ES2640215T3 - Procedimiento para la purificación a escala industrial de gammaglobulinas a partir de plasma humano para aplicaciones industriales - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la producción de gammaglobulinas para administración intravenosa (IVIG), empleando, como material de partida, plasma humano o una fracción plasmática intermedia enriquecida en gammaglobulinas (IgG), comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas cromatográficas: una primera etapa cromatográfica, que consiste en una etapa de "captura" de IgG, realizada sobre un intercambiador catiónico fuerte, y una segunda etapa cromatográfica, que consiste en una etapa de "pulido", realizada sobre un intercambiador aniónico fuerte; en el que el intercambiador catiónico fuerte pertenece a la categoría de un intercambiador fuerte caracterizado por un grupo funcional SO3 -; y en el que el intercambiador aniónico fuerte tiene grupos de amonio cuaternario como grupos intercambiadores; en el que entre las dos etapas cromatográficas se realiza al menos una etapa de inactivación de virus realizada mediante un tratamiento con disolvente-detergente; en el que posteriormente, después de la segunda etapa cromatográfica, la solución que contiene IVIG se somete a una etapa de eliminación de virus mediante nanofiltración; en el que el intercambiador catiónico fuerte se carga con 20-60 mg de IgG/ml de resina y en el que las etapas de acondicionamiento, de carga y de lavado, se realizan empleando un tampón a 25- 75 mM a un pH 5,4-5,7 mientras que la elución se realiza utilizando un tampón que tiene una concentración de cloruro de sodio de 0,25-1 M; en el que el intercambiador aniónico fuerte se carga con 20-60 mg de proteína/ml de resina y en el que las etapas de acondicionamiento, de carga y de lavado, se realizan empleando un tampón a 10-30 mM, pH 9,0 ± 0,5, NaCl 8- 10 mM mientras que la elución se realiza o utilizando una fuerza iónica aumentada o mediante una variación de pH; cuando la elución se realiza utilizando una fuerza iónica aumentada, se emplea un tampón que tiene una conductividad de 9,5-10,5 mS/cm y un pH de 9,0 ± 0,5; cuando la elución se realiza mediante una variación de pH, se emplea un tampón que tiene la conductividad de 1-1,5 mS/cm y un pH de 6-7.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para la purificacion a escala industrial de gammaglobulinas a partir de plasma humano para aplicaciones industriales

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere al campo de los derivados plasmaticos, y en particular, a las inmunoglobulinas (IgG), y especificamente, a un procedimiento para la produccion de gammaglobulinas para administracion intravenosa (IVIG).

Estado de la tecnica

[0002] Las IVIG son el derivado plasmatico con mayor demanda en el mercado mundial: en 2008 el mercado de las IVIG alcanzo aproximadamente 82 toneladas metricas (incluyendo 37 en los Estados Unidos, 21 en Europa y 17 en Asia) con una tendencia a crecer a una tasa de aproximadamente 7 % al ano (la demanda prevista para 2012 es de 108 t).

[0003] Las IVIG se utilizan en diversas aplicaciones clinicas para el tratamiento de inmunodeficiencias primarias o adquiridas, y para tratar enfermedades infecciosas y autoinmunitarias. Tambien ha habido un notable aumento en el numero de estudios centrados en otros usos terapeuticos de las IVIG.

[0004] La disminucion de las reacciones adversas, gracias a la mayor tolerabilidad de las IVIG disponibles en el mercado, ha ampliado las aplicaciones terapeuticas de las IVIG y, en consecuencia, han llevado a un uso creciente de este derivado plasmatico. Sin embargo, la mayor demanda de este medicamento a menudo no se satisface debido a su inadecuada disponibilidad en el mercado.

[0005] El procedimiento industrial normalmente utilizado para purificar IgG es una version modificada y optimizada del metodo original ideado por Cohn, que se remonta a la decada de 1940 y se basa en la precipitacion fraccionada en frio de proteinas plasmaticas. Despues de adiciones progresivas de etanol en condiciones controladas de fuerza ionica, pH y temperatura, este procedimiento de fraccionamiento de plasma obtiene fracciones enriquecidas o concentradas de proteinas para aplicaciones terapeuticas (factores de coagulacion, albumina, inmunoglobulina, antitrombina III). Aplicando el fraccionamiento de Cohn, las IgG se obtienen a partir de las fracciones II + III.

[0006] La limitada disponibilidad de las IVIG en el mercado mundial refleja los bajos rendimientos (promedio de 3,54,2 g de IgG por kg de plasma) de los procedimientos de produccion actualmente utilizados, que son versiones modificadas y optimizadas del metodo original de Cohn.

