EA017733B1 - СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СЛИТЫХ БЕЛКОВ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу очистки Fc-слитого белка, имеющего pI 6,9-9,5, предусматривающему белок А- или белок G-аффинную хроматографию, катионообменную хроматографию, анионообменную хроматографию и гидроксиапатитную хроматографию.

Description

Данное изобретение относится к области очистки белков. Более конкретно оно относится к очистке Рс-слитых белков посредством белок А- или белок 6-аффинной хроматографии, катионообменной хроматографии, анионообменной хроматографии и гидроксиапатитной хроматографии.

Уровень техники

Белки стали коммерчески важными в качестве лекарственных средств, которые обычно называют биологическими средствами. Одной из важнейших задач является развитие экономичных и эффективных способов для очистки белков в коммерческом масштабе. Хотя многие способы доступны теперь для крупномасштабного получения белков, неочищенные продукты, такие как супернатанты культур клеток, содержат на только желаемый продукт, но также примеси (загрязнения), которые трудно отделить от желаемого продукта. Хотя супернатанты культур клеток, экспрессирующих рекомбинантные белковые продукты, могут содержать меньше загрязнений, если эти клетки выращиваются в бессывороточной среде, белки клетки-хозяина (НСР) все еще требуют элиминации во время процесса очистки. Кроме того, органы здравоохранения требуют высоких стандартов чистоты для белков, предназначенных для введения человеку.

Многие способы очистки содержат стадии, требующие применения низкого или высокого рН, высоких концентраций солей или других чрезвычайных условий, которые могут ставить под угрозу биологическую активность этого белка.

Известен ряд хроматографических систем, которые широко применимы для очистки белков.

Системы ионообменной хроматографии используются для разделения белков прежде всего на основе различий в заряде. В ионообменной хроматографии заряженные участки на поверхности растворенного вещества аттрагируются противоположными зарядами, присоединенными к хроматографическому матриксу, при условии, что ионная сила окружающего буфера является низкой. Элюция обычно достигается увеличением ионной силы (т.е. проводимости) этого буфера для конкуренции с растворенным веществом за заряженные сайты ионообменного матрикса. Изменение рН и, следовательно, изменение заряда растворенного вещества является другим путем достижения элюции этого растворенного вещества. Изменение продуктивности или рН может быть постепенным (градиентная элюция) или ступенчатым (ступенчатая элюция).

Анионообменники могут классифицироваться как слабые или сильные. Заряженной группой на слабом анионообменнике является слабое основание, которое становится депротонированным и, следовательно, теряет свой заряд при высоком рН. ДЭАЭ-сефароза является примером слабого анионообменника, где аминогруппа может быть положительно заряженной ниже рН ~9 и постепенно теряет свой заряд при более высоких величинах рН. Диэтиламиноэтил (ДЭАЭ) или диэтил(2-гидроксипропил)аминоэтил (ОАЕ) имеют, например, хлорид в качестве противоиона. С другой стороны, сильный анионообменник содержит сильное основание, которое остается положительно заряженным на протяжении диапазона рН, обычно используемого для ионообменной хроматографии (рН 1-14). ρ-сефароза (О обозначает четвертичный аммоний) является примером сильного анионообменника.

Катионообменники могут быть также классифицированы как слабые или сильные. Сильный катионообменник содержит сильную кислоту (например, сульфопропильную группу), которая остается заряженной от рН 1 до 14; тогда как слабый катионообменник содержит слабую кислоту (например, карбоксиметильную группу), которая постепенно теряет свой заряд, когда рН уменьшается ниже 4 или 5. Карбоксиметил (СМ) и сульфопропил (8Р) имеют, например, натрий в качестве противоиона.

Другая хроматографическая смола основана на нерастворимом гидроксилированном кальцийфосфатном матриксе, называемом гидроксиапатитом. Гидроксиапатитная хроматография является способом очистки белков, который использует нерастворимый гидроксилированный фосфат кальция (Са₅(РО₄)₃ОН)₂, который образует как матрикс, так и лиганд. Функциональные группы состоят из пар положительно заряженных ионов кальция (С-сайтов) и кластеров отрицательно заряженных групп (Рсайтов). Взаимодействия между гидроксиапатитом и белками являются комплексными и многообразными. В одном способе взаимодействия положительно заряженные аминогруппы на белках связываются с отрицательно заряженными Р-сайтами, а карбоксильные группы белка взаимодействуют посредством координационного комплексообразования с С-сайтами (8Ьератб с1 а1., 2000).

Кристаллический гидроксиапатит был первым типом гидроксиапатита, использованным в хроматографии. Хроматография на керамическом гидроксиапатите (СНА) является дальнейшим развитием гидроксиапатитной хроматографии. Керамический гидроксиапатит имеет высокий срок службы (высокую прочность), хорошую способность связывания белка и может быть использован при более высоких скоростях потока и давлениях, чем кристаллический гидроксиапатит (Уо1а е1 а1., 1993).

Гидроксиапатит использовали в хроматографическом разделении белков, нуклеиновых кислот, а также антител. В гидроксиапатитной хроматографии колонку уравновешивают обычным образом и наносят пробу в фосфатном буфере низкой концентрации и затем адсорбированные белки элюируют в градиенте концентраций фосфатного буфера (Οίοναηηίηί е1 а1., 2000).

Еще один способ очистки белков основан на аффинности представляющего интерес белка в отношении другого белка, который иммобилизован на хроматографической смоле. Примерами таких иммо

- 1 017733 билизованных лигандов являются белки бактериальных клеточных стенок белок А и белок С, имеющие специфичность в отношении Ес-части некоторых иммуноглобулинов. Хотя как белок А, так и белок С имеют сильную аффинность в отношении 1дС-антител, они имеют также варьирующиеся аффинности в отношении других классов и изотипов иммуноглобулинов.

Белок А является белком в 43000 Да, который продуцируется бактериями 8!арйу1ососси5 аигеик и содержит четыре сайта связывания с Ес-районами 1§С. Белок С продуцируется стрептококками группы С и имеет два сайта связывания для Ес-района 1дС. Оба белка были широко охарактеризованы в отношении их аффинности с различными типами иммуноглобулинов. Белок Ь является следующим бактериальным белком, происходящим из Рер1о51гер1ососси5. связывающимся с иммуноглобулинами и их фрагментами, содержащими легкие цепи 1д (Акегйгот апй В_)огк, 1989).

Белок А-, белок С- и белок-Ь-аффинная хроматография широко используется для выделения и очистки иммуноглобулинов.

Поскольку сайты связывания для белка А и белка С находятся в Ес-районе иммуноглобулина, белок А- и белок С-аффинная хроматография позволяет также очистку так называемых Ес-слитых белков.

Ес-слитые белки являются химерными белками, состоящими из эффекторного района белка, такого как связывающий район рецептора, слитого с Ес-районом иммуноглобулина, который часто является иммуноглобулином С (1дС). Ес-слитые белки используются широко в качестве терапевтических средств, так как они предоставляют преимущества, придаваемые Ес-районом, такие как возможность очистки с использованием белок А- или белок С-аффинной хроматографии с аффинностями, варьирующимися в соответствии с изотипом 1дС. 1дС₁, 1дС₂ и 1дС₄ человека связываются сильно с белком А, и все 1дС человека, в том числе 1дС₃, связываются сильно с белком С;

увеличенное время полужизни в системе кровообращения, так как Ес-район связывается с рецептором спасения ЕсКп, который защищает от лизосомной деградации;

в зависимости от медицинского применения Ес-слитого белка могут быть желательными эффекторные функции Ес. Такие эффекторные функции включают в себя антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) через взаимодействия с Ес-рецепторами (ЕсуК) и комплементзависимую цитотоксичность (СЭС) посредством связывания с компонентом комплемента 1с.| (С1с.|). Изоформы 1дС проявляют различные уровни эффекторных функций. 1дС₁ и 1дС₃ человека имеют сильные эффекты АЭСС и СЭС, в то время как 1дС₂ человека проявляет слабые эффекты АЭСС и СЭС. 1дС₄ человека проявляет слабые эффекты АЭСС и не проявляет эффекты СЭС.

Время полужизни в сыворотке и эффекторные функции могут быть модулированы конструированием Ес-района для увеличения или уменьшения его связывания с ЕсКп, ЕсуК и Скр соответственно, в зависимости от терапевтического применения, предполагаемого для Ес-слитого белка.

В АЭСС Ес-район антитела связывается с Ес-рецепторами (ЕсуК) на поверхности иммунных эффекторных клеток, таких как природные клетки-киллеры и макрофаги, приводя к фагоцитозу или лизису этих клеток-мишеней.

В СЭС эти антитела убивают клетки-мишени запуском каскада комплемента на поверхности клеток. Изоформы 1дС проявляют различные уровни эффекторных функций, увеличивающиеся в последовательности 1дС₄<1дС₂<1дС₁<1дС₃. 1дС₁ человека проявляет высокие АЭСС и СЭС и является наиболее применимым для терапевтического применения против патогенов и раковых клеток.

При некоторых обстоятельствах, например, когда истощение клетки-мишени является нежелательным, может потребоваться аннулирование или уменьшение эффекторных функций. Напротив, в случае антител, предназначенных для применения в онкологии, увеличение эффекторных функций может улучшать их терапевтическую активность (Сайег е! а1., 2006).

Модификация эффекторных функций может достигаться конструированием Ес-района либо для улучшения, либо для уменьшения связывания антител с ЕсуК или факторами комплемента.

Связывание 1дС с активирующими (ЕсуК1, ЕсуКНа, ЕсуКШа и ЕсуКШЬ) и ингибирующими (ЕсуКНЬ) ЕсуК или первым компонентом комплемента (Ск|) зависит от остатков, локализованных в шарнирной области и СН2-домене. Два района СН2-домена являются решающими для ЕсуК и связывания С 1с.| комплемента и имеют уникальные последовательности в 1дС₂ и 1дС₄. Например, замена остатков 1дС₂ в положениях 233-236 в 1дС₁ человека сильно уменьшала АЭСС и СЭС (Агтоиг е! а1., 1999 и 8Ые1й§ е! а1., 2001).

Многочисленные мутации были произведены в СН2-домене 1дС и их действие на АЭСС и СЭС испытывали ίη уйго (8ЫеИ§ е! а1., 2001, Ии8од1е е! а1., 2001 и 2000, 8!еигег е! а1., 1995). В частности, сообщалось, что мутация аланина в Е333 увеличивала как АЭСС, так и СЭС (Ии8од1е е! а1., 2001 и 2000).

Увеличение времени полужизни терапевтического антитела является другим путем для улучшения его эффективности, делающим возможными более высокие уровни в кровотоке, менее частое введение и уменьшенные дозы. Это может быть достигнуто усилением связывания Ес-района с ЕсК новорожденного (ЕсКп). ЕсКп, который экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток, связывает 1дС рНзависимым образом и защищает его от деградации. Было показано, что несколько мутаций, расположенных на границе между доменами СН2 и СН3, увеличивают время полужизни !§С₁ (Нш!оп е! а1., 2004 и

- 2 017733

Уассаго е! а1., 2005).

Следующая табл. 1 суммирует некоторые известные мутации Ес-района 1дС (взятые из веб-сайта 1иу1уодеи).

Таблица 1

Сконструированный Ре	Изотип 1ё<3	Мутации	Свойства	Потенциальные преимущества	Применения
Ыв61с1	ΙβΟι человека	Т250О/М423Б	Увеличенное время полужизни в плазме	Улучшенная локализация в отношении мишени; увеличенная эффективность; уменьшенная доза или частота введения	Вакцинация; терапевтическое применение
Ы§С1е2	Ιδθι человека	Μ252Υ/8254Ί7 Т256Е + Η433Κ/Ν434Ρ	Увеличенное время полужизни в плазме	Улучшенная локализация в отношении мишени; увеличенная эффективность; уменьшенная доза или частота введения	Вакцинация; терапевтическое применение
Ь1@61еЗ	•δθΐ человека	Е233Р/Ь234У/ Ц235А/ДС236 + А327О/А3303/ Р3315	Уменьшенные АОСС и СОС	Уменьшенные 1 Терапевтическое побочные применение без действия деплецин клеток
ЫеО1е4	1ёО1 человека	ЕЗЗЗА	Увеличенные АОСС и СОС	Увеличенная | Терапевтическое эффективность применение без деплецин клеток
Ы§О2е1	№ человека	К322А	Уменьшенная СОС	Уменьшенные побочные действия	Вакцинация; терапевтическое применение

В некоторых известных Ес-слитых белках, имеющих терапевтическую применимость, Ес-районы были слиты с внеклеточными доменами некоторых рецепторов, принадлежащих к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΕ-К) (Ьоскк1еу е! а1., 2001, Войтег е! а1., 2002, Воккеп е! а1., 2006). Отличительным признаком членов суперсемейства ΤΝΕΚ является присутствие цистеин-богатых псевдоповторов во внеклеточном домене, описанных, например, Νηίκιηίΐΐι апй 8ртапд, 1998.

Два рецептора ΤΝΕ, р55 (ΤΝΕΚ1) и р75 ΤΝΕΚ (ΤΝΕΚ2) являются примерами таких членов суперсемейства ΤΝΕΚ. Этанерцепт является Ес-слитым белком, содержащим растворимую часть ΤΝΕΚ р75 (например, \νθ 91/03553, \УО 94/06476). Под товарным названием ЕпЬте1® он продается для лечения эндометриоза, инфекции вируса гепатита С, инфекции ВИЧ, псориатического артрита, псориаза, ревматоидного артрита, астмы, анкилозирующего спондилита, сердечной недостаточности, реакции трансплантат против хозяина, пневмофиброза, болезни Крона. Ленерцепт является слитым белком, содержащим внеклеточные компоненты ΤΝΕ-рецептора р55 человека и Ес-часть 1дС человека, и предназначен для потенциального лечения тяжелого сепсиса и рассеянного склероза.

0X40 является также членом суперсемейства ΤΝΓΚ. Были получены слитые белки ОХ40-[дС₁ и ОХ40-ЫО4ти! для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как болезнь Крона.

