ES2635631T3

ES2635631T3 - Composiciones detergentes que comprenden variantes de subtilasa

Info

Publication number: ES2635631T3
Application number: ES13704602.5T
Authority: ES
Inventors: Werner Besenmatter; Astrid Benie; Marco Malten
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2017-10-04
Anticipated expiration: 2033-02-14
Also published as: EP2628785B1; EP2628785A1; ES2582608T3; WO2013120952A3; US20150031114A1; EP2814933B1; EP2814933A2; WO2013120952A2; PL2814933T3

Abstract

Una composición detergente que comprende una variante de subtilisina que tiene actividad de proteasa, comprendiendo la variante las sustituciones correspondientes a Y217X y N218Z del polipéptido maduro codificado por la SEQ ID NO: 2, en la que X y Z se seleccionan del grupo que consiste en R o K, en el que la variante tiene al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de la SEQ ID NO : 2 o 4.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

5

15

25

35

45

55

65

en la molécula y se prueban las moléculas mutantes resultantes para determinar la actividad de la proteasa para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad dela molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica puede determinarse también por ensayo físico de la estructura, tal como se determina mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o etiquetado de fotoafinidad, junto con mutación de aminoácidos del sitio putativo de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de aminoácidos esenciales también sepuedededucir deuna alineación conun polipéptidorelacionado. Para BPN' (SEQ ID NO: 2) la tríada catalítica que comprende los aminoácidos S221, H64 y D32 es esencial para la actividad proteasa de la enzima.

Las variantes pueden consistir de 200 a 900 aminoácidos, por ejemplo, 210 a 800, 220 a 700, 230 a 600, 240 a 500, 250 a 400, 255 a 300, 260 a 290, 265 a 285, 270 a 280 o 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279 o 280 aminoácidos.

En una realización, la variante tiene una actividad catalíticamejorada en comparación con la enzima original.

En una realización, la variante tiene un rendimiento de lavado mejorado en comparación con la subtilisina original o comparada con una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de dicha variante pero que no tiene las alteraciones en una o más de dichas posiciones especificadas o comparada con una proteasa con la SEQ ID NO: 2, en el que el rendimiento de lavado semide como se describe en el ejemplo 2 en "Material y Métodos" aquí.

En otra realización, la composición detergente que comprende la variante tiene un rendimiento de lavado mejorado en comparación con una composición detergente por lo demás idéntica con una proteasa que es la subtilisina original o con una proteasa que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica de dicha variante pero que no tiene las alteraciones en una omás de dichas posiciones especificadas, o con una proteasa con la SEQ ID NO: 2.

Proteasas originales

Las enzimas que escinden los enlaces amida en sustratos de proteínas se clasifican como proteasas o (indistintamente) peptidasas (véase Walsh, 1979, Enzymatic Reaction Mechanisms, W.H. Freeman and Company, San Francisco, Capítulo 3).

Serinas proteasas

Una serina proteasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos, y en la que hay un residuo esencial de serina en el sitio activo (White, Handler and Smith, 1973, “Principles of Biochemistry”, Fifth Edition, McGraw-Hill Book Company, NY, páginas 271-272).

Las serina proteasas bacterianas tienen pesos moleculares en el intervalo de 20.000 a 45.000 Dalton. Seinhiben por diisopropilfluorofosfato. Hidrolizan ésteres terminales simples y son similares en actividad a la quimotripsina eucariótica, también una serina proteasa. Un término más estrecho, proteasa alcalina, que cubre un subgrupo, refleja el alto pH óptimo de algunas de las serina proteasas, de pH 9,0 a 11,0 (para revisión, véase Priest (1977) Bacteriological Rev. 41 711-753).

