitud de aminoacidos inferior al 25% han surgido mediante descendencia vertical si su estructura tridimensional tambien muestra similitudes. Se considera que los miembros de la familia de enzimas de serina proteasa, incluyendo el activador de plasminogeno tisular y la elastasa, han surgido mediante descendencia vertical a partir de un ancestro comun.
Los ortologos incluyen genes o sus productos genicos codificados que, por ejemplo, mediante evolucion, han divergido en cuanto a su estructura o actividad global. Por ejemplo, cuando una especie codifica para un producto genico que muestra dos funciones y cuando tales funciones se han separado en genes diferenciados en una segunda especie, se considera que los tres genes y sus correspondientes productos son ortologos. Para la produccion acoplada con el crecimiento de un producto bioqmmico, los expertos en la tecnica entenderan que el gen ortologo que alberga la actividad metabolica que va a alterarse debe elegirse para la construccion del microorganismo que no se produce de manera natural. Un ejemplo de ortologos que muestran actividades separables es en los que actividades diferenciadas se han separado en productos genicos diferenciados entre dos o mas especies o dentro de una unica especie. Un ejemplo espedfico es la separacion de la proteolisis de elastasa y
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la proteolisis de plasminogeno, dos tipos de actividad serina proteasa, en moleculas diferenciadas como activador de plasminogeno y elastasa. Un segundo ejemplo es la separacion de la actividad 5'-3' exonucleasa de micoplasma y ADN polimerasa III de Drosophila. La ADN polimerasa de la primera especie puede considerarse un ortologo de cualquiera o ambas de la exonucleasa o la polimerasa de la segunda especie y viceversa.
En cambio, los paralogos son homologos relacionados, por ejemplo, mediante duplicacion seguida por divergencia evolutiva y tienen funciones similares o comunes, pero no identicas. Los paralogos pueden originarse o derivarse, por ejemplo, de la misma especie o de una especie diferente. Por ejemplo, la epoxido hidrolasa microsomal (epoxido hidrolasa I) y la epoxido hidrolasa soluble (epoxido hidrolasa II) pueden considerarse paralogos porque representan dos enzimas diferenciadas, que evolucionaron conjuntamente de un ancestro comun, que catalizan reacciones diferenciadas y tienen funciones diferenciadas en la misma especie. Los paralogos son protemas de la misma especie con similitud de secuencia significativa entre sf que sugiere que son homologos, o relacionadas mediante evolucion conjunta a partir de un ancestro comun. Los grupos de familias de protemas paralogas incluyen homologos de HipA, genes de luciferasa, peptidasas, y otros.
Un desplazamiento genico no ortologo es un gen no ortologo de una especie que puede sustituir a una funcion genica a la que se hace referencia en una especie diferente. La sustitucion incluye, por ejemplo, poder realizar sustancialmente la misma funcion o una similar en la especie de origen en comparacion con la funcion a la que se hace referencia en la especie diferente. Aunque generalmente un desplazamiento genico no ortologo podra identificarse como estructuralmente relacionado con un gen conocido que codifica para la funcion a la que se hace referencia, no obstante genes estructuralmente menos relacionados pero funcionalmente similares y sus correspondientes productos genicos todavfa entraran dentro del significado del termino tal como se usa en el presente documento. La similitud funcional requiere, por ejemplo, al menos algo de similitud estructural en el sitio activo o la region de union de un gen no ortologo en comparacion con un gen que codifica para la funcion que se busca sustituir. Por tanto, un gen no ortologo incluye, por ejemplo, un paralogo o un gen no relacionado.
Por tanto, al identificar y construir los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion que tienen capacidad biosintetica de 4-HB, GBL y/o BDO, los expertos en la tecnica entenderan, al aplicar las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento a una especie particular, que la identificacion de modificaciones metabolicas puede incluir la identificacion e inclusion o inactivacion de ortologos. En la medida en que estan presentes paralogos y/o desplazamientos genicos no ortologos en el microorganismo al que se hace referencia que codifica para una enzima que cataliza una reaccion metabolica similar o sustancialmente similar, los expertos en la tecnica tambien pueden usar estos genes relacionados por evolucion.
Pueden determinarse ortologos, paralogos y desplazamientos genicos no ortologos mediante metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la inspeccion de secuencias de acido nucleico o de aminoacidos para dos polipeptidos revelara identidad de secuencia y similitudes entre las secuencias comparadas. Basandose en tales similitudes, un experto en la tecnica puede determinar si la similitud es suficientemente alta como para indicar que las protemas estan relacionadas mediante evolucion a partir de un ancestro comun. Algoritmos bien conocidos por los expertos en la tecnica, tales como Align, BLAST, Clustal W y otros, comparan y determinan una identidad o similitud de secuencia en bruto, y tambien determinan la presencia o significacion de huecos en la secuencia a los que se les puede asignar un peso o puntuacion. Tales algoritmos tambien se conocen en la tecnica y pueden aplicarse de manera similar para determinar la identidad o similitud de secuencia de nucleotidos. Los parametros para similitud suficiente para determinar la relacion se calculan basandose en metodos bien conocidos para calcular la similitud estadfstica, o la posibilidad de hallar una coincidencia similar en un polipeptido al azar, y la significacion de la coincidencia determinada. Si se desea, los expertos en la tecnica tambien pueden optimizar visualmente una comparacion informatica de dos o mas secuencias. Puede esperarse que las protemas o los productos genicos relacionados tengan una alta similitud, por ejemplo, identidad de secuencia del 25% al 100%. Las protemas que no estan relacionadas pueden tener una identidad que es esencialmente la misma que la que se esperana que se produjera por casualidad, si se explora una base de datos de tamano suficiente (aproximadamente el 5%). Las secuencias de entre el 5% y el 24% pueden representar o no homologfa suficiente como para concluir que las secuencias comparadas estan relacionadas. Pueden llevarse a cabo analisis estadfsticos adicionales para determinar la significacion de tales coincidencias dado el tamano del conjunto de datos para determinar la relevancia de estas secuencias.
Pueden establecerse parametros a modo de ejemplo para determinar la relacion de dos o mas secuencias usando el algoritmo BLAST, por ejemplo, de la siguiente manera. En resumen, pueden realizarse alineaciones de secuencias de aminoacidos usando BLASTP version 2.0.8 (05 de enero de 1999) y los siguientes parametros: Matriz: 0 BLOSUM62; apertura de hueco: 11; extension de hueco: 1; x_disminucion: 50; esperado: 10,0; tamano de palabra: 3; filtro: activado. Pueden realizarse alineaciones de secuencias de acido nucleico usando BLASTN version 2.0.6 (16 de septiembre de 1998) y los siguientes parametros: Coincidencia: 1; coincidencia erronea: -2; apertura de hueco: 5; extension de hueco: 2; x_disminucion: 50; esperado: 10,0; tamano de palabra: 11; filtro: desactivado. Los expertos en la tecnica sabran que modificaciones realizar en los parametros anteriores para o bien aumentar o bien disminuir la rigurosidad de la comparacion, por ejemplo, y determinar la relacion de dos o mas secuencias.
La descripcion proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un
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organismo microbiano que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que incluye al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehudo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, alfa-cetoglutarato descarboxilasa o glutamato descarboxilasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir acido 4- hidroxibutanoico (4-HB) monomerico. La 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa tambien se denomina 4-hidroxibutirato deshidrogenasa o 4-HB deshidrogenasa. La succinil-CoA sintetasa tambien se denomina succinil-CoA sintasa o succinil-CoA ligasa.
Tambien se proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que tiene al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) monomerico.
Los biocatalizadores microbianos que no se producen de manera natural de la invencion incluyen organismos microbianos que emplean combinaciones de reacciones metabolicas para producir de manera biosintetica los compuestos de la invencion. Los compuestos biosintetizados pueden producirse de manera intracelular y/o secretarse al medio de cultivo. Los compuestos a modo de ejemplo producidos por los microorganismos que no se producen de manera natural incluyen, por ejemplo, acido 4-hidroxibutanoico, 1,4-butanodiol y y-butirolactona. En la figura 1 se muestran a modo de ejemplo las relaciones de estos compuestos a modo de ejemplo con respecto a la smtesis qrnmica o biosmtesis.
Tal como se describe en el presente documento, se disena mediante ingeniena genetica un organismo microbiano que no se produce de manera natural para producir 4-HB. Este compuesto es un punto de entrada util en la familia de compuestos de 1,4-butanodiol. En las etapas 1-8 de la figura 2 se muestran las reacciones bioqmmicas para la formacion de 4-HB a partir de succinato, a partir de succinato a traves de succinil-CoA o a partir de a-cetoglutarato.
La invencion se describe en el presente documento con referencia general a la reaccion metabolica, reactivo o producto de la misma, o con referencia espedfica a uno o mas acidos nucleicos o genes que codifican para una enzima asociada con, o que cataliza, la reaccion metabolica, reactivo o producto al que se hace referencia. A menos que se mencione expresamente lo contrario en el presente documento, los expertos en la tecnica entenderan que la referencia a una reaccion tambien constituye una referencia a los reactivos y productos de la reaccion. De manera similar, a menos que se mencione expresamente lo contrario en el presente documento, la referencia a un reactivo o producto tambien hace referencia a la reaccion y la referencia a cualquiera de estos constituyentes metabolicos tambien hace referencia al gen o los genes que codifican para las enzimas que catalizan para la reaccion, el reactivo o producto al que se hace referencia. Asimismo, dados los campos bien conocidos de la bioqmmica metabolica, la enzimologfa y la genomica, la referencia en el presente documento a un gen o acido nucleico codificante tambien constituye una referencia a la enzima codificante correspondiente y a la reaccion que cataliza asf como a los reactivos y productos de la reaccion.
La produccion de 4-HB por medio de modos biosinteticos usando los organismos microbianos de la invencion es particularmente util porque puede producir 4-HB monomerico. Los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion y su biosmtesis de 4-HB y la familia de compuestos de BDO tambien son particularmente utiles porque el producto de 4-HB puede estar carente de cualquier derivatizacion tal como coenzima A; (3) evita cambios termodinamicos durante la biosmtesis; y permite la biosmtesis directa de BDO.
Generalmente los organismos microbianos carecen de la capacidad para sintetizar 4-HB y, por tanto, se sabe que cualquiera de los compuestos mostrados en la figura 1 estan dentro de la familia de compuestos de 1,4-butanodiol o los expertos en la tecnica saben que estan dentro de la familia de compuestos de 1,4-butanodiol. Ademas, no se conocen organismos que tengan todas las capacidades enzimaticas metabolicas requeridas para producir 4-HB a partir de las enzimas descritas y las rutas bioqmmicas mostradas a modo de ejemplo en el presente documento. En vez de eso, con la posible excepcion de algunos microorganismos anaerobios descritos adicionalmente a continuacion, los microorganismos que tienen la capacidad enzimatica usan 4-HB como sustrato para producir, por ejemplo, succinato. En cambio, los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion generan 4-HB como producto. Tal como se describio anteriormente, la biosmtesis de 4-HB en su forma monomerica permite la biosmtesis adicional de compuestos de la familia de BDO y evita completamente procedimientos de smtesis qrnmica.
Los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion que pueden producir 4-HB se producen garantizando que un organismo microbiano huesped incluye capacidades funcionales para la smtesis bioqmmica completa de al menos una ruta biosintetica de 4-HB de la invencion. Garantizar al menos una ruta biosintetica de 4-HB requerida confiere capacidad de biosmtesis de 4-HB al organismo microbiano huesped.
En el presente documento se muestran a modo de ejemplo cinco rutas biosinteticas de 4-HB requeridas y se muestran con fines de ilustracion en la figura 2. Una ruta biosintetica de 4-HB requerida incluye la biosmtesis de 4-
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HB a partir de succinato (la ruta de succinato). Las enzimas que participan en esta ruta de 4-HB incluyen semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. En esta ruta, la semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA cataliza la reaccion inversa a la flecha mostrada en la figura 2. Otra ruta biosintetica de 4-HB requerida incluye la biosmtesis a partir de succinato a traves de succinil- CoA (la ruta de succinil-CoA). Las enzimas que participan en esta ruta de 4-HB incluyen succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Otras tres rutas biosinteticas de 4-HB requeridas incluyen la biosmtesis de 4-HB a partir de a-cetoglutarato (las rutas de a- cetoglutarato). Por tanto, una tercera ruta biosintetica de 4-HB requerida es la biosmtesis de semialdetndo succmico a traves de glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Una cuarta ruta biosintetica de 4-HB requerida que se refiere a la invencion tambien incluye la biosmtesis de 4-HB a partir de a-cetoglutarato, pero usa a-cetoglutarato descarboxilasa para catalizar la smtesis de semialdehndo succmico. La 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa cataliza la conversion de semialdehndo succmico en 4-HB. Una quinta ruta biosintetica de 4-HB requerida que se refiere a la invencion, incluye la biosmtesis a partir de a- cetoglutarato a traves de succinil-CoA y usa a-cetoglutarato deshidrogenasa para producir succinil-CoA, que entra en la ruta de succinil-CoA descrita anteriormente. Cada una de estas rutas biosinteticas de 4-HB, sus sustratos, reactivos y productos, se describen adicionalmente a continuacion en los ejemplos.
Los organismos microbianos que no se producen de manera natural tal como se describen en el presente documento pueden producirse introduciendo acidos nucleicos expresables que codifican para una o mas de las enzimas que participan en una o mas rutas biosinteticas de 4-HB. Dependiendo del organismo microbiano huesped elegido para la biosmtesis, pueden expresarse acidos nucleicos para parte o la totalidad de una ruta biosintetica de 4-HB particular. Por ejemplo, si un huesped elegido es deficiente en ambas enzimas en la ruta de succinato a 4-HB y se selecciona esta ruta para la biosmtesis de 4-HB, entonces se introducen acidos nucleicos expresables tanto para semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA como para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa en el huesped para la posterior expresion exogena. Alternativamente, si el huesped elegido muestra semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA endogena, pero es deficiente en 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, entonces se necesita un acido nucleico codificante para esta enzima para lograr la biosmtesis de 4- HB.
De manera similar, cuando se selecciona que la biosmtesis de 4-HB se produzca a traves de la ruta de succinato a succinil-CoA (la ruta de succinil-CoA), deben expresarse de manera endogena en el huesped receptor acidos nucleicos codificantes para deficiencias en el huesped en las enzimas succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y/o 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. La seleccion de la biosmtesis de 4-HB a traves de la ruta de a-cetoglutarato a semialdehndo succmico (la ruta de a-cetoglutarato) puede usar la expresion exogena para deficiencias en el huesped en una o mas de las enzimas para glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa y/o 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, o a-cetoglutarato descarboxilasa y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.
Dependiendo de los constituyentes de la ruta biosintetica de 4-HB de un organismo microbiano huesped seleccionado, el biocatalizador de 4-HB microbiano que no se produce de manera natural descrito en el presente documento incluira al menos un acido nucleico codificante de la ruta de 4-HB expresado de manera exogena y hasta todos los acidos nucleicos codificantes para una o mas rutas biosinteticas de 4-Hb. Por ejemplo, puede establecerse la biosmtesis de 4-HB a partir de las cinco rutas en un huesped deficiente en 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa a traves de la expresion exogena de un acido nucleico codificante para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. En cambio, puede establecerse la biosmtesis de 4-HB a partir de las cinco rutas en un huesped deficiente en las ocho enzimas a traves de expresion exogena de las ocho de semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, a-cetoglutarato deshidrogenasa y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.
Dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los expertos en la tecnica entenderan que el numero de acidos nucleicos codificantes que deben introducirse en una forma expresable sera, al menos, paralelo a las deficiencias en la ruta de 4-HB del organismo microbiano huesped seleccionado. Por tanto, un organismo microbiano que no se produce de manera natural descrito en el presente documento puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho acidos nucleicos que codifican para las enzimas anteriores que constituyen una o mas rutas biosinteticas de 4-HB. En algunas realizaciones, los organismos microbianos que no se producen de manera natural tambien pueden incluir otras modificaciones geneticas que facilitan u optimizan la biosmtesis de 4-HB o que confieren otras funciones utiles al organismo microbiano huesped. Una de tal otra funcionalidad puede incluir, por ejemplo, aumento de la smtesis de uno o mas de los precursores de la ruta de 4-HB tales como succinato, succinil-CoA y/o a-cetoglutarato.
En algunas realizaciones, se genera un organismo microbiano que no se produce de manera natural de la invencion a partir de un huesped que contiene la capacidad enzimatica para sintetizar 4-HB. En esta realizacion espedfica puede ser util aumentar la smtesis o acumulacion de un producto de la ruta de 4-HB para, por ejemplo, impulsar las reacciones de la ruta de 4-HB hacia la produccion de 4-HB. Puede lograrse el aumento de la smtesis o la
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acumulacion, por ejemplo, mediante sobreexpresion de acidos nucleicos que codifican para una o mas de las enzimas de ruta de 4-Hb descritas anteriormente. La sobreexpresion de la enzima o enzimas de la ruta de 4-HB puede producirse, por ejemplo, a traves de expresion exogena del gen o los genes endogenos, o a traves de expresion exogena del gen o los genes heterologos. Por tanto, pueden generarse facilmente organismos que se producen de manera natural para que sean organismos microbianos que producen 4-HB de manera no natural de la invencion a traves de la sobreexpresion de uno, dos, tres, cuatro, cinco o los seis acidos nucleicos que codifican para enzimas de la ruta biosintetica de 4-HB. Ademas, puede generarse un organismo que no se produce de manera natural mediante mutagenesis de un gen endogeno que da como resultado un aumento de la actividad de una enzima en la ruta biosintetica de 4-HB.
En realizaciones particularmente utiles, se emplea la expresion exogena de los acidos nucleicos codificantes. La expresion exogena confiere la capacidad de disenar a medida la expresion y/o los elementos reguladores en el huesped y la aplicacion para lograr un nivel de expresion deseado que se controla por el usuario. Sin embargo, tambien puede usarse la expresion endogena en otras realizaciones tales como eliminando un efector regulador negativo o induciendo el promotor del gen cuando esta asociado con un promotor inducible u otro elemento regulador. Por tanto, puede regularse por incremento un gen endogeno que tiene un promotor inducible que se produce de manera natural proporcionando el agente inductor apropiado, o puede modificarse por ingeniena genetica la region reguladora de un gen endogeno para incorporar un elemento regulador inducible, permitiendo de ese modo la regulacion de la expresion aumentada de un gen endogeno en un momento deseado. De manera similar, puede incluirse un promotor inducible como elemento regulador para un gen exogeno introducido en un organismo microbiano que no se produce de manera natural (veanse los ejemplos II y IV, por ejemplo).
Se pretende que “exogeno”, tal como se usa en el presente documento, signifique que la molecula a la que se hace referencia o la actividad a la que se hace referencia se introduce en el organismo microbiano huesped incluyendo, por ejemplo, la introduccion de un acido nucleico codificante en el material genetico del huesped tal como mediante integracion en un cromosoma del huesped. Por tanto, el termino tal como se usa con referencia a expresion de un acido nucleico codificante se refiere a la introduccion del acido nucleico codificante en una forma expresable en el organismo microbiano. Cuando se usa con referencia a una actividad biosintetica, el termino se refiere a una actividad que se introduce en el organismo de referencia huesped. La fuente pude ser, por ejemplo, un acido nucleico codificante homologo o heterologo que expresa la actividad a la que se hace referencia tras la introduccion en el organismo microbiano huesped. Por tanto, el termino “endogeno” se refiere a una molecula o actividad a la que se hace referencia que esta presente en el huesped. De manera similar, el termino, cuando se usa con referencia a la expresion de un acido nucleico codificante, se refiere a la expresion de un acido nucleico codificante contenido dentro del organismo microbiano. El termino “heterologo” se refiere a una molecula o actividad derivada de una fuente distinta de la especie a la que se hace referencia, mientras que “homologo” se refiere a una molecula o actividad derivada del organismo microbiano huesped. Por consiguiente, la expresion exogena de un acido nucleico codificante de la invencion puede usar cualquiera o ambos de un acido nucleico codificante heterologo u homologo.
Las fuentes de acidos nucleicos codificantes para una enzima de la ruta de 4-HB pueden incluir, por ejemplo, cualquier especie en la que el producto genico codificado puede catalizar la reaccion a la que se hace referencia. Tales especies incluyen organismos tanto procariotas como eucariotas incluyendo, pero sin limitarse a, bacterias, incluyendo arqueas y eubacterias, y eucariotas, incluyendo levadura, planta, insecto, animal y marnffero, incluyendo ser humano. Las especies a modo de ejemplo para tales fuentes incluyen, por ejemplo, E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Clostridium kluyveri, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium
saccharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Ralstonia eutropha, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis y Porphyromonas gingivalis. Por ejemplo, los organismos microbianos que tienen produccion biosintetica de 4-HB se muestran a modo de ejemplo en el presente documento con referencia a huespedes de levadura y E. coli. Sin embargo, con la secuencia genomica completa disponible ahora para mas de 550 especies (estando mas de la mitad de estas disponibles en bases de datos publicas tales como el NCBI), incluyendo genomas de 395 microorganismos y una variedad de genomas de levaduras, hongos, plantas y mairnferos, la identificacion de genes que codifican para la actividad biosintetica de 4-HB requerida para uno o mas genes en especies relacionadas o distantes, incluyendo por ejemplo, homologos, ortologos, paralogos y desplazamientos genicos no ortologos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones geneticas entre organismos resulta rutinario y se conoce bien en la tecnica. Por consiguiente, las alteraciones metabolicas que permiten la biosmtesis de 4-HB y otros compuestos de la invencion descritos en el presente documento con referencia a un organismo particular tal como E. coli o levadura pueden aplicarse facilmente a otros microorganismos, incluyendo organismos procariotas y eucariotas por igual. Dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los expertos en la tecnica sabran que una alteracion metabolica mostrada a modo de ejemplo en un organismo puede aplicarse igualmente a otros organismos.
En algunos casos, tales como cuando existe una ruta biosintetica de 4-HB alternativa en una especie no relacionada, puede conferirse biosmtesis de 4-HB a la especie huesped, por ejemplo, mediante expresion exogena de un paralogo o paralogos de la especie no relacionada que catalizan una reaccion metabolica similar, pero no identica, para sustituir a la reaccion a la que se hace referencia. Dado que existen ciertas diferencias entre las redes metabolicas entre diferentes organismos, los expertos en la tecnica entenderan que el uso de genes real entre diferentes organismos puede diferir. Sin embargo, dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente
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documento, los expertos en la tecnica tambien entenderan que las ensenanzas y los metodos de la invencion pueden aplicarse a todos los organismos microbianos usando las alteraciones metabolicas relacionadas con las mostradas a modo de ejemplo en el presente documento para construir un organismo microbiano en una especie de interes que sintetizara 4-HB monomerico.
Pueden seleccionarse organismos microbianos huesped, y generarse los organismos microbianos que no se producen de manera natural, por ejemplo, de bacterias, levadura, hongo o cualquiera de una variedad de otros microorganismos aplicables a procedimientos de fermentacion. Las bacterias a modo de ejemplo incluyen especies seleccionadas de E. coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida. Las levaduras u hongos a modo de ejemplo incluyen especies seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Pichia pastoris.
Pueden realizarse metodos para construir y someter a prueba los niveles de expresion de un huesped productor de 4-HB que no se produce de manera natural, por ejemplo, mediante metodos recombinantes y de deteccion bien conocidos en la tecnica. Tales metodos pueden encontrarse descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). Pueden separarse 4-HB y GBL, por ejemplo, mediante HPLC usando una columna Spherisorb 5 ODS1 y una fase movil del 70% de tampon fosfato 10 mM (pH=7) y el 30% de metanol, y detectarse usando un detector UV a 215 nm (Hennessy et al. 2004, J. Forensic Sci. 46(6):1-9). BDO se detecta mediante cromatograffa de gases o mediante HPLC y detector de mdice de refraccion usando una columna Aminex HPX-87H y una fase movil de acido sulfurico 0,5 mM (Gonzalez-Pajuelo et al., Met. Eng. 7:329-336 (2005)).
