ES2642096T3

ES2642096T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedad celíaca

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Publication number: ES2642096T3
Application number: ES15168279.6T
Authority: ES
Inventors: Robert Paul Anderson; Jessica Anne Stewart; James Anthony Dromey; Jason Allan Tye-Din
Original assignee: Immusant Inc
Current assignee: Immusant Inc
Priority date: 2008-11-30
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2029-11-30
Also published as: CN102438643A; AU2009321481B2; NZ593474A; EP2977053A1; HK1162918A1; CA2744787C; CA2744787A1; US20190048047A1; HK1249446A1; EP2367561B1; WO2010060155A1; CN105079781A; CA3042826A1; PT2367561E; DK2977053T3; JP5851243B2; US8835603B2; JP6027215B2; CN105079781B; EP2977053B1

Description

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D-N-metilhistidina Dnmhis D-N-metilisoleucina Dnmile D-N-metilleucina Dnmleu D-N-metillisina Dnmlys D-N-metilmetionina Dnmmet D-N-metilornitina Dnmorn D-N-metilfenilalanina Dnmphe D-N-metilprolina Dnmpro D-N-metilserina Dnmser D-N-metiltreonina Dnmthr D-N-metiltriptófano Dnmtrp D-N-metiltirosina Dnmtyr D-N-metilvalina Dnmval L-t-butilglicina Tbug L-etilglicina Etg L-homofenilalanina Hphe L-metiletilglicina Metg L-norleucina Nle L-norvalina Nva L--metilalanina Mala L--metilarginina Marg L--metilasparagina Masn L--metilaspartato Masp L--metil-t-butiglicina Mtbug L--metilcisteína Mcys L--metilglutamato Mglu L--metilglutamina Mgln L--metilhistidina Mhis L--metilhomofenilalanina Mhphe L--metilisoleucina Mile L--metilleucina Mleu L--metillisina Mlys L--metilmetionina Mmet L--metilnorleucina Mnle L--metilnorvalina Mnva L--metilornitina Morn L--metilfenilalanina Mphe L--metilprolina Mpro L--metilserina Mser L--metiltreonina Mthr L--metiltriptófano Mtrp L--metiltirosina Mtyr L--metilvalina Mval L-N-metilalanina Nmala L-N-metilarginina Nmarg L-N-metilasparagina Nmasn L-N-ácido metilaspártico Nmasp L-N-metilcisteína Nmcys L-N-metilglutamina Nmgln L-N-ácido metilglutámico Nmglu L-N-metilhistidina Nmhis L-N-metilisoleucina Nmile L-N-metilleucina mleu L-N-metillisina Nmlys L-N-metilmetionina Nmmet L-N-metilnorleucina Nmnle L-N-metilnorvalina Nmnva L-N-metilornitina Nmorn L-N-metilfenilalanina Nmphe L-N-metilprolina Nmpro L-N-metilserina Nmser L-N-metiltreonina Nmthr L-N-metiltriptófano Nmtrp L-N-metiltirosina Nmtyr

