ES2640582T3

ES2640582T3 - Método y sistema para la detección de crecimiento microbiano en una muestra

Info

Publication number: ES2640582T3
Application number: ES13714422.6T
Authority: ES
Inventors: Michael Ullery
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2017-11-03
Anticipated expiration: 2033-03-15
Also published as: JP2015510775A; WO2013142347A8; MX2014010847A; BR112014023060B1; CA2866899C; CN104204219B; EP3249048A2; EP3249048A3; CA2866899A1; AU2013235400B2; MX349261B; HK1246365A1; CN104204219A; US20130252271A1; JP6442398B2; IN2014DN08629A; US10475527B2; WO2013142347A1; BR112014023060A2; AU2013235400A1

Abstract

Un método para determinar si se produce crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra que comprende las etapas de: incubar el recipiente de muestra que comprende un medio de la muestra y un medio de crecimiento; obtener una serie de puntos de datos de medida a partir del recipiente de muestra mientras se incuba el recipiente de muestra y almacenar los puntos de datos en una memoria legible por máquina, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra desde el medio de la muestra; utilizar un ordenador programado para realizar en paralelo los métodos analíticos (a) y (b), a saber: (a) un análisis de la variación en puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida, y (b) un análisis de los cambios en el área bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida; y imponer una limitación a la capacidad del método analítico (b) para determinar una condición positiva durante un período de tiempo basándose en el análisis de la variación en los puntos de datos sucesivos en el método analítico (a); y en donde ambos métodos analíticos (a) y (b) incluyen una etapa de proceso para determinar una condición positiva de crecimiento microbiano dentro del recipiente a partir de los puntos de datos de medida.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y sistema para la deteccion de crecimiento microbiano en una muestra

Esta descripcion se refiere en general al campo de los sistemas y metodos para determinar si un agente (por ejemplo, una bacteria) esta o no presente en una muestra biologica o clmica tal como sangre u orina.

Antecedentes

Actualmente existen en el mercado en los Estados Unidos instrumentos que detectan el crecimiento y por lo tanto la presencia de microorganismos en una muestra de sangre. Uno de tales instrumentos es el instrumento BacT/ALERT 3D del presente cesionario bioMerieux, Inc. El instrumento recibe un frasco de cultivo de sangre que contiene una muestra de sangre, por ejemplo, de un paciente humano. El instrumento incuba el frasco. Periodicamente durante la incubacion una unidad de deteccion optica en el incubador analiza un sensor colorimetrico incorporado al frasco. Las medidas de reflexion obtenidas por la unidad de deteccion se utilizan para detectar si se ha producido crecimiento microbiano dentro del frasco. La unidad de deteccion optica, los recipientes de muestras y los sensores estan descritos en la bibliograffa de patentes, vease las patentes de Estados Unidos 4.945.060; 5.094.955; 5.162.229; 5.164.796; 5.217.876; 5.795.773; y 5.856.175. Las patentes de Estados Unidos 5.856.175 y 5.164.796 describen metodos para determinar si se produce crecimiento microbiano en un recipiente de muestra.

El funcionamiento del algoritmo de deteccion de frascos positivos del instrumento BacT/ALERT se considera comercialmente aceptable. Sin embargo, tiene varias deficiencias. En primer lugar, el tiempo para la deteccion (TTD) parece estar retrasado en algunos casos cuando el TTD se compara con una inspeccion visual de la curva de reflectancia. En otras palabras, la deteccion se produce mas tarde en la fase de crecimiento exponencial (vease la Figura 2 y la descripcion que sigue) que lo que se debena esperar. En segundo lugar, se sabe que se producen resultados falsos positivos como resultado de sucesos tales como efectos de la temperatura por cargar frascos relativamente fnos, volver a cargar frascos en diferentes celdas del incubador, y mover los frascos dentro de la misma celda. En tercer lugar, se sabe que se producen resultados falsos negativos en el caso de retrasar una carga de frascos. Un resultado falso negativo se observa cuando se detecta solo la parte superior de la fase exponencial o la fase estacionaria no esta a un nivel de reflectancia suficientemente alto para activar el umbral positivo inicial del valor de reflectancia. En cuarto lugar, el algoritmo logico se considera complejo, diffcil de entender y diffcil de mantener.

Otra tecnica anterior de interes relacionada en general con la deteccion de microorganismos en una muestra biologica incluye las siguientes patentes: U.S. 5.770.394, U.S. 5.518.923; U.S. 5.498.543, U.S. 5.432.061, U.S. 5.371.016, U.S. 5.397.709, U.S. 5.344.417, U.S. 5.374.264, U.S. 6.709.857; y U.S. 7.211.430. Los siguientes documentos de patente son tambien de interes potencial: U.S. 7.991.558; U.S. 7.668.663; U.S. 2009/0119020; U.S. 2011/0029252; U.S. 2011/0208432; U.S. 2009/0287754 y U.S. 2010/0070190.

En los instrumentos de deteccion tales como el BacT/ALERT 3D e instrumentos similares, una vez que el frasco de cultivo de sangre ha sido analizado como positivo en cuanto a la presencia de microorganismos, es diffcil obtener un alto nivel de caracterizacion del agente microbiano, o identificacion de la especie del agente microbiano, debido a la interferencia de los componentes sangumeos y de los artefactos del sistema desechable (por ejemplo, un frasco) que contiene la muestra. Por lo tanto, los metodos actuales utilizan un frasco u otro recipiente desechable adecuado y un instrumento relacionado para el crecimiento natural y la deteccion de microorganismos en la muestra, como se ha descrito antes. Una vez que el instrumento indica que el frasco es positivo en cuanto a la presencia de un agente microbiano, segun los metodos actuales, el frasco “positivo” se separa manualmente del instrumento y una porcion de la muestra se retira manualmente del frasco y se cultiva en una placa de agar. La placa se coloca manualmente en un incubador y se inspecciona periodicamente en cuanto al crecimiento de un subcultivo del microorganismo. Una vez que el subcultivo ha crecido lo suficiente, se toma una muestra del cultivo de la placa y se coloca en un tubo de ensayo. El tubo de ensayo se introduce entonces en otro instrumento mas para el ensayo de identificacion por medio de una tarjeta desechable de muestras de ensayo que tiene una multitud de pocillos individuales. Las tarjetas de ensayo desechables son conocidas en la bibliograffa de patentes, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.118.280, 3.963.355, 4.018.652; 4.116.775 y 4.038.151, 5.609.828, 5.746.980, 5.766.553, 5.843.380, 5.869.005, 5.916.812, 5.932.177, 5.951.952, y 6.045.758.

La tarjeta de muestras de ensayo se procesa entonces en un instrumento anafftico conocido en la tecnica como el instrumento VITEK 2 del cesionario. El instrumento VITEK 2 incuba y lee periodicamente los pocillos de la tarjeta de muestras de ensayo con una unidad de lectura. El crecimiento de la muestra en uno o mas de los pocillos de las tarjetas da como resultado la identificacion del agente microbiano. El instrumento VITEK 2 esta descrito en la bibliograffa de patentes, vease, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.762.873 y 6.086.824.

Todo este proceso desde el momento de introducir la muestra en el frasco de recogida de sangre hasta el cultivo, deteccion de la presencia de microorganismos y, despues identificacion del microorganismo mediante el instrumento VITEK 2 normalmente dura 2-5 dfas. Solo las etapas de identificacion, que se producen despues de la deteccion de frascos positivos, normalmente ocupan 1-3 de estos dfas.

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Senan posibles para un paciente sustanciales beneficios clmicos, y potencialmente se podnan salvar vidas, si el tiempo que se emplea para la deteccion y la identificacion de un agente microbiano en una muestra de sangre y la informacion de los resultados a un medico se pudiera reducir de los actuales 2-5 dfas a menos de un d^a.

En una solicitud relacionada del cesionario de la solicitud, publicada como U.S. 2011/0281291, se describen metodos para la identificacion de un agente microbiano en un recipiente de muestras.

El documento U.S. 2011/029252 A1 describe sistemas, metodos y aparatos para determinar si un cultivo en un recipiente contiene o no una pluralidad de microorganismos. Se calcula un valor relativo de normalizacion para cada medida respectiva de un estado biologico del cultivo entre (i) la medida respectiva y (ii) un estado biologico inicial. Para cada intervalo fijo de tiempo, se calcula una derivada de los valores relativos de normalizacion en el intervalo de tiempo, formando de este modo una pluralidad de valores de transformacion. Para cada conjunto de valores de transformacion en la pluralidad de valores de transformacion, se computa una medida de la tendencia central de los valores en el conjunto, formando de este modo una pluralidad de valores de transformacion relativos medios. Se realiza una determinacion si el cultivo contiene microorganismos, basada en la posibilidad de que cualquier valor de transformacion relativo medio calculado exceda o no un primer umbral o en la posibilidad de que una extension del crecimiento presentada por el cultivo exceda un segundo umbral.

En la presente descripcion, se describen metodos para detectar si el crecimiento microbiano en un recipiente de muestra esta teniendo lugar, lo que indica que un agente esta presente en la muestra. Los metodos reducen el tiempo necesario para realizar esta determinacion inicial. Debido a que la determinacion inicial se hace mas temprano, la segunda etapa de identificacion del agente (tal como se describe en el documento US 2011/0281291) puede ser iniciada antes de lo que sena posible de otro modo. Esta invencion contribuye por lo tanto a una reduccion general del tiempo necesario para la deteccion e identificacion del agente microbiano. Por otra parte, los metodos de esta descripcion superan las deficiencias de los algoritmos de deteccion actuales.

Sumario de la invencion

Se describe un metodo y un sistema para determinar si se esta produciendo crecimiento microbiano en un recipiente de muestra. Los metodos utilizan puntos de datos de medida (intensidad, tiempo) a partir de un sistema que obtiene medidas del recipiente de muestra, tal como, por ejemplo, un sistema descrito en las patentes de Estados Unidos 5.856.175 y 5.164.576.

A este respecto, por lo tanto, una realizacion de la presente invencion proporciona:

un metodo para determinar si se esta produciendo crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra, que comprende las etapas de:

incubar el recipiente de muestra que comprende un medio de la muestra y un medio de crecimiento;

obtener una serie de puntos de datos de medida a partir del recipiente de muestra mientras se incuba el recipiente de muestra y almacenar los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra procedente del medio de la muestra;

utilizar un ordenador programado para realizar en paralelo los metodos analtticos (a) y (b), a saber:

(a) un analisis de la variacion en puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida, y

(b) un analisis de los cambios en el area bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida; y

imponer una limitacion a la capacidad del metodo analftico (b) para determinar una condicion positiva durante un penodo de tiempo basandose en el analisis de la variacion en los puntos de datos sucesivos del metodo analftico (a); y

en donde ambos metodos analtticos (a) y (b) incluyen una etapa de proceso para determinar una condicion positiva de crecimiento microbiano dentro del recipiente a partir de los puntos de datos de medida.