Por ejemplo, puede construirse un vector o vectores de expresion para albergar una o mas rutas biosinteticas de 4- HB y/o uno o mas acidos nucleicos codificantes biosinteticos para BDO tal como se muestra a modo de ejemplo en el presente documento unidos operativamente a secuencias de control de la expresion funcionales en el organismo huesped. Los vectores de expresion aplicables para su uso en los organismos huesped microbianos de la invencion incluyen, por ejemplo, plasmidos, vectores de fago, vectores virales, episomas y cromosomas artificiales, incluyendo vectores y secuencias de seleccion o marcadores operables para la integracion estable en un cromosoma huesped. Tambien pueden incluirse genes de marcadores seleccionables que, por ejemplo, proporcionan resistencia a antibioticos o toxinas, complementan deficiencias auxotroficas o suministran nutrientes cnticos que no estan en los medios de cultivo. Las secuencias de control de la expresion pueden incluir promotores constitutivos e inducibles, potenciadores de la transcripcion, terminadores de la transcripcion, y similares que se conocen bien en la tecnica. Cuando deben expresarse conjuntamente dos o mas acidos nucleicos codificantes exogenos, pueden insertarse ambos acidos nucleicos, por ejemplo, en un vector de expresion individual o en vectores de expresion separados. Para el vector expresion individual, los acidos nucleicos codificantes pueden unirse operacionalmente a una secuencia de control de la expresion comun o unirse a diferentes secuencias de control de la expresion, tales como un promotor inducible y un promotor constitutivo. La transformacion de secuencias de acido nucleico exogenas implicadas en una ruta metabolica o sintetica puede confirmarse usando metodos bien conocidos en la tecnica.
Los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion se construyen usando metodos bien conocidos en la tecnica tal como se mostro a modo de ejemplo anteriormente para expresar de manera exogena al menos un acido nucleico que codifica para una enzima de la ruta de 4-HB en cantidades suficientes para producir 4-HB monomerico. A continuacion en los ejemplos se describen adicionalmente niveles de expresion a modo de ejemplo para enzimas de 4-HB en cada ruta. Siguiendo las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion pueden lograr la biosmtesis de 4-HB monomerico dando como resultado concentraciones intracelulares de entre aproximadamente 0,1-25 mM o mas. Generalmente, la concentracion intracelular de 4-HB monomerico es de entre aproximadamente 3-20 mM, particularmente entre aproximadamente 5-15 mM y mas particularmente entre aproximadamente 8-12 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM o mas. Tambien pueden lograrse concentraciones intracelulares entre y por encima de cada uno de estos intervalos a modo de ejemplo a partir de los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion.
Tal como se describe adicionalmente a continuacion, una condicion de crecimiento a modo de ejemplo para lograr la biosmtesis de 4-HB incluye condiciones de cultivo o fermentacion anaerobias. En determinadas realizaciones, los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion pueden sustentarse, cultivarse o fermentarse en condiciones anaerobias o sustancialmente anaerobias. En resumen, las condiciones anaerobias se refieren a un entorno carente de oxfgeno. Las condiciones sustancialmente anaerobias incluyen, por ejemplo, un cultivo, fermentacion discontinua o fermentacion continua de tal manera que la concentracion de oxfgeno disuelto en el medio permanece entre el 0 y el 10% de la saturacion. Las condiciones sustancialmente anaerobias tambien incluyen celulas en crecimiento o en reposo en medio lfquido o en agar solido dentro de una camara sellada mantenida con una atmosfera con menos del 1% de oxfgeno. El porcentaje de oxfgeno puede mantenerse, por ejemplo, burbujeando el cultivo con una mezcla de N2/CO2 u otro gas o gases distintos de oxfgeno adecuados.
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La descripcion tambien proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO) que incluyen al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato:semialdel'ndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehfdo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehfdo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (BDO). La 4-hidroxibutirato:CoA transferasa tambien se conoce como 4- hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa.
La descripcion proporciona ademas un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural que incluye un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), las rutas incluyen al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, aldehfdo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (BDO).
Tambien pueden generarse organismos microbianos que no se producen de manera natural que biosintetizan BDO. Como con los organismos microbianos productores de 4-HB descritos en el presente documento, los organismos microbianos productores de BDO de la invencion tambien pueden producir de manera intracelular o secretar el BDO al medio de cultivo. Siguiendo las ensenanzas y directrices proporcionadas anteriormente para la construccion de organismos microbianos que sintetizan 4-HB, pueden incorporarse rutas de BDO adicionales en los organismos microbianos productores de 4-HB para generar organismos que tambien sintetizan BDO y otros compuestos de la familia de bDo. En la figura 1 se ilustra la smtesis qrnmica de BDO y sus productos posteriores. Los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion que pueden biosintetizar BDO sortean estas smtesis qrnmicas usando 4-HB como punto de entrada tal como se ilustra en la figura 2. Tal como se describe adicionalmente a continuacion, los productores de 4-HB tambien pueden usarse para convertir qmmicamente 4-HB en GBL y despues en BDO o tHf, por ejemplo. Segun la invencion, los productores de 4-HB se modifican adicionalmente para incluir capacidades biosinteticas para la conversion de 4-HB y/o GBL en BDO.
Las rutas de BDO adicionales para introducir en productores de 4-HB incluyen, por ejemplo, la expresion exogena en un contexto genetico deficiente huesped o la sobreexpresion de una o mas de las enzimas mostradas a modo de ejemplo en la figura 2 como las etapas 9-13. Una ruta de este tipo incluye, por ejemplo, las actividades enzimaticas necesarias para llevar a cabo las reacciones mostradas como las etapas 9, 12 y 13 en la figura 2, en las que las aldehfdo y alcohol deshidrogenasas pueden ser enzimas separadas o una enzima multifuncional que tiene actividad tanto aldehfdo como alcohol deshidrogenasa. Otra ruta de este tipo incluye, por ejemplo, las actividades enzimaticas necesarias para llevar a cabo las reacciones mostradas como las etapas 10, 11, 12 y 13 en la figura 2, tambien en las que las aldehfdo y alcohol deshidrogenasas pueden ser enzimas separadas o una enzima multifuncional que tiene actividad tanto aldehfdo como alcohol deshidrogenasa. Por consiguiente, las rutas de BDO adicionales para introducir en productores de 4-HB incluyen, por ejemplo, la expresion exogena en un contexto genetico deficiente huesped o la sobreexpresion de una o mas de a 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, aldehfdo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehfdo deshidrogenasa dependiente de CoA o una alcohol deshidrogenasa. En ausencia de acil-CoA sintetasa endogena que pueda modificar 4-HB, los organismos microbianos productores de BDO que no se producen de manera natural pueden incluir ademas una acil-CoA sintetasa exogena selectiva para 4-HB, o la combinacion de multiples enzimas que tienen como reaccion neta la conversion de 4-HB en 4-HB-CoA. Tal como se muestra a modo de ejemplo adicionalmente a continuacion en los ejemplos, butirato cinasa y fosfotransbutirilasa muestran actividad de la ruta de BDO y catalizan las conversiones ilustradas en la figura 2 con un sustrato de 4-HB. Por tanto, estas enzimas tambien pueden denominarse en el presente documento 4-hidroxibutirato cinasa y fosfotranshidroxibutirilasa, respectivamente.
En la tabla 1 a continuacion se enumeran alcohol y aldehfdo deshidrogenasas a modo de ejemplo que pueden usarse para estas conversiones in vivo de 4-HB en bDo.
Tabla 1. Alcohol y aldehfdo deshidrogenasas para la conversion de 4-HB en BDO.
ALCOHOL DESHIDROGENASAS
ec: 1.1.1.1 alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.2 alcohol deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.4 (R,R)-butanodiol deshidrogenasa ec: 1.1.1.5 acetoma deshidrogenasa ec: 1.1.1.6 glicerol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.7 propanodiol-fosfato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.78 metilglioxal reductasa (dependiente de NADH)
ec: 1.1.1.79 glioxilato reductasa (NADP+)
ec: 1.1.1.80 isopropanol deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.81 hidroxipiruvato reductasa
ec: 1.1.1.82 malato deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.83 D-malato deshidrogenasa
(descarboxilante)
ec: 1.1.1.84 dimetilmalato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.8 glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+)
ec: 1.1.1.11 D-arabinitol 4-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.12 L-arabinitol 4-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.13 L-arabinitol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.14 L-iditol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.15 D-iditol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.16 galactitol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.17 manitol-1-fosfato 5-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.18 inositol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.21 aldehndo reductasa
ec: 1.1.1.23 histidinol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.26 glioxilato reductasa
ec: 1.1.1.27 L-lactato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.28 D-lactato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.29 glicerato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.30 3-hidroxibutirato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.31 3-hidroxiisobutirato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.35 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa
ec: 1.1.1.36 acetoacetil-CoA reductasa
ec: 1.1.1.37 malato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.38 malato deshidrogenasa (oxaloacetato-
descarboxilante)
ec: 1.1.1.39 malato deshidrogenasa (descarboxilante)
ec: 1.1.1.40 malato deshidrogenasa (oxaloacetato-
descarboxilante) (NADP+)
ec: 1.1.1.41 isocitrato deshidrogenasa (NAD+)
ec: 1.1.1.42 isocitrato deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.54 alil-alcohol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.55 lactaldehfdo reductasa (NADPH)
ec: 1.1.1.56 ribitol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.59 3-hidroxipropionato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.60 2-hidroxi-3-oxopropionato reductasa
ec: 1.1.1.61 4-hidroxibutirato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.66 omega-hidroxidecanoato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.67 manitol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.71 alcohol deshidrogenasa [NAD(P)+]
ec: 1.1.1.72 glicerol deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.73 octanol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.75 (R)-aminopropanol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.76 (S,S)-butanodiol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.77 lactaldehfdo reductasa
ec: 1.1.1.178 3-hidroxi-2-metilbutiril-CoA
deshidrogenasa
ec: 1.1.1.185 L-glicol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.190 indol-3-acetaldehndo reductasa (NADH)
ec: 1.1.1.191 indol-3-acetaldehfdo reductasa (NADPH)
ec: 1.1.1.192 alcohol de cadena larga deshidrogenasa ec: 1.1.1.194 coniferil-alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.195 cinamil-alcohol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.198 (+)-borneol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.202 1.3-propanodiol deshidrogenasa ec: 1.1.1.207 (-)-mentol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.208 (+)-neomentol deshidrogenasa ec: 1.1.1.216 farnesol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.217 bencil-2-metil-hidroxibutirato
deshidrogenasa
ec: 1.1.1.222 (R)-4-hidroxifenilactato deshidrogenasa ec: 1.1.1.223 isopiperitenol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.85 3-isopropilmalato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.86 cetol-acido reductoisomerasa
ec: 1.1.1.87 homoisocitrato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.88 hidroximetilglutaril-CoA reductasa
ec: 1.1.1.90 aril-alcohol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.91 aril-alcohol deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.92 oxaloglicolato reductasa (descarboxilante)
ec: 1.1.1.94 glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
[NAD(P)+]
ec: 1.1.1.95 fosfoglicerato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.97 3-hidroxibencil-alcohol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.101 acilglicerona-fosfato reductasa
ec: 1.1.1.103 L-treonina 3-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.104 4-oxoprolina reductasa
ec: 1.1.1.105 retinol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.110 indol-lactato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.112 indanol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.113 L-xilosa 1-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.129 L-treonato 3-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.137 ribitol-5-fosfato 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.138 manitol 2-deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.140 sorbitol-6-fosfato 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.142 D-pinitol deshidrogenasa ec: 1.1.1.143 secuoyitol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.144 perilil-alcohol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.156 glicerol 2-deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.1.1.157 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa
ec: 1.1.1.163 ciclopentanol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.164 hexadecanol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.165 2-alquin-1-ol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.166 hidroxiciclohexanocarboxilato
deshidrogenasa
ec: 1.1.1.167 hidroximalonato deshidrogenasa ec: 1.1.1.174 ciclohexano-1,2-diol deshidrogenasa ec: 1.1.1.177 glicerol-3-fosfato 1-deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.2.1.5 aldehfdo deshidrogenasa [NAD(P)+]
ec: 1.2.1.7 benzaldehfdo deshidrogenasa [NAD(P)+] ec: 1.2.1.8 betarna-aldehndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.9 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.2.1.10 acetaldehfdo deshidrogenasa (acetilante) ec: 1.2.1.11 aspartato-semialdel'ndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.12 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (fosforilante)
ec: 1.2.1.13 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+) (fosforilante)
ec: 1.2.1.15 malonato-semialdel'ndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.16 succinato-semialdel'ndo deshidrogenasa [NAD(P)+]
ec: 1.2.1.17 glioxilato deshidrogenasa (acilante)
ec: 1.2.1.18 malonato-semialdel'ndo deshidrogenasa
(acetilante)
ec: 1.2.1.19 aminobutiraldehndo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.20 glutarato-semialdel'ndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.21 glicolaldehndo deshidrogenasa
ec: 1.1.1.226 4-hidroxiciclohexanocarboxilato
deshidrogenasa
ec: 1.1.1.229 2-metil-3-oxosuccinato de dietilo reductasa
ec: 1.1.1.237 hidroxifenilpiruvato reductasa ec: 1.1.1.244 metanol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.245 ciclohexanol deshidrogenasa ec: 1.1.1.250 D-arabinitol 2-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.251 galactitol 1-fosfato 5-deshidrogenasa
ec: 1.1.1.255 manitol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.256 fluoren-9-ol deshidrogenasa
ec: 1.1.1.257 4-(hidroximetil)bencenosulfonato
deshidrogenasa
ec: 1.1.1.258 6-hidroxihexanoato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.259 3-hidroxipimeloil-CoA deshidrogenasa ec: 1.1.1.261 glicerol-1-fosfato deshidrogenasa
[NAD(P)+]
ec: 1.1.1.265 3-metilbutanal reductasa
ec: 1.1.1.283 metilglioxal reductasa (dependiente de
NADPH)
ec: 1.1.1.286 isocitrato-homoisocitrato deshidrogenasa
ec: 1.1.1.287 D-arabinitol deshidrogenasa (NADP+)
butanol deshidrogenasa
ALDEHDO DESHIDROGENASAS
ec: 1.2.1.2 formiato deshidrogenasa
ec: 1.2.1.3 aldehfdo deshidrogenasa (NAD+)
ec: 1.2.1.4 aldehfdo deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.2.1.45 4-carboxi-2-hidroximuconato-6-
semialdetndo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.46 formaldetndo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.47 4-trimetilamoniobutiraldel'ndo
deshidrogenasa
ec: 1.2.1.48 aldehfdo de cadena larga deshidrogenasa ec: 1.2.1.49 2-oxoaldetndo deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.2.1.51 piruvato deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.2.1.52 oxoglutarato deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.2.1.53 4-hidroxifenilacetaldetndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.57 butanal deshidrogenasa ec: 1.2.1.58 fenilglioxilato deshidrogenasa (acilante)
ec: 1.2.1.22 lactaldehfdo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.23 2-oxoaldetndo deshidrogenasa (NAD+)
ec: 1.2.1.24 succinato-semialdehndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.25 2-oxoisovalerato deshidrogenasa
(acilante)
ec: 1.2.1.26 2,5-dioxovalerato deshidrogenasa
ec: 1.2.1.27 metilmalonato-semialdehndo
deshidrogenasa (acilante)
ec: 1.2.1.28 benzaldehndo deshidrogenasa (NAD+) ec: 1.2.1.29 aril-aldehndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.30 aril-aldehndo deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.2.1.31 L-aminoadipato-semialdehndo
deshidrogenasa
ec: 1.2.1.32 aminomuconato-semialdehndo
deshidrogenasa
ec: 1.2.1.36 retinal deshidrogenasa
ec: 1.2.1.39 fenilacetaldehndo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.41 glutamato-5-semialdehndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.42 hexadecanal deshidrogenasa (acilante)
ec: 1.2.1.43 formiato deshidrogenasa (NADP+)
ec: 1.2.1.59 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (NAD(P)+) (fosforilante)
ec: 1.2.1.62 4-formilbencenosulfonato deshidrogenasa ec: 1.2.1.63 6-oxohexanoato deshidrogenasa
ec: 1.2.1.64 4-hidroxibenzaldehndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.65 salicilaldehndo deshidrogenasa ec: 1.2.1.66 formaldetndo deshidrogenasa dependiente de micotiol
ec: 1.2.1.67 vanilina deshidrogenasa
ec: 1.2.1.68 coniferil-aldehndo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.69 fluoroacetaldehndo deshidrogenasa
ec: 1.2.1.71 succinilglutamato-semialdehndo
deshidrogenasa
Tambien pueden emplearse rutas distintas de las mostradas a modo de ejemplo anteriormente para generar la biosmtesis de BDO en organismos microbianos que no se producen de manera natural. En una realizacion, puede lograrse la biosmtesis usando una ruta de L-homoserina a BDO. Esta ruta tiene un rendimiento molar de 5 0,90 mol/mol de glucosa, que parece limitado por la disponibilidad de equivalentes reductores. Una segunda ruta
sintetiza BDO a partir de acetoacetato y puede lograr un rendimiento teorico maximo de 1,091 mol/mol de glucosa. Puede lograrse la implementacion de cualquier ruta mediante la introduccion de dos enzimas exogenas, y ambas rutas pueden complementar adicionalmente la produccion de BDO por medio de succinil-CoA. A continuacion se describen adicionalmente las enzimas, termodinamica, rendimientos teoricos y viabilidad global de las rutas.
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Tambien puede disenarse por ingeniena genetica una ruta de homoserina para generar organismos microbianos productores de BDO. La homoserina es un producto intermedio en el metabolismo de treonina y metionina, formada a partir de oxaloacetato por medio de aspartato. La conversion de oxaloacetato en homoserina requiere un NADH, dos NADPH y un ATP (figura 3). Una vez formada, se alimenta la homoserina a rutas biosinteticas tanto para 15 treonina como para metionina. En la mayona de los organismos, altos niveles de treonina o metionina se retroalimentan para reprimir la ruta de biosmtesis de homoserina (Caspi et al., Nucleic Acids Res. 34: D511-D516 (1990)).
La transformacion de homoserina en 4-hidroxibutirato (4-HB) puede lograrse en dos etapas enzimaticas tal como se 20 muestra en la figura 4. La primera etapa de esta ruta es la desaminacion de homoserina mediante una supuesta amoniaco liasa. Esta reaccion tiene una barrera termodinamica estimada de 12 kJ/mol, pero probablemente puede impulsarse en sentido directo mediante un gradiente de concentracion. En la etapa 2, se reduce el producto alqueno,
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4-hidroxibut-2-enoato, para dar 4-HB mediante una supuesta reductasa a costa de un NADH. Esta etapa de reaccion es altamente favorable desde el punto de vista termodinamico en el sentido de la smtesis de 4-HB, con una A^G estimada de -59 kJ/mol. Entonces puede convertirse 4-HB en BDO como en la figura 2 anterior.
En la figura 5 se muestran enzimas disponibles para catalizar las transformaciones anteriores. Por ejemplo, la amoniaco liasa en la etapa 1 de la ruta se parece estrechamente a la qmmica de aspartato amoniaco liasa (aspartasa). La aspartasa es una enzima generalizada en microorganismos, y se ha caracterizado extensamente (Viola, R.E., Mol. Biol. 74:295-341 (2008)). La estructura cristalina de la aspartasa de E. coli se ha resuelto (Shi et al., Biochemistry 36:9136-9144 (1997)), por tanto es posible disenar directamente por ingeniena genetica mutaciones en el sitio activo de la enzima que alteraran su especificidad de sustrato para incluir homoserina. La oxidorreductasa en la etapa 2 tiene una qmmica similar a varias enzimas bien caracterizadas incluyendo fumarato reductasa en el ciclo de TCA de E. coli. Dado que la termodinamica de esta reaccion es altamente favorable, es probable que una reductasa endogena con una amplia especificidad de sustrato pueda reducir 4-hidroxibut-2- enoato. El rendimiento de esta ruta en condiciones anaerobias es de 0,9 mol de BDO por mol de glucosa aunque, en comparacion con la ruta en la figura 2 (1,09 mol/mol de glucosa), ambas rutas parecen tener requisitos energeticos y reductores similares a partir del precursor metabolico oxaloacetato (figura 6).
Se encontro que la ruta de succinil-CoA tema un rendimiento superior debido al hecho de que es energeticamente mas eficaz. La conversion de una molecula de oxaloacetato en BDO por medio de la ruta de homoserina requerira el gasto de 2 equivalentes de ATP. Dado que la conversion de glucosa en dos moleculas de oxaloacetato puede generar un maximo de 3 moleculas de ATP suponiendo que la PEP carboxicinasa es reversible, la conversion global de glucosa en BDO por medio de homoserina tiene un rendimiento energetico negativo. Tal como se esperaba, si se supone que puede generarse energfa mediante la respiracion, el rendimiento maximo de la ruta de homoserina aumenta hasta 1,05 mol/mol de glucosa, lo cual es el 96% del rendimiento de la ruta de succinil-CoA. La ruta de succinil-CoA puede canalizar parte del flujo de carbono a traves de piruvato deshidrogenasa y la rama oxidativa del ciclo de TCA para generar tanto equivalentes reductores como succinil-CoA sin un gasto energetico. Por tanto, no encuentra las mismas dificultades energeticas que la ruta de homoserina porque no se canaliza todo el flujo a traves de oxaloacetato para dar succinil-CoA para dar BDO. En conjunto, la ruta de homoserina demuestra una ruta de rendimiento moderadamente alto para dar BDO. Una caractenstica particularmente util es que implica un diseno por ingeniena genetica mmimo, con solo dos etapas no nativas. Es probable que la ruta sea termodinamicamente favorable en el sentido de la smtesis de BDO.
Tambien puede disenarse por ingeniena genetica una ruta de acetoacetato para generar organismos microbianos productores de BDO. En E. coli se produce acetoacetato a partir de la degradacion de acetona y leucina. Tambien puede formarse acetoacetato a partir de acetil-CoA mediante enzimas implicadas en el metabolismo de acidos grasos, incluyendo acetil-CoA acetiltransferasa y acetoacetil-CoA transferasa (figura 7). Las rutas biosinteticas a traves de acetoacetato tambien son particularmente utiles en organismos microbianos que pueden metabolizar compuestos de carbono individuales para formar acetil-CoA.
Puede usarse una ruta de tres etapas a partir de acetoacetato para dar semialdehudo succmico (figura 8) para sintetizar BDO a traves de acetoacetato. Puede convertirse semialdetudo succmico, que esta separado por una etapa de reduccion de succinil-CoA o separado por una etapa de descarboxilacion de a-cetoglutarato, en BDO siguiendo tres etapas de reduccion (figura 2). En resumen, la etapa 1 de la biorruta de acetoacetato conlleva la conversion de acetoacetato en 3-aminobutanoato mediante una o-aminotransferasa. Se sobreexpreso la o- aminoacido:piruvato aminotransferasa (o-APT) de Alcaligens denitrificans en E. coli y se mostro que tema una alta actividad hacia 3-aminobutanoato in vitro (Yun et al., Appl. Environ. Microbiol. 70:2529-2534 (2004)). En este estudio no se midio la actividad de o-APT en el sentido requerido en este caso, debido a la descomposicion espontanea de acetoacetato para dar acetona en la mezcla de reaccion. Sin embargo, la termodinamica indica que es viable.
En la etapa 2, una supuesta aminomutasa desplaza el grupo amina de la posicion 3 a la 4 del esqueleto de carbono. No se ha caracterizado una aminomutasa que realiza esta funcion sobre 3-aminobutanoato, pero una enzima de Clostridium sticklandii tiene un mecanismo muy similar (figura 9). La enzima, D-lisina-5,6-aminomutasa, esta implicada en la biosmtesis de lisina.
