ES2632444T3

ES2632444T3 - Compuestos que mejoran la transducción viral

Info

Publication number: ES2632444T3
Application number: ES12836507.9T
Authority: ES
Inventors: Garrett Collins HEFFNER; Abraham Isaac BASSAN
Original assignee: Bluebird Bio Inc
Current assignee: Bluebird Bio Inc
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2017-09-13
Anticipated expiration: 2032-09-28
Also published as: US10501759B2; MX359398B; US20140234278A1; CN108220246A; EA201490627A1; JP2018099124A; JP2014530012A; EP2760994B2; UA114796C2; AU2012315699B2; ES2769270T3; NZ623341A; US20240229070A1; MX2018011791A; EP3269802A1; AU2012315699A1; US20180363004A1; EP2760994B8; EA032699B1; US20200048657A1

Abstract

Método para aumentar la eficiencia de transducción de células cultivadas con un lentivirus que comprende: cultivar las células y el lentivirus en un medio de cultivo que comprende un compuesto que aumenta la señalización de receptores EP de prostaglandinas, en el que las células se cultivan con el lentivirus durante, o antes del cultivo con el compuesto que aumenta la señalización de receptores EP de prostaglandinas en el que (a) el compuesto que aumenta la señalización de receptores EP de prostaglandinas está seleccionado del grupo que consiste en: PGA2; PGB2; PGD2; PGE1; PGE2; PGF2; PGI2; PGH2; PGJ2; y análogos de los mismos; (b) el compuesto que aumenta la señalización de receptores EP de prostaglandinas está seleccionado del grupo que consiste en: 15d-PGJ2; delta12-PGJ2; ácido 2-hidroxiheptadecatrienoico (HHT); tromboxano A2; tromboxano B2; iloprost; treprostinil; travoprost; carboprost trometamina; tafluprost; latanoprost; bimatoprost; unoprostona isopropilo; cloprostenol; Oestrophan; Superphan; misoprostol; butaprost; ácido linoleico; 13(s)- HODE; LY171883; ácido de Mead; ácido eicosatrienoico; ácido epoxieicosatrienoico; ONO-259; Cay1039; un agonista del receptor de PGE2; 16,16-dimetil PGE2; 19(R)-hidroxi PGE2; éster p-(p-acetamidobenzamido)fenílico de 16,16-dimetil PGE2; 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2; 9-desoxi-9-metilen-16,16-dimetil PGE2; 9-desoxi-9- metilen PGE2; sulprostona; serinolamida de PGE2; éster metílico de PGE2; 16-fenil tetranor PGE2; 15(S)-15- metil PGE2; 15(R)-15-metil PGE2; BIO; 8-bromo-AMPc; forskolina; bapta-AM; fendilina; nicardipina; nifedipina; pimozida; estrofantidina; lanatósido; L-Arg; nitroprusiato sódico; vanadato sódico; bradicinina; mebeverina; flurandrenolida; atenolol; pindolol; gaboxadol; ácido quinurénico; hidralazina; tiabendazol; bicuculina; vesamicol; peruvósido; imipramina; clorpropamida; 1,5-pentametilentetrazol; 4-aminopiridina; diazóxido; benfotiamina; ácido 12-metoxidodecenoico; N-formil-Met-Leu-Phe; galamina; IAA 94; y clorotrianiseno; o (c) el compuesto que aumenta la señalización de receptores EP de prostaglandinas está seleccionado del grupo que consiste en: prostaglandina E2 (PGE2) o 16,16-dimetil PGE2.

Description

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región R (repetición) está flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR está compuesta por las regiones U3, R y U5 y aparece en ambos extremos 5’ y 3’ del genoma viral. Adyacentes a la LTR 5’ hay secuencias necesarias para la transcripción inversa del genoma (el sitio de unión del cebador de ARNt) y para el empaquetamiento eficaz del ARN viral en las partículas (el sitio Psi).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “señal de empaquetamiento” o “secuencia de empaquetamiento” se refiere a secuencias situadas dentro del genoma retroviral que son necesarias para la inserción del ARN viral en la partícula o cápside viral, véase por ejemplo Clever et al. 1995. J. of Virology, vol. 69, nº 4; págs. 2101-2109. Varios vectores retrovirales utilizan la señal de empaquetamiento mínima (también denominada secuencia psi [Ψ] o [Ψ+]) necesaria para la encapsidación del genoma viral. Por lo tanto, tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones “secuencia de empaquetamiento”, “señal de empaquetamiento”, el término “psi” y el símbolo “Ψ”, se utilizan en referencia a la secuencia no codificante necesaria para la encapsidación de las cadenas de ARN retrovirales durante la formación de las partículas virales.

En diversas formas de realización, los vectores comprenden LTR 5’ y/o LTR 3’ modificadas. Con frecuencia se realizan modificaciones de la LTR 3’ para mejorar la seguridad de los sistemas lentivirales o retrovirales haciendo que los virus sean de replicación defectuosa. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “de replicación defectuosa” se refiere a un virus que no es capaz de realizar una replicación completa y eficaz, de manera que no se producen viriones infecciosos (por ejemplo, descendencia lentiviral de replicación defectuosa). La expresión “de replicación competente” se refiere a un virus silvestre o a un virus mutante que es capaz de replicarse, de manera que la replicación viral del virus es capaz de producir viriones infecciosos (por ejemplo, descendencia lentiviral de replicación competente).

