ES2640275T3

ES2640275T3 - Recipiente para la extracción de sangre

Info

Publication number: ES2640275T3
Application number: ES10154013.6T
Authority: ES
Inventors: Elke Helftenbein
Original assignee: PreAnalytiX GmbH
Current assignee: PreAnalytiX GmbH
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2019-08-12
Also published as: EP2071037A1; EP1105533A1; JP2002522092A; AU771212B2; US20130066234A1; ES2325009T3; USRE43389E1; EP2206792B1; ATE426677T1; DE19836559A1; CN1196796C; CA2348152C; EP1105533B1; ZA200102036B; BR9912949A; ES2593492T3; EP2071037B1; US6776959B1; JP4607323B2; EP2206792A1

Abstract

Recipiente para la extracción de sangre que presenta una presión negativa definida en el espacio previsto para la extracción de sangre, comprendiendo el recipiente un septo que está construido de manera que sea compatible con accesorios de extracción de muestras comunes, como cánulas, que contiene una solución acuosa con los siguientes componentes: - una sal de guanidinio; - una sustancia tampón; y - un detergente.

Description

DESCRIPCION

Recipiente para la extraccion de sangre

5 La presente invencion se refiere a un recipiente para la extraccion de sangre, donde la sangre extrafda se debe utilizar particularmente para la estabilizacion y analftica de acidos nucleicos.

Durante la extraccion, la sangre se recoge habitualmente en recipientes que ya contienen anticoagulantes como, por ejemplo, heparina, citrato o EDTA. De este modo se evita que la sangre coagule. Las muestras de sangre obtenidas 10 de este modo se pueden almacenar durante un tiempo prolongado a temperatures adecuadas. Sin embargo, esta forma de obtencion de sangre tiene considerables desventajas cuando se deben analizar acidos nucleicos como, por ejemplo, ARN(m) o ADN. Para tales propositos, sena preferible que los acidos nucleicos que estan contenidos en la muestra se estabilicen en el mismo momento de la extraccion, es decir, se debena evitar la degradacion de los acidos nucleicos presentes, asf como la neosmtesis de ARN.

15

Hasta ahora, este objetivo del almacenamiento estable de los acidos nucleicos contenidos en el material de muestra desde el momento de la extraccion, practicamente no se puede realizar en el caso del almacenamiento de sangre por los siguientes motivos:

20 Las celulas contienen nucleasas, enzimas que destruyen los acidos nucleicos, en cuanto se ponen en contacto con sus sustratos (ARN, ADN). Normalmente, la accion de nucleasas celulares y extracelulares esta bajo control fisiologico, siempre que las celulas esten en su entorno normal. La extraccion de sangre conduce a modificaciones mas o menos intensas de los acidos nucleicos contenidos en las celulas. Asf, las nucleasas se liberan dentro de las celulas y/o hacia el exterior por la lisis de celulas. Ademas, los acidos nucleicos se 25 sintetizan con mas o menos intensidad. Precisamente el almacenamiento de sangre a largo plazo conduce a envejecimiento y destruccion de las celulas.

Un problema adicional durante el almacenamiento a largo plazo de muestras de sangre que se han obtenido de acuerdo con procedimientos de extraccion convencionales es la fuerte modificacion del material de muestra. Tales 30 modificaciones como, por ejemplo, la lisis intensa de celulas, pueden conducir a que los procedimientos convencionales del aislamiento de acidos nucleicos ya no funcionen con eficacia satisfactoria.

Aparte de los problemas de un almacenamiento estable de acidos nucleicos que estan contenidos en el material de muestra, en los procedimientos convencionales de extraccion de sangre se producen dificultades adicionales. Los 35 anticoagulantes convencionales frecuentemente no se separan con una eficacia suficiente durante el aislamiento de acidos nucleicos e interfieren durante la posterior analftica de acidos nucleicos como, por ejemplo, durante la amplificacion mediante PCR (Reaccion en Cadena de la Polimerasa). La heparina, por ejemplo, es un inhibidor comunmente conocido de la PCR.

40 Finalmente, en la analftica cuantitativa de acidos nucleicos se plantea la cuestion de como se puede controlar todo el procedimiento desde la toma de la muestra hasta la medicion de acido nucleico en condiciones normalizadas. De forma ideal, al material de muestra se debena anadir en el mismo momento de la extraccion un acido nucleico patron definido en cuanto a la cantidad y calidad, que se somete a todo el proceso de la toma de la muestra y la determinacion. Esto tampoco se puede realizar con los sistemas de extraccion convencionales.

45

Una desventaja adicional de la extraccion de sangre convencional es el riesgo de la transmision de material infeccioso, ya que hasta ahora se necesitan etapas manuales en el procedimiento para el aislamiento de acidos nucleicos. No se puede excluir un contacto con agentes patogenos potencialmente infecciosos.