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L-N-metilvalina Nmval L-N-metiletilglicina Nmetg L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe L-O-metilserina Omser L-O-metilhomoserina Omhser N-(4-aminobutil)glicina Nglu N-(2-aminoetil)glicina Naeg N-(3-aminopropil)glicina Norn N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe N-(3-guanidinopropil)glicina Narg N-(1-hidroxietil)glicina Nthr N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp N-(2-carbamiletil)glicina Ngln N-(2-carboxietil)glicina Nglu N-(1-metilpropil)glicina Nile N-(2-metilpropil)glicina Nleu N-(1-metiletil)glicina Nval N-(2-metiltioetil)glicina Nmet N-amino--metilbutirato Nmaabu N-bencilglicina Nphe N-(carbamilmetil)glicina Nasn N-(carboximetil)glicina Nasp N-ciclobutilglicina Ncbut N-cicloheptilglicina Nchep N-ciclohexilglicina Nchex N-cicIodecilglicina Ncdec N-cilcododecilglicina Ncdod N-ciclooctilglicina Ncoct N-ciclopropilglicina Ncpro N-cicloundecilglicina Ncund N-(hidroxietil)glicina Nser N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr N-(imidazoliletil)glicina Nhis N-metil--aminobutirato Nmgabu N-metilaminoisobutirato Nmaib N-metilciclohexilalanina Nmchexa N-metilciclopentilalanina Nmcpen N-metilglicina Nala N-metil--naftilalanina Nmanap N-metilpenicilamina Nmpen N-(tiometil)glicina Ncys penicilamina Pen N-(N-(3,3-difenilpropil)carbamilmetil)glicina Nnbhe N-(N-(2,2-difeniletil)carbamilmetil)glicina Nnbhm 1-carboxi-1-(2,2-difeniletilamino)ciclopropano Nmbc

Se incluyen dentro del alcance de la presente invención un agente que comprende un péptido que se modifica durante o después de la traducción o síntesis (por ejemplo, por farnesilación, prenilación, miristoilación, glucosilación, palmitoilación, acetilación, fosforilación (tal como fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina), amidación,

5 derivatización por grupos de bloqueo/protección conocidos, escisión proteolítica, enlace con una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, y similares). Puede utilizarse cualquiera de los numerosos métodos de modificación química conocidos dentro de la técnica incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimiotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.

10 Las expresiones “grupo protector” y “grupo de bloqueo” como se usa en el presente documento, se refieren a modificaciones del péptido que lo protegen de reacciones químicas indeseables, particularmente in vivo. Los ejemplos de dichos grupos protectores incluyen ésteres de ácidos carboxílicos y ácidos borónicos, éteres de alcoholes y acetales, y cetales de aldehídos y cetonas. Los ejemplos de grupos adecuados incluyen grupos

15 protectores de acilo tales como, por ejemplo, furoílo, formilo, adipilo, celaílo, suberilo, dansilo, acetilo, tehílo, benzoílo, trifluoroacetilo, succinilo y metoxisuccinilo; grupos protectores de uretano aromático tales como, por ejemplo, benciloxicarbonilo (Cbz), grupos protectores de uretano alifático tales como, por ejemplo, t-butoxicarbonilo (Boc) o 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC); piroglutamato y amidación. Los expertos en la materia conocerán

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En ciertas realizaciones, uno cualquiera o más de los péptidos pueden incluir un grupo funcional, por ejemplo, en lugar del enlace peptídico escindible, que facilita la inhibición de una proteasa de tipo serina, cisteína o aspartato, según sea apropiado. Por ejemplo, la invención incluye una peptidil dicetona o un peptidil ceto éster, una péptido haloalquilcetona, un péptido sulfonil fluoruro, un peptidil boronato, un péptido epóxido, un peptidil diazometano, un

5 peptidil fosfonato, isocoumarinas, benzoxacin-4-onas, carbamatos, isocianatos, anhídridos isatoicos o similares. Dichos grupos funcionales se han proporcionado en otras moléculas peptídicas, y se conocen rutas generales para su síntesis.

Una variante puede ser un mimético. Se entiende que el término “mimético” se refiere a una sustancia que tiene alguna similitud química con la molécula que imita y conserva una actividad particular de interés (por ejemplo, que induce tolerancia). El fundamento subyacente detrás del uso de miméticos peptídicos, es que la cadena principal peptídica de proteínas existe principalmente para orientar cadenas laterales de aminoácidos de tal manera que faciliten las interacciones moleculares, tales como las de linfocitos T y péptidos MHC, anticuerpo y antígeno, enzima y sustrato o proteínas de armazón. Un mimético peptídico se diseña para permitir interacciones moleculares

15 similares a la molécula natural. Los miméticos incluyen olefinas, fosfonatos, análogos de aza-aminoácidos y similares. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente métodos para diseñar miméticos de péptidos y podrán utilizarlos para diseñar miméticos de los péptidos definidos en el presente documento.