El metodo tiene varias caractensticas unicas, siendo una de ellas que el metodo utiliza dos tecnicas diferentes que funcionan en paralelo para detectar el crecimiento de organismos dentro del recipiente de muestra. La primera es una medida de la variacion de datos punto a punto. Este metodo se aplica para diferenciar entre un error de medida, o el ruido de los datos, y la actividad biologica. La segunda es una medida de las variaciones en el area relativa bajo un grafico de crecimiento de microorganismos en funcion del tiempo (utilizando la intensidad de senal como un indicador del crecimiento), o "curva de crecimiento" en la presente memoria. Este metodo es sensible a la deteccion de puntos de inflexion en la curva de ensayo, y por lo tanto a la deteccion precoz de crecimiento microbiano. Ambos

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metodos analfticos incluyen una etapa de proceso para determinar si el recipiente es positivo en cuanto al crecimiento a partir de los datos de medida introducidos.

Los dos metodos evaluan los puntos de datos de medida en paralelo para minimizar el riesgo de un falso positivo o un falso negativo en la interpretacion del ensayo. (Un resultado negativo del ensayo implica que no se ha detectado crecimiento de organismos. Un resultado positivo implica que se ha detectado crecimiento de organismos). En una realizacion, el metodo de la variacion punto a punto identifica errores de medida y en consecuencia limita la posibilidad de variaciones en el metodo del area relativa bajo la curva de crecimiento para determinar una condicion positiva durante la condicion de error de medida. El metodo del area relativa bajo la curva de crecimiento es el metodo mas sensible para detectar la actividad biologica si los datos estan libres de errores de medida. Mediante la aplicacion simultanea del enfoque de la variacion punto a punto, el riesgo de una interpretacion incorrecta de la curva debido a la medida de sucesos no biologicos se minimiza y las ventajas de utilizar el metodo del area relativa bajo la curva se pueden lograr completamente.

Las realizaciones preferidas del metodo incorporan el uso de umbrales de decision en tiempo real calculados utilizando los datos de ensayo introducidos. Este enfoque es robusto frente a la variacion entre plataformas de medida, medios de ensayo, y organismos de ensayo, en comparacion con el uso de umbrales de decision predefinidos.

Adicionalmente, en las realizaciones ilustradas el metodo no requiere un proceso complejo de suavizado de datos. Los metodos que suavizan los datos pueden retrasar la interpretacion del ensayo y/o reducir la sensibilidad del algoritmo.

En otro aspecto, se proporciona un sistema para determinar si se esta produciendo crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra. El sistema incluye: un aparato para incubar el recipiente de muestra que comprende un medio de la muestra y un medio de crecimiento; un sistema de medida configurado para obtener una serie de puntos de datos de medida mientras se incuba el recipiente de muestra y para almacenar los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de los puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra procedente del medio de la muestra; y un ordenador programado para realizar en paralelo los metodos analfticos (a) y (b), a saber:

(b) un analisis de los cambios en el area bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida,

en donde el ordenador esta programado ademas para:

en donde ambos metodos analfticos (a) y (b) incluyen una etapa de proceso para determinar una condicion positiva del crecimiento microbiano dentro del recipiente a partir de los puntos de datos de medida.

Otro aspecto de esta descripcion se dirige a una metodologfa para identificar un recipiente de muestra como positivo para el crecimiento microbiano y por lo tanto la presencia del agente microbiano en la situacion en que el recipiente se incuba durante un penodo de tiempo inusualmente largo antes de la instalacion del recipiente en el sistema de deteccion que incorpora los metodos descritos. En particular, los metodos de punto a punto y del area relativa bajo la curva, descritos de forma resumida en este sumario y en detalle mas adelante, son capaces de interpretar las medidas de datos procedentes del sistema de deteccion del recipiente bajo uso clmico ftpico - es decir, cuando el frasco de ensayo se inocula con la muestra y el frasco es cargado inmediatamente en el sistema. Sin embargo, algunos laboratorios mantendran el frasco inoculado (posiblemente en condiciones de refrigeracion) durante un penodo de tiempo prolongado antes de cargar el frasco en el sistema. El retraso en la carga puede dar lugar a una reflectancia o curva de crecimiento incompleta. Por incompleta, se quiere indicar que puede faltar toda la fase de latencia y toda o parte de la fase exponencial de la curva de crecimiento "tfpica" (Figura 2). Una metodologfa, denominada en el texto que sigue de forma intercambiable como metodologfa de "incubacion temprana" o de "entrada tardfa", proporciona un analisis separado de los datos disenados especfticamente para este ensayo denominado de entrada retrasada. Esta metodologfa se puede realizar en paralelo con las metodologfas de la variacion "punto a punto" y/o del "area relativa bajo la curva de crecimiento", de modo que un recipiente se identifica correctamente como positivo independientemente de si el recipiente estuvo sujeto o no a la entrada tardfa en el sistema de deteccion. Alternativamente, este metodo se puede realizar solo, por ejemplo, en la situacion en que se sabe que ha transcurrido un cierto penodo de tiempo prolongado despues de la inoculacion de la muestra en el recipiente antes de que el recipiente es introducido en el sistema de deteccion.

Se pueden utilizar tres metodos alternativos diferentes en el algoritmo de deteccion de incubacion temprana para identificar un recipiente como positivo para el crecimiento microbiano, incluyendo un primer metodo que calcula una media de los valores de reflectancia y la compara con un umbral, un segundo metodo que utiliza el valor medio

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punto a punto y lo compara con un umbral, y un tercer metodo en el cual se cuenta el numero de valores punto a punto consecutivamente crecientes y se compara con un valor umbral especificado. En una posible realizacion, los tres metodos se llevan a cabo en paralelo en una serie de medidas del recipiente con indicacion de la hora.

Otras divulgaciones

Tanto el metodo de la variacion punto a punto como el metodo del area relativa bajo la curva de crecimiento se cree que son unicos. Ambos metodos tienen utilidad solos, o en combinacion con otros metodos para determinar el crecimiento microbiano.

Por lo tanto, tambien se da a conocer en la presente memoria un metodo de variacion de datos punto a punto para determinar si se esta produciendo crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestras que contiene una muestra. El metodo comprende las etapas de:

incubar el recipiente de la muestra;

obtener una serie de puntos de datos de medida mientras se incuba el recipiente de la muestra y almacenar los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de la muestra;

analizar la variacion de los puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida con respecto a un umbral de decision, y

si la variacion en los puntos de datos sucesivos excede el umbral de decision un numero predeterminado de veces para sucesivos puntos de datos de medida, identificar el recipiente de la muestra como positivo para el crecimiento microbiano.

La serie de puntos de datos de medida se puede obtener a partir de un sensor colorimetrico contenido dentro del recipiente de muestra. Sin embargo, el metodo es aplicable para su uso con otros metodos, incluyendo los metodos que monitorizan los cambios en la concentracion de CO2, en el pH u otro valor del recipiente de la muestra o su contenido que son un indicador del crecimiento de microorganismos.

El umbral de decision se puede calcular a partir de los puntos de datos de medida. En otra configuracion posible, el metodo incluye la etapa de determinar a partir de los puntos de datos de medida un pico en los puntos de datos de medida y en respuesta colocar una restriccion en un segundo metodo para determinar el crecimiento microbiano en el recipiente de la muestra a partir de los puntos de datos de medida. Por ejemplo, el segundo metodo puede ser uno basado en las lecturas de un sensor colorimetrico, por ejemplo, el metodo del area relativa bajo la curva, un metodo que determina el crecimiento a partir de las lecturas del pH, etc.

La muestra para la que se puede utilizar el metodo puede tomar cualquier forma adecuada, incluyendo muestras de alimentos, muestras ambientales o muestras de un paciente humano, por ejemplo, sangre u orina.

Se describe tambien en la presente memoria una mejora de una maquina de ensayo microbiologico operativa para recibir una pluralidad de recipientes de muestras, incubar los recipientes, y obtener una serie de puntos de datos de medida a partir de los recipientes de muestras. La mejora proporciona una unidad de proceso en la maquina operativa para determinar si los recipientes son positivos para el crecimiento microbiano utilizando el metodo de los datos punto a punto. El metodo puede tomar la forma de un dispositivo informatico programado que contiene instrucciones legibles por maquina para realizar el metodo de los datos punto a punto.

Tambien se describe aqrn un metodo para determinar si se esta produciendo crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestras que contiene una muestra, que utiliza el metodo del area relativa bajo la curva. Este metodo incluye las etapas de:

(a) incubar el recipiente de la muestra;

(b) obtener una serie de puntos de datos de medida mientras se incuba el recipiente de la muestra y almacenar los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de la muestra;

(c) calcular el area bajo la curva de crecimiento para un par de puntos de datos de medida;

(d) calcular el area bajo la curva de crecimiento para un segundo par de puntos de datos de medida;

(e) calcular la diferencia en tanto por ciento en el area bajo la curva de crecimiento calculada en las etapas

(c) y (d);

(f) determinar si la diferencia en tanto por ciento calculada en la etapa (e) es mayor que un umbral de decision;

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(g) si la etapa (f) es afirmativa, repetir las etapas (c), (d), (e) y (f) para pares sucesivos de puntos de datos de medida hasta que el numero de pares sucesivos de puntos de datos de medida que tienen una diferencia en tanto por ciento calculada en la etapa (f) por encima del umbral de decision, sea mayor que un Ifmite predeterminado; y

(h) en respuesta, registrar los recipientes de muestras como positivos para el crecimiento microbiano.

Como ocurrio con el metodo de los datos punto a punto, la serie de puntos de datos de medida se puede obtener en una variedad de formatos de ensayo donde los puntos de datos de medida son un indicador del crecimiento, por ejemplo, los puntos de datos de medida se obtienen a partir de un sensor colorimetrico contenido dentro del recipiente de la muestra.

El umbral de decision se puede calcular a partir de los puntos de datos de medida, y por lo tanto es resistente a la variacion entre plataformas de medida, medios de ensayo y tipos de muestras. El metodo se puede utilizar con una variedad de tipos de muestras, incluyendo muestras de alimentos, ambientales y clmicas, incluyendo las muestras obtenidas de un paciente humano, tales como sangre u orina.

Tambien se describe aqu una maquina de ensayo microbiologico operativa para recibir una pluralidad de recipientes de muestras, incubar los recipientes, y obtener una serie de puntos de datos de medida a partir de los recipientes de muestras. La maquina incluye una unidad de proceso en la maquina operativa para determinar si los recipientes son positivos para el crecimiento microbiano utilizando el metodo del area relativa bajo la curva de crecimiento. El metodo puede tomar la forma de un dispositivo informatico programado que contiene instrucciones legibles por maquina para realizar el metodo del area relativa bajo la curva de crecimiento.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 es una ilustracion de una disposicion de la tecnica anterior de un sistema para monitorizar el crecimiento de un agente microbiano desconocido dentro de un recipiente de muestra que puede ser utilizado conjuntamente con los presentes metodos.