Subtilasas

Un subgrupo de las serina proteasas designadas tentativamente subtilasas ha sido propuesto por Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Se definen por ensayo de homología de más de 170 secuencias de aminoácidos de serina proteasas anteriormente denominadas proteasas de tipo subtilisina. Anteriormente se definía a menudo una subtilisina como una serina proteasa producida por bacterias Gram-positivas u hongos, y según Siezen et al. ahora es un subgrupo de las subtilasas. Se ha identificado una amplia variedad de subtilasas y se ha determinado la secuencia de aminoácidos de una serie de subtilasas. Para una descripción más detallada de tales subtilasas y sus secuencias de aminoácidos se hace referencia a Siezen et al. (1997).

Un subgrupo de las subtilasas, I-S1 o subtilisinas "verdaderas", comprende las subtilisinas "clásicas", tales como subtilisina 168 (BSS168), subtilisina BPN', subtilisina Carlsberg (ALCALASE®, NOVOZYMES A/S) y subtilisina DY(BSSDY).

Otro subgrupo de las subtilasas, I-S2 o subtilisinas de alta alcalininidad, es reconocido por Siezen et al. (supra). Las proteasas del subgrupo I-S2 se describen como subtilisinas altamente alcalinas y comprenden enzimas tales como subtilisina PB92 (BAALKP) (MAXACAL®, Genencor International Inc.), subtilisina 309 (SAVINASE®, NOVOZYMES A/S), subtilisina 147 (BLS147) (ESPERASE®, NOVOZYMES A/S), y elastasa alcalina YaB (BSEYAB). BPN' es subtilisina BPN' de B. amyloliquefaciens BPN' tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

11

imagen10

imagen11

imagen12

imagen13

5

15

25

35

45

55

65

La composición detergente de la presente invención se puede formular, por ejemplo, como una composición detergente para lavado de ropa a mano o en máquina que incluye una composición aditiva para lavado de ropa adecuada para el pretratamiento de tejidos teñidos y una composición añadida al enjuague de suavizante de tejidos

o ser formulada como una composición detergente para uso en operaciones generales de limpieza doméstica de superficies duras, o pueden ser formuladas para operaciones generales domésticas de limpieza de superficies duras, o ser formulada para operaciones de lavado de platos manual o a máquina. Preferiblemente, la composición detergente de acuerdo con la invención es una composición detergente para ropa o una composición para el lavado de platos, preferiblemente una composición paramáquina lavaplatos.

En un aspecto específico, la presente invención proporciona un aditivo detergente que comprende un polipéptido de la presente invención como se describe aquí.

En una realización preferida adicional, la composición detergente de acuerdo con la invención comprende la variante de proteasa en una cantidad desde 1 x 10-8-10 por ciento en peso (en peso), desde 0,00001-2% en peso, desde 0,001-1% en peso, desde 0,007-0,8% en peso, desde 0,025-0,5% en peso y particularmente preferido desde 0,040,38% en peso, con base en el contenido de proteína total de la variante de proteasa. La concentración de proteína puede determinarse usando métodos conocidos, por ejemplo el Proceso BCA (ácido bicinconínico, ácido 2,2'biquinolil-4,4'-dicarboxílico) o el procedimiento biuret (A.G. Gornall, C.S. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), páginas 751-766).

En otra realización preferida, la composición detergente de acuerdo con la invención es una composición detergente líquida.

En una realización preferida adicional, la composición detergente se caracteriza porque presenta un rendimiento de lavado mejorado. Preferiblemente, dicho rendimiento de lavado mejorado se determina como se indica en las definiciones aquí, especialmente calculando el denominado valor de intensidad (Int) definido en el ensayo AMSA como se describe en materiales y métodos aquí (véase también la prueba de rendimiento de lavado en el Ejemplo 2 aquí) omediantela prueba de lavado de referencia descrita más adelante.