Los péptidos pueden analizarse por análisis de hidrofilia, que puede usarse para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas del péptido, ayudando de este modo al diseño de péptidos para manipulación experimental, tal como en experimentos de unión, síntesis de anticuerpos, etc. También puede realizarse análisis estructural secundario para identificar regiones de un péptido que adopten motivos estructurales específicos. Puede conseguirse manipulación, traducción, predicción de estructura secundaria, perfiles de hidrofilia e hidrofobicidad, predicción de fase abierta de lectura y representación, y determinación de homologías de secuencia, usando programas de software informático

25 disponibles en la técnica. También pueden usarse otros métodos de análisis estructural incluyendo, pero sin limitación, cristalografía de rayos X, espectrometría de masas y cromatografía de gases, modelación informática, dispersión rotatoria óptica (ORD) o dicroísmo circular (CD).

Los péptidos, fragmentos o variantes pueden estar en una forma de sal, preferentemente, una forma de sal farmacéuticamente aceptable. “Una forma de sal farmacéuticamente aceptable” incluye las sales no tóxicas convencionales o sales de amonio cuaternario de un péptido, por ejemplo, de ácido orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Las sales no tóxicas convencionales incluyen, por ejemplo, las derivadas de ácidos inorgánicos tales como clorhidrato, bromhídrico, sulfúrico, sulfónico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas a partir de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico,

35 palmítico, maleico, hidromaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano disulfónico, oxálico, isotiónico y similares.

Los péptidos pueden proporcionarse en el agente o vacuna como péptidos separados o unidos, por ejemplo, en una estructura poliepitópica. En una realización, los péptidos pueden presentarse en una única cadena polipeptídica (serie poliepitópica), es decir, en una disposición lineal o circular. En otra realización, los péptidos pueden presentarse en un sistema de presentación de antígenos múltiple, particularmente basándose en una cadena principal de dendrímero tal como polilisina. Una cadena principal de polilisina proporciona una disposición no lineal, ramificado, de epítopos. Este sistema proporciona la ventaja sobre una serie poliepitópica de que los péptidos no interfieren entre sí o son lábiles a la escisión en epítopos crípticos y por lo tanto son capaces de inducir una

45 respuesta de linfocitos T completa.

Conjugados

Uno o más de los péptidos pueden conjugarse con un compuesto usando métodos convencionales. Los ejemplos de compuestos con los que pueden conjugarse los péptidos incluyen pero sin limitación un radioisótopo, un marcador fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un marcador enzimático, un radical libre, un marcador de avidinabiotina, un marcador de bacteriófagos, un compuesto que aumenta la semivida del péptido en un sujeto, un adyuvante, una molécula del MHC o fragmento de la misma.

55 El compuesto puede facilitar la detección y/o el aislamiento o aumentar la inmunogenicidad del péptido conjugado.

“Conjugado” como se usa en el presente documento significa acoplado mediante enlaces covalentes o no covalentes. Aunque se prefieren enlaces covalentes, el compuesto también puede unirse con el péptido mediante formación de complejos sin enlace covalente, por ejemplo, mediante enlaces de hidrógeno o interacción electrostática, hidrófoba, etc.

Los isótopos radiactivos típicos incluyen 3H, 125I, 1311, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 58Co, 59Fe, 75Se y 152Eu.

Los marcadores fluorescentes típicos incluyen fluoresceín isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, 65 aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

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Los compuestos quimioluminiscentes típicos incluyen luminol, isoluminol, ésteres de acridinio aromáticos, imidazoles, sales de acridinio y los ésteres de oxalato. Los compuestos bioluminiscentes típicos incluyen luciferina, luciferasa y aecuorina.

5 Los marcadores enzimáticos típicos incluyen fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, maleato deshidrogenasa, glucosa oxidasa y peroxidasa.