[0007] El producto final representa un 30 % medio de la IgG existente en el grupo de plasma original. Esto explica por que las grandes empresas fabricantes se estan concentrando en desarrollar un procedimiento de produccion mas avanzado, que incluye etapas de purificacion cromatografica, caracterizado por el aumento en el rendimiento en comparacion con el procedimiento tradicional y capaz de proporcionar un producto con garantias de seguridad, eficacia y tolerabilidad caracteristicas.

[0008] El nuevo metodo ofrece otras ventajas sobre el fraccionamiento basado en etanol, la primera de las cuales es una reduccion notable en el uso de etanol y la posible eliminacion del sistema de destilacion, con la consecuente eliminacion total o parcial de las etapas de centrifugacion (lo que significa una menor interferencia, un ambiente mas limpio sin generacion de aerosol, un menor riesgo mecanico, una instrumentacion menos voluminosa), la eliminacion parcial o total de las fases de filtracion obtenidas por la adicion de adyuvantes (y por consiguiente un procedimiento “mas limpio”) y una reduccion en los volumenes de procesado debidos, en el metodo de Cohn, a que el plasma se diluye antes de someterse a precipitacion etalonica. Ademas, las condiciones del procedimiento, mas suaves y tamponadas, permiten reducir notablemente el riesgo de desnaturalizacion de las proteinas.

[0009] El uso de metodos cromatograficos para la purificacion de IVIG ha sido ya explorado: en particular, se describen la cromatografia de intercambio cationico y anionico, combinadas de forma diversa en distintas etapas o en serie, en los metodos patentados para purificar IgG a partir de plasma o de fracciones del mismo.

[0010] En la mayoria de los metodos patentados, la cromatografia de intercambio anionico se utiliza en modo negativo, es decir, se utilizan condiciones que permitan la union de las proteinas recombinantes, por ejemplo, IgA, IgM, albumina, fibrinogeno, transferrina, mientras que la IgG se recupera en el producto no adsorbido.

[0011] El documento US2007049733 describe un metodo para purificar IgG a partir de plasma reciente congelado, que implica una etapa de captura de cromatografia de intercambio cationico en un intercambiador debil (CM 650 Toyopearl), despues una doble inactivacion de virus, cromatografia de intercambio anionico sobre resina Toyopearl QAE-550 C, realizada en negativo, y una etapa final de nanofiltracion. Antes de las etapas de separacion cromatografica, el metodo implica dos precipitaciones con citrato de sodio. A partir de la primera precipitacion se

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obtiene una pasta, a partir de la cual se purifican el factor VIII, el factor IX, el factor de von Willebrand y el fibrinogeno. El sobrenadante procedente de la primera precipitacion se somete a una segunda precipitacion para obtener un sobrenadante que contiene albumina y una pasta a partir de la cual se purifica la IgG. Esta pasta se solubiliza en agua y se somete a diafiltracion para eliminar el citrato de sodio.

[0012] Ambas etapas de precipitacion implican el uso de adyuvantes de filtracion y las IgG tambien se precipitan, lo que implica una etapa de solubilizacion para eliminar los adyuvantes de filtracion.

[0013] El documento WO9805686 describe un metodo para purificar IgG a escala industrial a partir de plasma, sobrenadante I o fracciones II + III. Las lipoproteinas se eliminan preferentemente de la muestra inicial utilizando silice coloidal y euglobinas, dependiendo de su complejidad. A continuacion, se realizan dos etapas cromatograficas, la primera en un intercambiador anionico (DEAE- Sepharose FF) a un pH de 5,2, la segunda en una resina macroporosa de intercambio anionico (MacroPrepHQ, MacroprepQ, PorosQ, QHyper DM) a un pH de 6,0-6,6. Ambas etapas cromatograficas se realizan en modo negativo y la segunda cromatografia, en particular, garantiza una buena capacidad de carga, absorbiendo las proteinas contaminantes, y en particular la transferrina.

[0014] En la patente n.° US 6.307.028 B1 (2001) (11) para la purificacion de IgG a partir de plasma o de fracciones del mismo, por ejemplo, las fracciones II + III, hay dos etapas cromatograficas, con un intercambio anionico en modo negativo, despues de pretratamiento con acido caprilico. En la primera etapa, se utiliza un intercambiador anionico fuerte para unir la IgA; en la segunda etapa, se utiliza un intercambiador anionico debil para unir la IgM.

[0015] Los metodos reivindicados en los documentos US 6.093.324 (2000) y US 6.307.028 B1 (2001) parecen ser mas adecuados para productos intermedios parcialmente purificados que para el plasma, a menos que se utilicen grandes cantidades de resina en aplicaciones a escala industrial.

