ES2639821T3 - Composiciones a base de Arthrospira y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un método para preparar una composición biocida para uso tópico en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: 1) estresar fisiológicamente Arthrospira, por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o retirando hasta un 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira; y 2) combinar una cantidad biocida eficaz de la Arthrospira estresada de (1) con un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para administración tópica al sujeto, en el que la cantidad biocida eficaz es eficaz frente a bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero; y en la que la Arthrospira no se ha liofilizado.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Composiciones a base de Arthrospira y usos de las mismas
La presente invención se refiere a una composición biocida tópica que comprende una cantidad biocida eficaz de una Arthrospira fisiológicamente estresada, a un método para preparar dicha composición para uso tópico en un
5 sujeto y a una cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada para administración tópica a un sujeto para uso en la prevención o el tratamiento de una infección o infestación bacteriana del sujeto o en la reparación o prevención de un defecto de la piel en un mamífero.
La Arthrospira (anteriormente conocida como Spirulina) es una cianobacteria que se cultiva principalmente para uso como fuente de alimento y/o proteína. Se han descrito también usos terapéuticos para Arthrospira, incluyendo el uso
10 como agente antivírico, agente anticanceroso, reductor del colesterol, reductor de la diabetes, reductor de la hipertensión e inmunomodulador. Véanse, por ejemplo, las referencias citadas en el sitio web de SpirulinaSource.com en http://www.spirulinasource.com/library.html.
El documento WO 1998/025471 da a conocer un método de preparación de un compuesto de Spirulina tratado, incluyendo dicho método las etapas de rehidratar Spirulina desecada, estresar el cultivo y liofilizar la composición
15 hasta un polvo. El compuesto resultante tiene actividad como compuesto antivírico y compuesto antibacteriano.
Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición de Arthrospira para uso como agente biocida y/o terapéutico.
La Arthrospira fisiológicamente estresada tiene actividad biocida
Los presentes inventores han descubierto que la Arthrospira, cuando se estresa fisiológicamente, produce al menos
20 un tipo de agente bioactivo que es activo contra hongos, bacterias y presuntamente virus. La Arthrospira puede estresase fisiológicamente, por ejemplo, privando al organismo de nutrientes o luz, o deshidratando/secando el organismo. Es una señal de que un filamento de Arthrospira (tracoma) está “fisiológicamente estresado” cuando entra en estado anabiótico, en cuyo estado el filamento se redondea y se produce un recubrimiento mucoide espeso.
Se cree por los inventores que el filamento y/o recubrimiento mucoide espeso contiene uno o más agentes
25 bioactivos que protegen al organismo frente a los predadores. Uno o más de los bioactivos pueden degradar la pared celular o exoesqueleto de un organismo predador. Uno o más de los agentes bioactivos pueden ser, por ejemplo, un agente lítico o modificador tal como quitinasa, quitosanasa o quitina desacetilasa, que digiere quitina, un derivado de quitina (tal como quitosano) u otro polímero de pared celular que tenga, por ejemplo, Nacetilglucosamina o D-glucosamina como subunidad polimérica. El peptidoglicano de bacterias grampositivas es uno
30 de dichos polímeros, que comprende N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico. La quitina, derivado de quitina o polímero puede estar en cualquier forma adecuada. La quitina, derivado de quitina o polímero puede estar en una forma sustancialmente purificada o puede ser parte de un organismo tal como la pared celular de un hongo o bacteria grampositiva, o parte del exoesqueleto de un insecto.
Preferiblemente, el agente bioactivo puede ser una quitinasa, quitosanasa o quitina desacetilasa y el sustrato de
35 prueba es quitina, un derivado de quitina o un polímero que tiene N-acetil-D-glucosamina como subunidad polimérica. Preferiblemente, se usa la respirometría para ensayar la modificación (concretamente degradación) de la quitina, derivado de quitina u otro polímero.
La presente invención se refiere a un método de preparación de una composición biocida para uso tópico en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: (1) estresar fisiológicamente Arthrospira, por falta de nutrientes
40 o luz, por deshidratación o retirando hasta un 80 % del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira; y (2) combinar una cantidad biocida eficaz de la Arthrospira estresada de (1) con un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para administración tópica al sujeto, en la que la cantidad biocida eficaz es eficaz frente a bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero, y en la que la Arthrospira no se ha liofilizado.
Se reivindican realizaciones preferidas de dicho método en las reivindicaciones dependientes 2 a 4 y 14.
45 La presente invención se refiere también a una composición biocida tópica que comprende una cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada, en el que el estresado fisiológico se consigue por falta de nutrientes
o luz, por deshidratación o por retirada de hasta un 80 % del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira, y un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para administración tópica a un sujeto, en la que la cantidad biocida eficaz es eficaz frente a bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero; en la que la Arthrospira no
50 se ha liofilizado.
Se reivindican realizaciones preferidas de dicha composición en las reivindicaciones 6,7 y 13.
La invención se refiere finalmente a una cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada, en la que el estresado fisiológico se consigue por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o retirando hasta un 80 % del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira, y un portador, disolvente, base o excipiente para administración tópica a un sujeto, para uso en la prevención o el tratamiento de una infección o infestación bacteriana del sujeto, o en la reparación o prevención de un defecto en la piel de un mamífero; en la que la Arthrospira no se ha lifolizado.
imagen2
Se reivindican realizaciones preferidas de dicha cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada en las reivindicaciones 9 a 12.
5 Uso de Arthrospira fisiológicamente estresada como agente biocida y/o terapéutico
La quitina, derivados de quitina y polímeros que contienen glucosamina se encuentran en la naturaleza, habitualmente como componente de una pared celular o exoesqueleto, por ejemplo, de algas, hongos, protozoos, ciliados, celentéreos, briozoos, moluscos, anélidos, artrópodos, branquiópodos, foronídeos, pogonóforos y bacterias (bacterias grampositivas y Rhizobia).
10 Por ello, la Arthrospira fisiológicamente estresada que tiene actividad lítica o modificadora frente a quitina, derivados de quitina y polímeros que contienen glucosamina puede usarse potencialmente como agente biocida contra un amplio intervalo de organismos. “Biocida”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a la muerte de un organismo o la inhibición del crecimiento o replicación de un organismo (concretamente, el organismo puede no morir realmente). Ha de apreciarse que algunas aplicaciones del biocida serán con fines terapéuticos
15 Según la presente invención, se proporciona una composición biocida tópica que comprende una cantidad biocida eficaz de la Arthrospira fisiológicamente estresada, en la que el estresado fisiológico se consigue por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o por retirada de hasta un 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira, y un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para administración tópica a un sujeto, en la que la cantidad biocida eficaz es eficaz contra bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero; y en la que la
20 Arthrospira no se ha liofilizado.
Según la presente invención, se proporciona un método para preparar una composición biocida para uso tópico en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de: (1) estresar fisiológicamente la Arthrospira por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o retirando hasta un 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira; y
(2) combinar una cantidad biocida eficaz de la Arthrospira estresada de (1) con un portador, disolvente, base o
25 excipiente adecuado para administración tópica a un sujeto, en la que la cantidad biocida eficaz es eficaz contra bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero; y en la que la Arthrospira no se ha lifolizado.
Preferiblemente, la etapa de estresar fisiológicamente la Arthrospira comprende retirar hasta un 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira; y la etapa (2) está precedida por las etapas (1a) y (1b) como sigue: (1a) lavado de la Arthrospira fisiológicamente estresada para retirar contaminantes; y (1b) secado la Arthrospira lavada.
30 Preferiblemente, el sujeto es un ser humano, un animal, un producto agrícola u hortícola, suelo, una estructura artificial o una vía acuática.
Preferiblemente, el defecto de la piel se selecciona del grupo consistente en daño por acné, rosácea, un área enrojecida, una grieta, una quemadura, una ampolla, psoriasis, eccema, escamas, arrugas, una pápula, una lesión, una pústula, una herida, costra láctea, dermatitis del pañal, una úlcera, una úlcera bucal, dermatitis del afeitado,
35 dermatitis, y talones y codos agrietados.