50 En la bibliograffa se describe un procedimiento, en el que la muestra de sangre se mezcla directamente despues de la extraccion del paciente con sal de guanidinio (documento EP 0 818 542 A1). En este procedimiento, la sal de guanidinio esta presente en forma de polvo, para utilizar de este modo la mayor estabilidad de la sal de guanidinio. Sin embargo, este procedimiento posee serias desventajas, ya que la sal, por ejemplo, en primer lugar se tiene que disolver en la sangre anadida. El proceso de disolucion es particularmente dependiente de la temperatura y no se 55 puede controlar debido a la opacidad del material de muestra usado. Por tanto, el uso de un producto correspondiente para propositos de diagnostico-medicos es sumamente problematico.

Adicionalmente, las nucleasas son enzimas sumamente activas, que solamente se pueden inhibir en condiciones extremadamente desnaturalizantes. La desnaturalizacion depende de la concentracion de la sal de guanidinio en 60 solucion. Una concentracion inhibidora de sal de guanidinio en solucion no se da desde el principio en el procedimiento citado. Por tanto, se produce una degradacion incontrolada de acidos nucleicos durante el proceso de disolucion. Ademas, en este procedimiento se omite la adicion de agentes reductores, sin los que no se garantiza una inhibicion eficaz -particularmente de RNasas (vease el Ejemplo N° 5).

65 Ademas, la muestra producida de este modo no se puede usar directamente para el aislamiento adicional de acidos

nucleicos en superficies de vidrio. Ademas, el uso de polvo de sal de guanidinio no permite la adicion de patrones internos de acidos nucleicos. Tales patrones son imprescindibles para el control del procedimiento y la cuantificacion precisa.

5 El uso de una solucion que contiene isotiocianato de guanidinio 8 M, sarkosyl al 1% y citrato sodico 50 mM para el aislamiento de ARN para la deteccion de virus Junrn en muestras de sangre se describe en Lozano et al. (Virus Research 27(1993): 37-53). Sin embargo, ese documento no trata de la estabilizacion de los acidos nucleicos de la muestra de sangre en sf, sino de la estabilizacion del ARN vmco posiblemente presente. El uso de una solucion de tiocianato de guanidinio para la desnaturalizacion de protemas de muestras tisulares se describe en MacDonald et 10 al. (Methods in Enzymology 152(1987): 219-227), en el cual no se hace referencia a la estabilizacion a largo plazo de acidos nucleicos en general ni a muestras de sangre en particular.

La presente invencion se basaba en el problema tecnico de proporcionar un recipiente para la extraccion de sangre, que no presente las desventajas del estado de la tecnica Particularmente, la muestra extrafda con el recipiente se 15 debe poder suministrar directamente a los procedimientos comunes de analisis de acidos nucleicos, sin tener que realizar etapas adicionales de preparacion de la muestra.

Este problema se resuelve de acuerdo con la invencion mediante un recipiente para la extraccion de sangre que en el espacio previsto para la extraccion de sangre presenta una presion negativa definida, comprendiendo el recipiente 20 un septo que esta construido de manera que sea compatible con accesorios de extraccion de muestras comunes, como canulas, conteniendo el recipiente una solucion acuosa con los siguientes componentes:

- una sal de guanidinio;

- una sustancia tampon; y 25 - un detergente.

El recipiente de acuerdo con la invencion posee las siguientes ventajas: 1. La sangre se lisa en el mismo momento de la extraccion, debido a que el recipiente de extraccion ya contiene una sustancia estabilizante de acidos nucleicos en solucion. 2. La sustancia estabilizante de acidos nucleicos esta compuesta de tal forma, que el material de 30 muestra, particularmente los acidos nucleicos contenidos en la misma, se estabilizan directamente despues del contacto con la solucion. 3. La muestra estabilizada, al contrario que todos los sistemas de extraccion habituales hasta ahora como recipientes de extraccion que contienen EDTA o heparina, ya no se tiene que seguir manipulando como material infeccioso. 4.La sustancia estabilizante de acidos nucleicos esta compuesta de tal forma, que el material de muestra se puede usar directamente en los procedimientos de aislamiento posteriores. 5. La sustancia 35 estabilizante de acidos nucleicos se puede separar durante el aislamiento posterior de forma tan eficaz, que no tiene lugar ninguna inhibicion de la PCR. 6. A la sustancia estabilizante de acidos nucleicos se puede anadir un patron interno. Este permite el control de todo el procedimiento desde la extraccion de la muestra hasta la deteccion de acidos nucleicos.