En una realización, se incluye un enlazador no específico entre el compuesto y el péptido con el que se conjuga. Dicho enlazador no está implicado en la actividad peptídica. En su lugar el enlazador puede actuar como un 10 espaciador entre el péptido y un resto funcional. Los usos para un enlazador incluyen inmovilización del péptido, tal como para ayudar a la purificación o detección. Como alternativa, un enlazador puede permitir la unión de un compuesto con el péptido que permite el suministro específico del péptido con una diana particular, tal como una célula o un tejido, espacial o temporalmente. Cuando se usan como una vacuna, uno o más de los péptidos pueden acoplarse con un enlazador que actúa como un espaciador entre el péptido y un vehículo inmunógeno, o permite el

15 acoplamiento mejorado entre el péptido y el vehículo inmunógeno y evita la formación de epítopos crípticos.

En una realización, uno o más de los péptidos se acoplan covalentemente con un adyuvante (proteína vehículo inmunógena), tal como toxoide diftérico (DT), hemocianina de lapa californiana (KLH), toxoide del tétanos (TT) o la proteína nuclear del virus de la gripe (NP), para aumentar su inmunogenicidad, usando cualquiera de varias

20 químicas de conjugación conocidas en la técnica. Puede estar presente un enlazador no específico entre el péptido y el vehículo inmunógeno y se une preferentemente con el péptido o se sintetiza conjuntamente para facilitar el acoplamiento con el vehículo inmunógeno y/o para actuar como un espaciador entre el péptido y el vehículo inmunógeno.

25 Cuando se usa como un agente de diagnóstico, se conjugan preferentemente uno o más de los péptidos con un vehículo inmunógeno que no se ha usado previamente para vacunación. Cuando se controla el éxito de la vacunación, esto evita que el agente de diagnóstico reaccione con anticuerpos que se han formado contra la fracción de vehículo de la vacuna.

30 En una realización, el compuesto es una molécula del MHC de clase II o fragmento de unión a péptidos de la misma. La molécula del MHC de clase II puede purificarse a partir de una muestra biológica. Como alternativa, la molécula del MHC de clase II puede producirse de forma recombinante. Puede obtenerse un fragmento de unión a péptidos de la molécula del MHC de clase II, por ejemplo, mediante escisión enzimática de la molécula intacta purificada o recombinante. Como alternativa, el fragmento de unión a péptidos puede producirse de forma recombinante. En una

35 realización preferida, el compuesto es una molécula del MHC de clase II de dos dominios recombinante.

En su forma más básica, la molécula del MHC de clase II de dos dominios comprende el dominio 1 y 1 de una molécula de MHC de clase II de mamíferos en la que el extremo amino terminal del dominio 1 está unido covalentemente con el extremo carboxilo terminal del dominio 1 y en el que el polipéptido no incluye los dominios 40 2 o 2. La molécula del MHC de clase II de dos dominios se asocia por interacción covalente o no covalente con un péptido definido en el presente documento. En ciertas realizaciones, el péptido se une covalentemente con el extremo amino terminal del dominio 1 de la molécula de clase II. La molécula del MHC de clase II de dos dominios también puede comprender un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente, o una toxina. Cuando el marcador detectable o toxina va a unirse covalentemente con la molécula del MHC de una manera dirigida (es decir,

45 en lugar de unirse aleatoriamente) se unirá generalmente con un extremo carboxilo terminal de la molécula para minimizar la interferencia con el antígeno peptídico unido en el extremo amino terminal.