Sorprendentemente, los inventores han encontrado que sacar a Arthrospira de su entorno de crecimiento puede ser suficiente para que aparezca el estrés fisiológico y para inducir la expresión de uno o más agentes que tienen actividad biocida. Es decir, las etapas para estresar fisiológicamente Arthrospira como se enseñan en las memorias descriptivas de las patentes de Nueva Zelanda nº 336620 y 336619 no tienen que llevarse a cabo, y la Arthrospira
40 no tiene que procesarse adicionalmente (desestabilizarse, descomprimirse explosivamente, potenciarse, molerse, rehidratares con bicarbonato de sodio o liofilizarse) para que haya actividad biocida.
Además, se ha encontrado que todas las preparaciones comercialmente disponibles (comprimidos, cápsulas y polvos) de Arthrospira que se han ensayado hasta ahora por los inventores tienen actividad contra un sustrato, y se cree que esa actividad es indicativa de actividad biocida. Dichas preparaciones se preparan habitualmente
45 recogiendo Arthrospira, lavando y secando Arthrospira, sin una etapa para estresar específicamente el organismo. De hecho, los cultivadores comerciales de Arthrospira tienden a minimizar el estrés del organismo lo más posible, ya que el recubrimiento mucoide espeso tiende a obstruir la maquinaria para procesar el organismo.
Para una cualquiera o más de las composiciones descritas en la presente memoria, la Arthrospira puede ser cualquier especie adecuada, o mezcla de especies o variantes de Arthrospira incluyendo, pero sin limitación, A. 50 maxima. Ha de destacarse que Arthrospira y Spirulina son dos géneros separados. La separación entre estos dos géneros se ha afirmado repetidamente basándose en muchas características, incluyendo: helicidad y tamaño del tricoma, estructura de la pared celular y patrón de poros, vacuolas gaseosas, patrón de tilacoides, motilidad y fragmentación del tricoma, contenido de GC, catálogo oligonucleotídico de ARNr de 16S y mutaciones en el locus cpcB--cpcA. Véanse, por ejemplo, J. F. Manen y J. Falquet (2002) "The cpcB--cpcA locus as a tool for the genetic 55 'characterization of the genus Arthrospira (Cyanobacteria): evidence for horizontal transfer". International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology”, vol. 52, 861-867; y capítulo 1: “Morphology, Ultrastructure and Taxonomy
imagen3
of Arthrospira (Spirulina) Maxima and Arthrospira (Spirulina) Platensis” de Luisa Tomaselli, de “Spirulina platensis (Arthrospira): Physiology, Cell-biology and Biotechnology”. Taylor y Francis. Avigad Vonshak (Ed) 1997. Las composiciones descritas en esta memoria descriptiva excluyen las especies del género Spirulina.
La composición puede comprender filamentos intactos de Arthrospira, segmentos de los filamentos, segmentos
5 desestabilizados/lisados o extractos/fracciones de los mismos. La composición puede comprender Arthrospira que está viva o que no está viva. Preferiblemente, la composición comprende filamentos y segmentos de Arthrospira desestabilizados.
La composición a base de Arthrospira se puede preparar de cualquier manera adecuada, siempre que la actividad biocida no se vea comprometida. Normalmente, esto conllevaría las etapas de: (I) cultivar Arthrospira de cualquier
10 manera adecuada; (II) recoger la Arthrospira de cualquier manera adecuada; y (III) secar la Arthrospira de cualquier manera adecuada. Las etapas opcionales incluyen: estresar fisiológicamente adicionalmente la Arthrospira de cualquier modo adecuado, desestabilizar los filamentos y segmentos de cualquier modo adecuado, esterilizar el organismo de cualquier modo adecuado, decolorar la Arthrospira de cualquier modo adecuado, retirar o degradar la clorofila de cualquier modo adecuado, y moler la Arthrospira secada.
15 Algunas de las etapas anteriores se describen, por ejemplo, en las memorias descriptivas de las patentes de Nueva Zelanda nº 336620 y 336619. Por ejemplo, puede llevarse a cabo el estresado en el momento de la recogida privando a Arthrospira de nutrientes esenciales (disminución de nutrientes) o luz durante un periodo suficiente para estresarla pero no matarla controlando las condiciones de crecimiento. El estresado puede ser también por desecación parcial o recogiendo la Arthrospira y manteniéndola viva en condiciones húmedas hasta que se estrese
20 pero no muera. Por ejemplo, puede secarse por pulverización Arthrospira, formando un polvo fino de células desestabilizadas. El secado por pulverización puede tener lugar, por ejemplo, a 50-190 °C durante unos pocos segundos. Por ejemplo, el secado puede llevarse a cabo de cualquier modo adecuado incluyendo secado ciclónico, secado por bomba de calor, secado por tubo de calor, secado refractario o secado térmico a aproximadamente 67 ºC durante cortos periodos de tiempo. Por ejemplo, los filamentos pueden desestabilizarse usando molido o
25 descompresión explosiva como se describe en las patentes de Nueva Zelanda nº 328013 y nº 328740.
La concentración de Arthrospira en la composición puede variar dependiendo de la aplicación, por ejemplo, en cualquier punto de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 %. La composición puede incluir cualquier disolvente, portador, base, excipiente, carga, aglutinante, plastificante, emulsionante, estabilizante, lubricante, agente de tamponación, emoliente, agente solubilizante, agente de suspensión, espesantes, fragancia, colorante y
30 conservante adecuado.
Dependiendo del uso pretendido, la composición puede comprender adicionalmente uno o más principios activos no derivados de Arthrospira, tales como antimicrobianos (por ejemplo, bactericidas o antifúngicos), agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes curadores de heridas, esteroides) o nutrientes generales (por ejemplo, aminoácidos, vitaminas). Dichos principios activos son bien conocidos en la materia.
35 La composición puede estar en cualquier forma adecuada. La composición puede administrarse o aplicarse de cualquier modo adecuado. La composición puede ser un líquido, gel o sólido, o una mezcla de los mismos. La composición puede ser un cultivo líquido de Arthrospira que se aplica como pulverizador. Como alternativa, la composición puede ser un polvo que se distribuye uniformemente por un sitio diana por agitación o aplicación por soplado. El sujeto infectado o infestado puede sumergirse en un baño que contiene una forma líquida de la
40 composición. La composición y método de aplicación o administración pueden ser como se describe en las memorias descriptivas de las patentes de Nueva Zelanda nº 336620 y 336619.
Para uso terapéutico, la composición puede administrarse o aplicarse, por ejemplo, por vía oral, parenteral, por pulverizador de inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal o vaginal. La composición puede ser un comprimido, disolución, aerosol, pulverizador, crema, pomada, loción, emulsión, gel o polvo. La composición puede estar en
45 forma de vendaje, apósito, gasa adhesiva, supositorio, pesario o emplasto impregnado con Arthrospira.
Preferiblemente, el biocida es activo contra hongos, bacterias grampositivas, protozoos, virus, crustáceos, ácaros e insectos, y algunos de los cuales se analizan con más detalle más adelante.
Uso de Arthrospira estresada fisiológicamente como antifúngico
La Arthrospira fisiológicamente estresada puede usarse para tratar al menos los siguientes tipos de hongos: 50 Zygomycotina; Ascomycotina; Fungi imperfecti; Malassezia; Microsporum; Trichophyton y Epidermophyton.
Sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que la Arthrospira fisiológicamente estresada interacciona sinérgicamente con principios activos antifúngicos homologados (agentes fungiestáticos) proporcionando un amplio espectro superior de actividad antifúngica. Los inventores han encontrado que la Arthrospira estresada puede inhibir el crecimiento de hongos, matar hongos y prevenir el recrecimiento de hongos.
55 Uso de Arthrospira fisiológicamente estresada como un antibacteriano
imagen4
Los inventores han observado que la Arthrospira fisiológicamente estresada es un antibacteriano eficaz contra bacterias grampositivas. El modo de acción antibacteriano no se comprende completamente. Es posible que uno o más bioactivos de Arthrospira lisen o modifiquen de otra manera las paredes celulares de las bacterias
5 grampositivas. Las paredes celulares contienen péptidoglicano (que comprende N-acetilglucosamina y ácido Nacetilmurámico) y es posible que uno o más de los bioactivos puedan digerir el péptidoglicano.