40 El recipiente de extraccion que se ha mencionado en el punto 1 consiste en un recipiente de extraccion de sangre (tubo) convencional, en el que se pone un volumen definido de una sustancia estabilizante de acidos nucleicos. A continuacion, se proporciona al tubo un vado parcial definido, que garantiza que durante la extraccion solamente pueda entrar un volumen determinado de sangre. El tubo se puede manipular con procedimientos convencionales de extraccion de sangre. En una realizacion preferida especial la solucion contenida en el tubo contiene los siguientes 45 reactivos: tiocianato de guanidinio, Triton-X-100, ditiotreitol y un sistema tampon adecuado como, por ejemplo, citrato, Tris o Hepes. En la composicion descrita, la solucion es compatible con el tubo de vado. Esta solucion se puede almacenar sin problemas en el tubo de vado, sin que se produzca una alteracion de la funcion estabilizante deseada. Todo el sistema es particularmente sencillo para el donante de sangre y seguro durante la toma de la muestra.

50

La solucion, que contiene la sal de guanidinio, la sustancia tampon, el agente reductor y/o el detergente es estable en almacenamiento y transforma la sangre suministrada, reden extrafda en un material que tambien es estable en almacenamiento y que se puede suministrar directamente a los kits comunes de analisis de acidos nucleicos (como, por ejemplo, de Roche o Qiagen).

55

Como sal de guanidinio se prefieren tiocianato de guanidinio y/o cloruro de guanidinio.

Preferiblemente, la sal de guanidinio esta presente en una concentracion de 2,0 a 8,0 M. Como sustancia tampon se prefiere Tris o citrato, ajustandose el pH exacto preferiblemente con HCl. Sin embargo, otros tampones posibles son 60 HEPES, MOPS, tampon citrato y fosfato como, por ejemplo, PBS.

La concentracion de tampon esta preferiblemente entre 10 y 300 mM, mas preferiblemente entre 10 y 100 mM.

Como detergente se prefiere Triton-X-100. Son posibles detergentes adicionales NP-40, Tween 20, polidocanol u 65 otros detergentes.

La concentracion de detergente es preferiblemente del 5 al 30% (p/v), mas preferiblemente del 10 al 20% (p/v).

Como agente reductor se prefiere DTT, donde, sin embargo, tambien se pueden usar p-mercaptoetanol, TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfina) u otros reductores.

5

La concentracion preferida del agente reductor es del 0,1 al 10% (p/v); se prefiere particularmente del 0,5 al 2% (p/v).

El pH de la solucion es preferiblemente de 3,0 a 9,0, mas preferiblemente de 4,0 a 7,5, mas preferiblemente de 5 a 10 6. El pH de la solucion se selecciona particularmente de tal forma, que despues de la adicion del material de muestra se ajusta un valor de pH en el intervalo de 5,0 a 7,6. Se prefiere particularmente un pH entre 6,3 y 6,9 (vease el Ejemplo N° 8) Una solucion particularmente preferida contiene preferiblemente tiocianato de guanidinio 4 M, Tris/HCl 45 mM, Triton-X-100 al 18, preferiblemente al 15%, (p/v), DTT al 0,8% (p/v) y posee un pH de 6,0.

15 El volumen para la extraccion de la muestra de sangre presenta un vado parcial, el cual se puede ajustar de tal forma que se succiona un volumen de sangre determinado de antemano al interior del recipiente despues de que se haya realizado la puncion de un vaso sangumeo. En el mercado estan disponibles los correspondientes recipientes de evacuacion.

20 El recipiente, que contiene la sangre extrafda, se puede suministrar inmediatamente despues a la analttica posterior o se puede almacenar durante un periodo de tiempo prolongado (hasta varios dfas) sin desventajas para la calidad de la muestra.

En el procedimiento descrito la sangre recien extrafda se pone en contacto directamente con la solucion que se ha 25 descrito anteriormente en el recipiente de extraccion de sangre, de tal forma que se detienen inmediatamente todos los procesos que pueden modificar el perfil de acidos nucleicos de la muestra. Por tanto, los datos determinados posteriormente con respecto a los acidos nucleicos analizados representan de forma muy precisa el estado real en el momento de la extraccion de sangre, tanto con respecto a las cantidades como a los tipos de los acidos nucleicos.

30 Preferiblemente, la cantidad de sangre extrafda es de 0,1 a 4 veces la solucion presentada en el recipiente. La ultima comprende preferiblemente de 0,5 a 5,0 ml. Por tanto, la concentracion final de sal de guanidinio despues de la adicion de sangre es de 1,0 a 5 M, preferiblemente de 1 a 3 M, particularmente se prefiere 2-3 M (vease el Ejemplo 7).

35 El recipiente de acuerdo con la invencion se utiliza preferiblemente para la extraccion de sangre cuando la muestra de sangre se debe usar para la analftica de acidos nucleicos.