Vectores “autoinactivantes” (SIN) se refiere a vectores de replicación defectuosa, por ejemplo, vectores retrovirales o lentivirales, en los que se ha modificado la región potenciadora-promotora de la LTR derecha (3’), conocida como región U3 (por ejemplo, por deleción y/o sustitución) para impedir la transcripción viral más allá de la primera ronda de replicación viral. Esto se debe a que la región U3 de la LTR derecha (3’) se utiliza como plantilla para la región U3 de la LTR izquierda (5’) durante la replicación viral y, por lo tanto, la transcripción viral no puede hacerse sin el potenciador-promotor U3. En una forma de realización adicional de la divulgación, la LTR 3’ se modifica de manera que la región U5 se sustituye, por ejemplo, con una secuencia poli(A) heteróloga o sintética, uno

o más elementos aisladores y/o un promotor inducible. Cabe señalar que en la divulgación también se incluyen modificaciones en las LTR tales como modificaciones en la LTR 3’, en la LTR 5’ o en las LTR 3’ y 5’.

Se proporciona una mejora adicional de la seguridad sustituyendo la región U3 de la LTR 5’ con un promotor heterólogo para inducir la transcripción del genoma viral durante la producción de partículas virales. Los ejemplos de promotores heterólogos que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, los promotores virales de virus de simio 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, temprano inmediato), virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma de Rous (RSV) y virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa). Los promotores típicos son capaces de inducir altos niveles de transcripción de manera independiente de Tat. Esta sustitución reduce la posibilidad de recombinación para generar virus de replicación competente porque no hay una secuencia U3 completa en el sistema de producción de virus. En determinadas formas de realización, el promotor heterólogo puede ser inducible, de manera que la transcripción de la totalidad o de parte del genoma viral se produzca sólo cuando se encuentren presentes uno o más factores de inducción. Los factores de inducción incluyen, pero no se limitan a, uno o más compuestos químicos o condiciones fisiológicas, por ejemplo, de temperatura o de pH, en las que se cultivan las células hospedadoras.

En algunas formas de realización, los vectores virales comprenden un elemento TAR. El término “TAR” se refiere al elemento genético “de respuesta a la transactivación” que se encuentra en la región R de las LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactúa con el elemento genético transactivador lentiviral (tat) para potencia la replicación viral. Sin embargo, este elemento no es necesario en las formas de realización en las que la región U3 de la LTR 5’ se sustituye por un promotor heterólogo.

La “región R” se refiere a la región dentro de las LTR retrovirales que comienza en el inicio del grupo de formación de la caperuza (es decir, el inicio de la transcripción) y que termina inmediatamente antes del inicio del tramo poliA. La región R también se define como flanqueada por las regiones U3 y U5. La región R es importante durante la transcripción inversa, pues permite la transferencia del ADN naciente de un extremo del genoma al otro.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “elemento FLAP” se refiere a un ácido nucleico cuya secuencia incluye la región central del tracto de polipurina y las secuencias de terminación centrales (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Se describen elementos FLAP adecuados en la patente estadounidense nº 6.682.907 y en Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Durante la transcripción inversa del VIH-1, la iniciación central del ADN de cadena positiva en la región central del tracto de polipurina (cPPT) y la terminación central en la secuencia de terminación central (CTS) conducen a la formación de una estructura de ADN tricatenario: el “ADN flap” (DNA flap) central del VIH-1. Sin desear limitarse a teoría alguna, el “ADN flap” puede actuar como un determinante con actividad en cis de importación nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el título del virus. En formas de realización particulares, los esqueletos de vectores retrovirales o lentivirales comprenden uno o más

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concretos se produce en las células diana y no en otras células no diana. Cada una de las una o más secuencias de control de la expresión en un vector que son específicas de célula puede expresarse en tipos celulares iguales o diferentes dependiendo del tratamiento deseado. En formas de realización preferentes, los vectores comprenden una o más secuencias de control de la expresión específicas de las células hematopoyéticas, por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas. En otras formas de realización preferentes, los vectores comprenden una o más secuencias de control de la expresión específicas de las células eritroides.

El término “promotor”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleótido (ADN o ARN) al que se une una ARN polimerasa. El término “potenciador” se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar una transcripción potenciada y en algunos casos puede funcionar con independencia de su orientación con respecto a otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de manera cooperativa o aditiva con promotores y/o otros elementos potenciadores. El término “promotor/potenciador” se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias capaces de proporcionar ambas funciones promotora y potenciadora.

En formas de realización particulares, un vector de la divulgación comprende secuencias de control exógenas, endógenas o heterólogas tales como promotores y/o potenciadores. Una secuencia de control “endógena” es aquella que está naturalmente unida a un determinado gen en el genoma. Una secuencia de control “exógena” es aquella que está situada en yuxtaposición a un gen mediante manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de manera que la transcripción de ese gen esté dirigida por el potenciador/promotor unido. Una secuencia de control “heteróloga” es una secuencia exógena que pertenece a una especie diferente a la célula que se está manipulado genéticamente. Una secuencia de control “sintética” puede comprender elementos de una o más secuencias exógenas y/o endógenas, y/o secuencias determinadas in vitro o in silico que proporcionan actividad promotora y/o potenciadora óptima para la terapia génica particular.

La expresión “operativamente unido”, se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. En una forma de realización, la expresión se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de la expresión de ácido nucleico (tal como un promotor y/o potenciador u otra secuencia de control de la expresión) y una segunda secuencia polinucleotídica, por ejemplo, un polinucleótido-de-interés, en la que la secuencia de control de la expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia de control de la expresión constitutiva” se refiere a un promotor, potenciador o promotor/potenciador que permite de manera constante o continua la transcripción de una secuencia unida operativamente. Una secuencia de control de la expresión constitutiva puede ser un promotor, potenciador o promotor/potenciador “ubicuo” que permite la expresión en una gran diversidad de tipos de células y tejidos o un promotor, potenciador, o promotor/potenciador “específico de célula”, “específico de tipo de célula”, “específico de estirpe celular” o “específico de tejido”, que permite la expresión en una diversidad limitada de tipos de células y tejidos, respectivamente. Las secuencias de control de la expresión ubicuas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un promotor viral del virus de simio 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardío), un promotor de LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), una LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor del virus del herpes simple (HSV) (timidina quinasa), promotores H5, P7.5 y P11 del virus vaccinia, un promotor del factor de elongación 1-alfa (EF1a), respuesta de crecimiento precoz 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciación de la traducción eucariota 4A1 (EIF4A1), proteína 5 de choque térmico de 70 kDa (HSPA5), proteína de choque térmico de 90 kDa beta, miembro 1 (HSP90B1), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70), β-quinesina (β-KIN), el locus ROSA26 humano (Irions et al., (2007) Nature Biotechnology 25, 1477-1482), un promotor de ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK), un potenciador de citomegalovirus/promotor de β-actina de pollo (CAG) y un promotor de β-actina.