Ес-слитый белок ВАЕЕ-К, также называемого ВК3, названный ВК3-Ес, является растворимым рецептором-ловушкой из серии ингибиторов ВАЕЕ (В-клеточного активирующего фактора семейства ΤΝΡ), развивается для потенциального лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (КА) и системная красная волчанка (8ЬЕ).

ВСМА является следующим рецептором, принадлежащим к суперсемейству ΤΝΡΚ. Было описано, что слитый белок ВСМА-1д ингибирует аутоиммунное заболевание (Ме1сйетк, 2006).

Другим рецептором суперсемейства ΤΝΡ-К является ΤАСI, трансмембранный активатор и взаимодействующий с САМЬ агент (уоп Ви1о\у апй Вгат, 1997; И8 5969102, Сгокк е! а1., 2000), который имеет внеклеточный домен, содержащий два цистеин-богатых псевдоповтора. ΤАСI связывает два члена семейства лигандов фактора некроза опухолей (ΤΝΤ). Один лиганд был назван ВЬу8, ВАЕЕ, нейтрокин-а, ΤΛΕΕ-1. ΖΤΝΤ4 или ΤΗΛΝΚ (Мооге е! а1., 1999). Другой лиганд был назван АРК1Ь, лиганд 1 смерти ΤΝΚΤ или ΖΤΝΤ2 (Найпе е! а1., 1. Ехр. Мей. 188: 1185 (1998).

Известны также слитые белки, содержащие растворимые формы рецептора ΤАСI, слитые с Есрайоном 1дС, которые были названы ΤАСI-Εс (ν0 00/40716, ν0 02/094852). ΤАСI-Εс ингибирует связывание ВЬу8 и АРМЕ с В-клетками (Х1а е! а1., 2000). Он разрабатывается для лечения аутоиммунных

- 3 017733 заболеваний, в том числе системной красной волчанки (8ЬЕ), ревматоидного артрита (ВЛ) и гематологических злокачественностей, а также для лечения рассеянного склероза (М8). Кроме этого, ТЛС1-Ее разрабатывается для лечения множественной миеломы (ММ) (ΝονηΚ с1 а1., 2004; Могеаи с1 а1., 2004) и неходжкинской лимфомы (ΝΗΕ), хронического лимфоцитарного лейкоза (СЬЕ) и макроглобулинемии Вальденстрема (^М).

Вследствие терапевтической применимости Ее-слитых белков, в частности Ее-слитых белков, содержащих внеклеточные части суперсемейства ΤΝΕΒ, существует потребность в значительных количествах высокоочищенного белка, который является достаточным для введения человеку.

XVО 02/094852 описывает способ частичной очистки ТАС1-Ес, который включает в себя белок Ахроматографию с последующей гель-проникающей (гель-фильтрационной) хроматографией 8200.

νθ 03/059935 описывает способ очистки для р75 Т№В:Ес-слитого белка с использованием комбинации гидроксиапатитной хроматографии и аффинной хроматографии на белке А. Однако в способе, описанном в νθ 03/059935, Ес-слитый белок не связывается с гидроксиапатитом и, следовательно, содержится во фракции, протекающей через гидроксиапатитную колонку. Кроме того, применение ионообменной хроматографии не упоминается для очистки этого р75 Т№В:Ес-слитого белка.

νθ 2005/044856 описывает способ удаления высокомолекулярных агрегатов из препаратов антител при помощи гидроксиапатитной колонки. Описан также способ очистки с использованием белка А, анионообменной хроматографии и гидроксиапатитной хроматографии. Однако, во-первых, этот способ был описан исключительно для антител и, во-вторых, нет описания применения стадии катионнообменной хроматографии между стадией белок А-аффинной хроматографии и стадией анионообменной хроматографии.

νθ 94/06476 предполагает гипотетические протоколы очистки для рекомбинантных растворимых Т№-рецепторов на основе Т№- или лектин-аффинной хроматографии, анионо- или катионообменной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЖХ). В этом документе не упоминается гидроксиапатитная хроматография в качестве подходящей стадии очистки для растворимых Т№-рецепторов.

и8 2002/0115175 описывает очистку металлопротеаз, таких как фермент Т№-а-конвертаза (ТАСЕ). ТАСЕ имеет теоретическую изоэлектрическую точку приблизительно 5,4, как рассчитано, например, с использованием ЕМВЬ ννν Са1е\гау Ю 1кое1ес1пс Ροίηΐ 8егуюе, доступного в Интернете. ТАСЕ является протеазой, которая отщепляет 8 аминокислот на Ν-конце мембраносвязанного (про-) Т№а. Таким образом, цитокин Т№а высвобождается из клеточной мембраны и посредством этого активируется. Способ очистки ТАСЕ, описанный в И8 2002/0115175, содержит стадию с использованием агглютинина из зародышей пшеницы-агарозы. Ес-слитые белки ТАСЕ описаны в этом документе, но они не были очищены.

ЕР 1561756 описывает, что хроматография на основе белка А или белка О может быть недостаточной для отделения ДНК-примесей от белков и что для очистки белка могут быть использованы дополнительные стадии, такие как анионо- или катионообменная хроматография, гидроксиапатитная хроматография или их комбинации. Для этих хроматографических стадий не предлагалась какая-либо конкретная последовательность. Кроме того, белки ЕР 1561756 являются гематопоэтическими факторами, цитокинами и антителами. В ЕР 1561756 нет упоминаний о Ес-слитых белках.

ЕР 1614693 описывает способ очистки антител на основе белок А-аффинной хроматографии, анионообменной хроматографии и катионообменной хроматографии. В этом документе указывается, что эти антитела очищают посредством анионообменной и катионообменной хроматографии в этом порядке или, альтернативно, посредством катионообменной хроматографии. Гидрофобная хроматография может быть заменена хроматографией любого другого типа, в том числе гидроксиапатитной хроматографией. В ЕР 1614693 не упоминаются Ес-слитые белки.

Еепд е1 а1., 2005, описывают способы очистки антител, основанные на начальной стадии захвата на белке А с последующими стадиями дополнительной очистки, которыми могут быть хроматография гидрофобного взаимодействия, анионообменная хроматография, катионообменная хроматография или гидроксиапатитная хроматография. Однако Еепд е1 а1. описывает только способы очистки антител, но не Есслитых белков. Кроме того, кроме начальной стадии первоначальной белок А-аффинной хроматографии не предлагается какая-либо последовательность для систематического удаления всех нежелательных загрязнений, таких как белки клеток-хозяев (НСР), агрегаты, ДНК, вирусные примеси и просачивающийся белок А.

Таким образом, все еще имеется неудовлетворенная потребность в эффективных способах очистки для Ес-слитых белков, приводящих к такой чистоте, которая является подходящей для введения человеку.

Сущность изобретения

Данное изобретение основано на развитии способа очистки для Ес-слитого белка.

Таким образом, в первом аспекте это изобретение относится к способу очистки Ес-слитого белка, включающему в себя следующие стадии:

а) подвергание жидкости, содержащей указанный Ес-слитый белок белок А- или белок О-аффинной

- 4 017733 хроматографии;

b) подвергание элюата из стадии (а) катионообменной хроматографии;

c) подвергание элюата из стадии (Ь) анионообменной хроматографии и

б) подвергание проходящей фракции стадии (с) гидроксиапатитной хроматографии и сбор элюата для получения очищенного Ес-слитого белка.

Этот способ используют для очистки Ес-слитых белков, имеющих изоэлектрическую точку (р1) в диапазоне 7,0-9,5.

Этот способ предпочтительно используют для очистки терапевтических Ес-слитых белков, т. е. Есслитых белков, предназначенных для введения человеку. Более предпочтительно его используют для Есслитого белка, содержащего внеклеточную часть, в частности лигандсвязывающую и необязательно ингибирующую внеклеточную часть, члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΕΚ).

Неожиданно было показано, что стадия (Ь) была пригодна для удаления так называемого свободного Ес, т.е. доменов тяжелой цепи иммуноглобулина, которые не слиты с полной терапевтической частью молекулы, такой как, например, лигандсвязывающая внеклеточная часть члена семейства ΤΝΡΚ.

Во втором аспекте это изобретение относится к очищенному Ес-слитому белку, предпочтительно терапевтическому Ес-слитому белку, более предпочтительно Ес-слитому белку, содержащему внеклеточную часть, в частности лигандсвязывающую внеклеточную часть, члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΡΒ), содержащему менее чем 1 или 0,5 или 0,2 или 0,1% свободного Есбелка.

Далее было показано, что комбинация стадий (а), (с) и (б) значимо элиминировала агрегаты Есслитого белка, которые являются терапевтически неактивными и нежелательными для введения человеку.

Таким образом, в третьем аспекте это изобретение относится к композиции очищенного Ес-слитого белка, предпочтительно терапевтического Ес-слитого белка, более предпочтительно Ес-слитого белка, содержащего внеклеточную часть, в частности лигандсвязывающую внеклеточную часть, члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΡΒ), содержащей менее чем 1 или менее чем 0,5% агрегатов Ес-слитого белка и/или менее чем 0,5, или менее чем 0,2, или менее чем 0,1% свободного Есбелка.

Следующий аспект данного изобретения относится к применению катионообменной хроматографии для удаления свободного Ес в препарате Ес-слитого белка, предпочтительно препарате терапевтического Ес-слитого белка, более предпочтительно Ес-слитого белка, содержащего внеклеточную часть члена семейства рецепторов фактора некроза опухолей или ее лигандсвязывающий и необязательно ингибирующий фрагмент.

В дополнительном аспекте данное изобретение относится к применению гидроксиапатитной хроматографии для удаления агрегатов в препарате Ес-слитого белка, предпочтительно препарате терапевтического Ес-слитого белка, более предпочтительно Ес-слитого белка, содержащего внеклеточную часть члена семейства рецепторов фактора некроза опухолей или ее лигандсвязывающий и необязательно ингибирующий фрагмент.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 показывает невосстанавливающий окрашенный серебром электрофорез в ДСН-ПААГ различных фракций, происходящих из катионообменной хроматографии, описанной в примере 2. Дорожка 1: маркеры молекулярной массы, дорожка 2: очищенный ΤΑΟΙ-Εο, дорожка 3: нанесенный препарат, дорожка 4: промывка 2, дорожка 5: элюат 2, дорожка 6: промывка 3, дорожка 7: элюат 3, дорожка 8: промывка 1, дорожка 9: элюат 1, дорожка 10: очищенный свободный Ес;

фиг. 2 - хроматографический профиль катионообменной хроматографии, описанной в примере 2.

Краткое описание списка последовательностей

8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 является цистеиновой последовательностью-фингерпринтом (богатым цистеином псевдоповтором), общим для членов суперсемейства Е№К.;

8ЕЦ ГО ΝΟ: 2 является полноразмерной последовательностью рецептора ΤΑί'Ι человека (например, описанной в \¥О 98/39361);

8ЕЦ ГО ΝΟ: 3 является примером Ес-последовательности человека этого изобретения (например, описанной в \УО 02/094852);

8ЕЦ ГО ΝΟ: 4 является предпочтительным Ес-слитым белком этого изобретения, содержащим последовательности, произведенные из внеклеточной части ΤΑί'Ι и Ес-части человека (например, описанным в ΑΟ 02/094852);

8ЕЦ ГО ΝΟ: 5 является полинуклеотидом, кодирующим полипептид 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2 (например, описанный в ΑΟ 02/094852);

8ЕЦ ГО ΝΟ: 6 является полинуклеотидом, кодирующим полипептид 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3 (например, описанный в ΑΟ 02/094852);

8ЕЦ ГО ΝΟ: 7 является полинуклеотидом, кодирующим полипептид 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4 (например, описанный в \¥Ο 02/094852).

Подробное описание изобретения

Данное изобретение основано на развитии способа очистки для примерного терапевтического Ес

- 5 017733 слитого белка, названного ТАС1-Рс, приводящего к высокоочищенному препарату ТЛС1-Ре, который пригоден для введения человеку.

Таким образом, изобретение относится к способу очистки Рс-слитого белка, включающему в себя следующие стадии:

a) подвергания жидкости, содержащей указанный Рс-слитый белок белок А- или белок С-аффинной хроматографии;

b) подвергания элюата из стадии (а) катионообменной хроматографии;

c) подвергания элюата из стадии (Ь) анионообменной хроматографии и

б) подвергания проходящей фракции стадии (с) гидроксиапатитной хроматографии и сбора элюата для получения очищенного Рс-слитого белка.

В одном варианте осуществления этот способ очистки не включает в себя стадии лектин-аффинной хроматографии и, в частности, он не включает в себя стадии с использованием агглютинина из зародышей пшеницы-агарозы.

Способ этого изобретения применяют для очистки Рс-слитого белка, имеющего р1 в диапазоне 6,99,5. Изоэлектрическая точка или р1 белка является рН, при котором этот белок имеет полный общий заряд, равный нулю, т.е. рН, при котором этот белок имеет равное количество положительных и отрицательных зарядов. Определение р1 для каждого конкретного белка может выполняться в соответствии с хорошо установленными способами, такими как, например, изоэлектрическое фокусирование.

Таким образом, р1 Рс-слитого белка, подлежащего очистке в соответствии с данным изобретением, может быть, например, любым из 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, 8,0, 8,05, 8,1, 8,15, 8,2, 8,25, 8,3, 8,35, 8,4, 8,45, 8,5, 8,55, 8,6, 8,65, 8,7, 8,75, 8,8, 8,85, 8,9, 8,95, 9,0, 9,05, 9,1, 9,15, 9,2, 9,25, 9,3, 9,35, 9,4, 9,45, 9,5. Предпочтительно р1 Рсслитого белка, подлежащего очистке в соответствии с данным изобретением, равна 8-9 или 8,0-9,0, более предпочтительно 8,3-8,6.

Способ этого изобретения предназначен предпочтительно для очистки терапевтического Рс-слитого белка, т. е. Рс-слитый белок предназначен для лечения или предупреждения заболевания животного или предпочтительно для лечения человека. Более предпочтительно способ этого изобретения предназначен для очистки Рс-слитого белка, содержащего внеклеточный домен члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ТИРЕ). Эта внеклеточная часть является предпочтительно лигандсвязывающим фрагментом внеклеточной части или домена соответствующего рецептора. Предпочтительный Рс-слитый белок, который может быть очищен в соответствии с данным изобретением, связывает лиганд и ингибирует или блокирует функцию лиганда, например активацию рецептора.