La ruta sintetica para dar BDO a partir de acetoacetato pasa a traves de 4-aminobutanoato, un metabolito en E. coli que se forma normalmente a partir de la descarboxilacion de glutamato. Una vez formado, puede convertirse 4- aminobutanoato en semialdetudo succmico mediante 4-aminobutanoato transaminasa (2.6.1.19), una enzima que se ha caracterizado bioqmmicamente. La termodinamica de esta enzima y otras etapas de la ruta esta proxima al equilibrio, de modo que es probable que el funcionamiento de enzimas en el sentido de interes se impulse mediante concentraciones de sustrato y producto
Una consideracion para seleccionar enzimas candidatas en esta ruta es la estereoselectividad de las enzimas implicadas en las dos primeras etapas. La o-ABT en Alcaligens denitrificans es espedfica para el estereoisomero L de 3-aminobutanoato, mientras que D-lisina-5,6-aminomutasa requiere probablemente el estereoisomero D. Si no pueden encontrarse o disenarse por ingeniena genetica enzimas con estereoselectividad complementaria, sera
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necesario anadir una tercera enzima a la ruta con actividad racemasa que puede convertir L-3-aminobutanoato en D-3-aminobutanoato. Aunque las aminoacido racemasas estan generalizadas, se desconoce si estas enzimas pueden funcionar con ro-aminoacidos.
El rendimiento molar teorico maximo de esta ruta en condiciones anaerobias es de 1,091 mol/mol de glucosa. Con el fin de generar flujo a partir de acetoacetato para dar BDO era necesario suponer que la acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferasa (enzima 3 en la figura 10) es reversible. La funcion de esta enzima en E. coli es metabolizar acidos grasos de cadena corta convirtiendolos en primer lugar en tioesteres.
Aunque no se ha demostrado experimentalmente el funcionamiento de acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferasa en el sentido de consumo de acetato en E. coli, estudios con enzimas similares en otros organismos respaldan la suposicion de que esta reaccion es reversible. La enzima butiril-CoA:acetato:CoA transferasa en los microbios intestinales Roseburia sp. y F. prasnitzii funciona en el sentido de uso de acetato para producir butirato (Duncan et al., Appl. Environ. Microbiol 68:5186-5190 (2002)). Otra enzima muy similar, acetil:succinato CoA-transferasa en Trypanosoma brucei, tambien funciona en el sentido de uso de acetato. Esta reaccion tiene una A^G proxima al equilibrio, de modo que es probable que altas concentraciones de acetato puedan impulsar la reaccion en el sentido de interes. A la tasa de produccion de BDO teorica maxima de 1,09 mol/mol de glucosa, las simulaciones predicen que E. coli puede generar 1,098 mol de ATP por mol de glucosa sin subproductos de fermentacion. Este rendimiento de ATP debe ser suficiente para el crecimiento celular, el mantenimiento y la produccion. La biorruta de acetoacetato es una ruta de alto rendimiento para dar BDO a partir de acetil-CoA. Como la ruta de homoserina, esta ruta requiere una minima modificacion por ingeniena genetica de la cepa, con tan solo dos etapas no nativas ademas de la ruta de BDO.
Por tanto, ademas de cualquiera de las diversas modificaciones mostradas a modo de ejemplo anteriormente para establecer la biosmtesis de 4-HB en un huesped seleccionado, los organismos microbianos productores de BDO pueden incluir cualquiera de las combinaciones y permutaciones anteriores de modificaciones metabolicas de la ruta de 4-HB asf como cualquier combinacion de expresion para aldehndo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA o una alcohol deshidrogenasa para generar rutas biosinteticas para GBL y/o BDO. Por tanto, los productores de BDO descritos en el presente documento pueden tener expresion exogena, por ejemplo, de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o las 10 enzimas correspondientes a cualquiera de las seis enzimas de la ruta de 4-HB y/o cualquiera de las 4 de la ruta de BDO.
El diseno y la construccion de organismos microbianos modificados geneticamente se lleva a cabo usando metodos bien conocidos en la tecnica para lograr cantidades suficientes de expresion para producir BDO. En particular, los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion pueden lograr la biosmtesis de BDO dando como resultado concentraciones intracelulares de entre aproximadamente 0,1-25 mM o mas. Generalmente, la concentracion intracelular de BDO es de entre aproximadamente 3-20 mM, particularmente entre aproximadamente 5-15 mM y mas particularmente entre aproximadamente 8-12 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM o mas. Tambien pueden lograrse concentraciones intracelulares entre y por encima de cada uno de estos intervalos a modo de ejemplo a partir de los organismos microbianos que no se producen de manera natural de la invencion. Como con los productores de 4-HB, los productores de BDO tambien pueden sustentarse, cultivarse o fermentarse en condiciones anaerobias.
La descripcion proporciona ademas un metodo para la produccion de 4-HB. El metodo incluye cultivar un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehfdo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, a-cetoglutarato descarboxilasa o glutamato descarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico (4-HB). El metodo puede incluir adicionalmente la conversion qmmica de 4-HB en GBL y en BDO o THF, por ejemplo.
Se proporciona adicionalmente un metodo para la produccion de 4-HB. El metodo incluye cultivar un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que incluye al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir acido 4- hidroxibutanoico monomerico (4-HB). El producto de 4-HB puede secretarse al medio de cultivo.
Ademas se proporciona un metodo para la produccion de BDO. El metodo incluye cultivar un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural, que comprende un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), incluyendo las rutas al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-hidroxibutirato cinasa, fosfotranshidroxibutirilasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una
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aldetudo/alcohol deshidrogenasa durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO). El producto de BDO puede secretarse al medio de cultivo.
Se entiende que, en metodos de la invencion, cualquiera del uno o mas acidos nucleicos exogenos puede introducirse en un organismo microbiano para producir un organismo microbiano que no se produce de manera natural de la invencion. Los acidos nucleicos pueden introducirse para conferir, por ejemplo, una ruta biosintetica de 4-HB, BDO, THF o GBL en el organismo microbiano. Alternativamente, pueden introducirse acidos nucleicos codificantes para producir un organismo microbiano intermedio que tiene la capacidad biosintetica para catalizar algunas de las reacciones requeridas para conferir capacidad biosintetica de 4-HB, BDO, THF o GBL. Por ejemplo, un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintetica de 4-HB puede comprender al menos dos acidos nucleicos exogenos que codifican para enzimas deseadas, tales como la combinacion de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y a-cetoglutarato descarboxilasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y semialdetudo succmico deshidrogenasa independiente de CoA; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA; semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y succinil-CoA sintetasa; succinil-CoA sintetasa y glutamato descarboxilasa, y similares. Por tanto, se entiende que puede incluirse cualquier combinacion de dos o mas enzimas de una ruta biosintetica en un organismo microbiano que no se produce de manera natural descrito en el presente documento. De manera similar, se entiende que puede incluirse cualquier combinacion de tres o mas enzimas de una ruta biosintetica en un organismo microbiano que no se produce de manera natural descrito en el presente documento, por ejemplo, 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, a-cetoglutarato descarboxilasa y semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA; semialdetudo succmico deshidrogenasa independiente de CoA y succinil-CoA sintetasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y glutamato:semialdetndo succmico transaminasa, y asf sucesivamente, segun se desee, siempre que la combinacion de enzimas de la ruta biosintetica deseada de como resultado la produccion del producto deseado correspondiente.
De manera similar, por ejemplo, con respecto a uno cualquiera o mas acidos nucleicos exogenos introducidos para conferir produccion de BDO, un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintetica de BDO puede comprender al menos dos acidos nucleicos exogenos que codifican para enzimas deseadas, tales como la combinacion de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y a-cetoglutarato descarboxilasa; 4- hidroxibutanoato deshidrogenasa y 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y butirato cinasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y fosfotransbutirilasa; 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa y aldehfdo deshidrogenasa; 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa y alcohol deshidrogenasa; 4-hidroxibutiril- CoA:acetil-CoA transferasa y una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa, y similares. Por tanto, se entiende que puede incluirse cualquier combinacion de dos o mas enzimas de una ruta biosintetica en un organismo microbiano que no se produce de manera natural de la invencion. De manera similar, se entiende que puede incluirse cualquier combinacion de tres o mas enzimas de una ruta biosintetica en un organismo microbiano que no se produce de manera natural de la invencion, por ejemplo, 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, a-cetoglutarato descarboxilasa y 4- hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, butirato cinasa y fosfotransbutirilasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa y aldehfdo deshidrogenasa; 4- hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa, aldehfdo deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa; butirato cinasa, fosfotransbutirilasa y una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa, y similares. De manera similar, puede incluirse cualquier combinacion de cuatro, cinco o mas enzimas de una ruta biosintetica tal como se da a conocer en el presente documento en un organismo microbiano que no se produce de manera natural de la invencion, segun se desee, siempre que la combinacion de enzimas de la ruta biosintetica deseada de como resultado la produccion del producto deseado correspondiente.
Cualquiera de los organismos microbianos que no se producen de manera natural descritos anteriormente puede cultivarse para producir y/o secretar los productos biosinteticos descritos en el presente documento. Los productores de BDO pueden cultivarse para la produccion biosintetica de BDO. El BDO puede aislarse o someterse a tratamientos adicionales para la smtesis qrnmica de compuestos de la familia de BDO tales como los compuestos posteriores mostrados a modo de ejemplo en la figura 1.
El medio de crecimiento puede ser, por ejemplo, cualquier fuente de hidratos de carbono que pueda suministrar una fuente de carbono al microorganismo que no se produce de manera natural. Tales fuentes incluyen, por ejemplo, azucares tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, fructosa y almidon. Otras fuentes de hidratos de carbono incluyen, por ejemplo, materias primas renovables y biomasa. Los tipos a modo de ejemplo de biomasas que pueden usarse como materias primas en los metodos de la invencion incluyen biomasa celulosica, biomasa hemicelulosica y materias primas de lignina o porciones de materias primas. Tales materias primas de biomasa contienen, por ejemplo, sustratos de hidratos de carbono utiles como fuentes de carbono tales como glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa, fructosa y almidon. Dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los expertos en la tecnica entenderan que tambien pueden usarse materias primas renovables y biomasa distintas de las mostradas a modo de ejemplo anteriormente para cultivar los organismos microbianos de la invencion para la produccion de 4-HB y otros compuestos de la invencion.
Por consiguiente, dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los expertos en la tecnica entenderan que puede producirse un organismo microbiano que no se produce de manera natural que
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secreta los compuestos biosintetizados cuando se hace crecer sobre una fuente de carbono tal como un hidrato de carbono. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, 4-HB, BDO y cualquiera de los metabolitos intermedios en la ruta de 4-HB, la ruta de BDO y/o las rutas combinadas de 4-HB y BDO. Lo unico que se requiere es modificar por ingeniena genetica una o mas de las actividades enzimaticas mostradas en la figura 2 para lograr la biosmtesis del compuesto o producto intermedio deseado incluyendo, por ejemplo, la inclusion de parte o la totalidad de las rutas biosinteticas de 4-HB y/o BDO. Por consiguiente, la invencion proporciona un organismo microbiano que no se produce de manera natural que secreta 4-HB cuando se hace crecer sobre un hidrato de carbono, secreta BDO cuando se hace crecer sobre un hidrato de carbono y/o secreta cualquiera de los metabolitos intermedios mostrados en la figura 2 cuando se hace crecer sobre un hidrato de carbono. Los organismos microbianos productores de BDO de la invencion pueden iniciar la smtesis, por ejemplo, a partir de succinato, succinil-CoA, a-cetoglutarato, semialdehndo succmico, 4-HB, 4-hidroxibutirilfosfato, 4-hidroxibutiril-CoA (4-HB-CoA) y/o 4-hidroxibutiraldetndo.
En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo incluyen condiciones de crecimiento o mantenimiento anaerobias o sustancialmente anaerobias. Anteriormente se han descrito condiciones anaerobias a modo de ejemplo y se conocen bien en la tecnica. A continuacion en los ejemplos se describen condiciones anaerobias a modo de ejemplo para procedimientos de fermentacion. Cualquiera de estas condiciones pueden emplearse con los organismos microbianos que no se producen de manera natural asf como otras condiciones anaerobias bien conocidas en la tecnica. En tales condiciones anaerobias, los productores de 4-HB y BDO pueden sintetizar 4-HB monomerico y BDO, respectivamente, a concentraciones intracelulares de 5-10 mM o mas asf como todas las demas concentraciones mostradas a modo de ejemplo anteriormente.
Tambien pueden generarse varios compuestos posteriores para los organismos microbianos que no se producen de manera natural productores de BDO de la invencion.
Los procedimientos de fermentacion son particularmente utiles para la produccion biosintetica de cantidades comerciales de 4-HB y/o BDO. Generalmente, y como con procedimientos de cultivo no continuos, la produccion continua y/o casi continua de BDO incluira cultivar un organismo productor de BDO que no se produce de manera natural de la invencion en medio y nutrientes suficientes para sustentar y/o casi sustentar el crecimiento en una fase exponencial. El cultivo continuo en tales condiciones puede incluir, por ejemplo, 1 dfa, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas o mas. Adicionalmente, el cultivo continuo puede incluir 1 semana, 2, 3, 4 o 5 o mas semanas y hasta varios meses. Alternativamente, pueden cultivarse organismos de la invencion durante horas, si es adecuado para una aplicacion particular. Debe entenderse que las condiciones de cultivo continuo y/o casi continuo tambien pueden incluir todos los intervalos de tiempo entre estos periodos a modo de ejemplo.
En la tecnica se conocen bien procedimientos de fermentacion. En resumen, la fermentacion para la produccion biosintetica de BDO puede usarse, por ejemplo, en la fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua, o fermentacion continua y separacion continua. Ejemplos de procedimientos de fermentacion discontinuos y continuos bien conocidos en la tecnica se muestran a modo de ejemplo a continuacion adicionalmente en los ejemplos.
Ademas de los procedimientos de fermentacion anteriores que usan los productores de BDO de la invencion para la produccion continua de cantidades sustanciales de BDO, respectivamente, de manera similar los productores de BDO pueden, por ejemplo, someterse simultaneamente a procedimientos de smtesis qmmica tal como se describio anteriormente para la conversion qmmica de BDO, por ejemplo, en THF, GBL, pirrolidonas y/u otros compuestos de la familia de BDO. Ademas, los productos de los productores de BDO pueden separarse del cultivo de fermentacion y someterse secuencialmente a conversion qmmica, tal como se da a conocer en el presente documento.
En resumen, la hidrogenacion de GBL en el caldo de fermentacion puede realizarse tal como se describe por Frost et al., Biotechnology Progress 18: 201-211 (2002). Otro procedimiento para la hidrogenacion durante la fermentacion incluye, por ejemplo, los metodos descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.478.952. Este metodo se muestra a modo de ejemplo adicionalmente en los siguientes ejemplos.
La descripcion proporciona adicionalmente un metodo de fabricacion de y-butirolactona (GBL), tetrahidrofurano (THF) o 1,4-butanodiol (BDO). El metodo incluye fermentar un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y/o 1,4-butanodiol (BDO), las rutas comprenden al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdetndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamatersemialdelmdo succmico transaminasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, glutamato descarboxilasa, 4-hidroxibutanoato cinasa, fosfotransbutirilasa, 1,4-butanodiol semialdehndo deshidrogenasa independiente de CoA, 1,4-butanodiol semialdehndo deshidrogenasa dependiente de CoA, 1,4-butanodiol alcohol deshidrogenasa independiente de CoA o 1,4-butanodiol alcohol deshidrogenasa dependiente de CoA, en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO), GBL o THF, comprendiendo la fermentacion fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua, o fermentacion continua y separacion continua.
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Ademas de la biosmtesis de BDO y otros productos tal como se describe en el presente documento, los organismos microbianos que no se producen de manera natural y metodos de la invencion tambien pueden usarse en diversas combinaciones entre sf y con otros organismos microbianos y metodos bien conocidos en la tecnica para lograr la biosmtesis de producto mediante otras rutas.
Un metodo computacional para identificar y disenar alteraciones metabolicas que favorecen la biosmtesis de un producto es el la infraestructura computacional OptKnock, Burgard et al., Biotechnol Bioeng, 84: 647-57 (2003). OptKnock es un programa de modelado y simulacion metabolicos que sugiere estrategias de delecion genica que dan como resultado microorganismos geneticamente estables que sobreproducen el producto objetivo. Espedficamente, la infraestructura examina la red metabolica y/o bioqmmica completa de un microorganismo con el fin de sugerir manipulaciones geneticas que fuerzan que el producto bioqmmico deseado se convierta en un subproducto obligatorio del crecimiento celular. Acoplando la produccion de producto bioqmmico con el crecimiento celular a traves de deleciones genicas estrategicamente colocadas u otra alteracion genica funcional, las presiones de seleccion de crecimiento impuestas sobre las cepas modificadas por ingeniena genetica tras largos periodos de tiempo en un biorreactor conducen a mejoras en el rendimiento como resultado de la produccion de producto bioqmmico obligatoria acoplada con el crecimiento. Por ultimo, cuando se construyen deleciones genicas hay una posibilidad despreciable de que las cepas disenadas vuelvan a sus estados de tipo natural porque los genes seleccionados por OptKnock se eliminan completamente del genoma. Por tanto, esta metodologfa computacional puede o bien usarse para identificar rutas alternativas que conducen a la biosmtesis de 4-HB y/o BDO o bien usarse en relacion con los organismos microbianos que no se producen de manera natural para la optimizacion adicional de la biosmtesis de 4-HB y/o BDO.
En resumen, OptKnock es un termino usado en el presente documento para hacer referencia a un metodo y sistema computacional para modelar el metabolismo celular. El programa OptKnock se refiere a una infraestructura de modelos y metodos que incorporan limitaciones particulares a modelos de analisis de equilibrio de flujos (FBA). Estas limitaciones incluyen, por ejemplo, informacion cinetica cualitativa, informacion reguladora cualitativa y/o datos experimentales de microalineamientos de ADN. OptKnock tambien calcula soluciones a diversos problemas metabolicos, por ejemplo, estrechando los lfmites de flujo derivados a traves de modelos de equilibrio de flujos y posteriormente investigando los lfmites de rendimiento de redes metabolicas en presencia de adiciones o deleciones genicas. La infraestructura computacional OptKnock permite la construccion de formulaciones de modelo que permiten una consulta eficaz de los lfmites de rendimiento de redes metabolicas y proporciona metodos para solucionar los problemas de programacion lineal en enteros mixta resultantes. Los metodos de modelado y simulacion metabolicos denominados en el presente documento OptKnock se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 10/043.440, presentada el 10 de enero de 2002, y en la patente internacional n.° PCT/US02/00660, presentada el 10 de enero de 2002.
Otro metodo computacional para identificar y disenar alteraciones metabolicas que favorecen la produccion biosintetica de un producto es el sistema de modelado y simulacion metabolicos denominado SimPheny®. Este metodo y sistema computacional se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 10/173.547, presentada el 14 de junio de 2002, y en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US03/18838, presentada el 13 de junio de 2003.
SimPheny® es un sistema computacional que puede usarse para producir un modelo de red in silico y para simular el flujo de masa, energfa o carga a traves de las reacciones qmmicas de un sistema biologico para definir un espacio de solucion que limita todas y cada una de las posibles funcionalidades de las reacciones qmmicas en el sistema, determinando de ese modo un intervalo de actividades permitidas para el sistema biologico. Este enfoque se denomina modelado basado en limitaciones porque el espacio de solucion se define por limitaciones tales como la estequiometna conocida de las reacciones incluidas asf como limitaciones de capacidad y termodinamica de reaccion asociadas con flujos maximos a traves de las reacciones. Puede consultarse el espacio definido por estas limitaciones para determinar las capacidades fenotfpicas y el comportamiento del sistema biologico o de sus componentes bioqmmicos. Pueden usarse metodos de analisis tales como analisis convexo, programacion lineal y el calculo de rutas extremas tal como se describe, por ejemplo, en Schilling et al., J. Theor. Biol. 203:229-248 (2000); Schilling et al., Biotech. Bioeng. 71:286-306 (2000) y Schilling et al., Biotech. Prog. 15:288-295 (1999), para determinar tales capacidades fenotfpicas. Tal como se describe en los ejemplos a continuacion, esta metodologfa de computacion se uso para identificar y analizar las rutas biosinteticas de 4-HB viables asf como las optimas en organismos microbianos no productores de 4-HB.
Tal como se describio anteriormente, un metodo basado en limitaciones usado en los programas computacionales aplicables a la invencion es el analisis de equilibrio de flujos. El analisis de equilibrio de flujos se basa en equilibrar los flujos en una condicion de estado estacionario y puede realizarse tal como se describe, por ejemplo, en Varma y Palsson, Biotech. Bioeng. 12:994-998 (1994). Se han aplicado enfoques de equilibrio de flujos a redes de reaccion para simular o predecir propiedades sistemicas, por ejemplo, del metabolismo de adipocitos tal como se describe Fell y Small, J. Biochem. 138:781-786 (1986), la secrecion de acetato a partir de E. coli en condiciones de maximizacion de ATP tal como se describe en Majewski y Domach, Biotech. Bioeng. 35:732-738 (1990) o la secrecion de etanol por levadura tal como se describe en Vanrolleghem et al., Biotech. Prog. 12:434-448 (1996). Adicionalmente, este enfoque puede usarse para predecir o simular el crecimiento de E. coli en una variedad de
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fuentes de carbono individual asf como el metabolismo de H. influenzae tal como se describe en Edwards y Palsson, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5528-5533 (2000), Edwards y Palsson, J. Bio. Chem. 274:17410-17416 (1999) y Edwards et al., Nature Biotech. 19:125-130 (2001).
Una vez definido el espacio de solucion, puede analizarse para determinar posibles soluciones en diversas condiciones. Este enfoque computacional concuerda con realidades biologicas porque los sistemas biologicos son flexibles y pueden alcanzar el mismo resultado de muchas maneras diferentes. Los sistemas biologicos se disenan a traves de mecanismos evolutivos que se han limitado mediante limitaciones fundamentales a las que deben enfrentarse todos los sistemas vivos. Por tanto, la estrategia de modelado basado en limitaciones acepta estas realidades generales. Ademas, la capacidad para imponer continuamente restricciones adicionales en un modelo de red a traves del estrechamiento de limitaciones da como resultado una reduccion del tamano del espacio de solucion, potenciando de ese modo la precision con la que puede predecirse el rendimiento fisiologico o el fenotipo.
Dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los expertos en la tecnica podran aplicar diversas infraestructuras computacionales para el modelado y la simulacion metabolicos para disenar e implementar la biosmtesis de 4-HB, BDO, GBL, THF y otros compuestos de la familia de BDO en organismos microbianos huesped distintos de E. coli y levadura. Tales metodos de modelado y simulacion metabolicos incluyen, por ejemplo, los sistemas computacionales mostrados a modo de ejemplo anteriormente como SimPheny® y OptKnock. Para ilustracion de la invencion, se describen algunos metodos en el presente documento con referencia a la infraestructura computacional OptKnock para el modelado y la simulacion. Los expertos en la tecnica sabran como aplicar la identificacion, el diseno y la implementacion de las alteraciones metabolicas usando OptKnock a cualquiera de tales otros metodos e infraestructuras computacionales de modelado y simulacion metabolicos bien conocidos en la tecnica.
La capacidad de una celula o un organismo para producir de manera biosintetica un producto bioqmmico puede ilustrarse en el contexto de los lfmites de produccion de producto bioqmmico de una red metabolica tfpica calculada usando un modelo in silico. Estos lfmites se obtienen fijando la(s) tasa(s) de captacion del/de los sustrato(s) limitante(s) a su(s) valor(es) medido(s) experimentalmente y calculando las tasas maxima y minima de produccion de producto bioqmmico a cada nivel de crecimiento alcanzable.
