ES2632747T3

ES2632747T3 - Cepas Shigella hipervesiculante

Info

Publication number: ES2632747T3
Application number: ES10768559.6T
Authority: ES
Inventors: Christiane Gerke; Francesco Berlanda Scorza; Allan Saul; Luana Maggiore
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2030-09-28
Also published as: KR101786025B1; CN102906245A; DK2483389T3; JP2013505716A; CY1118970T1; HRP20170845T1; JP2019068864A; KR20120106729A; PL2483389T3; EP3279313A3; AU2010299577A1; PH12012500629A1; EP2483389A2; CA2775642C; PL3279313T3; PT3279313T; DK3279313T3; PT2483389T; SI2483389T1; AU2010299577B2

Abstract

Una bacteria Shigella hipervesiculante que expresa no más de 4 proteínas entre TolA, TolB, TolQ, TolR y Pal y que no expresa un lipopolisacárido de Shigella nativo.

Description

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Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son normalmente hidroxifosfatos de aluminio, y también suelen contener una pequeña cantidad de sulfato (es decir, hidroxifosfato sulfato de aluminio). Se pueden obtener por precipitación y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de hidroxilo por fosfato en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una relación molar PO4/Al comprendida entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos se pueden distinguir de ALPO4 estrictamente por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda del espectro IR a 3164 cm-1 (p.ej. a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (capítulo 9 de ref. 19).

La relación molar PO4/Al3+ del adyuvante de fosfato de aluminio estará comprendida generalmente entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente 0,95 ± 0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, en particular para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante normal es un hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar PO4/Al comprendida entre 0,84 y 0,92, incluyendo 0,6 mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio estará generalmente en partículas (p.ej. morfología de tipo placa tal como se observa en las micrografías de transmisión electrónica). Los diámetros normales de las partículas se encuentran dentro del intervalo de 0,5-20 µm (p.ej. aproximadamente 5-10 µm) tras la adsorción del antígeno. Se han notificado capacidades de adsorción comprendidas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) de fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución de hidroxilo por fosfato, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos utilizados para preparar la sal por precipitación. PZC también se altera cambiando la concentración de los iones fosfato libres en la solución (más fosfato = más PZC ácido) o añadiendo un tampón como tampón histidina (hace más básico el PZC). Los fosfatos de aluminio tienen generalmente un PZC comprendido entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, p.ej. aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio utilizadas para preparar las composiciones pueden contener un tampón (p.ej., un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y desprovistas de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuoso libres, p.ej., presentes en una concentración comprendida entre 1,0 y 20 mM , preferentemente, entre 5 y 15 mM, y más preferentemente aproximadamente 10 mM . Las suspensiones pueden comprender también cloruro sódico.

Un componente adyuvante incluye una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En tal caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, p.ej., una relación en peso de al menos 2:1 p.ej. ≥ 5:1, ≥ 6:1, ≥ 7:1, ≥ 8:1, ≥ 9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para su administración a un paciente es preferentemente menos de 10 mg/ml p.ej. ≤5 mg/ml, ≤4 mg/ml, ≤3 mg/ml, ≤2 mg/ml, ≤1 mg/ml, etc. Un intervalo de preferencia es el comprendido entre 0,3 y 1 mg/ml. Preferentemente, un máximo de <0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones oleosas

Las composiciones en emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen emulsiones escualenoagua, como MF59 [Capítulo 10 de ref. 19; véase también ref. 16] (5% escualeno, 0,5% Tween 80, y 0,5% Span 85, formulado en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador). También se pueden utilizar adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA).

Se conocen diversas emulsiones aceite en agua adecuadas, que incluyen normalmente al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el (los) aceite(s) y el (los) tensioactivo(s) biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión tienen generalmente un tamaño inferior a 5 µm de diámetro y ventajosamente, la emulsión comprende gotitas de aceite con un diámetro submicrométrico, consiguiéndose dichos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Son preferentes las gotitas que tienen un tamaño inferior a 220 nm ya que se pueden someter a esterilización por filtración.