Термин Рс-слитый белок в данном контексте обозначает белки, в частности терапевтические белки, содержащие произведенную из иммуноглобулина часть молекулы, которая будет называться здесь Рс-частью, и часть молекулы, произведенную из второго не являющегося иммуноглобулином белка, которая будет называться здесь терапевтической частью молекулы независимо от того, предполагается или не предполагается лечение заболевания.

Термин свободный Рс в данном контексте включает в себя любую часть Рс-слитого белка, подлежащего очистке в соответствии с данным изобретением, которая произведена из иммуноглобулиновой части Рс-слитого белка и не содержит существенной части терапевтической части Рс-слитого белка. Таким образом, свободный Рс может содержать димеры шарнирной области 1дС, домены СН2 и СН3, которые не соединены или не связаны с существенными частями терапевтической части молекулы, и соответствует, например, Рс-части, которая генерируется расщеплением папаином. Мономеры, произведенные из Рс-части молекулы, могут также содержаться в этой фракции свободного Рс. Понятно, что свободный Рс может все еще содержать ряд аминокислотных остатков из терапевтической части молекулы, таких как, например, 1-10 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) аминокислот, принадлежащих к терапевтической части молекулы, слитой с Рс-частью молекулы.

Рс-часть может быть произведена из иммуноглобулина (1д) человека или животного, который является предпочтительно 1дС. Этот 1дС может быть 1дС|. 1дС₂, 1дС₃ или 1дС₄. Предпочтительно также эта Рс-часть молекулы произведена из тяжелой цепи иммуноглобулина, предпочтительно 1дС. Более предпочтительно Рс-часть молекулы содержит часть, такую как, например, домен, константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Такая константная область 1д предпочтительно содержит по меньшей мере один константный домен 1д, выбранный из любого из шарнирной области, домена СН2, СН3 или любой их комбинации. Предпочтительно Рс-часть молекулы содержит, по меньшей мере, домен СН2 и СН3. Кроме того, предпочтительно Рс-часть молекулы содержит шарнирную область 1дС, домен СН2 и СН3.

Рс-слитый белок этого изобретения может быть мономером или димером. Рс-слитый белок может быть также псевдодимером, содержащим димерную Рс-часть (например, димер из двух связанных дисульфидным мостиком конструкций шарнир-СН2-СН3, из которых только одна связана с терапевтической частью молекулы).

Рс-слитый белок может быть гетеродимером, содержащим две разные терапевтические части молекулы, или гомодимером, содержащим две копии единственной терапевтической части молекулы.

- 6 017733

В соответствии с данным изобретением Ре-часть молекулы может быть также модифицирована для модуляции эффекторных функций. Например, могут быть введены следующие мутации Рс согласно положениям Εϋ-индексов (КаЬа! с1 а1., 1991), если эта Рс-часть молекулы произведена из ΙβΟι:

Т250р/М428Ь

Μ252Υ/8254Τ/Τ256Ε + Η433Κ/Ν434Ρ

Е233Р/Е234У/Б235А/АО236 + А327О/А330Б/Р331Б

Е333А; К322А.

Дополнительными Рс-мутациями могут быть, например, замены в положениях ЕИ-индексов, выбранных из 330, 331, 234 или 235, или их комбинации. Аминокислотная замена в ЕИ-индекс-положении 297, расположенном в домене СН2, также может быть введена в Рс-часть в контексте данного изобретения, с элиминацией потенциального сайта присоединения Ν-связанного углевода. Остаток цистеина в ЕИ-индекс-положении 220 может быть также заменен остатком серина, исключающим остаток цистеина, который обычно образует дисульфидные связи с константной областью легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно данному изобретению предпочтительно Рс-часть содержит 8ЕО ΙΌ N0: 3 или состоит из 8Е0 ΙΌ N0: 3 или кодируется полинуклеотидом, содержащим 8Е0 ΙΌ N0: 6.

Терапевтической частью молекулы этого изобретения может быть, например, ЕРО, ТРО, гормон роста, интерферон-а, интерферон-β, интерферон-γ, ΡΩΟΡ-β. УЕОР, 1Б-1-а, ГЪ-1-β, 1Б-2, !И-4. [И-5, 1Б-8, 1Б-10, 1Б-12, 1Б-18, ΙΕ-18-связывающий белок, ТОР-β, ΤΝΡ-а или ΤΝΡ-β или их производные.

Терапевтическая часть молекулы этого изобретения может быть также произведена из рецептора, например трансмембранного рецептора, может быть предпочтительно произведена из внеклеточного домена рецептора и, в частности, лигандсвязывающего и необязательно ингибирующего фрагмента внеклеточной части или домена конкретного рецептора. Примерами представляющих интерес рецепторов являются С4)2, 0Ό3, С4)4, С4)8, СП11а, 0Ό14, 0Ό18, ΟΌ20, ΟΌ22, ΟΌ23, ΟΌ25, ΟΌ33, С4)40, С4)44, СИ52, СИ80, СИ86, СИ147, СИ164, ΙΕ-2-рецептор, ΙΕ-4-рецептор, ΙΕ-6-рецептор, ΙΕ-12-рецептор, субъединицы ΙΕ-18-рецептора (ΙΕ-18Β-α, ΙΕ-18Β-β), ЕОР-рецептор, УЕОР-рецептор, интегрин α4/β7, интегрин УБА4, интегрины В2, ТКАГО-рецепторы 1, 2, 3 и 4, ΚΑΝΚ, лиганд ΚΑΝΚ, адгезионная молекула эпителиальных клеток (ЕрСАМ), молекула 3 межклеточной адгезии ДСАМ-3), СТБА4 (который является цитотоксическим Т-лимфоцит-ассоциированным антигеном), Рс^-1-рецептор, ΗΕΑ-ΌΒ 10β, антиген НБАΌΚ, Ь-селектин.

Высокопредпочтительным является то, что терапевтическая часть молекулы этого изобретения произведена из рецептора, принадлежащего к суперсемейству Т№К.. Эта терапевтическая часть молекулы может быть, например, внеклеточным доменом ТЖ1 (р55), ТЖ2 (р75), ОХ40, остеопротегерином, СИ27, (4)30, (4)40, ΡΑΝΚ, ΌΒ3, Рак-лигандом, ТКА1И-К1, ТКАГО-КТ, ΤКΑI^-К.3, ТАГО-КТ, \(.,14Е ΑΙΈΚ, ВАРРК, ВСМА, ТАС'4 или может быть произведена из них.

Согласно данному изобретению эта терапевтическая часть молекулы, произведенная из члена суперсемейства ΊΝΕΚ, предпочтительно содержит весь внеклеточный домен этого члена ΕΝΕΚ. или часть внеклеточного домена этого члена ТДОК. и более предпочтительно содержит лигандсвязывающий и необязательно ингибирующий фрагмент такого члена Т№Р.

Следующая табл. 2 содержит список членов суперсемейства ТДОК, из которых может быть произведена терапевтическая часть молекулы в соответствии с данным изобретением, и их соответствующих лигандов. Лигандсвязывающий фрагмент члена этого семейства ТИРЕ может быть легко определен квалифицированным в данной области специалистом, например, в простом анализе ίη νίίτο, измерением связывания между белковым фрагментом этого рецептора и соответствующим лигандом. Таким анализом может быть, например, простой сэндвич-анализ ίη νίίτο типа ΡΙΑ или ЕЕ$А, в котором один из этих белков, например фрагмент рецептора, иммобилизуют с носителем (например, планшетом ЕШЗА) и инкубируют после подходящего блокирования сайтов связывания белка на этом носителе с вторым белком, например лигандом. После инкубирования связывание лиганда детектируют, например, с использованием радиоактивного мечения в сцинтилляционном счетчике. Связывание лиганда может быть также определено с меченым антителом или первым лиганд-специфическим антителом и вторым меченым антителом, направленным против константной части первого антитела. Таким образом, связывание лиганда может быть легко определено в зависимости от используемой метки, например, в цветной реакции. Блокирование или ингибирование функции связывания лиганда может быть тестировано в подходящих анализах на основе клеток.

Предпочтительно способ данного изобретения предназначен для очистки Рс-слитого белка, содержащего терапевтическую часть молекулы, произведенную из члена суперсемейства ТХРЕ, выбранного из членов суперсемейства ТКЕК, приведенных в списке в табл. 2.

- 7 017733

Таблица 2

Суперсемейство ΤΝΕΡ (согласно ЬоскЧсу с! а1., 2001 и Во55сп с! а1., 2006)

В предпочтительном варианте осуществления Ре-слитый белок содержит терапевтическую часть, выбранную из внеклеточного домена ΤΝΡΚΤ, ΤΝΕΡ2 или их ΤΝΡ-связывающего и необязательно ингибирующего фрагмента.

В следующем предпочтительном варианте осуществления Рс-слитый белок содержит терапевтическую часть, выбранную из внеклеточного домена ΒΛΡΡ-Β, ВСМА или ΤΛΕΊ или их фрагмента, связывающего по меньшей мере один из В1у§ или АРК1Ь.

Один анализ для тестирования способности связывания с В1у§ или АРК1Ь описан, например, в Нуιηο\νίΙζ с! а1., 2006.

ΤΛΟΙ является предпочтительно ΤΛΟΙ человека. 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 соответствует аминокислотной последовательности полноразмерного рецептора ΤΛΟΙ человека (также вход δνίδδΡτοΐ 014836). Более предпочтительно эта терапевтическая часть молекулы содержит растворимую часть ΤΛΟΙ, предпочтительно произведенную из внеклеточного домена ΤΛΟΙ. Предпочтительно произведенная из ΤΛΟΙ терапевтическая часть молекулы содержит, по меньшей мере, аминокислоты 33-67 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2 и/или аминокислоты 70-104 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2. В одном предпочтительном варианте осуществления внеклеточный домен ΤΛΟΙ, включенный в эту терапевтическую часть согласно данному изобретению, содержит аминокислоты (или состоит из них) 1-166 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, или аминокислоты 30-166 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, или аминокислоты 30-119 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2, или аминокислоты 30-110 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2. Все из этих терапевтических

- 8 017733 частей молекул являются предпочтительными для получения Рс-слитого белка для очистки по способу этого изобретения и комбинируются с Рс-частями, описанными подробно выше, и в частности с Рсчастью молекулы, содержащей 8ЕО ГО N0: 3 или состоящей из 8Е0 ГО N0: 3. Один высокопредпочтительный Рс-слитый белок, подлежащий очистке с использованием данного изобретения, содержит 8Е0 ГО N0: 4, или состоит из 8Е0 ГО N0: 4, или кодируется полинуклеотидом 8Е0 ГО N0: 7.

Таким образом, чрезвычайно предпочтительно, чтобы Рс-слитый белок содержал полипептид, выбранный из

a) аминокислот 34-66 8Е0 ГО N0: 2;

b) аминокислот 71-104 8Е0 ГО N0: 2;

c) аминокислот 34-104 8Е0 ГО N0: 2;

б) аминокислот 30-110 8Е0 ГО N0: 2;

е) 8ЕО ГО N0: 3;

I) 8ЕО ГО N0: 4;

д) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с комплементом 8Е0 ГО N0: 5, или 6, или 7 при условиях высокой строгости; и

II) мутеина любого из (с), (б), (е) или (ί), имеющего по меньшей мере 80, или 85, или 90, или 95% идентичность последовательности с полипептидом (с), (б), (е) или (ί);

причем этот полипептид связывается по меньшей мере с одним из В1у§ или АРИШ.

В следующем предпочтительном варианте осуществления Рс-слитого белка содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина, более предпочтительно константную область иммуноглобулина человека. В одном варианте осуществления этого изобретения этим иммуноглобулином является 1дО1.

Предпочтительно также эта константная область содержит шарнирную область, домены СН2 и СН3.

В следующем варианте осуществления эта терапевтическая часть молекулы содержит богатый цистеином псевдоповтор 8Е0 ГО N0:1.

В соответствии с данным изобретением жидкость, содержащую Рс-слитый белок, сначала подвергают белок А- или белок О-аффинной хроматографии. Эта жидкость может быть предпочтительно материалом культуры клеток, например солюбилизированными клетками, более предпочтительно супернатантом культуры клеток. Термин супернатант культуры клеток относится в данном контексте к среде, в которой культивируются клетки и в которую секретируются белки, при условии, что они содержат подходящие клеточные сигналы, так называемые сигнальные пептиды. Предпочтительно экспрессирующие Рс-слитые белки клетки культивируют в условиях бессывороточного культивирования. Так, предпочтительно, супернатант культуры клеток лишен компонентов сыворотки животных. Наиболее предпочтительно среда культуры клеток является средой с определенным химическим составом.

Белок А, используемый для аффинной хроматографии, может быть, например, рекомбинантным. Он может быть также модифицирован для улучшения его свойств (например, как в смоле, называемой МаЬ8е1ес1 8иРе. коммерчески доступной из ОЕ НеаИйсате). В предпочтительном варианте осуществления стадию (а) проводят на смоле, содержащей сшитую агарозу, модифицированную рекомбинантным белком А. Колонка, коммерчески доступная под названием МаЬ§е1ес1 Х!та (из ОЕ НеаНйсате), является примером аффинной смолы, которая особенно пригодна для стадии (а) этого способа.

Белок А- или белок О-аффинная хроматография используется предпочтительно в качестве стадии захвата и, следовательно, служит для очистки Рс-слитого белка, в частности элиминации белков клеткихозяина и агрегатов Рс-слитого белка, и для концентрирования препарата Рс-слитого белка.

Термин агрегаты в данном контексте относится к агрегатам белка. Он включает в себя мультимеры (такие как димеры, тетрамеры или агрегаты более высокого порядка) Рс-слитого белка, подлежащего очистке, и могут приводить, например, к высокомолекулярным агрегатам.

Аффинная хроматография имеет дополнительное преимущество уменьшения уровня агрегатов в 2-4 раза.

С использованием белок А- или О-аффинной хроматографии уровни белков клетки-хозяина могут быть уменьшены в 100-300 раз.