La produccion de un producto bioqmmico deseado esta generalmente en competicion directa con la formacion de biomasa para recursos intracelulares. En estas circunstancias, tasas potenciadas de produccion de producto bioqmmico daran necesariamente como resultado tasas de crecimiento inferiores a la maxima. Las desactivaciones sugeridas por los programas de modelado y simulacion metabolicos anteriores tales como OptKnock se disenan para limitar los lfmites de solucion permisibles forzando un cambio en el comportamiento metabolico a partir de la cepa de tipo natural. Aunque los lfmites de solucion reales para una cepa dada se expandiran o se contraeran a medida que aumente(n) o disminuya(n) la(s) tasa(s) de captacion de sustrato, cada punto experimental se encontrara dentro de ese lfmite de solucion calculado. Graficos como estos permiten predicciones precisas de lo cerca que estan las cepas disenadas de sus lfmites de rendimiento, lo que tambien indica cuanto espacio queda disponible para mejoras.
La infraestructura matematica de OptKnock se muestra a modo de ejemplo en el presente documento para precisar deleciones genicas que conducen a la biosmtesis de producto y, particularmente, biosmtesis de producto acoplada con el crecimiento. El procedimiento se desarrolla sobre el modelado metabolico basado en limitaciones que estrecha el intervalo de fenotipos posibles que puede presentar un sistema celular a traves de la imposicion sucesiva de limitaciones fisicoqmmicas gobernantes, Price et al., Nat Rev Microbiol, 2: 886-97 (2004). Tal como se describio anteriormente, los modelos y las simulaciones basados en limitaciones se conocen bien en la tecnica y generalmente invocan la optimizacion de un objetivo celular particular, sujeto a la estequiometna de la red, para sugerir una distribucion de flujos probable.
En resumen, la maximizacion de un objetivo celular cuantificado como un flujo de reaccion agregado para una red metabolica en estado estacionario que comprende u conjunto N = {1,..., N} de metabolitos y un conjunto M = {1,..., M} de reacciones metabolicas se expresa matematicamente de la siguiente manera:
maximizar vobjetivo celular
M
someter a
Z j =0
V i e N
j=i
vsustrato = vcaptacion_sustrato mm°l/gD^V'h
V i e {sustrato(s) limitante(s)}
Vatp ^ Vmant_atp mmol/gDW h
Vj > 0
V j e {reacciones irrev.}
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en donde Sj es el coeficiente estequiometrico del metabolite i en la reaccion j, Vj es el flujo de la reaccion j, Vcaptacion_sustrato representa la(s) tasa(s) de captacion supuesta(s) o medida(s) del/de los sustrato(s) limitante(s) y Vmant_atp es el requisite de mantenimiento de ATP no asociado con el crecimiento. El vector v incluye flujos tanto internos como externos. En este estudio, con frecuencia se supone que el objetivo celular es un consumo de precursores biosinteticos en las razones requeridas para la formacion de biomasa, Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2a ed. 1996, Washington, D.C.: ASM Press. 2 v. (xx, 2822, lxxvi). Los flujos se notifican generalmente por 1 gDWh (gramo de peso en seco por hora) de tal manera que la formacion de biomasa se expresa como g de biomasa producida/gDWh o l/h.
El modelado de deleciones genicas, y por tanto la eliminacion de reaccion, emplea en primer lugar la incorporacion de variables binarias en la infraestructura de enfoque basado en limitaciones, Burgard et al., Biotechnol Bioeng, 74: 364-375 (2001), Burgard et al., Biotechnol Prog, 17: 791-797 (2001). Estas variables binarias,
fl, si el flujo de reaccion v. es activo y =< , V jeM
10, si el flujo de reaccion vj no es activo
asumen un valor de 1 si la reaccion j es activa y un valor de 0 si es inactiva. La siguiente limitacion,
• yj < vj <v
max
j
y,, V j e M
min
v
garantiza que el flujo de reaccion Vj solo se fija a cero si la variable yj es igual a cero. Alternativamente, cuando yj es igual a uno, Vj es libre de asumir cualquier valor entre un lfmite inferior v™in y uno superior vjax. En este caso,
v;min y vjax se identifican minimizando y maximizando, respectivamente, cada flujo de reaccion sujeto a las limitaciones de red descritas anteriormente, Mahadevan et al., Metab Eng, 5: 264-76 (2003).
Se identifican desactivaciones genicas/de reaccion optimas resolviendo un problema de optimizacion de dos niveles que elige el conjunto de reacciones activas (yj = 1) de tal manera que una solucion de crecimiento optima para la red resultante sobreproduce el producto qmmico de interes. Matematicamente, este problema de optimizacion de dos niveles se expresa como el siguiente problema de optimizacion en enteros mixta de dos niveles:
maximizar
Vproducto_quimico
(OptKnock)
yj
(
someter a
maximizar
biomasa
\
v.
V
someter a
M
Z S,Vj =
,=1
v
sustrato
=v
captacion _ sustrato
V i e N
V i e {sustrato(s) limitante( s)}
v
atp
> v
mant _ atp
y
v > v^™
biomasa biomasa
• y < v. < vma • y.,
j j j j
min
v
V j e M
Z o - yj)=K
jeMdirecta
y} V j eM
en donde Vpmducto_quimico es la produccion del producto objetivo deseado, por ejemplo succinato u otro producto
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bioqmmico, y K es el numero de desactivaciones permisibles. Observese que fijar K igual a cero devuelve la solucion de biomasa maxima de la red completa, mientras que fijar K igual a uno identifica la desactivacion genica/de reaccion individual (y = 0) de tal manera que la red resultante implica la sobreproduccion maxima dado su rendimiento de biomasa maximo. La limitacion final garantiza que la red resultante cumple con un rendimiento de biomasa mmimo. Burgard et al., Biotechnol Bioeng, 84: 647-57 (2003), proporcionan una descripcion mas detallada del procedimiento de formulacion y solucion de modelos. Pueden solucionarse problemas que contienen cientos de variables binarias en cuestion de minutos a horas usando CPLEX 8,0, GAMS: The Solver Manuals. 2003: GAMS Development Corporation, al que se accede a traves de GAMS, Brooke et al., GAMS Development Corporation (1998), entorno de modelado en una estacion de trabajo IBM RS6000-270. La infraestructura OptKnock ya ha podido identificar estrategias de delecion genica prometedoras para la sobreproduccion de producto bioqmmico, Burgard et al., Biotechnol Bioeng, 84: 647-57 (2003), Pharkya et al., Biotechnol Bioeng, 84: 887-899 (2003), y establece una infraestructura sistematica que abarcara naturalmente futuras mejoras de infraestructuras de modelado metabolico y regulador.
Cualquier solucion del problema de OptKnock de dos niveles descrito anteriormente proporcionara un conjunto de reacciones metabolicas para alterar. La eliminacion de cada reaccion dentro del conjunto o la modificacion metabolica puede dar como resultado 4-HB o BDO como producto obligatorio durante la fase de crecimiento del organismo. Dado que se conocen las reacciones, una solucion del problema de OptKnock de dos niveles tambien proporcionara el gen o los genes asociados que codifican para una o mas enzimas que catalizan cada reaccion dentro del conjunto de reacciones. La identificacion de un conjunto de reacciones y sus correspondientes genes que codifican para las enzimas que participan en cada reaccion es generalmente un procedimiento automatizado, logrado a traves de correlacion de las reacciones con una base de datos de reacciones que tiene una relacion entre enzimas y genes codificantes.
Una vez identificado, el conjunto de reacciones que deben alterarse con el fin de lograr la produccion de 4-HB o BDO se implementa en la celula o el organismo diana mediante alteracion funcional de al menos un gen que codifica para cada reaccion metabolica dentro del conjunto. Un medio particularmente util para lograr la alteracion funcional del conjunto de reacciones es mediante delecion de cada gen codificante. Sin embargo, en algunos casos, puede ser beneficioso alterar la reaccion mediante otras aberraciones geneticas incluyendo, por ejemplo, mutacion, delecion de regiones reguladoras tales como promotores o sitios de union en cis para factores reguladores, o mediante truncamiento de la secuencia codificante en cualquiera de varias ubicaciones. Estas ultimas aberraciones, que dan como resultado menos que la delecion total del conjunto de genes pueden ser utiles, por ejemplo, cuando se desean evaluaciones rapidas del acoplamiento de succinato o cuando es menos probable que se produzca reversion genetica.
Para identificar soluciones productivas adicionales al problema de OptKnock de dos niveles descrito anteriormente que conducen a conjuntos adicionales de reacciones para alterar o modificaciones metabolicas que pueden dar como resultado la biosmtesis, incluyendo la biosmtesis acoplada con el crecimiento de 4-HB u otro producto bioqmmico, puede implementarse un metodo de optimizacion, denominado cortes en enteros. Este metodo avanza resolviendo de manera iterativa el problema de OptKnock mostrado a modo de ejemplo anteriormente con la incorporacion de una limitacion adicional denominada corte en enteros en cada iteracion. Las limitaciones de corte en enteros impiden eficazmente que el procedimiento de solucion escoja exactamente el mismo conjunto de reacciones identificado en una iteracion anterior que obligatoriamente acopla la biosmtesis de producto con el crecimiento. Por ejemplo, si una modificacion metabolica acoplada con el crecimiento anteriormente identificada especifica las reacciones 1, 2 y 3 para su alteracion, entonces la siguiente limitacion impide que se consideren simultaneamente las mismas reacciones en soluciones posteriores: yi + y2 + y3 ^ 1. El metodo de corte en enteros se conoce bien en la tecnica en la tecnica y puede encontrarse descrito, por ejemplo, en la referencia Burgard et al., Biotechnol Prog, 17: 791-797 (2001). Como con todos los metodos descritos en el presente documento con referencia a su uso en combinacion con la infraestructura computacional OptKnock para el modelado y la simulacion metabolicos, el metodo de corte en enteros de reduccion de la redundancia en analisis computacional iterativo tambien puede aplicarse con otras infraestructuras computacionales bien conocidas en la tecnica incluyendo, por ejemplo, SimPheny®.
Las limitaciones de la forma anterior excluyen la identificacion de conjuntos de reacciones mayores que incluyen conjuntos anteriormente identificados. Por ejemplo, el empleo del metodo de optimizacion de corte en enteros anterior en una iteracion adicional excluira la identificacion de un conjunto de reacciones cuadruple que especifique las reacciones 1,2 y 3 para su alteracion ya que estas reacciones se identificaron anteriormente. Para garantizar la identificacion de todos los posibles conjuntos de reacciones que conducen a la produccion biosintetica de un producto, puede emplearse una modificacion del metodo de corte en enteros.
En resumen, el procedimiento de corte en enteros modificado comienza con la iteracion “cero” que calcula la produccion maxima del producto bioqmmico deseado a un crecimiento optimo para una red de tipo natural. Este calculo corresponde a una solucion de OptKnock con K igual a 0. A continuacion, se consideran desactivaciones individuales y se introducen los dos conjuntos de parametros, objalmacenartter y yalmacenarterj, para almacenar la funcion objetiva (vproducto_qwmico) y la informacion de activacion-desactivacion de reaccion (y), respectivamente, en cada iteracion, iter. Entonces se anaden sucesivamente las siguientes limitaciones a la formulacion de OptKnock en
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cada iteracion.
vpmducto_quimtCo ^ objalmacenariter +e-M • £jeyalmacena^__0y
En la ecuacion anterior, s y M son un numero pequeno y uno grande, respectivamente. En general, s puede fijarse a aproximadamente 0,01 y M puede fijarse a aproximadamente 1000. Sin embargo, tambien pueden usarse numeros mas pequenos y/o mas grandes que estos numeros. M garantiza que la limitacion solo puede ser vinculante para estrategias de desactivacion anteriormente identificadas, mientras que s garantiza que la adicion de desactivaciones a una estrategia anteriormente identificada debe conducir a un aumento de al menos s en la produccion de producto bioqmmico a crecimiento optimo. El enfoque pasa a deleciones dobles siempre que una estrategia de delecion individual no logre mejorar la cepa de tipo natural. Entonces se consideran deleciones triples cuando ninguna estrategia de delecion doble mejora la cepa de tipo natural, y asf sucesivamente. El resultado final es una lista clasificada, representada como la produccion de producto bioqmmico deseado a crecimiento optimo, de distintas estrategias de delecion que se diferencian unas de otras en al menos una desactivacion. Este procedimiento de optimizacion asf como la identificacion de una amplia variedad de conjuntos de reacciones que, cuando se alteran, conducen a la biosmtesis, incluyendo la produccion acoplada con el crecimiento, de un producto bioqmmico. Dadas las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los expertos en la tecnica entenderan que los metodos y disenos de modificacion por ingeniena genetica metabolica mostrados a modo de ejemplo en el presente documento son igualmente aplicables para identificar nuevas rutas biosinteticas y/o para el acoplamiento obligatorio del crecimiento de celulas o microorganismos con cualquier producto bioqmmico.
Los metodos mostrados a modo de ejemplo anteriormente e ilustrados adicionalmente en los ejemplos a continuacion permiten la construccion de celulas y organismos que producen de manera biosintetica, incluyendo la produccion de un producto bioqmmico objetivo acoplada obligatoriamente con el crecimiento de la celula u organismo modificado por ingeniena genetica para albergar las alteraciones geneticas identificadas. Con respecto a esto, se han identificado alteraciones metabolicas que dan como resultado la biosmtesis de 4-HB y 1,4-butanodiol. Las cepas de microorganismos construidas con las alteraciones metabolicas identificadas producen niveles elevados de 4-HB o BDO en comparacion con organismos microbianos sin modificar. Estas cepas pueden usarse de manera beneficiosa para la produccion comercial de 4-HB, BDO, THF y GBL, por ejemplo, en procedimientos de fermentacion continua sin someterse a las presiones de seleccion negativas.
Por tanto, los metodos computacionales descritos en el presente documento permiten la identificacion e implementacion de modificaciones metabolicas que se identifican mediante un metodo in silico seleccionado de OptKnock o SimPheny. El conjunto de modificaciones metabolicas puede incluir, por ejemplo, la adicion de una o mas enzimas de ruta biosintetica y/o la alteracion funcional de una o mas reacciones metabolicas incluyendo, por ejemplo, alteracion mediante delecion genica.
Se entiende que las modificaciones que no afectan sustancialmente a la actividad de las diversas realizaciones de esta invencion tambien se incluyen dentro de la definicion de la invencion proporcionada en el presente documento. Por consiguiente, se pretende que los siguientes ejemplos ilustren pero no limiten la presente invencion.
EJEMPLO I
Biosmtesis de acido 4-hidroxibutanoico
Este ejemplo describe las rutas bioqmmicas para la produccion de 4-HB.
Informes previos de la smtesis de 4-HB en microbios se han centrado en este compuesto como producto intermedio en la produccion del plastico biodegradable poli-hidroxialcanoato (PHA) (patente estadounidense n.° 6.117.658). El uso de copolfmeros de 4-HB/3-HB con respecto a polfmero de poli-3-hidroxibutirato (PHB) puede dar como resultado plastico que es menos fragil (Saito y Doi, Intl. J. Biol. Macromol. 16:99-104 (1994)). La produccion de 4-HB monomerico descrita en el presente documento es un procedimiento fundamentalmente distinto por varios motivos: (1) el producto se secreta, en contraposicion a PHA que se produce de manera intracelular y permanece en la celula; (2) para organismos que producen polfmeros de hidroxibutanoato, no se produce 4-HB libre, sino que mas bien la polihidroxialcanoato sintasa usa el derivado de coenzima A; (3) en el caso del polfmero, la formacion del producto granular cambia la termodinamica; y (4) el pH extracelular no es un problema para la produccion del polfmero, mientras que afectara si esta presente 4-HB en el estado de acido libre o base conjugada, y tambien al equilibrio entre 4-HB y GBL.
Puede producirse 4-HB en dos etapas de reduccion enzimatica a partir de succinato, un metabolito central del ciclo de TCA, con semialdehudo succmico como producto intermedio (figura 2). La primera de estas enzimas, semialdehido succmico deshidrogenasa, es nativa para muchos organismos incluyendo E. coli, en el que se han encontrado enzimas dependientes tanto de NADH como de NADPH (Donnelly y Cooper, Eur. J. Biochem. 113:555561 (1981); Donnelly y Cooper, J. Bacteriol. 145:1425-1427 (1981); Marek y Henson, J. Bacteriol. 170:991-994
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(1988)). Tambien hay pruebas que apoyan la actividad semialdehndo succmico deshidrogenasa en S. cerevisiae (Ramos et al., Eur. J. Biochem. 149:401-404 (1985)), y se ha identificado un gen supuesto mediante homolog^a de secuencia. Sin embargo, la mayona de los informes indican que esta enzima avanza en el sentido de smtesis de succinato, tal como se muestra en la figura 2 (Donnelly y Cooper, citado anteriormente; Lutke-Eversloh y Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett. 181:63-71 (1999)), participando en la ruta de degradacion de 4-HB y gamma- aminobutirato. El semialdehndo succmico tambien se produce de manera nativa por determinados organismos microbianos tales como E. coli a traves del producto intermedio del ciclo de TCA a-cetoglutarato por medio de la accion de dos enzimas: glutamato:semialdel'ndo succmico transaminasa y glutamato descarboxilasa. Una ruta alternativa, usada por el anaerobio obligado Clostridium kluyveri para degradar succinato, activa succinato para dar succinil-CoA, convirtiendo luego succinil-CoA en semialdehndo succmico usando una semialdelmdo succmico deshidrogenasa alternativa que se sabe que funciona en este sentido (Sohling y Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212:121-127 (1993)). Sin embargo, esta ruta tiene el coste energetico de que se requiere ATP para convertir succinato en succinil-CoA.
La segunda enzima de la ruta, 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, no es nativa para E. coli o levadura pero se encuentra en diversas bacterias tales como C. kluyveri y Ralstonia eutropha (Lutke-Eversloh y Steinbuchel, citado anteriormente; Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996); Valentin et al., Eur. J. Biochem. 227:43-60 (1995); Wolff y Kenealy, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)). Se sabe que estas enzimas son dependientes de NADH, aunque tambien existen formas dependientes de NADPH. Una ruta adicional para dar 4-HB a partir de alfa- cetoglutarato se demostro en E. coli dando como resultado la acumulacion de poli(acido 4-hidroxibutirico) (Song et al., Wei Sheng Wu Xue. Bao. 45:382-386 (2005)). La cepa recombinante requena la sobreexpresion de tres genes heterologos, PHA sintasa (R. eutropha), 4-hidroxibutirato deshidrogenasa (R. eutropha) y 4-hidroxibutirato:CoA transferasa (C. kluyveri), junto con dos genes de E. coli nativos: glutamato^emialdehndo succmico transaminasa y glutamato descarboxilasa. Las etapas 4 y 5 en la figura 2 pueden llevarse a cabo alternativamente mediante una alfa-cetoglutarato descarboxilasa tal como la identificada en Euglena gracilis (Shigeoka et al., Biochem. J. 282(Pt2):319-323 (1992); Shigeoka y Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991); Shigeoka y Nakano, Biochem J. 292(Pt 2):463-467 (1993)). Sin embargo, esta enzima no se ha aplicado previamente para tener un impacto en la produccion de 4-HB o polfmeros relacionados en ningun organismo.
La direccionalidad notificada de semialdehfdo succmico deshidrogenasa condujo a la investigacion de la termodinamica del metabolismo de 4-HB. Espedficamente, este estudio investigo si las reacciones implicadas en la conversion de succinato o succinil-CoA en 4-HB son favorables termodinamicamente o no (es decir, AGr < 0) en las condiciones fisiologicas tfpicas presentes en E. coli y S. cerevisiae. Se supuso que todas las reacciones de oxidacion/reduccion usaban NADH, aunque los resultados de la suposicion del uso de NADPH senan similares. Se calcularon las energfas libres de Gibbs convencionales de formacion (AG°) para cada compuesto en las rutas de succinato y succinil-CoA mostradas en la figura 2 basandose en el metodo de contribucion de grupos (Mavrovouniotis, M.L., J. Biol. Chem. 266:14440-14445 (1991)). Entonces se transformo cada energfa de Gibbs convencional de formacion con el fin de obtener un criterio de cambio espontaneo a presion, temperatura, pH y fuerza ionica especificados (Alberty, R.A., Biochem. Biophys. Acta 1207:1-11 (1994)) (ecuacion 1).
imagen1
En donde AGf° es la energfa de Gibbs convencional de formacion, Nh es el numero de atomos de hidrogeno en el compuesto, R es la constante de gases universal, T es constante a 298 K, z es la carga de la molecula al pH de interes, I es la fuerza ionica en M y B es una constante igual a 1,6 L0,5/mol0,5.
La ecuacion 1 revela que tanto el pH intracelular como la fuerza ionica desempenan un papel en la determinacion de la viabilidad termodinamica. Normalmente, el pH intracelular de las celulas esta muy bien regulado, incluso cuando hay grandes variaciones en el pH del cultivo. En la bibliograffa se ha notificado el pH intracelular tanto de E. coli como de S. cerevisiae. E. coli mantiene un pH intracelular de 7,4-7,7 durante condiciones de crecimiento tfpicas en tampones neutros, pero puede descender hasta 7,2 en medio a pH 6, e incluso llegar hasta tan solo 6,9 para un pH externo de 5 (Riondet et al., Biotechnology Tech. 11:735-738 (1997)). Sin embargo, el crecimiento de E. coli se ve gravemente inhibido a un pH externo por debajo de 6. El pH de las levaduras presenta mas variacion. Durante la fase de crecimiento exponencial, se ha medido que el pH interno de S. cerevisiae esta en el intervalo de 6,7-7,0 con un pH externo controlado a 5,0 (Dombek e Ingram, Appl. Environ. Microbiol. 53:1286-1291 (1987)). Por otro lado, en celulas en reposo el pH interno desciende hasta por debajo de 6 cuando el pH externo es de 6 o menos (Imai y Ohno, J. Biotechnol. 38:165-172 (1995)). Este analisis supone un pH intracelular de 7,4 para E. coli y 6,8 para S. cerevisiae. Tambien se supuso una fuerza ionica de 0,15 (Valenti et al., citado anteriormente).
Se calcularon las energfas de Gibbs transformadas de formacion en el estado convencional (pH = 7,0, I = 0) y en los estados fisiologicos de E. coli (pH = 7,4, I = 0,15) y S. cerevisiae (pH = 6,8, I = 0,15). Entonces se calcularon las energfas de Gibbs transformadas de reaccion (AGr') tomando la diferencia en AGf' entre los productos y los
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reactivos. Las energfas de Gibbs transformadas de las reacciones necesarias para convertir succinato o succinil- CoA en 4-HB se proporcionan en la tabla 2. Aunque algunas de las etapas tienen valores de delta G positivos calculados, los errores estandar de estos calculos y gradientes de concentracion indican que cualquiera de las etapas es viable. Observese que el error estandar, Uf,est, en AGf calculado mediante la teona de contribucion de grupos es de 4 kcal/mol. La incertidumbre en AGr, Ur,est, puede calcularse como la norma euclidiana de la incertidumbre para AGf de cada compuesto (ecuacion).
imagen2
En donde n es el coeficiente estequiometrico e i es el compuesto. Para las reacciones examinadas, esta incertidumbre es del orden de 8 kcal/mol.
Tabla 2. Energfa libre de Gibbs de reaccion (kcal/mol) a valores de pH y fuerza ionica diferentes. La primera columna es en condiciones convencionales, mientras que las otras se ajustan segun la ecuacion 1. La temperatura es constante a 298 K. Las barras de error para estos valores son del orden de 8 kcal/mol, tal como se calcula mediante la ecuacion 2. Abreviaturas: suc, succinato, sucsa, semialdetdo succmico; succoa, succinil-CoA; Pi, fosfato inorganico.