En una forma de realización particular, puede resultar deseable utilizar una secuencia de control de la expresión específica de célula, tipo celular, linaje celular o tejido para conseguir la expresión específica de tipo celular, específica de linaje o específica de tejido de una secuencia polinucleotídica deseada (por ejemplo, para expresar un ácido nucleico concreto que codifica un polipéptido en sólo un subconjunto de tipos celulares, linajes celulares o tejidos, o durante etapas de desarrollo específicas).

Los ejemplos ilustrativos de promotores específicos de tejido incluyen, pero no se limitan a: un promotor de B29 (expresión en linfocitos B), un promotor del factor de transcripción Runt (CBFA2) (expresión específica en células madre), un promotor de CD14 (expresión en células monocíticas), un promotor de CD43 (expresión en leucocitos y plaquetas), un promotor de CD45 (expresión en células hematopoyéticas), un promotor de CD68 (expresión en macrófagos), un promotor de CYP450 3A4 (expresión en hepatocitos), un promotor de desmina (expresión en músculo), un promotor de elastasa 1 (expresión en células acinares pancreáticas), un promotor de endoglina (expresión en células endoteliales), un promotor de proteína específica de fibroblastos 1 (FSP1) (expresión en células fibrobásticas), un promotor de fibronectina (expresión en células fibrobásticas), un promotor de tirosina quinasa relacionada con fms 1 (FLT1) (expresión en células endoteliales), un promotor de la proteína ácida

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Los sitios de reconocimiento adecuados para la recombinasa FLP incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake y Bode, 1994), F4, F5 (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988).

Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que son reconocidas por la enzima recombinasa integrasa λ, por ejemplo, phi-c31. La SSR de φC31 interviene en la recombinación solamente entre los sitios heterotípicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Groth et al., 2000). Tanto attB como attP, denominados así por los sitios de anclaje para la integrasa del fago en los genomas de bacterias y fagos, respectivamente, contienen repeticiones invertidas imperfectas que probablemente están unidas por homodímeros de φC31 (Groth et al., 2000). Los sitios producto, attL y attR, son de hecho inertes para la posterior recombinación mediada por φC31 (Belteki et al., 2003), haciendo que la reacción sea irreversible. Para catalizar las inserciones, se ha descubierto que el ADN que porta attB se inserta en un sitio attP genómico más fácilmente que un sitio attP en un sitio attB genómico (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Por lo tanto, las estrategias típicas sitúan mediante recombinación homóloga un “sitio de acoplamiento” que porta attP en un locus definido, que a continuación se empareja con una secuencia entrante que porta attB para la inserción.

Tal como se utiliza en el presente documento, un “sitio interno de entrada al ribosoma” o “IRES” se refiere a un elemento que promueve la entrada interna directa al ribosoma al codón de iniciación, tal como ATG, de un cistrón (una región codificante de proteínas), lo que conduce a la traducción independiente de caperuza del gen. Véase, por ejemplo, Jackson et al., (1990) Trends Biochem Sci 15(12):477-83, y Jackson y Kaminski (1995) RNA 1 (10):9851000. En formas de realización particulares, los vectores que se contemplan en la divulgación incluyen uno o más polinucleótidos-de-interés que codifican uno o más polipéptidos. En formas de realización particulares, para conseguir una traducción eficiente de cada uno de la pluralidad de polipéptidos, las secuencias polinucleotídicas pueden estar separadas por una o más secuencias IRES o secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de autoescisión.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “secuencia de Kozak” se refiere a una secuencia nucleotídica corta que facilita en gran medida la unión inicial del ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma y aumenta la traducción. La secuencia de Kozak consenso es (GCC)RCCATGG, en la que R es una purina (A o G) (Kozak, (1986) Cell 44(2):283-92, y Kozak, (1987) Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). En formas de realización particulares, los vectores que se contemplan en la divulgación, comprenden polinucleótidos que tienen una secuencia de Kozak consenso y que codifican un polipéptido deseado.

En determinadas formas de realización, los vectores comprenden un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, higromicina, metotrexato, Zeocin, blasticidina o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes fundamentales no disponibles en los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para bacilos. Puede utilizarse multitud de sistemas de selección para recuperar las estirpes celulares transformadas. Estos incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., (1977) Cell 11:223-232) y de la adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., (1990) Cell 22: 817-823) que pueden emplearse en células tk-o aprt-, respectivamente.

En diversas formas de realización, los vectores de la divulgación se utilizan para aumentar, establecer y/o mantener la expresión de uno o más polipéptidos, por ejemplo, globinas. Los términos “polipéptido” y “proteína” se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos del mismo. Por lo tanto, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son aminoácidos de origen no natural sintéticos, tal como un análogo químico de un correspondiente aminoácido de origen natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los ejemplos ilustrativos de polipéptidos globina adecuados para utilizarse en las composiciones y los métodos de formas de realización particulares de la invención incluyen, por ejemplo, las SEQ ID NO: 2-4, 6-9, 11-13 y 15. Véase también, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 6.051.402 y nº 7.901.671.