In vitro, la molécula del MHC de clase II de dos dominios puede usarse para detectar y cuantificar linfocitos T y regular la función de linfocitos T. Por lo tanto, dichas moléculas cargadas con un péptido seleccionado pueden 50 usares para detectar, controla y cuantificar la población de linfocitos T que son específicos para ese péptido. El conjugado de péptido/molécula del MHC de clase II de dos dominios también puede usarse para inducir anergia de linfocitos T específicos de gluten, aliviando síntomas asociados con la enfermedad celíaca. Como alternativa, dichas moléculas pueden conjugarse con una toxina para destruir más directamente los linfocitos T causantes de la enfermedad. Las toxinas adecuadas incluyen toxinas proteicas (por ejemplo, ricina, toxina diftérica y toxina de

55 Pseudomonas), agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, metotrexato, citotoxina y ARN antisentido), anticuerpos para una molécula de superficie de linfocitos T citotóxica, lipasas, y radioisótopos que emiten radiación “dura”, por ejemplo, beta.

Diseño de molécula del MHC de clase II 11 recombinante

60 Las secuencias de aminoácidos de proteínas de cadena  y  del MHC de clase II de mamífero, así como ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, se conocen bien en la técnica y están disponibles de numerosas fuentes incluyendo GenBank.

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Como alternativa, o además, la “variante biológicamente activa” puede hibridar con la secuencia de nucleótidos codificante del péptido de referencia (o una forma complementaria de la misma) en condiciones de baja rigurosidad. La referencia en el presente documento a “baja rigurosidad” se refiere a formamida de al menos aproximadamente 0 a al menos aproximadamente 15% v/v y sal de al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M 5 para hibridación, y sal de al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M para condiciones de lavado. En general, la baja rigurosidad es de aproximadamente 25-30 ºC a aproximadamente 42 ºC. La temperatura pude alterarse y pueden usarse temperaturas mayores para reemplazar formamida y/o para proporcionar condiciones de rigurosidad alternativas. Las condiciones de rigurosidad alternativas pueden aplicarse cuando sea necesario, tales como rigurosidad media o alta. La referencia en el presente documento a “rigurosidad media” se refiere a formamida de al menos aproximadamente 16% v/v a al menos 30% v/v y sal de al menos aproximadamente 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9 M para hibridación, y sal de al menos aproximadamente 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9 M para condiciones de lavado. La referencia en el presente documento a “alta rigurosidad” se refiere a formamida de al menos aproximadamente 31% v/v a al menos aproximadamente 50% v/v y sal de al menos aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M para hibridación, y sal de al menos

15 aproximadamente 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M para condiciones de lavado.

En general, se lleva a cabo lavado a Tm = 69,3 + 0,41 (G+C) %. Sin embargo, la Tm de una molécula de ácido nucleico bicatenaria se reduce en 1 ºC con cada aumento del 1% en el número de pares de bases desapareadas. La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación.

Los niveles de rigurosidad particularmente preferidos se definen de la siguiente manera: la baja rigurosidad es tampón SSC 6x, SDS 0,1% p/v a 25-42 ºC; la rigurosidad moderada es tampón SSC 2x, SDS 0,1% p/v a 20-65 ºC; la alta rigurosidad es tampón SSC 0,1 X, SDS 0,1% p/v a al menos 65 ºC.

25 Las variantes biológicas incluyen polinucleótidos que varían en uno o más nucleótidos del polinucleótido de referencia. Por ejemplo, una variante puede comprender una sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural con un análogo (tal como el anillo de morfolina), nucleótido metilado, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos aoméricos, etc.).

Pueden proporcionarse en un vector polinucleótidos que codifican uno o más de los péptidos.

35 Un polinucleótido que codifica uno o más de los péptidos definidos en el presente documento puede usarse para la producción recombinante de los péptidos usando técnicas bien conocidas en este campo. Como alternativa, el polinucleótido puede usarse para inmunizar/hacer tolerante a un sujeto al gluten.

Un polinucleótido para su uso en la invención incluye una secuencia de ADN que puede derivarse de uno o más de los péptidos, teniendo en cuenta la degeneración del uso codónico. Esto se conoce bien en la técnica, así como el conocimiento del uso codónico en diferentes hospedadores de expresión, lo que es útil para optimizar la expresión recombinante de los péptidos.