La invención se puede utilizar con aceites, como puedan ser de origen animal (por ejemplo pescado) o de origen vegetal. Las fuentes para los aceites de origen vegetal incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva son los aceites de nuez más comunes. Se puede utilizar aceite de yoyoba, p.ej. obtenido del grano de yoyoba. Entre los aceites de semilla se incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los aceites de grano, el de maíz es el más asequible, si bien se puede utilizar igualmente aceite de otros granos de cereal como trigo, avena, centeno, arroz, cereal teff, triticalo y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2propanodilo, aunque no se dan de forma natural en aceites de semilla, se pueden preparar por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados a partir de los aceites de nuez y de semilla. Las grasas y los aceites de la leche de mamífero se pueden metabolizar y por tanto se pueden utilizar. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son conocidos dentro de la especialidad. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón y aceite de ballena, como por ejemplo espermaceti, son ejemplos de varios aceites de pescado que se pueden utilizar en este punto. Existe una serie de aceites de cadena ramificada que se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5-carbonos y

que se denominan generalmente terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide insaturado ramificado conocido como escualeno 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexeno. Otros aceites preferentes son tocoferoles (véase más adelante). Las emulsiones aceite en agua que comprenden escualeno son particularmente preferentes. Se pueden emplear mezclas de aceites.

5 Los tensioactivos se pueden clasificar según su “HLB” (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos de preferencia tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. Los tensioactivos que se pueden utilizar incluyen, sin limitarse solo a ellos: tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitano (denominados comúnmente Tween), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/o óxido de butileno (BO), distribuidos con el nombre comercial DOWFAX™, como

10 por ejemplo copolímeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) que se repiten, siendo y particular interés octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes láurico, cetílico, estearílico y oleico (conocidos como tensioactivos Brij), como por ejemplo éter mono-láurico de trietilen glicol (Brij 30); y ésteres de sorbitano (conocidos comúnmente como

15 SPAN), como trioleato de sorbitano (Span 85) y monolaurato de sorbitano. Los tensioactivos preferentes para su inclusión en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilen sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina y Triton X-100. Tal como se ha mencionado anteriormente, los detergentes como Tween 80 pueden contribuir a la estabilidad térmica, observada en los ejemplos a continuación.

Se pueden utilizar mezclas de tensioactivos, p.ej., mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una

20 combinación de éster de polioxietilen sorbitano, como por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitano (Tween 80) y un octoxinol como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 plus, un éster de polioxietilen sorbitano y/o un octoxinol.

Las cantidades (% en peso) de tensioactivos preferentes son: ésteres de polioxietilen sorbitano (como por ejemplo Tween 80) de 0,01 a 1%, in particular aproximadamente 0,1 %; octil-o nonilfenoxi polioxietanoles (como Triton X

25 100, u otros detergentes en la serie Triton) de 0,001 a 0,1 %, en particular de 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (como laureth 9) de 0,1 a 20 %, preferentemente de 0,1 a 10 % y en particular de 0,1 a 1% o aproximadamente 0,5%.

Los adyuvantes de emulsión aceite en agua específicos incluyen, pero sin limitarse a ellos:

• una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composición de la emulsión en volumen

30 puede ser aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5 % de Span 85. En peso, estas relaciones pasan a ser 4,3% de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como ’MF59’ [16-18], tal como se describe con más detalle en el capítulo 10 de la ref. 19 y el capítulo 12 de la ref. 20. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones citrato, p.ej., tampón citrato sódico 10 mM.