El uso de la solucion que se ha mencionado anteriormente como componente del sistema de extraccion que se ha descrito garantiza por sf solo la lisis inmediata de las celulas y la estabilizacion simultanea de la muestra por 40 inactivacion directa de las nucleasas. Sorprendentemente, la muestra de sangre obtenida de este modo se puede almacenar incluso a temperatura ambiente o superior a lo largo de varios dfas. Ademas, el sistema de extraccion garantiza una manipulacion segura en cuanto a la contaminacion y no infecciosa desde la toma de la muestra pasando por el aislamiento de acidos nucleicos hasta la analftica. En el procedimiento convencional del aislamiento de acidos nucleicos siempre se necesitan hasta el momento etapas adicionales de manipulacion (como la 45 transferencia de la muestra de sangre extrafda a los reactivos para el aislamiento de acidos nucleicos, etc.), que estan asociadas con un riesgo adicional de infeccion.

La muestra obtenida con el sistema de extraccion de sangre es compatible con todos los procedimientos convencionales comunes de aislamiento de acidos nucleicos. Se tienen que resaltar en este contexto 50 particularmente procedimientos que se basan en la union de acidos nucleicos a superficies de vidrio, pero tambien procedimientos de extraccion basados en disolventes y en la union espedfica de secuencias a acidos nucleicos complementarios.

Por tanto, la invencion que se ha descrito consiste en un sistema de extraccion de sangre que esta concebido de tal 55 forma que se cumplen las siguientes condiciones: 1. Extraccion controlada de la muestra y estabilizacion simultanea de los acidos nucleicos (ADN, ARN) contenidos en el material de muestra. 2. Extraccion de la muestra, en la que se puede omitir completamente la utilizacion de anticoagulantes. 3. La muestra obtenida con el sistema de extraccion de sangre que se ha descrito se puede utilizar de forma universal en todos los sistemas conocidos de aislamiento de acidos nucleicos. 4. El sistema de extraccion de sangre es estable en almacenamiento.

60

Adicionalmente se ha comprobado sorprendentemente que la muestra obtenida con el sistema de extraccion que se ha descrito se puede almacenar en el recipiente a lo largo de un tiempo prolongado sin degradacion de los acidos nucleicos (vease los Ejemplos 2, 3, 7, 8).

65 Los siguientes ejemplos explican la invencion.

Ejemplo 1:

El sistema de extraccion de sangre puede estar compuesto del siguiente modo en una realizacion preferida (vease la Figura 1): un tubo se llena con un volumen definido de la sustancia estabilizante de acidos nucleicos, se proporciona 5 al mismo un vado definido y se cierra con un septo. El septo esta construido de tal forma que es compatible con los accesorios comunes para extraccion de muestras (canula, etc.). En el presente ejemplo se prepararon 2,2 ml de reactivo y el vado estaba ajustado de tal forma, que durante la toma de la muestra pudieron entrar exactamente 2,2 ml de sangre. Los acidos nucleicos contenidos en la corriente de sangre entrante se transfirieron directamente en forma estable.

10

Observacion general con respecto a los ejemplos siguientes.

En todos los ejemplos descritos a continuacion, la sustancia estabilizante de acidos nucleicos (N-sS), a menos que se indique de otro modo, tema la siguiente composicion: Tris 45 mM, tiocianato de guanidinio (GTC) 5 M, ditiotreitol 15 (DTT) al 0,8% (p/v), Triton-X-100 al 18% (p/v), pH 6,0.

En todos los ejemplos descritos, la sustancia estabilizante de acido nucleico, a menos que se indique de otro modo, se mezclo con la muestra con la proporcion de 1 a 1 (1 volumen de N-sS mas 1 volumen de material de muestra). Una concentracion inferior de N-sS, por ejemplo, 1 volumen de N-sS mas 5 volumenes de muestra, podna conducir 20 a degradacion de ARN.

Para todos los ejemplos, la sangre se estabilizo anadiendo la misma directamente durante la extraccion al tubo mezclado con N-sS.

25 Ejemplo 2:

Estabilidad de acidos nucleicos despues de mezcla de material de muestra y N-sS. Aislamiento de ARN y ADN del lisado de muestra con superficies derivatizadas con sflice.

30 Materiales y Metodos:

El material de muestra para el aislamiento de ADN y ARN se uso directamente despues de la extraccion, despues de almacenamiento durante 6 dfas a 4°C y despues de almacenamiento durante 1 mes a -20°C.

35 Para el aislamiento de ARN (Figura 2) se uso el Kit de Aislamiento de ARN HighPure (Boehringer Mannheim, N° de Cat. 1828 665). Las instrucciones del prospecto se modificaron del siguiente modo: un volumen de 2,4 ml de lisado de muestra se aplico en 4 alfcuotas de 600 |il cada una sobre la columna, de tal forma que se aplico un total de material de muestra de 2,4 ml de lisado. Todas las demas etapas se realizaron de acuerdo con el prospecto. El ARN se eluyo finalmente con 100 |il de tampon de elucion.