Cuando el polinucleótido se usa para la producción recombinante de uno o más de los péptidos, el polinucleótido

45 puede incluir la secuencia codificante para los péptidos solamente o la secuencia codificante para los péptidos en fase de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre, pro o prepro proteína, secuencia de péptido enlazador u otras partes de péptidos de fusión. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación del péptido fusionado. En ciertas realizaciones, la secuencia marcadora es un péptido de hexahistidina, como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.), o es un marcador HA, o es glutatión-S-transferasa. El polinucleótido también puede contener secuencias 5’ y 3’ no codificantes, tales como secuencias transcritas, no traducidas, señales de corte y empalme y poliadenilación, sitios de unión a ribosomas y secuencias que estabilizan el ARNm.

Células presentadoras de antígenos

55 El agente y/o los péptidos definidos en el presente documento pueden suministrarse cargando APC con, por ejemplo, los primer, segundo y tercer péptidos, un fragmento biológicamente activo o variante de uno o más de los mismos y/o un polinucleótido que codifica uno o más de los mismos.

Preferentemente, las APC se seleccionan del grupo que consiste en células dendríticas, macrófagos, linfocitos B y células endoteliales sinusoides del hígado que expresan moléculas del MHC de clase II compartidas con el fenotipo del MHC del sujeto. Por ejemplo, las APC pueden expresar HLA-DQ2 (por ejemplo, HLA DQA1*05 y HLA DQB1*02) y/o HLA DQ8. Las APC empleadas para este fin pueden aislarse del sujeto al que van a suministrarse después de cargar, o pueden obtenerse de un sujeto alocoincidente.

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Uno o más de los péptidos pueden recuperarse y purificarse de cultivos celulares recombinantes (es decir, de las células o el medio de cultivo) por métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía

5 de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de lectinas y HPLC. Puede emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas para regenerar la conformación activa cuando el péptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o la purificación.

Para producir un péptido glucosilado, se prefiere usar técnicas recombinantes. Para producir un péptido glucosilado, se prefiere emplear células de mamífero tales como COS-7 y Hep-G2 en las técnicas recombinantes.

Los péptidos también pueden prepararse por escisión de péptidos más largos, especialmente de extractos de alimentos.

15 Pueden sintetizarse sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos a partir de los péptidos que contienen un resto básico o ácido por métodos químicos convencionales. Generalmente, las sales se preparan haciendo reaccionar la base o el ácido libre con cantidades estequiométricas o con un exceso del ácido o base orgánico o inorgánico formador de sales deseado en un disolvente adecuado.

Vacunas y administración

La invención también proporciona una vacuna que comprende los primer, segundo y tercer péptidos, un fragmento biológicamente activo o variante de uno o más de los mismos y/o un polinucleótido que codifica uno o más de los mismos. También se proporciona una vacuna que comprende un péptido de la invención y/o un polinucleótido de la

25 invención.

Como se usa en el presente documento, el término “vacuna” se refiere a una composición que comprende o que codifica péptidos que pueden administrarse a un sujeto sensible al gluten para modular la respuesta del sujeto al gluten. La vacuna puede reducir la reactividad inmunológica de un sujeto al gluten. Preferentemente, la vacuna induce tolerancia al gluten.

La administración de la vacuna a un sujeto puede inducir tolerancia por supresión clonal de poblaciones de linfocitos T efectores específicos del gluten, por ejemplo, linfocitos T CD4+ específicos del gluten, o mediante inactivación (anergia) de dichos linfocitos T de modo que se hagan menos sensibles, preferentemente, no sensibles a exposición

35 posterior al gluten (o péptidos de los mismos).

Como alternativa, o además, la administración de la vacuna puede modificar el perfil de secreción de citocinas del sujeto (por ejemplo, dar como resultado IL-4, IL-2, TNF y/o IFN reducidos y/o IL-10 aumentado). La vacuna puede inducir subpoblaciones de linfocitos T supresores, por ejemplo linfocitos Treg, para producir IL-10 y/o TGF y de este modo suprimir linfocitos T efectores específicos del gluten.

