ES2640624T3 - Derivados de 2-((4-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona y su uso como inhibidores de fosfoinosítido-3-cinasas - Google Patents

Derivados de 2-((4-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona y su uso como inhibidores de fosfoinosítido-3-cinasas Download PDF

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Rudy Laurent Maria Broeckx
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Abstract

Un compuesto de fórmula (I) **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, incluyendo todos los estereoisómeros, tautómeros y derivados isotópicos del mismo.

Description

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descripcion
Derivados de 2-((4-amino-3-(3-fIuoro-5-hidroxifeniI)-1H-pirazoIo[3,4-d]pirimidin-1-iI)metiI)-3-(2-
(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona y su uso como inhibidores de fosfoinosttido-3-cinasas
Campo de la invencion
La invencion se refiere a compuestos que inhiben las fosfoinosttido-3-cinasas, (PI3-cinasas, PI3K). En particular, la divulgacion se refiere a compuestos que inhiben el subtipo PI3K delta y, ademas, el subtipo gamma de las mismas, y a su uso en terapia, incluyendo en combinaciones farmaceuticas, especialmente en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades inflamatorias del pulmon, tales como COPD y asma. La invencion tambien se refiere a metodos de preparacion de dichos compuestos y a composiciones farmaceuticas que comprenden los mismos.
Antecedentes de la invencion
Las cinasas lip^dicas catalizan la fosforilacion de Kpidos para producir especies implicadas en la regulacion de una amplia gama de procesos fisiologicos, incluyendo la migracion y la adhesion celulares. Las PI3-cinasas (PI3K) son protemas asociadas a la membrana y pertenecen a la clase de enzimas que catalizan la fosforilacion de Ifpidos que estan asociados en sf mismos con membranas celulares. La isozima PI3K delta (PI3K 6) es una de cuatro isoformas de las PI3K-cinasas de tipo I responsables de la generacion de diversos fosfoinosttidos 3'-fosforiIados, que median en la senalizacion celular y se han implicado en la inflamacion, la senalizacion de factores de crecimiento, la transformacion maligna y la inmunidad [vease la revision de Rameh, L. E. y Cantley, L. C. J. Biol. Chem., 1999, 274:8347-8350.].
La implicacion de PI3K en el control de la inflamacion se ha confirmado en varios modelos que usan inhibidores de PI3K pan-activos, tales como LY-294002 y Wortmannin [Ito, K. et al., J Pharmacol. Exp. Ther., 2007, 321:1-8.]. Se han realizado estudios recientes usando o bien inhibidores de PI3K selectivos o bien en ratones deficientes que carecen de una isoforma de enzima espedfica tal como se describe mas adelante. Estos estudios han demostrado el papel de las rutas controladas por las enzimas PI3K en la inflamacion. Se encontro que el inhibidor selectivo de PI3K 6 IC-87114 inhibe la hipersensibilidad de las vfas respiratorias, la liberacion de IgE, la expresion de citocinas proinflamatorias, la acumulacion de celulas inflamatorias en el pulmon y la permeabilidad vascular en ratones sensibilizados a la ovoalbumina, expuestos a ovoalbumina [Lee, K. S. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2006, 118:403-409 y Lee, K. S. et al., FASEB j., 2006, 20:455-65.]. Ademas, IC-87114 redujo la acumulacion de neutrofilos en los pulmones de ratones y la funcion neutrofila, estimulada por TNFa [Sadhu, C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 308:764-9].
La isoforma PI3K 6 se activa mediante la insulina y otros factores de crecimiento, asf como mediante citocinas inflamatorias y de senalizacion de protemas acopladas a protema G. Ademas, estudios que usaron ratones deficientes revelaron que la activacion de PI3K gamma (PI3K y) puede ser importante en la patogenesis del asma. Por ejemplo, las respuestas de mastocitos murinos se agravan in vitro e in vivo mediante senales autocrinas que requieren PI3K y funcional. Los ratones que caredan de PI3K y no presentaban edema cuando se indudan mediante anafilaxia sistemica pasiva [Wymann M.P. et al., Biochem. Soc. Trans., 2003, 31:275-80.]. Por tanto, la PI3K y env^a senales inflamatorias a traves de diversos receptores acoplados a protema G (GPCR), especialmente controlando la funcion de los mastocitos. Tambien se notifico que la acumulacion de eosinofilos en ratones sensibilizados y expuestos a ovoalbumina se inhida en estos ratones deficientes en PI3K y, en comparacion con animales de tipo natural [Lim D.H. et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 2o09, 296(2):L210-L219]. Finalmente, el tratamiento con un inhibidor de PI3K y atenuo la contractilidad de las vfas respiratorias aumentada por IL-13 de cortes pulmonares [Jiang H. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2012, 342(2):305-11].
Recientemente, se notifico que el inhibidor de PI3K dual 6/y TG100-115 inhibe la eosinofilia pulmonar y reduce los niveles de interleucina-13, la acumulacion de mucina y la hipersensibilidad de las vfas respiratorias en un modelo murino, cuando se administra mediante aerosolizacion. Los mismos autores tambien notificaron que el compuesto pod^a inhibir la neutrofilia pulmonar provocada o bien por LPS o bien por el humo de cigarrillos [Doukas, J. et al., J Pharmacol. Exp. Ther., 2009, 328:758-765.]. Se notifico que otros inhibidores de molecula pequena de PI3K 6 y y producen una inhibicion superior de la produccion de TNFa inducida por LPS y de activacion de celulas T en comparacion con los inhibidores selectivos de PI3K 6 [Williams O. et al., Chem Biol., 2010, 17(2): 123-34.].
Dado que tambien se activa mediante estres oxidativo, es probable que la isoforma PI3K 6 sea relevante como diana para la intervencion terapeutica en aquellas enfermedades en las que esta implicado un alto nivel de estres oxidativo. Los mediadores en el sentido descendente de la ruta de transduccion de senales de PI3K incluyen Akt (una serina/treonina protema cinasa) y la diana de mairnfero de rapamicina, la enzima mTOR. Un trabajo reciente ha sugerido que la activacion de PI3K 6, que conduce a la fosforilacion de Akt, puede inducir un estado de resistencia a corticosteroides en celulas por lo demas sensibles a corticosteroides [To, Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904.]. Estas observaciones han conducido a la hipotesis de que esta cascada de senalizacion puede ser un mecanismo responsable de insensibilidad a los corticosteroides de la inflamacion observada en los pulmones
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de pacientes que padecen COPD, as^ como en aquellos asmaticos que fuman, sometiendo de ese modo sus pulmones a un estres oxidativo aumentado. De hecho, se ha sugerido que la teofilina, un compuesto usado en el tratamiento tanto de COPD como de asma, invierte la insensibilidad a esteroides a traves de mecanismos que implican interaccion con rutas controladas por la PI3-cinasa 6 [To, Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904.].
En la actualidad, el pilar del tratamiento tanto para el asma como para la COPD es la terapia por inhalacion, usando una combinacion de corticosteroides, antagonistas muscarrnicos y p2-agonistas, tal como se considero clmicamente como apropiado. Una manera de abordar las necesidades medicas no cubiertas en la COPD y el asma es identificar nuevos medicamentos para inhalacion, que tengan el potencial de proporcionar un beneficio significativo cuando se usan o bien como monoterapia o bien en combinacion con uno o mas medicamentos de estas tres clases farmacologicas. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de identificar y desarrollar inhibidores de PI3K selectivos de isoformas que tengan el potencial de proporcionar una eficacia terapeutica potenciada en asma, COPD y otras enfermedades inflamatorias.
El documento WO 2012/052753 da a conocer: 6-(2-((4-amino-3-(3-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)- 3-(2-clorobencil)-4-oxo-3,4-dihidroquinazolin-5-il)-W,A/-bis(2-metoxietil)hex-5-inamida, denominada en el presente documento compuesto A de la tecnica anterior.
El documento WO 2011/048111 da a conocer ciertas 3-bencil-5-alquinil-quinazolin-4(3H)-onas
Un ejemplo de compuesto dado a conocer en ese documento es 2-((4-amino-3-(3-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4- d]pirimidin-1-il)metil)-3-(2-fluorobencil)-5-(3-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)prop-1-inil)quinazolin-4(3H)-ona, denominada en el presente documento ejemplo 50.
Ninguno de estos compuestos de la tecnica anterior tiene el mismo perfil ventajoso del compuesto de formula (I) descrito en el presente documento.
Sumario de la invencion
Segun la invencion, se proporciona un compuesto de formula (I):
imagen1
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, incluyendo todos los estereoisomeros, tautomeros y derivados isotopicos del mismo.
En otro aspecto de la invencion se proporciona un compuesto de formula (I) en forma cristalina solida.
En un aspecto adicional de la invencion se proporciona un compuesto de formula (I) en forma de su polimorfo cristalino de forma 2 (denominado en ocasiones en el presente documento “el polimorfo cristalino de forma 2”).
En un aspecto adicional de la invencion se proporciona un compuesto de formula (I) en forma de su polimorfo cristalino de forma 3 (denominado en ocasiones en el presente documento “el polimorfo cristalino de forma 3”).
Una comparacion de los perfiles in vitro de los compuestos de la tecnica anterior, compuesto A y ejemplo 50, con el compuesto de la presente divulgacion se presenta mas adelante en el presente documento (vease la tabla 5 en la seccion experimental). El compuesto de la presente invencion es un inhibidor de la isoforma PI3K 6 / y dual particularmente potente, una caracteristica farmacologica que le confiere un perfil terapeutico distinto y ventajoso con respecto a los compuestos dados a conocer previamente. Este aspecto de la invencion resulta particularmente evidente a partir del perfil in vivo del compuesto de formula (I) en modelos animales que son factores pronostico de
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la eficacia terapeutica y el beneflclo clmico en la inflamacion pulmonar (veanse las tablas 8-12 en la seccion experimental).
En una realizacion, el compuesto de la presente divulgacion tiene una actividad inhibidora mejorada con respecto a los compuestos de la tecnica anterior cuando se compara en un ensayo in vivo que mide la capacidad de una sustancia de prueba para inhibir el influjo inducido por poli-IC de neutrofilos al pulmon de raton. La mejora demostrada puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o lO veces (o mas) con respecto a los compuestos conocidos, dados a conocer previamente en la tecnica.
Se considera que la actividad en el ensayo de poli-IC in vivo es indicativa del potencial del compuesto de la presente invencion para inhibir agravamientos inducidos por virus en pacientes que padecen asma o cOpD. Se cree que las infecciones vmcas inducen agravamientos patologicos empeorando la inflamacion en los pulmones de pacientes y generando un fenotipo resistente a los esteroides. El poli-lC estimula uno de los mecanismos a traves de los cuales los virus son proinflamatorios.
Las propiedades de tipo farmacologico del compuesto descrito en el presente documento, incluyendo su estabilidad ffsica y qmmica intrmseca, el perfil de solubilidad, y especialmente su actividad biologica distintiva convierten a dicho compuesto en particularmente adecuado para su uso como agente farmaceutico y en particular para el tratamiento de enfermedades mediadas por inflamacion.
Breve descripcion de las figuras
Figura la:
Figura 1b: Figura 2a:
Figura 2b:
Figura 3: Figura 4:
Figura 5:
Figura 6: Figura 7
Figura 8:
Figura 9:
Figura 10:
Figura 11:
es un grafico de barras que representa los efectos del tratamiento con el compuesto (l) o el compuesto A sobre la acumulacion de neutrofilos inducida por poli-l:C en v^as respiratorias de ratones.
muestra una comparacion de las potencias inhibidoras del compuesto (l) frente al compuesto A sobre la acumulacion de neutrofilos inducida por poli-l:C en vfas respiratorias de ratones
es un grafico de barras que representa el efecto del tratamiento con el compuesto (l) o el compuesto A sobre la acumulacion de macrofagos inducida por el humo de cigarrillos en BALF murino.
es un grafico de barras que representa el efecto del tratamiento con el compuesto (l) o el compuesto A sobre la acumulacion de neutrofilos inducida por el humo de cigarrillos en BALF murino.
es un patron de difraccion de rayos X de polvo (XRPD) obtenido de una muestra del polimorfo cristalino de forma 1 (vease el ejemplo 2).
muestra un analisis termogravimetrico (TGA) (grafico superior) y un analisis de analisis de calorimetna diferencial de barrido (DSC) (grafico inferior) de una muestra del polimorfo cristalino de forma 1 (vease el ejemplo 2)
es un patron de XRPD obtenido de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 (vease el ejemplo 4).
muestra un analisis TGA de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 (vease el ejemplo 4).
muestra un analisis de DSC de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 (vease el ejemplo 4).
un grafico de isotermas de DVS para una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 (vease el ejemplo 4).
es un grafico de cambio de masa de DVS para una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 (vease el ejemplo 4).
muestra patrones de XRPD obtenidos antes (grafico inferior) y despues (grafico superior) del analisis de DVS en una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 (vease el ejemplo 4)
muestra patrones de XRPD de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 obtenidos antes (grafico inferior) y despues de 1 semana de almacenamiento a 250C/el 96% de HR (grafico central) y a 4Ooc/el 75% de hR (grafico superior) (vease el ejemplo 4).
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Figura 12: es un patron de XRPD obtenido de una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 (vease el
ejemplo 8).
Figura 13: muestra un analisis TGA (grafico superior) y de DSC (grafico inferior) de una muestra del polimorfo
cristalino de forma 3 (vease el ejemplo 8).
Figura 14: es un analisis de GVS en una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 (vease el ejemplo 8).
Figura 15: muestra patrones de XRPD obtenidos antes (grafico inferior) y despues (grafico superior) de un
analisis de GVS en una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 (vease el ejemplo 8).
Figura 16: muestra patrones de XRPD de una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 obtenidos antes
(grafico inferior) y despues de 1 semana de almacenamiento a 250C/el 96% de HR (grafico central) y a 40oc/el 75% de hR (grafico superior) (vease el ejemplo 8).
Figura 17: muestra una superposicion de patrones de XRPD obtenidos de muestras de la forma 7 (grafico
superior), forma 6, forma 5, forma 4, forma 3, forma 2 y forma 1 (grafico inferior) (veanse los ejemplos 9 a 12).
Descripcion detallada de la invencion
El termino inhibidor tal como se emplea en el presente documento pretende hacer referenda a un compuesto que reduce (por ejemplo en al menos el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o mas) o elimina la actividad biologica de la protema diana, por ejemplo la isozima PI3K 6, en un ensayo enzimatico in vitro.
El termino inhibidor delta/gamma (6/y) tal como se emplea en el presente documento pretende hacer referenda al hecho de que el compuesto inhibe, en cierto grado, la actividad inhibidora en ambas isoformas enzimaticas aunque no necesariamente en la misma medida.
El compuesto de la presente divulgacion es activo en sistemas de examen basados en celulas y de ese modo demuestra que presenta propiedades adecuadas para penetrar en las celulas y puede ejercer efectos farmacologicos intracelulares (veanse la tabla 6 y la tabla 7 en la seccion experimental).
El compuesto de la presente divulgacion tiene propiedades farmaceuticas terapeuticamente relevantes y deseables para un medicamento, por ejemplo caractensticas fisicoqmmicas que incluyen una fotoestabilidad y estabilidad qmmica adecuadas, un perfil de solubilidad apropiado y una actividad potente.
En una realizacion se proporciona una sal farmaceuticamente aceptable del compuesto de la invencion.
En una realizacion se proporciona una sal de adicion de acido farmaceuticamente aceptable del compuesto de la invencion.
Se pretende que las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables a las que se hizo referenda anteriormente en el presente documento comprendan las sales de adicion de acido terapeuticamente activas, no toxicas, que puedan formar los compuestos de formula (I). Estas sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables pueden obtenerse convenientemente tratando la forma de base libre del compuesto de formula (I) con un ejemplo de tales acidos apropiados. Los ejemplos de acidos apropiados incluyen, por ejemplo, acidos inorganicos tales como acido clorfndrico, acido bromfndrico, y acidos sulfurico y fosforico y similares; o acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico, propanoico, hidroxiacetico, lactico, malonico, sucdnico, maleico, fumarico, malico, tartarico, dtrico, metanosulfonico, para-toluenosulfonico, ciclamico, salidlico, para-aminosalidlico, pamoico y similares. Un ejemplo adicional de un acido apropiado es acido bencenosulfonico.
Los ejemplos de sales del compuesto de formula (I) incluyen todas las sales farmaceuticamente aceptables, tales como, sin limitacion, sales de adicion de acido de acidos minerales tales como sales de HCl y HBr y sales de adicion de acidos organicos tales como una sal de acido metanosulfonico. Los ejemplos adicionales incluyen sales de acido sulfurico y sales de acido fosforico.
En otra realizacion se proporciona una sal farmaceuticamente aceptable del compuesto de la invencion formada haciendo reaccionar el compuesto de formula (I) con una base adecuada. Los ejemplos de bases apropiadas incluyen, por ejemplo hidroxido de sodio, hidroxido de potasio, hidroxido de magnesio, hidroxido de calcio, L- arginina, colina y L-lisina.
En una realizacion se proporciona 2-((4-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)-5-(3-(2- (2-metoxietoxi)etoxi)prop-1-in-1-il)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona como base libre.
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La invencion tambien se refiere a solvatos de Ios compuestos dados a conocer en el presente documento. Los ejemplos de solvatos incluyen hidratos.
Los compuestos de la divulgacion incluyen aquellos en Ios que el atomo especificado es un isotopo que se produce de manera natural o que no se produce de manera natural. En una realizacion, el isotopo es un isotopo estable. Por tanto, Ios compuestos de la divulgacion incluyen, por ejemplo, aquellos que contienen uno o mas atomos de deuterio en lugar de atomos de hidrogeno y similares.
La divulgacion tambien se refiere a todas las formas polimorficas de Ios compuestos definidos en el presente documento.
Los compuestos de formula (I) pueden prepararse convenientemente mediante un proceso que comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (II):
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o un derivado protegido del mismo, en el que LGi representa un grupo saliente tal como halogeno, en particular bromo, con un compuesto de formula (Ill):
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en presencia de un catalizador adecuado y una base organica y en un disolvente aprotico polar bajo una atmosfera inerte. Los catalizadores adecuados incluyen catalizadores de paladio tales como dicloruro de b/s(trifenilfosfino)paladio (ll), en presencia de yoduro de cobre. Un disolvente aprotico polar adecuado para esta transformacion es DMF y una atmosfera inerte adecuada es nitrogeno.
Para Ios procesos de smtesis en Ios que el compuesto de formula (ll) es un derivado protegido, el compuesto de formula (l) se revela mediante una etapa de desproteccion apropiada, tal como se conoce ampliamente y se pone en practica en la tecnica. Por ejemplo, cuando el fenol presente en Ios compuestos de formula (l) esta protegido con un grupo sililo, por ejemplo con un grupo ferc-butildimetilsililo, la etapa de desproteccion puede efectuarse mediante el tratamiento con un reactivo tal como fluoruro de tetrabutilamonio en presencia de un disolvente aprotico polar tal como DMF. La reaccion puede realizarse a una temperatura reducida, tal como a 0oC.
Pueden prepararse compuestos de formula (ll) haciendo reaccionar un compuesto de formula (IV):
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o un derivado protegido del mismo, en el que LGi es un grupo saliente, tal como se definio anteriormente en el presente documento para compuestos de formula (ll) y LG2 es tambien un grupo saliente tal como halogeno, por ejemplo un atomo de halogeno y de manera adecuada un cloro, con un compuesto de formula (V):
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o un derivado protegido del mismo, en presencia de un base y en un disolvente aprotico polar.
Las bases adecuadas para esta transformacion incluyen carbonato de potasio y un disolvente aprotico polar adecuado es DMF.
Los procesos de smtesis incluyen aquellos para los que se considera ventajoso proteger el hidroxilo fenolico del compuesto de formula (VII) durante la etapa de acoplamiento y los derivados protegidos adecuados incluyen un terc- butildimetilsilil etery un terc-butil eter.
Alternativamente pueden prepararse compuestos de formula (II) haciendo reaccionar un compuesto de formula (VI):
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o un derivado protegido del mismo, en el que LGi, es tal como se definio anteriormente para compuestos de formula (II) y LG3 representa un grupo saliente tal como halogeno, en particular yodo, con un compuesto de formula (VII):
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o un derivado protegido del mismo, en presencia de un catalizador de metal noble adecuado, una base inorganica y en un disolvente protico polar, bajo una atmosfera inerte; seguido, cuando sea apropiado, por desproteccion.
Un catalizador adecuado es tetrakis(trifenilfosfino)paladio (0).
Una base inorganica adecuada es carbonato de sodio y un disolvente protico polar adecuado es etanol.
La reaccion puede realizarse a una temperatura elevada, por ejemplo a 850C durante un periodo prolongado tal como, por ejemplo, 3 dfas antes de enfriar hasta TA.
Los grupos protectores pueden ser ventajosos para enmascarar grupos qmmicamente sensibles durante una o mas de las secuencias de reaccion descritas anteriormente, para garantizar que uno o mas de los procesos son eficaces. Por tanto, si se desea o es necesario, pueden protegerse los compuestos intermedios mediante el uso de grupos protectores convencionales. Grupos protectores y medios para su eliminacion se describen en “Protective Groups in Organic Synthesis”, de Theodora W. Greene y Peter G.M. Wuts, publicado por John Wiley & Sons Inc; 4th Rev Ed., 2006, ISBN-10: 0471697540.
Los productos intermedios novedosos se reivindican como un aspecto de la invencion.
Ventajosamente, el compuesto (I) de la presente invencion no presenta atropisomerismo.
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El compuesto (I) preparado segun el ejemplo 2 de esta divulgacion se produce como el pollmorfo crlstallno de forma
1. El polimorfo cristalino de forma 1 se caracteriza por un patron de xRpD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 3.
Se encontro que el comportamiento termico de una muestra del polimorfo cristalino de forma 1 era complejo. Tal como se comenta en el ejemplo 2 y se ilustra en el analisis de dSc mostrado en la Figura 4 (grafico inferior), una muestra del polimorfo cristalino de forma 1 se sometio a varios eventos de calentamiento, y en ultima instancia se transformo en un polimorfo cristalino diferente - denominado en el presente documento polimorfo cristalino de forma
2.
Se encontro que el polimorfo cristalino de forma 2 era anhidro y se fundfa con descomposicion a aproximadamente 190oC (maximo pico). Los experimentos de suspension realizados en el polimorfo cristalino de forma 1 condujeron a la formacion del polimorfo cristalino de forma 2 para la mayona de los disolventes, aunque un polimorfo cristalino anhidro - denominado en el presente documento polimorfo cristalino de forma 3, se obtuvo suspendiendo el polimorfo cristalino de forma 1 en diclorometano. Se encontro que el polimorfo cristalino de forma 3 era anhidro y se fundfa con descomposicion a aproximadamente 186oc (maximo pico; vease el ejemplo 8). Tambien se obtuvieron varios pseudopolimorfos del compuesto (I) (pseudopolimorfos de forma 4, 5, 6 y 7) a partir de la suspension del polimorfo cristalino de forma 1 o del compuesto (I) en forma amorfa con THF, 1,4-dioxano, agua al 10%/acetonitrilo o agua al 10%/acetona (veanse los ejemplos 9 a 12).
De las siete formas polimorficas y pseudopolimorficas diferentes del compuesto (I), Ios polimorfos cristalinos de forma 2 y forma 3 teman las propiedades de estado solido mas prometedoras, siendo el polimorfo cristalino de forma 2 el mas favorable debido a que tiene el punto de fusion mas alto.
Se realizaron experimentos de suspension competitiva usando una mezcla 50/50 de Ios polimorfos cristalinos de forma 2 y forma 3 en diversos disolventes a diversas temperaturas (vease el ejemplo 13). Todos Ios experimentos dieron como resultado el polimorfo cristalino de forma 2, Io que confirma que este es la forma termodinamicamente mas estable. Dado que es deseable minimizar el riesgo de interconversion de formas polimorficas durante el almacenamiento del compuesto y la fabricacion de productos farmaceuticos que contienen el compuesto, o durante la vida util de un producto de este tipo tras la fabricacion, el polimorfo cristalino de forma 2 tiene ventajas con respecto al polimorfo cristalino de forma 3 y otras formas polimorficas del compuesto (I).
De manera adecuada, el polimorfo cristalino de forma 2 se prepara cristalizando el compuesto (I) en una disolucion en 1-propanol. En el ejemplo 3 se describen procedimientos a modo de ejemplo que usan 1-propanol, con y sin siembra.
El polimorfo cristalino de forma 2 tambien puede prepararse suspendiendo el polimorfo cristalino de forma 1 en metanol, etanol, 2-propanol, 1-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, acetato de isopropilo, TBME, 2-butanona, DMSO, dietil eter, MIBK, heptano, nitrometano, agua al 10%/etanol, agua al 10%/acetonitrilo o agua al 10%/2-propanol.
Alternativamente, el polimorfo cristalino de forma 2 puede prepararse suspendiendo el compuesto (I) en forma amorfa en metanol, etanol, 2-propanol, 1-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, acetato de isopropilo, TBME, 2-butanona, DMSo, dietil eter, MIBK, nitrometano, agua al 10%/etanol o agua al 10%/2-propanol.
Los experimentos de Ios inventores han mostrado que suspender el compuesto (I) en forma amorfa, en diclorometano, conduce a la formacion del polimorfo cristalino de forma 3. Por tanto, debe evitarse el uso de diclorometano en condiciones de cristalizacion previstas para formar el polimorfo cristalino de forma 2.
Los experimentos de Ios inventores han mostrado que suspender el compuesto (I) en forma amorfa o el polimorfo cristalino de forma 1, en THF, conduce a la formacion del pseudopolimorfo de forma 4. Por tanto, debe evitarse el uso de THF en condiciones de cristalizacion previstas para formar el polimorfo cristalino de forma 2.
Los experimentos de Ios inventores han mostrado que suspender el compuesto (I) en forma amorfa o el polimorfo cristalino de forma 1, en 1,4-dioxano, conduce a la formacion del pseudopolimorfo de forma 5. Por tanto, debe evitarse el uso de 1,4-dioxano en condiciones de cristalizacion previstas para formar el polimorfo cristalino de forma 2.