Según la invención, también se proporciona la cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada tal como se ha descrito anteriormente, para uso en la prevención o tratamiento de una infección o infestación bacteriana del sujeto, o en la reparación o prevención de un defecto de la piel de un mamífero, en la que la
10 Arthrospira no se ha liofilizado.
Preferiblemente, el sujeto es un ser humano y la infección bacteriana está causada por Propionibacterium acnes.
Uso de Arthrospira fisiológicamente estresada como un pesticida
El pesticida puede estar dirigido a plagas tales como los crustáceos y ácaros. El pesticida se puede dirigir a insectos tales como las moscas (por ejemplo, Simulidae, moscas negras), avispas, mosquitos y termitas. El pesticida se
15 puede utilizar para detener la transmisión de parásitos, tales como los que causan la malaria, y otras enfermedades transmitidas por insectos.
Uso de Arthrospira como un agente terapéutico
Al usar Arthrospira fisiológicamente estresada como un biocida y/o agente terapéutico en la piel, los inventores han encontrado que uno o más de otros sustituyentes de Arthrospira interaccionan sinérgicamente con uno o más
20 agentes bioactivos, promoviendo la curación de la piel. Estos otros sustituyentes es probable que incluyan: βcaroteno, que proporciona nutrición a la piel; ficocianina, que es un antiinflamatorio; otras proteínas y otros nutrientes, incluyendo vitaminas, minerales, oligoelementos, antioxidantes, aceites esenciales y carbohidratos.
En primer lugar, la Arthrospira estresada inhibe o mata el microbio, ya sea un hongo, bacteria o virus y después otros sustituyentes de Arthrospira reparan el daño causado por el microbio.
25 Los presentes inventores han encontrado que la Arthrospira tiene cualidades terapéuticas incluso cuando no está fisiológicamente estresada, tal como en el tratamiento de afecciones cutáneas y en reparación cutánea.
El defecto cutáneo puede ser, por ejemplo, una cicatriz, daño por acné, rosácea, una zona enrojecida, una grieta, una quemadura, una ampolla, psoriasis, eccema, escamas, arrugas, una pápula, una estomatitis, una lesión, una pústula, una herida, costra láctea, dermatitis del pañal, una úlcera, una úlcera bucal, dermatitis del afeitado, varicela,
30 dermatitis, talones y codos agrietados. La composición se puede utilizar para tratar quemaduras, picaduras de insectos y mordeduras de animales, y para eliminar la inflamación de la piel. La composición se puede utilizar para reducir el picor de la piel. La composición se puede utilizar para reparar el tejido cicatricial, la piel dañada por el sol, y la piel seca y escamada que ha perdido su elasticidad.
Otros aspectos y realizaciones de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de 35 la misma.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la actividad de Arthrospira fisiológicamente estresada (AMYCOT® y polvo no procesado) sobre quitina evaluada por respirometría;
la Figura 2 muestra la actividad antifúngica de AMYCOT® sobre C. albicans;
40 la Figura 3 muestra la actividad antibacteriana de AMYCOT® sobre P. acnes evaluada por respirometría;
la Figura 4 muestra la actividad antifúngica de diferentes preparaciones comerciales de Arthrospira (Spirulina) sobre
T. rubrum;
la Figura 5 muestra la actividad antifúngica de una preparación comercial (Life Stream) de Arthrospira sobre A. niger;
la Figura 6 muestra la actividad antifúngica de AMYCOT® sobre M canis;lLa Figura 7 muestra la actividad 45 antifúngica de AMYCOT® sobre E. graminearum;
la Figura 8 muestra la actividad antifúngica de AMYCOT® sobre M. furfur;
la Figura 9a muestra la actividad antifúngica del champú AMYCOT® sobre T. rubrum;
imagen5
la Figura 9b muestra la actividad antifúngica del champú AMYCOT® sobre C. albicans; la Figura 10 muestra la actividad antifúngica de AMYCOT® sobre P. chartarum; la Figura 11 muestra la actividad antifúngica de AMYCOT® sobre B. cinerea; la Figura 12 muestra los resultados inhibidores de T. rubrum usando AMYCOT® y diversos principios activos
5 antifúngicos homologados;
la Figura 13 muestra los resultados inhibidores de T. mentagrophytes usando AMYCOT® y diversos principios activos homologados; la Figura 14 muestra los resultados inhibidores de C. albicans usando AMYCOT® y diversos principios activos
homologados;. 10 la Figura 15 muestra los resultados inhibidores de C. albicans usando un principio activo homologado;
la Figura 16 muestra los resultados inhibidores de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con un principio activo homologado y diversos principios activos homologados; la Figura 17 muestra los resultados inhibidores de C. albicans usando AMYCOT® en combinación con un principio
activo homologado y diversos principios activos homologados;
15 la Figura 18 muestra los resultados inhibidores de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con principios activos homologados; la Figura 19 muestra los resultados inhibidores de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con
principios activos homologados; la Figura 20 muestra los resultados inhibidores de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con un 20 principio activo homologado y diversos principios activos homologados;
la Figura 21 muestra los resultados inhibidores de C. albicans usando AMYCOT® en combinación con un principio activo homologado y diversos principios activos homologados; la Figura 22 muestra los resultados fungicidas de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con
principios activos homologados;
25 la Figura 23 muestra los resultados fungicidas de T. rubrum usando AMYCOT® en combinación con principios activos homologados; la Figura 24 muestra los resultados fungicidas de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con
principios activos homologados; la Figura 25 muestra los resultados fungicidas de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con 30 principios activos homologados;
la Figura 26 muestra los resultados fungicidas de T. mentagrophytes usando AMYCOT® en combinación con principios activos homologados; la Figura 27 muestra los resultados fungicidas de C. albicans usando AMYCOT® en combinación con un principio
activo homologado y diversos principios activos homologados; 35 la Figura 28 muestra los resultados fungicidas de T. rubrum usando AMYCOT® y principios activos homologados;
la Figura 29 muestra la actividad de Arthrospira fisiológicamente estresada (AMYCOT®) sobre quitina a diferentes temperaturas evaluada por respirometría; la Figura 30 muestra la actividad de Arthrospira fisiológicamente estresada (AMYCOT®) sobre quitina en diversas
condiciones de pH evaluada por respirometría;
40 la Figura 31 muestra la actividad antifúngica de Arthrospira sobre T. mentagrophytes; la Figura 32 muestra la actividad antifúngica de Arthrospira sobre T. rubrum; la Figura 33 muestra la actividad antifúngica de Arthrospira sobre M. fructicola; y la Figura 34 muestra la actividad antifúngica de "AMYCOT® potenciado" y "AMYCOT® original" sobre Alternaria sp.
imagen6
Mejor modo y otros modos para llevar a cabo la invención
Solo a modo de ilustración, se describen con detalle realizaciones preferidas de la presente invención, con referencia a la siguiente serie de ejemplos.
Ejemplo 1-Preparación de Arthrospira fisiológicamente estresada
5 Se estresó un cultivo de Arthrospira maxima (obtenible en Biovite Australia Pty Ltd) por disminución de nutrientes o desecación parcial. Se deshidrató la Arthrospira y se secó, formando un polvo “no procesado”. Se descomprimió explosivamente entonces la Arthrospira secada (se potenció) usando el método descrito en las patentes de Nueva Zelanda nº 328013 y nº 328740. Se rehidrató la Arthrospira, se decoloró, se secó y se molió, formando un “polvo de premezcla”. Se dispersó entonces el polvo de premezcla en un portador adecuado (por ejemplo, crema acuosa
10 comercialmente disponible de la Farmacopea británica o agua). Se hace referencia al polvo de premezcla como “polvo de premezcla de AMYCOT®".