[0016] El documento US2001051708 describe un metodo para purificar IgG a partir de plasma estandar o hiperinmune, o de fracciones de plasma enriquecidas con IgG, que implica un pretratamiento con un agente precipitante (PEG, acido caprilico, sulfato de amonio) para eliminar lipoproteinas, proteinas contaminantes, agregados y virus. Despues de esto se realiza cromatografia de intercambio anionico (DEAE Sepharose Fast Flow) en modo negativo en serie con cromatografia de intercambio cationico (CM Sepharose Fast Flow) para unir la IgG. Este procedimiento se repite una segunda vez, despues del pretratamiento con un disolvente/detergente (S/D), para refinar el grado de pureza y eliminar los componentes inactivadores de virus. El metodo descrito en esta patente implica una etapa para eliminar las lipoproteinas y numerosas etapas cromatograficas, haciendo que sea escasamente aplicable a escala industrial.

[0017] En el documento WO9429334, se purifican IgG a partir de plasma mediante cromatografia de intercambio anionico realizada en modo negativo (DEAE-Trisacryl) acoplada a una cromatografia de intercambio cationico (CM- Trisacryl), despues de la activacion de virus mediante una mezcla S/D.

[0018] El documento WO02092632 describe un metodo para purificar IgG a partir de plasma, o fracciones de plasma, mediante una sola etapa cromatografica en un intercambiador anionico, despues del pretratamiento con acido caprilico e inactivacion de virus con una mezcla S/D. En este caso, el intercambiador anionico se utiliza en condiciones alcalinas para unir la IgG y eliminar los componentes que inactivan el virus. Las IgG se recogen cambiando el pH, mientras que las IgA e IgM se eliminan en etapas posteriores y se separan aumentando la fuerza ionica.

[0019] De nuevo, en los documentos WO9429334 y WO02092632, el metodo reivindicado parece ser mas adecuado para su uso con productos intermedios parcialmente purificados a menos que se utilicen grandes cantidades de resina y no se tenga en cuenta la posterior purificacion de albumina, lo que se complica un poco por el hecho de que permanece unida a la resina utilizada en la primera etapa cromatografica.

[0020] El documento EP 0440483 describe un procedimiento para purificar la inmunoglobulina (Ig) a partir de la fraccion I +II +III de Cohn de plasma humano, comprendiendo dicho procedimiento primero una etapa de captura de IgG sobre una resina de intercambio cationico de CM-Sepharose FF debil y posteriormente una etapa en una resina de intercambio anionico DEAE-Sepharose FF debil.

[0021] El documento GB 1344340 describe un procedimiento para purificar Ig a partir de plasma humano congelado, comprendiendo dicho procedimiento primero una etapa de captura de Ig sobre una resina de intercambio cationico de Sephadex CM debil y posteriormente una etapa sobre una resina de intercambio anionico de Sephadex DEAE debil.

[0022] Stucki et al. (J. Chromat. 1997, 700, 241-248) describen un procedimiento para purificar Ig anti-D a partir de plasma humano congelado, comprendiendo dicho procedimiento primero una etapa de captura de Ig sobre una resina de intercambio cationico de MacroPrep 50 CM debil y despues una etapa sobre una resina de intercambio anionico de DEAE-Sephadex debil.

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[0023] El objeto de la presente invencion es un procedimiento alternativo, aplicable a escala industrial, al aislamiento de IgG a partir de fracciones de plasma o de plasma con un alto rendimiento.

Definiciones y abreviaturas

[0024]

IgG = gammaglobulinas

IVIG = gammaglobulinas para inyeccion intravenosa

IgM = inmunoglobulina M

IgA = inmunoglobulina A

S/D = disolvente/detergente

PTC = complejo de protrombina

PEG = polietilenglicol

Sumario de la invencion

[0025] La presente invencion consigue el objeto anteriormente mencionado mediante un procedimiento segun la reivindicacion 1 para la produccion industrial de IVIG, utilizando plasma humano o fracciones intermedias de plasma enriquecidas con IgG, y preferentemente el criosobrenadante o sobrenadante de la fraccion I de Cohn, como materia prima. Dicho procedimiento comprende dos etapas cromatograficas: la primera etapa cromatografica consiste en una etapa de “captura” de IgG "en un intercambiador cationico fuerte; la segunda etapa consiste en una etapa de “pulido” realizada sobre un intercambiador anionico fuerte, es decir, caracterizado por grupos de amonio cuaternario.

[0026] El intercambiador cationico en cuestion pertenece a la clase de intercambiadores fuertes con el grupo funcional SO3". Se pueden utilizar resinas de la familia Capto, por ejemplo Capto S (GEHealthcare), y de la familia Gigacap, por ejemplo, Gigacap S 650 M (Toyopearl). La etapa de captura con cromatografia de intercambio cationico se lleva a cabo en condiciones disenadas para permitir la union de la IgG.