Los experimentos de Ios inventores han mostrado que suspender el compuesto (I) en forma amorfa en agua al

10%/acetonitrilo conduce a la formacion del pseudopolimorfo de forma 6. Por tanto, debe evitarse el uso de agua al
10%/acetonitrilo en condiciones de cristalizacion previstas para formar el polimorfo cristalino de forma 2 a partir del compuesto (I) en forma amorfa.

Los experimentos de Ios inventores han mostrado que suspender el compuesto (I) en forma amorfa en agua al

10%/acetona conduce a la formacion del pseudopolimorfo de forma 7. Por tanto, debe evitarse el uso de agua al
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10%/acetona en condiciones de cristalizacion previstas para formar el polimorfo cristalino de forma 2 a partir del compuesto (I) en forma amorfa.
El polimorfo cristalino de forma 2 se caracteriza por un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 5. Este patron tiene picos principales en las posiciones 8,2, 9,0, 9,2, 9,7, 12,2, 14,1, 14,3, 15,0, 16,4, 18,0, 18,5, 19,0, 19,6, 21,8, 22,3, 22,5, 24,3, 24,5, 24,8, 25,1 y 25,8 (± 0,2 grados, valores 2-theta). Es tfpico que al menos tres (por ejemplo tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o Ios veintiuno) de estos pueden observarse en el patron de XRPD resultante. Los picos en 9,7, 12,2, 14,1 y 14,3 son particularmente caractensticos para el polimorfo cristalino de forma 2 y por tanto es tfpico que al menos uno (por ejemplo uno, dos, tres o Ios cuatro) de estos picos puedan observarse en el patron de XRPD.
El polimorfo cristalino de forma 3 se caracteriza por un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 12.
El pseudopolimorfo de forma 4 se caracteriza por un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 17.
El pseudopolimorfo de forma 5 se caracteriza por un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 17.
El pseudopolimorfo de forma 6 se caracteriza por un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 17.
El pseudopolimorfo de forma 7 se caracteriza por un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 17.
En un aspecto, el compuesto es util en el tratamiento, por ejemplo de COPD y/o asma.
Los compuestos de PI3K desarrollados hasta la fecha se han previsto normalmente para su administracion oral. Normalmente, esta estrategia implica la optimizacion del perfil farmacocinetico de un compuesto con el fin de conseguir una duracion de accion adecuada. De esta manera se establece y se mantiene una concentracion de farmaco suficientemente alta entre dosis para proporcionar un beneficio clmico continuo. Una consecuencia inevitable y frecuentemente no deseada de este enfoque es que es probable que tejidos corporales no seleccionados como diana, especialmente el fngado y Ios intestinos, se expongan a concentraciones farmacologicamente activas del farmaco.
Una estrategia alternativa es disenar regfmenes de tratamiento en Ios que el farmaco se dosifica directamente al organo inflamado (por ejemplo terapia topica). Aunque este enfoque no es adecuado para tratar todos Ios estados inflamatorios cronicos, se ha aprovechado de manera extensa en el tratamiento de enfermedades pulmonares (asma, COPD, fibrosis qmstica), lesiones cutaneas (dermatitis atopica y psoriasis), enfermedades nasales (rinitis alergica), enfermedad ocular (conJuntivitis alergica) y trastornos gastrointestinales (colitis ulcerosa).
En la terapia topica, la eficacia deseada puede conseguirse en ocasiones garantizando que el farmaco tiene una duracion de accion sostenida y se retiene predominantemente en el organo diana, minimizando de ese modo Ios riesgos de toxicidad sistemica. Alternativamente puede usarse una formulacion apropiada que genera un “reservorio” del farmaco activo que esta entonces disponible para sostener Ios efectos deseados. El primer enfoque se muestra a modo de ejemplo en el uso del farmaco anticolinergico bromuro de tiotropio (Spiriva HandiHaler®), que se administra por v^a topica al pulmon como tratamiento para la COPD. Este compuesto tiene una afinidad excepcionalmente alta para su receptor objetivo, dando como resultado una tasa de desactivacion (tasa de disociacion) muy lenta y una consecuente duracion de accion sostenida.
Segun un aspecto de la presente divulgacion se proporciona el uso del compuesto de formula (I) o una formulacion farmaceutica que Io contiene, como inhibidor de PI3-cinasa, administrada por ejemplo por v^a topica al pulmon.
Por tanto, en una realizacion se pretende que el compuesto de la presente divulgacion sea para su uso mediante la administracion topica a Ios pulmones con el fin de maximizar el beneficio terapeutico para Ios pacientes, al tiempo que minimiza el potencial de efectos sistemicos no deseables. Por tanto resulta ventajoso que el compuesto de formula (I) se metabolice rapidamente una vez que ha alcanzado la circulacion general y que el/los producto(s) de recambio es/son menos activos que la molecula original.
Un producto probablemente principal de metabolismo de primer paso del compuesto de formula (I) es el alcohol correspondiente, compuesto (la), que se producina de la O-desmetilacion, un proceso metabolico que es una caractenstica comun para estructuras de este quimiotipo. Este posible producto metabolico es significativamente menos activo que el compuesto de formula (l) como inhibidor de PI3K en Ios subtipos tanto a como p (vease la tabla 6 en la seccion experimental).
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Por tanto, en un aspecto se proporciona un compuesto de formula (la) o una sal farmaceuticamente aceptable del mlsmo, incluyendo todos los estereoisomeros, tautomeros y derivados isotopicos del mismo.
En un aspecto de la divulgacion, el compuesto de la invencion es particularmente adecuado para su suministro topico, tal como suministro topico a los pulmones, en particular para el tratamiento de COPD.
Por tanto, en un aspecto se proporciona el uso de un compuesto de la invencion para el tratamiento de COPD y/o asma, en particular COPD o asma grave, mediante la inhalacion, es decir, mediante la administracion topica al pulmon. Ventajosamente, la administracion al pulmon permite implementar los efectos beneficiosos de los compuestos, al tiempo que se minimizan los efectos secundarios, para pacientes.
En una realizacion, los compuestos son adecuados para sensibilizar pacientes con respecto al tratamiento con un corticosteroide.
Ademas, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun la divulgacion opcionalmente en combinacion con uno o mas diluyentes o portadores farmaceuticamente aceptables.
Los diluyentes y portadores pueden incluir aquellos adecuados para su administracion parenteral, oral, topica, mucosa y rectal, y pueden ser diferentes dependiendo de la v^a de administracion.
En una realizacion pueden prepararse composiciones por ejemplo para administracion parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intraarticular o periarticular, particularmente en forma de disoluciones o suspensiones Ifquidas; para su administracion oral, particularmente en forma de comprimidos o capsulas; para administracion topica por ejemplo pulmonar o intranasal, particularmente en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles y administracion transdermica; para administracion mucosa por ejemplo a la mucosa bucal, sublingual o vaginal, y para administracion rectal por ejemplo en forma de un supositorio. En otra realizacion pueden prepararse composiciones para administracion oral en forma de disoluciones o suspensiones Ifquidas; para administracion topica en forma de disoluciones Ifquidas, suspensiones Ifquidas, gotas nasales que comprenden disoluciones o suspensiones o aerosoles presurizados o no presurizados.
Las composiciones pueden administrarse convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los metodos ampliamente conocidos en la tecnica farmaceutica, por ejemplo tal como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Las composiciones tambien pueden administrarse convenientemente en multiples formas de dosificacion unitaria.
Las formulaciones para la administracion parenteral pueden contener como excipientes agua esteril o solucion salina, alquilenglicoles tales como propilenglicol, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares.
Las formulaciones para administracion nasal pueden ser solidas y pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa o dextrano, o pueden ser disoluciones acuosas o aceitosas para su uso en forma de gotas nasales o una pulverizacion medida. Las formulaciones para administracion nasal tambien pueden estar en forma de suspensiones acuosas. Para la administracion bucal, los excipientes tfpicos incluyen azucares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidon pregelatinizado, y similares.
Las composiciones adecuadas para administracion oral pueden comprender uno o mas portadores y/o excipientes fisiologicamente compatibles y pueden estar en forma solida o Kquida. Pueden prepararse comprimidos y capsulas
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con agentes aglutinantes, por ejemplo, jarabe, goma arabiga, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinilpirrolidona; cargas, tales como lactosa, sacarosa, almidon de mafz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina; lubricantes, tales como estearato de magnesio, talco, polietilenglicol o s^lice; y tensioactivos, tales como laurilsulfato de sodio. Las composiciones Kquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspension, por ejemplo jarabe de sorbitol, metilcelulosa, jarabe de azucar, gelatina, carboximetilcelulosa o grasas comestibles; agentes emulsionantes tales como lecitina o goma arabiga; aceites vegetales tales como aceite de almendra, aceite de coco, aceite de hfgado de bacalao o aceite de cacahuetes; conservantes tales como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). Las composiciones Kquidas pueden encapsulate en, por ejemplo, gelatina para proporcionar una forma de dosificacion unitaria.
Las formas de dosificacion oral solidas incluyen comprimidos, capsulas de envuelta dura de dos piezas y capsulas de gelatina elastica blanda (SEG). Tales capsulas de envuelta dura de dos piezas pueden prepararse a partir de, por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC).
Una formulacion de envuelta seca comprende normalmente una concentracion de aproximadamente el 40%-60%o de gelatina, una concentracion de aproximadamente el 20%-30% de plastificante (tal como glicerina, sorbitol o propilenglicol) y una concentracion de agua de aproximadamente el 3o%-40%. Tambien pueden estar presentes otros materiales tales como conservantes, colorantes, opacificantes y aromas. El material de carga Kquido comprende un farmaco solido que se ha disuelto, solubilizado o dispersado (con agentes de suspension tales como cera de abejas, aceite de ricino hidrogenado o polietilenglicol 4000) o un farmaco Ifquido en vetnculos o combinaciones de vehtulos tales como aceite mineral, aceites vegetales, trigliceridos, glicoles, polioles y agentes tensioactivos.
De manera adecuada, el compuesto de formula (I) se administra por via topica al pulmon. Por tanto, en una realizacion se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la divulgacion opcionalmente en combinacion con uno o mas diluyentes o portadores aceptables por v^a topica.
La administracion topica al pulmon puede conseguirse mediante el uso de una formulacion de aerosol. Las formulaciones de aerosol comprenden normalmente el principio activo suspendido o disuelto en un propelente de aerosol adecuado, tal como un clorofluorocarburo (CFC) o un hidrofluorocarburo (HFC). Los propelentes de CFC adecuados incluyen tricloromonofluorometano (propelente 11), diclorotetrafluorometano (propelente 114) y diclorodifluorometano (propelente 12). Los propelentes de HFC adecuados incluyen tetrafluoroetano (HFC-134a) y heptafluoropropano (hFC-227). El propelente comprende normalmente el 40o/o-99,5%, por ejemplo el 40%-90% en peso de la composicion para inhalacion total. La formulacion puede comprender excipientes que incluyen codisolventes (por ejemplo etanol) y tensioactivos (por ejemplo lecitina, trioleato de sorbitano y similares). Otros excipientes posibles incluyen polietilenglicol, polivinilpirrolidona, glicerina y similares. Las formulaciones de aerosol se envasan en recipientes y una dosis adecuada se suministra por medio de una valvula de dosificacion (por ejemplo tal como se suministra por Bespak, Valois o 3M o alternativamente por Aptar, Coster o Vari).
La administracion topica al pulmon tambien puede conseguirse mediante el uso de una formulacion no presurizada tal como una disolucion o suspension acuosa. Estas pueden administrate por medio de un nebulizador, por ejemplo uno que puede ser manual y portatil o para uso domestico u hospitalario (es decir, no portatil). La formulacion puede comprender excipientes tales como agua, tampones, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes de ajuste del pH, tensioactivos y codisolventes. Las formulaciones de aerosol y Ifquidas en suspension (ya sean presurizados o no presurizados) contendran normalmente el compuesto de la invencion en una forma finamente dividida, por ejemplo con un D50 de 0,5-10 |im, por ejemplo de aproximadamente de 1-5 |im. Las distribuciones de tamano de parttula pueden representarse usando valores de D10, D50 y D90. La mediana del valor de D50 de distribuciones de tamano de parttula se define como el tamano de partfcula en micras que divide la distribucion por la mitad. La medicion derivada de la difraccion laser se describe de manera mas exacta como distribucion de volumen, y por consiguiente el valor D50 obtenido usando este procedimiento se denomina de manera mas significativa valor de DV50 (mediana para una distribucion de volumen). Tal como se usa en el presente documento, los valores de Dv se refieren a distribuciones de tamano de parttula medidas usando difraccion laser. De manera similar, se considera que los valores D10 y D90, usados en el contexto de la difraccion laser, significan valores de DV10 y DV90 y hacen referenda al tamano de parttula, por lo cual el 10% de la distribucion se encuentra por debajo del valor de D10, y el 90% de la distribucion se encuentra por debajo del valor de D90, respectivamente.
La administracion topica al pulmon tambien puede conseguirse mediante el uso de una formulacion de polvo seco. Una formulacion de polvo seco contendra el compuesto de la divulgacion en una forma finamente dividida, normalmente con un diametro medio de la masa (MMAD) de 1-10 |im 0 un D50 de 0,5-10 |im, por ejemplo de aproximadamente 1-5 |im. Los polvos del compuesto de la invencion en una forma finamente dividida pueden prepararse mediante un proceso de micronizacion 0 un proceso de reduccion del tamano similar. La micronizacion puede realizarse usando un molino de chorro tal como los fabricados por Hosokawa Alpine. La distribucion de tamano de parttula resultante puede medirse usando difraccion laser (por ejemplo con un instrumento Malvern Mastersizer 2000S). La formulacion contendra normalmente un diluyente aceptable por via topica tal como lactosa, glucosa 0 manitol (preferiblemente lactosa), habitualmente de un tamano de parttula comparativamente grande, por ejemplo un diametro medio de la masa (MMAD) de 50 |im 0 mas, por ejemplo de 100 |im 0 mas 0 un D50 de 40-
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150 |im. Tal como se usa en el presente documento, el termlno “lactosa” se reflere a un componente que contlene lactosa, Incluyendo a-lactosa monohldratada, p-lactosa monohldratada, a-lactosa anhldra, p-lactosa anhldra y lactosa amorfa. Los componentes de lactosa pueden procesarse medlante mlcronlzaclon, tamlzado, mollenda, compreslon, aglomeraclon o secado por pulverlzaclon. Tamblen estan abarcadas las formas de lactosa dlsponlbles comerclalmente en dlversas formas, por ejemplo los productos Lactohale® (lactosa de calldad para lnhalaclon; DFE Pharma), lnha-Lac®70 (lactosa tamlzada para un lnhalador de polvo seco; Meggle), Pharmatose® (DFE Pharma) y Respltose® (lactosa de calldad para lnhalaclon tamlzada; DFE Pharma). En una reallzaclon, el componente de lactosa se selecclona del grupo que conslste en a-lactosa monohldratada, a-lactosa anhldra y lactosa amorfa. Preferlblemente, la lactosa es a-lactosa monohldratada.
Las formulaclones de polvo seco tamblen pueden contener otros exclplentes tales como estearato de sodlo, estearato de calclo o estearato de magneslo.
Una formulaclon de polvo seco se sumlnlstra normalmente usando un dlsposltlvo lnhalador de polvo seco (DPI). Los slstemas de sumlnlstro de polvo seco de ejemplo lncluyen SPINhAlER®, DISKHALER®, TURBOHALER®, DISKUS®, SKYEHALER®, aCcUHALER® y CLIcKhALER®. Los ejemplos adlclonales de slstemas de sumlnlstro de polvo seco lncluyen ECLIPSE, NEXT, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER,
breezhaler/neohaler, monodose, flowcaps, twincaps, x-caps, turbospin, elpenhaler,
MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, PRESSAIR, ELLIPTA, el lnhalador de polvo seco ORIEL, MICRODOSE,
pulvinal, easyhaler, ultrahaler, taifun, pulmojet, omnihaler, gyrohaler, taper, conix,
XCELOVAIR y PROHALER.
En una reallzaclon se proporclona un compuesto de la presente lnvenclon como formulaclon de polvo seco mlcronlzado, por ejemplo que comprende lactosa de una calldad adecuada, cargada en un dlsposltlvo tal como DISKUS. De manera adecuada, un dlsposltlvo de este tlpo es un dlsposltlvo multldosls, por ejemplo la formulaclon se carga en blfsteres para su uso en un dlsposltlvo de multlples dosls unltarlas tal como DISKUS.
En una reallzaclon se proporclona un compuesto de la presente lnvenclon como formulaclon de polvo seco
mlcronlzado, que comprende lactosa de una calldad adecuada y estearato de magneslo, cargada en blfsteres para su uso en un dlsposltlvo multldosls tal como DISKUS. De manera adecuada, un dlsposltlvo de este tlpo es un dlsposltlvo multldosls.
En otra reallzaclon se proporclona un compuesto de la presente lnvenclon como formulaclon de polvo seco mlcronlzado, por ejemplo que comprende lactosa de una calldad adecuada, cargada en capsulas de envuelta dura para su uso en un dlsposltlvo monodosls tal como AEROLISER.
En otra reallzaclon se proporclona un compuesto de la presente lnvenclon como formulaclon de polvo seco
mlcronlzado, que comprende lactosa de una calldad adecuada y estearato de magneslo, cargada en capsulas de