Prueba de lavado de referencia:

En la prueba de lavado de referencia, el rendimiento de lavado se determina en un sistema de lavado que contiene una composición detergente a una proporción de dosificación de entre 4,5 y 7,0 gramos por litro de licor de lavado así como la proteasa. Las composiciones detergentes a comparar contienen la misma cantidad de la proteasa respectiva con base en el contenido de proteína total, proporcionando preferiblemente una cantidad de 5 mg de proteasa por litro de licor de lavado. El rendimiento de lavado se determina con respecto a las manchas de huevo, en particular con respecto a una omás de las siguientes manchas:

-huevo completo con pigmento sobre algodón: producto número C-S-37 se obtine de CFT (Centro para Materiales de Prueba) B.V., Vlaardingen, Países Bajos,

-huevo completo con pigmento sobre algodón/poliéster: producto número PC-S-37 se obtiene de CFT (Centro para Materiales de Prueba) B.V., Vlaardingen, Países Bajos,

-huevo completo con pigmento, envejecido por calentamiento, sobre algodón/poliéster: número PC-S-39 obtenible de CFT (Centro para Materiales de Prueba) B.V., Vlaardingen, Países Bajos,

midiendo la blancura de los textiles lavados, realizándose el procedimiento de lavado durante al menos 30 minutos, opcionalmente 60 minutos, a una temperatura de 40ºC, y el agua que tiene una dureza del agua entre 15,5 y 16,5º (grados de dureza alemanes) .

La composición detergente líquida preferida para dicho sistema de lavado tiene la siguiente composición (todas las indicaciones en porcentaje en peso): goma de xantano al 0,3 a 0,5%, agente antiespumante al 0,2 a 0,4%, glicerol al 6 a 7%, etanol al 0,3 a 0,5%, FAEOS (sulfato de éter de alcohol graso) al 4 a 7%, tensioactivos no iónicos al 24 a 28%, ácido bórico al 1%, citrato de sodio (dihidrato) al 1 a 2%, bicarbonato sódico al 2 a 4%, ácido graso de coco al 14 a 16%, HEDP (1-hidroxietano-(1,1-ácido difosfónico)) al 0,5%, PVP (polivinilpirrolidona) al 0 a 0,4%, abrillantadores ópticos al 0 a 0,05%, colorante al 0 a 0,001%, lo restante de agua desionizada. La proporción de dosificación del agente de lavado líquido está preferiblemente entre 4,5 y 6,0 gramos por litro de licor de lavado, por ejemplo 4,7, 4,9 o 5,9 gramos por litro de licor de lavado. El lavado se produce preferiblemente en un intervalo de pH entre pH 8 y pH 10,5, preferiblemente entre pH 8 y pH 9.

La composición detergente en polvo preferida para dicho sistema de lavado tiene la siguiente composición (todas las indicaciones en porcentaje en peso): alquilbencenosulfonato lineal (sal de sodio) al 10%, sulfato de alcohol graso C12 a C18 (sal de sodio) al 1,5%, alcohol graso C12 a C18 con 7 EO al 2,0%, carbonato de sodio al 20%, hidrógeno carbonato de sodio al 6,5%, disilicato de sodio amorfo al 4,0%, peroxohidrato de carbonato de sodio al 17%, TAED al 4,0%, poliacrilato al 3,0%, carboximetilcelulosa al 1,0%, fosfonato al 1,0% y sulfato sódico al 25%; el

16 5

15

25

35

45

55

65

restante: opcionalmente inhibidores de espuma, abrillantadores ópticos, aromas y, en su caso, agua para hacer 100%. La proporción de dosificación del agente de lavado en polvo es preferiblemente entre 5,5 y 7,0 gramos por litro de licor de lavado, por ejemplo 5,6, 5,9 o 6,7 gramos por litro de licor de lavado. El lavado se produce preferiblemente en un intervalo de pH entre pH 9 y pH 11.

Se prefiere de acuerdo con la presente invención si se utiliza el agente de lavado líquido mencionado anteriormente, como seindica, para determinar el rendimiento delavadomediante la prueba de lavado de referencia.