В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения элюцию в стадии (а) проводят при рН в диапазоне 2,8-4,5, предпочтительно 3,0-4,2, более предпочтительно при 3,5, 3,55, 3,6, 3,65, 3,7, 3,75, 3,8, 3,85, 3,9, 3,95, 4,0, 4,05, 4,1 или 4,15. Элюция в стадии (а) может также проводиться градиентом рН, предпочтительно градиентом рН от 4,5 до 2,8.

В следующем предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии (а) проводят в буфере, выбранном из ацетата натрия или цитрата натрия. Подходящие концентрации буфера выбраны, например, из 50, или 100, или 150, или 200, или 250 мМ.

Согласно данному изобретению элюат из белок А- или белок О-хроматографии подвергают катионообменной хроматографии. Катионообменная хроматография может проводиться на любой подходящей катионообменной смоле, такой как, например, слабые или сильные катионообменники, как объясняется выше в разделе Уровень техники этого изобретения.

Предпочтительно стадию (Ь) проводят на сильной катионообменной смоле. Более предпочтительно

- 9 017733 катионообменный материал содержит сшитый метакрилат, модифицированный 80₃ ^--группами. Колонка, коммерчески доступная под товарным названием Етас1оде1 ΕΜΌ 80₃ ^- (из Мегск), является примером катионообменной смолы, которая особенно пригодна для стадии (Ь) этого способа.

Предпочтительно элюат белок А-колонки наносят непосредственно на катионообменную колонку. Предпочтительно нанесение проводят при рН по меньшей мере на одну единицу более низком, чем р1 подлежащего очистке Ес-слитого белка.

Предпочтительно после нанесения эту колонку промывают буфером, имеющим проводимость 6-10 мС/см, например 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8 или 9,9 мС/см. Более предпочтительно проводимость находится в диапазонах от 7,6 до 9,2, т.е. 8,4±0,8 мС/см. Эту стадию промывания предпочтительно проводят при рН в диапазоне от 5,5 до 7,5, предпочтительно от 6,0 до 7,0.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления эту катионообменную колонку элюируют при рН в диапазоне от 7,0 до 8,5, предпочтительно 7,25, или 7,3, или 7,35, или 7,4, или 7,45, или 7,5, или 7,55, или 7,6, или 7,65, или 7,7, или 7,7, или 7,75, или 7,8, или 7,85, или 7,9, или 7,95, или 8,0, или 8,05, или 8,1, или 8,15, или 8,2, или 8,25, или 8,3, или 8,35, или 8,4, или 8,45, или 8,5.

Элюция может предпочтительно проводиться при проводимости в диапазоне от 15 до 22 мС/см. Например, проводимость может быть выбрана из 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 мС/см. Предпочтительным буфером для элюции является фосфатный буфер.

В высокопредпочтительном варианте осуществления стадия (Ь) включает в себя следующие дополнительные стадии:

Ь.1) промывание катионообменной смолы буфером, имеющим рН в диапазоне от 6,0 до 7,0 и проводимость в диапазоне от 6 до 10 мС/см; и

Ь.2) элюцию этой колонки при рН в диапазоне от 7,0 до 8,5 и проводимости в диапазоне от 15 до 22 мС/см.

Предпочтительным буфером для стадии (Ь.1) является 75-125 мМ фосфат натрия.

В рамках данного изобретения было неожиданно обнаружено, что стадия (Ь) эффективно элиминирует свободный Ес. Таким образом, согласно данному изобретению катионообменная хроматография может быть предпочтительно использована для элиминации или уменьшения свободного Ес в 5-15 раз.

Предпочтительно стадия (Ь) способа данного изобретения уменьшает также концентрацию белков клетки-хозяина из препарата Ес-слитого белка, например, в 1-2 раза, значительно способствуя клиренсу белка клетки-хозяина (НСР).

Затем согласно данному изобретению элюат из стадии катионообменной хроматографии подвергают анионообменной хроматографии. Анионообменная хроматография может проводиться на любой подходящей анионообменной смоле, такой как, например, слабые или сильные анионообменники, как объясняется выше в разделе Уровень техники этого изобретения. Предпочтительно стадию (с) проводят на сильной анионообменной смоле. Более предпочтительно анионообменная смола содержит полистирол/дивинилбензол, модифицированный И^(СН₃)₃. Колонка, коммерчески доступная под названием 8оитсе 30Ц (из СЕ НеаИйсате), является примером анионообменной смолы, которая особенно пригодна для стадии (с) данного способа.

Предпочтительно элюат стадии (Ь) разбавляют или диализуют в подходящий буфер для нанесения перед нанесением его на анионообменную колонку. Анионообменную колонку предпочтительно также уравновешивают буфером для нанесения.

Предпочтительный рН для буфера нанесения является по меньшей мере на одну единицу более низким, чем р1. Подходящие величины рН находятся в диапазоне от 6,0 до 8,5, предпочтительно от 7,0 до 8,0, например 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95 или 8,0. Предпочтительная проводимость для буфера для нанесения находится в диапазоне 3,0-4,6 мС/см.

Подходящим буфером для уравновешивания/нанесения может быть, например, фосфат натрия при концентрации в диапазоне от 5 до 35, предпочтительно от 20 до 30 мМ. Например, концентрация буфера может быть 10, 15, 20, 25, 30 мМ. В рамках данного изобретения протекающую жидкость (также называемую проскакивающей жидкостью) анионообменной хроматографии, содержащую представляющий интерес Ес-слитый белок, собирают.

Стадия (с) этого способа данного изобретения дополнительно уменьшает агрегаты в 3-5 раз и белки клетки-хозяина в 30-70 раз.

Согласно данному изобретению проходящую жидкость анионообменной хроматографии стадии (с) используют затем для дополнительной очистки гидроксиапатитной хроматографией. Любая гидроксиапатитная смола может быть использована для проведения стадии (ά) способа по этому изобретению. В предпочтительном варианте осуществления стадию (ά) проводят на керамической гидроксиапатитной колонке, такой как гидроксиапатитная смола типа I или типа II. Гидроксиапатитная смола может иметь частицы любого размера, например 20, 40 или 80 мкм. В высокопредпочтительном варианте осуществления эта керамическая гидроксиапатитная смола содержит частицы, имеющие размер 40 мкм. Гидроксиапатитной смолой, которая особенно пригодна для стадии (ά) этого способа, является колонка, коммерче

- 10 017733 ски доступная под названием Керамический гидроксиапатит типа I СНТ, 40 мкм.

В предпочтительном варианте осуществления проходящую жидкость из стадии (с) непосредственно наносят на гидроксиапатитную смолу, т.е. без предварительного разведения или диализа в подходящий буфер для нанесения. Нанесение предпочтительно проводят при рН 6,5-7,5, например 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,1, 7,2, 7,3 или 7,4 и предпочтительно 7,0.

В следующем предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии (б) проводят в присутствии фосфата натрия в диапазоне от 2 до 10 мМ, предпочтительно в диапазоне от 1,75 до 5,25 мМ, например при 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5 мМ.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии (б) проводят при рН в диапазоне от 6,0 до 7,0, например при 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9.

В другом предпочтительном варианте осуществления элюцию в стадии (б) проводят в присутствии хлорида натрия в диапазоне от 0,4 до 1 М, предпочтительно при 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 М, наиболее предпочтительно при 0,6 М.

Согласно данному изобретению собирают элюат стадии (б), содержащий окончательно очищенный препарат Ее-слитого белка.

Подходящими материалами матрикса, т.е. материалами-носителями для хроматографических смол, используемых в стадиях (а)-(с), которые могут быть использованы в связи с данным изобретением, могут быть, например, агароза (сефароза, супероза), декстран (сефадекс), полипропилен, метакрилатцеллюлоза, полистирол/дивинилбензол или т.п. Эти материалы смол могут присутствовать в различных сшитых формах в зависимости от конкретного применения.

Объем смолы, длина и диаметр используемой колонки, а также динамическая емкость и скорость потока зависят от нескольких параметров, таких как объем обрабатываемой жидкости, концентрация белка в жидкости, подвергаемой способу этого изобретения, и т.д. Определение этих параметров для каждой стадии находится в пределах средней квалификации специалиста в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления данного способа очистки выполняют одну или несколько стадий ультрафильтрации. Ультрафильтрация применима для удаления малых органических молекул и солей в элюатах, происходящих из предыдущих хроматографических стадий, для уравновешивания Ес-слитого белка в общем буфере или для концентрирования Ес-слитого белка до желаемой концентрации. Такая ультрафильтрация может, например, выполняться на ультрафильтрационных мембранах с порами, позволяющими удаление компонентов, имеющих молекулярные массы ниже 5, 10, 15, 20, 25, 30 кДа или более.

Предпочтительно ультрафильтрацию проводят между стадиями (Ь) и (с) и/или после стадии (б). Более предпочтительно проводят две стадии ультрафильтрации: одну между стадиями (Ь) и (с) и одну после стадии (б).

Если белок, очищенный в соответствии с этим способом данного изобретения, предназначен для введения людям, полезно включить одну или несколько стадий удаления вирусов в этом способе. Предпочтительно стадию фильтрации для удаления вирусов проводят после стадии (б). Более предпочтительно этой стадией фильтрации для удаления вируса является стадия нанофильтрации, где этот фильтр имеет номинальный размер пор 20 нм. Способ по данному изобретению и, в частности, стадии (а), (с), (б) в комбинации с нанофильтрацией эффективно элиминирует вирусную нагрузку до объединенной БРУ (1од-величины уменьшения) до приблизительно 15-25.

Для облегчения хранения или транспортировки, например, этот материал может быть замороженным и оттаиваться до и/или после любой стадии очистки этого изобретения.

Согласно данному изобретению рекомбинантный Ес-слитый белок может продуцироваться в эукариотической системе экспрессии, такой как клетки дрожжей, насекомого или млекопитающего, приводящей к гликозилированным Ес-слитым белкам.

Согласно данному изобретению наиболее предпочтительно экспрессировать Ес-слитый белок в клетках млекопитающих, таких как клеточные линии животных или клеточные линии человека. Клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клеточная линия миеломы мыши N80 являются примерами клеточных линий, которые являются особенно подходящими для экспрессии Ес-слитого белка, подлежащего очистке. Этот Ес-слитый белок может также предпочтительно продуцироваться в клеточных линиях человека, таких как, например, клеточная линия фибросаркомы НТ1080 человека, клеточная линия ретинобластомы человека РЕК.С6 или клеточная линия эмбриональной почки человека 293 или перманентная клеточная линия амниоцитов, как описано, например, в ЕР 1230354.

Если Ес-слитый белок, подлежащий очистке, экспрессируется клетками млекопитающих, секретирующими его, исходным материалом способа очистки этого изобретения является супернатант культуры клеток, также называемый сбором клеток или неочищенным сбором. Если клетки культивируют в среде, содержащей сыворотку животного, супернатант этой культуры клеток также содержит сывороточные белки в качестве загрязнений.

Предпочтительно экспрессирующие и секретирующие Ес-слитый белок клетки культивируют в бессывороточных условиях. Ес-слитый белок может также продуцироваться в среде с определенным химическим составом. В этом случае исходным материалом способа очистки является супернатант бессы

- 11 017733 вороточной культуры клеток, который содержит в основном белки клеток-хозяев в качестве загрязнений. Если к среде культуры клеток добавляют факторы роста, такие как инсулин, эти белки будут также элиминироваться во время процесса очистки.

Для создания растворимых, секретируемых Ес-слитых белков, которые высвобождаются в супернатант культуры клеток, используют либо природный сигнальный пептид терапевтической части Есслитого белка, либо предпочтительно гетерологичный сигнальный пептид, т. е. сигнальный пептид, произведенный из другого секретируемого белка, являющийся эффективным в этой конкретной системе экспрессии, такой как, например, сигнальный пептид бычьего или человеческого гормона роста, или сигнальный пептид иммуноглобулина.

Как упоминалось выше, предпочтительным Ес-слитым белком для очистки согласно данному изобретению, является Ес-слитый белок, имеющий терапевтическую часть молекулы, произведенную из ТАС1 человека (8ЕО ΙΌ N0: 2) и, в частности, из его внеклеточного домена (аминокислоты 1-165 8Е0 ΙΌ N0: 2). Предпочтительный фрагмент содержит аминокислоты 30-110 8Е0 Ш N0: 2. В дальнейшем описании терапевтические части, произведенные из внеклеточного домена ТАС1, будут называться растворимым ТАС1 или кТАСГ¹. Предпочтительная Ес-часть молекулы содержит 8Е0 ΙΌ N0: 3, приводящую к Ес-слитому белку 8Е0 ΙΌ N0: 4, в дальнейшем описании называемому ТАС1-Ес.

Термин ТАС1-Ес в данном контексте включает в себя также мутеины ТАС1-Ес.

Термин мутеины в данном контексте относится к аналогам кТАС1 или ТАС1-Ес, в которых один или несколько из аминокислотных остатков кТАС1 или ТАС1-Ес заменены другими аминокислотными остатками или делетированы, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к первоначальной последовательности кТАС1 или ТАС1-Ес без существенного изменения активности полученных продуктов в сравнении с первоначальными кТАС1 или ТАС1-Ес. Эти мутеины получают известными способами синтеза, и/или сайт-направленного мутагенеза, или любым другим способом, подходящим для этого.

Мутеины в соответствии с данным изобретением включают в себя белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с комплементом ДНК или РНК, который кодирует 5ТЛС1 или ТАС1-Ес в соответствии с любой из 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 4 при строгих условиях. Одним примером ДНК-последовательности, кодирующей ТАС1-Ес, является 8Е0 ΙΌ N0: 7.