[0027] La resina utilizada para la etapa de cromatografia de pulido pertenece a la familia de fractogeles tentaculares (Merck) y se utiliza en condiciones de pH y conductividad disenadas para permitir la union tanto de la IgG como de las proteinas contaminantes (IgA, IgM y transferrina).

[0028] El metodo de acuerdo con la invencion ofrece las siguientes ventajas sobre las patentes anteriormente mencionadas:

- el material de partida no requiere ningun tratamiento preliminar para eliminar las lipoproteinas;

- la decision de unir la IgG en lugar de las proteinas contaminantes procede del hecho de que, debido a que el contenido de las proteinas diana es menor que el de las proteinas contaminantes, esto permite que las dimensiones de la columna cromatografica se mantengan tan pequenas como sea posible en aplicaciones a escala industrial;

- la cromatografia de pulido tiene el doble proposito de eliminar el disolvente y el detergente utilizados para la etapa de inactivacion de virus, opcionalmente incluida entre las dos cromatografias, y tambien de resolucion entre la IgG y las proteinas contaminantes, conseguida mediante una etapa de elucion selectiva. Dicha etapa de inactivacion de virus, opcionalmente incluida entre las dos cromatografias y realizada mediante un tratamiento con disolvente-detergente, permite inactivar los virus con una envoltura lipidica;

- el procedimiento tambien implica, opcional y preferentemente, una etapa de nanofiltracion, que garantiza la eliminacion de los virus sin envoltura y la formulacion del producto final con un pH de 4, condicion que garantiza una mayor estabilidad del producto. El tratamiento y el pH de 4 constituyen una etapa adicional de inactivacion de virus. El procedimiento en su conjunto garantiza mayores rendimientos (5,1 g de IgG por kg de plasma) que el metodo de Cohn clasico y un producto extremadamente purificado, sin productos de degradacion.

[0029] El procedimiento reivindicado en el presente documento para la purificacion de IVIG no interfiere significativamente con los procedimientos de purificacion de otras proteinas plasmaticas.

[0030] De hecho, el material de partida no es plasma reciente congelado, sino preferentemente el sobrenadante de la fraccion I procedente del metodo de fraccionamiento de Cohn, que tiene la ventaja de no afectar a la descongelacion del plasma y a la recuperacion de la criopasta fundamental para la purificacion de FVIII, factor de von Willebrand y fibrinogeno. Comenzar a partir del sobrenadante I significa tambien que el procedimiento de acuerdo con la invencion no interfiere con la extraccion de PTC y antitrombina III y que el uso de etanol es relegado a la precipitacion de la fraccion I sola.

[0031] La fraccion no unida por la primera etapa de captura de IgG, cuando toda la albumina esta todavia contenida en el plasma procesado, tiene caracteristicas que la hacen facilmente adecuada para la reinclusion en el procedimiento de purificacion de albumina por precipitacion etanolica.

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[0032] La invencion se refiere a un nuevo procedimiento para la purificacion y produccion industrial de gamma inmunoglobulinas humanas formuladas de una manera adecuada para administracion intravenosa, partiendo de fracciones de plasma o de plasma.

Breve descripcion de las figuras

[0033]

La FIG. 1 muestra el flujograma de una realizacion preferida del metodo segun la invencion, desde la materia prima hasta la produccion de una solucion de IgG de pureza intermedia, despues de la elucion de la primera etapa cromatografica de “captura” sobre una resina de intercambio cationico fuerte.

La FIG. 2 muestra el flujograma de una realizacion preferida del metodo de acuerdo con la invencion, a partir de la solucion de IgG de pureza intermedia despues de la elucion de la primera etapa cromatografica de “captura” sobre una resina de intercambio cationico fuerte y hasta la etapa de nanofiltracion despues de la segunda etapa de cromatografia de intercambio anionico.

La FIG. 3 muestra el flujograma del tratamiento posterior de la IgG obtenida por el metodo segun la invencion, despues de las dos etapas de cromatografia de intercambio ionico.

Descripcion detallada de la invencion

[0034] En la presente invencion, como material de partida se prefiere el criosobrenadante o sobrenadante I procedente del metodo de fraccionamiento de Cohn. Despues de corregir el pH a 5,4 -5,7, y preferentemente a 5,6, el material de partida se diluye con agua para obtener una conductividad en el intervalo de 3,5-4,5 mS/cm, y preferentemente 4 mS/cm.