La Figura 2 es un grafico de crecimiento microbiano con el recipiente como una funcion del tiempo de incubacion; la curva de crecimiento se representa como las medidas de la intensidad obtenidas por el detector de la Figura 1.

La Figura 3 es un grafico de crecimiento y de variacion punto a punto en las medidas de datos, que demuestra que cuando la variacion punto a punto excede el umbral de decision superior un numero mmimo de veces, se hace una interpretacion de ensayo positivo.

La Figura 4 es un segundo ejemplo de un grafico de crecimiento y de variacion punto a punto en las medidas de datos similar a la Figura 3, que demuestra que cuando la variacion punto a punto excede el umbral de decision superior un numero mmimo de veces, se hace una interpretacion de ensayo positivo.

La Figura 5 es un ejemplo de un grafico de crecimiento y de variacion punto a punto de las medidas de datos en la situacion en que los frascos dan negativo para el crecimiento microbiano. Se debe tener en cuenta que la representacion de la variacion de datos punto a punto no excede el umbral superior durante todo el penodo de incubacion.

La Figura 6 es un grafico que muestra la curva de crecimiento (intensidad) como una funcion del tiempo de incubacion, y un area bajo la curva entre dos puntos arbitrarios en el tiempo, representada el area en unidades arbitrarias.

La Figura 7 es un grafico de la curva de crecimiento, umbrales de decision superior e inferior, y la variacion del area relativa bajo la curva (RAUC) como una funcion del tiempo de incubacion, que demuestra que se hace una interpretacion de ensayo positivo despues de que el grafico de la variacion de RAUC excede el umbral de decision superior un numero mmimo de veces.

La Figura 8A es una ilustracion del metodo de analisis de RAUC en condiciones de un ensayo negativo. Se debe tener en cuenta que el grafico de la variacion de RAUC se mantiene dentro de los umbrales superior e inferior y tiende hacia un valor cero. Las figuras 8B-8E son graficos de la variacion lectura a lectura (punto a punto), umbrales, y reflectancia que ilustran como se puede utilizar el metodo de la variacion punto a punto para limitar, por ejemplo, temporalmente, la capacidad del metodo de RAUC para declarar un resultado positivo.

La Figuras 9A y 9B son un diagrama de flujo que muestra un metodo de la variacion de datos punto a punto para determinar si un recipiente de muestra es positivo para el crecimiento microbiano. El diagrama de flujo puede ser codificado como una secuencia de instrucciones de proceso para su ejecucion por una unidad de computacion de uso general, tal como por ejemplo un ordenador que tiene acceso a las medidas de ensayo procedentes del sistema de la Figura 1.

Las figuras 10A y 10B son un diagrama de flujo que muestra un metodo del area relativa bajo la curva (RAUC) para determinar si un recipiente de muestra es positivo para el crecimiento microbiano. El diagrama de flujo tambien

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puede ser codificado como una secuencia de instrucciones de proceso para su ejecucion por una unidad de computacion de uso general, tal como por ejemplo un ordenador que tiene acceso a las medidas de ensayo procedentes del sistema de la Figura 1.

La Figura 11 es una ilustracion del metodo de analisis de datos punto a punto con una condicion de ensayo negativo y los errores de medida indicados por los picos en la grafica de la variacion punto a punto.

La Figura 12 es una ilustracion del metodo de analisis de RAUC con una condicion de ensayo negativo y los errores de medida indicados por los picos en la grafica de la variacion de RAUC.

La Figura 13 es una ilustracion de un grafico de crecimiento microbiano como una funcion del tiempo en la situacion de "incubacion temprana" en la que el recipiente se retrasa en ser cargado en el sistema de deteccion para el ensayo; en esta situacion la fase de latencia y la mayor parte o todas las fases de crecimiento exponencial de la curva tfpica de crecimiento estan ausentes. Una de las metodologfas de esta descripcion identifica un frasco positivo en esta situacion. Esta metodologfa se puede realizar en paralelo con los metodos de la variacion punto a punto y del area relativa bajo la curva descritos conjuntamente con las figuras 7 y 10.

La Figura 14 es una ilustracion de un metodo de valor positivo de intensidad media para la situacion de "entrada tardfa".

La Figura 15 es una ilustracion de un metodo de valor positivo medio punto a punto para la situacion de "entrada tardfa".

La Figura 16 es una ilustracion del metodo del numero de valores punto a punto consecutivos crecientes mayor que un valor especificado para la situacion de "entrada tardfa".

La Figura 17 es una ilustracion esquematica de un instrumento de deteccion para detectar recipientes tales como frascos que son positivos para el crecimiento microbiano. Los metodos de la invencion de esta descripcion son adecuados para su implementacion en un sistema tal como el que se muestra en la Figura 17 o sistemas equivalentes.

Descripcion detallada

A continuacion, se describen metodos y sistemas para la determinacion de una condicion de crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra. Los metodos son aplicables a una variedad de formatos de ensayo para la presencia microbiologica en un medio de la muestra y no se consideran limitados a ningun formato particular. En la practica, los metodos se pueden utilizar en cualquier sistema que monitorice un parametro del recipiente de la muestra o su contenido, directa o indirectamente, tal como por ejemplo el cambio en el pH, o en la concentracion de CO2 directamente, o por medio de medidas indirectas de crecimiento tales como la monitorizacion de las medidas de intensidad por un sensor colorimetrico dentro del recipiente.

La siguiente exposicion utilizara un ejemplo de un formato de ensayo que es representativo de una realizacion actual a modo de ejemplo y no de limitacion, es decir, el formato de ensayo de un sensor colorimetrico incorporado en un recipiente tipo frasco que es interrogado regularmente utilizando un dispositivo de iluminacion y un fotodetector, vease las patentes de Estados Unidos 5.856.175 y 5.164.576. Una version modificada de esta disposicion se describe en la solicitud de Estados Unidos, numero de serie 13/352.428 presentada el 18 de enero de 2012.

El sistema de deteccion colorimetrico basico descrito en las patentes '175 y '576 se muestra en la Figura 1 de las figuras adjuntas. Un diodo emisor de luz (LED) roja 4 dirige la luz sobre el fondo de un recipiente de muestras o frasco 1 que contiene un medio de la muestra (por ejemplo, sangre o plasma) y, posiblemente, un agente microbiano desconocido. El frasco incluye tfpicamente un medio de crecimiento junto con la muestra, y la disposicion de la Figura 1 esta en ambiente de incubacion durante el ensayo del frasco para el crecimiento microbiano. Un sensor colorimetrico 2 se deposita sobre el fondo del frasco 1 en el momento de la fabricacion. El sensor colorimetrico es conocido en la bibliograffa de patentes citada anteriormente y no se volvera a describir. La luz LED incide sobre el sensor en un angulo de 45 grados con respecto a la superficie del fondo del frasco 1. La mayor parte de la luz penetra en la estructura del frasco e incide sobre el sensor colorimetrico 2. Parte de la luz se reflejara fuera del material plastico del frasco y el sensor 2 a 45 grados con respecto a la superficie del fondo del frasco, pero en una direccion opuesta a la luz incidente (por ejemplo, el angulo de reflexion es equivalente al angulo de incidencia). Gran parte de la luz restante es dispersada desde la superficie y el interior del sensor. El sensor 2 cambia su color cuando vana el porcentaje de CO2 en el frasco, el color vana de azul a amarillo, respectivamente. Un fotodetector de silicio 5 "mira fijamente" (es decir, monitoriza continuamente la senal de intensidad dispersada) a la region del sensor 2, donde la luz procedente del LED interactua con el sensor. La intensidad de la luz dispersada que es detectada por el fotodetector es proporcional al nivel de CO2 dentro del frasco 1. La Figura 1 muestra tambien la electronica asociada que incluye una fuente de corriente 6, un convertidor de corriente a voltaje 7 y un filtro de paso bajo 8. Una serie de puntos de datos de medida (intensidad, tiempo de incubacion) en forma digital se almacenan en la memoria y son utilizados por un ordenador (por ejemplo, un ordenador de uso general, estacion de trabajo o unidad central de proceso incluidos con el sistema de la Figura 1) para determinar si se ha producido crecimiento microbiano dentro del recipiente de la muestra, como se explica en la presente memoria.

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Los metodos de esta descripcion estan disenados para evaluar las curvas de ensayo o de crecimiento y determinar si la curva es indicativa o no de crecimiento de organismos. Los datos de entrada a los metodos son un valor de respuesta del ensayo (por ejemplo, valor de la intensidad de un fotodetector) y el tiempo de incubacion correspondiente en el que se obtuvo el valor. Se asume que la curva de crecimiento presentara una forma tfpica cuando este presente un organismo en la muestra. La forma de la curva de crecimiento "tfpica" se muestra en la Figura 2 como un grafico 200 de medidas de intensidad en funcion del tiempo. El grafico 200 contendra un mmimo de dos de las siguientes: una fase de latencia 201, una fase de crecimiento exponencial 202, y una fase estacionaria 203. Tfpicamente, la fase de latencia 201 y la fase de crecimiento exponencial 202 estan presentes en recipientes que contienen el agente microbiano, aunque en la practica ellas pueden no coincidir exactamente con la curva "tfpica" que se muestra en la Figura 2 y tambien pueden surgir errores de medida de un tipo u otro. Estos errores de medida se compensan, como se explica mas adelante y en conjuncion con las figuras 11 y 12.

La transicion del grafico entre la fase de latencia 201 y la fase de crecimiento exponencial 202 es importante aqrn, ya que la fase de crecimiento exponencial normalmente no se produce en condiciones en que no hay crecimiento microbiano. Los metodos de esta descripcion alcanzan una deteccion de esta transicion desde el principio. El metodo tiene varias caractensticas unicas, siendo una que el metodo utiliza dos metodos analfticos diferentes que funcionan en paralelo para detectar el crecimiento de organismos dentro del recipiente de muestra. La primera medida analftica es una medida de la variacion de datos punto a punto. Este metodo analttico se realiza para diferenciar entre un error de medida, o el ruido de los datos, y la actividad biologica. El segundo metodo analttico incorpora medidas del area relativa bajo una grafica de crecimiento de microorganismos como una funcion del tiempo (usando la intensidad de senal como un indicador para el crecimiento), o "curva de crecimiento" en la presente memoria y, en particular los cambios en el area relativa bajo la curva (RAUC) como una funcion del tiempo. Esta tecnica es sensible a la deteccion de puntos de inflexion en la curva de ensayo, y en particular el punto de inflexion en la Figura 2 entre la fase de latencia 201 y la fase de crecimiento exponencial 202. Las dos tecnicas evaluan los datos de medida en paralelo para minimizar el riesgo de un falso positivo o un falso negativo en la interpretacion del ensayo. (Un resultado negativo del ensayo implica que no se ha detectado crecimiento de organismos. Un resultado positivo del ensayo implica que se ha detectado crecimiento de organismos).