40

Para el aislamiento de ADN (Figura 3) se utilizo el Kit de Sangre QiaAmp (Qiagen N° de Cat. 29104). El procedimiento convencional descrito en el prospecto se modifico en diferentes puntos: se pusieron 400 |il de volumen de muestra directamente sobre la columna, donde no se utilizo el reactivo de union contenido en el kit. Se anadieron 25 |il de solucion madre de proteinasa K y la muestra se incubo durante 10 min a temperatura ambiente. 45 Despues, la columna se puso en un recipiente de extraccion y se centrifugo como se describe en el prospecto. Todas las demas etapas se realizaron, a excepcion del uso de etanol, como se describe en el prospecto. El volumen de elucion fue 200 |il.

Ejemplo 3:

50

Aislamiento de ARNm de lisado de muestra mediante el uso de partfculas magneticas recubiertas con estreptavidina y oligo(dT) marcado con biotina (Figura 4)

Materiales y Metodos:

55

Se pusieron 20 ml de lisado de muestra en un recipiente. El ARNm se aislo de acuerdo con el siguiente metodo: en primer lugar se anadieron 30 ml de tampon de hibridacion (Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, oligo(dT) marcado con biotina 6 nM, pH 7,4) al lisado. Despues se anadieron 3 mg de partfculas magneticas con estreptavidina (Boehringer Mannheim). La muestra se mezclo y se incubo durante 5 min a temperatura ambiente. Las partfculas magneticas se 60 separaron con ayuda de un iman, el sobrenadante se desecho. Despues, las partfculas se resuspendieron en tampon de lavado 1 (Tris-HCl 10 mM, NaCl 200 mM, Triton-X-100 al 1%, pH 7,5) y se lavaron 3 veces con tampon de lavado 2 (Tris-HCl 10 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) (etapas de lavado: resuspension, separacion magnetica, eliminacion del sobrenadante). Despues de la ultima etapa de lavado se retiro completamente el sobrenadante y las partfculas se resuspendieron en 20 |il de agua destilada. La muestra se calento durante 5 min a 70°C. Las partfculas

magneticas se separaron y el sobrenadante, que contema el ARNm, se analizo mediante electroforesis en gel. Ejemplo 4:

5 Aislamiento del ADN y ARN mediante el uso de un documento modificado de acuerdo con Chomczynski y Sacchi (Analytical Biochemistry 162, 156-159 (1987)) (Ejemplo de un metodo basado en extraccion con disolvente) (Figura 5):

Materiales y Metodos:

10

Se transfirieron 2 ml de volumen de muestra desde el recipiente de extraccion de sangre a un tubo. Despues, se anadieron 0,2 ml de una solucion de acetato sodico 2 M, pH 4, 2 ml de fenol (saturado con agua) y 0,4 ml de una mezcla de cloroformo-alcohol isoairnlico (49:1), donde despues de la adicion de cada solucion se mezclo la muestra cuidadosamente. La solucion completa se agito intensamente durante 10 segundos y se incubo durante 15 minutos 15 en hielo. La muestra se centrifugo durante 20 minutos a 4°C con 10000 g. Despues de la centrifugacion, el ARN estaba en la fase acuosa, el ADN y las protemas, en la interfase y la fase fenolica. La fase acuosa se transfirio a un nuevo recipiente y se mezclo con un 1 ml de isopropanol. Para la precipitacion del ARN se almaceno la muestra durante 1 hora a -20°C. Despues de una nueva centrifugacion a 4°C con 10000 g, el ARN estaba en el sedimento. Este se recogio en 0,3 ml de tampon (tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sodico 25 mM, pH 7,0, sarkosyl al 0,5% 220 mercaptoisopropanol 0,1 M), se transfirio a un nuevo recipiente Eppendorf de 1,5 ml y se mezclo con 1 volumen de isopropanol. Despues de 1 hora de incubacion a -20°C, la solucion se centrifugo en una centnfuga Eppendorf durante 10 minutos a 4°C. El sedimento de ARN se recogio en etanol al 75% y se concentro por centrifugacion (Speed vac) y se seco. Para procesamientos posteriores se disolvio la muestra en 100 |il de Tris-HCl 10 mM, pH 6,5.