Los ejemplos ilustrativos de polipéptidos ABCD1 adecuados para utilizarse en los métodos de formas de realización particulares de la invención incluyen, por ejemplo, la SEQ ID NO: 18. Véanse también, por ejemplo, las patentes estadounidenses nº 5.869.039 y nº 6.013.769.

Las formas de realización particulares de la invención también incluyen “variantes” polipeptídicas. La mención del término “variante” polipeptídica se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de referencia por la adición, deleción, truncamientos y/o sustitución de al menos un residuo de aminoácido, y que conservan una actividad biológica. En determinadas formas de realización, una variante polipeptídica se distingue de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, que pueden ser conservadoras o no conservadoras, tal como se conoce en la técnica.

En determinadas formas de realización, una variante polipeptídica incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente una identidad o similitud de secuencia del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,

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(véase Fei, R., et al., patente estadounidense nº 5.635.387; McGlave, et al., patente estadounidense nº 5.460.964; Simmons, P., et al., patente estadounidense nº 5.677.136; Tsukamoto, et al., patente estadounidense nº 5.750.397; Schwartz, et al., patente estadounidense nº 5.759.793; DiGuisto, et al., patente estadounidense nº 5.681.599; Tsukamoto, et al., patente estadounidense nº 5.716.827). Cuando se trasplantan a seres humanos o animales irradiados letalmente, las células madre y progenitoras hematopoyéticas pueden repoblar la reserva de células hematopoyéticas eritroides, neutrófilos-macrófagos, megacariocitos y linfoides.

Con frecuencia se necesita la producción de partículas virales a gran escala para conseguir un título viral razonable. Las partículas virales se producen transfectando un vector de transferencia en una estirpe celular de empaquetamiento que comprende genes virales estructurales y/o accesorios, por ejemplo, los genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef, u otros genes retrovirales.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “vector de empaquetamiento” se refiere a un vector de expresión o vector viral que carece de una señal de empaquetamiento y comprende un polinucleótido que codifica uno, dos, tres, cuatro o más genes virales estructurales y/o accesorios. Por lo general, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una célula de empaquetamiento, y se introducen en la célula mediante transfección, transducción o infección. Los métodos de transfección, transducción o infección son bien conocidos por los expertos en la materia. Un vector de transferencia retroviral/lentiviral de la presente divulgación puede introducirse en una estirpe celular de empaquetamiento, mediante transfección, transducción o infección, para generar una célula o estirpe celular productora. Los vectores de empaquetamiento de la presente divulgación pueden introducirse en células o estirpes celulares humanas mediante métodos convencionales incluidos, por ejemplo, la transfección con fosfato cálcico, la lipofección o la electroporación. En algunas formas de realización, los vectores de empaquetamiento se introducen en las células junto con un marcador seleccionable dominante, tal como neomicina, higromicina, puromicina, blastocidina, zeocina, timidina quinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido de selección en presencia del fármaco apropiado y aislamiento de clones. Un gen marcador seleccionable puede estar unido físicamente a genes que codifican el vector de empaquetamiento, por ejemplo, IRES o péptidos virales de autoescisión.

Las proteínas de la envoltura viral (env) determinan la diversidad de células hospedadoras que en última instancia pueden ser infectadas y transformadas por los retrovirus recombinantes generados a partir de las estirpes celulares. En el caso de los lentivirus, tales como VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIV, las proteínas env incluyen gp41 y gp120. Preferentemente, las proteínas env virales expresadas por las células de empaquetamiento de la divulgación están codificadas en un vector distinto a partir de los genes virales gag y pol, como se ha descrito anteriormente.

Los ejemplos ilustrativos de genes env de origen retroviral que pueden emplearse en la divulgación incluyen, pero no se limitan a: envolturas de MLV, envoltura de 10A1, envolturas de BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, del Ébola, Sendai, FPV (virus de la peste aviar) y del virus de la gripe. Asimismo, pueden utilizarse genes que codifican envolturas de virus de ARN (por ejemplo, familias de virus de ARN de Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae), así como de virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos incluyen, FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, de la rabia, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 y EIAV.

En otras formas de realización, las proteínas de la envoltura para seudotipificar un virus de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes virus: virus de la gripe A tal como H1N1, H1N2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), gripe B, gripe C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, rotavirus, cualquier virus del grupo de virus Norwalk, adenovirus entéricos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela del mono, Mononegavirales, Lyssavirus tal como el virus de la rabia, virus del murciélago de Lagos, virus Mokola, virus Duvenhage, virus del murciélago europeo 1 y 2 y virus del murciélago australiano, Ephemerovirus, Vesiculovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), Herpesvirus tales como el virus del herpes simple tipos 1 y 2, varicela zóster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (EBV), herpesvirus humanos (HHV), herpesvirus humanos tipo 6 y 8, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, gammaherpesvirus murino, Arenavirus tales como el virus de la fiebre hemorrágica argentina, virus de la fiebre hemorrágica boliviana, virus de la fiebre hemorrágica asociada a Sabia, virus de la fiebre hemorrágica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus Machupo, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Bunyaviridiae tal como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, Hantavirus, virus responsable del síndrome renal con fiebre hemorrágica, virus de la fiebre del valle del Rift, Filoviridiae (filovirus) incluidos el virus de la fiebre hemorrágica del Ébola y de la fiebre hemorrágica de Marburg, Flaviviridae incluido el virus de la enfermedad de Kyasanur Forest, virus de la fiebre hemorrágica de Omsk, virus responsable de la encefalitis transmitida por garrapatas y Paramyxoviridae tales como el virus Hendra y el virus Nipah, Variola major y Variola minor (viruela), alfavirus tales como el virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis equina occidental, coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), virus del Nilo Occidental, cualquier virus responsable de la encefalitis.

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Los artículos “un”, “una”, “el” y “la” se utilizan en el presente documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, al menos a uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” se refiere a un elemento o a más de un elemento.

Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) se refiere a una de las alternativas, a ambas, o a cualquier combinación de las mismas. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “incluye” y “comprende” se utilizan como sinónimos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta en un 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una forma de realización, el término “aproximadamente” se refiere un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% o ± 1% alrededor de una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, se entenderá que a menos que el contexto requiera otra cosa, los términos “comprenden”, “comprende” y la expresión “que comprende” implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicados, pero no la exclusión de ninguna otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. La expresión “que consiste en” se refiere a que incluye, y se limita a, todo lo que siga a la expresión “que consiste en”. Por lo tanto, la expresión “que consiste en” indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no puede haber otros elementos presentes. La expresión “que consiste esencialmente en” se refiere a que incluye cualquier elemento enumerado después de la expresión, y que se limita a otros elementos que no interfieren con ni contribuyen a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Por lo tanto, la expresión “que consiste esencialmente en” indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que hay otros elementos opcionales y pueden estar o no estar presentes dependiendo de si influyen no en la actividad o acción de los elementos enumerados.

La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a “una forma de realización” se refiere a que una función, estructura o característica concreta descrita en relación con la forma de realización está incluida en al menos una forma de realización de la presente invención. Por lo tanto, no todas las apariciones de la expresión “en una forma de realización” en diversos lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva se refieren necesariamente a la misma forma de realización. Además, las funciones, estructuras o características concretas pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más formas de realización.

En la siguiente descripción, se presentan determinados detalles específicos con el fin de proporcionar una profunda comprensión de las diversas formas de realización de la invención. Sin embargo, un experto en la materia entenderá que la invención puede ponerse en práctica sin estos detalles. Además, debe entenderse que los vectores individuales, o grupos de vectores, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en el presente documento, se divulgan mediante la presente solicitud como si cada vector o grupo de vectores se presentase individualmente. Por lo tanto, la selección de estructuras de vector concretas o sustituyentes concretos pertenece al alcance de la presente divulgación.

C. Vectores virales

Se han ensayado vectores retrovirales y lentivirales y se ha descubierto que son vehículos de introducción adecuados para la introducción estable de genes de interés, por ejemplo, que codifican polipéptidos terapéuticos, en el genoma de una gran variedad de células diana. La presente divulgación contempla, en parte, la mejora de la introducción de vectores de terapia génica a una población de células que se administra a un sujeto para proporcionar la terapia génica.

La presente divulgación proporciona adicionalmente vectores de transferencia, que pueden utilizarse para poner en práctica los métodos de la presente invención. Aunque el experto entenderá que tales vectores de transferencia pueden producirse utilizando diversos vectores virales diferentes, en formas de realización particulares, el vector de transferencia es un vector retroviral o un vector lentiviral, en parte debido a que los vectores lentivirales son capaces de proporcionar una introducción, integración y expresión a largo plazo eficaces de los transgenes en células que no están en división, tanto in vitro como in vivo. Se conocen en la técnica diversos vectores lentivirales, véase Naldini et al., (1996a, 1996b y 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, patentes estadounidenses nº 6.013.516 y nº 5.994.136, cualquiera de los cuales puede adaptarse para producir un vector de transferencia de la presente divulgación.

En general, estos vectores están basados en plásmidos o basados en virus, y se configuran para llevar las secuencias esenciales para transferir un ácido nucleico que codifica un polipéptido terapéutico a una célula hospedadora.

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En una forma de realización particular, el vector de transferencia útil en los métodos de la invención comprende una LTR retroviral izquierda (5’); una región central del tracto de polipurina/”ADN flap” (cPPT/FLAP); un elemento de exportación retroviral; un promotor activo en una célula de la microglía, unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido casete de unión a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); y una LTR retroviral derecha (3’).

En una determinada forma de realización, la divulgación proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR de VIH-1 izquierda (5’); una señal de empaquetamiento Psi (Ψ); una cPPT/FLAP; un RRE; un promotor de MND, unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido ABCD1 humano; una LTR de VIH-1 autoinactivante (SIN) derecha (3’); y una secuencia de poliadenilación de β-globina de conejo.

El experto entenderá que pueden diseñarse muchas otras formas de realización diferentes a partir de las formas de realización actuales de la invención, de manera que el transgén terapéutico o gen de interés se exprese en un tipo celular o linaje celular diana que no sea el linaje hematopoyético, por ejemplo, el linaje neuronal.

D. Métodos de transducción

La presente invención contempla, en parte, métodos que aumentan significativamente la eficiencia de transducción de las células diana. Sin desear limitarse a ninguna teoría concreta, se contempla que los métodos de la presente invención pueden utilizarse para transducir un número significativamente mayor de células con un número significativamente menor de virus, minimizando así el riesgo de modificación genómica y/o activación por inserción de protooncogenes del genoma de la célula terapéutica. Minimizar el riesgo de activación por inserción de protooncogenes y otras modificaciones genómicas en la célula terapéutica es una cuestión importante en la elaboración de un protocolo de terapia génica adecuado, dado que minimiza la posibilidad de que células transducidas que comprendan características cancerosas experimenten expansión clonal in vivo y den lugar a cánceres, tumores u otras enfermedades que implican la proliferación celular anormal. Por otra parte, se ha observado en la técnica que la transducción con grandes cantidades de virus puede ser generalmente citotóxica para la célula transducida. Por lo tanto, los métodos de la presente invención mejorar adicionalmente la capacidad de supervivencia de las células transducidas. Por consiguiente, la presente invención proporciona una terapia génica más segura y más eficaz.