[0035] Despues de la correccion del pH y de la predilucion, la muestra se filtra a traves de un filtro de profundidad y despues a traves de un filtro de clarificacion; despues, la muestra filtrada se fracciona por cromatografia de intercambio cationico.

[0036] La resina utilizada para la primera cromatografia pertenece a las familias Capto (GE Healthcare) o Gigacap (Toyopearl), caracterizadas por el grupo funcional -SO3-, que garantiza una alta capacidad de carga y una alta selectividad. Entre los muchos probados, estos tipos de resina se seleccionaron porque garantizaban una alta capacidad de carga de IgG. En las condiciones experimentales adoptadas, casi toda la IgG contenida en la muestra procesada se une al intercambiador cationico y la proporcion unida se eluye posteriormente en una sola etapa aumentando la fuerza ionica.

[0037] La fraccion no unida despues de la etapa de cromatografia de captura es adecuada para su uso como una materia prima para la purificacion de albumina.

[0038] La columna de intercambio cationico se acondiciona preferentemente con tampon 25-75 mM, mejor aun con acetato de sodio 50 mM, a un pH en el intervalo de 5,4-5,7, y preferentemente 5,6. La columna se carga con 2060 mg de IgG por ml de resina, y preferentemente con 40 mg de IgG por ml de resina. Despues de cargar, la columna se lava con al menos 7 volumenes de lecho de tampon 50 mM a un pH en el intervalo de 5,4-5,7, y preferentemente 5,6. La parte no adsorbida y el primer volumen de lecho de lavado se recogen y se usan para la purificacion de albumina.

[0039] En las condiciones de conductividad y pH adoptadas para el acondicionamiento y lavado de la columna y para preparar el material de partida, el porcentaje de union de IgG con la resina cromatografica esta en el intervalo del 80 % al 85 % de la carga inicial, mientras que toda la albumina y la transferrina se eluyen en la porcion no adsorbida y en el primer volumen de lecho de lavado.

[0040] Las IgG se eluyen aumentando la fuerza ionica y lavando la resina cromatografica con un tampon caracterizado por una concentracion de cloruro de sodio en el intervalo de 0,25 M a 1 M, y preferentemente con una concentracion de NaCl de 0,6 M y un pH en el intervalo de 5,4 a 5,7, y preferentemente 5,6.

[0041] El producto, que es una solucion de IgG de pureza intermedia, se eluye en una sola etapa de cromatografia de intercambio cationico, despues se filtra preferentemente a traves de un filtro de clarificacion antes de dializarse mediante filtracion en flujo cruzado para reemplazar el tampon utilizado para eluir la resina de captura cromatografica con un tampon 10-30 mM, preferentemente Tris 20 mM, pH 9,0 ± 0,5, NaCl 8-10 mM (preferentemente 9 mM) y se concentro hasta un nivel de concentracion de proteina en el intervalo de 15-25 mg/ml, y preferentemente 20 mg/ml. Para el filtrado de flujo cruzado, los modulos utilizados tienen un limite molecular de 50 o 100 KDa.

[0042] A continuacion, el producto concentrado se somete preferentemente a una etapa de filtracion a traves de un filtro de clarificacion, seguido de filtracion a traves de un filtro de grado de esterilizacion.

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[0043] El producto, con una concentracion de proteina en el intervalo de 25-30 mg/ml, se somete despues a una etapa de inactivacion de virus, implicando el tratamiento con una mezcla de disolvente/detergente (Triton-X100 al 1 % y TnBP al 0,3 %). La solucion proteica se agita en condiciones de temperatura controlada en el intervalo de 24 °C a 28 °C, y preferentemente 25 °C, durante un periodo de contacto en el intervalo de 6-10 horas, y preferentemente 8 horas.

[0044] Despues de ser tratado con la mezcla de disolvente/detergente y filtrado a traves de un filtro de clarificacion, el producto se purifica adicionalmente mediante cromatografia de intercambio ionico sobre una resina con grupos de amonio cuaternario como grupos intercambiadores, por ejemplo Fractogel TMAE, con una carga proteica en el intervalo de 20-60 mg de proteina por ml de resina, y preferentemente 50 mg/ml. La resina de cromatografia se acondiciona con tampon 10-30 mM, preferentemente Tris-HCl 20 mM, pH 9,0 ± 0,5 y NaCl 8-10 mM, preferentemente 9 mM. Despues de cargar el producto, la resina se lava ampliamente con tampon 10-30 mM, preferentemente Tris-HCl 20 mM, pH 9,0 ± 0,5 y NaCl 8-10 mM, preferentemente 9 mM, para garantizar la reduccion del Triton X-100 y TnBp a los valores especificados para el producto final. En las condiciones de conductividad y pH adoptadas para acondicionar y lavar la resina de cromatografia de intercambio anionico y para preparar la solucion de IgG de pureza intermedia sometida a tratamiento con S/D, las proteinas contaminantes y las IgG se unen a la resina. Las IgG se separan de los contaminantes por elucion selectiva.