Reaccion
AG°' AGr AGr
pH = 7,0 IS = 0 pH=7,4 IS = 0,15 M pH = 6,8 IS = 0,15 M
succ + NADH + 2 H+ ^ sucsa + NAD + h2o
12,0 14,4 12,8
succ + coa + ATP ^ succoa + ADP + Pi
0,30 -0,03 -0,03
succoa + NADH + H+ ^ sucsa + NAD + coa
4,4 7,0 6,2
sucsa + NADH + H+ ^ 4-HB + NAD
-5,0 -3,8 -4,6
La tabla 2 revela que la reaccion que es mas probable que encuentre una barrera termodinamica tras considerar la posible incertidumbre en los calculos es la semialdetndo succmico deshidrogenasa (etapa 1 en la figura 2). Tambien se estudio si esta reaccion puede impulsarse mas cerca de la viabilidad termodinamica variando las concentraciones supuestas de los metabolitos participates. Por ejemplo, las energfas de Gibbs convencionales suponen concentraciones de 1 M para todos los compuestos participates (excepto agua). En un entorno anaerobio, NADH estara presente a una concentracion varias veces superior a la de NAD. Suponiendo [NADH] = 5 x [NAD], se calculo el efecto sobre AGr usando la ecuacion
A Gf = A G)
+ RT In
\[[prod]
]^|[ra/cr]
(3)
Este cambio da como resultado una diferencia de aproximadamente 1 kcal/mol en los valores de delta G para semialdetdo succmico deshidrogenasa. Tambien se uso la ecuacion 3 para calcular otros efectos sobre AGr, tales como la alta concentracion de succinato para impulsar las reacciones. Una diferencia de 1000 veces en las concentraciones de succinato y semialdetdo succmico aportara aproximadamente 5 kcal/mol a delta G. Tomado junto con una incertidumbre supuesta de 8 kcal/mol, no puede eliminarse la posibilidad de que la semialdetdo succmico deshidrogenasa funcione en el sentido hacia semialdetdo succmico en algun conjunto de condiciones fisiologicas. Por tanto, la ruta directa desde succinato hasta 4-HB sigue en consideracion en el analisis posterior.
Se exploraron las capacidades de produccion microbiana de 4-hidroxibutirato en dos microbios, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, usando modelos metabolicos in silico de cada organismo. Las posibles rutas para dar 4- HB avanzan a traves de productos intermedios de succinato, succinil-CoA o alfa-cetoglutarato tal como se muestra en la figura 2.
Una primera etapa en la produccion de 4-HB a partir de succinato implica la conversion de succinato en semialdetdo succmico por medio de una semialdetdo succmico deshidrogenasa dependiente de NADH o NADPH. En E. coli, gabD es una semialdetdo succmico deshidrogenasa dependiente de NADP y es parte de una agrupacion genica implicada en la captacion y degradacion de 4-aminobutirato (Niegemann et al., Arch. Microbiol. 160:454-460 (1993); Schneider et al., J. Bacteriol. 184:6976-6986 (2002)). Se cree que sad codifica para la enzima para la actividad semialdetdo succmico deshidrogenasa dependiente de NAD (Marek y Henson, citado anteriormente). S. cerevisiae solo contiene la semialdetdo succmico deshidrogenasa dependiente de NADPH,
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asignada supuestamente a UGA2, que se localiza en el citosol (Huh et al., Nature 425:686-691 (2003)). Los calculos de rendimiento maximo suponiendo la ruta de succinato para dar 4-HB tanto en E. coli como en S. cerevisiae solo requieren la suposicion de que se ha anadido una 4-HB deshidrogenasa no nativa a sus redes metabolicas.
La ruta desde succinil-CoA hasta 4-hidroxibutirato se describio en la patente estadounidense n.° 6.117.658 como parte de un procedimiento para preparar polihidroxialcanoatos que comprenden unidades monomericas de 4- hidroxibutirato. Clostridium kluyveri es un organismo de ejemplo que se sabe que presenta actividad semialdetdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA (Sohling y Gottschalk, citado anteriormente; Sohling y Gottschalk, citado anteriormente). En este estudio, se supone que esta enzima, de C. kluyveri u otro organismo, se expresa en E. coli o S. cerevisiae junto con una 4-HB deshidrogenasa no nativa o heterologa para completar la ruta desde succinil-CoA hasta 4-HB. Se demostro la ruta desde alfa-cetoglutarato hasta 4-HB en E. coli dando como resultado la acumulacion de poli(acido 4-hidroxibutmco) hasta el 30% del peso celular seco (Song et al., citado anteriormente). Como E. coli y S. cerevisiae presentan de manera nativa o endogena tanto glutamato:semialdetdo succmico transaminasa como glutamato descarboxilasa (Coleman et al., J. Biol. Chem. 276:244-250 (2001)), la ruta desde AKG hasta 4-HB puede completarse en ambos organismos suponiendo solo que esta presente una 4-HB deshidrogenasa no nativa.
EJEMPLO II
Produccion de acido 4-hidroxibutanoico en E. coli
Este ejemplo describe los rendimientos biosinteticos para acido 4-hidroxibutanoico que resultan de cada ruta bioqmmica.
En esta seccion, los rendimientos teoricos maximos de 4-HB a partir de glucosa se calculan suponiendo que cada una de las tres rutas metabolicas representadas en la figura 2 son funcionales en E. coli. Se uso un modelo metabolico a escala de genoma de E. coli, similar al descrito en Reed et al., Genome Biol. 4:R54 (2003), como base para el analisis. La ganancia energetica, en cuanto a moleculas de ATP producidas, de cada ruta de rendimiento maximo se calcula suponiendo condiciones anaerobias, a menos que se mencione lo contrario. Se supone que 4- hidroxibutirato sale de E. coli por medio de simporte de protones, como es el caso con la mayona de los acidos organicos. Tambien es posible que GBL se secrete mediante difusion simple, y en este caso el perfil energetico sera mas favorable que en el caso considerado en el presente documento. Tambien se investigo el impacto de la especificidad de cofactor (es decir, dependencia de NADH o NADPH) de las enzimas participates sobre el rendimiento maximo y el perfil energetico de cada ruta.
En las tablas 3 A-C se muestran los resultados del analisis. Desde un punto de vista energetico y de rendimiento, la ruta de succinato a 4-HB es la mas prometedora. Espetficamente, los calculos revelan que el rendimiento teorico maximo de 4-HB a partir de glucosa es de 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 Cmol/Cmol) suponiendo que la ruta de succinato a 4-HB es funcional. Ademas, la produccion anaerobia de 4-HB por medio de succinato dara como resultado la produccion neta de o bien 1,8, 1,5 o bien 1,1 mol de ATP por glucosa dependiendo de la especificidad de cofactor supuesta de las enzimas participates. Estos rendimientos energeticos son comparables a los 2,0 ATP por glucosa que pueden obtenerse por medio de la fosforilacion a nivel de sustrato mediante la produccion de etanol o lactato, lo que sugiere la posibilidad de produccion de homo-4-HB anaerobia en E. coli.
La ruta de succinil-CoA para dar 4-HB es otra ruta prometedora cuando se consideran el rendimiento maximo y el perfil energetico. Puede lograrse un rendimiento de 1,33 mol/mol de 4-HB en E. coli si se supone que al menos una de las etapas de la ruta es dependiente de NADH. Sin embargo, debido a que esta ruta requiere la formacion de succinil-CoA, su rendimiento energetico es inferior al de la ruta de succinato. Se anticipa un requisito de oxfgeno a altos rendimientos de 4-HB si se supone que las etapas tanto de semialdetdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA como de 4-HB deshidrogenasa son dependientes de NADPH. En este caso, la produccion de 4- HB en el rendimiento maximo no dara como resultado una ganancia de ATP neta y posiblemente no soportara las demandas de mantenimiento energetico necesarias para la supervivencia de E. coli. Por tanto, tendra que originarse algo de energfa a partir de fosforilacion oxidativa para permitir la produccion de 4-HB homo-fermentativa. La ruta de alfa-cetoglutarato que usa glutamato:succinato semialdetdo transaminasa y glutamato descarboxilasa para dar 4- HB es la menos favorable de las tres rutas posibles con un rendimiento maximo que puede lograrse de 1,0 mol de 4- HB por mol de glucosa. Ademas del rendimiento maximo inferior, esta ruta requiere el uso de 1,5 moles de oxfgeno por mol de glucosa convertida en 4-HB. El perfil energetico de esta ruta no se ve afectado por la especificidad de cofactor supuesta de 4-HB deshidrogenasa.
Tabla 3. La estequiometna de conversion de sustrato global para dar 4-HB suponiendo que las rutas de produccion de A) succinato, B) succinil-CoA o C) alfa-cetoglutarato son funcionales en E. coli. Se captan glucosa y oxfgeno mientras que se producen todas las demas moleculas.
A) Ruta de succinato
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Especificidad de cofactor
2 etapas de NADH 1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH 2 etapas de NADPH
Glucosa
-1,000 -1,000 -1,000
Oxfgeno
0,000 0,000 0,000
Protones
1,333 1,333 1,333
4HB
1,333 1,333 1,333
CO2
0,667 0,667 0,667
H2O
0,667 0,667 0,667
ATP
1,800 1,510 1,097
B) Ruta de succinil-CoA
Especificidad de cofactor
2 etapas de NADH 1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH 2 etapas de NADPH 2 etapas de NADPH
Glucosa
-1,000 -1,000 -1,000 -1,000
Oxfgeno
0,000 0,000 -0,036 0,000
Protones
1,333 1,333 1,325 1,294
4HB
1,333 1,333 1,325 1,294
CO2
0,667 0,667 0,698 0,082
H2O
0,667 0,667 0,698 0,470
ATP
0,467 0,177 0,000 0,000
C) Ruta de alfa-cetoglutarato
Especificidad de cofactor
1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH
Glucosa
-1,000 -1,000
Oxfgeno
-1,500 -1,500
Protones
1,000 1,000
4HB
1,000 1,000
CO2
2,000 2,000
H2O
2,000 2,000
ATP
5,500 5,500
Con el fin de corroborar las predicciones computacionales propuestas en este informe, pueden construirse y someterse a prueba las cepas que expresan una ruta completa para dar 4-HB. Se realiza la corroboracion tanto con E. coli (ejemplos II y IV) como con S. cerevisae (ejemplo III). En E. coli, se expresan los genes relevantes en un operon sintetico detras de un promotor inducible en un plasmido de numero de copias medio o alto; por ejemplo el promotor Pbad que se induce por arabinosa, en un plasmido de la serie pBAD (Guzman et al., J. Bacteriol. 177:41214130 (1995)). En S. cerevisiae, se integran los genes en el cromosoma detras del promotor PDC1, reemplazando el gen de piruvato carboxilasa nativo. Se ha notificado que esto da como resultado una expresion de genes foraneos mayor que a partir de un plasmido (Ishida et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:1964-1970 (2005)), y tambien garantizara la expresion durante condiciones anaerobias.
Se hacen crecer celulas que contienen los constructos relevantes en medios mmimos que contienen glucosa, con adicion de arabinosa en el caso de E. coli que contiene genes expresados bajo el promotor Pbad. Se toman muestras periodicas para analisis tanto de la expresion genica como de la actividad enzimatica. Se realizan ensayos de actividad enzimatica en extractos celulares en bruto usando procedimientos bien conocidos en la tecnica. Alternativamente, pueden usarse ensayos basados en la oxidacion de NAD(P)H, que se produce en todas las etapas de reaccion de deshidrogenasa y puede detectarse mediante espectrofotometna. Ademas, pueden usarse anticuerpos para detectar el nivel de enzimas particulares. En lugar, o ademas, de las mediciones de la actividad enzimatica, puede aislarse ARN a partir de muestras paralelas y medirse el transcrito del gen de interes mediante PCR con transcriptasa inversa. Se vuelve a analizar cualquier constructo que carezca de expresion de transcrito detectable para garantizar que los acidos nucleicos codificantes se albergan en una forma expresable. Cuando se detectan transcritos, este resultado indica o bien una falta de traduccion o bien produccion de enzima inactiva. Pueden emplearse adicionalmente una variedad de metodos bien conocidos en la tecnica, tales como optimizacion de codones, modificacion por ingeniena genetica de un sitio de union a ribosoma fuerte, uso de un gen de una especie diferente y prevencion de la N-glicosilacion (para la expresion de enzimas bacterianas en levadura) mediante la conversion de residuos de Asn en Asp. Una vez detectadas todas las actividades enzimaticas requeridas, la siguiente etapa es medir la produccion de 4-HP in vivo. Se hacen crecer cultivos en matraz de agitacion por triplicado de manera o bien anaerobia o bien microaerobia, dependiendo de las condiciones requeridas (vease anteriormente), y se toman muestras periodicas. Se analizan los acidos organicos presentes en los sobrenadantes de cultivo mediante HPLC usando la columna Aminex AH-87X. El tiempo de elucion de 4-HB se determinara usando un patron adquirido de un proveedor qmmico.
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La ruta independiente de CoA puede implementarse y someterse a prueba para su corroboracion. En este caso, los genes sobreexpresados son la semialdetndo succmico deshidrogenasa nativa de cada organismo y la 4- hidroxibutanoato deshidrogenasa de Ralstonia eutropha. Una vez detectadas ambas actividades enzimaticas tal como se comento anteriormente, se someten a prueba las cepas para determinar la produccion de 4-HB. La corroboracion tambien puede obtenerse a partir de la implementacion de la ruta dependiente de CoA. La semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa de Clostridium kluyveri se expresan tal como se describio anteriormente. Ademas, tambien puede realizarse la sobreexpresion de la succinil-CoA sintetasa nativa, para canalizar mas succinato a la ruta heterologa. Finalmente, si la produccion de 4- HB es desfavorable, pueden someterse a prueba diferentes condiciones de cultivo, tales como un cambio en el estado de oxigenacion que puede manipular la razon NAD(P)H/NAD(P).
EJEMPLO III
Produccion de acido 4-hidroxibutanoico en levadura
Este ejemplo describe los rendimientos biosinteticos para acido 4-hidroxibutanoico que resultan de cada ruta bioqmmica en S. cerevisiae.
En esta seccion, se calculan los rendimientos teoricos maximos de 4-HB a partir de glucosa suponiendo que cada una de las tres rutas metabolicas representadas en la figura 2 es funcional en S. cerevisiae. Se uso un modelo metabolico a escala del genoma de S. cerevisiae, similar al descrito en Forster et al. Genome Res. 13:244-253 (2003) como base para el analisis. Se calcula la ganancia energetica de cada ruta de rendimiento maximo suponiendo condiciones anaerobias a menos que se mencione lo contrario. Se supone que 4-hidroxibutirato sale de S. cerevisiae por medio de simporte de protones, como es el caso con la mayona de los acidos organicos. Tambien se investigo el impacto de la especificidad de cofactor (es decir, dependencia de NADH o NADPH) de las enzimas participates en el rendimiento maximo y el perfil energetico de cada ruta.
Los resultados del analisis se muestran en las tablas 4 A-C. Como con E. coli, la ruta de succinato a 4-HB es la mas prometedora siempre que puedan superarse los problemas termodinamicos planteados en el ejemplo I. Los calculos revelan que el rendimiento teorico maximo de 4-HB a partir de glucosa es de 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 Cmol/Cmol) en S. cerevisiae. Ademas, la produccion anaerobia de 4-HB por medio de succinato dara como resultado la produccion neta de o bien 1,4, 1,1 o bien 0,5 mol de ATP por glucosa dependiendo de la especificidad de cofactor supuesta de las enzimas participantes.
La ruta de succinil-CoA para dar 4-HB es la segunda ruta mas favorable. Puede lograrse un rendimiento maximo de 1,33 mol de 4-HB/mol de glucosa en S. cerevisiae independientemente de la especificidad de cofactor. Sin embargo, la generacion de energfa neta al rendimiento teorico maximo solo es posible si se supone que las etapas tanto de semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA como de 4-HB deshidrogenasa son dependientes de NADH. Si cualquier etapa es dependiente de NADPH, no se obtendra ATP neto a partir de la produccion de 4-HB anaerobia y se requerira una fuente de energfa alternativa (por ejemplo, fosforilacion oxidativa) para soportar el crecimiento y mantenimiento celular. La ruta de alfa-cetoglutarato para dar 4-HB es la menos favorable de las tres rutas posibles en S. cerevisiae aunque el rendimiento maximo de 1,1-1,2 mol de 4-HB por mol de glucosa es ligeramente superior al encontrado en E. coli. No obstante, esta ruta requiere una captacion de oxfgeno de 0,80,9 mol de oxfgeno por mol de glucosa para llegar a ser energeticamente neutra.
Tabla 4. La estequiometna de conversion de sustrato global para dar 4-HB en S. cerevisiae, suponiendo que las rutas de produccion de A) succinato, B) succinil-CoA o C) alfa-cetoglutarato son funcionales en S. cerevisiae. Se captan glucosa y oxfgeno mientras que se producen todas las demas moleculas.
A) Ruta de succinato
Especificidad de cofactor
2 etapas de NADH 1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH 2 etapas de NADPH
Glucosa
-1,000 -1,000 -1,000
Oxfgeno
0,000 0,000 0,000
Protones
1,333 1,333 1,333
4HB
1,333 1,333 1,333
CO2
0,667 0,667 0,667
H2O
0,667 0,667 0,667
ATP
1,444 1,067 0,533
B) Ruta de succinil-CoA
Especificidad de cofactor | 2 etapas de NADH | 1 etapa de NADH________| 2 etapas de NADPH
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1 etapa de NADPH
Glucosa
-1,000 -1,000 -1,000
Oxfgeno
0,000 0,000 0,000
Protones
1,333 1,333 1,333
4HB
1,333 1,333 1,333
CO2
0,667 0,667 0,667
H2O
0,667 0,667 0,667
ATP
0,533 0,000 0,000
C) Ruta de alfa-cetoglutarato
Especificidad de cofactor
1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH
Glucosa
-1,000 -1,000
Oxfgeno
-0,785 -0,879
Protones
1,159 1,138
4HB
1,159 1,138
CO2
1,364 1,448
H2O
1,364 1,448
ATP
0,000 0,000
EJEMPLO IV
Biosintesis de 1,4-butanodiol a partir de succinato y a-cetoglutarato
Este ejemplo ilustra la construccion y produccion biosintetica de 4-HB y BDO a partir de organismos microbianos.
Tal como se describio anteriormente en los ejemplos I-III, las caractensticas termodinamicas de las etapas de biotransformacion desde 4-HB hasta BDO mostradas en la figura 1 tambien se calcularon basandose en la ene^a libre de Gibbs convencional de formacion determinada mediante contribucion de grupos. Los resultados se proporcionan en la tabla 5. De manera similar, aunque algunas de las etapas tienen valores de delta G positivos calculados, los errores estandar para estos calculos y gradientes de concentracion indican que cualquiera de las etapas es viable.
Tabla 5. Energfa libre de Gibbs de reaccion (kcal/ml) en condiciones convencionales (valores de pH y fuerza ionica). La temperatura era constante a 298 K. Las barras de error para estos valores son del orden de 8 kcal/mol, tal como se calcula mediante la ecuacion 2. Abreviaturas: 4-HBald, 4-hidroxibutiraldetndo.
Reaccion
AG°'
pH = 7,0 IS = 0
4-HB + NADH + H+ ^ 4-HBald + NAD
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4-HB + acetil-CoA ^ 4-HB-CoA + acetato
-5,0
4-HB-CoA + NADH + H+ ^ 4-HBald + NAD + CoA
9,5
4-HBald + NADH + H+ ^ bdo + NAD
-5,0
Se calcularon los rendimientos teoricos suponiendo que todas las rutas en la figura 2 se incorporan en E. coli. Se uso un modelo metabolico a escala del genoma de E. coli, similar al descrito en Reed et al., Genome Biol 4: R54 (2003), como base para el analisis. El rendimiento teorico maximo suponiendo neutralidad energetica y ausencia de crecimiento o mantenimiento celular fue de 1,09 mol de BDO/mol de glucosa en condiciones mciroaerobias. En simulaciones realizadas en condiciones anaerobias, que pueden usarse para impulsar la ruta hacia la produccion de BDO, se produce o bien acetato o bien etanol como coproducto. En estas condiciones, los rendimientos maximos fueron de 1,04 y 1,00 mol/mol, respectivamente. Una alternativa es anadir cantidades limitantes de nitrato como aceptor de electrones, controlando asf la cantidad de respiracion que puede producirse. En esta condicion, el rendimiento maximo vuelve a 1,09 mol/mol. Otra alternativa es reemplazar la fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilasa de E. coli por una fosfoenolpiruvato carboxicinasa heterologa o modificada por ingeniena genetica que puede funcionar en el sentido de carboxilacion de PEP. Esta enzima produce ATP, mientras que la PEP carboxilasa no. Con esta suposicion, el rendimiento maximo vuelve a 1,09 mol/mol.
Ademas, hay varias enzimas alternativas que pueden usarse en la ruta descrita anteriormente. La enzima nativa o endogena para la conversion de succinato en succinil-CoA (etapa 1 en la figura 2) puede reemplazarse por una CoA transferasa tal como la codificada por el gen cat1 de C. kluyveri (Sohling, B. y G. Gottschalk, Eur. J Biochem. 212: 121-127 (1993)), que funciona de una manera similar a la etapa 9. Sin embargo, la produccion de acetato por esta enzima puede no ser optima, ya que puede secretarse en vez de convertirse de nuevo en acetil-CoA. En este
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sentido, tambien puede ser beneficioso eliminar la formacion de acetato en la etapa 9. Como alternativa a esta CoA transferasa, puede emplearse un mecanismo en el que en primer lugar se fosforila el 4-HB mediante ATP y luego se convierte en el derivado de CoA, de manera similar a la ruta de acetato cinasa/fosfotransacetilasa en E. coli para la conversion de acetato en acetil-CoA. El coste neto de esta ruta es un ATP, que es lo mismo que se requiere para regenerar acetil-CoA a partir de acetato. Se sabe que las enzimas fosfotransbutirilasa (ptb) y butirato cinasa (bk) llevan a cabo estas etapas en las moleculas no hidroxiladas para la produccion de butirato en C. acetobutylicum (Cary et al., Appl Environ Microbiol 56:1576-1583 (1990); Valentine, R. C. y R. S. Wolfe, J Biol Chem. 235:1948-1952 (I960)). Estas enzimas son reversibles, permitiendo que la smtesis avance en el sentido de 4-HB.
Tambien puede producirse BDO por medio de a-cetoglutarato ademas, o en lugar, de a traves de succinato. Tal como se describio anteriormente, y se muestra a modo de ejemplo adicionalmente a continuacion, una ruta para lograr la biosmtesis del producto es con la produccion de semialdetndo succmico por medio de a-cetoglutarato usando las enzimas endogenas (figura 2, etapas 4-5). Una alternativa es usar una a-cetoglutarato descarboxilasa que puede realizar esta conversion en una etapa (figura 2, etapa 8; Tian et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:1067010675 (2005)).
Para la construccion de diferentes cepas de organismos microbianos productores de BDO, se ensamblo una lista de genes aplicables para su corroboracion. En resumen, se identificaron uno o mas genes dentro de las rutas biosinteticas de 4-Hb y/o BDO para cada etapa de la ruta de produccion de BDO completa mostrada en la figura 2, usando recursos bibliograficos disponibles, la base de datos geneticos del NCBI y busquedas de homologfa. Los genes clonados y evaluados en este estudio se presentan a continuacion en la tabla 6, junto con las menciones de URL y referencias apropiadas para la secuencia de polipeptido. Tal como se comenta adicionalmente a continuacion, algunos genes se sintetizaron para la optimizacion de codones mientras que otros se clonaron por medio de PCR a partir del ADN genomico del organismo nativo o de tipo natural. Para algunos genes se usaron ambos enfoques, y en este caso los genes nativos se indican mediante un sufijo “n” en el numero de identificacion de gen cuando se usan en un experimento. Observese que solo difieren las secuencias de ADN; las protemas son identicas.
Tabla 6. Genes expresados en organismos microbianos productores de BDO huesped.