Термин строгие условия относится к гибридизации и последующим условиям промывки, которые специалисты с обычной квалификацией в данной области обычно называют строгими. См. Аи8иЬе1 е! а1., Ситгеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, кирга, 1п1ег5с1епсе. N. Υ., §§ 6.3 апб 6.4 (1987, 1992). Без ограничения примеры строгих условий включают в себя условия промывки, на 12-20°С ниже рассчитанной Тт исследуемого гибрида, например, в 2х88С и 0,5% ДСН в течение 5 мин, 2х88С и 0,1% ДСН в течение 15 мин; 0,1х88С и 0,5% ДСН при 37°С в течение 30-60 мин и затем 0,1х88С и 0,5% ДСН при 68°С в течение 30-60 мин. Специалисты с обычной квалификацией в данной области понимают, что условия строгости зависят также от длины ДНК-последовательностей, олигонуклеотидных зондов (например, 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если используются смешанные зонды, предпочтительно использовать хлорид тетраметиламмония (ТМАС) вместо 88С. См. Аи8иЬе1, кирга.

В другом варианте осуществления любой такой мутеин имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичность или гомологию с исходным белком.

Идентичность отражает родство между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определяемое сравнением этих последовательностей. Обычно идентичностью называют точное соответствие нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте двух полинуклеотидов или двух полипептидных последовательностей, соответственно, на протяжении длины сравниваемых последовательностей.

Для последовательностей, где нет точного соответствия, может быть определена %-ная идентичность. Обычно эти две сравниваемые последовательности сопоставляют для получения максимальной корреляции между этими последовательностями. Это может включать в себя инсертирование гэпов в любую одну из последовательностей или в обе последовательности для увеличения степени сопоставления, %-ная идентичность может быть определена на протяжении всей длины каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное сопоставление), которое особенно удобно для последовательностей одной и той же длины или на протяжении коротких определенных длин (так называемое локальное сопоставление), которое особенно удобно для последовательностей неравной длины.

Способы для сравнения идентичности и гомологии двух или нескольких последовательностей хорошо известны в данной области. Так, например, программы, доступные в пакете \У18соп8ш 8ес.|иепсе Апа1у818 Раскаде, уеткюп 9.1 (Эеуегеих 1. е! а1., 1984), например, программы ВЕ8ТЕ1Т и ОАР, могут быть использованы для определения %-ной идентичности между двумя полинуклеотидами, и %-ной идентичности и %-ной гомологии между двумя полипептидными последовательностями. ВЕ8ТЕ1Т использует алгоритм локальной гомологии 8ιηί11ι и \Уа1егтап (1981) и находит наилучший единственный район сходства между двумя последовательностями. Другие программы для определения идентичности и/или

- 12 017733 сходства между последовательностями также известны в данной области, например, семейство программ ВБА8Т (Л1!8сйи1 8.Р. с1 а1., 1990, Л115сйи1 8.Р. е1 а1., 1997, доступное через домашнюю страницу ΝΡΒΙ в \\л\л\'.псЫ.п1т.ш11.доу), и РЛ8ТЛ (Реагаоп \ν.Β. 1990).

Любой такой мутеин предпочтительно имеет последовательность аминокислот, достаточно дубликатную относительно последовательности §ТЛС1 или ТАС1-Рс, чтобы иметь, по существу, одинаковую лигандсвязывающую активность с активностью белка 8ЕО ΙΌ N0: 2 или 4. Например, одной активностью ТАС1 является его способность связывания с В1у§ или АРК1Б (Нушо\\Ц/ е1 а1., 2006). Можно считать, что пока этот мутеин имеет существенную связывающую АРКРБ или В1у§ активность, он имеет, по существу, одинаковую активность в отношении ТАС1. Таким образом, квалифицированный в данной области специалист может легко определить, имеет ли любой конкретный мутеин, по существу, ту же самую активность, что и белок 8Е0 ΙΌ N0: 2 или 4, посредством рутинного экспериментирования.

Предпочтительные изменения для мутеинов согласно этому изобретению являются изменениями, которые известны как консервативные замены. Консервативные аминокислотные замены 5ТЛС.Ч или ТАС1-Рс могут включать в себя синонимичные аминокислоты в группе, которые имеют достаточно сходные физико-химические свойства, чтобы замена между членами этой группы сохраняла биологическую функцию этой молекулы (Сгап1йат, 1974). Ясно, что инсерции и делеции аминокислот могут быть также произведены в вышеописанных последовательностях без изменения их функции, в частности, если эти инсерции или делеции включают в себя только небольшое число аминокислот, например, менее тридцати, менее двадцати или предпочтительно менее десяти, и не удаляют или не заменяют аминокислоты, которые являются решающими для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, продуцируемые такими делениями и/или инсерциями, входят в сферу действия данного изобретения.

Предпочтительно этими консервативными группами аминокислот являются группы, определенные в табл. 3.

Более предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. 4; и наиболее предпочтительно группами синонимичных аминокислот являются группы, определенные в табл. 5.

Таблица 3 Предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота Синонимичная группа

Зег	Зег,	ТЬг,	61у,	Азп
Агд	Агд,	. С1п,	Ьуз,	С1и,	Н13
Ьеи	Не,	. РЬе,	Туг,	Мер,	Уа1,	Ьеи
Рго	С1у,	А1а,	ТЬг,	Рго
ТЬг	Рго,	- Зег,	А1а,	С1У,	Н15 ,	С1п,	ТЬг
А1а	С1у,	ТЬг,	Рго,	А1а
Уа1	Мер,	- Туг,	РЬе,	11е,	Ьеи,	Уа1
Е1у	А1а,	ТЬг,	Рго,	Зег,	□1у
11е	Мер,	туг,	РЬе,	Уа1,	Ьеи,	11е
РЬе	Тгр,	Мер,	Туг,	11е,	Уа1,	Ьеи,	РЬе
Туг	Тгр,	. Мер,	РЬе,	Не,	Уа1,	Ьеи,	Туг
Суз	Зег,	, ТЬг,	Суз
Н1з	61и,	Ьуз,	С1п,	ТЬг,	Агд,	Ηί3
Θ1Π	С1и,	ьуз,	Азп,	Н13,	ТЬг,	Агд,	С1п
АЗП	С1п,	Азр,	Зег,	Азп
Ьуз	01 и,	. С1п,	Н13,	Агд,	Ьуз
Азр	С1и,	. АЗП,	Азр
С1и	Азр,	. Ьуз,	Азп,	С1п,	Н13,	Агд,	С1и
Мер	РЬе,	. 11е,	Уа1,	Ьеи,	МеР

Тгр Тгр

- 13 017733

Таблица 4

Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Синонимичная группа

Аминокислота

Зег	Зег
Агд	Н1з, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, РЬе, Меб
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЙГ
А1а	Рго, А1а
Ца1	Уа1, Меб, 11е
61 у	61у
Не	Не, Меб, РЬе, Уа1,
РЬе	Меб, Туг, Не, Ьеи,
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, Зег
Ηίδ	ΗΪ3, 61п, Агд
С1п	С1и, С1п, ΗΪ3
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
С1и	С1и, О1п
Мер	Мер, РЬе, Не,
Тгр	Тгр

Таблица 5

Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи,	Не,	Меб
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
61у	61у
11е	11е,	Меб,	Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз,	Зег
Н1з	Н15
61п	61п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
61и	С1и
Меб	Меб,	Не,	Ьеи
Тгр	Меб

- 14 017733

Функциональное производное может быть получено из Рс-слитого белка, очищенного в соответствии с данным изобретением.

Функциональные производные в данном контексте включают в себя производные Рс-слитого белка, подлежащие очистке в соответствии с данным изобретением, которые могут быть получены из функциональных групп, которые встречаются в виде боковых цепей на этих остатках, или Ν- или С-концевых групп способами, известными в данной области, и включены в это изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не разрушают активность этого белка, которая является, по существу, одинаковой с активностью немодифицированного Рс-слитого белка, определенного выше, и не придают токсичные свойства содержащим его композициям.

Функциональные производные Рс-слитого белка могут быть, например, конъюгированы с полимерами для улучшения свойств этого белка, таких как стабильность, время полужизни, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность. Для достижения этой цели ТАС1-Рс может быть связан, например, с полиэтиленгликолем (ПЭГ). ПЭГилирование может проводиться известными способами, описанными, например, в \УО 92/13095.

Функциональные производные могут также включать в себя, например, алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, образованные реакцией с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными частями молекул (например, алканоильной или карбоциклической ароильной группами) или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильных групп серильных или треонильных остатков), образованные с ацильными частями молекул.

В третьем аспекте это изобретение относится к белку, очищенному способом очистки в соответствии с данным изобретением. Далее такой белок называется также очищенным Рс-слитым белком.

Такой очищенный Рс-слитый белок является предпочтительно высокоочищенным Рс-слитым белком. Высокоочищенный Рс-слитый белок определяют, например, по присутствию единственной полосы в окрашенном серебром, невосстановленном геле электрофореза в ДСН-ПААГ после нанесения белка в количестве 2 мкг на дорожку. Очищенный Рс-слитый белок может быть также определен по элюции в виде единственного пика в ВЖХ.

Препарат Рс-слитого белка, полученный процессом очистки согласно изобретению, может содержать менее 20% загрязнений, предпочтительно менее 10, 5, 3, 2 или 1% загрязнений, или он может быть очищен до гомогенности, т.е. быть не содержащим каких-либо детектируемых белковых загрязняющих примесей согласно определению, например, электрофорезом в ДСН-ПААГ с окрашиванием серебром или ВЖХ, как объяснено выше.

Очищенные Рс-слитые белки могут быть предназначены для терапевтического применения, в частности для введения пациентам-людям. Если очищенный Рс-слитый белок вводят пациентам, его вводят предпочтительно системно и предпочтительно подкожно, или внутримышечно, или местно, т.е. локально. Может быть удобным также ректальное или внутриоболочечное введение в зависимости от конкретного медицинского применения очищенного Рс-слитого белка.

Для этой цели в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения очищенный Рсслитый белок может быть приготовлен в виде фармацевтической композиции, т.е. вместе с фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентами или т.п.

Определение фармацевтически приемлемый включает в себя любой носитель, который не препятствует эффективности биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным в отношении хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального введения этот активный белок (активные белки) могут быть приготовлены в унифицированной (стандартной) форме для инъекции в таких носителях, как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Активные ингредиенты фармацевтической композиции согласно этому изобретению могут вводиться индивидууму различными способами. Способы введения включают в себя интрадермальный, трансдермальный (например, в препаратах медленного высвобождения), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, внутричерепной, эпидуральный, местный, ректальный и интраназальный способы введения. Может быть использован любой другой терапевтически эффективный способ введения, например абсорбция через эпителиальные и эндотелиальные ткани или посредством генной терапии, где пациенту вводят (например, посредством вектора) ДНК-молекулу, кодирующую активный агент, что вызывает экспрессию и секрецию этого активного агента ίη νίνο. Кроме того, белок (белки) этого изобретения может вводиться вместе с другими компонентами биологически активных агентов, такими как фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и наполнители.

Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок (активные белки) может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка в ассоциации с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, солевым раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Этот

- 15 017733 препарат стерилизуют обычно используемыми способами.

Терапевтически эффективные количества активного белка (активных белков) будут зависеть от многих переменных, в том числе от типа Рс-слитого белка, аффинности Рс-слитого белка в отношении его лиганда, способа введения, клинического состояния пациента.

Терапевтически эффективное количество является таким количеством, что при введении этот Рсслитый белок приводит к ингибированию его лиганда терапевтической части этого Рс-слитого белка, как объяснялось выше, и в соответствии с табл. 2 выше.

Доза, вводимая в виде единственной дозы или в виде множественных доз индивидууму, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, включающих в себя фармацевтические свойства Рсслитого белка, способ введения, состояние и характеристики пациента (пол, возраст, массу тела, состояние здоровья, размер), степень симптомов, одновременные способы лечения, частоту введения доз и желаемый эффект. Корректирование установленных диапазонов доз и манипулирование ими находится вполне в рамках квалификации специалистов в данной области, так же как и способы ίη νίίτο и ίη νίνο определения ингибирования его лиганда терапевтической части Рс-слитого белка в индивидууме.

Очищенный Рс-слитый белок может быть использован в количестве 0,001-100, или 0,01-10, или 0,15, или 1-3, или 2 мг/кг массы тела.

В следующих предпочтительных вариантах осуществления очищенный белок Рс-слитый белок вводят один раз в день, или каждый второй день, или три раза в неделю, или один раз в неделю.

Суточные дозы обычно вводят в разделенных дозах или в виде формы задержанного высвобождения, эффективной для получения желаемых результатов. Второе или последующие введения могут выполняться в виде дозы, которая является той же самой, меньшей или большей, чем начальная или предыдущая доза, введенная этому индивидууму. Второе или последующее введение может выполняться во время или до проявления этого заболевания.

Данное изобретение относится также к композиции очищенного Рс-слитого белка, содержащей внеклеточную часть члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΕΚ.). полученной по способу в соответствии с этим изобретением, описанному подробно выше, причем указанная композиция содержит менее 2, или менее 1,5, или менее 1, или менее 0,7, или менее 0,6, или предпочтительно менее 0,5% агрегатов белка. Композиция этого изобретения предпочтительно содержит полностью интактный Рс-слитый белок, который лишен не более чем 1 или 2 аминокислот на его Ν- или С-конце.

Данное изобретение относится также к композиции очищенного Рс-слитого белка, содержащей внеклеточную часть члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (ΤΝΕΒ), полученной по способу в соответствии с этим изобретением, описанному подробно выше, причем указанная композиция содержит менее 1, или менее 0,8, или менее 0,5, или менее 0,1% свободного Рс, определенного выше.

Такой Рс-слитый белок может быть, например, получен из ОХ40, члена суперсемейства ΤΝΕΚ.. Такие белки с ОХ40-функцией, например ОХ40-[дС| и ОХ40-Ыд6₄тир могут быть предпочтительно использованы для лечения и/или предупреждения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как болезнь Крона.

Рс-слитый белок, содержащий терапевтическую часть молекулы, выбран предпочтительно из внеклеточного домена ΤΝΕΚΤ, ΤΝΕΚ.2 или их ΤΝΕ-связывающего фрагмента.