35 • Una emulsión que comprende escualeno, un α-tocoferol, y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0,3 a 3 % de Tween 80, y la relación en peso de escualeno: tocoferol es preferentemente ≤1 (p.ej. 0,90), ya que proporciona una emulsión más estable. El escualeno y Tween 80 pueden estar presentes en una relación en volumen de aproximadamente 5:2, o en una relación en peso de of aproximadamente 11:5. Una de dichas emulsiones se puede fabricar disolviendo Tween 80 en PBS

40 para dar una solución al 2 %, mezclando después 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-αtocoferol y 5 ml de escualeno), microfluidizando después la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotas de aceite submicrométricas p.ej. con un diámetro medio comprendido entre 100 y 250 nm, preferentemente aproximadamente 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (p.ej. Triton X-100). La emulsión puede incluir 45 también un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (p.ej. polisorbato 80), un detergente Triton (p.ej. Triton X-100) y un tocoferol (p.ej. succinato de α-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (p.ej. 750 mg/ml de polisorbato 80, 110 µg/ml de Triton X-100 y 100 µg/ml de succinato de α-tocoferol), y estas concentraciones deberán incluir cualquier contribución de estos

50 componentes desde antígenos. La emulsión puede incluir también escualeno. La emulsión puede incluir también 3d-MPL (véase más adelante). La fase acuosa puede contener tampón fosfato.

• Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("Pluronic™ L121"). Se puede formular la emulsión en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de entrega útil para dipéptidos de muramilo y se ha utilizado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" [21] (0,05-1% Thr-MDP, 5% de

55 escualeno, 2.5% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). También se puede utilizar sin Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" [22] (5% de escualeno, 1,25% de Pluronic L121 y 0,2% de polisorbato 80). Es preferente la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrófilo de éter polioxietilen alquílico (p.ej. éter polioxietilen (12) cetoestearílico) y un tensioactivo no iónico hidrófobo (p.ej. éster de sorbitano, o éster de manida, como monooleato de sorbitano o Span 80’). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos 90% de gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño de menos de 200 nm

5 [23]. La emulsión puede incluir también uno o más entre: alditol; un agente crioprotector (p.ej. un azúcar como dodecilmaltosida y/o sacarosa) y/o un alquilpoliglicosida. Dichas emulsiones se pueden liofilizar.

• Una emulsión que tiene de 0,5-50% de un aceite, 0,1-10% de un fosfolípido, y 0,05-5% de un tensioactivo no iónico. Tal como se describe en la referencia 24, los componentes de fosfolípido preferentes son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, sfingomielina y

10 cardiolipina. Son ventajosos tamaños submicrométricos de la gota.

• Una emulsión aceite en agua submicrométrica de un aceite no metabolizable (como por ejemplo aceite mineral ligero) y al menos un agente tensioactivo (como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, como QuilA saponina, colesterol, un conjugado saponina-lipófilo (como GPI-0100, descrito en la referencia 25, producido por adición de una amina alifática a desacilsaponina a través del grupo carboxilo de ácido

15 glucurónico), bromuro de dimetildioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipófilo no iónico, un tensioactivo hidrófilo no iónico (p.ej. un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque polioxieitleno-polioxipropileno) [26].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrófilo no iónico y un tensioactivo 20 lipófilo no iónico (p.ej. un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno) [26].

• Una emulsión en la que saponina (p.ej. QuilA o QS21) y un esterol (p.ej. un colesterol) están asociadas como micelas helicoidales. [27].

Normalmente, se mezclarán los antígenos y los adyuvantes de la composición en el momento de su administración a un paciente. Las emulsiones pueden mezclarse con el antígeno durante la fabricación, o de forma extemporánea, en

25 el momento de la administración. Por lo tanto, el adyuvante y el antígeno se pueden guardar por separado en una vacuna empaquetada o distribuida, lista para su formulación final en el momento de su uso. El antígeno se presentará en general en forma acuosa, de manera que la vacuna se pueda preparar finalmente mezclando los dos líquidos. La relación de volumen de los dos líquidos para el mezclado puede variar (p.ej. entre 5:1 y 1:5) pero es generalmente aproximadamente 1:1.