La blancura, es decir el abrillantado de las manchas, se determina como una indicación del rendimiento de lavado, preferiblemente usando métodos ópticos de medición, preferiblemente fotométricamente. Un dispositivo adecuado para esto es, por ejemplo, el espectrómetro Minolta CM508d. Los dispositivos utilizados para la medición se calibran usualmente utilizando un patrón blanco, preferiblemente un patrón blanco provisto con la unidad.

La enzima o enzimas de las composiciones detergentes de la invención, especialmente las variantes de proteasa descritas aquí, pueden estabilizarse usando agentes estabilizantes convencionales, por ejemplo, un poliol tal como propilenglicol o glicerol, una azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo, un éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenilborónico tal como ácido 4-formilfenilborónico, y la composición puede formularse como se describe, por ejemplo, en los documentos WO92/19709 y WO92/19708

o las variantes de acuerdo con la invención pueden estabilizarse usando aldehídos o cetonas peptídicas tales como las descritas en los documentosWO2005/105826 yWO2009/118375.

Una composición detergente de acuerdo con la invención podría comprender además uno o más compuestos peroxi.

Tales compuestos peroxi presentes opcionalmente en las composiciones que pueden considerarse en particular son perácidos orgánicos o sales peracídicas de ácidos orgánicos, tales como ácido ftalimidopercaproico, ácido perbenzóico o sales de ácido diperdodecanodióico, peróxido de hidrógeno y sales inorgánicas que liberan peróxido de hidrógeno bajo las condiciones de lavado, tal como perborato, percarbonato y/o persilicato. El peróxido de hidrógeno también se puede producir aquí con la ayuda de un sistema enzimático, es decir, una oxidasa y su sustrato. Donde se vayan a utilizar compuestos peroxi sólidos, se pueden utilizar en forma de polvos o gránulos, que también pueden encapsularse en principio de manera conocida. Se prefieren particularmente percarbonato de metal alcalino, perborato de metal alcalino monohidrato, perborato de metal alcalino tetrahidrato o peróxido de hidrógeno en forma de soluciones acuosas que contienen de 3% en peso a 10% en peso de peróxido de hidrógeno. Los compuestos peroxi están preferiblemente presentes en agentes de lavado o de limpieza de acuerdo con la invención en cantidades de hasta 50% en peso, en particular de 5% en peso a 30% en peso.

Además de la variante de proteasa que se va a usar de acuerdo con la invención, las composiciones detergentes de acuerdo con la invención, que pueden tomar en particular la forma de sólidos pulverulentos, partículas postcomprimidas, soluciones o suspensiones homogéneas, pueden contener en principio cualquier ingrediente conocido y convencionales en tales composiciones. Las composiciones de acuerdo con la invención pueden contener en particular sustancias aditivas, tensioactivos de superficie activa, disolventes orgánicos inmiscibles en agua, enzimas, agentes secuestrantes, electrolitos, reguladores de pH, polímeros con efectos específicos tales como polímeros de liberación de suciedad, inhibidores de transferencia de colorantes, inhibidores de agrisamiento, ingredientes activos poliméricos reductores de arrugas e ingredientes activos poliméricos que retienen la forma, y otras sustancias auxiliares, tales como abrillantadores ópticos, reguladores de espuma, activadores peroxi adicionales, colorantes y aromas.

Además de los ingredientes anteriormente indicados, una composición de acuerdo con la invención puede contener principios activos antimicrobianos convencionales con el fin de potenciar la acción de desinfección, por ejemplo hacia microorganismos específicos. Tales aditivos antimicrobianos están preferiblemente presentes en los desinfectantes de acuerdo con la invención en cantidades de hasta 10% en peso, en particular de 0,1% en peso a 5% en peso.