envuelta dura para su uso en un dlsposltlvo monodosls tal como AeROLISER.
Las composlclones a modo de ejemplo del compuesto (I) que son adecuadas para su uso en un lnhalador de polvo seco se enumeran en el ejemplo 15.
Se pretende que los compuestos segun la dlvulgaclon tengan actlvldad terapeutlca. En un aspecto adlclonal, la presente lnvenclon proporclona un compuesto de la dlvulgaclon para su uso como medlcamento.
Los compuestos segun la dlvulgaclon tamblen pueden ser utlles en el tratamlento de trastornos resplratorlos que lncluyen COPD (lncluyendo bronqultls cronlca y enflsema), asma, asma pedlatrlca, flbrosls qmstica, sarcoldosls, flbrosls pulmonar ldlopatlca, rlnltls alerglca, rlnltls, slnusltls y agravamlentos lnducldos por vlrus de una cualqulera de las mlsmas, lnfecclon resplratorla vrnca, especlalmente asma, bronqultls cronlca y COPd.
Los vlrus resplratorlos lncluyen lnfluenza, vlrus resplratorlo slncltlal, vlrus de la paralnfluenza humana, coronavlrus de SARS y adenovlrus. Un ejemplo adlclonal de un vlrus resplratorlo es rlnovlrus.
El compuesto de la dlvulgaclon tamblen puede volver a senslblllzar el estado del paclente al tratamlento con un cortlcosterolde, cuando prevlamente el estado del paclente habfa dejado de responder al mlsmo.
En una reallzaclon de la lnvenclon se emplea una dosls del presente compuesto que es lgual a la que es adecuada para su uso como monoterapla, pero admlnlstrada en comblnaclon con un cortlcosterolde.
En una reallzaclon se emplea una dosls del compuesto de formula (I) que sena subterapeutlca como agente unlco, en comblnaclon con un cortlcosterolde, restableclendo de ese modo la capacldad de respuesta del paclente a este ultlmo, en casos en los que el paclente habfa dejado de responder prevlamente al mlsmo.
En una reallzaclon se emplea una dosls del compuesto de formula (I), en comblnaclon con una dosls de cortlcosterolde que sena subterapeutlca sl se admlnlstra en ausencla del compuesto de formula (I), restableclendo
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de ese modo la capacidad de respuesta del paclente al cortlcosterolde, en casos en Ios que el paclente ha^a dejado de responder previamente al mismo.
Adicionalmente, el compuesto de la divulgacion puede presentar actividad antivmca y, por ejemplo, demostrar utilidad en el tratamiento de agravamientos vmcos de estados inflamatorios tales como asma y/o COPD.
El compuesto de la presente divulgacion tambien puede ser util en la profilaxis, el tratamiento o la mejora de una enfermedad o las complicaciones de una enfermedad asociadas con el virus influenza, rinovirus y/o virus respiratorio sincitial.
En una realizacion se proporciona un compuesto de formula (I) para su uso en el tratamiento o la prevencion de una infeccion vmca o complicaciones inflamatorias inducidas por infeccion vmca.
Segun la divulgacion tambien se espera que el compuesto de formula (I) sea util en el tratamiento de ciertos estados que pueden tratarse mediante terapia topica o local incluyendo conjuntivitis alergica, conjuntivitis, dermatitis alergica, dermatitis por contacto, psoriasis, colitis ulcerosa, articulaciones inflamadas derivadas de artritis reumatoide u osteoartritis.
En una realizacion, el compuesto de formula (I) se considera util en el tratamiento de la hepatitis C y/o VIH, cuando se administra mediante una v^a apropiada. Las v^as de administracion apropiadas pueden incluir v^a oral, inyeccion intravenosa o infusion.
En una realizacion, el compuesto de formula (I) para el tratamiento de la hepatitis C se suministra justo antes de la entrada de la sangre al tugado.
Tambien se espera que el compuesto de la divulgacion sea util en el tratamiento de otros ciertos estados que incluyen artritis reumatoide, pancreatitis, caquexia, inhibicion del crecimiento y metastasis de tumores incluyendo carcinoma pulmonar de celulas no pequenas, carcinoma de mama, carcinoma gastrico, carcinomas colorrectales y melanoma maligno.
En una realizacion, el compuesto dado a conocer en el presente documento y las formulaciones farmaceuticas que comprenden el mismo son utiles en el tratamiento o la prevencion de cancer, en particular cancer de pulmon, especialmente mediante la administracion topica al pulmon.
Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el compuesto tal como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de uno o mas de Ios estados mencionados anteriormente.
En un aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona el uso del compuesto tal como se describe en el presente documento para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de uno o mas de Ios estados mencionados anteriormente.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de tratamiento de Ios estados mencionados anteriormente que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz del compuesto de la divulgacion o una composicion farmaceutica del mismo.
El compuesto descrito en el presente documento tambien puede usarse en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una o mas de las enfermedades identificadas anteriormente.
La palabra “tratamiento” pretende abarcar la profilaxis asf como el tratamiento terapeutico.
El compuesto de la divulgacion tambien puede administrarse en combinacion con uno o mas de otros principios activos, por ejemplo principios activos adecuados para tratar Ios estados mencionados anteriormente. Por ejemplo, las combinaciones posibles para el tratamiento de trastornos respiratorios incluyen combinaciones con corticosteroides (por ejemplo budesonida, dipropionato de beclometasona, propionato de fluticasona, furoato de mometasona, furoato de fluticasona), beta-agonistas (por ejemplo terbutalina, salbutamol, salmeterol, formoterol, indacaterol), xantinas (por ejemplo teofilina), antagonistas muscarmicos, (por ejemplo ipratropio) y/o un inhibidor de la p38 MAP cinasa. Un ejemplo adicional de un corticosteroide adecuado es ciclesonida o flunisolida. De manera adecuada, el beta-agonista es un beta2-agonista. Ejemplos adicionales de beta2-agonistas son reproterol, vilanterol, olodaterol, reproterol y fenoterol. Los ejemplos adicionales de antagonistas muscarmicos incluyen tiotropio, umeclidinio, glicopirronio, aclidinio y daratropio, cualquiera de estos por ejemplo como la sal de bromuro. Una posible combinacion adicional para el tratamiento de trastornos respiratorios es el compuesto de la divulgacion y un inhibidor de fosfodiesterasas.
En una realizacion, el compuesto de la divulgacion se administra en combinacion con un agente antivmco, por ejemplo aciclovir, oseltamivir, zanamavir (Relenza®) o interferon.
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En una realizacion, la combinacion de principios activos se formula conjuntamente.
En una realizacion, el compuesto de la presente divulgacion se formula conjuntamente con un corticosteroide como formulacion para inhalacion, por ejemplo para su uso en la terapia de mantenimiento de COPD o cancer de pulmon incluyendo la prevencion de este ultimo.
En una realizacion, la combinacion de principios activos simplemente se administra conjuntamente.
En una realizacion se proporciona un producto de combinacion que comprende:
(A) un compuesto de la presente divulgacion; y
(B) un principio activo adicional seleccionado por ejemplo de corticosteroides, beta-agonistas, xantinas, antagonistas muscarmicos, inhibidores de fosfodiesterasas e inhibidores de p38 MAP cinasa (seleccionado por ejemplo de corticosteroides, beta-agonistas, xantinas, antagonistas muscarmicos e inhibidores de p38 MAP cinasa).
en el que cada uno de los componentes (A) y (B) se formula en una mezcla con un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable. La combinacion puede comprender opcionalmente excipientes relevantes adicionales. De manera adecuada, el beta-agonista es un beta2-agonista.
En una realizacion se proporciona un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1 para su uso como medicamento que debe administrarse en combinacion con uno o mas principios activos adicionales seleccionados por ejemplo de corticosteroides, beta-agonistas, xantinas, antagonistas muscarmicos e inhibidores de p38 MAP cinasa. De manera adecuada, el beta-agonista es un beta2-agonista.
En una realizacion, el compuesto de la divulgacion se administra mediante inhalacion y un corticosteroide se administra por via oral o mediante inhalacion ya sea en combinacion o por separado.
En una realizacion, el compuesto de la divulgacion se administra mediante inhalacion y un beta2-agonista se administra por via oral o mediante inhalacion ya sea en combinacion o por separado.
Seccion experimental
Las abreviaturas usadas en el presente documento se definen a continuacion (tabla 1). Cualquier abreviatura no definida pretende expresar su significado aceptado generalmente.
Tabla 1: Abreviaturas
Aq
Ac
acd
atp
balf
a
bsa
copd
cxcli
CXCL8
d
dcm
DMA
dmap
dmso
edc.hci
elisa
(es+)
Et
EtOAc
EtOH
facs
fcs
fitc
fp
hplc-ms
h
hrp
acuoso
acetilo
acido-citrato-dextrosa adenosina-5'-trifosfato fluido de lavado broncoalveolar ancho
albumina serica bovina
enfermedad pulmonar obstructiva cronica
ligando 1 de quimiocinas de motivo CXC
ligando 8 de quimiocinas de motivo CXC
doblete
diclorometano
dimetilacetamida
4-dimetilaminopiridina
dimetilsulfoxido
clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas ionizacion por electrospray, modo positivo etilo
acetato de etilo etanol
clasificacion de celulas activadas por fluorescencia suero de ternero fetal isotiocianato de fluorescema propionato de fluticasona
cromatograffa de Kquidos de alto rendimiento con espectrometna de masas hora(s)
peroxidasa del rabano
IFNy
interferon-aamma
i-n
intranasal
i-t
intratraqueal
IL-4
interleucina 4
IL-5
interleucina 5
IL-13
interleucina 13
IL-17
interleucina 17
lps
lipopolisacarido
ipa
isopropanol [propan-2-ol]
M
molar
(m+h)+
ion molecular protonado
mcp-1
protema quimioatrayente de monocitos
mda
malondialdehndo
Me
metilo
MeOH
metanol
MHz
meaahercios
min
minuto(s)
mibk
metil isobutil cetona
MOMA-2
anticuerpo anti-monocitos y macrofaaos
mtt
bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
m/z
relacion masa/caraa
NH4OAc
acetato de amonio
nm
nanometro
nmp
N-metilpirrolidona
rmn
resonancia maanetica nuclear (espectroscopfa)
ova
ovoalbumina
pbmc
celula(s) mononuclear(es) de sanare periferica
pbs
solucion salina tamponada con fosfato
Pd2(dba)a
tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0)
PdCl2(PPha)2
dicloruro de bis(trifenilfosfino)paladio (ll)
Ph
fenilo
PIP2
4,5-bifosfato de fosfatidilinositol
PIP3
3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol
pma
acetato-miristato de forbol
Po
mediante administracion oral
PPh3
trifenilfosfina
q
cuartete
quin
quintete
r‘
tiempo de retencion
hr
humedad relativa
ta
temperatura ambiente
rp-hplc
cromatoaraffa de l^quidos de alto rendimiento de fase in
s
sinalete
sds
dodecilsulfato de sodio
eem
error estandar de la media
t
triplete
tbme
metil ferc-butil eter
thf
tetrahidrofurano
tmb
3,3',5,5'-tetrametilbencidina
TNFq
factor de necrosis tumoral alfa
tr-fret
transferencia de enerafa por resonancia de fluorescenc
Procedimientos aenerales
Todos los materiales de partida y disolventes se obtuvieron o bien de fuentes comerciales o bien se prepararon 5 seaun las referencias de la biblioaraffa. A menos que se indique lo contrario, todas las reacciones fueron con aaitacion. Las disoluciones oraanicas se secaron de manera rutinaria sobre sulfato de maanesio anhidro.
La cromatoaraffa en columna se realizo en cartuchos de s^lice preempaquetados (230-400 de malla, 40-63 |im) usando la cantidad indicada.
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Metodos analiticos
LCMS analftica
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Se llevo a cabo una LCMS analftica usando una columna Waters Xselect CSH Ci8 de 3,5 |im (4,6 x 50 mm) con un caudal de 2,5-4,5 ml min"1 eluyendo con un gradiente de H20-MeCN que contiene el 0,1% v/v de acido formico a lo largo de 4 min. Informacion de gradiente: 0-3,00 min, con una variacion de desde el 95% de H2O-50/o de MeCN hasta el 5% de H2O-950/o de MeCN; 3,00-3,01 min, mantenido al 5% de H2O-950/o de MeCN, caudal aumentado hasta 4,5 ml min"1; 3,01 3,50 min, mantenido al 5% de H2O-950/o de MeCN; 3,50-3,60 min, de vuelta al 95% de H2O-5/0 de MeCN, caudal reducido hasta 3,50 ml min"1; 3,60-3,90 min, mantenido al 95% de H2O-5/0 de MeCN; 3,90-4,00 min, mantenido al 95% de H2O-5/0 de MeCN, caudal reducido hasta 2,5 ml min"1. Se detectaron las fracciones que conteman la muestra mediante su absorbancia de UV a 254 nm. Se midieron los espectros de masa de los picos eluidos usando un espectrometro de masas cuadrupolar Agilent 6120 que funcionaba en los modos de electrospray de iones positivo y negativo mixtos.
Espectroscop^a de 1H-RMN
Se obtuvieron espectros de 1H-RMN en un espectrometro Bruker Avance Ill a 400 MHz usando el disolvente no deuterado residual como referenda y a menos que se especifique lo contrario se ejecutaron en DMSO-d6.
Difraccion de rayos X de polvo - metodo 1 (usando un difractrometro Brucker AXS C2 GADDS)
Se recogieron patrones de difraccion usando radiacion Ka de Cu (40 kV, 40 mA), fase XYZ automatizada, videomicroscopio laser para autoposicionamiento de muestras y un detector de area bidimensional HiStar. La optica de rayos X consistfa en un unico espejo multicapa Gobel acoplado con un colimador de agujero de 0,3 mm. La divergencia de haz, es decir, el tamano efectivo del haz de rayos X en la muestra era de aproximadamente 4 mm. Se empleo un modo de barrido continuo 0-0 con una distancia de muestra-detector de 20 cm, que dio un intervalo de 20 efectivo de 3,20-29,70 Normalmente se expuso la muestra al haz de rayos X durante 120 segundos. El software usado para la recopilacion de datos fue GADDS para XP/2004 4.1.43 y los datos se analizaron y se presentaron usando Diffrac Plus EVA v13.0.0.2 o v15.0.0.0. Se prepararon muestras ejecutadas en condiciones ambientales como espedmenes en placa plana usando el polvo tal como se recibio sin molienda. Aproximadamente 1-2 mg de la muestra se prenso ligeramente sobre un portaobjetos de vidrio para obtener una superficie plana. Se montaron muestras ejecutadas en condiciones no ambientales en una oblea de silicio con un compuesto termoconductor. La muestra se calento entonces hasta la temperatura apropiada a 20oc/min y posteriormente se mantuvo de manera isotermica durante 1 minuto antes de iniciar la recopilacion de datos.
Difraccion de rayos X de polvo - metodo 2 (usando un difractometro Brucker AXS D8 advance)
Se recogieron patrones de difraccion usando radiacion Ka de Cu (40 kV, 40 mA), un goniometro 0-20, y divergencia de V4 y rendijas de recepcion, un monocromador Ge y un detector Lynxeye. El software usado para la recopilacion de datos fue Diffrac Plus XRD Commander v2.6.1 y los datos se analizaron y se presentaron usando Diffrac Plus EVA v13.0.0.2 o v15.0.0.0. Las muestras se ejecutaron en condiciones ambientales como espedmenes en placa plana usando el polvo tal como se recibio. La muestra se empaqueto suavemente en una cavidad cortada en una oblea de silicio pulida, sin fondo (510). La muestra se hizo rotar en su propio piano durante el analisis. Los detalles de la recopilacion de datos son: intervalo angular: de 2 a 42o 20; tamano del escalon: 0,05o 20; tiempo de recogida: 0,5 s/escalon.
Difraccion de rayos X de polvo - metodo 3 (usando un difractometro PANalytical (Philips) X’PertPRO MPD)
Se equipo el instrumento con un tubo de rayos X LFF de Cu. El compuesto se extendio sobre un portamuestras sin fondo. Los parametros de instrumento usados son los siguientes: voltaje del generador: 45 kV; amperaje del generador: 4o mA; geometna: Bragg-Brentano; fase: fase de disco. Las condiciones de medicion fueron las siguientes: modo de barrido: continuo; intervalo de barrido: de 3 a 50o 20; tamano de escalon: 0,020/escalon; tiempo de recuento: 30 s/escalon; tiempo de revolucion del disco: 1 s; tipo de radiacion: CuKa. Los parametros de trayectoria del haz incidente fueron tal como sigue: rendija de divergencia program.: 15 mm; rendija Soller: 0,04 rad; mascara de haz: 15 mm; rendija antidispersion: 10; cuchillo de haz: +. Los parametros de trayectoria de haz difractado fueron tal como sigue: pantalla antidispersion larga: +; rendija Soller: 0,04 rad; filtro de Ni: +; detector: X'Celerator.
Calorimetna diferencial de barrido - metodo 1 (usando un instrumento Mettler DSC 823e)
Un instrumento Mettler DSC 823E esta equipado con un automuestreador de 34 posiciones. El instrumento se calibro para la energfa y la temperatura usando indio certificado. Normalmente 0,5-3 mg de cada muestra, en una bandeja de aluminio con agujeros, se calentaron a 10oc/min desde 25oc hasta 300oc. Se mantuvo una purga de nitrogeno a 50 ml/min sobre la muestra. El software de control de instrumento y de analisis de datos era STARe v9.20.
Calorimetna diferencial de barrido - metodo 2 (usando un instrumento TA-lnstruments Q 1000 MTDSC equipado con una unidad de enfriamiento RCS)
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Se cerro una bandeja de muestra TA-lnstruments con la cubierta apropiada y se registro la curva de DSC en un Instrumento TA-Instruments Q1000 MTDSC equipado con una unidad de enfriamiento RCS. Se usaron los siguientes parametros: temperatura inicial: 250C; velocidad de calentamiento: 10oC/min; temperatura final: 250oC.
Analisis termogravimetrico - metodo 1 (usando un instrumento Mettler TGA/SDTA 851e)
Los datos TGA se recogieron en un instrumento Mettler TGA/SDTA 851e equipado con un automuestreador de 34 posiciones. El instrumento se calibro para la temperatura usando indio certificado. Normalmente se cargaron 5 - 30 mg de cada muestra en un crisol de aluminio pesado previamente y se calentaron a 10oc/min desde temperatura ambiental hasta 350oc. Se mantuvo una purga de nitrogeno a 50 ml/min sobre la muestra. El software de control de instrumento y de analisis de datos era STARe v9.20.
Analisis termogravimetrico (TGA) - metodo 2 (usando un termograv^metro TA-lnstruments Q500 TGA)
Los datos de TGA se recogieron en un termogravfmetro TA-Instruments Q500 TGA. El compuesto se transfirio a una bandeja de muestra de aluminio antes de analizarse usando los siguientes parametros: temperatura inicial: temperatura ambiente; velocidad de calentamiento: 20oc/min; factor de resolucion: 4; condicion final: 350oc o <80[%o
(p/p)].
Sorcion gravimetrica de vapor (GVS)