Las realizaciones preferidas incorporan el uso de umbrales de decision en tiempo real calculados utilizando los datos de ensayo introducidos para determinar el crecimiento microbiano positivo. Esta estrategia permite que el metodo sea robusto frente a la variacion entre plataformas de medida, medios de ensayo, y organismos de ensayo, en comparacion con los metodos que utilizan umbrales de decision predefinidos. Un desaffo con los algoritmos de desarrollo, en particular en el campo instantaneo, es hacer que el analisis sea robusto frente a fuentes de variacion que contribuyen a la senal que se mide. Tfpicamente, en los metodos de la tecnica anterior, se especifican los umbrales absolutos a la vez que se define el algoritmo que debe tener en cuenta todas las posibles fuentes de variacion. Por el contrario, el presente metodo calcula los umbrales basandose en la variacion de los datos introducidos. Por lo tanto, si la curva es "ruidosa", los umbrales reflejaran el nivel observado de ruido de fondo. En este caso, el analisis sera menos sensible. Si la curva no es "ruidosa", el umbral para la determinacion positiva se ajustara automaticamente para ser mas sensible.

Las realizaciones preferidas de la invencion no requieren un proceso de suavizado de datos complejos que opere sobre las medidas del ensayo. Los metodos que suavizan los datos pueden retrasar la interpretacion del ensayo y/o reducir la sensibilidad del algoritmo.

Basandose en la experiencia del trabajo realizado para varios productos del cesionario, el presente inventor ha considerado diversos conceptos matematicos en el desarrollo de los presentes metodos. En primer lugar, el area bajo la curva es otro calculo comunmente utilizado para caracterizar la forma de una curva junto con la velocidad de cambio y la aceleracion. En segundo lugar, es ventajoso utilizar medidas relativas cuando se evalua la actividad de los organismos. Esto puede compensar la diversidad de formas de curvas de crecimiento observadas en aplicaciones clmicas e industriales. Junto con la variacion de organismos, las medidas relativas pueden ser utiles para minimizar los efectos de la variacion de sistema a sistema, lote a lote de frascos, y laboratorio a laboratorio. En tercer lugar, los metodos que pueden diferenciar entre la actividad de los organismos y las desviaciones de senales debidas a los sucesos del proceso podnan mejorar el rendimiento del producto. Se recuerdan conceptos de control de proceso cuando se considera como distinguir entre la variacion natural o aleatoria frente a la variacion que se puede atribuir a factores espedficos.

Una combinacion de estos conceptos llevo al diseno de los metodos descritos en la presente memoria. La comparacion del area bajo una curva de crecimiento del segmento actual de la curva con el segmento previo de la curva proporciona una medida relativa que puede identificar la transicion desde la fase de latencia hasta la fase exponencial. Mediante el analisis de los datos de ensayo durante las primeras etapas de incubacion del frasco de ensayo, se pueden construir lfmites de control que permiten la interpretacion de los datos de ensayo. Los lfmites de control, denominados de aqrn en adelante lfmites de decision, se pueden utilizar para diferenciar entre la variacion aleatoria de la senal de reflectancia, los cambios de la senal de reflectancia debido a sucesos del sistema, y los aumentos de la senal de reflectancia debidos al crecimiento de organismos.

Vision general del metodo de la variacion punto a punto (lectura a lectura)

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La Figura 3 es una ilustracion 300 del metodo de la variacion punto a punto y como se utiliza para determinar una interpretacion de ensayo positivo que indica que se esta produciendo crecimiento microbiano. La Figura 3 muestra la curva de ensayo 200 (intensidad del fotodetector de la Figura 1 en funcion del tiempo), los umbrales de decision superior e inferior 302 y 304, respectivamente, determinados a partir de los datos de medida introducidos, y un grafico de la variacion punto a punto en las medidas adquiridas 306. El grafico de la variacion punto a punto 306 excede el umbral superior 302 para un numero mmimo definido de medidas de ensayo, lo que se interpreta como un ensayo positivo (310) en un tiempo de incubacion de 46,2 horas despues del comienzo del tiempo de incubacion. La Figura 4 es un segundo ejemplo de un grafico de la variacion de los datos punto a punto similar al de la Figura 3, pero que muestra la variacion de los datos punto a punto con mayor detalle. Se debe observar que el grafico de la variacion punto a punto 306 excede el umbral para dos puntos de datos consecutivos lo que se traduce en la interpretacion de ensayo positivo 310, en este ejemplo a las 15,7 horas despues del inicio de la incubacion.

Observese el grafico de la curva 200 de reflectancia (crecimiento) en las figuras 3 y 4. El tiempo de deteccion (310) esta justo en la transicion de la fase de latencia inicial 201 y la fase de crecimiento exponencial 202, lo que indica que en este metodo la identificacion positiva se hace muy pronto en la fase de crecimiento exponencial, cuando la curva de crecimiento exhibe la primera prueba de crecimiento microbiano.

La Figura 5 muestra el grafico de la curva de crecimiento (200) y la variacion de datos punto a punto en condiciones tfpicas de ningun crecimiento microbiano. La variacion punto a punto no excede el umbral superior 302 y por lo tanto no se hizo ninguna determinacion positiva.

La idea basica para el metodo de la variacion punto a punto (figuras 3, 4) es diferenciar entre la variacion normal en las lecturas de la reflectancia y la variacion de la reflectancia que pueda ser atribuida a una actividad de los organismos o a un suceso en el proceso de recogida de datos. Para hacer esto, se calculan los lfmites de decision superior e inferior (figuras 302 y 304) en tiempo real durante la incubacion basados en lecturas reales. Los lfmites se basan en valores para la desviacion estandar de los valores punto a punto (tambien denominados aqu como "lectura a lectura"), y un valor de un parametro de entrada, numero de desviacion estandar lectura a lectura (R2R). La desviacion estandar se calcula con cada nuevo punto de datos de reflectancia, con excepciones. Como con el metodo de RAUC (descrito a continuacion), los valores de la reflectancia recogidos durante un penodo de estabilizacion de la curva de crecimiento (normalmente una o dos horas despues de empezar la incubacion) se ignoran. Tambien, los valores iniciales n de la variacion R2R deben ser menores que el valor de la pantalla de variacion R2R inicial (un parametro de entrada). (n es igual al valor del intervalo de curva sobre el cual se computan las medidas.) Una vez mas, estas excepciones minimizan el riesgo de calcular los lfmites de decision que son demasiado amplios y que no son representativos de la variacion tfpica durante la fase de latencia de crecimiento de organismos.

Vision general del metodo del area relativa bajo la curva de crecimiento (RAUC)

Como se ha indicado antes, el metodo de la variacion de datos punto a punto es opcional, pero en la presente invencion se implementa en paralelo con un segundo metodo que monitoriza el area relativa bajo la curva de crecimiento (RAUC) y, en particular los cambios en el RAUC. La Figura 6 muestra un ejemplo de una curva de crecimiento 200 y dos tiempos de incubacion t1 y t2. El area bajo la curva 600 entre t1 y t2 se calcula utilizando un metodo de aproximacion trapezoidal. Con la condicion de que t1 y t2 esten suficientemente cerca uno de otro la curva 200 se aproxima a una lmea recta y el area A (600) se puede calcular segun la formula:

A = /X (I1 + I2) X (t2- t-i)

donde I1 es la medida de la intensidad en el tiempo ti e I2 es la medida de la intensidad en el tiempo t2.

Como se explicara mas adelante, el metodo de RAUC monitoriza los cambios en el area relativa bajo la curva, denominados "variacion de RAUC" en la presente memoria. La Figura 7 muestra un grafico de la curva de ensayo (crecimiento) 200, la variacion de RAUC 702 y los umbrales de decision superior e inferior 702 y 704 en funcion del tiempo. Se debe tener en cuenta que los umbrales 702 y 704 se calculan en tiempo real por separado a partir de los datos de entrada y por lo general no son los mismos que los umbrales de la Figura 3. Cuando la variacion de RAUC excede el umbral superior 702 para un numero predeterminado de medidas de ensayo como se indica en 708 en la Figura 7, se hace una interpretacion de ensayo positivo como se indica en 310. Notese que en esta tecnica la interpretacion de ensayo positivo se hace tambien desde muy pronto en la transicion entre la fase de latencia 201 y la fase de crecimiento exponencial 202 de la curva de crecimiento 202.

La Figura 8 es una ilustracion del metodo de analisis de RAUC en condiciones de un ensayo negativo. Notese que el grafico de la variacion de RAUC 706 tiende a cero y no supera el umbral superior 702, por lo tanto, no se hace ninguna interpretacion positiva.

Ejemplo

Teniendo en cuenta la exposicion anterior y las figuras 3 y 7, esta descripcion presentara una explicacion detallada de un ejemplo del metodo en conjuncion con las figuras 9A, 9B, 10A y 10B. Las figuras 9A y 9B son un diagrama de flujo que muestra el metodo analttico de la variacion de datos punto a punto y las figuras 10A y 10B son un diagrama

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de flujo que muestra el metodo analftico de la variacion de RAUC. Como se ha indicado antes, ambos metodos en la presente invencion se realizan en paralelo.

Datos de entrada y constantes almacenadas:

El metodo utiliza como datos de entrada las siguientes cosas:

1. Puntos de datos de medida ordenados (pares) de la forma (valor de ensayo, tiempo). El "valor de ensayo" en este ejemplo es una medida de intensidad en unidades arbitrarias. El "tiempo" es el tiempo de incubacion (por ejemplo, 10,35 horas). El sistema que registra los puntos de datos de medida incluye un reloj y con cada medida se asocia una marca de tiempo para formar la porcion de tiempo del punto de datos.

2. Un factor de multiplicacion (numero real positivo) utilizado cuando se calculan los umbrales de decision 302 y 304 para la tecnica de la variacion de datos punto a punto (figuras 3, 9A-9B). El uso de tal factor es analogo al ajuste de un nivel de confianza para un intervalo estadfstico.

3. Un factor de multiplicacion (numero real positivo) utilizado cuando se calculan los umbrales de decision 702, 704 para la variacion en el metodo de RAUC (figuras 7, 10a-10B). El uso de tal factor es analogo al ajuste de un nivel de confianza para un intervalo estadfstico.

4. Un numero de valores de ensayo (numero entero) a ser utilizado cuando se compara el area relativa bajo la curva de una seccion de la curva de ensayo con una seccion previa de la curva de ensayo. Este es el parametro x en la siguiente exposicion.