La introducción de un(os) gen(es) u otras secuencias polinucleotídicas utilizando un vector retroviral o lentiviral mediante infección viral en lugar de mediante transfección se denomina “transducción”. En una forma de realización, los vectores retrovirales se transducen en una célula mediante la infección y la integración del provirus. En determinadas formas de realización, una célula, por ejemplo, una célula diana, está “transducida” si comprende un gen u otra secuencia polinucleotídica introducida en la célula mediante infección utilizando un vector viral o retroviral. En formas de realización particulares, una célula transducida comprende uno o más genes u otras secuencias polinucleotídicas introducidas mediante un vector retroviral o lentiviral en su genoma celular.

En formas de realización particulares, las células hospedadoras o células diana transducidas con un vector viral útiles en los métodos de la invención expresan un polipéptido terapéutico y se administran a un sujeto para tratar y/o prevenir una enfermedad, trastorno o afección.

La producción de partículas virales infecciosas y soluciones madre de virus puede llevarse a cabo mediante técnicas convencionales. Los métodos para preparar soluciones madre de virus son conocidos en la técnica y se ilustran, por ejemplo, en Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y N.R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113.

En formas de realización particulares, pueden generarse partículas virales basadas en el VIH tipo 1 (VIH-1) mediante coexpresión de los elementos de empaquetamiento del virión y el vector de transferencia en una célula productora. Estas células puede transfectarse de manera transitoria con varios plásmidos. Por lo general, se emplean de tres a cuatro plásmidos, pero el número puede ser mayor dependiendo del grado en que los componentes lentivirales se rompen en unidades distintas. Por ejemplo, un plásmido puede codificar los componentes básicos y enzimáticos del virión, derivados del VIH-1. Este plásmido se denomina plásmido de empaquetamiento. Otro plásmido codifica por lo general la(s) proteína(s) de la envoltura, más comúnmente la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) debido a su alta estabilidad y amplio tropismo. Este plásmido puede denominarse plásmido de expresión de la envoltura. Otro plásmido codifica el genoma a transferir a la célula diana, es decir, el propio vector, y se denomina vector de transferencia. Los plásmidos de empaquetamiento pueden introducirse en estirpes celulares humanas mediante técnicas conocidas, incluidas la transfección con fosfato cálcico, la lipofección o la electroporación. Pueden generarse virus recombinantes con títulos de varios millones de unidades de transducción por mililitro (TU/ml) mediante esta técnica y variantes de la misma. Después de la ultracentrifugación pueden obtenerse reservas concentradas de aproximadamente 108 TU/ml, 109 TU/ml, 1010 TU/ml, 1011 TU/ml, 1012 TU/ml, o aproximadamente 1013 TU/ml.

Pueden recogerse partículas virales infecciosas a partir de las células de empaquetamiento mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas infecciosas pueden recogerse mediante lisis celular, o la

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En una forma de realización, el compuesto que estimula la vía de las prostaglandinas está seleccionado de los grupos que consisten en: PGA2; PGB2; PGD2; PGE1 (Alprostadil (Caverject™; Edex™; Muse™; Prostin VR™); PGE2; PGF2; PGI2 (Epoprostenol (Flolan™; Prostacyclin™)); PGH2; PGJ2; y precursores, metabolitos, derivados y análogos de los mismos.

Los compuestos ilustrativos adicionales que estimulan la vía de las prostaglandinas incluyen, pero no se limitan a, 15d-PGJ2; delta12-PGJ2; ácido 2-hidroxiheptadecatrienoico (HHT); tromboxano (TXA2 y TXB2); análogos de PGI2, por ejemplo, iloprost (Ventavis™) y treprostinil (Remodulin™); análogos de PGF2, por ejemplo, travoprost (Travatan™), carboprost trometamina (Hemabate™), tafluprost (ZioptanI™), latanoprost (Xalatan™), bimatoprost (Lumigan™; Latisse™), unoprostona isopropilo (Rescula™), cloprostenol (Ciosin™, Cyclix™, Estrumate™, Lutaprost™, Onsett™, Planate™), Oestrophan y Superphan; análogos de PGE1, por ejemplo, misoprostol (Cytotec™) y butaprost; y alcohol-A de Corey [[3aα,4a,5β,6aα]-(-)-[hexahidro-4-(hidroximetil)-2-oxo-2Hciclopenta/b/furan-5-il][1,1’-bifenil]-4-carboxilato]; alcohol-B de Corey [2H-ciclopenta[b]furan-2-on,5(benzoiloxi)hexahidro-4-(hidroximetil)[3aR-(3aα,4α,5β,6aα)]]; y diol de Corey ((3aR,4S,5R,6aS)-hexahidro-5-hidroxi4-(hidroximetil)-2H-ciclopenta[b]furan-2-ona).

En una forma de realización, el compuesto es un ligando del receptor EP de prostaglandinas, incluido pero no limitado a, prostaglandina E2 (PGE2), así como “análogos” o “derivados” del mismo. “Prostaglandinas” se refiere en general a moléculas hormonoides que se derivan de ácidos grasos que contienen 20 átomos de carbono, incluido un anillo de 5 carbonos, tal como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

Los ejemplos ilustrativos de “análogos” o “derivados” de PGE2 incluyen, pero no se limitan a, 16,16-dimetil PGE2, éster p-(p-acetamidobenzamido)fenílico de 16,16-dimetil PGE2, 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9metilen-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metilen PGE2, 9-ceto fluprostenol, 5-trans PGE2, 17-fenil-omega-trinor PGE2, serinolamida de PGE2, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2, 15(S)-15-metil PGE2, 15(R)-15-metil PGE2, 8-iso-15-ceto PGE2, éster isopropílico de 8-iso PGE2, 20-hidroxi PGE2, 11-desoxi PGEi, nocloprost, sulprostona, butaprost, 15-ceto PGE2, y 19(R)-hidroxi PGE2.

También se incluyen análogos o derivados de prostaglandinas con una estructura similar a PGE2 que están sustituidos con halógeno en la posición 9 (véase, por ejemplo, el documento WO 2001/12596), así como derivados de prostaglandinas 2-descarboxi-2-fosfínicos, tales como los descritos en la publicación estadounidense nº 2006/0247214).