Se obtuvieron isotermas de sorcion usando un analizador de sorcion de humedad SMS DVS Intrinsic, controlado mediante el software DVS Intrinsic Control v1.0.1.2 (o v 1.0.1.3). La temperatura de la muestra se mantuvo a 25oc mediante los controles de instrumento. La humedad se controlo mezclando corrientes de nitrogeno seco y humedo. con un caudal total de 200 ml/min. La humedad relativa se midio mediante una sonda Rotronic calibrada (intervalo dinamico del 1,0 - 100% de HR), ubicada cerca de la muestra. El cambio de peso (relajacion masica) de la muestra en funcion del % de HR se monitorizo constantemente mediante la microbalanza (precision de ±0,005 mg). Normalmente se pusieron 5 - 20 mg de muestra en una cesta de acero inoxidable de malla tarada en condiciones ambientales. La muestra se cargo y se descargo al 40% de HR y 25oc (condiciones ambiente tfpicas). Se realizo una isoterma de sorcion de humedad tal como se esboza mas adelante (dando 4 barrido 2 ciclos completos). Se realizo la isoterma convencional a 25oc a intervalos del 10% de HR a lo largo de un intervalo del 0 - 90% de HR. El analisis de datos se realizo en Microsoft Excel usando DVS Analysis Suite v6.2 (o 6.1 o 6.0).
Tabla 2: Parametros de metodo para experimentos con SMS DVS Intrinsic
Parametros
Valores
Adsorcion - barridos 1 y 3
40-90
Desorcion/Adsorcion - barridos 2 y 4
90-0. 0-40
Intervalos (% de HR)
10
Numero de barridos
4
Caudal (ml/min)
200
Temperatura (oc)
25
Estabilidad (oc/min)
0.2
Tiempo de sorcion (horas)
6 horas de temporizacion
La muestra se recupero tras completar la isoterma y se volvio a analizar mediante XRPD.
Sorcion dinamica de vapor (DVS)
Se transfirieron aproximadamente 20 mg del compuesto a una sorcion dinamica de vapor SMS y se registro el cambio de peso con respecto a la humedad atmosferica a 25oc usando los siguientes parametros: secado: 60 min bajo nitrogeno seco; equilibrio: 60 min; puntos de medicion de la HR (%): ciclo 1: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5; ciclo 2: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 0.
Eiemplo 1 - Preparacion del compuesto (l) y del compuesto (la)
Producto______intermedio______A______2-((4-Amino-3-yodo-1H-pirazolo[3,4-d1pirimidin-1-il)metil)-5-bromo-3-(2-
(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona.
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A una mezcla agitada de acido 2-bromo-6-(2-cloroacetamido)benzoico [King-Underwood et al., documento W02011/048111] (50,0 g, 171 mmol), (2-(trifluorometil)fenil)metanamina (29,4 ml, 205 mmol) y trietilamina (34 ml, 430 mmol) en tolueno (1,2 l) a -10C se le anadio una disolucion de tricloruro de fosforo (37 ml, 430 mmol) en tolueno (100 ml) gota a gota a lo largo de 1 h, tiempo durante el cual se mantuvo la temperatura interna por debajo de 50c. Se calento la mezcla de reaccion a reflujo durante 2,5 h y entonces se filtro la suspension resultante mientras estaba todav^a caliente. Se retuvo el filtrado y se suspendio el solido recogido en tolueno nuevo (100 ml), y se calento hasta 90oc con agitacion vigorosa. Se elimino el solido mediante filtracion y entonces se combinaron los extractos organicos que conteman el producto bruto.
Se preparo un segundo lote de este material repitiendo la reaccion en condiciones identicas a la misma escala. Se evaporaron a vado los filtrados combinados de ambas reacciones y se trituro el residuo con IPA (2 x 400 ml). El material bruto asf obtenido se seco a vado para producir 5-bromo-2-(clorometil)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin- 4(3H)-ona como un solido blanquecino (100 g, 90% de pureza mediante HpLc, 61%); Rt 2,70 min; m/z 431/433 (M+H)+ (ES+).
A una disolucion de la quinazolinona, obtenida tal como se describio anteriormente, (100 g, 90% de pureza, 210mmol) y 3-yodo-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-amina (50,4 g, 193 mmol) en DMF (600 ml) a TA se le anadio carbonato de potasio (80,0 g, 580 mmol) y tras 18 h se vertio la mezcla de reaccion en agua (1,2 l). El precipitado resultante se recogio mediante filtracion, y se lavo secuencialmente con agua (500 ml), con EtOAc (600 ml) y finalmente con Et20 (400 ml). La torta resultante se seco a vado para producir el compuesto del tttulo, el producto intermedio A, como un solido blanquecino (115 g, 89%); Rt 2,28 min, m/z 656/658 (M+H)+ (ES+).
Producto intermedio B: 2-((4-Amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4-cnpirimidin-1-il)metil)-5-bromo-3-(2- (trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona.
imagen10
Producto intermedio B
K3P04/PPfWPd(dba)2
Producto
intermedio A
A una disolucion del producto intermedio A (54.4 g. 83.0 mmol). acido (3-fluoro-5-hidroxifenil)boronico (15.5 g. 99,0 mmol) y K3PO4 (19,1 g. 83.0 mmol) en 1-butanol (900 ml) se le burbujeo nitrogeno a TA durante 20 min. Se trato la mezcla con PPh3 (3.26 g. 12,4 mmol) y con Pd2(dba)3 (1,90 g. 2.07 mmol) y se burbujeo con nitrogeno durante 10 min mas y entonces se calento hasta 90oc bajo un flujo de nitrogeno. Tras 40 h se enfrio la mezcla hasta 70oc y se le anadio agua (250 ml) gota a gota. Se enfrio la mezcla hasta 50oc durante 3 h y entonces hasta TA durante 3 dfas, tiempo durante el cual se formo un precipitado beis. El solido se recogio mediante filtracion. se lavo con 1-butanol (2 x 100 ml) y con agua (2 x 100 ml) y entonces se seco a vado a 40oc para producir el compuesto del tttulo, el producto intermedio B. como un solido blanquecino (35.2 g. 65%); Rt 2,25 min. m/z 640/642 (M+H)+
(es+).
Compuesto______(])_______2-((4-Amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3.4-d1pirimidin-1-il)metil)-5-(3-(2-(2-
metoxietoxi)etoxi)prop-1-in-1-il)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona.
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Una suspension del producto intermedio B (35,2 g, 55,0 mmol), 3-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)prop-1-ino [King- Underwood et al., documento W02011/048111], (17,4 g, 110 mmol), PdCl2(PPh3)2 (3,86 g, 5,50 mmol) y yoduro de cobre (I) (1,05 g, 5,50 mmol) en una mezcla de Et2NH y DMF (4:1 v/v, 820 ml) se burbujeo con nitrogeno a TA durante 10 min. Se calento la mezcla hasta 650C durante 1,5 h y entonces se enfrio hasta TA. Se evaporaron los volatiles a vado y se repartio el residuo entre EtOAc (600 ml) y NH4OAC aq. sat. (650 ml). Se separo la fase acuosa y se extrajo con EtOAc (300 ml) y se evaporaron las fases organicas combinadas a vado para producir un aceite viscoso marron oscuro. Se le anadio metanol (200 ml) y se agito la mezcla a TA durante 16 h. Se formo un precipitado amarillo que se recogio mediante filtracion y se lavo con MeOH (100 ml). Se purifico el solido resultante mediante en columna ultrarrapida en dos lotes separados (Si02, 330 g, MeOH en DCM, 0-6%, elucion en gradiente). Se llevaron juntos los materiales purificados a una mezcla de DCM/MeOH (10:1 v/v) para dar una disolucion homogenea que entonces se evaporo y se seco a vado para producir el compuesto del tftulo, el compuesto (I), como un solido blanquecino (20,1 g, 51%); Rt 2,15 min, m/z 718 (M+H)+ (ES+); 1H-RMN 6: 3,19 (3H, s), 3,35-3,38 (2H, m solapante), 3,44-3,49 (4H, m solapante), 3,60-3,63 (2H, m solapante), 4,37 (2H, s), 5,49 (2H, s), 5,76 (2H, s), 6,42 (1 H, d), 6,65 (1 H, m), 6,73 (1 H, m), 6,79 (1 H, m), 7,15 (1 H, t), 7,28 (1 H, t), 7,52 (1 H, d), 7,65-7,69 (2H, m solapante), 7,82 (1 H, m), 8,12 (1 H, s), 10,15 (1 H, s)
Compuesto______(la):______2-((4-Amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)-5-(3-(2-(2-
hidroxietoxi)etoxi)prop-1-in-1-il)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona.
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Una suspension del producto intermedio B (190 mg, 0,297 mmol), 2-(2-(prop-2-in-1-iloxi)etoxi)etanol [King- Underwood et al., documento W02011/048111] (257 mg, 0,890 mmol), PdCl2(PPha)2 (208 mg, 0,297 mmol) y yoduro de cobre (l) (57 mg, 0.30 mmol) en una mezcla de Et2NH y DMF (4:1 v/v, 7,5 ml) se desgasifico con N2 y entonces se calento hasta 600C durante 16 h. La mezcla de reaccion se enfrio hasta TA y se evaporo a vado sobre gel de sflice y se purifico mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (SO2, 12 g, MeOH en DCM, 0-5%, elucion en gradiente) para producir el compuesto del tftulo, el compuesto (la), como un solido tostado palido (30 mg, 14%); Rt 1,88 min, m/z 704 (M+H)+ (ES+); 1H-RMN 6: 3,36-3,50 (6H, m solapante), 3,61-3,63 (2H, m solapante), 4,37 (2H, s), 4,58 (1H, m), 5,48 (2H, s), 5,76 (2H, s), 6,41 (1H, d), 6,64 (1H, m), 6,72 (1H, d), 6,78 (1H, s), 7,14 (1H, t), 7,27 (1H, t), 7,52 (1H, d), 7,65-7,71 (2H, m solapante), 7,82 (1H, t), 8,13 (1H, s), 10,19 (1 H, s a).
Basandose en el analisis de compuestos estructuralmente similares (vease el documento WO2011/048111), se consldera muy improbable que el compuesto (I) presente atropisomerismo. La complejidad y las consecuencias adicionales para el desarrollo de farmacos que resultan del atropisomerismo son analogas a las que surgen de otras fuentes de isomerismo molecular tal como la presencia de un centro estereogenico. Esta propiedad convierte tales 5 moleculas tanto en quirales como, a menos que se resuelvan, en una mezcla racemica; cuyos componentes pueden tener perfiles farmacologicos y toxicologicos diferentes. Es probable que esta caractenstica aumente significativamente los costes de desarrollo posterior para tales moleculas, y la ausencia de atropisomerismo en el compuesto (I) es por tanto una propiedad sumamente deseable y ventajosa.
10 Eiemplo 2 - Preparacion del compuesto (I) como polimorfo cristalino de forma 1
Se preparo el compuesto (I) como polimorfo cristalino de forma 1 partiendo del producto intermedio B, que puede prepararse como se resume en el siguiente esquema:
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BIQ-Frb
' BuLi, THF
NaO-Eu
DMA
Producto
intermedio A
N 3'iCOn,
PdlPPhaH,
PdCI,|d|>t>0
EtOHfH2Q
KCIAt;. uhlsO
TFA
Producto
intermedio B
La preparacion de los productos intermedios se expone a continuacion.
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1-Bromo-3-(terc-butoxi)-5-fluorobenceno
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A DMA enfriada con hielo (2,0 l) se le anadio terc-butoxido de sodio (284 g, 3,89 moles) en porciones seguido por la adicion gota a gota de 1-bromo-3,5-difluorobenceno (298 ml, 2,59 moles). Tras completar la adicion se calento la 25 mezcla hasta TA y se agito durante 72 h. Se anadio agua (200 ml) y se filtro el precipitado gomoso resultante. Se concentro el sobrenadante a vado y se purifico el residuo mediante destilacion a vado. El aceite resultante se disolvio en dietil eter (1,0 l), se lavo con agua (6 x 250 ml), se seco (MgS04) y se concentro a vado para dar el compuesto del tttulo como un aceite incoloro (22o g, 881 mmol, 34,0%): p.e. 84-860C (8 mbar); 1H-RMN (400 MHz, CDCIs) 6: 1,35 (9H, s), 6,64 (1H, dt), 6,92-6,96 (2H, m solapante).
Acido (3-(terc-butoxi)-5-fluorofenil)boronico; 2
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A una disolucion de 1-bromo-3-(terc-butoxi)-5-fIuorobeneeno (75,0 g, 304 mmol) en THF (1,0 I) se le anadio n-butil- litio (2,5 M en hexanos,150 ml, 337 mmol) gota a gota at -780C. Se agito la mezcla resultante a esta temperatura durante 45 min y entonces se anadio gota a gota borato de triisopropilo (105 ml, 455 mmol). Se agito la mezcla a esa temperatura durante 1,5 h, y entonces se ealento hasta -50c a lo largo de 1,5 h. Se diluyo la mezcla con dietil eter (1,0 I) y disolucion aq de Hci 1 M (450 ml) y se separaron las fases. Se extrajo la fase acuosa con dietil eter adicional (2 x 250 ml). Los extractos organicos combinados se secaron (MgS04), se filtraron y entonces se evaporaron a vado para dar un aceite amarillo palido. El aceite se redisolvio en /so-hexanos (300 ml) y se concentro de nuevo para producir un solido pegajoso blanquecino. El solido se trituro con /so-hexanos (150 ml) y se filtro para producir un polvo bianco. Se repartio el material entre NaOH 2 M (600 ml) y dietil eter (600 ml). Se reeogio la fase acuosa y se extrajo la organiea con NaOH adicional (2 x 200 ml). Una cantidad significativa de material no era soluble y este se filtro, se lavo con dietil eter (se eonfirmo como producto limpio mediante LCMS). Se enfrio la fase acuosa basiea en un bano de hielo y se aeidifieo hasta pH 1 con Hci cone. (~ 130 ml). Se extrajo la fase acuosa con DCM (3 x 300 ml) y las fases organieas se seearon (Na2S04), se filtraron y se eoneentraron a vado para dar un polvo beis. Este se trituro eon iso-hexanos (100 ml) para producir producto limpio adicional. Los dos lotes se eombinaron para dar el eompuesto del tftulo 2 como un polvo blanquecino (17,2 g, 73,0 mmol, 24,1 %): Rt: 1,87 min.
2-(3-(terc-Butox/)-5-fluorofen/l)-4,4,5,5-tetramet/l-1,3,2-d/oxaborolano; 3
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Se lavo eon nitrogeno una mezcla de dieloruro de paladio (N)-1,1'-b/s(difeniifosfino)ferroeeno (6,81 g, 9.31 mmol), aeetato de potasio (54,8 g, 558 mmol) y 4,4,4',4',5,5,5',5'-oetametii-2,2'-bi(1,3,2-dioxaboroiano) (52,0 g, 205 mmol) y a esto se le anadio una disolucion de 1-bromo-3-(terc-butoxi)-5-fiuorobeneeno (46,0 g, 186 mmol) en DMSO (528 ml). La mezcla resultante se sonieo durante 3 minutos, se desgasifieo durante 5 minutos y se ealento a 80oc durante 23 h. La mezcla de reaceion se repartio entre dietil eter (500 ml) y agua (500 ml). Se extrajo la fase acuosa eon dietil eter adicional (3 x 400 ml). Los extractos organicos combinados se lavaron eon salmuera (300 ml), se seearon (MgS04), se filtraron y se evaporaron a vado para dar un residuo marron oseuro. Este residuo se disolvio en una mezcla de iso-hexanos/EtOAe, se filtro a traves de un tapon eorto de sflice y se evaporo a vado para dar un solido marron elaro. El solido residuo se adsorbio previamente sobre sflice y se purifieo mediante cromatograffa en eolumna, (Si02, eluyendo eon 0-4% EtOAe en iso-hexanos, elueion en gradiente) para dar el eompuesto del tftulo 3 como un solido bianco (27,0 g, 87,0 mmol, 46,8%): 1H-RMN (400 MHz, CDCIs) 6: 1,31 (12H, s), 1,34 (9H, s), 6,78 (1H, m), 7,17-7,20 (2H, m solapante).
2-((4-Am/no-3-(3-(terc-butox/)-5-fluorofen/l)-1H-p/razolo[3,4-d]p/r/m/d/n-1-/l)met/l)-5-bromo-3-(2- (tr/fluoromet/l)benc/l)qu/nazol/n-4(3H)-ona;1 (a part/r de ac/do boron/co, 3)
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Producto intermedio A
O Bu
N a2c (j3, Pd (pprt3
EtOHm-,0
Se desgasifico con nitrogeno una mezcla de producto intermedio A (2 x 10,0 g, 14,9 mmol), acido (3-(terc-butoxi)-5- fluorofenil)boronico 3 (2 x 3,17 g, 14,9 mmol), carbonato de sodio decahidratado (2 x 6,75 g, 23,6 mmol) y tetrakis- trifenilfosfina de paladio (2 x 0,52 g, 0,45 mmol) en una mezcla de EtOH/agua (9:1, 2 x 500 ml), se sonico durante 10 min y entonces se agito a 650C bajo nitrogeno durante 18 h. Se combinaron las mezclas de reaccion y se eliminaron los disolventes a vado, se disolvio el residuo en MeOH al 10% en disolucion de DCM (500 ml) y se lavo con disolucion de acetato de amonio sat. (400 ml). Se extrajo la fase acuosa con MeOH al 10% adicional en disolucion de DCM (2 x 400 ml). Se evaporaron los extractos organicos combinados a vado y se adsorbio previamente el residuo sobre gel de silice y se purifico mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (eluyendo con 0-40% EtOAc en DCM, elucion en gradiente) para dar el compuesto del titulo 1 como un solido amarillo palido (8,4 g, 9,89 mmol, 32,4%): Rt 2,70 min, Vl-RMN (400 MHz, DMSO-da) 6: 1,37 (9H, s), 5,50 (2H, s), 5,78 (2H, s), 6,49 (1H, d), 6,91 (1H, t), 6,95 (1H, dt), 7,04 (1H, m), 7,15 (1H, t), 7,28 (1H, t), 7,54 (1H, d), 7,68-7,72 (2H, m solapante), 7,83 (1 H, dd), 8,15 (1 H, s). El material tema aproximadamente una pureza del 80%.
2-((4-Amino-3-(3-(terc-butoxi)-5-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)-5-bromo-3-(2- (trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona; 1 (a partir de ester boronico, 2)
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Una mezcla del producto intermedio A (10,0 g, 14,9 mmol; preparado tal como se describe en el ejemplo 1), 2-(3- (terc-butoxi)-5-fluorofenil)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano 2 (6,59 g, 22,40 mmol) (3,17 g, 14,9 mmol), carbonato de sodio decahidratado (26,75 g, 23,6 mmol) y tetrakis-trifenilfosfina de paladio (0,52 g, 0,45 mmol) en una mezcla de EtOH/agua (9:1, 500 ml) se desgasifico con nitrogeno, se sonico durante 10 min y entonces se agito a 65oc bajo nitrogeno durante 40 h. Se eliminaron los disolventes a vado, se disolvio el residuo en MeOH al 10% en disolucion de DCM (250 ml) y se lavo con disolucion de acetato de amonio sat. (200 ml). Se extrajo la fase acuosa con MeOH al 10% adicional en disolucion de DCM (2 x 200 ml). Se evaporaron los extractos organicos combinados a vado y se adsorbio previamente el residuo sobre gel de sflice y se purifico mediante cromatograffa en columna ultrarrapida (eluyendo con 0-40% EtOAc en DCM, elucion en gradiente) para dar el compuesto del titulo como un solido amarillo palido (4,5 g, 6,14 mmol, 41,1%): Rt 2,70 min.
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2-((4-Amino-3-(3-fluom-5-hidmxifenil)- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1 -il)metil)-5-bromo-3-(2- (trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona
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A una disolucion de de 2-((4-amino-3-(3-(terc-butoxi)-5-fluorofenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1-il)metil)-5-bromo-3- (2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona 1 (13,0 g, 18,6 mmol) en DCM (l5o ml) se le anadio acido trifluoroacetico (21,6 ml, 280 mmol) y se agito la disolucion resultante durante 2 h. Se elimino el disolvente a vado. El residuo se llevo a DCM (200 ml) y una disolucion saturada de NaHC03 (200 ml). Se extrajo la fase acuosa adicionalmente con MeOH al 10% en DCM (2 x 100 ml) y se evaporaron los extractos organicos combinados a vado. El residuo se absorbio previamente sobre gel de silice y se purifico mediante cromatograffa en columna ultrarrapida eluyendo con 0-3% MeOH en DCM para dar el compuesto del titulo 1b como un solido bianco (7,60 g, 11,8 mmol, 63,0%): m/z 640 (M+H)+ (ES+); 1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 6: 5,47 (2H, s), 5,78 (2H, s), 6,43 (1H, d), 6,65 (1H, dt), 6,75 (1H, m), 6,79 (1H, t), 7,14 (1H, t), 7,28 (1H, t), 7,53 (1H, d), 7,69-7,73 (2H, m solapante), 7,85 (1H, m), 8,13 (1H, s), 10,18 (1H, d).