30 C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de ref. 19]

Se pueden utilizar asimismo formulaciones de saponina. Las saponinas son un grupo heterogéneo de esterol glucosidos y glucosidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies vegetales. Se han estudiado exhaustivamente las saponinas de corteza del árbol Quillaia saponaria Molina como adyuvantes. Una saponina también se puede obtener en el mercado, de

35 Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (hierba jabonera). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas como QS21, así como formulaciones de lípidos como ISCOMs. QS21 está disponible en el mercado como Stimulon™.

Se han purificado composiciones de saponina por HPLC o RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas mediante el empleo de dichas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y

40 QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. En la ref. 28 se desvela un procedimiento de producción de QS21. Las formulaciones de saponina pueden comprender también un esterol, como por ejemplo colesterol [29].

Se pueden emplear combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM; véase el capítulo 23 de ref. 19; también refs. 30 y 31). Los ISCOM incluyen también típicamente un fosfolípido como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede emplear cualquier saponina

45 conocida en los ISCOM. Preferentemente, un ISCOM incluye uno o más QuilA, QHA y QHC. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de un detergente adicional [32].

En las refs. 33 y 34 se pueden encontrar una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina.

D. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso incluyen derivados bacterianos o microbianos como derivados no tóxicos de

50 lipopolisacáridos (LPS) entorobacterianos, derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ADP-ribosilantes y derivados desintoxicados de las mismas.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-deacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de “partícula pequeña” preferente de monofosforil lípido A 3 De-O-acilado se desvela en ref. 35. Dichas "partículas pequeñas" de 3dMPL

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Absorción de vesícula

Se combinaron las vesículas con hidróxido de aluminio (2 mg/ml) para determinar la adsorción. Se almacenó el material adsorbido a 4°C durante 1 día, 1 semana o 1 mes. Se adsorbieron totalmente las vesículas al cabo de 1 día y no hubo evidencia de desorpción incluso al cabo de 1 mes (Figura 6).

5 Crecimiento con limitación del hierro

La Figure 5 muestra proteínas expresadas por Shigella cultivadas en varias condiciones. En la calle, se cultivaron las bacterias en presencia de 200 µM de FeSO4 mientras que en la calle 5 el cultivo tenía 200 µM de dipiridilo. El inserto muestra que tres proteínas se regulan a la alza en condiciones de limitación del hierro. Estas tres proteínas fueron identificadas como receptor de membrana externa FepA (GI 74311118), el receptor de colicina I (GI 74312677), y el

10 receptor de sideroforo férrico putativo (GI 74313972). Estas proteínas se conservan bien entre Shigella spp. y las enterobacteriaceae y son potencialmente altamente inmunogénicas. Por lo tanto el cultivo de Shigella en condiciones de limitación de hierro puede suponer una liberación de vesículas que, en comparación con las condiciones de crecimiento normal, están enriquecidas para estas proteínas.

TABLA 1

SEQ ID NO:: GI Nombre del gen Definición

8: 56480244 tolC proteína de canal de membrana externa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

9: 74312736 ompC proteína porina C de membrana externa [Shigella sonnei Ss046]

10: 74311514 ompA proteína de membrana externa A [Shigella sonnei Ss046]

11: 110807342 SFV_3519 proteína hipotética SFV_3519 [Shigella flexneri 5 cepa 8401]

12: 56479734 ompX proteína de membrana externa X [Shigella flexneri 2a cepa 301]

13: 24113033 slyB proteína de membrana externa putativa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

14: 24112608 lolB lipoproteína de membrana externa LolB [Shigella flexneri 2a cepa 301]

15: 24111612 yaeT Factor de ensamblaje YaeT de proteína de membrana externa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

16: 187733369 proteína de membrana externa C [Shigella boydii CDC 3083-94]

17: 24113066 Lpp lipoproteína mureína [Shigella flexneri 2a cepa 301]

18: 56479690 pal lipoproteína de membrana externa asociada a peptidoglicano [Shigella flexneri 2ª cepa 301]

19: 24115506 ecnB lipoproteína de membrana enterocidina B [Shigella flexneri 2a cepa 301]