25 Ejemplo 5:

Importancia de reactivos reductores (por ejemplo, DTT) en la solucion de estabilizacion para la estabilizacion a largo plazo de ARN

30 Materiales y Metodos:

Solucion de estabilizacion usada: GTC 4,0 M; Triton X100 al 13,5%, Tris/HCl 45 mM; con o sin DTT 120 mM. Se mezclaron 700 |il de suero con 700 |il de solucion de estabilizacion. Despues de 2 min de incubacion se anadieron 20 |il de ARN de MS2 (0,8 |ig/|il de Roche). Las muestras se incubaron durante 180 min a 40°C y a continuacion se 35 prepararon en alfcuotas de 400 |il con el Kit de ARN total High Pure de Roche. Las muestras se anadieron a la columna en un paso sin adicion del reactivo de union del kit y se centrifugaron de acuerdo con las instrucciones. Las siguientes etapas de lavado y la elucion del ARN en 50 |il de tampon de elucion se realizaron de acuerdo con las instrucciones. La analftica se realizo mediante gel de agarosa (vease la Figura 6).

40 Resultado: sin la adicion de reactivos reductores a la solucion de estabilizacion no se puede conseguir ninguna estabilizacion a largo plazo de ARN.

Ejemplo 6:

45 Estabilidad de ARN de MS2 libre en suero. Cinetica de la degradacion de ARN por componentes de la muestra. Materiales y Metodos

Se realizaron adiciones puntuales de 10 |il de ARN de MS2 (0,8 |ig/|il de Roche) a 250 |il de suero y se incubaron a 50 temperatura ambiente. Inmediatamente despues de la adicion del ARN, despues de 2 min a 50 min se detuvo la degradacion natural del ARN en suero por adicion de 250 |il de solucion de estabilizacion. Todas las mezclas se realizaron como determinacion por duplicado. Como patron, una muestra se mezclo con ARN de MS2 solamente despues de la adicion de la solucion de estabilizacion al suero y se proceso en paralelo.

55 Todas las muestras se procesaron en paralelo con el Kit de ARN vmco High Pure de Roche. Las muestras se pusieron en una etapa sin adicion del reactivo de union del kit sobre la columna y se centrifugaron de acuerdo con las instrucciones. Las siguientes etapas de lavado y la elucion del ARN en 50 |il de tampon de elucion se realizaron de acuerdo con las instrucciones. 20 |il del eluato se separaron mediante un gel de agarosa nativo al 1,2% y se analizaron (vease la Figura 7).

60

Resultado: el ARN de MS2 no es estable en suero. Incluso dos minutos despues de la adicion de ARN a suero, el mismo se ha degradado completamente. Por la adicion de solucion de estabilizacion al suero con la proporcion 1:1 se puede detener inmediatamente este proceso y se puede conseguir una estabilizacion del ARN en el momento de la adicion de la solucion de estabilizacion (= extraccion de sangre).

Ejemplo 7:

Estabilidad de ARN de MS2 en suero/solucion de estabilizacion: dependencia de la concentracion de GTC 5

Materiales y Metodos:

Soluciones de estabilizacion usadas: GTC 3-5 M; Triton X100 al 13,5%; DTT 50 mM; Tris/HCl 42 mM

10 pH de las soluciones: aproximadamente 4,0

pH de las soluciones despues de adicion de suero: aproximadamente 6,7.

2 ml de suero se mezclaron con 2,5 ml de las respectivas soluciones de estabilizacion. Despues de un tiempo de 15 incubacion de 2-5 min se anadieron 90 il de ARN de MS2 (0,8 ig/il de Roche) y se incubaron a 40°C. A intervalos regulares se extrajeron 400 il de muestra y se prepararon con el Kit de ARN total High Pure de Roche de forma correspondiente al Ejemplo 5. Las muestras se eluyeron en 50 il y se congelaron a -20°C. Para el analisis de la integridad del ARN se aplicaron 20 il del eluato sobre un gel de agarosa al 1,5% (vease la Figura 8).

20 Para el analisis por PCR de las muestras, 10 il del eluato se sometieron a transcripcion inversa mediante AMV-RT (Roche) y a continuacion se analizaron mediante PCR en el Lightcycler:

Mezcla para RT: 4,0 il

(42°C durante 1 h) 2,0 il 0,5 |il 1,0 |il 1,9 |il

0,6 il 10 il 20 il

tampon para AMV-RT dNTP (concentracion final 10 mM) inhibidor de RNasa (Roche, 20 unidades) cebador 2827 (concentracion final 1 iM) DMPC-agua

AMV-RT (Roche, 15 unidades)

ARN molde

La PCR se realizo en el Lightcycler a una temperatura de hibridacion de 61°C mediante el uso de SYBR-Green como 25 sistema de deteccion. Mezcla para PCR:

1,6 il MgCl2 (solucion madre 25 mM)

5,9 il DMPC-agua

0,25 il cebador 2827 (solucion madre 20 mM)

0,25 il cebador 2335 (solucion madre 20 mM)

1.0 il mezcla madre SYBR-Green (Roche)

1.0 il mezcla de RT (diluida 1:50)

10 il

El producto de amplificacion de la PCR se aplico completamente sobre un gel de agarosa al 2% (vease la Figura 9).