En una composición detergente de acuerdo con la invención, pueden usarse también activadores de blanqueo convencionales que forman ácidos peroxicarboxílicos o ácidos peroxiimídicos en condiciones de perhidrólisis y/o complejos convencionales de metal de transición que activan el blanqueo. El componente activador de blanqueo opcionalmente presente en particular en cantidades de 0,5% en peso a 6% en peso comprende compuestos de Nor O-acilo utilizados convencionalmente, por ejemplo alquilendiaminas poliactiladas, en particular tetraacetiletilendiamina, glicolurilos acilados, en particular tetraacetilglicolurilo, hidantoínas N-aciladas, hidrazidas, triazoles, urazoles, dicetopiperazinas, sulfurilamidas y cianuratos, además de anhídridos carboxílicos, en particular anhídrido ftálico, ésteres de ácidos carboxílicos, en particular isononanoilfenolsulfonato de sodio, y derivados de azúcares acilados, en particular pentaacetilglucosa, junto con derivados de nitrilo catiónicos tales como sales de acetonitrilo de trimetilamonio. Con el fin de evitar la interacción con compuestos per durante el almacenamiento, los activadores de blanqueo pueden, de manera conocida, haberse recubierto con sustancias de envoltura o granulado, siendo particularmente preferidas la tetraacetiletilendiamina granulada con la ayuda de carboximetilcelulosa y con un tamaño de grano medio de 0,01 mm a 0,8 mm, 1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina granulada, y/o trialquilamonio acetonitrilo formulado en forma particulada. Tales activadores de blanqueo están preferiblemente

17

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

5

15

25

35

45

55

65

Con respecto al componente e), en una realización preferida de las composiciones de acuerdo con la invención, están presentes 1,5 a 5% en peso de policarboxilato polimérico, en particular seleccionados de los productos de polimerización o copolimerización de ácido acrílico, ácido metacrílico y/o ácido maleico. Entre éstos, se prefieren los homopolímeros de ácido acrílico y, entre éstos, se prefieren particularmente aquellos con una masa molar media en el intervalo desde 5.000 D a 15.000 D (estándar PA).

En otra realización preferida, la composición detergente de acuerdo con la invención comprende una o más enzimas adicionales tales como una proteasa, una lipasa, cutinasa, amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o peroxidasa.

En general, las propiedades de la enzima o enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, el pH óptimo, la compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.) y la enzima o enzimas deben estar presentes en cantidades efectivas.

Celulasas: celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes modificados químicamente o modificados con proteínas. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en los documentos US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 yWO 89/09259.

Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios de cuidado del color. Ejemplos de tales celulasas son celulasas descritas en los documentos EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasa tales como las descritas en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.

Las celulasas comercialmente disponibles incluyen CelluzymeTM, CarezymeTM (Novozymes A/S), ClazinaseTM y Puradax HA™ (Genencor International Inc.) y KAC-500(B)™(Kao Corporation).

Proteasas: La enzima adicional puede ser otra proteasa o variante de proteasa. La proteasa puede ser de origen animal, vegetal o microbiano, incluyendo mutantes modificados químicamente o genéticamente. Se prefiere el origen microbiano. Puede ser una proteasa alcalina, tal como una serina proteasa o una metaloproteasa. Una serina proteasa puede ser, por ejemplo, de la familia S1, tal como tripsina, o la familia S8, tal como subtilisina. Una proteasametaloproteasas puede ser, por ejemplo, una termolisina a partir, por ejemplo, familia M4, M5, M7 o M8.

El término "subtilasas" se refiere a un subgrupo de serina proteasa de acuerdo con Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 y Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. Las serina proteasas son un subgrupo de proteasas caracterizado por tener una serina en el sitio activo, que forma un aducto covalente con el sustrato. Las subtilasas se pueden dividir en 6 subdivisiones, es decir, la familia de la Subtilisina, la familia Thermitasa, la familia de la proteinasa K, la familia peptidasa Lantibiotica, la familia Kexin y la familia Pirolisina. En un aspecto de la invención, la proteasa adicional puede ser una subtilasa, tal como una subtilisina o una variante de lamisma.