[0045] Las IgG se eluyen aumentando la fuerza ionica o cambiando el pH.

[0046] Cuando se eluyen aumentando la fuerza ionica, se utiliza un tampon con una conductividad en el intervalo de 9,5 a 10,5 mS/cm y un pH de 9,0 ± 0,5. Las IgG se recuperan con un rendimiento de al menos 80 % y una pureza de al menos 95 %, preferentemente 98 %. Los niveles de IgA e IgM se encuentran dentro de los limites especificados para la IVIG producida utilizando el metodo actualmente adoptado.

[0047] Cuando la elucion se efectua cambiando el pH, se utiliza un tampon de fosfato de sodio, acetato de sodio o MES con una conductividad en el intervalo de 1 a 1,5 mS/cm, preferentemente 1,2 mS/cm, y a un pH en el intervalo de 6-7, preferentemente 6,2. Las IgG se recuperan con un rendimiento de al menos 95 % y una pureza de al menos 95 %, preferentemente 98 %.

[0048] Los niveles de IgA e IgM estan dentro de los limites especificados para la IVIG producida de acuerdo al metodo actualmente adoptado.

[0049] La solucion de IgG con una alta pureza obtenida por cromatografia de intercambio anionico se filtra con un filtro de clarificacion y despues se preformula por filtracion en flujo cruzado, utilizando modulos con un limite molecular de 50 o 100 KDa, en glicina 0,25 M, NaCl 9 mM, pH 6, y se concentra a una concentracion proteica en el intervalo de 25-35 mg/ml, y preferentemente 30 mg/ml.

[0050] La solucion de IgG de alta pureza se dializa y se concentra a 30 ± 5 mg de proteinas/ml, despues de corregir el pH a 4, despues se filtra previamente a traves de un filtro de grado de esterilizacion con una porosidad de 0,1 pm y se filtra sobre un filtro de grado virico con una porosidad de 20 nm.

[0051] El producto nanofiltrado se concentra adicionalmente hasta una concentracion proteica final de 90-110 g/l (preferentemente 100 g/l) por filtracion en flujo cruzado en modulos con un limite molecular de 100 KDa.

[0052] La solucion final que contiene 10 % de IgG se somete posteriormente a filtracion de grado de esterilizacion antes del envasado.

[0053] En las figuras 1, 2 y 3 se muestra una realizacion particularmente preferida del procedimiento de purificacion.

[0054] La presente invencion puede ser mas facil de entender a la luz de los siguientes ejemplos de sus realizaciones.

Parte experimental

Ejemplo 1

a. Preparacion del material de partida

[0055] Como material de partida se utilizo el sobrenadante de la fraccion Cohn.

[0056] El pH de la muestra se ajusto a 5,56 con acido acetico, despues, la veces con agua para conseguir una conductividad final de 4 mS/cm, acondicionamiento en la columna de cromatografia de intercambio cationico. La muestra diluida se filtro primero a traves de un filtro de profundidad y despues a traves de un filtro de clarificacion.

I (13 kg), obtenido segun el metodo de

muestra se diluyo aproximadamente 3,5 correspondiente a la del tampon de

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b. Cromatograffa de intercambio cationico

[0057] La cromatograffa de intercambio cationico se realizo sobre resina Capto S (fabricada por GE Healthcare) rellenada en una columna de 14 cm de diametro y de 20 cm de altura. La columna se acondiciono con tampon de acetato de sodio 50 mM, pH 5,56, a un caudal de 300 cm/h.

[0058] El sobrenadante 1 diluido y filtrado se cargo a un caudal de 300 cm/h y a una carqa de 40 mg de IgG por ml de resina (carga de proteina total: 300 mg/ml de resina). Despues de cargar, la columna se lavo con siete volumenes de columna de tampon de acetato de sodio 50 mM, pH 5,56. Despues, la elucion se realizo con tampon de acetato de sodio 50 mM, pH 5,56, cloruro de sodio 600 mM, para un total de siete volumenes de columna.

[0059] La Tabla 1 muestra las caracteristicas del eluato despues de la cromatograffa de intercambio cationico.

Tabla 1

Muestra

% de rendimiento de IgG por etapa IgG g/l IgA mg/l IgM mg/l Albumina g/l Transferrina g/l Proteinas g/l

Columna de eluato Capto S

86 ± 3 3,99 ± 0,58 111 ± 19 38,4 ± 7,7 < 0,36 < 0,088 7,23 ± 0,76

c. Dialisis/ultrafiltracion

[0060] El eluato de la cromatograffa de intercambio ionico se sometio a dialisis/ultrafiltracion utilizando un dispositivo de filtracion de flujo cruzado y casetes con un limite molecular de 100 KDa (Millipore o Pall).