5. Los valores umbral (numero entero) que corresponden al numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision que necesitan ser observados antes de interpretar un ensayo como positivo. Un valor necesita ser especificado para el metodo de la variacion punto a punto (valor "NR2RP" mas adelante), y un segundo valor necesita ser especificado para el metodo del area relativa bajo la curva (valor "NRAUCP" mas adelante).

6. Periodo de tiempo (numero real positivo que corresponde a un numero de horas) durante las etapas iniciales de incubacion cuando se ignoraran los valores de ensayo. Para algunos ensayos, se requiere un penodo de tiempo para estabilizar el ambiente del ensayo. Este parametro se denomina CSP (periodo de estabilizacion de la curva) en la presente memoria.

7. Un tiempo maximo de incubacion, despues del cual el proceso se para si no se ha registrado un resultado de ensayo positivo por ninguno de los metodos, variacion punto a punto o el metodo de RAUC. Si se ha alcanzado el tiempo maximo de incubacion sin que se haya obtenido un resultado de ensayo positivo el metodo registra un resultado negativo del ensayo.

Una descripcion de alto nivel del metodo es como sigue:

Utilizar datos a partir del tiempo de incubacion despues del periodo de estabilizacion de la curva (CSP):

Repetir lo siguiente para cada nuevo punto de datos hasta que la curva sea interpretada como positiva o se observe el tiempo maximo de incubacion.

Para el procedimiento de analisis punto a punto de los datos, calcular la diferencia entre dos puntos de datos consecutivos escalados en el tiempo entre puntos de datos (variacion punto a punto).

Si la diferencia calculada es el valor inicial de la diferencia, calcular los umbrales de decision superior e inferior

Si la diferencia calculada no es el valor inicial y la variacion punto a punto cae dentro de los umbrales superior e inferior relacionados, actualizar los umbrales superior e inferior utilizando la informacion adicional.

Si la diferencia calculada no es el valor inicial y la variacion punto a punto esta por debajo del umbral inferior, el numero de puntos de datos inferior a 4 veces x sera marcado como datos poco fiables para los calculos del algoritmo de RAUC.

Si la variacion punto a punto esta por encima del umbral superior, incrementar el numero de los valores de variacion punto a punto consecutivos por encima del lfmite de control superior.

Tambien, si la variacion punto a punto esta por encima del umbral superior, el numero de puntos de datos inferior al valor de 2 veces x sera marcado como datos poco fiables para los calculos del algoritmo de RAUC.

Si la variacion punto a punto no esta por encima del umbral superior, fijar a cero el numero de valores de variacion punto a punto consecutivos por encima del umbral superior.

Si el numero de valores de variacion punto a punto consecutivos por encima del umbral superior es igual al numero de valores de variacion punto a punto necesarios para determinar una curva positiva (NR2RP), la curva se interpreta como positiva.

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Para el metodo del area relativa bajo la curva (RAUC), calcular el area del trapezoide formado por dos puntos de datos de medida consecutivos ordenados.

Cuando se dispone de datos suficientes, calcular el area relativa bajo la curva (RAUC) basada en el valor de x (el area bajo la curva se calcula por el metodo de aproximacion trapezoidal).

Calcular la diferencia entre el valor de RAUC actual y el valor de RAUC previo.

Si la diferencia calculada es el valor inicial de la diferencia, calcular los umbrales de decision superior e inferior de RAUC.

Si se ha realizado mas de un calculo de la diferencia y el valor de RAUC cae dentro de los umbrales superior e inferior relacionados y los datos se marcan como fiables, actualizar los umbrales superior e inferior utilizando la informacion adicional.

Si el valor de RAUC es mayor que el umbral superior y los datos son fiables, incrementar el numero de valores de RAUC consecutivos por encima del umbral superior.

Si el valor de RAUC no es mayor que el umbral superior, fijar en cero el numero de valores de RAUC consecutivos por encima del umbral superior.

Si el numero de valores consecutivos de RAUC por encima del umbral superior es igual al numero de valores de RAUC para determinar una curva positiva (NRAUCP), la curva se interpreta como positiva.

Volviendo ahora a la Figura 9A, se describira una realizacion espedfica del metodo de la variacion punto a punto. El metodo de la Figura 9A esta codificado como instrucciones de software que se ejecutan en una unidad de proceso tfpica (CPU) de un ordenador de uso general, estacion de trabajo o unidad de proceso asociada con el sistema de incubacion y el ensayo de Figura 1 o Figura 17, descrito mas adelante. El metodo comienza en la etapa 900 de adquisicion de un valor de ensayo en la forma de (valor, tiempo).

En la etapa 902, calcular la diferencia entre el valor de ensayo actual y el valor de ensayo previo y escalar la diferencia por el intervalo de tiempo de incubacion entre los dos valores de ensayo. El escalado en el intervalo de tiempo de incubacion entre los dos puntos de datos compensa de las inconsistencias que se obtienen entre los tiempos de los valores de ensayo.

En la etapa 904, determinar si la diferencia de 902 es o no el primer valor de diferencia.

Si lo es, continuar en la etapa 914

En la etapa 914, calcular los umbrales de decision superior e inferior punto a punto (302 y 304 de la Figura 3) utilizando los valores de desviacion estandar lectura a lectura (R2R) como sigue:

La formula para la desviacion estandar de R2R viene dada por:

(Ecuacion 1) Desviacion estandar de R2R s = Suma (de las diferencias entre dos valores consecutivos de R2R 1 a n) /n

donde la diferencia entre dos valores consecutivos de R2R es | R2R previo - R2R actual | y

n es el valor de R2R asociado con la lectura actual de la reflectancia. (Los valores de RAUC a ser ignorados no estan incluidos en la secuencia 1 a n)

Las formulas para los lfmites de decision superior e inferior vienen dadas por:

Lfmite de decision R2R inferior (304, Figura 3) = ks Lfmite de decision R2R superior (302, Figura 3) = -ks

Donde k es el numero de desviacion estandar de R2R (un parametro de entrada), y s es la desviacion estandar de R2R calculada por la Ecuacion 1.

Si no lo es (etapa 904), continuar en la etapa 906.

En la etapa 906, determinar si una diferencia recien obtenida (etapa 902) cae o no dentro de los umbrales de decision superior e inferior existentes calculados en la etapa 914.

Si es sf, la diferencia cae dentro de los umbrales de decision superior e inferior, continuar con las etapas 908, 910, 912, 914 y 916.

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En la etapa 908, fijar a cero el recuento de los puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior.

En la etapa 910, actualizar la suma acumulativa de las diferencias.

En la etapa 912, actualizar la desviacion estandar (s, ecuacion 1).

En la etapa 914, calcular los umbrales de decision superior e inferior como se ha descrito previamente.

Continuar en la etapa 916.

Si es no, en la etapa 906, la diferencia no cae dentro de los umbrales de decision superior e inferior, el proceso pasa a las etapas que se muestran en la Figura 9B.

En la etapa 920 (Figura 9B), determinar si la diferencia esta por encima del umbral superior o por debajo del umbral inferior.

Si esta por encima, continuar en las etapas 922, 924, 926 y 928:

En la etapa 922, incrementar en 1 el recuento del numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision.

En la etapa 924, definir un intervalo de tiempo durante el cual el metodo RAUC no puede hacer una interpretacion (figuras 10A y 10B). En este punto, es posible que se haya producido un error de medida del ensayo. Por lo tanto, la etapa 924 evita que el metodo RAUC interprete la curva de ensayo como positiva en base a cambios en los datos no necesariamente relacionados con la actividad microbiologica.

En la etapa 926, comparar el numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior con el valor del parametro de entrada (NR2RP), el valor requerido para indicar una interpretacion de ensayo positivo.

Si el numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior es igual a NR2RP, (etapa 928), se registra un resultado positivo en la etapa 930.

Si el numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior no es igual a NR2RP, (etapa 928), continuar con la etapa 916.

Si la medida de la diferencia recien obtenida esta por debajo del umbral inferior (302) en la etapa 920, continuar en la etapa 932.

En la etapa 932, definir el intervalo de tiempo durante el cual el metodo de RAUC no puede hacer una interpretacion (figuras 10A y 10B). Como se ha mencionado antes, esto evita una posible interpretacion de un falso positivo.

En la etapa 934, fijar en cero el recuento de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior.

Continuar en la etapa 916.

En la etapa 916, comparar el tiempo de incubacion actual con el tiempo maximo de incubacion para determinar si se termina o no el analisis,

Si es sf, el tiempo de incubacion actual es igual al tiempo maximo de incubacion, terminar el ensayo y la interpretacion es un resultado negativo.

Si es no, el tiempo de incubacion actual es menor que el tiempo maximo de incubacion, volver a la etapa 900. Continuar el procedimiento hasta que se obtenga una interpretacion de ensayo positivo a traves del analisis de los datos punto a punto, hasta que se obtenga una interpretacion de ensayo positivo a traves del analisis de RAUC, o hasta que el procedimiento alcance el tiempo maximo de incubacion.

El metodo de RAUC se describira ahora con referencia a las figuras 7 y 10A-10B. El procedimiento comienza por la obtencion de un par de datos del resultado del ensayo (900, Figura 9A).

En la etapa 1000, calcular el area bajo la curva (AUC) para la porcion de la curva determinada por los ultimos valores de ensayo 1 a x y el area bajo la curva para la porcion de la curva determinada por los ultimos valores de ensayo x a (2x -1), donde x es el numero de valores de ensayo especificados en los datos de entrada.

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En la etapa 1002, calcular la diferencia en tanto por ciento (RAUC) en el area bajo la curva usando la siguiente formula

RAUC = 100 (AUC(2x-1) a x - AUC1 a x) / AUC1 a x En la etapa 1004, calcular la diferencia entre el valor RAUC actual y el valor RAUC previo.

En la etapa 1006, determinar si la diferencia de la etapa 1004 es o no el valor de la primera diferencia.

Si es sf, continuar en la etapa 1012.

En la etapa 1012, calcular el valor medio de RAUC.

En la etapa 1014, calcular la suma acumulativa de las diferencias de RAUC.

En la etapa 1016, calcular la diferencia media basada en la etapa 1014.

En la etapa 1018 calcular los umbrales de decision superior e inferior de RAUC utilizando la siguiente formula:

Umbral de decision superior (702) = (RAUC media) + (factor de multiplicacion) (diferencia media)

Umbral de decision inferior (704) = (RAUC media) + (factor de multiplicacion) (diferencia media)

[Nota, el factor de multiplicacion para calcular los umbrales de decision de RAUC se define como un parametro de entrada].

Continuar en la etapa 1020.

Si es no, en la etapa 1006 se ha calculado mas de un valor de diferencia, continuar en la etapa 1008.

En la etapa 1008, determinar si el valor de RAUC recien obtenido, en 1002, cae o no dentro de los umbrales de decision de RAUC.