Compuesto (I): 2-((4-Amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)- 1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-1 -il)metil)-5-(3-(2-(2-
metoxietoxi)etoxi)prop-1-in-1-il)-3-(2-(trifluorometil)bencil)quinazolin-4(3H)-ona como polimorfo cristalino de forma 1
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Se desgasifico con nitrogeno meticulosamente una mezcla de 3-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)prop-1-ino (4,69 g, 29,7 mmol), yoduro de cobre (I) (226 mg, 1,19 mmol), el producto intermedio B (7,6 g, 11,9 mmol) y dicloruro de bis(trifenilfosfino)paladio (II) (833 mg, 1,19 mmol) en dietilamina (330 ml) y se agito a 600C durante 3 h. Se anadio mas 3-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)prop-1-ino (400 mg), dicloruro de bis(trifenilfosfino)paladio (II) (167 mg, 0,24 mmol) y yoduro de cobre (I) (0,45 g, 0,24 mmol) se le anadio en dietilamina (30,0 ml) y se agito a 600C durante 3 h. Se anadio una alfcuota adicional de 3-(2-(2-metoxietoxi)etoxi)prop-1-ino 7 (400 mg), dicloruro de bis(trifenilfosfino)paladio (II) (167 mg, 0,24 mmol) y yoduro de cobre (I) (0,45 g, 0,24 mmol) y se agito la mezcla de reaccion a 600C durante unas 7 h mas. Se elimino el disolvente a vado, se disolvio el residuo en MeOH al 10% en disolucion de DCM (200 ml) y se lavo con disolucion de acetato de amonio acuoso (10% en peso, 300 ml). Se extrajo adicionalmente la fase acuosa con MeOH al 10% en disolucion de DCM (2 x 200 ml). Se evaporo la fase organica combinada a vado. Se suspension el residuo en MeOH (30,0 ml) durante la noche y se filtro. El solido residuo se adsorbio previamente sobre sflice y se purifico mediante cromatograffa en columna, (Si02, eluyendo con 0-5% MeOH en DCM, elucion en gradiente) para dar el compuesto (I) como un solido tostado en forma del polimorfo
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cristalino de forma 1 (4,73 g, 6,52 mmol, 55,0%): m/z 718 (M+H)+ (ES+); 1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 6: 3,20 (3H, s), 3,35-3,39 (2H, m solapante), 3,43-3,50 (4H, m solapante), 3,60-3,64 (2H, m solapante), 4,38 (2H, s), 5,49 (2H, s), 5,77 (2H, s), 6,42 (1H, d), 6,65 (1H, dt), 6,74 (1H, dq), 6,79 (1H, t), 7,15 (1H, t), 7,28 (1H, t), 7,52 (1H, d), 7,65-7,72 (2H, m solapante), 7,83 (1H, m), 8,13 (1H, s), 10,19 (1H, s).
El analisis de XRPD de una muestra de este material se realizo usando metodo de XRPD 2 en los procedimientos generales. El material era cristalino tal como se muestra en el patron de XRPD obtenido (Figura 3), pero tambien contema algun material amorfo. Un analisis de DSC (usando el metodo de DSC 1 en los procedimientos generales) en una muestra del polimorfo cristalino de forma 1 se muestra en la Figura 4 (grafico inferior), en la que puede observarse que la muestra se sometio a varios eventos de calentamiento. Una endoterma ancha con un pico maximo de 102oC fue seguida por una exoterma con un pico maximo de 1410C, que fue seguido por una endoterma mas afilada con un pico maximo de 174oc. Se observo que durante el calentamiento se formo un nuevo polimorfo cristalino - posteriormente se encontro que era el polimorfo cristalino de forma 2. El analisis TGA (usando el metodo de TGA 1 en los procedimientos generales) en una muestra del polimorfo cristalino de forma 1 (Figura 4; grafico superior) mostro una perdida de peso del 0,34% del ambiente a 75oc probablemente debido a la evaporacion del disolvente libre y/o agua higroscopica.
Eiemplo 3 - Preparacion del compuesto (I) como polimorfo cristalino de forma 2 Metodo 1
El polimorfo cristalino de forma 2 puede prepararse cristalizando en una disolucion en 1-propanol, tal como sigue. Se cargo un reactor de 100 ml con 1,98 g del compuesto (I) y 49,5 ml de 1-propanol (25 l/kg). Se agito la mezcla y se calento hasta 95oc (se observo una disolucion a 92oC). Se mantuvo la disolucion a 95oc durante 30 minutos antes de enfriarse hasta 23oc a lo largo de 10 horas, produciendose cristalizacion espontanea a 72oc. Se agito la mezcla heterogenea durante 4 horas, entonces el filtrado se filtro y se lavo con 1-propanol (2 ml). Se seco el producto a 45oc a vado durante 18 horas para dar 1,71 g del polimorfo cristalino de forma 2 en un rendimiento del 86,4%.
Metodo 2
La cristalizacion del polimorfo cristalino de forma 2 en una disolucion en 1-propanol tambien puede facilitarse sembrando con un cristal 0 cristales del polimorfo cristalino de forma 2, tal como sigue. Se anadio 1-propanol (25,00 l/kg, 275,0 ml) al compuesto (I) (11,00 g). Se agito la mezcla a 350 rpm a 25oc. Entonces se calento la mezcla heterogenea hasta 97oc a lo largo de 40 minutos (temperatura de reflujo), se mantuvo durante 5 minutos a 97oc, entonces se enfrio hasta 96oc a lo largo de 5 minutos, entonces se mantuvo durante 1 hora a 96oc. Se enfrio la disolucion ligeramente naranja homogenea hasta 85oc a lo largo de 15 minutos. Entonces se redujo la velocidad de agitacion hasta 250 rpm y se sembro la disolucion con el polimorfo cristalino de forma 2 (0,01 kg de cristal de siembra/kg de material de partida de compuesto (I), 0,11 g). Se agito la mezcla durante 10 minutos a 85oc, entonces se enfrio hasta 220C a lo largo de 8 h, usando enfriamiento cubico con un coeficiente no lineal de 2,3. Se agito la mezcla heterogenea durante 10 horas a 220C antes de filtrar el filtrado. El producto se lavo con 1-propanol (1,00 l/kg, 8,84 g, 11,00 ml), entonces se seco a 45oc (fin de semana; 72 horas) para dar el polimorfo cristalino de forma 2 (9,5 g, 86,4%).
Metodo 3
El polimorfo cristalino de forma 2 puede prepararse suspendiendo el polimorfo cristalino de forma 1 en metanol, etanol, 2-propanol, 1-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, acetato de isopropilo, TBME, 2- butanona, dMsO, dietil eter, MIBK, heptano, nitrometano, agua al 10%/etanol, agua al 10%/acetonitrilo 0 agua al 10%/2-propanol.
Metodo 4
El polimorfo cristalino de forma 2 puede prepararse suspendiendo el compuesto (I) en forma amorfa en metanol, etanol, 2-propanol, 1-propanol, acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, acetato de isopropilo, TBME, 2- butanona, dMsO, dietil eter, MIBK, nitrometano, agua al 10%/etanol 0 agua al 10%/2-propanol.
Metodo 5
Una preparacion ampliada a escala del polimorfo cristalino de forma 2 es tal como sigue: se pesaron 200 mg de polimorfo cristalino de forma 1 en un vial de centelleo a 20 ml. Se anadieron 50 volumenes de metanol y se suspendio la muestra durante 24 horas entre 20oc y 50oc (4 horas a cada temperatura) con agitacion constante a 500 rpm. El material resultante se filtro a vado y se seco en el horno de vado durante la noche a 40oc.
Eiemplo 4 - Caracterizacion del compuesto (I) como polimorfo cristalino de forma 2
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El analisis de XRPD de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 se realizo usando el metodo de XRPD 3 en Ios procedimientos generales. El patron de XRPD obtenido se muestra en la Figura 5.
El analisis TGA de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 se realizo usando el metodo de TGA 2 en Ios procedimientos generales. Los datos obtenidos se muestran en la Figura 6 a partir de la que resulta evidente que el polimorfo cristalino de forma 2 mostro una perdida de peso de ± 0,5% de desde 1550C hasta 200oC.
El analisis de DSC en una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 se realizo usando el metodo de DSC 2 en Ios procedimientos generales. Los datos obtenidos se muestran en la Figura 7 a partir de la que resulta evidente que el polimorfo cristalino de forma 2 mostro fusion con descomposicion a 190,1oc (maximo pico).
Un grafico de isotermas de DVS de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 se muestra en la Figura 8 y un grafico del cambio de masa de DVS se muestra en la Figura 9. Se observo que el polimorfo cristalino de forma 2 absorbio agua gradualmente ±0,4% desde el 0% de HR hasta el 95% de HR y la captacion de agua fue reversible, Io que indica que la forma 2 no es higroscopica.
Un estudio de estabilidad estatica de una muestra del polimorfo cristalino de forma 2 demostro que la muestra era estable a la humedad con respecto a la forma solida ya que no se observaron cambios mediante XRPD (usando el metodo de XRPD 3 en Ios procedimientos generales) tras el analisis de DVS (vease la Figura 10) y 1 semana de almacenamiento a 25oc/96% de HR y 40oc/75% de HR (vease la Figura 11, usando XRPD metodo 1 en Ios procedimientos generales).
Eiemplo 5 - Estabilidad del compuesto (I) micronizado como polimorfo cristalino de forma 2
Se preparo el polimorfo cristalino de forma 2 micronizado usando un dispositivo de micronizacion Jetmill de 5 cm para producir la siguiente distribucion de tamano de partfcula: Dio = 1,14 |im; D50 = 1,94 |im y Dgo = 3,39 |im (la distribucion de tamano de partfcula se determino usando difraccion laser (instrumento Malvern Mastersizer).
Se analizo el material micronizado mediante TGA, XRPD y DSC en el momento cero y despues de diferentes condiciones de almacenamiento. Se almacenaron muestras en las siguientes condiciones: (i) 7 semanas a TA/<5% de HR; (ii) 7 semanas a TA/56% de HR; (iii) 7 semanas a TA/75% de HR; (iv) 7 semanas a 50oC; y (v) 7 semanas a 40oC/75% de HR.
Los datos mostrados en la tabla 3 indican que la muestra era cristalografica y termodinamicamente estable ya que no se observaron cambios significativos en las diferentes condiciones.
Tabla 3: Datos de estabilidad para el polimorfo cristalino de forma 2 (micronizado)
Condiciones
tga xrd ir dsc Apariencia
<100
<185oC Max. (oC) Adicional (oC)
0 dfas
0,1 0,3 ref ref 188,4 113,3(17 J/g) bianco
TA/<5% de HR*
0,1 0,3 -Ref -Ref 188,6 113,8(11 J/g) bianco
TA/56% de HR*
0,1 0,4 -Ref -Ref 188,5 113,7(8 J/g) bianco
TA/75% de HR*
0,2 0,4 -Ref -Ref 188,7 113,7(10 J/g) bianco
50oC*
0,0 0,3 -Ref -Ref 187,8 119,8 (3 J/g) bianco
40oC/75% de HR*
0,1 0,2 -Ref -Ref 188,5 117,4 (1 J/g) bianco
* durante 7 semanas; REF =
: referenda cristalina; - -Ref = identico a la referenda
Eiemplo 6 - Preparacion del compuesto (I) en forma amorfa
El compuesto (I) en forma amorfa se preparo calentando el polimorfo cristalino de forma 1 (obtenido usando el procedimiento del ejemplo 2) hasta 120oc.
Eiemplo 7 - Preparacion del compuesto (I) como polimorfo cristalino de forma 3 Metodo 1
El polimorfo cristalino de forma 3 puede prepararse suspendiendo el compuesto (I) en forma amorfa en diclorometano.
Metodo 2
Una preparacion ampliada a escala del polimorfo cristalino de forma 3 es tal como sigue: 200 mg del polimorfo cristalino de forma 1 se le anadio a un vial de 4 ml que contiene 5 volumenes de diclorometano. La muestra se agito con vortex durante 30 segundos. Entonces se anadieron 5 volumenes adicionales de DCM y la muestra se agito con
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vortex durante otros 30 segundos. La muestra se filtro a vado y se seco en un horno de vado a Io largo del transcurso de un fin de semana a 250C.
Eiemplo 8 - Caracterizacion del compuesto (I) como polimorfo cristalino de forma 3
El analisis de XRPD de una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 se realizo usando el metodo de XRPD 2 en los procedimientos generales. El patron de XRPD se muestra en la Figura 12.
Los datos de TGA y DSC (usando el metodo de TGA 1 y el metodo de DSC 1 en los procedimientos generales) obtenidos en una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 se muestran en la Figura 13. El polimorfo cristalino de forma 3 se funde con descomposicion a aproximadamente 1860C (maximo pico; DSC - grafico inferior).
Una isoterma de GVS obtenida en una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 se muestra en la Figura 14, en la que se observo un cambio de masa del 0,99% desde el 0-90% de HR.
Un estudio de estabilidad estatica de una muestra del polimorfo cristalino de forma 3 demostro que la muestra era estable a la humedad con respecto a la forma solida ya que no se observaron cambios mediante XRPD (usando el metodo de XRPD 2 en los procedimientos generales) tras el analisis de GVS (vease la Figura 15) y tras 1 semana de almacenamiento a 25oc/96% de HR y 40oc/75% de HR (vease la Figura 16; usando XRPD metodo 1 en los procedimientos generales).
Eiemplo 9 - Preparacion del compuesto (I) como pseudopolimorfo de forma 4
El compuesto (I) en forma del polimorfo cristalino de forma 1 (20 mg) o el compuesto (I) en forma amorfa (20 mg) se peso en un vial de HPLC. Entonces se anadio THF en incrementos a temperatura ambiente con agitacion durante 1 minuto. Entonces se agito la muestra (500 rpm) a 50oc durante 15 minutos antes de la siguiente adicion de THF. Se continuo con este proceso hasta que se hadan anadido 80 volumenes de THF para obtener una disolucion. La disolucion se enfrio desde 50oc hasta 50c a 0,1oc/min y se mantuvo a 50c durante la noche. Entonces se dejo que la disolucion se evaporase con el fin de obtener un solido. El solido se filtro a vado, se seco al aire (a vado) durante 2 horas antes de analizarse mediante XRPD usando el metodo de XRPD 1 en los procedimientos generales. El patron de XRPD de una muestra del solido obtenido usando el compuesto (I) en forma amorfa como material de partida se muestra en la Figura 17 y corresponde al pseudopolimorfo de forma 4. Una muestra del solido obtenido usando el polimorfo cristalino de forma 1 como material de partida se seco en un horno de vado a 25oc durante >48 horas antes de analizarse de nuevo mediante XRPD. Tras este periodo de secado prolongado, se observo que el polimorfo cristalino de forma 4 se hada convertido en el compuesto (I) en forma amorfa. Como tal, el pseudopolimorfo de forma 4 es un solvato metaestable.
Eiemplo 10 - Preparacion del compuesto (I) como pseudopolimorfo de forma 5
El compuesto (I) en forma del polimorfo cristalino de forma 1 (20 mg) o el compuesto (I) en forma amorfa (20 mg) se peso en un vial de HPLC. Entonces se anadio 1,4-dioxano en incrementos a temperatura ambiente con agitacion durante 1 minuto. Entonces se agito la muestra (500 rpm) a 50oc durante 15 minutos antes de la siguiente adicion de 1,4-dioxano. Se continuo con este proceso hasta que se hadan anadido 80 volumenes de 1,4-dioxano hasta obtener una disolucion. Se enfrio la disolucion desde 5ooc hasta 50c a 0,1oc/min y se mantuvo a 50c durante la noche. Entonces se dejo que se evaporase la disolucion con el fin de obtener un solido. El solido se filtro a vado, se seco al aire (a vado) durante 2 horas antes de analizarse mediante XRPD usando el metodo de XRPD 1 en los procedimientos generales. El patron de XRPD de una muestra del solido obtenido usando el compuesto (I) en forma amorfa como material de partida se muestra en la Figura 17 y corresponde al pseudopolimorfo de forma 5. Una muestra del solido obtenido usando el polimorfo cristalino de forma 1 como material de partida se seco en un horno de vado a 25oc durante >48 horas antes de analizarse de nuevo mediante XRPD. Tras este periodo de secado prolongado, el pseudopolimorfo de forma 5 no hada cambiado de forma. Se realizo una caracterizacion adicional para generar datos de 1H-RMN, TGA y DSC (no mostrados) que mostraron que el pseudopolimorfo de forma 5 revirtio de vuelta al compuesto (I) en forma amorfa tras la perdida de disolvente. Como tal, el pseudopolimorfo de forma 5 es un solvato metaestable.
Eiemplo 11 - Preparacion del compuesto (I) como pseudopolimorfo de forma 6
El compuesto (I) en forma amorfa (20 mg) se peso en un vial de HPLC. Entonces se anadio agua al 10%/acetonitrilo en incrementos a temperatura ambiente con agitacion durante 1 minuto. Entonces se agito la muestra (500 rpm) a 50oc durante 15 minutos antes de la siguiente adicion de agua al 10%/acetonitrilo. Se continuo con este proceso hasta que se hadan anadido 80 volumenes de agua al 10%/acetonitrilo. Se dejo que la suspension resultante madurase entre 25oc y 50oc (4 horas a cada temperatura) con agitacion a 500 rpm durante 2 dfas. El solido se filtro entonces a vado, se seco al aire durante 2 horas y se analizo mediante XRPD usando el metodo de XRPD 1 en los procedimientos generales. El patron de XRPD de una muestra de este material se muestra en la Figura 17 y corresponde al pseudopolimorfo de forma 6. Tras el analisis de XRPD, el material se seco en un horno de vado a 40oc durante la noche. Tras este periodo de secado prolongado, se observo que el pseudopolimorfo de forma 6
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habfa perdido disolvente y se convirtio en el polimorfo cristalino de forma 2. Como tal, el pseudopollmorfo de forma 6 es un solvato metaestable.
Eiemplo 12 - Preparacion del compuesto (I) como pseudopolimorfo de forma 7
El compuesto (I) en forma amorfa (20 mg) se peso en un vial de HPLC. Entonces se anadio agua al 10%/acetona en incrementos a temperatura ambiente con agitacion durante 1 minuto. Entonces se agito la muestra (500 rpm) a 50oC durante 15 minutos antes de la siguiente adicion de agua al 10%/acetona. Se continuo con este proceso hasta que se ha^an anadido 80 volumenes de agua al 10%/acetona. Se dejo que la suspension resultante madurase entre 25oc y 50oc (4 horas a cada temperatura) con agitacion a 500 rpm durante 2 dfas. El solido se filtro entonces a vado, se seco al aire durante 2 horas y se analizo mediante XRPD usando el metodo de XRPD 1 en los procedimientos generales. El patron de XRPD de una muestra de este material se muestra en la Figura 17 y corresponde al pseudopolimorfo de forma 7. Tras el analisis de XRPD el material se seco en un horno de vado a 40oc durante la noche. Tras este periodo de secado prolongado, se observo que el pseudopolimorfo de forma 7 habfa perdido disolvente y se habfa convertido en el polimorfo cristalino de forma 2. Como tal, el pseudopolimorfo de forma 7 es un solvato metaestable.
Eiemplo 13 - Estabilidad termodinamica de los polimorfos cristalinos de forma 2 y forma 3 y su interconversion
Se realizaron experimentos de suspension competitiva en mezclas 50:50 de los polimorfos cristalinos de forma 2 y forma 3. Se anadieron 50 volumenes de disolvente y se agitaron las muestras (300 rpm) a una temperatura fija durante 3 dfas. Todas las muestras se filtraron entonces a vado y se secaron al aire durante 30 minutos antes del analisis de XRPD.
Los resultados de los experimentos de suspension se resumen en la tabla 4 a continuacion:
Tabla 4: Resultados de suspension competitiva
Disolvente
Temperatura Observacion Resultados de XRPD
Cloroformo