20: 30063370 yedD proteína hipotética S2067 [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

21: 30064374 ygiW proteína hipotética S3269 [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

22: 30065519 yjel proteína hipotética S4565 [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

23: 24111837 ybaY proteína hipotética SF0398 [Shigella flexneri 2a cepa 301]

24: 24113773 SF2485 proteína hipotética SF2485 [Shigella flexneri 2a cepa 301]

25: 74313380 SSON_296 6 proteína hipotética SSON_2966 [Shigella sonnei Ss046]

26: 30063856 nlpB lipoproteína [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

27: 145294038 exc proteína 2 de exclusión de entrada [Shigella sonnei Ss046]

28: 82775909 rlpB lipoproteína RpIB de ensamblaje LPS [Shigella dysenteriae Sd197]

29: 74311310 ybhC pectinesterasa putativa [Shigella sonnei Ss046]

(continuación)

SEQ ID NO:: GI Nombre del gen Definición

30: 24114611 fkpA peptidil-prolil cis-trans isomerasa tipo FKBP [Shigella flexneri 2a cepa 301]

31: 74312826 hisJ proteína periplásmica de unión a histidina de sistema de transporte de histidina de alta afinidad [Shigella sonnei Ss046]

32: 24111599 htrA serina endoproteasa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

33: 30062097 tolB proteína de translocación TolB [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

34: 24111968 modA proteína periplásmica transportadora de molibdato [Shigella flexneri 2a cepa 301]

35: 24114628 ppiA peptidil-prolil cis-trans isomerasa A (rotamasa A) [Shigella flexneri 2a cepa 301]

36: 24111499 surA peptidil-prolil cis-trans isomerasa SurA [Shigella flexneri 2a cepa 301]

37: 30062764 oppA proteína periplásmica de unión a oligopéptido [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

38: 30065614 osmY proteína periplásmica [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

39: 74311404 artJ proteína de unión periplásmica del tercer sistema de transporte de arginina[Shigella sonnei Ss046]

40: 74311061 ushA UDP-azúcar hidrolasa/5&apos bifuncional; precursor de nucleotidasa periplásmico [Shigella sonnei Ss046]

41: 74311733 fliY subunidad de transporte de cistina [Shigella sonnei Ss046]

42: 110805056 mdoG proteína biosíntesis de glucano G [Shigella flexneri 5 cepa 8401]

43: 74312961 cysP subunidad de transporte de tiosulfato [Shigella sonnei Ss046]

44: 24114441 yraP proteína hipotética SF3191 [Shigella flexneri 2a cepa 301]

45: 74312191 SSON_168 1 receptor putativo [Shigella sonnei Ss046]

46: 74312061 ydgA proteína hipotética SSON_1546 [Shigella sonnei Ss046]

47: 24111764 proC pirrolin-5-carboxilato reductasa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

48: 24112431 SF1022 proteína hipotética SF1022 [Shigella flexneri 2a cepa 301]

49: 110806822 yggE proteína hipotética SFV_2968 [Shigella flexneri 5 cepa 8401]

50: 74312071 ydgH proteína hipotética SSON_1556 [Shigella sonnei Ss046]

51: 74313729 yrbC proteína hipotética SSON_3340 [Shigella sonnei Ss046]

52: 24115498 groEL chaperonina GroEL [Shigella flexneri 2a cepa 301]

53: 56479605 IpdA dihidrolipoamida dehidrogenasa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

54: 24112862 osmE Activador transcripcional de unión a ADN OsmE [Shigella flexneri 2a cepa 301]

55: 30065622 deoD purina nucleósido fosforilasa [Shigella flexneri 2a cepa 2457T]

56: 24111996 sucC subunidad beta de succinil-CoA sintetasa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

57: 24113762 Crr componente del sistema PTS específico de glucosa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

(continuación)

SEQ ID NO:: GI Nombre del gen Definición

58: 24111463 dnaK chaperona molecular DnaK [Shigella flexneri 2a cepa 301]