Si es sf, continuar en la etapa 1010.

En la etapa 1010, fijar a cero el recuento del numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior.

En la etapa 1012, calcular el valor medio de RAUC.

En la etapa 1014, calcular la suma acumulativa de las diferencias de RAUC.

En la etapa 1016, calcular la diferencia media basada en la etapa 1014.

En la etapa 1018 calcular los umbrales de decision superior e inferior de RAUC como se ha descrito anteriormente.

Continuar en la etapa 1020.

Si es no, en la etapa 1008, el valor de RAUC recien obtenido no cae dentro de los umbrales de decision, continuar en la etapa 1022 (vease la Figura 10B).

En la etapa 1022, se determina si el valor RAUC cae o no por encima del umbral de decision superior Si es sf, se continua en la etapa 1024

En la etapa 1024, determinar si hay o no una limitacion del procedimiento de analisis de los datos punto a punto (de las etapas 922 o 930).

Si es sf, continuar en la etapa 1036

En la etapa 1036, fijar a cero el recuento del numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior.

Despues, continuar en la etapa 1020. Al continuar en esta etapa, en este punto del proceso, se evita la posibilidad de una interpretacion de falso positivo de la curva debido a error de medida. Ademas, el punto de datos no se utiliza para actualizar los umbrales inferior y superior de RAUC. Por lo tanto, los datos de

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error de medida no inflan incorrectamente la evaluacion de la variacion natural del procedimiento.

Si es no en la etapa 1024, continuar en la etapa 1026

En la etapa 1026, incrementar el recuento de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior.

En la etapa 1028, comparar el numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral con el valor que indica una interpretacion de ensayo positivo (NRAUCP).

Si es igual (etapa 1030) al parametro de entrada, registrar un resultado de ensayo positivo en la etapa 1032. El proceso termina entonces (1034).

Si no es igual al parametro de entrada, continuar en la etapa 1036.

En la etapa 1036, fijar a cero el recuento del numero de puntos de datos sucesivos por encima del umbral de decision superior y despues continuar en la etapa 1020.

Si es no (en la etapa 1022), el valor de RAUC recien obtenido no esta por encima del umbral de decision superior, continuar en la etapa 1036 y despues en la etapa 1020.

En la etapa 1020, comparar el tiempo de incubacion actual con el tiempo maximo de incubacion para determinar si se termina o no el analisis.

Si es sf, terminar el ensayo y la interpretacion es un resultado negativo, etapa 1022.

Si es no, el tiempo de incubacion actual es menor que el tiempo maximo de incubacion, volver a la etapa 1000 con el siguiente par de datos. Continuar el procedimiento hasta que se obtenga una interpretacion de ensayo positivo a traves del analisis de datos punto a punto, hasta que se obtenga una interpretacion de ensayo positivo a traves del analisis de RAUC, o hasta que el procedimiento alcance el tiempo maximo de incubacion.

Como se ha mencionado anteriormente, los dos metodos (punto a punto y RAUC) operan preferiblemente, y, en la presente invencion, operan en paralelo y en determinadas condiciones el metodo de punto a punto puede operar para evitar que el metodo de RAUC indique un resultado positivo durante un cierto penodo de tiempo. Como se indica por el bloque 906 de la Figura 9A, en el metodo de punto a punto, con cada nuevo punto de datos (valor de ensayo), el valor de ensayo se compara con los lfmites de decision superior e inferior. Cuando el valor de ensayo esta dentro de los lfmites, el valor se utiliza para actualizar la desviacion estandar (etapa 912), los dos umbrales de decision (etapa 914), y el recuento positivo se fija en cero (etapa 908). Cuando el valor de ensayo esta por encima del lfmite de decision superior, el valor no se utiliza para actualizar la desviacion estandar ni el lfmite de decision (vease la Figura 9B, etapas 922, 924 y 926). En adicion, se deben considerar dos casos.

Un caso es que el aumento de los valores de ensayo sea un resultado de la actividad de los organismos. Para cubrir esta posibilidad, el recuento positivo lectura a lectura se aumenta en 1 (etapa 922). Si el aumento en los valores de R2R se debe a la actividad de los organismos, se produciran una serie de valores por encima del lfmite de decision superior. Cuando el recuento positivo de R2R alcanza el valor del numero positivo R2R, la curva se interpreta como positiva, como se indica por las etapas 926, 928 y 930.

El segundo caso es que el aumento se deba a algun factor del proceso que interfiera. Con el fin de evitar un resultado falso positivo con el algoritmo de RAUC, se inicia una condicion de alerta de desviacion positiva que evita que el algoritmo de RAUC interprete la curva como positiva. Por otra parte, los datos de reflectancia que se observan durante la condicion de alerta no se utilizan para actualizar la media de RAUC, la desviacion estandar ni el lfmite de decision. Existe la condicion de alerta durante un penodo especificado de tiempo.

Si el valor R2R esta por debajo del lfmite de decision inferior, se sabe que un factor del proceso ha provocado una disminucion de la reflectancia. Para esta situacion, como se indica en la etapa 932, se crea una condicion de alerta de desviacion negativa durante un tiempo especificado. Una vez mas, el algoritmo de RAUC no puede interpretar una curva como positiva durante este penodo de alerta, y los datos de reflectancia no se utilizan para los calculos de la media de RAUC, ni de la desviacion estandar ni del lfmite de decision.

El valor del numero de desviacion estandar lectura a lectura (un parametro de entrada utilizado en el calculo de los umbrales de decision, etapa 914) es cntico en la determinacion de un rendimiento optimo para el metodo de la variacion punto a punto y el metodo de RAUC. Cuando el valor de este parametro de entrada es demasiado pequeno, se consideraran demasiados puntos de datos fuera de la variacion normal del proceso. Como resultado, se crearan condiciones innecesarias de alerta de desviacion positiva y negativa. Esto puede eliminar potencialmente las ventajas del algoritmo de RAUC. Los valores del numero de desviacion estandar R2R que son demasiado grandes pueden dar lugar a factores que interfieren que no van a ser detectados. Por lo tanto, el riesgo de resultados falsos

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positivos se aumentana. En condiciones tipicas de recogida de datos, el algoritmo de RAUC es capaz de detectar cambios mas sutiles en la reflectancia debido a la actividad de los organismos que el algoritmo de punto a punto. El algoritmo de punto a punto cumple una funcion valiosa porque puede detectar sucesos del sistema que complican la interpretacion de la curva. La optimizacion de este parametro de entrada se puede realizar por un ejercicio rutinario de prueba y error para un sistema dado, tipo de recipiente y sensor, etc.

Las figuras 8B y 8C proporcionan una ilustracion de los algoritmos de punto a punto y de RAUC trabajando simultaneamente con los datos de reflectancia que contienen los efectos de la variacion de temperatura. La Figura 8B es un grafico de la variacion punto a punto (306, incluyendo los umbrales superior e inferior 302 y 304, y una curva de ensayo (crecimiento) 202 de las medidas de reflectancia. Observese que los lfmites de decision punto a punto (umbrales 302 y 304) capturan solo la porcion de los datos de reflectancia que no son afectados por los cambios de temperatura.

La Figura 8C muestra que el lfmite de decision de RAUC se ajusta a los datos a lo largo de la incubacion tomando instrucciones del algoritmo de punto a punto para ignorar los puntos de datos extremos. Lo mas importante, el algoritmo de punto a punto invoca condiciones de alerta en aproximadamente 20 y 25 horas que impiden que el algoritmo de RAUC interprete la curva como positiva. Al final, se determina apropiadamente que la curva es positiva en poco mas de 43 horas por el algoritmo de RAUC.

Un caso especial es posible cuando los datos de reflectancia son ruidosos alrededor del punto de inflexion entre las fases de latencia y exponencial. El algoritmo de punto a punto puede senalar una condicion de alerta que impide que el algoritmo de RAUC declare la curva positiva cuando, de hecho, la curva es positiva. El algoritmo de punto a punto eventualmente proporcionara un resultado positivo, pero con un retraso. En este caso especial, una condicion adicional se comprueba como parte del algoritmo de RAUC. Haciendo referencia de nuevo a la Figura 8B, los valores de RAUC afectados por sucesos que interfieren tienen la caractenstica de un montfculo y/o una depresion. Los valores de RAUC asociados con la actividad de los organismos durante la fase exponencial estan consistentemente por encima del lfmite de decision durante un penodo prolongado de tiempo. Si el recuento de RAUC positivo es igual al numero positivo de RAUC extendido, la curva se interpreta como positiva, incluso si existe una condicion de alerta del algoritmo de punto a punto.

La Figura 8D proporciona un ejemplo del caso especial. En la Figura 8C, varios valores R2R estan por encima del lfmite de decision superior despues de 25 horas. Estos valores crean alertas de desplazamiento. Sin embargo, la Figura 8E muestra que los valores de RAUC estan consistentemente por encima del lfmite de decision despues de 30 horas, aproximadamente. En este caso el numero de valores de RAUC por encima del umbral de decision es suficiente para conseguir que el frasco sea declarado como positivo por el metodo de RAUC.

La Figura 11 es una ilustracion del metodo de analisis de los datos punto a punto con un ensayo negativo, con errores de medida en la curva de crecimiento mostrados en 1100 y 1102, que provocan picos 1103 y 1104 en el grafico de la variacion punto a punto. Debido a que estos picos 1104 representan un unico caso por encima del umbral 302 y que el parametro NR2RP se fija en un numero entero mayor que uno (por ejemplo, dos, tres o cuatro), el error de medida no da como resultado una interpretacion de falso positivo.

La Figura 12 es una ilustracion del metodo de analisis RAUC con un ensayo negativo, con errores de medida en la curva de crecimiento indicados en 1200 y 1202, que causan picos 1204 y 1206 en el grafico de variacion de RAUC (708). Sin embargo, existe un unico pico 1206 por encima del umbral 702, por lo tanto, el numero de puntos sucesivos por encima del umbral 702 es uno, lo que es menos que el valor necesario para una interpretacion positiva (NRAUCP) en este ejemplo, y por lo tanto el error de medida no da lugar a una interpretacion de falso positivo.

Metodologfa de incubacion temprana/entrada retrasada

Como se ha senalado antes, otro aspecto de esta descripcion se dirige a una metodologfa para la identificacion de un recipiente de una muestra como positivo para el crecimiento microbiano y por lo tanto la presencia del agente microbiano en la situacion en la que el recipiente se retrasa durante un penodo de tiempo inusualmente largo antes de la instalacion del recipiente en el sistema de deteccion que incorpora los metodos de la presente invencion. En particular, los metodos de punto a punto y del area relativa bajo la curva, que se han descrito con detalle anteriormente, son capaces de interpretar las medidas de datos del sistema de deteccion del recipiente en el uso clmico tfpico - es decir, cuando el frasco de ensayo es inoculado con la muestra y el frasco se carga inmediatamente en el sistema para la incubacion y la lectura. Sin embargo, algunos laboratorios mantendran el frasco inoculado (posiblemente pero no necesariamente en condiciones de incubacion) durante un penodo prolongado de tiempo antes de la carga del frasco en el sistema de deteccion. El retraso en la carga puede dar lugar a una reflectancia o curva de crecimiento incompleta. Por incompleta, se quiere indicar que se puede perder la totalidad de la fase de latencia y toda, parte o la mayor parte de la fase exponencial de la curva de crecimiento "tipica" de la Figura 2.