50oc disolucion transparente y solido forma 2
Cloroformo
25oc suspension forma 2
Cloroformo
50c suspension forma 2
Acetonitrilo
50oc disolucion transparente y solido forma 2
Acetonitrilo
25oc suspension forma 2
Acetonitrilo
50c suspension forma 2
Agua al 10%/ACN
50oC disolucion transparente y solido forma 2
Agua al 10%/ACN
25oC suspension forma 2
Agua al 10%/ACN
50c suspension forma 2
Etanol
250C suspension forma 2
Etanol
40oC suspension forma 2
Etanol
60oC disolucion transparente y solido forma 2
Acetona
25oC suspension forma 2
Acetona
40oC suspension forma 2
Acetona
60oC disolucion transparente y solido forma 2
Acetato de etilo
25oC suspension forma 2
Acetato de etilo
40oC suspension forma 2
Acetato de etilo
60oC disolucion transparente y solido forma 2
Todos los experimentos de suspension competitiva dieron como resultado la forma 2, lo que indica que esta es la forma termodinamicamente mas estable.
Eiemplo 14 - Metodologia de examen in vitro e in vivo y resultados Examen in vitro
Pruebas biologicas: metodos experimentales Ensayo de inhibicion enzimatica
Las enzimas PI3K catalizan la fosforilacion de 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol (PIP2) a 3,4,5-trifosfato de fosfatidilinositol (PIP3) en presencia de ATP e iones Mg2+. El producto de PIP3 pueden detectarse mediante el desplazamiento de biotina-PIP3 a partir de complejos de transferencia de ene^a que consisten en anticuerpo monoclonal anti-GST marcado con europio, un dominio de homologfa Pleckstrin (PH) etiquetado con GST, PIP3 biotinilado y estreptavidina-aloficocianina (APC) mediante la transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET) (ensayo enzimatico HTRF®PI3K, Millipore). La excitacion, a 330 nm, de europio en el complejo da como resultado una transferencia de energfa a la APC y una emision fluorescente a
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665 nm aunque el propio europio emita a su longitud de onda caractenstica de 620 nm. El producto de PIP3 formado medlante la actividad PI3K desplaza la biotina-PIP3 del complejo y da como resultado una perdida de transferencia de ene^a (senal decreciente).
Se anadio el compuesto que debe someterse a prueba, a las concentraciones finales deseadas, a una mezcla de sustrato de PIP2 y una enzima PI3K recombinante (ya sean las isoformas a, p o6, de Millipore, o la isoforma y [constructo pllOy + p101], de United States Biological, Swampscott, MA) y la mezcla se incubo durante 2 ha TA. Tras este periodo de incubacion, se anadio ATP (10 |iM) a la mezcla de enzima/compuesto/sustrato de PIP2 y se incubo la mezcla resultante durante 30 min mas a TA. Entonces se anadieron una disolucion de parada que contiene PIP3 biotinilado y la mezcla de deteccion que contiene el dominio de homologfa pleckstrin (pH) GRP1 etiquetada con GST y fluoroforos, y se incubo la mezcla a TA durante 15-18 h, antes de la deteccion en un lector de microplacas de fluorescencia (Synergy 4, BioTek UK, Bedfordshire, Reino Unido).
Los resultados se calcularon segun la formula: senal de APC (emision a 665 nm)/senal de europio (emision a 620 nm) x 104. Se calculo la inhibicion en porcentaje de cada reaccion en relacion con el control tratado con DMSO, y entonces se calculo la concentracion inhibidora al 50% (valor de CI50) a partir de la curva de concentracion- respuesta.
Ensayo basado en celulas PI3K 6
Como medio de evaluacion de la activacion de PI3K 6 en respuesta a estfmulos, se determino el estado de fosforilacion de la protema, Akt, un producto posterior de la senalizacion de P13K6.
Se diferenciaron celulas U937, obtenidas de una lmea celular de linfoma monodtico, leucemica, humana, en celulas de tipo macrofago mediante incubacion con PMA (100 ng/ml) durante de 48 a 72 h. Entonces se incubaron previamente las celulas con 0 bien el compuesto de prueba 0 bien el vedculo durante 2 h y entonces se estimularon brevemente mediante exposicion a H2O2 (10 mM, 5-7 min) y se detuvo la reaccion reemplazando los medios con disolucion de formaldeddo al 4%. Se inactivaron la actividad de peroxido endogena y el formaldeddo incubando con tampon de extincion (azida de sodio al 0,1%, 1% de H2O2 en PBS con Triton X-100 al 0,1%) durante 20 min. Se lavaron las celulas con tampon (PBS que contema Triton x-100 al 0,1%) y se incubaron con disolucion de bloqueo (BSA al 1% en PBS) durante 1 h y entonces se volvieron a lavar con tampon y se incubaron durante la noche 0 bien con anticuerpo anti-pAkt 0 bien con anticuerpo anti-pan-Akt (ambos de Cell Signaling Technology). Tras lavar con tampon (PBS que contema Triton x-100 al 0,1%), se incubaron celulas con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Dako) y la senal resultante se determino colorimetricamente (DO: 450 nm con una longitud de onda de referenda de 655 nm) usando sustrato TMB (paquete de reactivos de sustrato suministrado por R&D Systems, Inc.).
Esta reaccion se detuvo mediante la adicion de disolucion de H2SO4 (100 |il). Entonces se lavaron las celulas con tampon (PBS que contema Triton x-100 al 0,1%) y se aplico disolucion de violeta cristal al 5% (100 |il) durante 30 min. Tras lavar con tampon (PBS que contema Triton x-100 al 0,1%) se anadio SDS al 1% (100 |il) a cada pocillo y se agitaron ligeramente las placas durante 1 h antes de medir la absorbancia a 595 nm (Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific). Se corrigieron las lecturas de DO450-655 medidas para el numero de celulas dividiendo la DO450-655 entre las lecturas de DO595. La relacion de senal de pAkt con respecto a senal de Akt total se uso para cuantificar el grado de activacion de PI3K 6. Se calculo la inhibicion en porcentaje para cada pocillo en relacion con un control convencional de 10 pg/ml (LY294002) fijado a una inhibicion del 1o0% frente a controles solo de H2O2 como unan inhibicion del 0%. Se calcularon los valores de CI50 a partir de las curvas de concentracion-respuesta generadas mediante las diluciones en serie de los compuestos de prueba.
Ensayo basado en celulas PI3K y
Como medio de evaluacion de la activacion de PI3K y en respuesta a estfmulos, se determino el estado de fosforilacion de la protema, Akt, un producto posterior de la senalizacion de PI3K y, tras estimulacion con MCP-1.
Se diferenciaron celulas U937 en celulas de tipo macrofago mediante incubacion con PMA (100 ng/ml) durante de 48 a 72 h. Entonces se incubaron previamente las celulas 0 bien con el compuesto de prueba 0 bien con el vehmulo durante 2 h y entonces se estimularon brevemente con MCP-1 (10 nM, 1 min) y se detuvo la reaccion reemplazando los medios con disolucion de formaldeddo al 4%. Se inactivaron las actividad peroxido endogena y el formaldeddo incubando con tampon de extincion (azida de sodio al 0,1%, 1% de H2O2 en PBS con Triton X-100 al 0,1%) durante 20 min. Se lavaron las celulas con tampon (PBS que contema Triton X-100 al 0,1%) y se incubaron con disolucion de bloqueo (BSA al 1% en PBS) durante 1 h y entonces se volvieron a lavar con tampon y se incubaron durante la noche 0 bien con anticuerpo anti-pAkt 0 bien con anticuerpo anti-pan-Akt (ambos de Cell Signaling Technology). Tras lavar con tampon (PBS que contema Triton X-100 al 0,1%), se incubaron las celulas con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Dako) y la senal resultante se determino colorimetricamente (DO: 450 nm con una longitud de onda de referenda de 655 nm) usando sustrato de TMB (paquete de reactivos de sustrato suministrado por R&D Systems, Inc.).
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Se detuvo esta reaccion mediante la adicion de dis°lucion de H2SO4 1 N (100 |il). Entonces se lavaron las celulas con tampon (PBS que contema Triton X-100 al 0,1%) y se aplico disolucion de violeta cristal al 5% (100 |il) durante 30 min. Tras lavar con tampon (PBS que contema Triton x-100 al 0,1%) se anadio SDS al 1% (100 |il) a cada pocillo y se agitaron ligeramente las placas durante 1 h antes de medir la absorbancia a 595 nm (Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific). Se corrigieron las lecturas de DO450-655 medidas para el numero de celulas dividiendo la DO450-655 entre las lecturas de DO595. La relacion de senal de pAkt con respecto a la senal Akt total se uso para cuantificar el grado de activacion de PI3K y. Se calculo la inhibicion en porcentaje para cada pocillo en relacion con un control convencional de 10 pg/ml (LY294002) fijado a una inhibicion del 100% frente a controles solo de MCP-1 como una inhibicion del 0%. Se calcularon los valores de CI50 a partir de las curvas de concentracion-respuesta generadas mediante las diluciones en serie de los compuestos de prueba usando XL-Fit (idbs, Guildford, Reino Unido).
Ensayo de produccion de aniones superoxido
Como medio de evaluacion de la funcion celular dependiente de PI3K6, se evaluo la produccion de aniones superoxido en celulas U937 cebadas con IFNy, mediante un ensayo de quimioluminiscencia. Se mantuvieron las celulas U937 (adquiridas de ATCC, Manassas, VA) en RPMI 1640 (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) con FCS al 10% a 370C. Se suspendieron las celulas a una densidad de 107 celulas/ml en 40 ml de FCS RPMI 164o al 10%, y se trataron con 20 pl de disolucion de IFNy 100 pg/ml (concentracion final: 50 ng/ml), y se incubaron a 37oc, CO2 al 5% durante 4 dfas.
Se sembraron celulas U937 cebadas con IFNy, a 0,2 x 10s celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos, y se incubaron previamente con compuestos de prueba durante 2 h en medios de privacion de nutrientes (FCS RPMI1640 al 0,5% libre de rojo fenol). Se resuspendio Zymosan A (10 mg) de Saccharomyses cerevisiae (de Sigma-Aldrich) en 1 ml de NaCI 150 mM y se sometio a ebullicion a 100oc durante 15 min. Tras la ebullicion, las partfculas de Zymosan se lavaron con 1 ml de PBS dos veces, y se incubaron con 0,5 ml de reactivos opsonizados BioParticIes™ (Life technologies) durante 60 min a 37oc. Se trataron las celulas con una mezcla de disolucion de partfculas Zymosan (10 pl), tampon de ensayo (85 pl), luminol (2,5 pl) y disolucion potenciadora (2,5 pl), que se proporcionan todos (excepto el Zymosan) en el kit de ensayo de aniones superoxido (n.° CS1000, Sigma-Aldrich Ltd, Poole, Reino Unido). Se midio la quimioluminiscencia que indica anion superoxido liberado cada 15 min hasta 60 min mediante la medicion luminometrica (Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific).
Los datos 60 min tras la incubacion se usaron para el analisis. Se calculo la inhibicion en porcentaje para cada pocillo en relacion con IC87114 10 pg/ml, un inhibidor de PI3K6 convencional, fijado a una inhibicion del l0o% frente al control como una inhibicion al 0%. Los valores de CE50 relativos se calcularon a partir de las curvas de concentracion-respuesta generadas mediante las diluciones en serie de los compuestos de prueba usando XL-Fit (idbs, Guildford, Reino Unido).
Produccion de citocinas inducida por CytoStim en PBMC
Como medio de evaluacion de la funcion celular dependiente de PI3K6, se evaluaron las IL-4, IL-5, IL-13 inducidas por CytoStim y la produccion de IFNy en PBMC mediante un ensayo de multiplex Luminex. Todos los voluntarios sanos se reclutaron por Quintiles Limited (London, Reino Unido), y se suministraron muestras sangurneas a Respivert Ltd. Este estudio fue aprobado por el Comite de etica local, y todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito.
Se anadieron suspensiones de PBMC (200 pl; 2 x 10s celulas/ml) a una placa de 96 pocillos. Se trataron las celulas ° bien con compuestos de prueba en DMSO puro ° bien con DMSO como vehfculo (2 pl) y se incubaron a TA durante 1 h. Se introdujo CytoStim (Miltentyi Biotec, Surrey, Reino Unido) a una razon de 1:50 y se incubaron las celulas durante 20 h (37oC; 5% CO2). Se hicieron rotar las placas a 500 x g durante 5 min y se recogio el sobrenadante. Se uso un kit de perla magnetica de citocina con alta sensibilidad (#HSCYTMAG-60SK, Millipore, Watford, Reino Unido) para medir los cuatro analitos (IL-4, IL-5, IL-13 y IFNy) de Luminex tal como sigue: se multiplexaron las celulas de anticuerpo magneticos y se incubaron en una placa de 96 pocillos con medio, convencional solo ° una muestra (50 pl) durante la noche con agitacion a 40c. Tras lavar dos veces con tampon de lavado Millipore proporcionado en el kit usando un lavador de placa magnetica, las perlas se incubaron durante 1 h con anticuerpo de deteccion (50 pl) con agitacion a TA. Una disolucion de estreptavidina/ficoeritrina proporcionada en el kit se le anadio durante 30 min con agitacion a TA. Tras el lavado, las perlas se volvieron a suspender en fluido de recubrimiento (150 pl) y se analizaron inmediatamente. El sistema Luminex se fijo a un recuento de 50 perlas y la cantidad de cada analito en el sobrenadante se calculo con respecto a una curva convencional. Los valores de CI50 se determinaron a partir de curvas de concentracion-inhibicion usando XL-Fit (IDBS, Guildford, Reino Unido)
Quimiotaxis con respecto a MCP1
Como medio de evaluacion de la funcion celular dependiente de PI3K y, se evaluo la quimiotaxis de celulas THP1 en relacion con MCP-1 usando una camara de quimiotaxis de 48 pocillos. Se mantuvieron las celulas THP1 de una
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lmea celular de linfosoma de monocitos leucemica humana (adquirida de ATCC Manassas, VA) en RPMI 1640 (Invitrogen Ltd., Paisley, Reino Unido) con FCS al 10% a 370C. Las celulas volvieron a suspenderse en BSA al 0,5% /rPMI1640 (2 x 10s celulas/ml) y se incubaron durante 10 min a 37oc, CO2 al 5%. Entonces se trataron alfcuotas de suspensiones celulares (500 |il) o bien con compuestos en DMSO puro 0 bien con DMSO como vetnculo (2,5 |il) durante 1 h (37oc, CO2 al 5%).
Se preparo MCP1 (50 nM) en BSA al 0,5o/o/RPMI1640. Se anadio disolucion de MCP1 (50 |il) a cada pocillo en la placa inferior de una camara de quimiotaxis de 48 pocillos (AP48, NeuroProbe Inc., Gaithersburg, MD). Se monto una membrana de policarbonato (8 |im) en la camara inferior, y entonces se monto la placa superior sobre la camara inferior y la membrana de filtro. Se trataron alfcuotas de suspension celular (50 |il) con compuestos 0 vetnculo antes de anadirse a la camara superior cuidadosamente, y se aplico BSA al 0,5% RPMI1640 (50 |il) en la parte superior. Entonces se dejo la camara durante 2 h (37oc, CO2 al 5%). Entonces se retiro cuidadosamente la membrana y se transfirio la muestra (25 |il) de la camara inferior a una nueva placa de 96 pocillos.
Se anadio una disolucion de MTT (50 |il) en FCS al 10% RPMI1640 libre de rojo fenol a cada pocillo, y se incubo la placa durante 2 h (37oc, CO2 al 5%). Se anadio DMSO puro (100 |il) a cada pocillo para extraer el formazan formado a partir de MTT y las placas se agitaron ligeramente durante 1 h antes de medir la absorbancia a 595 nm (Varioskan® Flash, Thermo-Fisher Scientific). Se compararon los valores con la inhibicion mediante AS604850 (10 |ig/ml), un inhibidor de PI3Ky selectivo, para calcular las inhibiciones en porcentaje relativas. Los valores de CE50 relativos se determinaron a partir de las curvas de concentracion-inhibicion usando XL-Fit (idbs, Guildford, Reino Unido).
Liberation de CXCL8 a partir de neutrofilos obtenidos de patientes con COPD
Se evaluaron mediante un ensayo ELISA Ios efectos de tratamiento sobre la liberacion de CXCL8 a partir de los neutrofilos obtenidos de pacientes con COPD. Todos Ios pacientes fueron reclutados por Quintiles Limited (Londres, Reino Unidos), y se suministraron las muestras de sangre a Respivert Ltd. Este estudio se aprobo por el Comite Etico local, y todos Ios sujetos dieron un consentimiento informado escrito. Se mezclo suavemente sangre completa (30 ml) con ACD (5 ml; que comprende: 7,36 g de acido cftrico, 14,71 g de citrato de sodio, 9,91 g de dextrosa en 250 ml de agua esteril, de doble destilacion) y dextrano al 6% (15 ml; diluidos en NaCI al 0,9%) para eliminar Ios globulos rojos. Los tubos se incubaron a TA durante 45 min, y el sobrenadante (fraccion rica en globulos blancos) se recogio entonces, dejando Ios globulos rojos.
Esta fraccion se centrifugo (10 min a 1200 rpm, 40C) con bajo frenado. Se aspiro el sobrenadante y se resuspendio el sedimento en H2O destilada dos veces, esteril, helada (10 ml), y se anadio KCI 0,6 M (4 ml) 30 segundos mas tarde. Se diluyo la suspension celular con PBS esteril (hasta un volumen final de 50 ml) y entonces se centrifugo a 1500 rpm durante 5 min. Se aspiro el sobrenadante y volvio a suspenderse el sedimento en PBS (2,5 ml), y dos tubos del mismo donador se combinaron en uno.
Esta suspension celular se deposito cuidadosamente encima de 5 ml de Ficoll-paque™ premium (GE Healthcare Bio Science AB, Uppsala, Suecia) usando una pipeta Pasteur, y entonces se centrifugo (30 min a 1500 rpm con frenado bajo). Los neutrofilos aislados en el fondo de Ios tubos se resuspendieron en medio RPMI-1640 (Gibco, Paisley, Reino Unido) que contema FCS al 5% y se sembraron a una densidad de 4x105 celulas/pocillo en una placa de 96 pocillos. Las celulas se incubaron durante 30 min (37oC; CO2 al 5%) antes de iniciar el tratamiento.
Se incubaron previamente Ios neutrofilos con compuestos de prueba 0 con vetnculo de DMSO durante 1 h y entonces se estimularon con TNFa (10 ng/ml). Se recogio sobrenadante libre de celulas 3 h tras la estimulacion de TNFci, y se midio CXCL8 mediante ELISA usando el kit de desarrollo DuoSet ELISA (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). Se determinaron Ios valores de CI50 notificados a partir de curvas de concentracion-inhibicion usando XL-Fit (IDBS, Guildford, Reino Unido).
Ensayo de MTT
Se incubaron previamente celulas U937 diferenciadas con PMA con el compuesto de prueba (10 |ig/ml) 0 vetnculo durante 4 h en FCS al 5% 0 FCS al 10% durante 24 h. El sobrenadante se reemplazo con nuevo medio (200 |il) y se anadio disolucion madre de MTT (10 |il, 5 mg/ml) a cada pocillo. Tras 1 h de incubacion, se retiraron Ios medios, se anadieron 200 |il de DMSO a cada pocillo y las placas se agitaron ligeramente durante 1 h antes de leer la absorbancia a 550 nm. Se calculo el porcentaje de perdida de viabilidad celular para cada pocillo en relacion con el tratamiento con vetnculo (DMSO al 0,5%).
Examen in vivo: farmacodinamica y actividad antiinflamatoria
Acumulacion de neutrofilos en las v^as aereas inducida por LPS en ratones