30 Resultado:

Integridad del ARN despues de 3 dfas a 40°C:

El gel de agarosa en la Figura 8 muestra 20 il del ARN de MS2 elrndo despues de 3 dfas de incubacion a 40°C. 35 Despues de este periodo de tiempo se pueden observar, dependiendo del contenido de GTC, claras diferencias en la integridad del ARN. De acuerdo con esto, para la integridad del ARN es ventajoso un contenido de sal inferior a 2 M en el suero/solucion de estabilizacion.

Capacidad de amplificacion del ARN despues de 8 dfas a 40°C:

40

A pesar de que incluso despues de 3 dfas a 40°C se pudo comprobar una degradacion incipiente del ARN, todas las muestras de ARN se pudieron amplificar despues de una incubacion de 8 dfas a 40°C y se pudieron comprobar claramente. El producto de amplificacion de la PCR se aplico completamente sobre un gel de agarosa al 2% (vease la Figura 9).

45

Ejemplo 8:

Estabilidad de ARN de MS2 en suero/solucion de estabilizacion: dependencia del valor de pH de la muestra

mezclada con solucion de estabilizacion Materiales y Metodos

Solucion usada:: GTC 4 M (5 M)

: Triton X 100 al 14,4%

: DTT 50 mM

: Tris/HCl 45 mM

5

pH despues de adicion de suero entre 6,7 y 8,0

2,5 ml de solucion de estabilizacion se mezclaron con 2,0 ml de suero. Despues de adicion de 90 |il de ARN de MS2 (0,8 |ig/ml, Roche), las muestras se incubaron a temperatura ambiente. A intervalos regulares se preparo el ARN de 500 |il de muestra con el Kit de ARN vmco de Roche de forma correspondiente al Ejemplo 6 y se aislo en 50 |il de tampon de elucion. Se analizaron 20 |il del eluato mediante gel de agarosa (vease la Figura 10).

10

Resultado:

El pH del suero/solucion de estabilizacion y, por tanto, tambien el pH y el intervalo de tampon de la solucion de estabilizacion, es decisivo para la estabilizacion a largo plazo de ARN. Mientras que con un valor de pH de 8,0 ya no 15 se pudo comprobar ningun ARN intacto incluso despues de 2 dfas, en un intervalo de pH entre 6,6 y 7,0 todavfa se puede comprobar ARN intacto despues de 13 dfas de incubacion a temperatura ambiente.

Sin embargo, ademas del valor de pH tambien es importante una concentracion de GTC ajustada optimamente para la estabilizacion a largo plazo de ARN (vease tambien el Ejemplo 7). El ejemplo representado ilustra que para una 20 estabilizacion a largo de plazo de ARN es mejor una concentracion final de gTc en la muestra estabilizada de GTC 2,2 M que 2,78.

Leyendas

25 Fig. 1:

Recipiente de extraccion de muestra con N-sS, vacfo definido, sellado con septo.

Fig. 2:

30

Analisis en gel (agarosa al 1%) de ARN que se almaceno durante diferente tiempo en el recipiente de extraccion de muestra. Columna 1: aislamiento directamente despues de extraccion de la muestra (ningun almacenamiento), columna 2: almacenamiento durante un mes a -20°C, columna 3: almacenamiento durante 6 dfas a 4°C. La cantidad del ARN aplicado se correspondfa a un volumen de sangre de 120 |il.

35

Fig 3:

Analisis en gel (agarosa al 1%) de ADN que se almaceno durante diferente tiempo en el recipiente de extraccion de muestra. Columna 1: aislamiento directamente despues de extraccion de la muestra (ningun almacenamiento),

40 columna 2: almacenamiento durante un mes a -20°C, columna 3: almacenamiento durante 6 dfas a 4°C. La cantidad del ADN aplicado se correspondfa a un volumen de sangre de 10 |il.

Fig. 4:

45 Analisis en gel (agarosa al 1%) de ARNm que se aislo de 10 ml de sangre (columna 2). Marcador de peso molecular (columna 1). Adicionalmente al ARNm son visibles las bandas de ARNr. Los contornos definidos de las bandas demuestran la integridad de los acidos nucleicos.

Fig. 6:

50

Analisis en gel (agarosa al 1%) del ARN que se aislo de 120 |il de sangre.

Fig. 6:

55 Analisis en gel de ARN de MS2 aislado despues de incubacion en suero/solucion de estabilizacion con/sin DTT durante 180 min a 40°C.