Ejemplo 2-Caracterización de la actividad de Arthrospira estresada
Los resultados de la respirometría sugieren que la Arthrospira fisiológicamente estresada es capaz de modificar o lisar sustratos que comprenden quitina, quitosano y/o N-acetil-D-glucosamina.
15 Sustrato de quitina
Se hicieron reaccionar separadamente cantidades estándares de polvo de premezcla de AMYCOT® y el polvo no procesado con quitina BHD polimérica de cuatro unidades (Sigma, número de catálogo C7170) en un respirómetro Warburg usando técnicas estándares. Se mezcló cada composición junto con quitina y se midió a cantidad de gas desprendido. Se monitorizó la reacción durante 1 hora después de equilibrado durante 30 minutos. La misma 20 composición, pero hervida previamente en un baño de agua durante 5 minutos, no producía ningún gas, lo que sugería que la actividad podría ser enzimática y podría ser debida a uno o más tipos de proteínas desnaturalizables.
Se representan los resultados en la Figura 1. La tasa de actividad (presuntamente actividad enzimática) del polvo no procesado era de 694,9 ml/g de material celulosa/g de sustrato/hora. La tasa de actividad del polvo de premezcla de AMYCOT® era de 729,65 ml/g de material celular/g de sustrato/hora.
25 Se usó también la respirometría para identificar la temperatura óptima para la actividad. Se incubó polvo de premezcla de AMYCOT® (0,02 g y 0,06 g) con quitina (0,02 g) a 20 ºC, 30 ºC, 33 ºC y 40 ºC. Se incubó también polvo de premezcla de AMYCOT® basado en crema (0,05 g) con quitina (0,02 g) a esas temperaturas. Se representan los resultados en la Figura 29. Se determinó que la temperatura óptima para la actividad en cada caso era de 33 ºC.
30 Se usó también la respirometría para identificar el pH óptimo para la actividad. Se suspendió polvo de premezcla de AMYCOT® (0,02 g) en tampones de pH variable (60-70 % de etanol, 30-40 % de agua, 0-0,05 % de fenolftaleína, 00,03 % de azul de bromotimol, 0-0,02 % de sal de sodio de rojo de metilo, 0-0,01 % de hidróxido de sodio y 0-0,01 % de sal de sodio de naranja de metilo a pH 5, 7, 9 y 11) y se incubó con quitina (0,02 g) a 33 ºC. Se representan los resultados en la Figura 30. Se determinó que el pH óptimo para la actividad era de 6.
35 Estos resultados sugieren que el agente o agentes bioactivos deberían tener actividad cuando se apliquen tópicamente a la piel, ya que la piel tiene una temperatura y pH similares.
Sustratos de N-acetil-D-glucosamina y quitosano
Se incubó separadamente polvo de premezcla de AMYCOT® (0,02 g) con sustratos de N-acetil-D-glucosamina (0,02 g, número de catálogo Sigma A8625-5G) y quitosano (0,02 g, número de catálogo Sigma C3646) en un respirómetro
40 Warburg a 33 ºC. Se monitorizó cada reacción durante 1 hora después de equilibrado durante 30 minutos.
Se presentan los resultados para AMYCOT® más N-acetil-D-glucosamina en la tabla siguiente.
Tabla 1-AMYCOT® + N-acetil-D-glucosamina
Tiempo (min)
mm g de gas mm g de gas mm g de gas
0
0
0
0
5
9 6 7
10
12 9 11
30
12 10 11
Tabla 1-AMYCOT® + N-acetil-D-glucosamina
Tiempo (min)
mm g de gas mm g de gas mm g de gas
60
12 10 11
Se presentan los resultados para AMYCOT® más quitosano en la tabla siguiente.
Tabla 2-AMYCOT® + quitosano
Tiempo (min)
mm g de gas mm g de gas mm g de gas
0
0
0
0
5
12 10 10
10
14 12 14
30
17 13 15
60
17 14 16
Para comparación, se presentan los resultados para AMYCOT® (0,02 g) más quitina (0,02 g), incubados a 33 ºC, en la tabla siguiente.
Tabla 3-AMYCOT® + quitina
Tiempo (min)
mm g de gas mm g de gas mm g de gas
0
0
0
0
5
12 10 15
10
18 18 20
30
19 18 21
60
19 19 21
Estos resultados sugieren que la Arthrospira fisiológicamente estresada tiene uno o más agentes bioactivos que
5 lisan o modifican quitina, quitosano y/o N-acetil-D-glucosamina, o posiblemente otro tipo de polímero que tiene Nacetil-D-glucosamina como subunidad polimérica. El agente bioactivo puede ser, por ejemplo, una quitinasa, quitosanasa o quitina desacetilasa.
Ejemplo 3-Actividad antifúngica y antibacteriana de Arthrospira estresada
Se ensayó in vitro la actividad biocida de polvo de premezcla de AMYCOT® en hongos vivos y bacterias 10 grampositivas.
Se consiguieron cultivos vivos de los patógenos diana de la American Type Culture Collection (ATCC), la Australian Collection of Microorganisms (ACM) y Sullivan Niccolaides. Se muestran los cultivos que se ensayaron en la Tabla 4.
Tabla 4
Patógeno
Nº ATCC Nº ACM Aislamientos
Trichophyton mentagrophytes
4808, 9533 5068
Candida albicans
753 4574
Trichophyton rubrum
SN01 (Sullivan Niccolaides)
Epidermophyton floccosum
SN02 (Sullivan Niccolaides)
Tabla 4
Patógeno
Nº ATCC Nº ACM Aislamientos
Propionibacterium acnes
25746 5109
Se cultivó un césped uniforme de cada patógeno en un plato que contiene medio agar de dextrosa de patata (PDA). Después de 3-4 días de incubación, se cortaron cuatro pocillos en el medio de PDA con un taladracorchos estéril de 8 mm de diámetro. Se dispusieron en cada pocillo cantidades medidas de polvo de premezcla AMYCOT® y cremas/polvos de control. Se cultivaron los platos en condiciones apropiadas para el patógeno respectivo y se
5 inspeccionaron diariamente los discos.
Después de 2-4 días, resultaron evidentes dos zonas concéntricas alrededor del pocillo:
1. Una zona “de aclaramiento” circular transparente más pequeña alrededor del pocillo. Esta es el área donde se han destruido los hongos, dejando solo materia citoplásmica seca residual (como se observa por microscopía óptica y electrónica).
10 2. Una zona “afectada” semitransparente mayor que se extiende desde el perímetro de la zona de aclaramiento. La zona afectada se reconoce por la menor altura del césped, su menor densidad y mayor transparencia en comparación con césped no afectado. Este es un área donde las paredes de células fúngicas se han destruido en gran medida, pero algunas siguen presentes, a menudo como esferas citoplásmicas redondeadas (como se observa por microscopía óptica y electrónica).
15 Se toma la medida de las zonas desde el perímetro externo del pocillo hasta el perímetro externo de la zona de cada caso. Se hace referencia a esta medida como la distancia zonal (DZ). El radio de las zonas es una medida no lineal de la eficacia del agente o agentes biocidas contra el patógeno in vitro.
Se muestran en la Tabla 5 los resultados de control in vitro.
Tabla 5
Nº ACM
Patógeno Resultado Tamaño de la zona de aclaramiento (DZ) (mm) Tamaño de la zona afectada (mm)
5068
Trichophyton mentagrophytes Aclaramiento 6 10
4574
Aclaramiento 6,5 -
5109
Propionibacterium acnes (cultivado anaeróbicamente) Sin aclaramiento - -
Nº ATCC
4808
Trichophyton mentagrophytes Aclaramiento 5 8
9533
Trichophyton mentagrophytes Aclaramiento 6 10
753
Candica albicans Aclaramiento 6,5 -
25746
Propionibacterium acnes (cultivado anaeróbicamente) Sin aclaramiento - -
Nº de aislamiento
SN01
Tricophyton rubrum Aclaramiento 6 -
SN02
Epidermophyton floccosum Aclaramiento 5 8
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 5
Nº ACM
Patógeno Resultado Tamaño de la zona de aclaramiento (DZ) (mm) Tamaño de la zona afectada (mm)
301
Tinea pedisaislamiento Aclaramiento 6 10
307
Tiña cruralaislamiento Aclaramiento 6 10
La Figura 2 muestra el aclaramiento de Canada albicans (ACM 4574) usando AMYCOT®, que es prueba de la eficacia de uno o más agentes biocidas contra la afección candidiasis. El polvo de premezcla AMYCOT® está en la posición inferior y una “crema de ensayo humana” que tiene AMYCOT® al 12,5 % p/p en una crema acuosa, está en la posición superior (DZ de 9 mm).