[0061] Como tampon de dialisis se utilizo Tris 20 mM pH 9,0 (al menos seis volumenes de dialisis) y la muestra se concentro hasta obtener una concentracion proteica de 20 g/l.

d. Inactivacion de virus con mezcla de disolvente/detergente

[0062] La muestra dializada, concentrada a 20 g/l, se sometio a inactivacion de virus por contacto con una mezcla de Triton X-100 (1 % p/p) y Tri-n-butil-fosfato (0,3 % p/p) durante 8 horas a una temperatura controlada de 25 °C.

[0063] Despues de la inactivacion de los virus, la muestra se clarifico por filtracion.

e. Cromatograffa de intercambio anionico

[0064] La cromatograffa de intercambio anionico se completo con resina Fractogel TMAE (fabricada por Merck) rellenada en una columna de 14 cm de diametro y de 26 cm de altura. La columna se acondiciono con tampon Tris 20 mM, pH 9,0, a un caudal de 150 cm/h.

[0065] La muestra inactivada y filtrada se cargo en una columna con una carga de proteina de 30 mg por ml de resina a un caudal de 50 cm/h. Despues de cargar, la columna se lavo con 10 volumenes de columna de tampon Tris 20 mM, pH 9,0, a un caudal de 150 cm/h. Despues se realizo elucion con el tampon Tris 20 mM, pH 9,0 y cloruro de sodio 75 mM, a un caudal de 50 cm/h para un total de al menos seis volumenes de columna.

[0066] La Tabla 2 muestra las caracteristicas de la solucion de inmunoglobulina con un alto grado de pureza eluida de la columna de cromatograffa de intercambio cationico.

Tabla 2

Fraccion

% de rendimiento de IgG por etapa IgG g/l IgA mg/l IgM mg/l Proteinas g/l

Eluato de columna Fractogel TMAE

82,5 ± 11,2 2,22 ± 0,08 < 0,2 < 0,1 2,28 ± 0,16

f. Dialisis/ultrafiltracion

[0067] La muestra se sometio a dialisis/ultrafiltracion utilizando un dispositivo de filtracion de flujo cruzado con casetes con un limite molecular de 100 KDa (Millipore o Pall).

[0068] Se utilizo un tampon de glicina 0,25 M con cloruro de sodio 0,6 g/l para las etapas de dialisis y formulacion y la muestra se concentro hasta obtener una concentracion de proteina de 30 g/l. El pH de la solucion se ajusto a 4,0 con acido clorhidrico 1 N.

5

10

15

20

25

30

35

g. Nanofiltracion

[0069] La solucion de proteina concentrada a 30 g/l en tampon que contenia glicina 0,25 M y cloruro de sodio 0,6 g/l, pH 4,0, se filtro primero a traves de un filtro de grado de esterilizacion y despues a traves de un filtro de eliminacion de virus con una porosidad de 20 nm.

[0070] Despues de eliminar los virus, la solucion purificada de IgG se concentro hasta una concentracion final de proteina de 100 g/l, despues se paso a traves de un filtro de esterilizacion y se envaso.

Ejemplo 2

[0071] Para este ejemplo, la Tabla 3 resume las caracteristicas principales del producto final obtenido aplicando el protocolo descrito en el ejemplo 1.

Tabla 3

Lote 1 Lote 2 Lote 3 Media

Pureza (%)

98,4 98,5 97,9 98,3

monomeros + dimeros (%)

99,492 99,897 99,21 99,53

polimeros (%)

0,165 0,104 0,31 0,193

fragmentos (%)

0,342 0 0,48 0,274

Distribucion de las subclases

IgG 1 (g/l)

36,7 55,71 52,73 48,38

IgG2 (g/l)

16,7 25,36 26,77 22,94

IgG3 (g/l)

1,46 4 4,24 3,23

IgG4 (g/l)

0,47 1,3 1,24 1

IgA (mg/l)

1,6 3,6 2 2,4

IgM (mg/l)

<0,1 <0,1 <0,1 <0,1

Transferrina (g/l)

0,135 <0,088 0,23 0,151

Ejemplo 3

[0072] La solucion de IgG con una pureza intermedia obtenida implementando el protocolo del ejemplo 1, apartados (a)-(d), se purifico sobre resina Fractogel TMAE, como se explica a continuacion.