Nbmoro de ID de gen
NCmerc de reaccibn (figura 1) Ngmbre del gen Organisms fuente Nombre de Fa enzima Enlace a la secuencia de la prolei na Referenda
0001
9 Cat2 Clostridium kluyveri DSM 555 4-hidroxibutirato coenzima A transferasa
www.ncbi.nlm.ni h.gov/en t rez/ viewer. fcgi7db=iuiccore<!fcid= 1228100 am
0002
12/13 adhE Clostridium acetobuiylicu m ATCC 824 Aldehido/alcohd deshidrogenasa
www.ncbi.nlm.ni h.go v/ent rez/ viewer. fcgi?db=protem&val= 15004739 {22)d}
0003
12/13 adhE2 Clostridium acetobuiylicu m ATCC 824 Aldchido/alcohol deshidrogenasa www. nebi. n lm.nih.gov/ent re 2/ viewer, fcgi?vq|=NP_ 1493251 (I2)d}
0004
1 Cat! Clostridium khtyveri DSM 555 Succinate coenzima A transferase www.ncbi.nlm,nih.gov/ent rezt vicwcr.fcgi7db=nucc(jrc&id= 1228100 (29)d}
OOOS
6 SoeD Clostridium klicyveri DSM 555 Semialdehido sued nice deshidrogenasa (de- pendiente de CoA}
www.ncbi.nlni. nih.gov/cnt rez/ viewer.fcgi?db=nucc«re&id= 1228100 {29)d}
0009
7 4-HBd Kahiottio eutropha 1116 4-hidroKibutiratE> deshidrogenasa (de- pendiente de NAD)
www.nebi nlm.nih.gov/entre2/ viewer.fcgi7val=YP 726053. 1 (32)d}
0010
7 4-HBd Clostridium kluyveri DSM 555 4-hidroxibutiralo deshidrogenasa (dependents; ds NAD) www. nebi.nlm.nih.gov/eiitrez/ viewer.fcgi?db=nuccoTi&!tid= 1228100 (2m
0011
12/13 adhE E. coli Aldehido/alcohol deshidrogenasa
www.shigen-nig.ac.jp/ecoli/pe c/genes. List. Del ail Act ion do?f romLi si Flag=inur& feaiureTyp e=l&orfId=l2l9
0012
12/13 yqhD E. coli Ardehido/alcahol deshidrogenasa
www.shigen.nig.acj p/ecoli/pe c/genes. U st.Detail Action.do
0013
13 bdhb Clostridium acetobuiylicu m ATCC 824 Sutanol deshidrogenasa II www. nebi. nlm.nih.gov/cntrez/ viewer. fegi?val=Nr,_34989 i. 1 (35)d}
0020
il pib Clostridium acetobuiylicu m ATCC 824 Fosfo- transbulirilasa w w w. nebi. nlm. nih.go v/en t rez/ viewer. rcgi7db=protein& id= 1 5896327 (4)dJ
0021
10 bukl Clostridium acetobuiylicu m ATCC 824 Buiirato cinasa 1 www. nebi. nlm.nih.gov/entre2/ viewer. ftgi7db=protein&id=2 0137334 <4)d}
0022
10 buk2 Clostridium acetobutylicu m ATCC 824 But irate cinasa II w ww. nebi. n Lm. n i h.go v/entnez/ viewer. Icgi ?db=protein& id=2 0137415 (4)d}
0023
13 adliEm aislado de metabiblioteca de conscrcios microbianos digestoras de sguas residuals a enaerobioa Alcohol deshidrogenasa (37)d}
Numero de ID de gen
Numero de reaction [figura 1) Ncmbre del gen Organismo luenle Nombre de la enzima Enlace a la secuencia de la protefna Referencia
0024
13 adhE Clostridium thermocellum Alcohol deshidrogenasa
www.genome.jp/dbget- bin/www_bgct?clh:Cthe_0423
0025
13 aid Clostridium beijerinckii Coenzima A-acilante aldehido deshidrogenasa
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer. fcgi?db=protein&id=4 903668I C3l)dJ
0026
13 bdhA Clostridium acetobutylicu m ATCC 824 Butanol deshidrogenasa
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer. fcgi?val=NP_.349892. 1 (35 Id}
0027
12 bid Clostridium saccharoperb utylacetonicu m Butiraldehido deshidrogenasa
www.ncbi.nlm.nih.gov/cntrez/ viewer.fcgi?db=protein&id=3 1075383 <lS>d}
0028
13 bdh Clostridium saccharoperb utylacetonicu m Butanol deshidrogenasa
www.ncbi.nlmnih.gov/entrez/ viewer.fcgi?db=protein&id= 1 24221917 U8)d}
0029
12/13 adhE Clostridium tetani Aldehido/alcohol deshidrogenasa
www.genome.jp/dbget- bi n/w ww_bget?ctc:CTC01366
0030
12/13 adhE Clostridium perfringens Aldehido/alcohol deshidrogenasa
www.genome.jp/dbget- bin/www_bget?cpe:CPE2531
003 J
12/13 adhE Clostridium difficile Aldehido/alcohol deshidrogenasa
www.genome.jp/dbget- bin/www_bget?cdf:CD2966
0032
8 sucA Mycobacteria m bo vis BCG, Pasteur a-cetoglutarato descarboxilasa
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?val=YP_977400. 1 (30jd)
0033
9 cat2 Clostridium aminobutyric un 4-hidroxibutirato coenzima A transferasa
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?db=protein&val= 6249316
0034
9 cat2 Porphyromon as gingivalis W83 4-hidroxibutirato coenzima A transferasa
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi?db=protein&val= 34541558
0035
6 sucD Porphyromon as gingivalis W83 Semialdehido succinico deshidrogenasa (dependiente de CoA)
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrcz/ vicwer.fcgi?val=NP_904963. 1
0036
7 4-HBd Porphyromon as gingivalis W83 4-hidroxibutirato deshidrogenasa dependiente de NAD www. ncbi. nlm. mh .gov/ent rez/ viewer.fcgi?val=NP_904964. 1
0037
7 gbd Bacteria no cultivada 4-hidroxibutirato deshidrogenasa
www.ncbi.nlntnih.gov/entrez/ viewer, fcgi ?db=nuccore&id= 5916168 (I6)d}
0038
l sucCI7 E. coli Succinil-CoA sintetasa
www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/pe c/genes. List.Detai 1 Action. do
Construccion del vector de expresion para la ruta de BDO. Se obtuvieron estructuras principales de vector y algunas cepas del Dr. Rolf Lutz de Expressys (
www.expressys.de/). Los vectores y las cepas se basan en el sistema de 5 expresion pZ desarrollado por el Dr. Rolf Lutz y el Prof. Hermann Bujard (Lutz, R. y H. Bujard, Nucleic Acids Res 25: 1203-1210 (1997)). Los vectores obtenidos eran pZE13luc, pZA33luc, pZs*13luc y pZE22luc y conteman el gen de luciferasa como fragmento de relleno. Para reemplazar el fragmento de relleno de luciferasa por un fragmento de lacZ-alfa flanqueado por sitios de enzimas de restriccion apropiados, se retiro en primer lugar el fragmento de relleno de luciferasa de cada vector mediante digestion con EcoRI y Xbal. Se amplifico por PCR el fragmento de lacZ-alfa a 10 partir de pUC19 con los siguientes cebadores:
lacZalfa-RI
5'GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCCAATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3'
lacZalfa 3'BB
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5'-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGGCATCAGAGCAGA-3'.
Esto genero un fragmento con un extremo en 5' de sitio EcoRI, sitio Nhel, un sitio de union a ribosoma, un sitio Sail y el codon de iniciacion. En el extremo 3' del fragmento estaba contenido el codon de terminacion, sitios Xbal, Hindlll y Avrll. Se digirio el producto de PCR con EcoRI y Avrll y se ligo en los vectores de base digeridos con EcoRI y Xbal (Xbal y Avrll tienen extremos compatibles y generan un no sitio). Debido a que los sitios de enzimas de restriccion Nhel y Xbal generan extremos compatibles que pueden ligarse entre sf (pero generan un no sitio Nhel/Xbal que no se digiere por ninguna de las enzimas), los genes clonados en los vectores pueden unirse mediante la tecnica de “bioladrillos” (Biobricks) entre sf (
http://openwetware.org/wiki/Synthetic_Biology:BioBricks). En resumen, este metodo permite la union de un numero ilimitado de genes en el vector usando los mismos 2 sitios de restriccion (siempre que los sitios no aparezcan internos a los genes), porque los sitios entre los genes se destruyen tras cada adicion.
Todos los vectores tienen la designacion pZ seguida por letras y numeros que indican el origen de replicacion, el marcador de resistencia a antibioticos y la unidad promotora/reguladora. El origen de replicacion es la segunda letra y se indica mediante E para ongenes basados en ColEI, A para p15A y S para pSC101. El primer numero representa el marcador de resistencia a antibioticos (1 para ampicilina, 2 para kanamicina, 3 para cloranfenicol, 4 para espectinomicina y 5 para tetraciclina). El numero final define el promotor que regulaba el gen de interes (1 para PLteto-i, 2 para Puaco-i, 3 para PAilaco-i y 4 para Plac/ara-i). Siguen inmediatamente despues el MCS y el gen de interes. Para el trabajo comentado en este caso se emplearon dos vectores de base, pZA33 y pZEi3, modificados para las inserciones de bioladrillos tal como se comento anteriormente. Una vez clonado(s) el/los gen(es) de interes en los mismos, se indican los plasmidos resultantes usando los codigos de genes de cuatro dfgitos facilitados en la tabla 6; por ejemplo, pZA33-XXXX-YYYY-....
Construccion de la cepa huesped. La cepa original en todos los estudios descritos en el presente documento es la cepa MGi655 de E. coli K-i2. Se construyeron cepas de delecion sin marcador en adhE, gabD y aldA bajo contrato de servicio por un tercero usando el metodo de redET (Datsenko, K. A. y B. L. Wanner, Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645 (2000)). Se construyeron cepas posteriores por medio de transduccion mediada por bacteriofago Pi (Miller, J. i973. Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York). Se obtuvo la cepa C600Zi (laciq, PN25-tetR, SpR, lacYi, leuB6, mcrB+, supE44, thi-i, thr-i, tonA2i) de Expressys y se uso como fuente de un alelo laclq para la transduccion de Pi. Se hizo crecer el bacteriofago Pivir en la cepa de E. coli C600Zi, que tiene el gen de resistencia a espectinomicina unido al laclq. Se uso el lisado de Pi hecho crecer en C600Zi para infectar MGi655 con seleccion para resistencia a espectinomicina. Entonces se examinaron las colonias resistentes a espectinomicina para detectar el laclq unido determinando la capacidad de los transductantes para reprimir la expresion de un gen unido a un promotor PAilaco-i. La cepa resultante se designo MGi655 laclq. Se uso un procedimiento similar para introducir laclQ en las cepas de delecion.
Produccion de 4-HB a partir de succinato. Para la construccion de un productor de 4-HB a partir de succinato, se ensamblaron genes que codifican para las etapas desde succinato hasta 4-HB y 4-HB-CoA (i, 6, 7 y 9 en la figura 2) en los vectores pZA33 y pZEi3 tal como se describe a continuacion. Se evaluaron diversas combinaciones de genes, asf como constructos que portaban rutas incompletas como controles (tablas 7 y 8). Entonces se transformaron los plasmidos en cepas huesped que conteman laclQ, lo que permite la expresion inducible mediante la adicion de p-D-i-tiogalactopiranosido de isopropilo (lPTG). Se sometieron a prueba tanto el tipo natural como los huespedes con deleciones en genes que codifican para la semialdelmdo succmico deshidrogenasa nativa (etapa 2 en la figura i).
En primer lugar se sometio a prueba la actividad de las enzimas heterologas en ensayos in vitro, usando la cepa MGi655 laclQ como huesped para los constructos de plasmido que conteman los genes de la ruta. Se hicieron crecer las celulas de manera aerobia en medios LB (Difco) que conteman los antibioticos apropiados para cada constructo, y se indujeron mediante la adicion de lPTG a i mM cuando la densidad optica (DO600) alcanzo aproximadamente 0,5. Se recogieron las celulas tras 6 horas, y se realizaron ensayos enzimaticos tal como se comenta a continuacion.
Ensayos enzimaticos in vitro. Para obtener extractos en bruto para los ensayos de actividad, se recogieron celulas mediante centrifugacion a 4.500 rpm (Beckman-Coulter, Allegera X-i5R) durante i0 min. Se resuspendieron los sedimentos en 0,3 ml de reactivo BugBuster (Novagen) con benzonasa y lisozima, y la lisis avanzo durante i5 minutos a temperatura ambiente con agitacion suave. Se obtuvo el lisado libre de celulas mediante centrifugacion a i4.000 rpm (centnfuga Eppendorf 5402) durante 30 min a 4°C. Se determino la protema celular en la muestra usando el metodo de Bradford et al., Anal. Biochem. 72:248-254 (i976), y se realizaron ensayos enzimaticos espedficos tal como se describe a continuacion. Las actividades se notifican en unidades/mg de protema, en las que una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para convertir i gmol de sustrato en i min a temperatura ambiente. En general, los valores notificados son promedios de al menos 3 ensayos repetidos.
Se determino la actividad succinil-CoA transferasa (Cati) monitorizando la formacion de acetil-CoA a partir de succinil-CoA y acetato, siguiendo un procedimiento descrito previamente, Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. i78:87i- 880 (i996). Se determino la actividad succinil-CoA sintetasa (SucCD) siguiendo la formacion de succinil-CoA a partir
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de succinato y CoA en presencia de ATP. El experimento siguio un procedimiento descrito por Cha y Parks, J. Biol. Chem. 239:1961-1967 (1964). Se determino la actividad succinato semialdelmdo deshidrogenasa (SucD) dependiente de CoA siguiendo la conversion de NAD en NADH a 340 nm en presencia de succinato semialdelmdo y CoA (Sohling y Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212:121-127 (1993)). Se determino la actividad enzimatica de 4-hB deshidrogenasa (4-HBd) monitorizando la oxidacion de NADH para dar NAD a 340 nm en presencia de succinato semialdelmdo. El experimento siguio un procedimiento publicado, Gerhardt et al. Arch. Microbiol. 174:189-199 (2000). Se determino la actividad 4-HB CoA transferasa (Cat2) usando un procedimiento modificado a partir de Scherf y Buckel, Appl. Environ. Microbiol. 57:2699-2702 (1991). Se determino la formacion de 4-HB-CoA o butiril- CoA a partir de acetil-CoA y 4-HB o butirato usando HPLC.
Se sometieron a ensayo alcohol (ADH) y aldelmdo (ALD) deshidrogenasa en el sentido reductor usando un procedimiento adaptado a partir de varias fuentes de bibliograffa (Durre et al., FEMS Microbiol. Rev. 17:251-262 (1995); Palosaari y Rogers, J. Bacteriol. 170:2971-2976 (1988) y Welch et al., Arch. Biochem. Biophys. 273:309-318 (1989)). La oxidacion de NADH se sigue leyendo la absorbancia a 340 nM cada cuatro segundos durante un total de 240 segundos a temperatura ambiente. Se realizaron ensayos reductores en MOPS 100 mM (ajustado a pH 7,5 con KOH), NADH 0,4 mM y desde 1 hasta 50 |il de extracto celular. Se inicia la reaccion anadiendo los siguientes reactivos: 100 |il de acetaldelmdo o butiraldelmdo 100 mM para ADH, o 100 |il de acetil-CoA o butiril-CoA 1 mM para ALD. Se calibra rapidamente con blanco del espectrofotometro y entonces se inicia la lectura cinetica. La pendiente resultante de la reduccion de la absorbancia a 340 nM por minuto, junto con el coeficiente de extincion molar de NAD(P)H a 340 nM (6000) y la concentracion de protema del extracto, pueden usarse para determinar la actividad espedfica.
La actividad enzimatica de PTB se mide en el sentido de butiril-CoA a butiril-fosfato tal como se describe en Cary et al. J. Bacteriol. 170:4613-4618 (1988). Proporciona fosfato inorganico para la conversion, y sigue el aumento en CoA libre con el reactivo 5,5'-ditiobis-(acido 2-nitrobenzoico), o DTNB. DTNB reacciona rapidamente con grupos tiol tales como CoA libre liberando el acido 2-nitro-5-mercaptobenzoico (TNB) de color amarillo, que absorbe a 412 nm con un coeficiente de extincion molar de 14,140 M cm-1. El tampon de ensayo contema fosfato de potasio 150 mM a pH 7,4, DTNB 0,1 mM y butiril-CoA 0,2 mM, y se inicio la reaccion mediante la adicion de 2 a 50 |il de extracto celular. Se mide la actividad enzimatica de BK en el sentido de formacion de butirato a butiril-fosfato a expensas de ATP. El procedimiento es similar al ensayo para acetato cinasa descrito previamente, Rose et al., J. Biol. Chem. 211:737-756 (1954). Sin embargo, se ha encontrado que otro protocolo de ensayo enzimatico de acetato cinasa proporcionado por Sigma es mas util y sensible. Este ensayo vincula la conversion de ATP en ADP por acetato cinasa a la conversion vinculada de ADP y fosfoenol piruvato (PEP) en ATP y piruvato por piruvato cinasa, seguido por la conversion de piruvato y NADH en lactato y NAD+ por lactato deshidrogenasa. La sustitucion de butirato por acetato es la unica modificacion importante para permitir que el ensayo siga la actividad enzimatica de BK. La mezcla de ensayo contema tampon trietanolamina 80 mM a pH 7,6, butirato de sodio 200 mM, MgCh 10 mM, NADH 0,1 mM, ATP 6,6 mM, fosfoenolpiruvato 1,8 mM. Se anadieron piruvato cinasa, lactato deshidrogenasa y miocinasa segun las instrucciones del fabricante. Se inicio la reaccion anadiendo de 2 a 50 |il de extracto celular, y se monitorizo la reaccion basandose en la disminucion de la absorbancia a 340 nm que indica oxidacion de NADH.
Analisis de derivados de CoA mediante HPLC. Se desarrollo un ensayo basado en HPLC para monitorizar reacciones enzimaticas que implican transferencia de coenzima A (CoA). El metodo desarrollado permitio la caracterizacion de la actividad enzimatica mediante determinacion cuantitativa de CoA, acetil CoA (AcCoA), butiril CoA (BuCoA) y 4-hidroxibutirato CoA (4-HBCoA) presentes en mezclas de reaccion in vitro. Se logro una sensibilidad de hasta pocos |iM, asf como resolucion excelente de todos los derivados de CoA de interes.
Se realizo la preparacion de productos qmmicos y de muestra tal como sigue. En resumen, CoA, AcCoA, BuCoA y todos los demas productos qmmicos, se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Los disolventes, metanol y acetonitrilo, eran de calidad para HPLC. Las curvas de calibracion patron mostraron linealidad excelente en el intervalo de concentracion de 0,01-1 mg/ml. Las mezclas de reaccion enzimatica conteman tampon Tris HCl 100 mM (pH 7), se tomaron alfcuotas en diferentes puntos de tiempo, se extinguieron con acido formico (concentracion final del 0,04%) y se analizaron directamente mediante HPLC.
Se realizo el analisis de HPLC usando un sistema de HPLC 1100 de Agilent equipado con una bomba binaria, desgasificador, inyector automatico con termostato y compartimento de columna y se uso detector de red de diodos (DAD) para el analisis. Se empleo una columna de fase inversa, Kromasil 100 5um C18, 4,6x150 mm (Peeke Scientific). Se usaron fosfato de potasio 25 mM (pH 7) y metanol o acetonitrilo, como disolventes acuosos y organicos a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se desarrollaron dos metodos: uno corto con un gradiente mas rapido para el analisis de CoA, AcCoA y BuCoA bien resueltos, y un metodo mas largo para distinguir entre AcCoA y 4-HBCoA que eluyen muy proximos. El metodo corto empleo gradiente de acetonitrilo (0 min - 5%, 6 min - 30%, 6,5 min - 5%, 10 min - 5%) y dio como resultado los tiempos de retencion de 2,7, 4,1 y 5,5 min para CoA, AcCoA y BuCoA, respectivamente. En el metodo largo se uso metanol con el siguiente gradiente lineal: 0 min - 5%, 20 min - 35%, 20,5 min - 5%, 25 min - 5%. Los tiempos de retencion para CoA, AcCoA, 4-HBCoA y BuCoA eran de 5,8, 8,4, 9,2 y 16,0 min, respectivamente. El volumen de inyeccion era de 5 |il, la temperatura de columna de 30°C y se monitorizo la absorbancia UV a 260 nm.
Los resultados demostraron la actividad de cada una de las cuatro etapas de ruta (tabla 6), aunque la actividad depende claramente de la fuente del gen, posicion del gen en el vector y el contexto de otros genes con los que se expresa. Por ejemplo, el gen 0035 codifica para una semialdetndo succmico deshidrogenasa que es mas activa que 5 la codificada por 0008, y 0036 y 0010n son genes mas activos para 4-HB deshidrogenasa que 0009. Tambien parece haber mejor actividad 4-HB deshidrogenasa cuando hay otro gen que precede al mismo en el mismo operon.
Tabla 7. Actividades enzimaticas in vivo en extractos celulares a partir de MG1655 lacIQ que contiene los plasmidos que expresan los genes en la ruta de 4-HB-CoA. Las actividades se notifican en unidades/mg de protema, en las 10 que una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para convertir 1 umol de sustrato en 1 min a temperatura ambiente.
n.° de muestra
pZE13 (a) pZA33 (b) DO600 Prot. celular (c) Cat1 SucD 4HBd Cat2
1
cat1 (0004) 2,71 6,43 1,232 0,00
2
cat1 (0004)- sucD (0035) 2,03 5,00 0,761 2,57
3
cat1 (0004)- sucD (0008) 1,04 3,01 0,783 0,01
4
sucD (0035) 2,31 6,94 2,32
5
sucD (0008) 1,10 4,16 0,05
6
4hbd (0009) 2,81 7,94 0,003 0,25
7
4hbd (0036) 2,63 7,84 3,31
8
4hbd (0010n) 2,00 5,08 2,57
9
cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0009) 2,07 5,04 0,600 1,85 0,01
10
cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0036) 2,08 5,40 0,694 1,73 0,41
11
cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0010n) 2,44 4,73 0,679 2,28 0,37
12
cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd (0009) 1,08 3,99 0,572 -0,01 0,02
13
cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd (0036) 0,77 2,60 0,898 -0,01 0,04
14
cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd (0010n) 0,63 2,47 0,776 0,00 0,00
15
cat2 (0034) 2,56 7,86 1,283
16
cat2(0034)-4hbd(0036) 3,13 8,04 24,86 0,993
17
cat2(0034)-4hbd(0010n) 2,38 7,03 7,45 0,675
18
4hbd(0036)-cat2(0034) 2,69 8,26 2,15 7,490
19
4hbd(0010n)-cat2(0034) 2,44 6,59 0,59 4,101
Genes expresados a partir de Plac en pZE13, un plasmido de numero de copias alto con origen de colEI y resistencia a ampicilina. Los numeros de identificacion de gen son tal como se facilitan en la tabla 2.
Genes expresados a partir de Plac en pZA33, un plasmido de numero de copias medio con origen de pACYC y resistencia a cloranfenicol.
(c) Protema celular facilitada como mg de protema por ml de extracto.
Entonces se evaluaron las cepas recombinantes que conteman genes en la ruta de 4-HB para determinar la 15 capacidad para producir 4-HB in vivo a partir de productos intermedios metabolicos fundamentales. Se hicieron crecer celulas de manera anaerobia en medio LB hasta una DO600 de aproximadamente 0,4, entonces se indujeron con IPTG 1 mM. Una hora mas tarde, se anadio succinato de sodio hasta 10 mM, y se tomaron muestras para el analisis tras 24 y 48 horas adicionales. Se analizo 4-HB en el caldo de cultivo mediante CG-EM tal como se describe a continuacion. Los resultados indican que la cepa recombinante puede producir mas de 4-HB 2 mM tras 24 horas, 20 en comparacion con esencialmente cero en la cepa control (tabla 8).