En el caso de la bacteria anaeróbica causante de acné Propionibacterium acne, no se obtuvo aclaramiento cuando se ensayó en condiciones anaeróbicas. Se proporciona una explicación para esto en el ejemplo 4.
Ejemplo 4-Actividad antibacteriana de Arthrospira estresada sobre Propionibacterium acnes
La respirometría mostró que AMYCOT® tiene actividad antibacteriana contra P. acnes.
Se hicieron reaccionar separadamente el polvo de premezcla de AMYCOT® (0,02 g) y 5 g de "crema de ensayo humana” que comprende AMYCOT® al 12,5 % p/p con un caldo del organismo aneróbico causante de acné P. acnes (nº ACM 5109) en un respirómetro de Warburg en presencia o ausencia de oxígeno. Se compararon los resultados con aquellos de un control que comprende caldo de P. acnes desprovisto de AMYCOT®. En ausencia de oxígeno, no se liberó gas. En presencia de oxígeno, se liberó gas y cada composición tenía actividad antibacteriana.
Se representan en la Figura 3 los resultados para AMYCOT® y crema de ensayo humana en presencia de oxígeno. La tasa del polvo de premezcla AMYCOT® (presuntamente enzimática) era de 626,00 ml/g de material celular/g de sustrato/hora. La tasa de la crema de ensayo humana era de 12,00 ml/g de material celular/g de sustrato/hora.
Los resultados mostraban que, para que la composición funcione como antibacteriano sobre P. acnes in vivo, se requiere la presencia de oxígeno. Por lo tanto, al menos uno de los agentes biocidas puede ser una oxidasa.
Los inventores sospechan que uno o más de los agentes biocidas contra hongos puede lisar o modificar la pared celular de hongos. Dicho agente puede ser una quitinasa, quitosanasa o quitina desacetilasa.
Aunque no se cree que P. acnes y otras bacterias grampositivas tengan quitina ni quitosano en sus paredes celulares, se sospecha que uno o más agentes biocidas lisan o modifican N-acetil-D-glucosamina/peptidoglicanos en la pared de la célula bacteriana.
Ejemplo 5-Diferentes fuentes comerciales de Arthrospira tienen actividad antifúngica
Se consiguieron preparaciones comerciales de Arthrospira secada (polvos y cápsulas) de diferentes suministradores en diferentes jurisdicciones y se ensayó la actividad antifúngica. Los polvos se preparan típicamente recogiendo Arthrospira, lavando la Arthrospira recogida y secando la Arthrospira lavada. Algunos suministradores muelen la Arthrospira en húmedo. La preparación no conlleva la etapa de estresar específicamente a Arthrospira después de la recogida de modo que la Arthrospira entre en estado anabiótico. De hecho, como se menciona anteriormente, los cultivadores comerciales de Arthrospira tienden a minimizar el estresado del organismo lo más posible ya que el recubrimiento mucoide espeso tiende a obstruir la maquinaria para el procesamiento del organismo.
Se obtuvieron polvos de Arthrospira (Spirulina) de los siguientes suministradores:
1.
China Spirulina-Jiangsu Cibainian Nutrition Food Co., Ltd. China
2.
Febico -Far East Biotech Co. Ltd. Taiwán
3.
Life Stream/Earthrise -DIC. California, EE.UU.
4.
Pacifica -Cyanotech. Hawaii, EE.UU.
5.
Siam Algae Co. -DIC. Tailandia
6.
Spirin -Yunnan Spirin Co. Ltd. China
5
10
15
20
25
30
35
40
45
7. Synergy -DIC. China
Se mezcló cada polvo en una crema acuosa usando una concentración de 12,5 % p/p. Se decoloró entonces cada crema. Se cultivó un césped uniforme de T. rubrum sobre medio PDA en un plato. Después de 3-4 días de incubación, se cortaron pocillos en el medio PDA con un taladracorchos estéril. Se dispusieron cantidades medidas de cada crema en el pocillo respectivo y se incubaron entonces los platos durante 2-4 días.
La Figura 4 muestra las actividades antifúngicas de Siam Algae Co. al 12,5 % p/p (posición derecha), Life Stream al 12,5 % p/p (posición inferior) y China Spirulina al 12,5 % p/p (posición izquierda).
Los resultados mostraban que todos los polvos comerciales ensayados tenían cierta actividad antifúngica. La respirometría confirmó que todos los polvos comerciales ensayados tenían también actividad (presuntamente enzimática) cuando se incubaban con quitina (resultados no mostrados).
Se seleccionó aleatoriamente un polvo (Life Stream) para mezclar con una crema acuosa sin receta a una concentración de 12,5 % p/p sin procesamiento adicional y se ensayó la actividad antifúngica contra Aspergillus niger. La crema produjo un aclaramiento de 4 mm, como se observa en la Figura 5 en las posiciones superior, derecha, inferior e izquierda. Esto indicaba que posiblemente todas las preparaciones comerciales de Arthrospira secada era probable que tuvieran el mismo nivel de actividad antifúngica, sin requerir una etapa de estresado adicional o etapa de procesamiento adicional tal como la desestabilización de filamentos.
Ejemplo 6-Actividad de Arthrospira estresada contra enfermedades fúngicas de mamíferos
Se ensayó la actividad antifúngica de AMYCOT® in vitro contra diferentes enfermedades fúngicas de mamíferos. Se consiguieron los siguientes patógenos del Departamento de industrias primarias, el Departamento de Agricultura, ACM y viveros:
 Candida albicans
 Microsporum canis
 Trichophyton mentagrophytes
 Trichophyton rubrum
 Epidermophyton floccosum
 Fusarium graminearum
 Alternaria sp
 Malassezia furfur
Se cultivó un césped uniforme de cada patógeno en medio PDA. Después de 1-2 días de incubación, se cortaron pocillos en el medio PDA con un taladracorchos estéril de 8 mm de diámetro. Se dispusieron cantidades medidas de AMYCOT® en cada pocillo. Se cultivaron los platos a una temperatura apropiada dependiendo del patógeno. Se inspeccionaron diariamente los platos con pocillos. Se midió el aclaramiento después de 2-3 días. Se toma la medida de la zona desde el perímetro del pocillo al perímetro exterior de la zona.
Esta zona estaba vacía de células fúngicas vivas, probando la eficacia de AMYCOT® contra los patógenos diana.
La crema con AMYCOT® al 12,5% p/p producía un aclaramiento de 8 mm del patógeno T. rubrum. T. rubrum es el agente causal de infecciones de pezuña y tiña corporal.
La crema con AMYCOT® al 12,5% p/p producía un aclaramiento de 15 mm del patógeno T. mentagrophytes. T. mentagrophytes es el agente causal de infecciones de pezuña y tiña corporal.
La Figura 6 muestra que un pocillo de crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producía un aclaramiento de 3 mm del patógeno M. canis. M. canis es el agente causal de infecciones de pezuña y tiña corporal.
La crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producía un aclaramiento de 3 mm del patógeno E. floccosum. E. floccosum es el agente causal de infecciones de pezuña y tiña corporal.
La crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producía un aclaramiento de 4,5 mm del patógeno C. albicans. C. albicans es el agente causal de tiña corporal y dermatitis.
La Figura 7 muestra que un pocillo de crema con AMYCOT® al 12,5% p/p producía un aclaramiento de 12 mm del patógeno F. graminearum. F. graminearum es el agente causal de infecciones de pezuña.
imagen7
La Figura 8 muestra que los pocillos de crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producían aclaramientos de M. furfur.