Columna 1: control positivo: ARN de MS2, columna 2: marcador de ADN, columna 3, 4, 5: ARN de MS2 despues de incubacion con solucion de estabilizacion que contiene DTT, columna 6, 7, 8: ARN de MS2 despues de incubacion con solucion de estabilizacion sin DTT

5 Fig. 7:

Analisis en gel de ARN de MS2 aislado despues de incubacion en suero durante 0-50 min

Columna 10, 17: patron de ARN de MS2, columna 9, 16: marcador de ADN, columna 7, 8: incubacion durante 0 min, 10 columna 5, 6: incubacion durante 2 min, columna 3, 4: incubacion durante 5 min, columna 1, 2: incubacion durante 10 min, columna 11, 12: incubacion durante 15 min, columna 13, 14: incubacion durante 30 min, columna 15: incubacion durante 50 min

Fig. 8:

15

Analisis en gel de ARN de MS2 que se aislo despues de incubacion en suero/solucion de estabilizacion durante 3 dfas a 40°C. El contenido de GTC de la solucion de estabilizacion despues de la adicion de suero, en la que se incubo la respectiva muestra de ARN, se indica en la correspondiente columna.

20 Columna 1: GTC 2,70 M, columna 2: GTC 2,5, columna 3: GTC 2,36 M, columna 4: GTC 2,20 M, columna 5: GTC 2,08 M, columna 6: GTC 1,94 M, columna 7: GTC 1,80 M, columna 8: GTC 1,66 M.

Fig. 9:

25 Analisis en gel de los productos de amplificacion de PCR de ARN de MS2, que se aislo despues de 1 u 8 dfas de incubacion a 40°C en suero/solucion de estabilizacion.

Columna 1: producto de amplificacion del ARN aislado despues de 1 dfa, columna 2: producto de amplificacion del ARN aislado despues de 8 dfas, columna 3: marcador de ADN, columna 4: control positivo de ARN de MS2: 0,8 |ig 30 en 10 |il de RT; diluido 1:50, 1 |il amplificado

Fig. 10:

Analisis en gel de ARN de MS2 aislado despues de 6 (columna 2-12) o 13 (columna 14-19) dfas de incubacion a 35 temperatura ambiente en suero/solucion de estabilizacion. Detras de las columnas correspondientes se indica el valor de pH que se consiguio despues de la mezcla de suero y solucion de estabilizacion.

Columna 1, 13, 20: marcador de ADN, columna 2: pH 8,0, columna 3: pH 7,7, columna 4: pH 7,5, columna 5: pH 7,35, columna 6: pH 7,18, columna 7, 14: pH 7,07, columna 8, 15: pH 6,94, columna 9, 16: pH 6,8, columna 10, 17: 40 pH 6,72, columna 11, 18: pH 6,68 y columna 12, 19: pH 6,7 La solucion de estabilizacion del ARN en la columna 12, 19 tema el mismo valor de pH que la del ARN en la columna 11, sin embargo, contema GTC 5 M en vez de 4 M.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Recipiente para la extraccion de sangre que presenta una presion negativa definida en el espacio previsto para la extraccion de sangre, comprendiendo el recipiente un septo que esta construido de manera que sea compatible con

5 accesorios de extraccion de muestras comunes, como canulas, que contiene una solucion acuosa con los siguientes componentes:

- una sal de guanidinio;

- una sustancia tampon; y

10 - un detergente.
2. Recipiente de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la sal de guanidinio se selecciona de tiocianato de guanidinio y cloruro de guanidinio.

15 3. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que la sal de guanidinio esta presente en una concentracion de 1 a 8,0 M, preferiblemente de 2,5 a 8,0 M.
4. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la sustancia tampon se selecciona de Tris, HEPES, MOpS, tampon citrato y tampon fosfato.

20
5. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la sustancia tampon esta presente en una concentracion de 10 a 300 mM.
6. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el detergente se 25 selecciona de Triton-X-100®, NP-40®, polidocanol y Tween 20®.
7. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el detergente esta presente en una concentracion del 5 al 30% (p/p).

30 8. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que el pH de la solucion esta entre 4,0 y 7,5, o entre 4,0 y 6,5.
9. Recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que contiene sangre extrafda.

35
10. Recipiente de acuerdo con la reivindicacion 9, caracterizado por que la cantidad de sangre contenida ah corresponde a de 0,1 a 4 veces el volumen de la solucion en el recipiente.
11. Recipiente de acuerdo con la reivindicacion 10, caracterizado por que la concentracion final de sal de 40 guanidinio despues de la adicion de sangre esta entre 1,0 M y 5 M o entre 1,5 M y 5 M.
12. Procedimiento para la estabilizacion y aislamiento de acidos nucleicos de sangre, caracterizado por que la sangre directamente despues de la extraccion se encuentra en un recipiente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y se afsla en una etapa adicional con un sistema de aislamiento de acido nucleicos.

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