La vacuna de la invención puede usarse para tratamiento profiláctico de un sujeto capaz de desarrollar sensibilidad al gluten, por ejemplo, que se ha diagnosticado que porta el gen de HLA-DQ2 y/o HLA-DQ8 y/o tratamiento continuo de un sujeto que es sensible al gluten, por ejemplo, un sujeto que tiene enfermedad celíaca. Hay datos animales

45 considerables para apoyar la actividad profiláctica de péptidos inmunodominantes para diversas afecciones autoinmunitarias e inmunitarias modelo, por ejemplo, encefalitis alérgica experimental.

Como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” incluye anular, inhibir, ralentizar o invertir la progresión de una enfermedad o afección, o aliviar o prevenir un síntoma clínico de la enfermedad (por ejemplo, enfermedad celíaca) o afección.

La cantidad de vacuna (o agente, péptido, polinucleótido y/o APC) para administrar se denomina la “cantidad eficaz”. La expresión “cantidad eficaz” significa la cantidad suficiente para proporcionar el efecto terapéutico o fisiológico deseado cuando se administra en condiciones apropiadas o suficientes. Pueden administrarse dosis individuales o

55 múltiples. En ocasiones se manifiestan efectos indeseables, por ejemplo, efectos secundarios, junto con el efecto terapéutico deseado; por lo tanto, un practicante equilibra los beneficios potenciales contra los riesgos potenciales al determinar una “cantidad eficaz” apropiada. La cantidad exacta requerida variará entre sujetos, dependiendo de la especie, la edad, la talla y la condición general del sujeto, modo de administración y similares. Por lo tanto, puede que no sea posible especificar una “cantidad eficaz” exacta. Sin embargo, una “cantidad eficaz” en cualquier caso individual puede determinarse por un experto habitual en la materia usando solamente experimentación rutinaria.

La vacuna (o agente, péptido, polinucleótido y/o APC) modifica la respuesta de linfocitos T al trigo, la cebada y el centeno en el sujeto, y preferentemente al trigo, la cebada, el centeno y la avena, como se representa por las proteínas gliadina, secalina, hordeína, glutenina y opcionalmente avedina. Por lo tanto, un sujeto que se trata de 65 acuerdo con la invención preferentemente es capaz de comer al menos trigo, centeno, cebada y opcionalmente avena sin una respuesta de linfocitos T significativa que normalmente conduciría a síntomas de enfermedad celíaca.

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Tabla 4. Farmacocinética de péptidos estimulantes de linfocitos T derivatizados.

N y C terminales libres: N-Acetilo y C-amida N-piroGlu y C-amida

LQPFPQPELPYPQPQ (SEC ID Nº: 13) NPL033 T1/2 10,2 minutos AUC 2618: N-Acetilo-QLQPFPQPELPYPQPQ-amida (SEC ID Nº: 231) NPL030 T1/2 19,4 minutos AUC 43474 piroE-LQPFPQPELPYPQPQ-amida (SEC ID Nº: 228) NPL001 T1/2 28,20 minutos AUC 89350

PQQPFPQPEQPFPWQP (SEC ID Nº: 320) T1/2 13,2 minutos AUC 22393: N-Acetilo-QQPFPQPEQPFPWQP-amida (SEC ID Nº: 232) NPL031 T1/2 22,9 minutos AUC 80263 piroE-QPFPQPEQPFPWQP-amida (SEC ID Nº: 229) NPL002 T1/2 27,18 minutos AUC 81514

FPEQPIPEQPQPYPQQ (SEC ID Nº: 321) T1/2 12,5 minutos AUC 8206: N-Acetilo-FPEQPIPEQPQPYPQQ-amida (SEC ID Nº: 233) NPL032 T1/2 24,2 minutos AUC 79439 piroE-PEQPIPEQPQPYPQQ-amida (SEC ID Nº: 230) NPL003 T1/2 25,98 minutos AUC 51390