Ejemplos de subtilisinas son las derivadas de Bacillus tales como subtilisina lentus, Bacillus lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN', subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 descritas en el documentoWO 89/06279 y proteasa PD138 (documento WO 93/18140). Otros ejemplos de serina proteasa se describen en los documentos WO 98/020115, WO 01/44452, WO 01/58275, WO 01/58276, WO 03/006602 y WO 04/099401. Otros ejemplos de variantes de subtilasa pueden ser aquellos que tienen mutaciones en cualquiera de las posiciones: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 217, 218, 222, 232, 235, 236, 245, 248, 252 y 274 utilizando la numeración BPN’. Más preferiblemente, las variantes de la subtilasa pueden comprender las mutaciones: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V,R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A (utilizando numeración BPN'). Otra proteasa preferida es la proteasa alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, como se describe por ejemplo en WO 95/23221, y sus variantes que se describen en los documentos WO 92/21760, WO 95/23221, EP 1921147 y EP 1921148.

Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (por ejemplo de origen porcino o bovino) y la proteasa Fusarium descrita en los documentos WO 89/06270 y WO 94/25583. Ejemplos de proteasas útiles son las variantes descritas en los documentos WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.

Ejemplos demetaloproteasas son la metaloproteasa neutra como se describe en el documentoWO 07/044993.

Las enzimas de proteasa preferidas disponibles comercialmente Alcalase™, Coronase™, Duralase™, Durazym™, Esperase™, Everlase™, Kannase™, Liquanase™, Liquanase Ultra™, Ovozyme™, Polarzyme™, Primase™,

22

imagen18

5

15

25

35

45

55

65

los mismos y los éteres derivables de las clases de compuestos indicadas. Tales disolventes miscibles en agua están preferiblemente presentes en las composiciones de lavado de acuerdo con la invención en cantidades de no más de 30% en peso, en particular de 6% en peso a 20% en peso.

Con el fin de establecer un valor de pH deseado que no se obtiene automáticamente mezclando los componentes restantes, las composiciones de acuerdo con la invención pueden contener ácidos que sean compatibles con el sistema y sean compatibles con el medio ambiente, en particular ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido málico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido glutárico y/o ácido adípico, así como ácidos minerales, en particular ácido sulfúrico, o bases, en particular hidróxidos de amonio o de metal alcalino. Dichos reguladores del pH están presentes en las composiciones de acuerdo con la invención preferiblemente en una cantidad de no más de 20% en peso, en particular de 1,2% en peso a 17% en peso.

Los polímeros con una capacidad de desprendimiento de suciedad, que se conocen a menudo como ingredientes activos de "liberación de suciedad" o, debido a su capacidad para proporcionar un acabado repelente a la suciedad sobre la superficie tratada, por ejemplo la fibra, como "repelentes de suciedad", son por ejemplo derivados de celulosa no iónicos o catiónicos. Los polímeros con capacidad de desprendimiento de suciedad, en particular con respecto a los poliésteres, incluyen copoliésteres preparados a partir de ácidos dicarboxílicos, por ejemplo ácido adípico, ácido ftálico o ácido tereftálico, dioles, por ejemplo etilenglicol o propilenglicol y polidioles, por ejemplo polietilenglicol o polipropilenglicol. Los poliésteres con una capacidad de desprendimiento de suciedad que se utilizan preferiblemente incluyen aquellos compuestos que, en términos formales, pueden obtenerse esterificando dos fracciones monoméricas, siendo el primer monómero un ácido dicarboxílico HOOCPh-COOH y el segundo monómero un diol HO-(CHR11-)aOH, que también puede estar presente como un diol polimérico H-(O-(CHR11-)a) bOH. Ph aquí significa un residuo o-, m-o p-fenileno que puede llevar de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de residuos alquilo con 1 a 22 átomos de carbono, grupos ácido sulfónico, grupos carboxilo y mezclas de los mismos, R11 significa hidrógeno, un residuo alquilo con 1 a 22 átomos de carbono y mezclas de los mismos, a significa un número de 2 a 6 y b un número de 1 a 300. Los poliésteres obtenibles a partir de los mismos contienen preferiblemente no sólo unidades monómeras de diol -O-(CHR11-)aO-sino también unidades poliméricas de diol -(O(CHR11-)a)bO-. La proporción molar de unidades de monómero diol a unidades de polímero diol asciende preferiblemente a 100:1 a 1:100, en particular a 10:1 a 1:10. En las unidades de polímero diol, el grado de polimerización b está preferiblemente en el intervalo desde 4 a 200, en particular desde 12 a 140. El peso molecular