59: 74311033 metabolismo glicoproteína-polisacárido

60: 30064444 yqjD proteína hipotética S3349

61: 82777539 ycbO unión a sustrato transportador de alcanosulfonato

62: 74313684 yraM glicosilasa putativa

63: 24113841 SF2558 subunidad YfgL de complejo de ensamblaje de proteína OM

64: 24112186 ybiS proteína hipotética SF0769

65: 24111697 tauA subunidad de unión a sustrato transportador de taurina

66: 24115105 yifL lipoproteína de membrana externa putativa

67: 24113718 vacJ lipoproteína precursora

68: 1679580 phoN precursor de fosfatasa no específico [Shigella flexneri]

69: 13449092 mxiD proteína de secreción de Tipo III

70: 24112703 pspA proteína PspA de shock por fagos [Shigella flexneri 2a cepa 301]

71: 24112822 yeaF proteína hipotética SF1441 [Shigella flexneri 2a cepa 301]

72: 24113297 SF1963 subunidad de transporte de cistina

73: 24113931 SF2652 subunidad YfiO de complejo de ensamblaje de proteína de membrana externa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

74: 24114232 sigA serina proteasa [S. flexneri 2a cepa 301]

75: 24115037 ATP synt_ab_C subunidad alfa de F0F1 ATP sintasa

76: 24115158 glnA glutamina sintetasa [Shigella flexneri 2a cepa 301]

77: 30061681 aceF dihidrolipoamida acetiltransferasa

78: 30062108 sucD subunidad alfa de succinil-CoA sintetasa

79: 30062110 sucB dihidrolipoamida succiniltransferasa

80: 30062117 gltA citrato sintasa tipo II

81: 30062179 dacA Fracción A de D-alanil-D-alanina carboxipeptidasa

82: 30062295 glnH proteína periplásmica transportadora de glutamina ABC

83: 30062539 agp Glucosa-1-fosfato/inositol fosfatasa

84: 30062760 adhE acetaldehído-CoA/alcohol dehidrogenasa bifunctional

85: 30062895 mdoD proteína D de biosíntesis de glucano

86: 30062959 gapA gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa

87: 30063091 rspA proteína de sensación de hambre

88: 30063194 S1842 cisteína desulfurasa/selenocisteína liasa bifunctional

(continuación)

SEQ ID NO:: GI Nombre del gen Definición

89: 30063263 zwf glucosa-6-fosfato 1-dehidrogenasa

90: 30063276 aspS aspartil-tRNA sintetasa

91: 30063294 sitA proteína de transporte de hierro

92: 30063449 yeeX proteína hipotética S2177

93: 30063472 hisB imidazol glicerol-fosfato dehidratasa/histidinol fosfatasa

94: 30063593 mglB proteína de transporte de unión a galactosa; receptor para galactosa taxis

95: 30064126 eno fosfopiruvato hidratasa

96: 30064248 tktA transquetolasa

97: 30064278 ansB L-asparaginasa II

98: 30064289 S3169 ADN helicasa de superfamilia I

99: 30064503 yhbM lipoproteína Nlpl

100: 30064729 rpoC subunidad beta de ARN polimerasa dirigida a ADN

101: 30064730 rpoB subunidad beta de ARN polimerasa dirigida a ADN

102: 30064872 udp uridina fosforilasa

103: 30064882 pldA fosfolipasa A

104: 30064963 atpD subunidad beta de F0F1 ATP sintasa

105: 30065048 iutA receptor de sideforo férrico putativo

106: 30065119 lldD L-lactato dehidrogenasa

107: 30065247 nikA proteínas periplásmicas de unión para níquel

108: 30065291 glpD glicerol-3-fosfato dehidrogenasa

109: 30065404 rpoA subunidad alfa de ARN polimerasa dirigida a ADN

110: 30065544 hfq proteína Hfq de unión a ARN

111: 56479788 yccZ proteína de exportación de exopolisacárido [Shigella flexneri 2a cepa 301]