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A ratones BALB/c no sometidos a ayuno (6-8 semanas de edad) se les dosifico vefuculo o compuesto de prueba mediante administracion intratraqueal (volumen de dosis 20 |il) en los puntos de tiempo T = -2 h, -8 ho -12 h con respecto al inicio de tratamiento con LPS. El LPS se preparo en una disolucion de 0,5 mg/ml y se aerosolizo usando un nebulizador ultrasonica 2000 De Vibliss (7 ml durante 30 min de exposicion). Ocho h tras la exposicion de LPS, se canulo la traquea y se extrajo fluido de lavado broncoalveolar (BALF) ex^do infundiendo y entonces retirando PBS (1 ml) en los pulmones a traves del cateter traqueal. Este procedimiento se repitio para dar un rendimiento de aproximadamente 2 ml de fluido de lavado. Se midio el numero de celulas totales en las muestras de BALF usando un hemocitometro. Se prepararon frotis de Cytospin de las muestras de BALF mediante centrifugacion a 1200 rpm durante 2 min a TA y se tineron usando un sistema de tincion DiffQuik (Dade Behring) para recuentos de celulas diferenciales. Se contaron las celulas usando microscopfa de inmersion en aceite. Los datos se expresan como numero de neutrofilos de celulas por ml de BALF (media ± E.E.M.).
Acumuladon de neutrofilos en las v^as respiratorias indudda por LPS en ratas
A ratas no sometidas a ayuno se les dosifico o bien el vefuculo o bien el compuesto de prueba mediante administracion intratraqueal (volumen de dosis 100 |il) en los puntos de tiempo T = -2 h, -8ho -12 h con respecto al inicio de tratamiento con LPS. La disolucion de LPS (0,3 mg/ml) se aerosolizo usando un nebulizador ultrasonico 2000 De Vibliss (7 ml durante 30 min). Ocho h tras la exposicion a LPS, se canulo la traquea y se extrajo fluido de lavado broncoalveolar (BALF) infundiendo y entonces retirando PBS (1 ml) en los pulmones a traves del cateter traqueal. Este procedimiento se repitio para proporcionar aproximadamente 2 ml de fluido de lavado.
Se midieron los numeros de celulas totales en las muestras de BALF usando un contador de celulas automatizadas Countess (Invitrogen). Se prepararon frotis de Cytospin de las muestras de BALF mediante centrifugacion a 1200 rpm durante 2 min a TA y se tineron usando un sistema de tincion DiffQuik (Dade Behring) para recuentos de celulas diferenciales. Se contaron las celulas usando microscopfa de inmersion en aceite. Los datos se expresan como numero de neutrofilos de celulas por ml de BALF (media ± E.E.M.).
Acumuladon de eosinofilos y neutrofilos en las v^as respiratorias indudda por ovoalbumina en ratones
Se inmunizaron ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) con OVA (10 pg/raton i.p.) los dfas 0 y 7. Con el fin de provocar una respuesta inflamatoria local en el pulmon, los ratones se expusieron repetidamente entre los dfas 1315 con una disolucion nebulizada de ovoalbumina (10 mg/ml, 30 min de exposicion, De Vilibiss Ultraneb 2000). El dfa 17 cada animal recibio una administracion por v^a intratraqueal o bien de vefuculo o bien de compuesto de prueba 2 h antes de la exposicion a OVA final. Se anestesiaron los animales 8 h mas tarde, antes de someterse a traqueotoirna. Se obtuvo BaL instilando PBS (1 ml) en los pulmones, que entonces se retiro. Este procedimiento se repitio para proporcionar aproximadamente 2 ml de fluido de lavado. Se midieron los numeros de celulas totales en las muestras de BALF usando un hemocitometro. Se prepararon frotis de Cytospin de las muestras de BALF mediante centrifugacion a 200 rpm durante 5 min a TA y se tineron usando un sistema de tincion DiffQuik (Dade Behring) para recuentos de celulas diferenciales. Se contaron las celulas usando microscopfa de inmersion en aceite. Los datos se expresan como numero diferencial de celulas por ml de fluido de lavado nasal (media ± E.E.M.).
Acumuladon de celulas indudda por poli-l:C en ratones
A ratones A/J libres de patogenos espedficos (machos, 5 semanas de edad) se les dosifico poli (l:C)-LMW (1 mg/ml, 40 |il) (InvivoGen, San Diego, CA, EE.UU.) por via intranasal dos veces al dfa durante 3 dfas bajo anestesia (isoflurano al 3%). Las sustancias de prueba se dosificaron por via intranasal (50 |il en DMSO al 10%/veldculo salino isotonico) 2 h antes de cada tratamiento con poli-l:C. 24 h tras la ultima exposicion a poli-l:C, se anestesiaron los animales, se canulo la traquea y se obtuvo lavado alveolar bronquial (BAL) instilando en y entonces retirando de los pulmones, solucion salina isotonica (100 ml/kg). Se midieron los numeros de celulas totales en las muestras de BALF usando un hemocitometro bajo un microscopio de contraste de fase.
Se determinaron las proporciones de macrofagos y neutrofilos alveolares mediante analisis de FACS usando anticuerpo anti-raton MOMA2-FITC (macrofago) o anticuerpo anti-raton 7/4-FITC (neutrofilo). Se suspendieron celulas en PBS y se incubaron con anticuerpo anti-MOMA2-FITC (2 |ig/ml, n.° de catalogo SM065F, Acris Antibodies GmbH, Herford, Alemania) ° anticuerpo anti-7/4-FITC (2 |ig/ml, n.° de catalogo CL050F, Acris Antibodies GmbH, Herford, Alemania) durante 30 min a 30oC, y entonces se contratineron con yoduro de propidio (2 |ig/ml) para permitir la exclusion de celulas necroticas. Las celulas se lavaron con PBS y se transfirieron a tubos de FACs. Se establecieron las muestras en un citometro de flujo (ALTRA II; Beckman Coulter Japan, Tokyo, Japon), y se dibujo un histograma de un unico parametro FL2 [PMT2] (FITC) con eje de las x logantmico para ilustrar la intensidad relativa de FITC. Se almacenaron los archivos de datos para un analisis posterior usando el software de analisis Kaluza (ver. 1.2) para calcular la proporcion de cada tipo de celula.
Modelo de humo de cigarrillos
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Se expusieron ratones A/J (machos, 5 semanas de edad) a humo de cigarrillos (humo de cigarrillos al 4%, diluido con aire comprimido) durante 30 min/dfa durante 11 d^as usando un sistema de experimento de inhalacion de humo de tabaco para animales pequenos (modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokyo, Japan). Se administraron las sustancias de prueba una vez al d^a durante 3 dfas tras la exposicion final al humo de cigarrillos (dosis intranasal que comprende 35 pl de disolucion en DMSO al 50%/solucion salina isotonica).
12 h tras la administracion de la ultima dosis, se anestesiaron los animales, se canulo la traquea y se llevo a cabo un lavado alveolar bronquial (BAL) mediante la instilacion en y entonces la retirada de los pulmones, de PBS (100 ml/kg). Se midieron los numeros de celulas totales en las muestras de BALF usando un hemocitometro bajo un microscopio de contraste de fase. Las proporciones de macrofagos y neutrofilos alveolares mediante analisis de FACS usando anticuerpo anti-raton MOMA2-FITC (macrofago) o anticuerpo anti-raton 7/4 (neutrofilo).
Se suspendieron las celulas en PBS y se incubaron con anticuerpo anti-MOMA2-FITC (2 pg/ml, n.° de catalogo SM065F, Acris Antibodies GmbH, Herford, Alemania) o anticuerpo anti-7/4-FITC (2 pg/ml, n.° de catalogo CL050F, Acris Antibodies GmbH, Herford, Alemania) durante 30 min a 30oC, y tambien se contratino con yoduro de propidio (2 pg/ml) para permitir la exclusion de celulas necroticas. Las celulas se lavaron con PBS, y se transfirieron a tubos de FACs. Se establecieron las muestras en un citometro de flujo (ALTRA II; Beckman Coulter Japan, Tokyo, Japon), y se dibujo un histograma de un unico parametro FL2 [PMT2] (fITC) con eje de la x logantmico para ilustrar la intensidad relativa de FITC.
Se almacenan los archivos de datos para un analisis posterior usando el software de analisis Kaluza (ver. 1.2) para calcular la proporcion de cada tipo de celula. Los niveles de CXCLI(KC), MCP1, TNFci, IL-17 u osteopontina en BALF se determinaron usando el kit de ELISA Quentikine® raton kC, MCP1, TNFci, IL-17 u osteopontina (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EE.UU.). La presencia de malondialdefudo se midio usando el kit de ensayo OxiSelect® TBARS (cuantificacion de MdA; Cell Biolabs Inc, San Diego, CA, EE.UU.).
Sumario de resultados de examen in vitro e in vivo
El perfil in vitro del compuesto de formula (I), tal como se determina usando los metodos descritos anteriormente se presenta a continuacion (tablas 5, 6 y 7). El compuesto de la presente invencion demuestra una inhibicion potente de ambas isoformas PI3K 6 y y, y no muestra actividad inhibidora frente a PI3K a y una actividad inhibidora baja de PI3K p frente a ensayos enzimaticos (tabla 5).
Estos efectos se traducen en una inhibicion potente de la fosforilacion de Akt inducida por la estimulacion de celulas o bien con hidrogeno peroxido o bien con mCP-1. No se detectaron efectos sobre la viabilidad celular, que resultante de la incubacion con el compuesto de formula (I) (Tabla 6). Ademas, se encontro que el tratamiento de celulas con el compuesto de formula (I) dado a conocer en el presente documento inhibfa la produccion de ROS a partir de celulas U937 y de citocinas a partir de PBMC expuestas a Cytostim (tabla 7).
Resulta destacable que el producto metabolico probable del compuesto de formula (I), que se corresponde concretamente con alcohol, el compuesto (la), es un inhibidor significativamente menos activo de las isoformas tanto PI3K 8 como y que el compuesto de formula (l) (tabla 6). Por consiguiente, el compuesto de formula (la), es un inhibidor significativamente menos activo de produccion ROS a partir de celulas U937 y de citocinas a partir de PBMC expuestas a Cytostim (tabla 7) que el compuesto de formula (l).
Tabla 5: Comparacion de las actividades inhibidoras de la isoforma PI3K de compuestos de la tecnica anterior con el compuesto (I).
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Compuestos de __________Valores de CI50 para la inhibicion de PI3K en la isozima indicada (nM)
prueba______________PI3Ka_____________PI3K P_____________PI3K 5______________PI3Ky
Compuesto (I)
>13900 4890 2,5 28
Compuesto A'
193 NT 12 25
Ejemplo 502 6 53 NT 5,7 120
1) Compuesto de la tecnica anterior dado a conocer en el documento WO 2012/052753; 2) Compuesto de la tecnica anterior dado a conocer en el documento WO 2011/048111; NT no sometido a prueba;
Tabla 6: La actividad inhibidora de los compuestos (I) y (Ia) sobre las isoformas de la enzima PI3K; la inhibicion de fosfilacion inducida de Akt en celulas y sobre la viabilidad celular.
Inhibicion de PI3-cinasa Actividad celular Viabilidad celular
Comp. de
Valor de CI50 en la isozima de estado (nM) Valores de REC50a en celulas d-U937 (nM) Ensayo de MTTb en celulas d-U937
prueba
5 Y a P Estfmulo de H2O2 Estfmulo de MCP-1 a 4 h a 24 h
(I)
2,5 28 >13900 4890 7,4 16,5 -ve -ve
(Ia)
17 577 >14200 >14200 ND ND -ve -ve
a) para la inhibicion de la fosforilacion de Akt inducida; b) -ve indica un valor de <30% de inhibicion a 10 pg/ml; ND: no realizado
Tabla 7: Los efectos de los compuestos de formula (I) y (Ia) sobre la produccion de ROS a partir de celulas U937 y la liberacion de citocina a partir de PBMC
_______________Valor de REC501 o de CI502 (nM)______________
Sistema celular
Compuesto (I)
Compuesto (Ia)
Produccion de ROSa inducida por Zymosan en celulas U937 cebadas con IFNy1
11,8 143
IL-4 inducida por Cytostim en PBMC2
<1,4 674
IL-5 inducida por Cytostim en PBMC2
<1,4 14,5
IL-13 inducida por Cytostim en PBMC2
<1,4 6,1
IFNy inducida por Cytostim en PBMC2
13,8 60,8
Quimiotaxis de celulas THP1
a MCP11 33,9 >14200
CXCL8 inducida por TNFa en neutrofilos de pacientes con cOpD1
2,2 ND
a) ROS: especies de oxfgeno reactivas.
Los efectos de tratamiento con el compuesto (I) sobre neutrofilia en las vfas respiratorias inducida por LPS en ratones y ratas se notifican en las tablas 8 y 9, respectivamente. Se encontro que el tratamiento produce una inhibicion dependiente de la dosis de la neutrofilia inducida por LPS en ambas especies. Ademas, se encontro que los efectos inhibidores del tratamiento sobre la acumulacion de celulas demuestran una larga duracion de accion.
Tabla 8: Los efectos del tratamiento con el compuesto (I) sobre la neutrofilia en las vfas respiratorias inducida por LPS en ratones. Numeros de neutrofilos en BALF (x105/ml, media ± EEM) en el momento previo a la Compuesto (I) (mg/ml) dosis indicado (% de inhibicion)
2 h 8 h 12 h
Vehnculo
17,1 ±2,5 - -
0,05
13,8±2,5 (19) - -
0,2
8,0±1,4 (53) 9,4±2,0 (45) 13,1 ±2,5 (23)
1,0
5,5±0,9 (68) - -
N = 8 animales por grupo
Tabla 9: Los efectos del tratamiento con el compuesto (I) sobre la neutrofilia en las vfas respiratorias inducida por LPS en ratas. Numeros de neutrofilos en BALF (x105/ml, media ± EEM) en el momento previo a la Compuesto (I) (mg/ml) dosis indicado (% de inhibicion)
2 h 8 h 12 h
Vehnculo
15,1 ±2,6 - -
0,05
13,2±2,3 (9) - -
0,2
6,3±1,6 (58) 10,1 ±1,8 (33) 13,6±2,7 (10)
1,0
4,1±0,7 (73) - -
N = 8 animales por grupo
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Los efectos del tratamiento con el compuesto (I) sobre la eosinofilia y neutrofllla en las vfas resplratorlas Inducldas por exposicion a alergenos en ratones se notifican en la tabla 10. Se encontro que el tratamiento de ratones con el compuesto dado a conocer en el presente documento produda una inhibicion dependiente de la dosis de la acumulacion tanto de eosinofilos como de neutrofilos en el lavado broncoalveolartras la exposicion a alergenos.
Tabla 10: Los efectos del tratamiento con el compuesto (I) sobre la eosinofilia y neutrofilia en las vfas respiratorias
inducida por ovoalbumina en ratones sensibilizados a la ovoalbumina.
„ Numeros de celulas en BALF (x104/ml, media ± EEM) y (% de inhibicion)
Compuesto (I) (mg/ml) -------------------=—^-rr.-------------11,1 \—
r ''' 3 ' Eosinofilos Neutrofilos
Vehroulo
24,7±3,1 9,8±0,6
0,05
19,7±3,2 (20) 8,0±0,4 (18)
0,2
3,8±0,9 (85) 2,9±0,5 (70)
1
2,1±0,4 (91) 2,0±0,3 (80)
N = 8 animales por grupo
Tambien se investigo el efecto de tratamiento con el compuesto (1) o con el compuesto A sobre la acumulacion de macrofagos y neutrofilos en BALF tras la exposicion de ratones a poli-l:C. En esta comparacion directa, se encontro que el tratamiento o bien con el compuesto (1) o bien con el compuesto A produda una inhibicion dependiente de la dosis de la acumulacion de macrofagos y neutrofilos inducida por poli-l:C en BALF (tabla 11). Es destacable que el compuesto (1) muestra una potencia significativamente mayor que el compuesto A y estos datos se representan graficamente para neutrofilos (figuras la y 1b).
Tabla 11: Los efectos del tratamiento con el compuesto (1) o el compuesto A sobre la acumulacion de celulas inducida por poli-l:C en las vfas aereas de ratones. Tratamiento y dosis del compuesto Numeros de celulas en BALFa (x104/ml) y (% de inhibicion)
(1) o del compuesto A (mg/ml)
Macrofagos Neutrofilos
Vehroulo
3,6±0,2 1,4±0,1
Vehroulo + poli l:C
19,0±0,5 11,6±0,2
Compuesto (1) (0,002) + poli l:C
11,5±0,2 (49) 7,3±0,3 (43)
Compuesto (1) (0,02) + poli l:C
8,3±0,3 (69) 5,0±0,2 (65)
Compuesto (1) (0,2) + poli l:C
6,8±0,3 (79) 3,8±0,2 (77)
Compuesto A (0,02) + poli l:C
14,3±0,3 (31) 8,9±0,2 (26)
Compuesto A (0,2) + poli l:C
11,0±0,4 (52) 7,3±0,3 (42)
Compuesto A (2) + poli l:C
7,8±0,2 (73) 4,8±0,2 (67)
a) Los datos para los numeros de celulas se muestran como la media ± EEM;
N = 5 animales por grupo
Tabla 12: El efecto del tratamiento con el compuesto (1) ± propionato de fluticasona sobre la acumulacion de celulas inducida por humo de cigarrillos (CS) en BALF murino. Tratamiento y dosis del compuesto Numeros de celulas en BALb (x104/ml) y (% de inhibicion)
(1) (mg/ml)
Macrofagos Neutrofilos
Aire + vehroulo
4,5±0,3 1,5±0,2
CS + vehroulo
17,9±0,6 11,1±0,5
CS + compuesto (1) (0,02)
13,6±0,2 (32) 8,6±0,2 (26)
CS + compuesto (1) (0,2)
9,5±0,2 (63) 6,0±0,1 (54)
CS + compuesto (1) (2)
7,4±0,3 (79) 4,6±0,1 (68)
CS + compuesto (1) (0,02) + FPa
13,6±0,4 (32) 8,7±0,2 (26)
CS + compuesto (1) (0,2) + FPa
9,4±0,3 (63) 5,8±0,3 (55)
CS + compuesto (1) (2) + FPa
7,0±0,3 (81) 4,3±0,2 (71)
25 N = 5 animales por grupo; a) FP = propionato de fluticasona dosificado a 50 |jg/ml; b) Los datos para los numeros de celulas se muestran como la media ± EeM,
Se determinaron los efectos del tratamiento con el compuesto (I) sobre la acumulacion de macrofagos y neutrofilos en BALF tras la exposicion al humo de cigarrillos (tabla 12). Se notifico que el modelo de humo de cigarrillos usado 30 para este estudio era un sistema que no respondfa al tratamiento con corticosteroides [To, Y. et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2010, 182:897-904; Medicherla, S. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008, 324:921-9] y los datos revelan que la dexametasona (0,3-10 mg/kg, p.o.) era, tal como se anticipo, inactiva. Los efectos del tratamiento con el compuesto (I) sobre los neutrofilos de BALF y sobre los numeros de macrofagos alveolares activados demuestran que presenta actividad antiinflamatoria cuando se administra como monoterapia. Ademas, cuando el compuesto (I) 35 se administro conjuntamente con propionato de fluticasona, a una dosis que carece de ningun efecto significativo como monoterapia, se detecto un aumento marcado de la actividad antiinflamatoria. En un estudio contemporaneo se evaluaron los efectos del tratamiento, con el compuesto A, de ratones expuesto a humo de cigarrillos. Una comparacion de estos datos con los presentados anteriormente para el compuesto (I) demuestra que el compuesto
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(I) es un inhibidor mas potente de la acumulacion de celulas inducida por el humo de clgarrlllos en BALF murlno que el compuesto A (figuras 2a y 2b).
La exposicion al humo de tabaco tambien aumento las concentraciones de los biomarcadores inflamatorios CXCL1, MCP1, TNFa, IL17, osteopontina y malondialdetndo en el fluido de lavado broncoalveolar. El tratamiento con el compuesto (I) redujo las concentraciones de cada uno de los biomarcadores de una manera dependiente de la dosis. Ademas, el tratamiento tanto con compuesto (I) como con propionato de fluticasona en combinacion mostro disminuciones mayores en las concentraciones de biomarcadores que lo que se eonsegma con el tratamiento con el compuesto (I) solo (tabla 13).
Tabla 13: El efecto del tratamiento con el compuesto (I) ± propionato de fluticasona sobre biomarcadores en BALF murino.
Concentracion de ________________________Inhibicion1 (%)_______________________
biomarcador en BALF
Biomarcador frente al tratamiento Compuesto (I) (mg/ml) Compuesto (I) (mg/ml) + FP2
_________(pg/m|)___________________________________________________________________