o el peso molecular medio o el máximo de la distribución del peso molecular de los poliésteres preferidos con una capacidad de desprendimiento de suelo se encuentra en el intervalo desde 250 a 100.000, en particular de 500 a

50.000. El ácido sobre el que se basa el residuo Ph se selecciona preferiblemente entre ácido tereftálico, ácido isoftálico, ácido ftálico, ácido trimelítico, ácidomelítico, los isómeros de ácido sulfóftálico, ácido sulfoisoftálico y ácido sulfotereftálico y mezclas de los mismos. Cuando los grupos ácidos de los mismos no forman parte del enlace éster en el polímero, están preferiblemente presentes en forma de sal, en particular como una sal de metal alcalino o de amonio. Entre éstas, son particularmente preferidas las sales de sodio y potasio. Si se desea, en lugar del monómero HOOC-Ph-COOH, el poliéster con una capacidad de desprendimiento de suciedad puede contener pequeñas proporciones, en particular no más del 10% en moles con respecto a la proporción de Ph con el significado anteriormente indicado, de otros ácidos que comprenden al menos dos grupos carboxilo. Estos incluyen, por ejemplo, ácidos dicarboxílicos alquileno y alquenileno tales como ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azelaico y ácido sebácico. Los dioles preferidos HO-(CHR11-)aOH incluyen aquellos en los que R11 es hidrógeno y a es un número de 2 a 6, y aquellos en los que a tiene el valor 2 y R11 se selecciona de hidrógeno y residuos de alquilo con 1 a 10, en particular 1 a 3 átomos de carbono. Entre los dioles mencionados en último lugar, son particularmente preferidos los de la fórmula HO-CH2-CHR11-OH, en la que R11 tiene el significado indicado anteriormente. Ejemplos de componentes de diol son etilenglicol, 1,2-propilenglicol, 1,3-propilenglicol, 1,4-butanodiol, 1,5-pentanodiol, 1,6hexanodiol, 1,8-octanodiol, 1,2-decanodiol, 1,2-dodecanodiol y neopentilglicol. Entre los dioles poliméricos, se prefiere particularmente el polietilenglicol con una masamolar media en el intervalo desde 1000 a 6000. Si se desea, estos poliésteres pueden estar también terminados en grupos terminales, con grupos terminales que pueden considerarse grupos alquilo con 1 a 22 átomos de carbono y ésteres de ácidos monocarboxílicos. Los grupos terminales unidos mediante enlaces éster pueden tener como base ácidos monocarboxílicos alquil, alquenilo y arilcon 5 a 32 átomos de carbono, en particular 5 a 18 átomos de carbono. Éstos incluyen ácido valérico, ácido capróico, ácido enántico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido cáprico, ácido undecanóico, ácido undecenóico, ácido láurico, ácido lauroléico, ácido tridecanóico, ácido mirístico, ácido miristoléico, ácido pentadecanóico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido petroselínico, ácido petroselaídico, ácido oléico, ácido linoléico, ácido linolaídico, ácido linolénico, ácido eleosteárico, ácido araquídico, ácido gadoléico, ácido araquidónico, ácido behénico, ácido erúcico, ácido brassídico, ácido clupanodónico, ácido lignocérico, ácido cerótico, ácido melésico, ácido benzóico, que puede llevar de 1 a 5 sustituyentes que tienen un total de hasta 25 átomos de carbono, en particular de 1 a 12 átomos de carbono, por ejemplo ácido terc.-butilbenzóico. Los grupos terminales también pueden tener como base ácidos hidroximonocarboxílicos con 5 a 22 átomos de carbono, que incluyen, por ejemplo, ácido hidroxivalérico, ácido hidroxicaproico, ácido ricinoléico, su producto de hidrogenación, ácido hidroxiesteárico y ácido o-, m-y phidroxibenzóico. Los ácidos hidroximonocarboxílicos pueden a su vez estar unidos entre sí a través de su grupo hidroxilo y su grupo carboxilo y así estar presentes repetidamente en un grupo terminal. El número de unidades de ácido hidroximonocarboxílico por grupo final, es decir, su grado de oligomerización, está preferiblemente en el intervalo desde 1 a 50, en particular desde 1 a 10. En un desarrollo preferido de la invención, los polímeros de