e1. Cromatografia de intercambio anionico: se realizo sobre resina Fractogel TMAE rellenada en columna de 2,6 cm de diametro y 21 cm de altura, y acondicionada con tampon Tris 20 mM, pH 9,0 ± 0,1, NaCl 9 mM;

e2. Carga de la solucion de IgG de pureza intermedia: la solucion de IgG de pureza intermedia obtenida de las etapas descritas en los apartados (a)-(d) del ejemplo 1 se cargo en la columna Fractogel TMAE a una carga de 50 mg de proteina por ml de resina y a un caudal de 50 cm/h;

e3. Lavado de la columna Fractogel TMAE: despues de completar la carga, la columna se lavo a un caudal de 150 cm/h, con 10 volumenes de columna del tampon de acondicionamiento;

e4. Elucion de IgG: las IgG se eluyeron a un caudal de 150 cm/h. Los cinco ensayos diferian en el tampon utilizado para la elucion, como se muestra en la tabla 4. Los eluatos obtenidos en los diversos ensayos se convirtieron en productos finales como se explica en los apartados (f) y (g) del ejemplo 1. La Tabla 4 muestra el % de rendimiento de cada etapa en IgG y los niveles de contaminantes en los productos finales concentrados a 10 % p/v.

Tabla 4

Conductividad

Tampon de elucion

del tampon mS/cm % de rendimiento de IgG por etapa IgA mg/l IgM mg/l Transferrina g/l

Fosfato de sodio 6,2

10 mM, pH 1,0 95 2,53 0,89 < 0,08

Fosfato de sodio 6,2

15 mM, pH 1,3 99 6,61 0,95 0,42

Fosfato de sodio 6,2

50 mM, pH 4,0 97 18,53 2,04 26,21

Acetato de sodio 6,2

20 mM, pH 1,6 88 2,06 0,7 < 0,08

Tampon de elucion

Conductividad del tampon mS/cm % de rendimiento de IgG por etapa IgA mg/l IgM mg/l Transferrina g/l

MES 50 mM, pH 6,2

1,8 95 2,92 <0,1 0,67

Claims (5)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para la produccion de gammaglobulinas para administracion intravenosa (IVIG), empleando, como material de partida, plasma humano o una fraccion plasmatica intermedia enriquecida en gammaglobulinas (IgG), comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas cromatograficas: una primera etapa cromatografica, que consiste en una etapa de “captura” de IgG, realizada sobre un intercambiador cationico fuerte, y una segunda etapa cromatografica, que consiste en una etapa de “pulido”, realizada sobre un intercambiador anionico fuerte;

   en el que el intercambiador cationico fuerte pertenece a la categoria de un intercambiador fuerte caracterizado por un grupo funcional SO3"; y en el que el intercambiador anionico fuerte tiene grupos de amonio cuaternario como grupos intercambiadores; en el que entre las dos etapas cromatograficas se realiza al menos una etapa de inactivacion de virus realizada mediante un tratamiento con disolvente-detergente; en el que posteriormente, despues de la segunda etapa cromatografica, la solucion que contiene IVIG se somete a una etapa de eliminacion de virus mediante nanofiltracion; en el que el intercambiador cationico fuerte se carga con 20-60 mg de IgG/ml de resina y en el que las etapas de acondicionamiento, de carga y de lavado, se realizan empleando un tampon a 2575 mM a un pH 5,4-5,7 mientras que la elucion se realiza utilizando un tampon que tiene una concentracion de cloruro de sodio de 0,25-1 M;

   en el que el intercambiador anionico fuerte se carga con 20-60 mg de proteina/ml de resina y en el que las etapas de acondicionamiento, de carga y de lavado, se realizan empleando un tampon a 10-30 mM, pH 9,0 ± 0,5, NaCl 810 mM mientras que la elucion se realiza o utilizando una fuerza ionica aumentada o mediante una variacion de pH; cuando la elucion se realiza utilizando una fuerza ionica aumentada, se emplea un tampon que tiene una conductividad de 9,5-10,5 mS/cm y un pH de 9,0 ± 0,5; cuando la elucion se realiza mediante una variacion de pH, se emplea un tampon que tiene la conductividad de 1 -1,5 mS/cm y un pH de 6-7.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el intercambiador cationico fuerte se selecciona entre resinas de la familia Capto o entre resinas de la familia Gigacap.
3. 3. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el intercambiador anionico fuerte pertenece a la familia de Fractogel tentacular.
4. 4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que como material de partida se emplea criosobrenadante o sobrenadante de la fraccion I de Cohn.
5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que antes de la etapa cromatografica en un intercambiador cationico fuerte, el sobrenadante se somete a una correccion de pH a un valor de 5,4 -5,7, y despues se diluye con agua hasta una conductividad de 3,5-4,5 mS/cm.