T1/2 semivida y AUC área bajo la curva (biodisponibilidad) después de inyección de embolada intradérmica 0,9 mg en 0,1 ml de solución salina de mezcla equimolar de NPL001+2+3, NPL033+38+34 o NPL030+31+32

5 Los hallazgos de los inventores apoyan la noción de que los péptidos que abarcan epítopos presentes en NPL001 (SEC ID Nº: 228), NPL002 (SEC ID Nº: 229) y NPL003 (SEC ID Nº: 230), son dominantes, no redundantes y contribuyen uniformemente con una proporción sustancial de la actividad estimulante de linfocitos T del gluten. Estos 3 péptidos o los epítopos dentro de ellos son por lo tanto probablemente críticos para el diseño de una vacuna

10 terapéutica basada en péptidos o en diagnósticos funcionales que pueden aplicarse uniformemente a enfermedad celíaca asociada con HLA-DQ2.

Estos hallazgos enfatizan que los enfoques in vitro que se basan en la expansión de linfocitos T específicos de antígeno poco comunes frecuentemente no se traducen necesariamente a epítopos relevantes in vivo después de 15 reactivación de enfermedad aguda. De hecho la mayoría de los péptidos estimulantes de linfocitos T dominantes no redundantes identificados en el presente estudio no se han descrito previamente en estudios funcionales que utilizan clones y líneas de linfocitos T. Ya que el mapeo de epítopos exhaustivo usando linfocitos T inducidos in vivo por el antígeno patógeno no se ha llevado a cabo previamente, este estudio proporciona el primer verdadero ensayo de un enfoque in vitro para mapear los epítopos relevantes para una enfermedad humana inmunitaria. La técnica anterior

20 no describe la manera en que los péptidos estimulantes de linfocitos T dominantes no redundantes se seleccionarían para inmunoterapia basada en péptidos para maximizar el número de linfocitos T diana en el mayor número de pacientes minimizando al mismo tiempo el número de péptidos para simplificar la formulación.

Sin embargo, es probable que péptidos adicionales aumenten la capacidad estimulante de linfocitos T y uniformidad

25 de las respuestas de linfocitos T donantes de esta mezcla después de exposición a trigo, cebada o centeno. Los péptidos de gluten con las mayores “puntuaciones” pero no reconocidos por clones de linfocitos T específicos para DQ2--I (SEC ID Nº: 3), DQ2--II (SEC ID Nº: 4), DQ2--I (SEC ID Nº: 10), DQ2--II (SEC ID Nº: 15), o DQ2-Hor-I (SEC ID Nº: 17) tienen más probabilidad de aumentar adicionalmente la capacidad estimulante de linfocitos T de la mezcla. El aumento de la proporción de linfocitos T específicos de gluten a los que se dirige uniformemente una

30 mezcla de péptidos probablemente mejore su utilidad terapéutica o de diagnóstico para enfermedad celíaca HLADQ2+8-, pero también puede complicar la formulación, comprometer la estabilidad química y aumentar la probabilidad de efectos adversos.

Por otro lado, NPL001 (SEC ID Nº: 228) podría sustituirse con un único péptido, por ejemplo, incluyendo la

35 secuencia LPYPQPELPYPQ (SEC ID Nº: 60; W01-E7) reconocido por clones de linfocitos T específicos para DQ2-I (SEC ID Nº: 3) y también clones de linfocitos T DQ2--II (SEC ID Nº: 4). Como alternativa, NPL001 (SEC ID Nº: 228) podría sustituir dos péptidos separados, uno reconocido por clones de linfocitos T específicos para DQ2--I (SEC ID Nº: 3), y el otro reconocido por clones de linfocitos T específicos para DQ2--II (SEC ID Nº: 4). El mismo

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Claims

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