24

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

6.0% de alquiletoxi sulfato de sodio (C-9-15, 2EO) 3.0% de dodecil benceno sulfonato de sodio 3.0% de tolueno sulfonato de sodio

2.0% de ácido oleico

Detergente líquido modelo para: 3.0% de etoxilato de alcohol primario (C12-15,

lavar ropa: 7EO)

2.5% de etoxilato de alcohol primario (C12-15,

3EO)

0.5% de Etanol

2.0% de Monopropilenglicol

4.0% de citrato trisódico 2H2O

0.4% de Trietanolamina

100% de agua desionizada

pH adjustado a 8,5 con NaOH

32.3% de Deshidratado de citrato de sodio

Detergente modelo en polvo para: 24.2% de Sodio-LAS

lavar ropa: 32.2% de lauril sulfato de sodio

6.4% de Neodol 25-7 (etoxilato de alcohol)

4.9% de sulfato de sodio

Material de prueba: PC-S-37 (huevo entero sobre algodón/poliéster) PC-S-39 (huevo envejecido entero sobre algodón/poliéster)

La dureza del agua se ajustó a 15°dH mediante la adición de CaCl2, MgCl2 y NaHCO3 (Ca2+:Mg2+ = 4:1:7,5) al sistema de prueba. Después del lavado, los textiles selavaron abundantemente en agua del grifo y se secaron.

5 El rendimiento de lavado semide como el brillo del color del textil lavado. El brillo también puede expresarse como la intensidad de la luz reflejada de la muestra cuando se ilumina con luz blanca. Cuando la muestra está manchada, la intensidad de la luz reflejada es menor que la de una muestra limpia. Por lo tanto, la intensidad de la luz reflejada puede usarse paramedir el rendimiento de lavado.

10 Las mediciones de color se realizan con un escáner de cama plana profesional (Kodak iQsmart, Kodak, Midtager 29, DK-2605 Brøndby, Dinamarca), que se utiliza para capturar una imagen del textil lavado.

Para extraer un valor para la intensidad de luz de las imágenes escaneadas, los valores de píxeles de 24 bits de la 15 imagen se convierten en valores para rojo, verde y azul (RGB). El valor de intensidad (Int) se calcula sumando los valores RGBjuntos como vectores y luego tomando la longitud del vector resultante:

imagen24

20 Ejemplo 1: Preparación y pruebas de variantes de proteasa Preparación y expresión de variantes

25 MutacióneintroduccióndeuncasetedeexpresiónenBacillussubtilis. Todas las manipulaciones de ADN se realizaron por PCR (por ejemplo, Sambrook et al.; Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory Press) y pueden repetirse por todos los experimentados en la técnica.

30

imagen25

Claims

imagen1