________________Aire_______Tabaco 0,02_______0,2________2_______0,002 0,02______0,2

CXCL1_______8,4±0,1______18±0,3______32_______52________71________32________58_______77

MCP-1_______2,3±0,2 7,2±0,1______28_______45________78________28________53_______73

TNF a_______1,5±0,04 3,6±0,1______22_______38________62________22________39_______64

IL-17________1,2±0,1 2,7±0,1______27_______41________60________26________51_______67

Osteopontina 11±0,3 23±0,4 22_______44________63________21________45_______62

MdA 0,3±0,023 1,6±0,043 25 42 64 29 43 64
N = 5 animales por grupo; 1) Inhibicion en porcentaje con respecto al tabaco, 2): propionato de fluticasona (0,5 mg/ml); 3) Estos datos son son valores en |iM; son valores de control de humo tras haber restado el control de aire
En resumen, el compuesto de la invencion es un inhibidor potente de las isoformas de PI3K tanto 6 como y. El perfil in vitro se traduce en un fenotipo antiinflamatorio ancho in vivo. En este entorno, los efectos inhibidores del compuesto dado a conocer en el presente documento frente a la acumulacion de celulas inducida por poli I:C en las v^as respiratorias son notables. Tambien es particularmente sorprendente que, a diferencia de los inhibidores selectivos de PI3K 6, el tratamiento con el compuesto (I) dado a conocer en el presente documento solo da como resultado una inhibicion marcada de inflamaeion en las vfas respiratorias inducida por el humo de cigarrillos y que estos efectos se producen a dosis menores cuando se administra conjuntamente con un corticosteroide, propionato de fluticasona, en condiciones en las que el tratamiento con el corticosteroide solo no tiene efecto.
Eiemplo 15 - Formulaciones farmaeeutieas que comprenden el compuesto (I)
Una composicion del compuesto (I) puede formularse para un inhalador de polvo seco tal como sigue:
El compuesto (I) se microniza mediante un metodo adecuado tal como un molino de chorro de aire para dar un valor de D50 de aproximadamente 2 |im y entonces se formula en una combinacion con 0 sin estearato de magnesio. La combinacion se carga en contenedores de dosis unitaria (por ejemplo, capsulas, blfsteres) para la inhalacion por medio de un inhalador de polvo seco. Se facilitan ejemplos de formulaciones que contienen entre el 0 y el 1% de estearato de magnesio, con un peso de carga de ejemplo de 25 mg por dosis y con una concentracion de la dosis que oscila entre 1 y 1000 microgramos (meg) por dosis. Tambien pueden usarse diferentes concentraciones, diferentes eantidades de estearato de magnesio y diferente pesos de carga por dosis.
Tabla 14: Formulaciones que contienen el 0% de estearato de magnesio
____________________________________________________% p/p
Concentracion del material/produeto meg por dosis
1 5 25 100 250 1000
Compuesto de formula (I)
0,004 0,02 0,1 0,4 1 4
Laetosa para inhalacion
99,996 99,98 99,9 99,6 99,0 96,0
Tabla 15: Formulaciones que contienen el 0,5% de estearato de magnesio
% p/p
Concentracion del material/producto en meg por dosis
1 5 25 100 250 1000
Compuesto de formula (1)
0,004 0,02 0,1 0,4 1 4
Estearato de magnesio
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Lactosa para inhalaeion
99,496 99,48 99,4 99,1 98,5 95,5
Tabla 16: Formulaciones que contienen el 1% de estearato de magnesio
____________________________________________________% p/p
Concentracion
del material/producto meg por dosis
1 5 25 100 250 1000
Compuesto de formula (1)
0,004 0,02 0,1 0,4 1 4
Estearato de
1 1 1 1 1 1
magnesio
Lactosa para inhalaeion
98,996 98,98 98,9 98,6 98,0 95,0
5 A lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entendera que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implica la inclusion de un numero entero, etapa, grupo de numero enteros o grupo de etapas especificados, pero no a la exclusion de cualquier otro numero entero, etapa, grupo de numero enteros o grupo de etapas.
10

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    reivindicaciones
    1.- Un compuesto de formula (I)
    imagen1
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, incluyendo todos los estereoisomeros, tautomeros y derivados isotopicos del mismo.
  2. 2. - Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1, como base libre en forma de su polimorfo cristalino de forma 2 que tiene un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 5.
  3. 3. - Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1, como base libre en forma de su polimorfo cristalino de forma 3 que tiene un patron de XRPD sustancialmente tal como se muestra en la Figura 12.
  4. 4. - Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en combinacion con uno o mas diluyentes o portadores farmaceuticamente aceptables.
  5. 5. - Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4, que comprende ademas un segundo principio activo o uno adicional seleccionado por ejemplo de corticosteroides, beta-agonistas, xantinas, antagonistas muscarmicos e inhibidores de p38 MAP cinasa.
  6. 6. - Un producto de combinacion que comprende:
    (A) un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
    (B) un principio activo adicional seleccionado por ejemplo de corticosteroides, beta-agonistas, xantinas, antagonistas muscarmicos, inhibidores de fosfodiesterasas e inhibidores de p38 MAP cinasa.
    en el que cada uno de los componentes (A) y (B) se formula en una mezcla con un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
  7. 7. - Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 4 o un producto de combinacion segun la reivindicacion 6, en el que el diluyente o portador farmaceuticamente aceptable es lactosa.
  8. 8. - Un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como medicamento.
  9. 9. - Un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso como medicamento que debe administrarse en combinacion con uno o mas principios activos adicionales seleccionados por ejemplo de corticosteroides, beta-agonistas, xantinas, antagonistas muscarmicos e inhibidores de p38 MAP cinasa.
  10. 10. - Un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composicion farmaceutica segun una cualquiera de las reivindicaciones 4, 5 o 7 o un producto de combinacion segun la reivindicacion 6 para su uso en el tratamiento o la prevencion de un estado seleccionado de:
    COPD (incluyendo bronquitis cronica y enfisema), asma, asma pediatrica, fibrosis qmstica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopatica, rinitis alergica, rinitis, sinusitis, y agravamientos inducidos por virus de una cualquiera de las mismas, infeccion respiratoria vmca (incluyendo las complicaciones de la misma), conjuntivitis alergica, conJuntivitis, dermatitis alergica, dermatitis por contacto, psoriasis, colitis ulcerosa, articulaciones inflamadas derivadas de la artritis reumatoide u osteoartritis, artritis reumatoide, pancreatitis, caquexia, inhibicion del crecimiento y metastasis
    5
    10
    15
    20
    25
    de tumores incluyendo carcinoma pulmonar de celulas no pequenas, carcinoma de mama, carcinoma gastrico, carcinomas colorrectales y melanoma maligno.
  11. 11.- Un compuesto de formula (II):
    imagen2
    en el que LGi representa halogeno o un derivado protegido del mismo, en el que el grupo protector es un grupo sililo.
  12. 12.- Un proceso para preparar un compuesto de formula (I) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende
    hacer reaccionar un compuesto de formula (II)
    imagen3
    o un derivado protegido del mismo,
    en el que LGi representa halogeno, con un fragmento:
    imagen4
    en condiciones apropiadas para proporcionar el compuesto de formula (I) o un derivado protegido del mismo, en el que el grupo protector es un grupo sililo y, si es necesario, desproteger el compuesto protegido para dar un compuesto de formula (I).
  13. 13.- Un compuesto de formula (la)
    imagen5
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mlsmo, Incluyendo todos Ios estereoisomeros, tautomeros y derlvados isotopicos del mismo.
    5
  14. 14. - Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 1 como base libre en forma de su polimorfo cristalino de forma 2 que tiene un patron de XRPD que contiene tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciseis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o Ios veintiun picos seleccionados de 8,2, 9,0, 9,2, 9,7, 12,2, 14,1, 14,3, 15,0, 16,4, 18,0, 18,5, 19,0, 19,6, 21,8, 22,3, 22,5, 24,3, 24,5, 24,8, 25,1 y 25,8 (± 0,2
    10 grados, valores 2-theta).
  15. 15. - Un compuesto de formula (I) segun la reivindicacion 14, que tiene un patron de XRPD que contiene uno, dos, tres o cuatro picos seleccionados de 9,7, 12,2, 14,1 y 14,3 (± 0,2 grados, valores 2-theta).
    15
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