В предпочтительном варианте осуществления таким Рс-слитым белком является этанерцепт, Рсслитый белок, содержащий растворимую часть ЕЫРВ р75 (например, \¥О 91/03553, \УО 94/06476). Этанерцепт, очищенный в соответствии с данным изобретением, может быть использован, например, для лечения и/или предупреждения эндометриоза, инфекции вируса гепатита С, ВИЧ-инфекции, псориатического артрита, псориаза, ревматоидного артрита, астмы, анкилозирующего спондилита, сердечной недостаточности, реакции трансплантат против хозяина, пневмофиброза, болезни Крона. Ленерцепт является слитым белком, содержащим внеклеточные компоненты ΤNР-рецептора р55 человека и Рс-часть [§С человека, и предназначен для потенциального лечения тяжелого сепсиса и рассеянного склероза.

В следующем предпочтительном варианте осуществления Рс-слитый белок содержит терапевтическую часть, выбранную из внеклеточного домена ВАРР-В, ВСМА или ΤΑΟΙ или их фрагмента, связывающего по меньшей мере один из В1у§ или АРВГЬ.

Рс-слитый белок, произведенный из ВАРР-В, очищенный в соответствии с данным изобретением, может быть предпочтительно использован для лечения и/или предупреждения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (ВА) и системная красная волчанка (8ЬЕ).

ВСМАЛд-слитый белок, очищенный в соответствии с данным изобретением, может быть предпочтительно использован для лечения и/или предупреждения аутоиммунных заболеваний.

Рс-слитый белок, произведенный из ΤАСI ^АСЕРс), предпочтительно содержит полипептид, выбранный из

a) аминокислот 34-66 8ЕО ΙΌ ЫО: 2;

b) аминокислот 71-104 8ЕО ΙΌ ЫО: 2;

c) аминокислот 34-104 8ЕО ΙΌ ЫО: 2;

ά) аминокислот 30-110 8ЕО ΙΌ ЫО: 2;

е) ЛЕ) ΙΌ ЫО: 3;

- 16 017733

ί) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4;

д) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с комплементом 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 5, или 6, или 7, при условиях гибридизации высокой строгости; и

11) мутеина любого из (с), (б), (с) или (ί), имеющего по меньшей мере 80, или 85, или 90, или 95% идентичность последовательности с полипептидом (с), (б), (с) или (ί);

причем этот полипептид связывается по меньшей мере с одним из В1у§ или ΛΡΚ1Ε.

Очищенный ΤΛΟΙ-Εο может быть предпочтительно использован для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения ряда заболеваний или нарушений. Такие заболевания или нарушения предпочтительно выбраны из аутоиммунных нарушений, таких как системная красная волчанка (8ЬЕ), ревматоидный артрит (ΒΛ), а также рассеянного склероза (М8). Очищенный ΤΛΟΙ-Εο может быть также использован для лечения рака, например гематологических злокачественностей, таких как множественная миелома (ММ) и неходжкинская лимфома (ΝΗΌ), хронический лимфоцитарный лейкоз (СЬЬ) и макроглобулинемия Вальденстрема (\УМ).

После полного описания этого изобретения квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что оно может выполняться в широком диапазоне эквивалентных параметров, концентраций и условий без отклонения от идеи и объема этого изобретения и без чрезмерного экспериментирования. Хотя это изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, будет понятно, что оно может быть подвергнуто дополнительным модификациям. Эта заявка предназначена для включения любых вариаций, применений или адаптаций этого изобретения в соответствии, в общем, с принципами этого изобретения и с включением таких отклонений от данного описания, которые находятся в пределах известной или обычной практики в области, к которой относится это изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, описанным здесь выше, как следует из объема прилагаемой формулы изобретения.

Все цитируемые здесь ссылки, в том числе журнальные статьи или аннотации, опубликованные или неопубликованные заявки на патент США или иностранные заявки, выданные США, или иностранные патенты или другие ссылки, включены здесь в качестве ссылки в полном виде, в том числе со всеми результатами, таблицами, фигурами и текстом, представленными в этих цитируемых ссылках. Кроме того, все содержание этих ссылок в цитируемых здесь документах включено в полном виде.

Ссылка на известные стадии способа, общепринятые стадии способов, известные способы или общепринятые способы ни в коей мере не является признанием того, что любой аспект, любое описание или любой вариант осуществления этого изобретения описан, объяснен или высказан в качестве предположения в известном уровне техники.

Предыдущее описание конкретных вариантов осуществления будет настолько полно выявлять основной характер этого изобретения, что другие исследователи могут, посредством использования знаний, даваемых квалификацией в данной области (в том числе приведенным содержанием цитируемых ссылок), легко модифицируют и/или адаптируют для различного применения такие конкретные варианты осуществления, без чрезмерного экспериментирования, без отклонения от общей концепции данного изобретения. Таким образом, предполагается, что такие адаптации и модификации находятся в диапазоне эквивалентов этих описанных вариантов осуществления на основании утверждений и руководящих описаний, представленных в них. Должно быть понятно, что фразеология или терминология, применяемая здесь, служит цели описания, а не ограничения, так что эта терминология или фразеология данного описания должна интерпретироваться квалифицированным в данной области специалистом в свете объяснений и руководства, представленных здесь, в комбинации со знаниями специалиста с обычной квалификацией в данной области.

Примеры

Очистка рекомбинантного ТЛС1-Ес человека из бессывороточного супернатанта клеток СНО

Перечень сокращений

ВУ - объем слоя,

СНО - яичник китайского хомячка,

Ό8Ρ - процесс ниже по потоку,

ΕΌΤΛ - этилендиаминтетрауксусная кислота,

ΕΌΙδΛ - твердофазный иммуносорбентный анализ,

НАС - гидроксиапатитная хроматография,

НСР - белок клетки-хозяина,

ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография,

1б - внутренний диаметр,

К - калий, кД - килодальтон,

МЕ8 - 2-морфолиноэтансульфоновая кислота,

Να - натрий,

NаΛс - ацетат натрия.

н.о. - не определяли,

- 17 017733

РА-8Е-НРЬС - белок А-гель-проникающая - высокоэффективная жидкостная хроматография,

м. д. - миллионные доли,

ΚΟ - обратный осмос,

К.т. - комнатная температура,

ДСН-ПААГ - додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель-электрофорез,

8Е-НРЬС - гель-проникающая - высокоэффективная жидкостная хроматография,

Т°С - температура,

ТМАС - хлорид тетраметиламмония,

УФ - ультрафиолет, νΤΙ - вода для инъекций, \νΡΟ - водный обратный осмос.

Пример 1. Стадия захвата: аффинная очистка на белке А.

Исходным материалом был осветленный сбор клона клеток СНО, экспрессирующих ΤΑΟΙ-Ес, культивируемых при бессывороточных условиях и хранящихся в замороженном виде до использования.

Стадию захвата на колонке МаЬ8е1ес1 Х1га™ (СЕ НеаИйсаге 17-5269-03) проводили в соответствии со следующим протоколом на колонке, имеющей высоту слоя 17 см. Все операции выполняли при комнатной температуре за исключением раствора для нанесения, который хранили при температуре ниже 15°С. Регистрировали сигнал УФ при 280 нм.

Дезинфицирование.

Колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 колоночными объемами (3 ВУ) 0,1М уксусная кислота + 20% этанол в обратном потоке при 250 см/ч. Этот поток останавливали и выдерживали в течение 1 ч.

Стадия промывания.

Колонку промывали по меньшей мере 2 колоночными объемами (2 ВУ) ΚΟ воды в обратном потоке при 250 см/ч.

Уравновешивание.

Колонку уравновешивали по меньшей мере 5 колоночными объемами (5 ВУ) 25 мМ фосфат натрия + 150 мМ №1С1 рН 7,0 (пока параметры проводимости и рН находятся в указанном диапазоне: рН 7,0±0,1, проводимость 18±2 мС/см) в направленном вниз потоке при 450 см/ч.

Нанесение.

На колонку наносили осветленный сбор, хранящийся при температуре ниже 15°С, до емкости 15 мг общего ΤΑΟΙ-Ес, определенной анализом В1асоге, на 1 мл упакованной смолы при скорости потока 350 см/ч.

Стадия промывания.

Эту колонку промывали по меньшей мере 2 колоночными объемами (2 ВУ) буфера для уравновешивания при 350 см/ч, затем по меньшей мере 4 колоночными объемами (4 ВУ) буфера для уравновешивания (пока сигнал УФ не возвращался к линии фона) при 450 см/ч.

Элюция.

Этот материал элюировали различными буферами для элюции, как показано в табл. Ι, при скорости потока 350 см/ч. Фракцию элюата собирали от начала увеличения сигнала УФ до 6,0±0,5 ВУ элюции. Элюат инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при рН ниже 4,1 (доведенном добавлением раствора лимонной кислоты, если необходимо) и затем рН доводили до 5,0±0,1 добавлением 32% раствора №ЮН.

Регенерация.

Колонку регенерировали по меньшей мере 3 колоночными объемами (3 ВУ) 50 мМ ^Ο^Μ №1С1 в обратном потоке при 450 см/ч, останавливали поток на 15 мин и затем снова запускали этот поток при 450 см/ч по меньшей мере в течение протекания 3 колоночных объемов (пока сигнал УФ не возвращался к линии фона).

С этой стадии колонка работала в режиме обратного потока.

Стадия промывания.

Колонку промывали по меньшей мере 2 ВУ ΚΟ-воды при 450 см/ч.

Дезинфицирование.

Колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ буфера для дезинфекции при 250 см/ч, поток останавливали и колонку инкубировали в течение 60 мин.

Конечные стадии промывания.

Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ ΚΟ-воды при 250 см/ч, затем по меньшей мере 3 ВУ буфера для уравновешивания при 250 см/ч и наконец по меньшей мере 2 ВУ ΚΟ-воды при 250 см/ч.

Наконец, колонку хранили после промывания по меньшей мере 3 ВУ 20% этанола при 250 см/ч.

- 18 017733

Результаты.

Таблица I

Результаты с использованием различных буферов для элюции

Номер опыта	Буфер для элюции	Выход ТАС1-ГС	Агрегаты (*)	НСВ (м.д.)
1	50 мМ йаАс рНЗ,7	47,7	30, 3	5558
2	100 мМ ЙаАс рНЗ, 8	55,7	25,2	не определяли
3	200 мМ ЙаАс рНЗ, 8	58,0	28,2	не определяли
4	100 мМ ЙаАс рНЗ,7	68	30, 0	не определяли
5	0,2М йаАс+150 мМ йаС1 рН4	75, 1	3,8	не определяли
6	ЮОмМ ЙаАс рНЗ,7	84, 6	22	3491
7	250мМ ЙаАс рНЗ,7	82, 8	18,7	3318
8	ЮОмМ йа-цитрат рНЗ,7	79,2	8,8	4710
$	250мМ йа-цитрат рНЗ,7	71,9	23	2347
10	ЮОмМ йа-цитрат рНЗ,75	82,8	8,5	1576
11	ЮОмМ Йа-цитрат рНЗ,75	66, 6	9,0	664
12	ЮОмМ ЙаАс рНЗ,85	83,3	15,0	не определяли
13	ЮОмМ йа-цитрат рНЗ,75	81, 0	9,1	3490
				О КОЛ
14	100мм йа-цитрат рнЗ,ь5	/5, 1	14,6
14	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	44, 7	18,4	3783
16	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	47,1	15,8	3217
17	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	50,7	9,4	2349
18	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	58,0	10, 4	2550
19	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	67,1	28,7	2372
20	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	65, 6	17,5	2353
21	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	75, 6	19, 4	1807
22	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	57, 1	20,7	2465
23	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	51, 9	18,4	2030
24	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	58	11,5	1746
25	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	41,8	22,9	3029
26	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	39, 4	6,0	2424
27	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	31, 0	8,8	2936
28	100 мМ йа Ас рН4,1	28,3	25,0	3311

29	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	46, 4	9,1	не определяли
30	100 мМ ЙаАс рН4,1	42, 8	13,4	не определяли
31	100 мМ йа-цитрат рНЗ,75	57,5	26, 5	не определяли
32	100 ММ ЙаАс рН4,2	38,1	10,1	не определяли
33	100 мМ йа-цитрат рНЗ, 9	43,3	8,3	2011
34	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	63, 6	6, 6	1749
35	100 мМ йа-цитрат рНЗ, 9	65, 7	7,3	1689
36	100 мМ йа-цитрат рНЗ, 9	62,7	7,4	1609
37	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	61, 6	7,4	1479
38	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	60, 6	7,4	1623
39	100 мМ йа-цитрат рНЗ,9	64, 6	8,0	1497

- 19 017733

Выводы.

ТАС1-Ес5 в осветленном сборе захватывали непосредственно на колонке МаЬ8е1ес1 Х1га при динамической емкости 15 г общего ТАС1-Ес5 на 1 л упакованной смолы при скорости потока 350 см/ч. Условия элюции, в частности рН, оптимизировали для максимизации извлечения продукта при обеспечении значительного уменьшения уровней агрегатов. Был выбран буфер для элюции 0,1 М цитрат натрия рН 3,9, дающий приблизительно 5-10% уровни агрегатов, в сравнении с приблизительно 25-40% в осветленном сборе, без наблюдения мутности. Уровни НСР были обычно равны 1500-2000 м.д. Уровни НСР измеряли при помощи ЕЫ8А с использованием поликлональных антител. Эту смесь антител генерировали против белков клеток-хозяев, полученных из осветленного и концентрированного супернатанта культуры клеток нетрансфицированных клеток СНО.

Пример 2. Катионообменная хроматография.

Элюат из стадии захвата на белке А, диализованный в подходящий буфер для нанесения, использовали в качестве исходного материала для катионообменной хроматографии.

В этой стадии использовали колонку Егас!оде1 ЕМЭ 8О₃ ^-(Мегск 1.16882.0010), имеющую высоту слоя 10 см. Может быть использована также колонка Егас!оде1 8О₃ ^- с высотой слоя 15 см. В последнем случае динамическая емкость и скорость потока могут требовать адаптации, которая находится вполне в пределах обычных знаний специалиста в данной области.

Все операции выполняли при комнатной температуре и скорость потока поддерживали постоянной при 150 см/ч. При всех временных точках регистрировали сигнал УФ при 280 нм.

Стадия промывания.

Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ νΒΟ (водным обратным осмосом).

Дезинфицирование.