M. furfur es el agente causal de la caspa.
La Figura 9a muestra que un pocillo de champú con AMYCOT® al 5 % producía un aclaramiento de 3 mm del patógeno T. rubrum.
5 La Figura 9b muestra que un pocillo de champú con AMYCOT® al 5 % p/p producía un aclaramiento de 20 mm del patógeno C. albicans.
Ejemplo 7 – Actividad de Arthrospira estresada contra enfermedades fúngicas de las plantas
Se ensayó la actividad antifúngica de AMYCOT® in vitro contra diferentes actividades fúngicas de plantas. Se consiguieron los siguientes patógenos del Departamento de industrias primarias, Departamento de agricultura, ACM 10 y viveros:
 Fusarium graminearum  Pithomyces chartarum  Botrytis cinerea  Alternaria sp.
15 Se cultivó un césped uniforme de cada patógeno en medio PDA. Después de 1-2 días de incubación, se cortaron pocillos en el medio PDA con un taladracorchos estéril de 8 mm de diámetro. Se dispusieron cantidades medidas de AMYCOT® en cada pocillo. Se cultivaron los platos a una temperatura apropiada dependiendo del patógeno. Se inspeccionaron diariamente los platos con pocillos.
Se midió el aclaramiento después de 2-3 días. Se toma la medida de la zona desde el perímetro del pocillo al 20 perímetro exterior de la zona.
La zona estaba vacía de células fúngicas vivas, probando la eficacia de AMYCOT® contra los patógenos diana.
La crema con AMYCOT al 12,5% p/p producía un aclaramiento de 13 mm del patógeno F. graminearum. F. graminearum es el agente causal de tizón de espiga y pudrición de corona en granos pequeños.
La Figura 10 muestra que un pocillo de crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producía un aclaramiento de 10 mm del 25 patógeno P. chartarum. P. chartarum es el agente causal de eccema facial en ganado ovino.
La crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producía un aclaramiento de 8 mm del patógeno B. cinerea. B. cinerea es el agente causal de botritis en la fruta.
La crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p producía un aclaramiento de 9 mm del patógeno Alternaria sp, el agente causal de mancha de la hoja en la fruta.
30 Ejemplo 8-Ensayo de AMYCOT® como pulverizador sobre patógenos fúngicos vegetales
Se ensayó AMYCOT® en forma de pulverizador antifúngico in vitro contra un patógeno vegetal común, Botrytis cinerea. Se hidrató polvo AMYCOT® al 5 % p/p con agua, pero era solo escasamente soluble.
Se cultivó un césped uniforme de B. cinerea en medio PDA en un plato. Se pulverizó entonces el lado derecho del plato con el pulverizador y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 24 horas. El lado izquierdo del plato no 35 se pulverizó. La Figura 11 muestra que el lado pulverizado del plato tenía hongos muertos. El pulverizador era eficaz para eliminar botritis e inhibir la esporulación adicional.
Ejemplo 9-Ensayos antimicrobianos in vitro con Arthrospira estresada y principios activos homologados
Se ensayaron las actividades antifúngicas y antibacterianas de diversas cremas antifúngicas y antibacterianas sin receta (incluyendo Lamisil™, Dakta Gold™, Canesten™, Tinaderm™, Daktarin™, Tripod Labs™, Resolve Tinea™, 40 Resolve Balm™, Resolve Plus™, Clearasil™, Benzac W™) y AMYCOT® en este y otros ejemplos.
En este ejemplo, se ensayaron las actividades antifúngica y antibacteriana de diversas cremas sin receta y AMYCOT® por un laboratorio independiente (ConMac Laboratory Services) contra los patógenos diana Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum y Propionibacterium acnes.
imagen8
Se muestran los resultados en la Tabla 6
Tabla 6
Patógeno diana
Crema de ensayo Día de aclaramiento 1 Día de aclaramiento 2 Día de aclaramiento 3
Trichophyton mentagrophytes
1) control Nada detectado Nada detectado Nada detectado
2) Amycot®
0,5-1 mm no aclarado redondeado 4 mm no aclarado redondeado 1-2 mm aclarado redondeado, 3-4 mm no aclarado redondeado
3) Lamisil
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
4) Dakta Gold
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
Epidermophyton floccosum
1) Control Nada detectado Nada detectado Nada detectado
2) Amycot®
1 mm aclarado redondeado 2,5 mm aclarado redondeado 2,5 mm aclarado redondeado, 5 mm no aclarado redondeado
3) Canesten
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
4) Lamisil
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
Trichophyton rubrum
1) Control Nada detectado Nada detectado Nada detectado
2) Amycot®
1 mm aclarado redondeado 5,5 mm aclarado redondeado 5,5 mm aclarado redondeado, 4 m no aclarado redondeado
3) Tinaderm
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
4) Lamisil
Nada detectado 1 mm aclarado irregular 1,5 mm aclarado irregular
Propionibacterium acnes
1) Control Nada detectado Nada detectado Nada detectado
2) Amycot®
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
3) Clearasil
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
4) Benzac W
Nada detectado Nada detectado Nada detectado
Los resultados muestran que solo AMYCOT® era activo contra cada patógeno. El único otro ejemplo de crema que muestra actividad era Lamisil™ contra T. rubrum.
Ejemplo 10-Ensayos in vitro con principios activos homologados y combinaciones con AMYCOT®
5 Los antifúngicos tales como miconazol, tolnaftato, bifonazol y coltrimazol funcionan inhibiendo la producción de proteína, evitando funciones normales tales como la reproducción. La terbinafina antifúngica funciona evitando la formación de esteroles vitales.
El primer objetivo de estos ensayos in vitro era determinar las eficacias de diversas cremas sin receta o sus principios activos como inhibidores fúngicos y comparar con la eficacia de AMYCOT®. El segundo objetivo era
10 determinar la eficacia de AMYCOT® en combinación con una o más cremas sin receta o sus principios activos como inhibidores fúngicos.
Se inoculó medio líquido de Sabouraud con el patógeno elegido. Se incubaron los caldos durante 1 semana a 28 ºC. Se sumergió una torunda estéril en caldo de patógeno y se inoculó una placa de medio PDA por estriado de la placa a ángulos rectos, asegurando que la placa tenía un césped uniforme,
15 Los principios activos homologados todavía no en base de crema se mezclaron con una base de crema respectiva.
Se dispuso la crema seleccionada sobre un disco de papel de filtro de 10 mm de diámetro y se dispuso el disco sobre una placa recién inoculada. Se dispusieron hasta 4 discos diferentes sobre una placa. Se incubó entonces la
placa durante 24-48 horas a la temperatura apropiada, dependiendo del patógeno. Se tomaron entonces fotos al término de las 24-48 horas.
Se muestran los resultados del ensayo inhibidor en las Figuras 12-21 y en las Tablas 7-16 siguientes.