En algunas formas de realización, el compuesto es un ligando no basado en PGE2. En determinadas formas de realización, el ligando no basado en PGE2 está seleccionado del grupo que consiste en un agonista de EP1, un agonista de EP2, un agonista de EP3 y un agonista de EP4.

En formas de realización particulares, el receptor EP de prostaglandinas está seleccionado de entre EP1, EP2, EP3 y EP4.

Los ejemplos ilustrativos de agonistas de EP1 no basados en PGE2 incluyen, pero no se limitan a, ONO-DI004 y ONO-8713. Los ejemplos ilustrativos de agonistas de EP2 no basados en PGE2 incluyen, pero no se limitan a, CAY10399, ONO_8815Ly, ONO-AE1-259 y CP-533536. Los ejemplos adicionales de agonistas de EP2 no basados en PGE2 incluyen los carbazoles y fluorenos divulgados en el documento WO 2007/071456. Los ejemplos ilustrativos de agonistas de EP3 no basados en PGE2 incluyen, pero no se limitan a, AE5-599, MB28767, GR 63799X, ONO-NT012 y ONO-AE-248. Los ejemplos ilustrativos de agonistas de EP4 no basados en PGE2 incluyen, pero no se limitan a, ONO-4819, APS-999 Na, AH23848 y ONO-AE 1-329. Pueden encontrarse ejemplos adicionales de agonistas de EP4 no basados en PGE2 en el documento WO/2000/038663, la patente estadounidense nº 6.747.037 y la patente estadounidense nº 6.610.719.

En una forma de realización, el compuesto que estimula la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas es un agonista de Wnt. Los ejemplos ilustrativos de agonistas de Wnt incluyen, pero no se limitan a inhibidores de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) y polipéptidos Wnt. Los ejemplos ilustrativos de polipéptidos Wnt adecuados para utilizarse como compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas incluyen, pero no se limitan a, Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt7c, Wnt8, Wnt8a, Wnt8b, Wnt8c, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt14, Wnt15 o Wnt15 y fragmentos biológicamente activos de los mismos.

Los inhibidores de GSK3 adecuados para utilizarse como compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas se unen a y disminuyen la actividad de GSK3α o GSK3β. Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de GSK3 incluyen, pero no se limitan a, BIO (6-bromoindirubin-3’-oxime), LiCl u otros inhibidores de GSK-3, como se ejemplifica en las patentes estadounidenses nº 6.057.117 y nº 6.608.063; y las solicitudes estadounidenses 2004/0092535 y 2004/0209878; los inhibidores de GSK-3 selectivos ATP-competitivos CHIR-911 y CHlR-837 (también denominados CT-99021 y CT-98023, respectivamente). Chiron Corporation (Emeryville, CA).

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En otra forma de realización, el compuesto que estimula la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas aumenta la señalización a través de la vía del segundo mensajero AMPc/PI3K/AKT y está seleccionado del grupo que consiste en dibutiril AMPc (DBcAMP), éster de forbol, forskolina, sclareline, 8-bromo-AMPc, toxina del cólera (CTx), aminofilina, 2,4-dinitrofenol (DNP), norepinefrina, epinefrina, isoproterenol, isobutilmetilxantina (IBMX), cafeína, teofilina (dimetilxantina), dopamina, rolipram, iloprost, el polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP) y el polipéptido intestinal vasoactivo (VIP), y derivados de estos agentes.

En otra forma de realización, el compuesto que estimula la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas aumenta la señalización a través de la vía del segundo mensajero Ca2+ y está seleccionado del grupo que consiste en bapta-AM, fendilina, nicardipina y derivados de estos compuestos.

En otra forma de realización, el compuesto que estimula la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas aumenta la señalización a través de la vía de señalización NO/angiotensina y está seleccionado del grupo que consiste en L-Arg, nitroprusiato sódico, vanadato sódico, bradicinina, y derivados de los mismos.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un método para mejorar la eficiencia de transducción que comprende cultivar una población de células con un retrovirus y uno o más compuestos que aumentan la señalización de receptores EP de prostaglandinas seleccionados del grupo que consiste en: una prostaglandina, PGE2; PGD2; PGI2; ácido linoleico; 13(s)-HODE; LY171883; ácido de Mead; ácido eicosatrienoico; ácido epoxieicosatrienoico; ONO-259; Cay1039; un agonista del receptor de PGE2; 16,16-dimetil PGE2; 19(R)hidroxi PGE2; éster p-(p-acetamidobenzamido)fenílico de 16,16-dimetil PGE2; 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2; 9desoxi-9-metilen-16,16-dimetil PGE2; 9-desoxi-9-metilen PGE2; butaprost; sulprostona; serinolamida de PGE2; éster metílico de PGE2; 16-fenil tetranor PGE2; 15(S)-15-metil PGE2; 15(R)-15-metil PGE2; BIO; 8-bromo-AMPc; forskolina; bapta-AM; fendilina; nicardipina; nifedipina; pimozida; estrofantidina; lanatósido; L-Arg; nitroprusiato sódico; vanadato sódico; bradicinina; mebeverina; flurandrenolida; atenolol; pindolol; gaboxadol; ácido quinurénico; hidralazina; tiabendazol; bicuculina; vesamicol; peruvósido; imipramina; clorpropamida; 1,5-pentametilentetrazol; 4aminopiridina; diazóxido; benfotiamina; ácido 12-metoxidodecenoico; N-formil-Met-Leu-Phe; galamina; IAA 94; y clorotrianiseno.