Затем колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ 0,5М ΝηΟΗ + 1,5М №С1 в режиме потока вверх.

Промывание.

Колонку промывали по меньшей мере 4 ВУ νΒΟ в режиме потока вниз.

Уравновешивание.

Колонку уравновешивали по меньшей мере 4 ВУ 100 мМ цитратом натрия рН 5,0 (или пока не достигались желаемая проводимость 12±1 мС/см и рН 5,0±0,1).

Нанесение.

На колонку наносили материал после захвата при рН 5,0 (рН при 5,0±0,1, проводимость при 12±1 мС/см) и при емкости не более 50 мг ТАС1-Ес, как определено анализом 8Е-НРБС, на 1 мл упакованной смолы.

Стадия промывания.

Затем колонку промывали по меньшей мере 5 ВУ 100 мМ фосфатом натрия рН 6,5.

Элюция.

Колонку элюировали различными буферами и при различных условиях, представленных в табл. II1У ниже.

Регенерация и дезинфицирование.

Колонку регенерировали и дезинфицировали 4 ВУ 0,5М №1ОН + 1,5М №10’1 в режиме потока вверх. Затем поток останавливали и выдерживали в течение 30 мин.

Промывание.

Колонку промывали по меньшей мере 4 ВУ \\РО.

Хранение.

Колонку хранили по меньшей мере в 3 ВУ 20% этанола.

- 20 017733

Результаты.

Таблица II

Действие рН и проводимости при элюции Уровни НСР в нанесенном материале: 189 м.д.

рн	Проводимость	Извлечение	НСР	Клиренс НСР
	(мС/см)	ТАС1-Ес	(м.д.)	(х)
6,5	15, 0	25%	118	1,6
7,3	22, 5	100%	50	3,8
8,0	15,0	95%	34	5,5
7,3	22, 5	100%	56	3,4
7,3	33,0	98%	133	1,4
7,3	22, 5	96%	45	4,2
7,3	22, 5	97%	53	3, 6
7,3	12, 0	54%	79	2,4
6, 3	22,5	83%	47	4,1
8,0	30, 0	96%	108	1,8
8,2	22, 5	97%	46	4,2
6,5	30,0	91%	116	1,6
7,3	22, 5	93%	48	3,9
7,3	22,5	95%	40	4,8

Табл. III показывает извлечение ТЛС1-Рс и клиренс НСР при нанесении при емкости 10 и 32 мг ТЛС1-Рс на 1 мл смолы и элюировании в фосфатном буфере при проводимости 12-33 мС/см. Сбор пика выполняли от начала увеличения УФ в течение 10±0,5 ВУ.

Таблица III

Действие оптимального рН и проводимости при злюции при нанесении при емкости 10 и 32 мг ТЛСЧ-Рс на 1 мл

Уровни НСР в нанесенном материале: 201 м.д.

Емкость загрузки (мг/мл)	РН	Проводимость (мС/см)	Извлечение ТАС1-Ес	НСР (м.д.)	Клиренс НСР (х)
10	3, 0	15, 0	91%	67	3, 0
		20,7	93%	61	3, 3
32	8,0	20,7	88%	54	3,7

Табл. IV показывает действие стадии промывания 50 или 100 или 150 мМ фосфатом натрия с рН 6,5 на извлечение ТЛСВРс и клиренс НСР.

- 21 017733

Таблица IV

Действие условий стадии промывания на производительность колонки

Уровни НСР в загрузке: 190 м.д. и уровни агрегатов: 2,0%

Концентрация фосфата в	Выход ТАС1Ес в промывочном растворе	Выход ТАС1- Гс в элюате	Агрегаты в элюате	НСР в элюате (м.д.)
промывочном растворе	(мМ)
промывка (промывочной раствор) 1	50	0,7%	99%	2,8%	62
промывка (промывочной раствор) 2	100	2,1%	98%	2, 9%	59
промывка (промывочной раствор) 3	150	9,1%	90%	2,7%	49

Буфер, использованный в промывочном растворе 2, содержащий 100 мМ фосфат натрия рН 6,5, имел проводимость 8,4 мС/см.

Фиг. 1 показывает окрашенный серебром, невосстановленный гель электрофореза в ДСН-ПААГ проб, полученных из экспериментов с использованием условий трехстадийного промывания, показанных в табл. IV на клиренсе свободного Ес;

фиг. 2 показывает частично совпадающие хроматограммы экспериментов со стадиями очистки с фосфатом натрия при различных концентрациях.

Стадию промывания оптимизировали при рН 6,5 с увеличивающимися концентрациями фосфата натрия (50-150 мМ). Как можно видеть на фиг. 1, концентрация промывочного буфера 150 мМ (промывка 3, дорожка 6) приводила к потерям ТАС1-Ес. Концентрация промывочного буфера 50 мМ (промывка 1, дорожка 8) приводила к пику чистого ТАС1-Ес, однако этот элюат содержал следы свободного Ес. Стадия промывки с 100 мМ фосфатом натрия рН 6,5 приводила к 98% извлечению в основном пике элюции и только 2% потерям в этой промывке (фиг. 2). Клиренс НСР увеличивался в 3,2 раза. Анализ фракций промывки и элюата при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ показал, что стадия промывки содержала свободный Ес с некоторым количеством интактного ТАС1-Ес при концентрациях буфера 100 мМ или более высоких (фиг. 1, дорожки 4 и 6). Концентрация 100 мМ или более является необходимой для полного удаления свободного Ес из фракций элюата (фиг. 1, дорожки 5 и 7).

Выводы.

Катионообменную стадию вводили в качестве второй стадии очистки после стадии захвата. Элюат стадии захвата был при низком рН (5,0) и низкой проводимости и мог быть непосредственно нанесен на катионообменник. Была выбрана смола Бгас1одс1 ΕΜΌ 80₃ ^- с загрузочной емкостью 50 мг/мл. Продукт не биологически активной деградации, свободный Ес, мог быть эффективно удален в стадии промывки 0,1 М фосфатом натрия рН 6,5. Условия элюции были оптимизированы для наилучшего клиренса НСР и высокого извлечения ТАС1-Ес (179 мМ фосфат натрия рН 8,0, проводимость 20,7 мС/см).

Альтернативно, элюция может проводиться в 10 Βν 20 мМ фосфата натрия и 180 мМ ΝαΟΊ рН 8,0 от начала увеличения оптической плотности при 280 нм.

Пример 3. Анионообменная хроматография.

Исходным материалом, используемым для этой стадии очистки, был элюат из катионообменной стадии на БгасЮдс1 80₃ ^- (см. пример 2), разведенный или диализованный в подходящий буфер для нанесения.

Эту стадию анионообменной хроматографии проводили на колонке 80ИВСЕ 300 (ОЕ НеаИйсаге 17-1275-01) с высотой слоя 10 см. В этой стадии может быть также использована колонка 80ИВСЕ 300 с высотой слоя 15 см. В последнем случае динамическая емкость и скорость потока могут требовать адаптации, которая находится вполне в пределах обычных знаний специалиста в данной области.

Все операции выполняли при комнатной температуре и регистрировали сигнал УФ при 280 нм. Эти стадии проводили при скорости потока либо 150, либо 200 см/ч.

Промывание.

Сначала эту колонку промывали по меньшей мере 1 Βν ΚΌ воды при скорости потока 150 см/ч.

Дезинфицирование.

Затем колонку дезинфицировали по меньшей мере 3 Βν 0,5М Να0Η + 1,5М №С1.

Стадия промывания.

Колонку промывали по меньшей мере 3 Βν, предпочтительно 4-10 Βν 0,5М фосфата Να рН 7,5 при скорости потока 200 см/ч.

Уравновешивание.

Колонку уравновешивали по меньшей мере 5 Βν 10, 15, 20, 25 или 30 мМ фосфата натрия рН 7,5. Необязательно, эта колонка может быть предварительно уравновешена 3 Βν 0,5М фосфата натрия рН 7,5.

- 22 017733

Нанесение, промывание и сбор загрязнителей ТАС1-Ес в проходящем потоке.

На колонку наносили материал, полученный после катионообмена, разведенный для получения концентрации фосфата 10-30 мМ, рН 7,5 при емкости не более 50 мг ТАС1-Ес согласно определению при помощи анализа 8Е-НРЬС на 1 мл упакованной смолы, собирая проходящий поток от начала увеличения УФ до конца этой стадии промывания, которую проводят в 4±0,5 ВУ буфера для уравновешивания.

Регенерация/дезинфицирование.

Эту колонку регенерировали и дезинфицировали по меньшей мере 3 ВУ 0,5М ΝαΟΗ + 1,5М ЫаС1 в режиме обратного потока (пока сигнал УФ не возвращается к линии фона) при скорости потока 150 см/ч. В конце этой регенерации насос останавливали на 30 мин.

Стадия промывания.

Колонку промывали по меньшей мере 3 ВУ КО воды при скорости потока 200 см/ч.

Хранение.

Колонку хранили по меньшей мере в 3 ВУ 20% этанола (об./об.).

Результаты.

Следующая табл. У суммирует результаты, полученные с использованием способа очистки, описанного выше.

Таблица У

Действие концентрации используемого для нанесения (загрузки) фосфата

рН загрузки	Концентрация фосфата загрузки (мМ)	Концентрация ТАС1-Ес загрузки (мг/л)	Емкость загрузки (мг/мл)	Извлечение ТАС1-Ес	Агрегаты	НСР (м.д.)
7,5	30	773	39	94%	10, 4%	82,8
7,5	25	639	39	90%	6, 9%	50,4
7,5	20	651	49	90%	5, 6%	43,9
7,5	15	437	46	88%	3,4%	45,0
7,5	10	283	не определяли	82%	2,8%	26,3

Выводы.

Анионообменную стадию на колонке 8оигсе 30Ц в проточном режиме оптимизировали для максимизации клиренса НСР и агрегатов. Нанесение элюата из катионообменника, либо разведенного, либо диафильтрованного, в 20 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 7,5 давало наилучший компромисс между извлечением продукта (90%) и клиренсом НСР (приблизительно от 2000 до 44 м.д.) и агрегатов (приблизительно от 25 до 5,6%). Использовали динамическую емкость 50 мг ТАС1-Ес на 1 мл упакованной смолы при скорости потока 150-200 см/ч.

Пример 4. Гидроксиапатитная хроматография.

Исходным материалом, используемым для этой стадии очистки, был проходящий поток анионообменной хроматографии (см. пример 3).

Использовали СНТ Сегатк НуЧгохуараШе Туре I (СНТ керамический гидроксиапатит типа I), колонку 40 мкм (Έίοηά 157-0040) с высотой слоя 10 см.

Все операции проводили при комнатной температуре. Скорость потока поддерживали постоянной при 175 см/ч и регистрировали сигнал УФ при 280 нм. Все растворы стерильно фильтровали и оборудование дезинфицировали гидроксидом натрия перед использованием. Колонку хранили в 0,5М растворе ΝηΟΗ. когда ее не использовали.

Начальные стадии промывки (промывание и предварительное уравновешивание).

Эту колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ 20 мМ буфера фосфата натрия рН 7,5 и затем по меньшей мере 3 ВУ 0,5 мМ буфера фосфата натрия рН 7,5 для снижения рН.

Уравновешивание.

Колонку уравновешивали по меньшей мере 5 ВУ 20 мМ фосфата натрия рН 7,5 (или пока не достигались желаемая проводимость 3,0±0,3 мС/см и рН 7,5±0,1).

Нанесение.

На колонку наносили проходящий поток из колонки 8ОИКСЕ 30Ц с добавленным хлоридом кальция до конечной концентрации 0,1 мМ из исходного раствора при 0,5М и рН доводили до 7,0 добавлением 85% ортофосфорной кислоты при емкости ХМТ 50 мг ТАСКЕс, определенной при помощи анализа 8Е-НРЬС, на 1 мл упакованной смолы. Можно также наносить проходящий поток из колонки 8ОИКСЕ 30Ц без хлорида кальция, с доведением до рН 7,0 на гидроксиапатитной колонке.

- 23 017733

Стадии промывания.

Эту колонку промывали по меньшей мере 4 ВУ 3, 4 или 5 мМ фосфатом натрия, 10 мМ МЕ8, 0,1 мМ СаС1₂ рН 6,5. В этих стадиях можно также использовать тот же самый буфер без хлорида кальция.

Элюция.

Колонку элюировали 5, 4, 3 или 2 мМ натрий-фосфатным буфером (см. табл. У1), 10 мМ МЕ8, 0,1 мМ СаС1₂ и 0,6, 0,7, 0,8 или 0,9М КС1 рН 6,5 (см. табл. VII) от начала увеличения УФ для различных ВУ (см. табл. У1 и VII). Для элюции можно также использовать тот же самый буфер без хлорида кальция.

Промывание.

Колонку промывали по меньшей мере 1 ВУ 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,5;

по меньшей мере 3 ВУ 0,5 М натрий-фосфатного буфера рН 7,5 и по меньшей мере 1 ВУ 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,5.

Хранение.

Эту колонку хранили по меньшей мере в 3 ВУ 0,5 М М10Н.

Результаты.

Табл. У1 показывает действие концентрации фосфата (от 2 до 5 мМ) в буфере для элюции на клиренс агрегатов и извлечение продукта. Фракции пика элюции объединяли и анализировали при помощи 8Е-НРЬС на концентрацию ТАС1-Рс и уровни агрегатов.

Таблица У1

Действие концентрации фосфата в буфере для элюции

Концентрация фосфата (мМ)	ВУ элюции	Выход ТАС1-ГС	Агрегаты
5	12	73%	0,49%
	13	74%	0, 52%
	14	68%	0, 65%
	15	77%	0,67%
	16	77%	0,70%
	17	70%	0, 73%
	18	76%	0,85%
4	12	68%	0,34%
	13	67%	0,29%
	14	66%	0,36%
	15	67%	0,39%
	16	66%	0, 38%
	17	66%	0,32%
	18	66%	0,40%
3	12	70%	0,46%
	13	76%	0, 42%
	14	73%	0,51%
	15	71%	0,52%
	16	69%	0,55%
	17	69%	0, 50%
	18	70%	0,53%

- 24 017733

2	12	65%	0,19%
	13	66%	0,00%
	14	66%	0,18%
	15	68%	0, 14%
	16	66%	0,17%
	17	71%	0, 19%
	18	65%	0,16%

Табл. VII показывает действие концентрации КС1 в буфере для элюции на клиренс агрегатов и извлечение продукта. Исследовали две концентрации фосфата натрия: 2 и 3 мМ. Фракции пика элюции объединяли и анализировали при помощи 8Е-НРЬС на концентрацию ТАС1-Рс и уровни агрегатов.