Una metodologfa, descrita en esta seccion "la metodologfa de incubacion temprana" proporciona un analisis separado de los datos disenados espedficamente para esta incubacion temprana o "entrada retrasada" en el escenario del ensayo. Esta metodologfa se puede realizar en paralelo con las metodologfas de la variacion "punto a

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punto" y/o del "area relativa bajo la curva de crecimiento" explicadas en detalle anteriormente, de modo que un recipiente se identifica correctamente como positivo independientemente de si el recipiente ha sido sometido o no a una entrada tardfa en el sistema de deteccion. Alternativamente, este metodo se puede realizar solo, por ejemplo, en la situacion en la que se sabe que un recipiente dado es introducido en el sistema de deteccion despues de que haya transcurrido un cierto penodo de tiempo prolongado despues de la inoculacion de la muestra en el recipiente.

La curva de crecimiento de la Figura 13 es representativa de la que se puede esperar en la situacion de "entrada retrasada". La curva de crecimiento en este ejemplo se representa como una serie de medidas 1300 de intensidad o de reflectancia en funcion del tiempo de incubacion siendo t = 0 el tiempo en que el recipiente es interrogado por primera vez por el aparato de deteccion (vease la Figura 1 por ejemplo) en el instrumento de deteccion. La curva de crecimiento incluye una parte de la fase de crecimiento exponencial 202 (tfpicamente solo una pequena parte de la fase de crecimiento exponencial que se produce al final de la misma) y una fase estacionaria extendida 203 que normalmente dura mucho mas tiempo que la fase de crecimiento exponencial.

La metodologfa de incubacion temprana proporciona un analisis separado de los datos disenados espedficamente para el ensayo de entrada retrasada. Se pueden utilizar tres metodos alternativos diferentes en la metodologfa de deteccion de la incubacion temprana para identificar un recipiente como positivo para el crecimiento microbiano, incluyendo un primer metodo que calcula la media de los valores de reflectancia y la compara con un umbral (vease la Figura 14), un segundo metodo que utiliza el valor medio de punto a punto y la comparacion con un umbral (vease la Figura 15), y un tercer metodo en el que el numero de valores punto a punto consecutivamente crecientes se cuenta y se compara con un valor umbral especificado (vease la Figura 16). Estos metodos se describen a continuacion.

Para este analisis, se requiere el siguiente conjunto de parametros de entrada.

1. Intervalo de la curva: Numero de valores de reflectancia consecutivos (1300, en la Figura 13) sobre los cuales se realizan los calculos. (Numero entero)

2. Penodo de estabilizacion de la curva: Periodo inicial de incubacion, en horas, cuando se considera que los datos de reflectancia son inestables. (Numero real)

3. Tiempo maximo de incubacion temprana: El tiempo maximo de incubacion, en horas, para interpretar una curva como positiva durante la incubacion temprana. (Numero real)

4. Umbral positivo de los valores punto a punto consecutivos crecientes: Valor umbral para determinar si una curva es positiva cuando el tiempo de incubacion es menor que el valor maximo de incubacion temprana. En general, el numero de valores punto a punto consecutivos crecientes debe ser mayor que los criterios especificados requeridos para que una curva de crecimiento sea interpretada como positiva. (Numero entero)

5. Umbral positivo del valor medio punto a punto: Valor umbral para determinar si una curva es positiva cuando el tiempo de incubacion es menor que el valor maximo de incubacion temprana. Se calcula una media truncada basada en los valores consecutivos punto a punto y se compara con el valor umbral especificado. El numero de valores consecutivos corresponde al valor del intervalo de la curva. (Numero real)

6. Umbral positivo del valor de reflectancia: Valor umbral para determinar si una curva es positiva cuando el tiempo de incubacion es menor que el valor maximo de incubacion temprana. Se calcula una media truncada basada en los valores consecutivos de reflectancia y se compara con el valor umbral especificado. El numero de valores consecutivos corresponde al valor del intervalo de la curva. (Numero entero)

7. Pantalla de la variacion punto a punto inicial: Un lfmite superior de los valores de la variacion punto a punto basado en la distribucion de los valores a partir de frascos negativos. (Numero real)

En general, los datos disponibles entre el final del periodo de estabilizacion de la curva y el tiempo maximo de incubacion temprana se procesan utilizando la metodologfa de incubacion temprana. Como se ha senalado antes, hay tres formas alternativas en las que se puede interpretar una curva como positiva utilizando el algoritmo de incubacion temprana - 1) valor medio de reflectancia positivo, 2) valor medio de punto a punto positivo, y 3) numero de valores punto a punto consecutivos crecientes igual a un valor especificado. La metodologfa de incubacion temprana puede utilizar 1, 2 o los 3 de estos metodos, por ejemplo, puede utilizar los tres metodos en paralelo y si uno cualquiera de ellos da como resultado una identificacion positiva los recipientes se marcan como positivos.

1) metodo del valor medio de reflectancia positivo (vease la Figura 14)

El metodo del valor medio de reflectancia positivo trata el caso en que la fase de latencia y la mayor parte, si no el total, de la fase exponencial 202 de la curva de reflectancia faltan, como se muestra por ejemplo en las figuras 13 y 14. En otras palabras, la curva es en su mayor parte solo la fase estacionaria (203 en la Figura 13). El metodo del valor medio de reflectancia positivo calcula una media truncada de los valores x de reflectancia mas recientes (1300 en la Figura 13), donde x es igual al valor del parametro del intervalo de la curva (como se ha definido antes). Vease la Figura 14. Si el valor de la media truncada de la reflectancia observado actualmente es mayor que el umbral del

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valor de reflectancia positivo, la curva de crecimiento se considera positiva y el recipiente de la muestra se marca como positivo.

La formula para el valor de la media truncada de la reflectancia viene dada por

Media de reflectancia = [suma de (valores de reflectancia 1 a x) - maximo de (valores de reflectancia 1 a x) - mmimo de (valores de reflectancia 1 a x)] / (intervalo de la curva - 2)

donde x se define como el valor del intervalo de la curva.

2) metodo del valor medio punto-a-punto positivo (Figura 15)

El metodo del valor medio punto a punto positivo es el mas adecuado para el caso en que una porcion suficiente de la fase exponencial este disponible para el analisis. El grafico de la Figura 13 es un ejemplo. Para este metodo, se calcula la media truncada de los valores x punto a punto mas recientes (1300 en la Fig. 13) y se compara con el umbral del valor medio punto a punto positivo. Si el valor medio es mayor que el umbral del valor medio punto a punto positivo, la curva se clasifica como positiva. En el ejemplo de la Figura 15, la clasificacion positiva se hace en 1,75 horas, como se indica por la leyenda "positivo" en la figura.

La formula para el valor de la media truncada punto a punto (P2P) viene dada por

Media de P2P = [suma de (valores P2P 1 a x) - maximo de (valores P2P 1 a x) - mmimo de (valores P2P 1 a x)] / (intervalo de la curva - 2)

donde x se define como el valor del intervalo de la curva.

3) metodo del numero de valores punto a punto consecutivos crecientes igual a un valor especificado. (Figura 16)

El metodo del numero de valores punto a punto consecutivos crecientes mayor que un valor especificado se dirige tambien a los casos en que se captura un segmento de la fase exponencial de la curva de reflectancia, como en el caso de la Figura 13. Con este enfoque, cada valor punto a punto se compara con el valor de la pantalla inicial de variacion punto a punto. Si los valores punto a punto de incubacion temprana son consistentemente mayores que el valor de la pantalla es probable que los datos de reflectancia correspondan a la parte exponencial de la curva. Se utiliza un contador para determinar cuando se ha obtenido un numero suficiente de valores P2P consecutivos crecientes. El contador se computa utilizando la siguiente logica:

Si el valor actual de P2P es mayor que el valor de la pantalla inicial de variacion punto a punto y el valor actual de P2P es mayor que el 85 % del valor P2P previo, aumentar el contador en 1. En otro caso reiniciar el contador a cero.

Durante el penodo de incubacion temprana, el contador se compara con el umbral positivo de valores punto a punto consecutivos crecientes. Cuando el contador es igual al valor umbral, la curva se clasifica como positiva. En el ejemplo de la Figura 16, la curva se clasifica como positiva en aproximadamente 2,4 horas, cuando el grafico positivo consecutivo creciente cruza por primera vez el umbral que se muestra en la figura.

Efecto de los parametros de entrada sobre la interpretacion del ensayo

Se evaluo un conjunto de 5218 curvas de ensayo utilizando tres combinaciones diferentes de parametros de entrada con el presente metodo. Con fines de comparacion, las mismas 5218 curvas fueron evaluadas utilizando un metodo utilizado actualmente en el instrumento BacT/ALERT (metodo de la tecnica anterior). De las 5218 curvas de ensayo, 1559 no muestran evidencia de crecimiento de organismos. Las 3659 curvas restantes presentan evidencia de crecimiento de organismos. La Tabla 1 resume los 3 conjuntos de parametros de entrada. La Tabla 2 proporciona una comparacion de los resultados del ensayo del presente metodo con cada uno de los 3 conjuntos de parametros de entrada y el metodo anterior.

Tabla 1: Combinaciones de parametros de entrada evaluadas

Parametro: Conjunto 1 Conjunto 2 Conjunto 3

Factor de multiplicacion punto a punto: 2 1,75 1,75

Factor de multiplicacion de RAUC: 19 19 21

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Tabla 2: Comparacion de los resultados del algoritmo

Resultados: Tecnica anterior Presente metodo

Conjunto 1: Conjunto 2 Conjunto 3

Interpretacion: 1558/1559 1549/1559 1556/1559 1557/1559

negativa correcta: 99,9 % 99,4 % 99,8 % 99,9 %

Interpretacion: 3622/3659 3659/3659 3649/3659 3646/3659

positiva correcta: 99,0 % 100,0 % 99,7 % 99,6 %

En adicion a la interpretacion del ensayo, se comparo el tiempo de deteccion (TTD) entre los metodos de esta descripcion y un metodo de la tecnica anterior. La Tabla 3 proporciona un resumen de la comparacion.