Tabla 7-Ensayo inhibidor (Figura 12) Patógeno: Trichophyton rubrum
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 8
Derecha
Tinaderm (tolnaftato al 2 %) 0
Inferior
Placebo 0
Izquierda
Daktarin (miconazol al 2 %) 15
Tabla 8-Ensayo inhibidor (Figura 13) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 4
Derecha
Tinaderm (tolnaftato al 2 %) 1
Inferior
Placebo 0
Izquierda
Daktarin (miconazol al 2 %) Tabla 9-Ensayo inhibidor (Figu 11 ra 14)
Posición
Patógeno: Candida albicans Agente Tamaño del
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % aclaramiento (mm) 2
Derecha
Tinaderm (tolnaftato al 2 %) 3
Inferior
Placebo 0
Izquierda
Daktarin (miconazol al 2 %) 15
Tabla 10-Ensayo inhibidor (Figu
ra 15)
Patógeno: Candida albicans Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Tripod Labs (clotrimazol al 1% + aceite de árbol del té)
10
imagen9
Tabla 11-Ensayo inhibidor (Figura 16) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
50 % de crema con AMYCOT® al 12,5 % + 50 % de Daktarin (miconazol al 2 %) 10
Derecha
Resolve Tinea (miconazol al 2 %) 10
Inferior
Resolve Balm (miconazol al 2 %) 7
Izquierda
Resolve Plus (miconazol al 2 %) 11
Tabla 12-Ensayo inhibidor (Figura 17) Patógeno: Candida albicans
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
AMYCOT® + Daktarin 10
Derecha
Resolve Tinea (miconazol al 2 %) 6
Inferior
Resolve Balm (miconazol al 2 %) 7
Izquierda
Resolve Plus (miconazol al 2 %) 11
Tabla 13-Ensayo inhibidor (Figura 18) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 1
Derecha
AMYCOT® al 12 % + clotrimazol al 10 % 13
Inferior
AMYCOT® al 12 % + terbinafina al 1 % 1
Izquierda
AMYCOT® al 12 % + tolnaftato al 10 %
Tabla 14-Ensayo inhibidor (Figura 19) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 1
Derecha
AMYCOT® al 12 % + 10 % de clotrimazol 11
Inferior
AMYCOT® al 12 % + terbinafina al 1 % 2
Izquierda
AMYCOT® al 12 % + tolnaftato al 10 % 4
imagen10
Tabla 15-Ensayo inhibidor (Figura 20) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + miconazol al 2 % 11
Derecha
Placebo 0
Inferior
Resolve Balm (miconazol al 2 %) 7
Izquierda
Resolve Plus (miconazol al 2 %) 7
Tabla 16-Ensayo inhibidor (Figura 21) Patógeno: Candida albicans
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
50 % de crema con AMYCOT® al 12,5 % + 50 % de Daktarin (miconazol al 2 %) 14
Derecha
Clotrimazol al 1 % 4
Inferior
Tolnaftato al 10 % 0
Izquierda
Miconazol al 2 % 9
Los principios activos homologados de la Figura 21 están en una base de crema acuosa en contraposición a la base 5 alcohólica que se usa normalmente.
En los ensayos in vitro, se observó que miconazol y clotrimazol eran los inhibidores más eficaces de hongos patológicos (véanse las Figuras 12-21). Las Figuras 16 y 17 y las Tablas 11 y 12 establecen que el miconazol es un inhibidor fúngico eficaz. AMYCOT® actúa también como inhibidor, pero es solo aproximadamente un 40 % tan eficaz como clotrimazol y miconazol (véanse las Figuras 12-14). Las Figuras 18-21 y las Tablas 13-16 sugieren que las
10 combinaciones de AMYCOT® más miconazol y AMYCOT® más clotrimazol son los inhibidores fúngicos más eficaces in vitro cuando se comparan con terbinafina y tolnaftato.
El tercer objetivo de estos ensayos in vitro era determinar las eficacias de diversas cremas sin receta o sus principios activos como fungicidas y comparar con la eficacia de AMYCOT®. El cuarto objetivo era determinar la eficacia de AMYCOT® en combinación con principios activos homologados.
15 El ensayo fungicida implicaba cultivar un césped del patógeno sobre placas de medio PDA durante un periodo de 23 días y exponer entonces el patógeno maduro a los antifúngicos. Esto se hizo cortando pocillos en el agar con césped, retirando el agar y rellenando los pocillos con crema.
Se muestran los resultados del ensayo fungicida en las Figuras 22-28 y las Tablas 17-23 siguientes.
Tabla 17-Ensayo inhibidor (Figura 22) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 6
Derecha
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + terbinafina al 1 % 6
Inferior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % tolnaftato al 10 % 6
Izquierda
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + clotrimazol al 10 % 5
Tabla 18-Ensayo inhibidor (Figura 23) Patógeno: Trichophyton rubrum
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 9
Derecha
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + clotrimazol al 10 % 7
Inferior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + miconazol al 1 % 8
Izquierda
Placebo 0
Tabla 19-Ensayo inhibidor (Figura 24) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 6
Derecha
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + terbinafina al 1 % 5
Inferior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % tolnaftato al 10 % 5
Izquierda
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + clotrimazol al 10 % 4
Tabla 20-Ensayo inhibidor (Figura 25) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 8
Derecha
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + terbinafina al 1 % 7
Inferior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % tolnaftato al 10 % 5
Izquierda
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + clotrimazol al 10 % 4
Tabla 21-Ensayo inhibidor (Figura 26) Patógeno: Trichophyton mentagrophytes
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 9
Derecha
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + terbinafina al 1 % 4
Inferior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % tolnaftato al 10 % 5
Izquierda
Crema con AMYCOT® al 12,5 % + clotrimazol al 10 % 5
Tabla 22-Ensayo inhibidor (Figura 27) Patógeno: Candida albicans
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 8
Derecha
Daktarin (miconazol al 2 %) 0
Inferior
Canesten (clotrimazol al 1 %) 0
Izquierda
AMYCOT® al 12 % + clotrimazol al 1 % 5
Tabla 23-Ensayo inhibidor (Figura 28) Patógeno: Trichophyton rubrum
Posición
Agente Tamaño del aclaramiento (mm)
Superior
Crema con AMYCOT® al 12,5 % 6
Derecha
Clotrimazol al 10 % 0
Inferior
Tolnaftato al 10 % 0
Izquierda
Miconazol al 2% 0
Los principios activos homologados de la Figura 28 están en una base de crema acuosa en contraposición a la base 5 alcohólica que se usa normalmente.
Los resultados apoyan que los presentes antifúngicos sin receta y principios activos homologados son agentes fungiestáticos y no fungicidas. Las Figuras 22-28 y las Tablas 17-23 demuestran que AMYCOT® es un fungicida eficaz, incluso cuando se combina con principios activos homologados.
La combinación de AMYCOT® con miconazol o clotrimazol no reducía en gran medida las eficacias de ninguno. La
10 combinación aumentaba el efecto inhibidor (véanse las Figuras 17-21). Esto creaba un producto de espectro amplio muy eficaz.
La combinación de AMYCOT® con clotrimazol inhibía ligeramente la actividad antifúngica de AMYCOT® (véanse las Figuras 22-28), pero la combinación de AMYCOT® con miconazol no tenía grandes efectos perjudiciales sobre la actividad inhibidora o fungicida de la crema de combinación (véanse las Figuras 17-26).
15 La crema de combinación de AMYCOT® y miconazol era más eficaz como producto de amplio espectro que cualquiera de ellos debido a la naturaleza inhibidora de miconazol y las actividades tanto inhibidora como fungicida de AMYCOT®.
La crema de combinación actuaba como inhibidor y “se mantenía firme”, mientras que los aclaramientos conseguidos con miconazol solo resultaban invadidos por el recrecimiento como en el caso del patógeno T.
20 mentagrophytes (véase la Figura 20).
Se encontró también que la crema de combinación de AMYCOT® y miconazol al 2 % limitaba el recrecimiento del patógeno después realizar el aclaramiento alrededor de los pocillos.
Ejemplo 11-Ensayos de Arthrospira sobre diversas afecciones cutáneas
Un sujeto tenía pie de atleta avanzado, con lesiones profundas entre los dedos. El sujeto reseñó que el picor
25 causado por el hongo paró al cabo de 15 minutos de la primera aplicación de crema con AMYCOT® al 12,5 % p/p. La inflamación se redujo, y en algunos casos desapareció completamente en 12 horas. Las lesiones empezaron a cerrarse al cabo de 24 horas y curaron completamente al cabo de 4-5 días.
Se repitieron estas observaciones en el caso de acné, con sujetos que registraron que la inflamación desaparecía y su piel volvía al color normal y se volvía suave y flexible como piel nueva. Las pústulas se secaban también.
30 Es creencia de los inventores que uno o más agentes biocidas (por ejemplo, quitinasa, quitosanasa, quitina desacetilasa) interaccionan sinérgicamente con otros componentes de Arthrospira, dando lugar a los efectos terapéuticos. El picor en las infecciones fúngicas es una indicación de la liberación de enzimas digestivas o metabolitos de los hongos. Una vez se desestabiliza el metabolismo fúngico normal a medida que se desestabiliza la pared celular, cesa el picor.
imagen11
Se obtuvieron resultados similares cuando se usó la crema para afecciones no relacionadas con hongos, en talones y codos secos y agrietados, rosácea, eccema, piel dañada por el sol y psoriasis. Los sujetos reseñaron un alivio casi 5 inmediato del picor en la dermatitis.