Таблица VII

Действие концентрации хлорида калия в буфере для элюции

Концентрация	Концентрация	Βν	Выход ТАС1-	Агрегаты
фосфата (мМ)	КС1 (М)	элюции	Ес
3	0,6	10	102%	0, 48%
		11	109%	0, 46%
		12	106%	0, 43%
		13	105%	0, 42%
		14	103%	0,43%
3	0,7	10	96%	0, 42%
		11	97%	0, 40%
		12	98%	0, 41%
		13	96%	0, 40%
		14	96%	0,43%
3	0,8	10	106%	0, 58%
		11	110%	0, 55%
		12	112%	0, 57%
		13	101%	0, 59%
		14	110%	0,57%

2	0, 6	10	71%	0, 29%
		11	79%	0,28%
		12	80%	0,29%
		13	80%	0,29%
		14	81%	0, 26%
2	0,9	10	64%	0,27%
		11	72%	0, 25%
		12	73%	0, 29%
		13	70%	0, 33%
		14	66%	0, 24%

Выводы.

Гидроксиапатитная хроматография обеспечивает надежный эффективный способ уменьшения уровней агрегатов ТАСЕ-Рс. С использованием в качестве исходного материала очищенного анионообменной хроматографией материала (см. пример 3) с уровнями агрегатов приблизительно 5-8%, гидроксиапатитная хроматография может уменьшать эти уровни до менее 0,8% с извлечением ТАСЧ-Рс 8590%.

- 25 017733

Общий результат

Был разработан четырехстадийный способ очистки для ТАС1-Ес, приводящий к высокоочищенному ТАС1-Ес, с общим уменьшением агрегатов до менее 1% (0,2-0,8% в пяти экспериментах), общим уменьшением НСР до приблизительно 5-10 м.д. и общим уменьшением уровней свободного Ес до менее 0,5% (0,2 и 0,1% в двух экспериментах).

Ссылки

1. Акегз!гот апй Вргк, 1. Вю1. СНет. 1989 Ыоу 25; 264(33): 19740-6.

2. А1!зсНи1 8.Е. е! а1., 1. Мо1. Вю1., 215, 403-410, 1990.

3. А1!зсНи1 8.Е. е! а1., ЫисШс Ас1йз Кез., 25:389-3402, 1997.

4. Агтоиг К.Ь. е! а1., 1999. КесотЬтап! Нитап 1дС то1еси1ез 1асктд Есдатта гесер!ог I Ьтйтд апй топосу!е Нзддегтд ас!1УЙ1ез. Еиг. 1. 1ттипо1. 29(8):2613-24.

5. В1аск е! а1., И8 2002/0115175.

6. Войтег е! а1., Т1В8 27(1), 19-24.

7. ВозсНеШ, Е., 1ипдЬаиег, 8ер. 8сг & ТесН. 2 Ыо. 15, Асай. Ргезз (2000) 53.

8. ВозсНеШ е! а1., СепеЕс ЕпС1пееппд Уо1. 20, Ыо. 13, 1и1у, 2000.

9. Воззеп е! а1., /ВС 281 (2), 13964-13971.

10. Вгат апй уоп Ви1оте, И8 5969102 (1999).

11. Вгат е! а1., АО 98/39361.

12. СаЕег Р.Е, 2006. Ро!еп! апЕЬойу !НегареиЕсз Ьу йез1дп. Ыа!иге Ке\зе\\'з 1ттипо1оду. Айуапсе опЕпе риЬНсаЕоп.

13. Оеуегеих 1. е! а1., Ыис1е1с Ас1йз Кез, 12, 387-395, 1984.

14. Еепд е! а1., Вюргосеззтд 2005, 1-7.

15. Сюуаптш, Вю!есНпо1оду апй Вюепдтеегтд 73:522-529 (2000).

16. Сгап!Нат е! а1., 8с1епсе, Уо1. 185, рр. 862-864 (1974).

17. Сгозз е! а1., Ыа!иге 404(27), 995-999.

18. Сгозз е! а1., АО 00/40716.

19. Нт!оп Р.К. е! а1., 2004. Епдтеегей Нитап 1дС апЕЬоФез \\ЙН 1опдег зегит На1Г-Нуез ш рпта!ез. 1. Вю1. СНет. 279(8):6213-6.

20. 1 ВтоиП/ е! а1., /ВС 280(8), 7218-7227.

21. 1йизод1е Е.Е. е! а1., 2000. Марртд оГ Изе С1с| Ьтйтд зйе оп гйихап, а сЫтепс апЕЬойу \\ЙН а Нитап 1дС1 Ес. 1. 1ттипо1. 164 (8):4178-84.

22. 1йизод1е Е.Е. е! а1., 2001. Епдтеегей апЕЬоФез \\ЙН тсгеазей асЕуйу !о гесгш! сотр1етеп!. 1. 1ттипо1. 166(4):2571-5.

23. 1зН1Нага, ЕР 1614693.

24. КаЬа!, Е.А., Аи, Т.Т., Реггу, Н.М., Со!!езтап, К.8., апй Еое11ег, С. (1991), 8ес.|иепсез оГ Рго!етз оГ 1ттипо1од1са1 1п!егез!, 5!Н Ей., Ыа!юпа1 1пз!йи!ез оГ НеаНН, Ве!Незйа, МО.

25. КосНапек е! а1., ЕР 1230354.

26. Ьоскз1еу е! а1., Се11 104, 487-501, 2001

27. Ме1сНегз, Апп. КНеит. О1з 2003, 62, 25-27.

28. Мооге е! а1., 8с1епсе 285: 260-3.

29. Могеаи е! а1., В1оой 103(8), 3148-3157.

30. №1зтйН апй 8ргапд, Т1В8 23, 74-79, 1998.

31. Ыоуак е! а1., В1оой 103(2), 689-694.

32. Кзхоп е! а1., АО 02/094852.

33. Реагзоп, Ме!Нойз Епхуто1. 1990;183:63-98.

34. Рога!Н, 1. Саг1ззоп, I. О1ззоп, апй С. Ве1£гаде, Ыа!иге (Ьопйоп) 258, 598-599 (1975).

35. Рога!Н апй В. ОЕп, ВюсНет1зЕу 22, 1621-1630 (1983).

36. Ригеп е! а1., Ргос ЫаЕ Асай 8οΐ И8А. 1999 Маг 2;96(5):2256-61.

37. 8Нерагй, 1. оГ СНгота!одгарНу 891:93-98 (2000).

38. 8Н1е1йз К.Ь. е! а1., 2001. Н1дН гезо1иЕоп тарртд оГ Изе Ьтйтд зйе оп Нитап 1дС1 Гог Ес датта К1, Ес датта КП, Ес датта К111, апй ЕсКп апй йез1дп оГ 1дС1 уапап!з \\ЙН тргоуей Ьтйтд !о !Не Ес датта К. 1. Вю1. СНет. 276(9):6591-604.

39. 8тйН е! а1., АО 91/03553.

40. 8тйН е! а1., АО 94/06476.

41. 8!апкег, 1. 1ттипо1од1са1 Ме!Нойз 76:157-169 (1985) (10 тМ !о 30 тМ зойшт рНозрНа!е е1изюп дгаФеп!).

42. 8!еигег А. е! а1., 1995. Ех у1уо соаНпд оГ 1з1е! се11 а11одгайз \\ЙН тшзпе СТЬА4/Ес ргото!ез дгай !о1егапсе. 1. 1ттипо1. 155(3): 1165-74.

43. 8ип е! а1., АО 2005/044856.

44. Такейа е! а1., ЕР 1 561 756.

45. Тагйй1, 1. СНгота!одгарНу 599:13-20 (1992).

46. Уассаго С. е! а1., 2005. Епдтееппд !Не Ес гедюп оГ 1ттипод1оЬи1т С !о тойи1а!е т у1уо апЕЬойу

- 26 017733

1еуе1к. ΝηΙ Вю!ескпо1. 23(10): 1283-8.

47. У1§егк е1 а1., Иа!иге. 1997 Маг 13; 386(6621 ):190-4.

48. УейапШат е! а1., АО 03/59935.

49. Уо1а е! а1., ВюТес11пк|иек 14:650-655 (1993).

50. уоп Ви1о\у апй Вгат, 8с1епсе 228: 138 (1997).

51. Х1а е! а1., I. Ехр. Мей. 2000, 137-143.

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ очистки Ес-слитого белка, имеющего изоэлектрическую точку (р1) 6,9-9,5, предусматривающий следующие стадии:

   a) аффинная хроматография на основе белка А или белка О жидкости, содержащей указанный Есслитый белок;

   b) катионообменная хроматография элюата со стадии (а);

   c) анионообменная хроматография элюата со стадии (Ь);

   й) гидроксиапатитная хроматография проходящей фракции стадии (с) и

   е) сбор элюата со стадии (й) с получением очищенного Ес-слитого белка.
2. 2. Способ по п.1, где элюцию на стадии (а) проводят при рН в диапазоне от 2,8 до 4,5.
3. 3. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадия (Ь) дополнительно предусматривает:

   Ь.1) промывание катионообменной смолы после нанесения элюата буфером, имеющим рН в диапазоне от 6,0 до 7,0 и проводимость в диапазоне от 6 до 10 мС/см; и

   Ь.2) элюцию колонки при рН в диапазоне от 7,3 до 8,2 и проводимости в диапазоне от 15 до 22 мС/см.
4. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где на стадии (с) уравновешивание и нанесение элюата проводят в буфере, имеющем проводимость 3-4,6 мС/см и рН на одну единицу ниже, чем величина р1 Ес-слитого белка.
5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где элюцию на стадии (й) проводят в присутствии фосфата натрия в диапазоне концентраций от 3 до 10 мМ.
6. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где элюцию на стадии (й) проводят в присутствии хлорида калия в диапазоне концентраций от 0,4 до 1М.
7. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, где элюцию на стадии (й) проводят при рН в диапазоне от 6 до 7.
8. 8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию (а) проводят на смоле, содержащей сшитую агарозу, модифицированную рекомбинантным белком А или белком О.
9. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию (Ь) проводят на сильной катионообменной смоле.
10. 10. Способ по п.9, где указанная смола содержит сшитый метакрилат, модифицированный 8О₃группами.
11. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию (с) проводят на сильной анионообменной смоле.
12. 12. Способ по п.11, где указанная смола содержит полистирол/дивинилбензол, модифицированный ^(СН₃)₃.
13. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию (й) проводят на керамической гидроксиапатитной смоле.
14. 14. Способ по п.13, где керамическая гидроксиапатитная смола содержит частицы с размером 40 мкм.
15. 15. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий по меньшей мере одну стадию ультрафильтрации.
16. 16. Способ по п.15, где стадию ультрафильтрации проводят между стадиями (Ь) и (с) и/или после стадии (й).
17. 17. Способ по любому из пп.1-16, где Ес-слитый белок имеет р1 8-9.
18. 18. Способ по п.17, где Ес-слитый белок имеет р1 8,3-8,6.
19. 19. Способ по любому из пп.1-16, где Ес-слитый белок содержит лигандсвязывающую часть члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (ТИЕВ).
20. 20. Способ по п.19, где лигандсвязывающая часть выбрана из внеклеточного домена ТИЕКТ, ТИВВ2 или их ТИВ-связывающего фрагмента.
21. 21. Способ по п.19, где лигандсвязывающая часть выбрана из внеклеточного домена ВАЕЕ-В ВСМА, ТАС1 или их фрагмента, связывающего по меньшей мере один из лигандов В1ук или АРВ1Ь.
22. 22. Способ по п.21, где Ес-слитый белок содержит полипептид, выбранный из:

    a) аминокислот 34-66 8ЕО ГО ИО: 2;

    b) аминокислот 71-104 8ЕО ГО ИО: 2;

    c) аминокислот 34-104 8ЕО ГО ИО: 2;

    - 27 017733

    б) аминокислот 30-110 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

    с) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3;

    ί) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4;

    д) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с последовательностью, комплементарной 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5, 6 или 7, в жестких условиях; и

    1) мутантного полипептида, выбранного из (с), (б), (с) и (ί), идентичного по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% последовательности полипептида (с), (б), (е) или (ί);

    где указанный полипептид связывается по меньшей мере с одним из лигандов В1у§ или ΛΡΚ1Ε.
23. 23. Способ по любому из предыдущих пунктов, где Рс-слитый белок содержит константную область тяжелой цепи иммуноглобулина.
24. 24. Способ по п.23, где константная область является константной областью иммуноглобулина человека.
25. 25. Способ по п.23 или 24, где иммуноглобулином является ΙβΟ|.
26. 26. Способ по любому из пп.22-24, где указанная константная область содержит шарнирную область, СН2- и СН3-домены.
27. 27. Композиция очищенного Рс-слитого белка, полученного при помощи способа по любому из предыдущих пунктов, для ингибирования связывания лигандов В1у8 и ΛΡΚ1Ε с В-клетками, где Рсслитый белок содержит полипептид, выбранный из

    a) аминокислот 34-66 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

    b) аминокислот 71-104 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

    c) аминокислот 34-104 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

    б) аминокислот 30-110 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2;

    с) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4;

    ί) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, гибридизующимся с последовательностью, комплементарной 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5, 6 или 7, в жестких условиях; и

    д) мутантного полипептида, выбранного из (с), (б) и (е), идентичного по меньшей мере на 80, 85, 90 или 95% последовательности полипептида (с), (б) или (е);

    где указанный полипептид связывается по меньшей мере с одним из лигандов В1у§ или ΛΡΚ1Ε и где указанная композиция содержит менее 1 или менее 0,5% агрегатов белка и где указанная композиция содержит менее 1, или менее 0,5, или менее 0,1% свободного Рс-белка.