Tabla 8. Produccion de 4-HB a partir de succinato en cepas de E. coli que albergan plasmidos que expresan diversas combinaciones de genes de la ruta de 4-HB.
24 horas 48 horas
N.° de muestra
Cepa huesped p2E13 pZA33 DO600 4HB, uM 4HB norm.(a) DO600 4HB, UM 4HB norm. (a)
1
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0035) 4had(0009) 0,47 487 1036 1,04 1780 1711
2
MG1655 cat1 (0004)- 4hbd (027) 0,41 111 270 0,99 214 217
5
10
15
20
25
30
laclq sucD (0035)
3
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd(0036) 0,47 863 1835 0,48 2152 4484
4
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd(0010n) 0,46 956 2078 0,49 2221 4533
5
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0008) 4had(0009) 0,38 493 1296 0,37 1338 3616
6
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd(0027) 0,32 26 81 0,27 87 323
7
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd (0036) 0,24 506 2108 0,31 1448 4672
8
MG1655 laclq cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd (0010n) 0,24 78 324 0,56 233 416
9
MG1655 laclq gabD cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0009) 0,53 656 1237 1,03 1643 1595
10
MG1655 laclq gabD cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0027) 0,44 92 209 0,98 214 218
11
MG1655 laclq gabD cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0036) 0,51 1072 2102 0,97 2358 2431
12
MG1655 laclq gabD cat1 (0004)- sucD (0035) 4hbd (0010n) 0,51 981 1924 0,97 2121 2186
13
MG1655 laclq gabD catl (0004)- sucD (0008) 4hbd(0009) 0,35 407 1162 0,77 1178 1530
14
MG1655 laclq gabD catl (0004)- sucD (0008) 4hbd(0027) 0,51 19 36 1,07 50 47
15
MG1655 laclq gabD cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd(0036) 0,35 584 1669 0,78 1350 1731
16
MG1655 laclq gabd cat1 (0004)- sucD (0008) 4hbd(0010n) 0,32 74 232 0,82 232 283
17
MG1655 laclq solo vector solo vector 0,8 1 2 1,44 3 2
18
MG1655 laclq gabD solo vector solo vector 0,89 1 2 1,41 7 5
(a) Concentracion de 4-HB normalizada, |iM/unidades de DO600
Una alternativa al uso de una CoA transferasa (cat1) para producir succinil-CoA a partir de succinato es usar los genes sucCD de E. coli nativos, que codifican para succinil-CoA sintetasa. Se clono esta agrupacion genica en pZ13 junto con genes candidatos para las etapas restantes para dar 4-HB para crear pZE13-0038-0035-0036.
Produccion de 4-HB a partir de glucosa. Aunque los experimentos anteriores demuestran una ruta funcional para dar 4-HB a partir de un producto intermedio metabolico fundamental (succinato), un procedimiento industrial requerira la produccion de productos qmmicos a partir de materias primas de hidrato de carbono de bajo coste tales como glucosa o sacarosa. Por tanto, el siguiente conjunto de experimentos estaba dirigido a determinar si el succinato endogeno producido por las celulas durante el crecimiento en glucosa podfa alimentar la ruta de 4-HB. Se hicieron crecer celulas de manera anaerobia en medio mmimo M9 (Na2HPO4 6,78 g/l, KH2PO4 3,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 1,0 g/l, MgSO4 1 mM, CaCl2 0,1 mM) complementado con glucosa 20 g/l, acido 3-(N-morfolino)propanosulfonico (MOPS) 100 mM para mejorar la capacidad tamponante, tiamina 10 |ig/ml y los antibioticos apropiados. Se anadio IPTG 0,25 mM cuando la DO600 alcanzo aproximadamente 0,2, y se tomaron muestra para el analisis de 4-HB cada 24 horas tras la induccion. En todos los casos 4-HB formo una meseta tras 24 horas, con un maximo de aproximadamente 1 mM en la mejores cepas (figura 11a), mientras que la concentracion de succinato siguio aumentando (figura 11b). Esto indica que el suministro de succinato a la ruta probablemente no es limitativo, y que el cuello de botella puede estar en la actividad de las propias enzimas o en la disponibilidad de NADH. 0035 y 0036 son claramente los mejores candidatos genicos para semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y 4-HB deshidrogenasa, respectivamente. La eliminacion de uno o ambos genes que codifican semialdehndo succmico deshidrogenasas nativas conocida (gabD) o supuesta (aldA) tema poco efecto sobre el rendimiento. Finalmente, debe observarse que las celulas crecieron hasta una DO mucho menor en las cepas productoras de 4-HB que en los controles (figura 11c).
Una ruta alternativa para la produccion de 4-HB a partir de glucosa es por medio de a-cetoglutarato. Se exploro el uso de una a-cetoglutarato descarboxilasa a partir de Mycobacterium tuberculosis, Tian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 10670-10675 (2005) para producir semialdehndo succmico directamente a partir de a-cetoglutarato (etapa 8 en la figura 2). Para demostrar que este gen (0032) era funcional in vivo, se expreso en pZ13 en el mismo huesped que 4-HB deshidrogenasa (gen 0036) en pZA33. Esta cepa podfa producir mas de 4-HB 1,0 mM en un plazo de 24 horas tras la induccion con IPTG 1 mM (figura 12). Puesto que esta cepa no expresa una semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, se elimina la posibilidad de produccion de semialdehndo succmico por medio
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de succinil-CoA. Tambien es posible que los genes nativos responsables de la produccion de semialdehndo succmico puedan funcionar en esta ruta (etapas 4 y 5 en la figura 2); sin embargo, la cantidad de 4-HB producido cuando el plasmido pZE13-0032 se dejo fuera del huesped es insignificante.
Produccion de BDO a partir de 4-HB. La produccion de BDO a partir de 4-HB requirio dos etapas de reduccion, catalizadas por deshidrogenasas. Alcohol y aldehndo deshidrogenasas (ADH y ALD, respectivamente) son enzimas dependientes de NAD+/H y/o NADP+/H que juntas pueden reducir un grupo acido carboxflico en una molecula para dar un grupo alcohol, o a la inversa, puede realizar la oxidacion de un alcohol para dar un acido carboxflico. Esta biotransformacion se ha demostrado en Clostridium acetobutylicum de tipo natural (Jewell et al., Current Microbiology, 13:215-19 (1986)), pero no se identificaron ni las enzimas responsables ni los genes responsables. Ademas, se desconoce si se requiere en primer lugar la activacion para dar 4-HB-CoA (etapa 9 en la figura 2), o si la aldehndo deshidrogenasa (etapa 12) puede actuar directamente sobre 4-HB. Se desarrollo una lista de enzimas candidatas a partir de C. acetobutylicum y organismos relacionados basandose en la actividad conocida con los analogos no hidroxilados para dar 4-HB y productos intermedios de la ruta, o por similitud con los genes caracterizados (tabla 6). Puesto que algunos de los candidatos son deshidrogenasas multifuncionales, posiblemente podnan catalizar tanto la reduccion dependiente de NAD(P)H del acido (o derivado de CoA) para dar el aldehndo, como del aldehndo para dar el alcohol. Antes de empezar a trabajar con estos genes en E. coli, en primer lugar se valido el resultado al que se hizo referencia anteriormente usando C. acetobutylicum ATCC 824. Se hicieron crecer celulas en caldo Schaedler (Accumedia, Lansing, MI) complementado con 4-HB 10 mM, en una atmosfera anaerobia de CO2 al 10%, H2 al 10% y N2 al 80% a 30°C. Se tomaron muestras de cultivo periodicas, se centrifugaron y se analizo el caldo para determinar BDO mediante CG-EM tal como se describe a continuacion. Se detectaron concentraciones de BDO de 0,1 mM, 0,9 mM y 1,5 mM tras 1 dfa, 2 dfas y 7 dfas de incubacion, respectivamente. No se detecto BDO en cultivo hecho crecer sin adicion de 4-HB. Para demostrar que el BDO producido se derivaba a partir de glucosa, se hizo crecer la mejor cepa productora de BDO, MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33- 0034-0036, en medio mmimo M9 complementado con glucosa marcada uniformemente con 13C 4 g/l. Se indujeron las celulas a DO de 0,67 con IPTG 1 mM, y se tomo una muestra tras 24 horas. Se realizo el analisis del sobrenadante de cultivo mediante espectrometna de masas.
A continuacion se sometieron a prueba candidatos genicos para la ruta de conversion de 4-HB en BDO para determinar la actividad cuando se expresaban en el huesped de E. coli MG1655 lacIQ. Se hicieron crecer cepas recombinantes que conteman cada candidato genico expresado en pZA33 en presencia de IPTG 0,25 mM durante cuatro horas a 37°C para inducir completamente la expresion de la enzima. Cuatro horas tras la induccion, se recogieron las celulas y se sometieron a ensayo para determinar la actividad de ADH y ALD tal como se describio anteriormente. Puesto que 4-HB-CoA y 4-hidroxibutiraldehndo no estan disponibles comercialmente, se realizaron ensayos usando los sustratos no hidroxilados (tabla 9). La razon de la actividad entre sustratos de 4 carbonos y 2 carbonos para C. acetobutylicum adhE2 (0002) y E. coli adhE (0011) eran similares a las indicadas previamente en la bibliograffa Atsumi et al., Biochim. Biophys. Acta. 1207:1-11 (1994).
Tabla 9. Actividades enzimaticas in vitro en extractos celulares a partir de MG1655 lacIQ que contema pZA33 que expresan candidatos genicos para las aldehndo y alcohol deshidrogenasas. Las actividades se expresan en |imolmin'1mg de protema celular-1. N.D., no determinado
Aldehndo deshidrogenasa Alcohol deshidrogenasa
Gen | Sustrato
Butiril-CoA Acetil-CoA Butiraldehndo Acetaldehndo
0002
0,0076 0,0046 0,0264 0,0247
0003n
0,0060 0,0072 0,0080 0,0075
0011
0,0069 0,0095 0,0265 0,0093
0013
N.D. N.D. 0,0130 0,0142
0023
0,0089 0,0137 0,0178 0,0235
0025
0 0,0001 N.D. N.D.
0026
0 0,0005 0,0024 0,0008
Para los experimentos de produccion de BDO, se incluyo cat2 de Porphyromonas gingivalis W83 (gen 0034) en pZA33 para la conversion de 4-HB en 4-HB-CoA, mientras que los genes de deshidrogenasa candidatos se expresaron en pZE13. La cepa huesped era MG1655 lacIQ. Junto con los candidatos de alcohol y aldehndo deshidrogenasa, tambien se sometio a prueba la capacidad de semialdehndo succmico deshidrogenasas dependientes de CoA (sucD) para funcionar en esta etapa, debido a la similitud de los sustratos. Se hicieron crecer celulas hasta una DO de aproximadamente 0,5 en medio LB complementado con 4-HB 10 mM, inducidas con IPTG 1 mM, y se tomaron muestras de caldo de cultivo tras 24 horas y se analizaron para determinar el BDO tal como se describe a continuacion. La mejor produccion de BDO se produjo usando adhE2 a partir de C. acetobutylicum, sucD a partir de C. kluyveri, o sucD a partir P. gingivalis (figura 13). De manera interesante, la cantidad absoluta de BDO producida era mayor en condiciones aerobias; sin embargo, esto se debe principalmente a la menor densidad celular alcanzada en cultivos anaerobios. Cuando se normaliza con respecto a la DO de la celula, la produccion de BDO por biomasa unitaria es mayor en condiciones anaerobias (tabla 10).
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Tabla 10. Concentraciones de BDO absolutas y normalizadas a partir de cultivos de celulas que expresan adhE2 a partir de C. acetobutylicum, sucD partir de C. kluyveri, o sucD partir de P. gingivalis (datos de los experimentos 2, 9 y 10 en la figura 11), asf como el control negativo (experimento 1).
Gen expresado
Condiciones BDO (|iM) DO (600 nm) BDO/DO
ninguno
Aerobia 0 13,4 0
ninguno
Microaerobia 0,5 6,7 0,09
ninguno
Anaerobia 2,2 1,26 1,75
0002
Aerobia 138,3 9,12 15,2
0002
Microaerobia 48,2 5,52 8,73
0002
Anaerobia 54,7 1,35 40,5
0008n
Aerobia 255,8 5,37 47,6
0008n
Microaerobia 127,9 3,05 41,9
0008n
Anaerobia 60,8 0,62 98,1
0035
Aerobia 21,3 14,0 1,52
0035
Microaerobia 13,1 4,14 3,16
0035
Anaerobia 21,3 1,06 20,1
Tal como se trata en la seccion 2, puede ser ventajoso usar una ruta para convertir 4-HB en 4-HB-CoA que no genere acetato como subproducto. Para este fin, se sometio a prueba el uso de fosfotransbutirilasa (ptb) y butirato cinasa (bk) de C. acetobutylicum para llevar a cabo esta conversion por medio de las etapas 10 y 11 en la figura 2. Se clono el operon ptb/bk nativo de C. acetobutylicum (genes 0020 y 0021) y se expreso en pZA33. Se tomaron extractos a partir de celulas que conteman el constructo resultante y se sometieron a ensayo para determinar las dos actividades enzimaticas tal como se describe en el presente documento. La actividad espedfica de BK era de aproximadamente 65 U/mg, mientras que la actividad espedfica de PTB era de aproximadamente 5 U/mg. Una unidad (U) de actividad se define como la conversion de sustrato 1 |iM en 1 minuto a temperatura ambiente. Finalmente, se sometio a prueba el constructo para determinar la participacion en la conversion de 4-HB en BDO. Se transformaron cepas huesped con el constructo pZA33-0020-0021 descrito y pZ13-0002, y se compararon con el uso de cat2 en la produccion de BDO usando el procedimiento aerobico usado anteriormente en la figura 13. La cepa BK/PTB produjo BDO 1 mM, en comparacion con 2 mM cuando se uso cat2 (tabla 11). De manera interesante, los resultados dependfan de si la cepa huesped contema una delecion en el gen adhE nativo.
Tabla 11. Concentraciones de BDO absolutas y normalizadas a partir de cultivos de celulas que expresan adhE2 a partir de C. acetobutylicum en pZ13 junto con o bien cat2 de P. gingivalis (0034) o bien los genes PTB/BK de C. acetobutylicum en pZA33. Las cepas huesped eran o bien MG1655 lacIQ o bien MG1655 AadhE lacIQ
Genes
Cepa huesped BDO (|iM) DO (600 nm) BDO/DO
0034
MG1655 lacIQ 0,827 19,9 0,042
0020+0021
MG1655 lacIQ 0,007 9,8 0,0007
0034
MG1655 AadhE lacIQ 2,084 12,5 0,166
0020+0021
MG1655 AadhE lacIQ 0,975 18,8 0,052
Produccion de BDO a partir de glucosa. La etapa final de la corroboracion de la ruta es expresar los segmentos tanto 4-HB como BDO de la ruta en E. coli y demostrar la produccion de BDO en medio mmimo de glucosa. Se construyeron plasmidos nuevos de manera que todos los genes requeridos caben en dos plasmidos. En general, se expresaron los genes cat1, adhE y sucD a partir de pZE13 y se expresaron cat2 y 4-HBd a partir de pZA33. Se sometieron a prueba diversas combinaciones de fuente genica y orden genico en el contexto de MG1655 lacIQ. Se hicieron crecer celulas de manera anaerobia en medio mmimo M9 (Na2HPO4 6,78 g/l, KH2PO4 3,0 g/l, NaCl 0,5 g/l, NH4Cl 1,0 g/l, MgSO4 1 mM, CaCl2 0,1 mM) complementado con glucosa 20 g/l, acido 3-(N- morfolino)propanosulfonico (MOPS) 100 mM para mejorar la capacidad tamponante, tiamina 10 |ig/ml y los antibioticos apropiados. Se anadio IPTG 0,25 mM aproximadamente 15 horas tras la inoculacion y se tomaron muestras de sobrenadante de cultivo para analisis de BDO, 4-HB y succinato 24 y 48 horas tras la induccion. La produccion de BDO parecio mostrar una dependencia del orden genico (tabla 12). Se obtuvo la mayor produccion de BDO, mas de 0,5 mM, expresandose en primer lugar cat2, seguido por 4-HBd en pZA33, y cat1 seguido por sucD de P. gingivalis en pZ13. La adicion de adhE2 de C. acetobutylicum en la ultima posicion en pZE13 dio como resultado una ligera mejora. Tambien se produjeron 4-HB y succinato a concentraciones mas altas.
Tabla 12. Produccion de BDO, 4-HB y succinato en cepas de E. coli recombinantes que expresan combinaciones de genes de la ruta de BDO, que se hacen crecer en medio mmimo complementado con glucosa 20 g/l. Las concentraciones se facilitan en mM.
24 horas 48 horas
Muestras
pZE13 pZA33 DO de induccion DO 600 nm Su 4HB BDO DO 600 nm Su 4HB BDO
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1
cat1(0004)- sucD(0035) 4hbd (0036)- cat2(0034) 0,92 1,29 5,44 1,37 0,240 1,24 6,42 1,49 0,280
2
cat1(0004)- sucD(0008N) 4hbd (0036)- cat2(0034) 0,36 1,11 6,90 1,24 0,011 1,06 7,63 1,33 0,011
3
adhE(0002)- cat1(0004)- sucD(0035) 4hbd (0036)- cat2(0034) 0,20 0,44 0,34 1,84 0,050 0,60 1,93 2,67 0,119
4
catl(0004)- sucD(0035)- adhE(0002) 4hbd (0036)- cat2(0034) 1,31 1,90 9,02 0,73 0,073 1,95 9,73 0,82 0,077
5
adhE(0002)- cat1(0004)- sucD(0008N) 4hbd (0036)- cat2(0034) 0,17 0,45 1,04 1,04 0,008 0,94 7,13 1,02 0,017
6
cat1(0004)- sucD(0008N)- adhE(0002) 4hbd (0036)- cat2(0034) 1,30 1,77 10,47 0,25 0,004 1,80 11,49 0,28 0,003
7
cat1(0004)- sucD(0035) cat2(0034)- 4hbd(0036) 1,09 1,29 5,63 2,15 0,461 1,38 6,66 2,30 0,520
8
cat1(0004)- suCD(0008N) cat2(0034)- 4hbd(0036) 1,81 2,01 11,28 0,02 0,000 2,24 11,13 0,02 0,000
9
adhE(0002)- cat1(0004)- sucD(0035) cat2(0034)- 4hbd(0036) 0,24 1,99 2,02 2,32 0,106 0,89 4,85 2,41 0,186
10
catl(0004)- sucD(0035)- adhE(0002) cat2(0034)- 4hbd(0036) 0,98 1,17 5,30 2,08 0,569 1,33 6,15 2,14 0,640
11
adhE(0002)- cat1(0004)- sucD(0008N) cat2(0034)- 4hbd(0036) 0,20 0,53 1,38 2,30 0,019 0,91 8,10 1,49 0,034
12
cat1(0004)- sucD(0008N)- adhE(0002) cat2(0034)- 4hbd(0036) 2,14 2,73 12,07 0,16 0,000 3,10 11,79 0,17 0,002
13
solo vector solo vector 2,11 2,62 9,03 0,01 0,000 3,00 12,05 0,01 0,000
Analisis de BDO, 4-HB y succinate mediante CG-EM. Se derivatizaron BDO, 4-HB y succinato en muestras de cultivo celular y fermentacion mediante sililacion y se analizaron cuantitativamente mediante CG-EM usando metodos adaptados a partir de informes de la bibliograffa ((Simonov et al., J. Anal Chem. 59: 965-971 (2004)). El metodo desarrollado demostro buena sensibilidad hasta 1 |iM, linealidad hasta al menos 25 mM, as^ como selectividad y reproducibilidad excelentes.
Se realizo la preparacion de la muestra tal como sigue: se secaron 100 |il de muestras filtradas (filtros de jeringa de 0,2 |im o 0,45 |im), por ejemplo caldo de fermentacion, cultivo celular o disoluciones patron, en un aparato Speed Vac Concentrator (Savant SVC-100H) durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiental, seguido por la adicion de 20 |il de disolucion de ciclohexanol 10 mM, como patron interno, en dimetilformamida. Se agitaron mediante vortex las mezclas y se sonicaron en un bano de agua (Branson 3510) durante 15 min para garantizar la homogeneidad. Se anadieron 100 |il de reactivo de derivatizacion de sililacion, N,O-bis(trimetilsilil)trifluoro-acetimida (BSTFA) con el 1% de trimetilclorosilano, y se incubo la mezcla a 70°C durante 30 min. Se centrifugaron las muestras derivatizadas durante 5 min, y se inyectaron las disoluciones transparentes directamente en CG-EM. Todos los productos qmmicos y reactivos eran de Sigma-Aldrich, con la excepcion de BDO que se adquirio de J.T.Baker.
Se realizo CG-EM en un cromatografo de gases 6890N de Agilent, conectado con un detector selectivo de masas (MSD) 5973N que se hizo funcionar en el modo de ionizacion de impacto electronico (EI), que se uso para el analisis. Se uso una columna capilar DB-5MS (J&W Scientific, Agilent Technologies), 30 m x 0,25 mm de d.i. x 0,25 |im de grosor de pelteula. Se hizo funcionar el CG en un modo de inyeccion fraccionada introduciendo 1 |il de muestra a una racion de fraccionamiento de 20:1. La temperatura del orificio de inyeccion era de 250°C. Se uso helio como gas portador, y se mantuvo la velocidad de flujo a 1,0 ml/min. Se optimizo un programa de gradiente de temperatura para garantizar buena resolucion de los analitos de interes e interferencia de matriz minima. Inicialmente se mantuvo el horno a 80°C durante 1 min, luego se aumento hasta 120°C a 2°C/min, seguido por un aumento rapido hasta 320°C a 100°C/min y un mantenimiento final durante 6 min a 320°C. Se mantuvo el tubo de transferencia de conexion con EM a 280°C. Se adquirieron los datos usando ajustes de configuracion de EM de “masa baja” y barrido en un intervalo de masa de 30-400 m/z. El tiempo de analisis total fue de 29 min incluyendo 3 min de retraso del disolvente. Los tiempos de retencion correspondfan a 5,2, 10,5, 14,0 y 18,2 min para ciclohexanol derivatizado con BSTFA, BDO, 4-HB y succinato, respectivamente. Para analisis cuantitativo, se seleccionaron los siguientes fragmentos de masa espedfica (cromatogramas de iones extrafdos): m/z 157 para
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ciclohexanol de patron interno, 116 para BDO y 147 para tanto 4-HB como succinato. Se construyeron curvas de calibracion patrones usando disoluciones de analito en el medio de cultivo celular o fermentacion correspondiente para coincidir lo mas posible con la matriz de muestra. Se procesaron los datos de CG-EM usando software Environmental Data Analysis ChemStation (Agilent Technologies).
Los resultados indicaron que la mayona del 4-HB y BDO producidos estaban marcados con 13C (figura 14, lados de la derecha). Para comparacion se muestran espectros de masas a partir de un cultivo paralelo que se hizo crecer en glucosa no marcada (figura 14; lados de la izquierda). Observese que los picos observados son para fragmentos de la molecula derivatizada que contema diferentes numeros de atomos de carbono a partir del metabolito. El reactivo de derivatizacion tambien aporta algunos atomos de carbono y silicio que marcan la distribucion que se produce de manera natural, por lo que los resultados no son estrictamente cuantitativos.
Produccion de BDO a partir de 4-HB usando rutas alternativas. Tambien se sometieron a prueba las diversas rutas alternativas para la produccion de BDO. Estas incluyen el uso de la enzima SucCD de E. coli nativa para convertir succinato en succinil-CoA (tabla 13, filas 2-3), el uso de a-cetoglutarato descarboxilasa en la ruta de a-cetoglutarato (tabla 13, fila 4) y el uso de PTB/BK como medio alternativo para generar el derivado de CoA de 4HB (tabla 13, fila 1). Se construyeron cepas que conteman plasmidos que expresaban los genes indicados en la tabla 13, que abarcan estas variantes. Los resultados muestran que en todos los casos, se produjo la produccion de 4-HB y bDo (tabla 13).