En una forma de realización particular, la presente invención proporciona un método para mejorar la eficiencia de transducción que comprende cultivar una población de células con un retrovirus y uno o más compuestos que son ligandos de un receptor EP de prostaglandinas seleccionado del grupo que consiste en: 16,16dimetil PGE2, éster p-(p-acetamidobenzamido)fenílico de 16,16-dimetil PGE2, 11-desoxi-16,16-dimetil PGE2, 9desoxi-9-metilen-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metilen PGE2, 9-ceto fluprostenol, 5-trans PGE2, 17-fenil-omegatrinor PGE2, serinolamida de PGE2, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2, 15(S)-15-metil PGE2, 15(R)-15metil PGE2, 8-iso-15-ceto PGE2, éster isopropílico de 8-iso PGE2, 20-hidroxi PGE2, 11-desoxi PGEi, nocloprost, sulprostona, butaprost, 15-ceto PGE2 y 19(R)-hidroxi PGE2.

La presente invención también contempla que la eficiencia de transducción de las células puede aumentarse cultivado las células en presencia de un retrovirus, un compuesto que estimula una vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas, por ejemplo, PGE2, y uno o más inhibidores de la histona desacetilasa (HDAC).

Los ejemplos ilustrativos de inhibidores de HDAC adecuados para utilizarse en las composiciones y los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: inhibidores de HDAC incluidos, pero no limitados a, TSA (tricostatina A) (véase, por ejemplo, Adcock, (2007) British Journal of Pharmacology 150:829-831), VPA (ácido valproico) (véase, por ejemplo, Munster, et al., (2007) Journal of Clinical Oncology 25: 18S: 1065), butirato sódico (NaBu) (véase, por ejemplo, Han, et al., (2007) Immunology Letters 108: 143-150), SAHA (ácido hidroxámico suberoilanilida o vorinostat) (véase, por ejemplo, Kelly, et al., (2005) Nature Clinical Practice Oncology 2: 150 -157), fenilbutirato sódico (véase, por ejemplo, Gore, et al., (2006) Cancer Research 66:6361-6369), depsipéptido (FR901228, FK228) (véase, por ejemplo, Zhu, et al., (2003) Current Medicinal Chemistry 3(3): 187-199), trapoxina (TPX) (véase, por ejemplo, Furumai, et al., (2001) PNAS 98(1): 87-92), péptido que contiene ácido hidroxámico cíclico 1 (CHAP1) (véase, Furumai, supra), MS-275 (véase, por ejemplo, Carninci, et al., WO2008/126932), LBH589 (véase, por ejemplo, Goh, et al., WO2008/108741) y PXD-101 (véase, Goh, supra).

La presente invención contempla que las células pueden cultivarse en presencia de un retrovirus, pueden exponerse a (ponerse en contacto con) un compuesto que estimula la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o un inhibidor de HDAC durante un tiempo de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 72 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 72 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 8 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas, o cualquier período de tiempo intermedio.

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En una forma de realización, las células cultivadas con un retrovirus se exponen a (se ponen en contacto con) un compuesto que estimula la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o un inhibidor de HDAC durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, o aproximadamente 72 horas, o cualquier tiempo de duración intermedio.

La presente invención contempla que las células pueden cultivarse con uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC antes del cultivo con un retrovirus, durante el cultivo con un retrovirus, o después del cultivo con un retrovirus, o cualquier combinación de los mismos, durante cualquiera de los períodos de tiempo anteriores divulgados en el presente documento.

La presente invención contempla adicionalmente que las células pueden cultivarse con uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y un retrovirus antes del cultivo con uno o más inhibidores de HDAC, durante el cultivo con uno o más inhibidores de HDAC, o después del cultivo con uno o más inhibidores de HDAC, o cualquier combinación de los mismos, durante cualquiera de los períodos de tiempo anteriores divulgados en el presente documento.

La presente invención también contempla que las células pueden cultivarse con un retrovirus antes del cultivo con uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC, durante el cultivo con uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC, o después del cultivo con uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC, o cualquier combinación de los mismos, durante cualquiera de los períodos de tiempo anteriores divulgados en el presente documento.

Además, un experto en la materia entenderá que los métodos de la presente invención para aumentar la transducción incluyen cultivar las células con retrovirus, uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC, durante las primeras 6 horas de la transducción, las primeras 12 horas de la transducción, las primeras 24 horas de la transducción, las primeras 48 horas de la transducción, o las primeras 72 horas de la transducción, o cualquier período de transducción intermedio.

Además, la presente invención contempla que las células pueden transducirse 1, 2, 3 o más veces en presencia de un retrovirus y uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC. En otra forma de realización, la presente invención contempla que las células pueden transducirse 1, 2, 3 o más veces en presencia de un retrovirus y exponerse a (ponerse en contacto con) uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC sólo una o dos veces.

En una forma de realización particular, la invención contempla que las células pueden cultivarse en el retrovirus, uno o más compuestos que estimulan la vía de señalización de los receptores EP de prostaglandinas y/o uno o más inhibidores de HDAC, en la que las células se exponen a o se ponen en contacto con ellos durante períodos de tiempo iguales o diferentes, como se divulga en otra parte del presente documento.

La presente invención también contempla que los métodos de la invención pueden aumentar la transducción de prácticamente cualquier tipo de célula hasta al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 65%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 75%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 91%, al menos aproximadamente un 92%, al menos aproximadamente un 93%, al menos aproximadamente un 94%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 96%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 98%, al menos aproximadamente un 99% o al menos aproximadamente un 100%.

En formas de realización particulares, el aumento de la eficiencia de transducción representa un enriquecimiento de las células transducidas al menos 2 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 25 veces, al menos 50 veces, o al menos 100 veces, o más veces, mayor en comparación con las células transducidas con el vector en solitario.

Antes de, durante y/o después de la transducción, las células pueden cultivarse en medios adecuados para el mantenimiento, el desarrollo o la proliferación de las células. Las condiciones y medios de cultivo adecuados son

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