112: 56480532 lamB maltoporina [Shigella flexneri 2a cepa 301]

113: 58045130 sepA SepA [Shigella flexneri]

114: 74310732 aceE subunidad E1 de piruvato dehidrogenasa [Shigella sonnei Ss046]

115: 74310771 fhuA transportador de membrana externa de ferricromo [Shigella sonnei Ss046]

116: 74311118 fepA receptor FepA de membrana externa [Shigella sonnei Ss046]

117: 74311859 prc proteasa carboxi-terminal [Shigella sonnei Ss046]

118: 74312394 yciD proteína de membrana externa W [Shigella sonnei Ss046]

119: 74312453 prsA ribosa-fosfato pirofosfoquinasa [Shigella sonnei Ss046]

120: 74312677 cirA receptor de colicina I [Shigella sonnei Ss046]

(continuación)

SEQ ID NO:: GI Nombre del gen Definición

121: 74312761 glpQ glicerofosfodiéster fosfodiesterasa [Shigella sonnei Ss046]

122: 74312989 talA transaldolasa A [Shigella sonnei Ss046]

123: 74313764 degQ serina endoproteasa [Shigella sonnei Ss046]

124: 74314527 malE proteína periplásmica transportadora de maltosa ABC [Shigella sonnei Ss046]

125: 82543910 SBO proteína de cápside mayor_1406 [Shigella boydii Sb227]

126: 82544504 ycdO proteína hipotética SBO_2040 [Shigella boydii Sb227]

127: 82545484 dsbC proteína DsbC de intercambio tiol:disulfuro [Shigella boydii Sb227]

128: 82777619 ybjP lipoproteína putativa [Shigella dysenteriae Sd197]

129: 110807066 yhbN proteína hipotética SFV_3230 [Shigella flexneri 5 cepa 8401]

130: 161486535 yajG proteína hipotética S0385

131: 187427808 tolC proteína de membrana externa TalC [Shigella boydii CDC 3083-94]

132: 187731061 SbBS512_E 3369 peptidasa, familia M48B [Shigella boydii CDC 3083-94]

133: 187731375 SbBS512_E 3904 lipoproteína de membrana externa, familia Slp [Shigella boydii CDC 308394]

134: 187733898 osmY proteína Y inducible osmóticamente [Shigella boydii CDC 3083-94]

135: 187734005 bglX beta-glucosidasa, periplásmica [Shigella boydii CDC 3083-94]

136: 30065453 pepA leucil aminopeptidasa

Se identificaron las SEQ ID NO: 70, 71, 73, 74, 76, 111, 112, 114-129 y 131-135 desde vesículas de S.sonnei ΔtolR. Se identificaron las SEQ ID NO: 8-15 y 17-58 desde vesículas de S.sonnei ΔtolRΔgalU. Se identificaron las SEQ ID

5 NO: 83, 94, 97 y 107 desde vesículas de S.flexneri ΔtolR. Se identificaron las SEQ ID NO: 68, 69, 72, 75, 77-82, 8493, 95, 96, 98-106, 108-10, 113, 130 y 136 desde vesículas de S.flexneri ΔtolRΔrfbG. Se identificaron las SEQ ID NO: 60-67 desde digestión superficial de S.sonnei.

Subgrupo 1: SEQ ID NO: 68, 69, 72, 75, 77-110, 113, 130 y 136.

Subgrupo 2: SEQ ID NO: 8-15, 17-58, 60-67, 70, 71, 73, 74, 76, 111, 112, 114-129 y 131-135.

10 Subgrupo 3: SEQ ID NO: 1-60.

Nota: SEQ ID NO: 18 es igual que la SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 33 es igual que la SEQ ID NO: 2; las SEQ ID NO: 9 y 16 están relacionadas (∼97 % de identidad); las SEQ ID NO: 23 y 59 están relacionadas (∼98 % de identidad).

REFERENCIAS

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[9] Liu y col. (2005) Sci China C Life Sci. 48(3):228-40.

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Claims

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