Ejemplo 12-Actividad antifúngica de Arthrospira estresada usando polvo “no procesado”
El ejemplo 5 apoyaba que las preparaciones comerciales de Arthrospira secada era probable que tuvieran cierto nivel de actividad antifúngica sin requerir una etapa de estrés adicional o etapa de procesamiento después de la recogida tal como desestabilización de filamento. El ejemplo 12 apoya adicionalmente este hallazgo.
10 Se consiguió una preparación secada de Arthrospira maxima de un cultivador comercial. Se mezcló la preparación con una crema acuosa sin receta a una concentración de 12,5 % p/p sin procesamiento adicional, y se ensayó la actividad antifúngica contra T. mentagrophytes, T. rubrum y M. fructicola (como se describe en el ejemplo 5).
Como se observa en la Figura 31, la crema producía un aclaramiento contra T. mentagrophytes en las posiciones superior, derecha, inferior e izquierda.
15 Como se observa en la Figura 32, la crema producía un aclaramiento contra T. rubrum en la posición inferior.
Como se observa en la Figura 33, la crema producía un aclaramiento contra M. fructicola en la posición inferior.
Estos hallazgos apoyan que las etapas después de la recogida tales como descompresión explosiva, liofilización, decoloración y molido no tienen que llevarse a cabo para producir Arthrospira con actividad fungicida.
Ejemplo 13-Actividad antifúngica de Arthrospira no descomprimida explosivamente
20 Este ejemplo apoya adicionalmente que no se requiere la etapa después de la recogida de descompresión explosiva (potenciación) para producir Arthrospira con actividad fungicida.
Se consiguió una preparación seca de Arthrospira maxima de un cultivador comercial. En un caso, se desestabilizó la Arthrospira secada por descompresión explosiva (se potenció) usando el método descrito en las patentes de Nueva Zelanda nº 328013 y nº 328740. Se rehidrató Arthrospira, se decoloró y se molió, formando un “polvo de
25 premezcla” seco. Se suspendió entonces el polvo de premezcla en un portador adecuado (al 12,5 %) y se hará referencia como “AMYCOT® potenciado”.
En otro caso, la preparación excluía el método de descompresión explosiva descrito en las patentes de Nueva Zelanda nº 328013 y nº 328740, y se hará referencia a esta preparación como “AMYCOT® original”.
Como se observa en la Figura 34, tanto “AMYCOT® original” como “AMYCOT® potenciado” producían
30 aclaramientos casi iguales contra Alternaria sp. en la posiciones superior e inferior, respectivamente. Por ello, la descompresión explosiva no es una etapa después de la recogida esencial para producir Arthrospira con actividad fungicida.
El término “comprender” y variantes del término tales como “comprende” o “comprendiendo” se usan en la presente memoria para designar la inclusión de un entero indicado o enteros indicados pero no para excluir cualquier otro
35 entero o cualesquiera otros enteros, a menos que el contexto o el uso requieran una interpretación exclusiva del término.
Cualquier referencia a publicaciones citadas en la presente memoria no es una admisión de que las divulgaciones constituyan conocimiento general común en Australia.

Claims (10)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un método para preparar una composición biocida para uso tópico en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:
    1) estresar fisiológicamente Arthrospira, por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o retirando hasta un 5 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira; y
    2) combinar una cantidad biocida eficaz de la Arthrospira estresada de (1) con un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para administración tópica al sujeto, en el que la cantidad biocida eficaz es eficaz frente a bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero; y
    en la que la Arthrospira no se ha liofilizado.
    10 2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa de estresado fisiológico de Arthrospira comprende retirar hasta un 80% del líquido en el que está creciendo la Arthrospira y la etapa (2) está precedida por las etapas (1a) y (1b) como sigue:
    (1a) lavado de la Arthrospira estresada para retirar contaminantes; y
    (1b) secado de la Arthrospira lavada.
    15 3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el portador, disolvente, base o excipiente adecuado para la administración tópica al sujeto es un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para la administración tópica a un ser humano, un animal, un producto agrícola u hortícola, suelo, una estructura artificial o una vía acuática.
  2. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el defecto de la piel se selecciona del grupo
    20 consistente en daño por acné, rosácea, un área enrojecida, una grieta, una quemadura, una ampolla, psoriasis, eccema, escamas, arrugas, una pápula, una lesión, una pústula, una herida, costra láctea, dermatitis del pañal, una úlcera, una úlcera bucal, dermatitis del afeitado, dermatitis, y talones y codos agrietados.
  3. 5. Una composición biocida que comprende una cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada, en la que el estresado fisiológico se consigue por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o retirando hasta un
    25 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira, y un portador, disolvente, base o excipiente adecuado para la administración tópica a un sujeto, en la que la cantidad biocida eficaz es eficaz contra bacterias del sujeto o defectos de la piel de un mamífero; y donde la Arthrospira no está liofilizada.
  4. 6. La composición biocida de la reivindicación 5, en la que el sujeto es un ser humano, un animal, un producto agrícola u hortícola, suelo, una estructura artificial o una vía acuática, y donde el mamífero es un ser humano.
    30 7. La composición biocida tópica de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, donde el defecto de la piel se selecciona del grupo consistente en daño por acné, rosácea, un área enrojecida, una grieta, una quemadura, una ampolla, psoriasis, eccema, escamas, arrugas, una pápula, una lesión, una pústula, una herida, costra láctea, dermatitis del pañal, una úlcera, una úlcera bucal, dermatitis del afeitado, dermatitis, y talones y codos agrietados.
  5. 8. Una cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada, en la que el estresado fisiológico se
    35 consigue por falta de nutrientes o luz, por deshidratación o retirando hasta un 80% del líquido en el que se está cultivando la Arthrospira, y un portador, disolvente, base o excipiente para la administración tópica a un sujeto, para uso en la prevención o el tratamiento de una infección o infestación bacteriana del sujeto, o en la reparación o la prevención de un defecto de la piel de un mamífero; en la que la Arthrospira no está liofilizada.
  6. 9. La cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada, no liofilizada para los usos según la
    40 reivindicación 8, en los que en el uso para prevenir o tratar una infección o infestación bacteriana de un sujeto, el sujeto es un ser humano, un animal, un producto agrícola u hortícola, suelo, una estructura artificial o una vía acuática, y en los que, en el uso de reparación o prevención de un defecto de la piel de un mamífero, el mamífero es un ser humano.
  7. 10. La cantidad biocida eficaz de Arthrospira estresada fisiológicamente, no liofilizada, para los usos según la
    45 reivindicación 8 o la reivindicación 9, en los que el sujeto es un ser humano y la infección bacteriana está causada por Propionibacterium acnes.
  8. 11. La cantidad biocida eficaz de Arthrospira estresada fisiológicamente, no liofilizada para los usos según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, para la reparación o prevención de un defecto de la piel del mamífero,
    20
    imagen2
    preferiblemente del ser humano, en los que el defecto de la piel se selecciona del grupo consistente en daño por acné, rosácea, un área enrojecida, una grieta, una quemadura, una ampolla, psoriasis, eccema, escamas, arrugas, una pápula, una lesión, una pústula, una herida, costra láctea, dermatitis del pañal, una úlcera, una úlcera bucal, dermatitis del afeitado, dermatitis, y talones y codos agrietados.
    5 12. La cantidad biocida eficaz de Arthrospira estresada fisiológicamente, no liofilizada para los usos según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que Arthrospira es A. maxima.
  9. 13. La composición biocida tópica que comprende una cantidad biocida eficaz de Arthrospira fisiológicamente estresada, no liofilizada de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que Arthrospira es A. maxima.
  10. 14. El método para preparar una composición biocida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que 10 Arthrospira es A. maxima.
    21
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