Tabla 13. Produccion de BDO, 4-HB, y succinato en genes de cepas de E. coli recombinantes para variantes de la ruta de BDO diferentes, que se hacen crecer de manera anaerobia en medio mmimo complementado con glucosa 20 g/l, y se recogen 24 horas tras la induccion con IPTG 0,1 mM. Las concentraciones se facilitan en mM.
Genes en pZE13
Genes en pZA33 Succinato 4-HB BDO
0002+0004+0035
0020n-0021n-0036 0,336 2,91 0,230
0038+0035
0034-0036 0,814 2,81 0,126
0038+0035
0036-0034 0,741 2,57 0,114
0035+0032
0034-0036 5,01 0,538 0,154
EJEMPLO V
Biosintesis de acido 4-hidroxibutanoico, y-butirolactona y 1,4-butanodiol
Este ejemplo describe la produccion biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico, y-butirolactona y 1,4-butanodiol usando fermentacion y otros bioprocedimientos.
A continuacion se describen metodos para la integracion de la epata de fermentacion de 4-HB en un procedimiento completo para la produccion de GBL, 1,4-butanodiol (BDO) y tetrahidrofurano (THF) purificados. Puesto que 4-HB y GBL estan en equilibrio, el caldo de fermentacion contendra ambos compuestos. A pH bajo este equilibrio se desplaza a favor de GBL. Por tanto, la fermentacion puede funcionar a pH 7,5 o menor, generalmente pH 5,5 o menor. Tras la eliminacion de la biomasa, la corriente de producto entra en una etapa de separacion en la que se elimina GBL y se recircula la corriente restante enriquecida en 4-HB. Finalmente, se destila GBL para eliminar cualquier impureza. El procedimiento funciona de una de tres maneras: 1) fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; 2) fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua; 3) fermentacion continua y separacion continua. Los dos primeros de estos modos se muestran esquematicamente en la figura 15. Los procedimientos de fermentacion integrados descritos a continuacion tambien se usan para las celulas productoras de BDO de la invencion para la biosintesis de BDO y productos de la familia de BDO posteriores.
Protocolo de fermentacion para producir 4-HB/GBL (discontinuo): Se hace crecer el organismo de produccion en un biorreactor de 10 l burbujeado con una mezcla de N2/CO2, usando 5 l de caldo que contiene fosfato de potasio 5 g/l, cloruro de amonio 2,5 g/l, sulfato de magnesio 0,5 g/l y licor de maceracion de mafz 30 g/l, y una concentracion de glucosa inicial de 20 g/l. A medida que las celulas crecen y usan la glucosa, se alimenta glucosa al 70% adicional en el biorreactor a una velocidad que equilibra aproximadamente el consumo de glucosa. Se mantiene la temperatura del biorreactor a 30°C. El crecimiento continua durante aproximadamente 24 horas, hasta que 4-HB alcanza una concentracion de entre 20-200 g/l, siendo la densidad celular de entre 5 y 10 g/l. El pH no se controla, y normalmente disminuira hasta pH 3-6 al final de la ejecucion. Tras completarse el periodo de cultivo, se pasa el contenido del fermentador a traves de una unidad de separacion de celular (por ejemplo, centnfuga) para eliminar las celulas y los residuos celulares, y se transfiere el caldo de fermentacion a una unidad de separacion de producto. El aislamiento de 4-HB y/o GBL tendra lugar mediante procedimientos de separacion convencionales empleados en la tecnica para separar productos organicos de disoluciones acuosas diluidas, tales como extraccion lfquido-lfquido usando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una disolucion organica de 4-HB/GBL. Entonces se somete la disolucion resultante a metodos de destilacion convencionales para retirar y recircular el disolvente organico y para proporcionar GBL (punto de ebullicion de 204-205°C) que se afsla como un lfquido purificado.
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Protocolo de fermentacion para producir 4-HB/GBL (completamente continuo): En primer lugar se hace crecer el organismo de produccion en modo discontinuo usando el aparato y la composicion de medio descritos anteriormente, excepto porque la concentracion de glucosa inicial es de 30-50 g/l. Cuando se agota la glucosa, se suministra medio de alimentacion de la misma composicion de manera continua a una velocidad de entre 0,5 l/h y 1 l/h y se retira lfquido a la misma velocidad. La concentracion de 4-HB en el biorreactor permanece constante a 3040 g/l, y la densidad celular permanece constante a entre 3-5 g/l. Se mantiene la temperatura a 30°C, y se mantiene el pH a 4,5 usando NaOH y HCl concentrados, segun se requiera. Se hace funcionar el biorreactor de manera continua durante un mes, tomandose muestras cada dfa para garantizar la constancia de la concentracion de 4-HB. En modo continuo, se retira constantemente el contenido del fermentador a medida que se suministra medio de alimentacion nuevo. Entonces se somete la corriente de salida, que contiene celulas, medio y productos 4-HB y/o GBL, a un procedimiento de separacion de producto continuo, con o sin eliminacion de celulas y residuos celulares, y tendra lugar mediante metodos de separacion continua convencionales empleados en la tecnica para separar productos organicos de disoluciones acuosas diluidas, tales como extraccion lfquido-lfquido continua usando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una disolucion organica de 4- HB/GBL. Posteriormente se somete la disolucion resultante a metodos de destilacion continua convencionales para retirar y recircular el disolvente organico y para proporcionar GBL (punto de ebullicion de 204-205°C) que se afsla como un lfquido purificado.
Protocolo de reduccion de GBL: Una vez aislado y purificado GBL tal como se describio anteriormente, entonces se sometera a protocolos de reduccion tales como aquellos bien conocidos en la tecnica (referencias citadas) para producir 1,4-butanodiol o tetrahidrofurano (THF) o una mezcla de los mismos. Se conocen bien catalizadores de hidrogenacion heterogeneos u homogeneos combinados con GBL a presion de hidrogeno para proporcionar los productos 1,4-butanodiol o tetrahidrofurano (THF) o una mezcla de los mismos. Es importante observar que la mezcla del producto 4-HB/GBL que se separa del caldo de fermentacion, tal como se describio anteriormente, puede someterse directamente, antes del aislamiento y la purificacion de GBL, a estos mismos protocolos de reduccion para proporcionar los productos 1,4-butanodiol o tetrahidrofurano o una mezcla de los mismos. Entonces se afslan y se purifican los productos resultantes, 1,4-butanodiol y THF, mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica.
Protocolo de fermentacion e hidrogenacion para producir BDO o THF directamente (discontinuo): Se hacen crecer celulas en un biorreactor de 10 l burbujeado con una mezcla de N2/CO2, usando 5 l de caldo que contiene fosfato de potasio 5 g/l, cloruro de amonio 2,5 g/l, sulfato de magnesio 0,5 g/l y licor de maceracion de mafz 30 g/l, y una concentracion de glucosa inicial de 20 g/l. A medida que las celulas crecen y usan la glucosa, se alimenta glucosa al 70% adicional en el biorreactor a una velocidad que equilibra aproximadamente el consumo de glucosa. Se mantiene la temperatura del biorreactor a 30°C. El crecimiento continua durante aproximadamente 24 horas, hasta que 4-HB alcanza una concentracion de entre 20-200 g/l, siendo la densidad celular de entre 5 y 10 g/l. No se controla el pH, y normalmente disminuira hasta pH 3-6 hacia el final de la ejecucion. Tras completarse el periodo de cultivo, se pasa el contenido del fermentador a traves de una unidad de separacion celular (por ejemplo, centnfuga) para eliminar celulas y residuos celulares, y se transfiere el caldo de fermentacion a una unidad de reduccion (por ejemplo, recipiente de hidrogenacion), en la que se reduce directamente la mezcla de 4-HB/GBL para dar o bien 1,4- butanodiol o bien THF o bien una mezcla de los mismos. Tras completarse el procedimiento de reduccion, se transfiere el contenido del reactor a una unidad de separacion de producto. El aislamiento de 1,4-butanodiol y/o THF tendra lugar mediante procedimientos de separacion convencionales empleados en la tecnica para separar productos organicos de disoluciones acuosas diluidas, tales como extraccion lfquido-lfquido usando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una disolucion organica de 1,4-butanodiol y/o THF. Entonces se somete la disolucion resultante a metodos de destilacion convencionales para retirar y recircular el disolvente organico y para proporcionar 1,4-butanodiol y/o THF que se afslan como lfquidos purificados.
Protocolo de fermentacion e hidrogenacion para producir BDO o THF directamente (completamente continuo): En primer lugar se hacen crecer las celulas en modo discontinuo usando el aparato y la composicion de medio descritos anteriormente, excepto porque la concentracion de glucosa inicial es de 30-50 g/l. Cuando se agota la glucosa, se suministra medio de alimentacion de la misma composicion de manera continua a una velocidad de entre 0,5 l/h y 1 l/h, y se retira lfquido a la misma velocidad. La concentracion de 4-HB en el biorreactor permanece constante a 3040 g/l, y la densidad celular permanece constante a entre 3-5 g/l. Se mantiene la temperatura a 30°C, y se mantiene el pH a 4,5 usando NaOH y HCl concentrados, segun se requiera. Se hace funcionar el biorreactor de manera continua durante un mes, tomandose muestras cada dfa para garantizar la constancia de la concentracion de 4-HB. En modo continuo, se retira constantemente el contenido del fermentador a medida que se suministra medio de alimentacion nuevo. Entonces se hace pasar la corriente de salida, que contiene celulas, medio y productos 4-HB y/o GBL, a traves de una unidad separacion celular (por ejemplo, centnfuga) para eliminar celulas y residuos celulares, y se transfiere el caldo de fermentacion a una unidad de reduccion continua (por ejemplo, recipiente de hidrogenacion), en el que se reduce directamente la mezcla 4-HB/GBL para dar o bien 1,4-butanodiol o bien THF o bien una mezcla de los mismos. Tras completarse el procedimiento de reduccion, se transfiere el contenido del reactor a una unidad de separacion de producto continua. El aislamiento de 1,4-butanodiol y/o THF tendra lugar mediante procedimientos de separacion continua convencionales empleados en la tecnica para separar productos organicos de disoluciones acuosas diluidas, tales como extraccion lfquido-lfquido usando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una disolucion organica de 1,4-butanodiol y/o THF.
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Entonces se somete la disolucion resultante a metodos de destilacion continua convencionales para retirar y recircular el disolvente organico y proporcionar 1,4-butanodiol y/o THF que se afslan como lfquidos purificados.
Protocolo de fermentacion para producir BDO directamente (discontinuo): Se hace creer el organismo de produccion en un biorreactor de 10 l burbujeado con una mezcla de N2/CO2, usando 5 l de caldo que contiene fosfato de potasio 5 g/l, cloruro de amonio 2,5 g/l, sulfato de magnesio 0,5 g/l y licor de maceracion de mafz 30 g/l, y una concentracion de glucosa inicial de 20 g/l. A medida que las celulas crecen y usan la glucosa, se alimenta glucosa al 70% adicional en el biorreactor a una velocidad que equilibra aproximadamente el consumo de glucosa. Se mantiene la temperatura del biorreactor a 30°C. El crecimiento continua durante aproximadamente 24 horas, hasta que el BDO alcanza una concentracion de entre 20-200 g/l, siendo la densidad celular generalmente de entre 5 y 10 g/l. Tras completarse el periodo de cultivo, se pasa el contenido del fermentador a traves de una unidad de separacion celular (por ejemplo, centnfuga) para eliminar celulas y residuos celulares, y se transfiere el caldo de fermentacion a una unidad de separacion de producto. El aislamiento de BDO tendra lugar mediante procedimientos de separacion convencionales empleados en la tecnica para separar productos organicos de disoluciones acuosas diluidas, tales como extraccion lfquido-lfquido usando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una disolucion organica de BDO. Entonces se somete la disolucion resultante a metodos de destilacion convencionales para retirar y recircular el disolvente organico y proporcionar BDO (punto de ebullicion de 228- 229°C) que se afsla como un lfquido purificado.
Protocolo de fermentacion para producir BDO directamente (completamente continuo): En primer lugar se hace crecer el organismo de produccion en modo discontinuo usando el aparato y la composicion de medio descritos anteriormente, excepto porque la concentracion de glucosa inicial es de 30-50 g/l. Cuando se agota la glucosa, se suministra medio de alimentacion de la misma composicion de manera continua a una velocidad de entre 0,5 l/h y 1 l/h, y se retira lfquido a la misma velocidad. La concentracion de BDO en el biorreactor permanece constante a 3040 g/l, y la densidad celular permanece constante a entre 3-5 g/l. Se mantiene la temperatura a 30°C, y se mantiene el pH a 4,5 usando NaOH y HCl concentrados, segun se requiera. Se hace funcionar el biorreactor de manera continua durante un mes, tomandose muestras cada dfa para garantizar la constancia de la concentracion de BDO. En modo continuo, se retira constantemente el contenido del fermentador a medida que se suministra medio de alimentacion nuevo. Entonces se somete la corriente de salida, que contiene celulas, medio y el producto BDO, a un procedimiento de separacion de producto continuo, con o sin eliminacion de celulas y residuos celulares, y tendra lugar mediante metodos de separacion continua convencionales empleados en la tecnica para separar productos organicos de disoluciones acuosas diluidas, tales como extraccion lfquido-lfquido continua usando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una disolucion organica de BDO. Posteriormente se somete la disolucion resultante a metodos de destilacion continua convencionales para retirar y recircular el disolvente organico y proporcionar BDO (punto de ebullicion de 228-229°C) que se afsla como un lfquido purificado (p.f. 20°C).
Aunque se ha descrito la invencion con referencia a las realizaciones dadas a conocer, los expertos en la tecnica apreciaran facilmente que los ejemplos y estudios espedficos detallados anteriormente solo son ilustrativos de la invencion. Debe entenderse que pueden hacerse diversas modificaciones. Por consiguiente, la invencion solo se limita por las siguientes reivindicaciones.
Realizaciones preferidas
1. Un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural, que comprende un organismo microbiano que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa, en el que dicho acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para secretar acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) monomerico.
2. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, en el que dicha ruta biosintetica de 4-HB comprende 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y succinil-CoA sintetasa y semialdehfdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa.
3. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, en el que dicho acido nucleico exogeno codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.
4. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 3, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una a-cetoglutarato descarboxilasa exogena.
5. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas dos o mas acidos nucleicos exogenos.
6. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 3, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una succinil-CoA sintetasa exogena, semialdehido succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exogena o succinil-CoA sintetasa exogena y semialdehido succmico deshidrogenasa dependiente de CoA
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7. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, en el que dicho organismo microbiano carece de una actividad biosintetica de 4-HB endOgena seleccionada de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y a- cetoglutarato descarboxilasa.
8. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, en el que dicho al menos un acido nucleico exOgeno comprende ademas un acido nucleico codificante heterOlogo.
9. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, en el que dicho 4-HB monomerico se expresa a una concentraciOn intracelular de al menos aproximadamente 5 mM.
10. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 9, que comprende ademas una concentraciOn intracelular de dicho 4-HB monomerico de aproximadamente 10 mM o mas.
11. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 1, que comprende ademas un medio de cultivo sustancialmente anaerobio.
12. Un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural, que comprende un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), comprendiendo dichas rutas al menos un acido nucleico exOgeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, a-cetoglutarato descarboxilasa, aldehfdo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa, en el que dicho acido nucleico exOgeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (BDO).
13. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, en el que dicha ruta biosintetica de 4-HB comprende 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y succinil-CoA sintetasa y semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa.
14. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, en el que dicho acido nucleico exOgeno codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.
15. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 14, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una a-cetoglutarato descarboxilasa exOgena.
16. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, en el que dicho al menos un acido nucleico exOgeno comprende ademas dos o mas acidos nucleicos exOgenos.
17. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 14, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una succinil-CoA sintetasa exOgena, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exOgena o succinil-CoA sintetasa exOgena y semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exOgena.
18. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, en el que dicho organismo microbiano carece de una actividad biosintetica de 4-HB endOgena seleccionada de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y a- cetoglutarato descarboxilasa.
19. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, en el que dicho al menos un acido nucleico exOgeno comprende ademas un acido nucleico codificante heterOlogo.
20. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural de los puntos 14, 15 O 17, en el que dicho acido nucleico exOgeno se expresa en cantidades suficientes para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico.
21. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, en el que dicha ruta biosintetica de BDO comprende aldehfdo deshidrogenasa, y alcohol deshidrogenasa o aldehfdo/alcohol deshidrogenasa.
22. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 21, en el que dicha ruta biosintetica de BDO comprende ademas 4-hidroxibutirato:CoA transferasa o 4-butirato cinasa y fosfotransbutirilasa.
23. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 21, en el que dicho acido nucleico exOgeno codifica para una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa.
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24. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 21, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas dos o mas acidos nucleicos exogenos.
25. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 21 o 22, en el que dicho organismo microbiano carece de una actividad biosintetica de BDO endogena seleccionada de 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, aldehfdo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa y aldelmdo/alcohol deshidrogenasa.
26. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 21, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas un acido nucleico codificante heterologo.
27. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 12, que comprende ademas un medio de cultivo sustancialmente anaerobio.
28. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 25, en el que dicho BDO monomerico se expresa a una concentracion intracelular de al menos aproximadamente 5 mM.
29. El biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural del punto 28, que comprende ademas una concentracion intracelular de dicho BDO monomerico de aproximadamente 10 mM o mas.
30. Un metodo para la produccion de 4-HB, que comprende cultivar un organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene una ruta biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) monomerico.
31. El metodo del punto 30, en el que dicha ruta biosintetica de 4-HB comprende 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y succinil-CoA sintetasa y semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa.
32. El metodo del punto 30, en el que dicho acido nucleico exogeno codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.
33. El metodo del punto 32, en el que dicho organismo microbiano que no se produce de manera natural comprende ademas un acido nucleico que codifica para una a-cetoglutarato descarboxilasa exogena.
34. El metodo del punto 30, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas dos o mas acidos nucleicos exogenos.
35. El metodo del punto 32, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una succinil-CoA sintetasa exogena, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exogena o succinil-CoA sintetasa exogena y semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exogena.
36. El metodo del punto 30, en el que dicho organismo microbiano que no se produce de manera natural carece de una actividad biosintetica de 4-HB endogena seleccionada de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y a-cetoglutarato descarboxilasa.
37. El metodo del punto 30, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas un acido nucleico codificante heterologo.
38. El metodo del punto 30, en el que dicho 4-HB monomerico se expresa a una concentracion intracelular de al menos aproximadamente 5 mM.
39. El metodo del punto 38, que comprende ademas una concentracion intracelular de dicho 4-HB monomerico de aproximadamente 10 mM o mas.
40. El metodo del punto 30, que comprende ademas aislar el 4-HB.
41. El metodo del punto 30, que comprende ademas un medio de cultivo que tiene un pH de aproximadamente 7,5 o
menos.
42. El metodo del punto 41, que comprende ademas aislar y-butirolactona (GBL).
43. El metodo del punto 42, en el que dicho aislamiento de GBL comprende la separacion de GBL.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
44. El metodo del punto 43, que comprende ademas destilacion para producir GBL sustancialmente puro.
45. El metodo del punto 30 o 44, que comprende ademas hidrogenacion qmmica de 4-HB, GBL o una mezcla de los mismos para producir 1-4 butanodiol (BDO).
46. El metodo del punto 30 o 44, que comprende ademas hidrogenacion qmmica de 4-HB, GBL o una mezcla de los mismos para producir tetrahidrofurano (THF).
47. Un metodo para la produccion de BDO, que comprende cultivar un biocatalizador microbiano que no se produce de manera natural, que comprende un organismo microbiano que tiene rutas biosinteticas de acido 4- hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), comprendiendo dichas rutas al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, a- cetoglutarato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa o una aldehndo/alcohol deshidrogenasa durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO).
48. El metodo del punto 47, en el que dicha ruta biosintetica de 4-HB comprende 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y succinil-CoA sintetasa y semialdehfdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA o a-cetoglutarato descarboxilasa.
49. El metodo del punto 47, en el que dicho acido nucleico exogeno codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.
50. El metodo del punto 49, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una a-cetoglutarato descarboxilasa exogena.
51. El metodo del punto 47, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas dos o mas acidos nucleicos exogenos.
52. El metodo del punto 49, que comprende ademas un acido nucleico que codifica para una succinil-CoA sintetasa exogena, semialdehfdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exogena o succinil-CoA sintetasa exogena y semialdehfdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA exogena.
53. El metodo del punto 47, en el que dicho organismo microbiano carece de una actividad biosintetica de 4-HB endogena seleccionada de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, succinil-CoA sintetasa, semialdehfdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y a-cetoglutarato descarboxilasa.
54. El metodo del punto 47, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas un acido nucleico codificante heterologo.
55. El metodo de los puntos 49, 50 o 52, en el que dicho acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico.
56. El metodo del punto 47, en el que dicha ruta biosintetica de BDO comprende aldehfdo deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa o una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa.
57. El metodo del punto 56, en el que dicha ruta biosintetica de BDO comprende ademas 4-hidroxibutirato:CoA transferasa o 4-butirato cinasa y fosfotransbutirilasa.
58. El metodo del punto 56, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas dos o mas acidos nucleicos exogenos.
59. El metodo del punto 56 o 57, en el que dicho organismo microbiano carece de una actividad biosintetica de BDO endogena seleccionada de 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, 4-butirato cinasa, fosfotransbutirilasa, aldehfdo deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa y aldehfdo/alcohol deshidrogenasa.
60. El metodo del punto 56, en el que dicho al menos un acido nucleico exogeno comprende ademas un acido nucleico codificante heterologo.
61. El metodo del punto 47, que comprende ademas un medio de cultivo sustancialmente anaerobio.
62. El metodo del punto 59, en el que dicho BDO monomerico se expresa a una concentracion intracelular de al menos aproximadamente 5 mM.
63. El metodo del punto 62, que comprende ademas una concentracion intracelular de dicho BDO monomerico de aproximadamente 10 mM o mas.

Claims (8)

  1. 10
  2. 2.
  3. 3. 15
  4. 4.
    20 5.
  5. 6.
    25
  6. 7.
  7. 8.
    30
  8. 9.
    35 10.
    REIVINDICACIONES
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural que tiene rutas biosinteticas de acido 4- hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (1,4-BDO), comprendiendo dichas rutas acidos nucleicos exogenos que codifican para a) una a-cetoglutarato deshidrogenasa, b) una semialdehudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, c) una 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, d) una 4-hidroxibutiril- CoA:acetil-CoA transferasa, o una butirato cinasa y una fosfotransbutirilasa, y e) una aldehfdo deshidrogenasa y una alcohol deshidrogenasa, o una aldehudo/alcohol deshidrogenasa, en el que dichos acidos nucleicos exogenos se expresan en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (1,4-BDO).
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1, en el que d) es una 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferasa.
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1, en el que d) es una butirato cinasa y una fosfotransbutirilasa.
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1, en el que e) es una aldehfdo deshidrogenasa y una alcohol deshidrogenasa.
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1, en el que e) es una aldehfdo/alcohol deshidrogenasa.
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1, en el que dichos acidos nucleicos exogenos comprenden al menos un acido nucleico heterologo.
    Organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1, en el que dicho organismo microbiano esta en un medio de cultivo sustancialmente anaerobio.
    Metodo para la produccion de 1,4-BDO que comprende cultivar el organismo microbiano que no se produce de manera natural segun la reivindicacion 1 durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-BDO.
    Metodo segun la reivindicacion 8, en el que dichos acidos nucleicos exogenos comprenden al menos un acido nucleico heterologo.
    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que dicho organismo microbiano esta en un medio de cultivo sustancialmente anaerobio.
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