Tabla 3: Comparacion del tiempo de deteccion con respecto a la tecnica anterior

Medida: Conjunto 1 Conjunto 2 Conjunto 3

Reduccion media TTD en horas: 2,5 h 2,2 h 2,1 h

Por lo tanto, los presentes metodos de la invencion reducen el tiempo de deteccion positiva del crecimiento microbiano en mas de dos horas en cada uno de los tres conjuntos en comparacion con los metodos existentes.

Ejemplos de maquinas /sistemas de deteccion

Los metodos de esta descripcion pueden ser implementados en sistemas que combinan unidades de incubacion, medida, y procesado, por ejemplo, el sistema de Robinson et al., documento U.S. 2011/0124028, el sistema BacT/ALERT del cesionario bioMerieux, Inc., sistemas competitivos o sistemas descritos en la bibliograffa de antecedentes de patentes antes citada. Tal sistema se configura en un aparato para incubar el recipiente de muestra (por ejemplo, cercado con suministro de aire caliente), un sistema de medida (vease la Figura 1 o una disposicion similar) que obtiene una serie de puntos de datos de medida mientras se incuba el recipiente de muestra y que almacena los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de la muestra; y un ordenador programado que realiza en paralelo los metodos analfticos (a) y (b), a saber:

(a) un analisis de variacion en los puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida (vease, por ejemplo, las figuras 3, 4 y 9A-9B), y

(b) un analisis de los cambios en el area bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida (vease, por ejemplo, las figuras 7 y 10A-10B),

en donde el ordenador esta programado ademas para:

imponer una limitacion sobre la capacidad del metodo analftico (b) para determinar una condicion positiva durante un penodo de tiempo basandose en el analisis de la variacion en los puntos de datos sucesivos del metodo analftico (a); y

en donde ambos metodos analfticos (a) y (b) incluyen una etapa de proceso para determinar una condicion positiva de crecimiento microbiano dentro del recipiente a partir de los puntos de datos de medida.

En una disposicion, se describe una memoria legible por maquina programada con instrucciones de proceso (software) para su ejecucion por un ordenador de uso general para la ejecucion de las etapas del metodo. Como un ejemplo, el software puede tomar la forma de codigo legible por la maquina residente en un disco duro u otro dispositivo de memoria que ejecute las etapas de las figuras 9-10. Como otro ejemplo, el software se puede cargar en un disco duro y se puede copiar en la memoria dentro de un instrumento de ensayo microbiologico que tiene un aparato de lectura del recipiente de la muestra tal como se presenta en la Figura 1 o una disposicion similar.

La Figura 17 es una ilustracion de un sistema 1400 en la forma de una maquina para detectar los recipientes (tales como frascos) con crecimiento microbiano positivo. El sistema incluye paredes aisladas 1401 y un calentador de incubacion 1418 (convencional) que suministra aire caliente al interior definido por las paredes con el fin de incubar los recipientes almacenados en el mismo en un ambiente controlado, tal como 30 grados centfgrados. El sistema 1400 incluye una puerta de acceso o cajon 1402 que proporciona acceso a los soportes 1404 de los recipientes, tales como por ejemplo soportes con un factor en forma de frasco para recibir frascos de cultivo de sangre o similares.

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El sistema 1400 esta configurado con multiples unidades de medida 1406 que pueden por ejemplo tomar la forma de una fuente de luz y detector como se muestran en la Figura 1 y se han descrito previamente. Las unidades de medida 1406 miden la reflectancia de los recipientes y suministran medidas de la reflectancia (puntos de datos) en forma digital a una memoria legible por ordenador 1408. El sistema incluye ademas un ordenador de uso general 1410 que tiene una unidad central de proceso 1412 y un disco duro de memoria 1414 que almacena el codigo del programa para analizar el par de datos de medidas (valor de reflectancia, tiempo). El codigo de programa implementa los metodos analtticos descritos en detalle anteriormente, a saber, el metodo de la variacion punto a punto, el metodo del area relativa bajo la curva y los metodos para la determinacion de "entrada tardfa" de recipientes positivos descritos en conjuncion con las figuras 13-16. El sistema 1400 incluye ademas una pantalla 1416 acoplada al ordenador 1410 que muestra mensajes al operador, por ejemplo, el estado de los recipientes incubados en el sistema 1400 y si se ha detectado y cuando se ha detectado algun recipiente positivo.

Se apreciara que el sistema mostrado en la Figura 17 normalmente tendra otras caractensticas para el procesado y manipulacion de recipientes de muestras, agitacion de recipientes, etc. como es habitual en las maquinas de este tipo que estan comercialmente disponibles y descritas en la tecnica. Estos detalles se han omitido de la presente exposicion, ya que no son particularmente relevantes. El lector interesado se debe dirigir al instrumento Bac- T/ALERT 3D del cesionario, asf como a Robinson et al., publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos n° 2010/0291619 como un ejemplo de tal sistema. La descripcion del sistema de deteccion en la '619 es un ejemplo de un sistema en el que se pueden implementar los metodos de la invencion. Se apreciara tambien que todas las descripciones anteriores para la operacion de los metodos de la invencion seran aplicables al sistema mostrado en la Figura 17.

Asf, por ejemplo, en un aspecto se describe un sistema (1400) para determinar si tiene lugar o no crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra (por ejemplo, un frasco de la Figura 1) que incluye un aparato (1401, 1418) para incubar el recipiente de muestra; un sistema de medida (1406, Figura 1) que obtiene una serie de puntos de datos de medida del recipiente de muestra mientras se incuba el recipiente de muestra y que almacena los puntos de datos en una memoria legible por maquina (1408), representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra; y un ordenador programado (1410, CPU 1412) que realiza en paralelo los metodos analfticos (a) y (b), a saber:

(a) un analisis de la variacion en los puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida (descrita anteriormente en conjuncion con las figuras 3, 4, 9A-9B), y

(b) un analisis de los cambios en el area bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida (descrita anteriormente en conjuncion con las figuras 7 y 10a-10B), en donde el ordenador esta programado ademas para:

imponer una limitacion sobre la capacidad del metodo analttico (b) para determinar una condicion positiva durante un penodo de tiempo basandose en el analisis de la variacion en los puntos de datos sucesivos del metodo analftico (a); y

Como otro ejemplo, se describe una maquina de ensayos microbiologicos (1400) que comprende un sistema de incubacion (1418) para incubar una pluralidad de recipientes de muestras, un sistema de medida (1406, Figura 1) que obtiene una serie de puntos de datos de medida a partir de los recipientes de muestras mientras el sistema de incubacion incuba los recipientes de muestras, una memoria legible por maquina (1408) que almacena los puntos de datos de medida, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra; y una unidad operativa de proceso 1412 para determinar si los recipientes son positivos para el crecimiento microbiano, ejecutando la unidad de proceso 1412 una secuencia de instrucciones de programa que analiza la serie de puntos de datos de medida, en donde el recipiente esta retrasado en la obtencion de los puntos de datos de medida de tal manera que no estan presentes una fase de latencia ni la mayor parte o la totalidad de una fase de crecimiento exponencial de la curva de crecimiento.

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo para determinar si se produce crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra que comprende las etapas de:

incubar el recipiente de muestra que comprende un medio de la muestra y un medio de crecimiento;

obtener una serie de puntos de datos de medida a partir del recipiente de muestra mientras se incuba el recipiente de muestra y almacenar los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de puntos de datos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra desde el medio de la muestra;

utilizar un ordenador programado para realizar en paralelo los metodos analfticos (a) y (b), a saber:

(a) un analisis de la variacion en puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida, y

(b) un analisis de los cambios en el area bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida; y

imponer una limitacion a la capacidad del metodo analftico (b) para determinar una condicion positiva durante un penodo de tiempo basandose en el analisis de la variacion en los puntos de datos sucesivos en el metodo analftico (a); y

en donde ambos metodos analfticos (a) y (b) incluyen una etapa de proceso para determinar una condicion positiva de crecimiento microbiano dentro del recipiente a partir de los puntos de datos de medida.
2. Un sistema para determinar si se produce crecimiento microbiano dentro de un recipiente de muestra, que comprende:

un aparato para incubar el recipiente de muestra que comprende un medio de la muestra y un medio de crecimiento;

un sistema de medida configurado para obtener una serie de puntos de datos de medida a partir del recipiente de muestra mientras se incuba el recipiente de muestra y para almacenar los puntos de datos en una memoria legible por maquina, representando la serie de datos de puntos de medida una curva de crecimiento del crecimiento microbiano dentro del recipiente de muestra a partir del medio de la muestra; y

un ordenador programado para realizar en paralelo los metodos analfticos (a) y (b), a saber:

(a) un analisis de la variacion en puntos de datos sucesivos en la serie de puntos de datos de medida, y

(b) un analisis de los cambios en el area bajo la curva de crecimiento entre conjuntos de puntos de datos en la serie de puntos de datos de medida,

en donde el ordenador esta programado ademas para:

imponer una limitacion a la capacidad del metodo analftico (b) para determinar una condicion positiva durante un penodo de tiempo basandose en el analisis de la variacion en los puntos de datos sucesivos en el metodo analftico (a); y

en donde ambos metodos analfticos (a) y (b) incluyen una etapa de proceso para determinar una condicion positiva del crecimiento microbiano dentro del recipiente a partir de los puntos de datos de medida.
3. El metodo o el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el metodo analftico (a) determina los casos de error de medida en la serie de puntos de datos de medida.
4. El metodo o el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde ambos metodos analfticos (a) y (b) calculan en tiempo real los umbrales de decision para una interpretacion positiva del crecimiento microbiano utilizando los puntos de datos de medida.
5. El metodo o el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende ademas realizar un metodo analftico (c) en paralelo con los metodos analfticos (a) y (b), comprendiendo el metodo analftico (c) un analisis de la serie de puntos de datos de medida en un caso en el que el recipiente se ha retrasado en la obtencion de los puntos de datos de medida de tal manera que no esta presente una fase de latencia en una curva de crecimiento asociada con los puntos de datos de medida.
6. El metodo o el sistema de la reivindicacion 5, en donde el metodo analftico (c) comprende al menos uno de los siguientes metodos:

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un primer metodo que calcula un valor medio de los puntos de datos de medida y que compara dicho valor medio de los puntos de datos de medida con un umbral,

un segundo metodo que calcula un valor medio de los datos de medida punto a punto y que compara dicho valor medio con un umbral, y

un tercer metodo en el que se cuenta un numero de valores de datos de medida punto a punto consecutivamente crecientes y se compara con un valor umbral especificado, opcionalmente en donde el metodo analftico (c) comprende realizar el primero, segundo y tercer metodos en paralelo.
7. El metodo o el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el recipiente de muestra comprende un frasco, opcionalmente en donde el frasco incluye un sensor colorimetrico interno.
8. El metodo o el sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el recipiente de muestra contiene una muestra biologica obtenida de un ser humano, opcionalmente en donde la muestra biologica comprende sangre o un producto sangumeo.