ES2643554T3

ES2643554T3 - Proceso y sistema para obtener neurotoxina botulínica

Info

Publication number: ES2643554T3
Application number: ES10733117.5T
Authority: ES
Inventors: Jennifer L. Ton; Hemant A. Patel; Ronald C. Bates; Wajdie M. Ahmad
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2010-07-12
Publication date: 2017-11-23
Anticipated expiration: 2030-07-12
Also published as: CN106117325B; EP4299070A2; US11326155B2; US11530400B2; US20220228136A1; US20200071686A1; PT3252070T; US20220204958A1; US8129139B2; US20170327811A1; WO2011008713A1; US11518986B2; DK3252070T3; SI2454275T1; US20150184141A1; MX2012000615A; CY1122567T1; EP3252070B1; MX2020009978A; CN102482332B

Description

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reconstitución. El ingrediente activo puede ser uno de los serotipos de toxina botulínica A, B, C1, D, E, F o G o una toxina botulínica, todas las cuales pueden ser hechas nativamente por bacterias clostridiales. Como se ha indicado, una composición farmacéutica puede ser líquida o sólida, por ejemplo, secada al vacío. Los métodos ejemplares para formular una composición farmacéutica de ingrediente activo de toxina botulínica se describen en la publicación de patente publicada U.S. 20030118598, presentada el 5 de noviembre, 2002.

"Sustancialmente libre" significa presente a un nivel de menos de uno por ciento en peso de un medio de cultivo, medio de fermentación, composición farmacéutica u otro material en el que se evalúa el porcentaje en peso de una sustancia (tal como un producto animal, una proteína animal o un producto o proteína derivado de un animal).

"Formulación terapéutica" significa que una formulación puede usarse para tratar y, de este modo, aliviar un trastorno o una enfermedad y/o síntoma asociado de la misma, tal como un trastorno o una enfermedad caracterizada por hiperactividad (por ejemplo, espasticidad) de un músculo periférico o glándula (por ejemplo, glándula sudorípara).

"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa el nivel, cantidad o concentración de un agente (por ejemplo, tal como una toxina botulínica o una composición farmacéutica que comprende toxina botulínica) necesaria para tratar una enfermedad, trastorno o afección sin causar efectos secundarios negativos o adversos significativos.

"Tratar", "que trata" o "tratamiento" significa un alivio o una reducción (que incluye cierta reducción, una reducción significativa, una reducción casi total y una reducción total), resolución o prevención (temporal o permanente) de una enfermedad, trastorno o afección, tal como una deformidad de nalgas, para conseguir un resultado terapéutico o cosmético deseado, tal como mediante la cicatrización de tejido lesionado o dañado, o alterando, cambiando, aumentando, potenciando, mejorando y/o embelleciendo una enfermedad, trastorno o afección existente o percibidoa. Un efecto de tratamiento, tal como un efecto de alivio de la administración de una neurotoxina botulínica, puede no aparecer clínicamente durante entre 1 a 7 días después de la administración de la neurotoxina botulínica a un paciente por ejemplo y puede tener una duración de efecto de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 1 año o cualquier intervalo de tiempo entre ellos, por ejemplo, dependiendo de la afección y del caso particular que se esté tratando. Los porcentajes se basan en el peso por volumen a menos que se indique lo contrario.

APF significa libre de producto/proteína animal

CV significa volumen de la columna

DF significa diafiltración

ELISA significa ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima.

IAPF, como en el "sistema IAPF" o "proceso IAPF ", significa sistema o proceso "libre de proteína animal mejorado". Un sistema o proceso IAPF incluye el uso de dos medios de cromatografía o tres medios de cromatografía para purificar un componente de toxina botulínica o neurotoxina, como se detalla específicamente en la presente memoria. Los medios de cromatografía incluyen resinas de cromatografía, como se conoce en la técnica. Los lotes de neurotoxina botulínica obtenidos mediante el uso de dos medios de cromatografía se denominan en este documento como IAPF.

FAPF, como en el "sistema FAPF" o "proceso FAPF", significa sistema o proceso "libre de proteína animal mejorado adicionalmente". Por consiguiente, FAPF es un proceso IAPF, y un sistema o proceso FAPF significa que tres medios de cromatografía se utilizan para purificar una toxina botulínica o un componente de neurotoxina. Los lotes de neurotoxina botulínica obtenidos mediante el uso de tres medios de cromatografía se denominan en este documento FAPF.

NAPF significa libre de proteína no animal

SDS-PAGE significa electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico SEC-HPLC significa cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión de tamaño

UF significa ultrafiltración

Un aspecto de la invención es un proceso para producir un complejo de neurotoxina botulínica tipo A biológicamente activo que comprende las etapas secuenciales de:

(a): cultivar la bacteria Clostridium botulinum en un medio de cultivo que está completamente libre de productos derivados de animales o contiene productos derivados de animales en una cantidad inferior al 1% (p/v);

(b): fermentar bacterias Clostridium botulinum a partir del medio de cultivo en 1,8 a 82,5 L de un medio de fermentación que está completamente libre de productos derivados de animales o contiene productos derivados de animales en una cantidad inferior al 1% (p/v);

(c): recolectar el medio de fermentación eliminando los restos celulares;

(d): concentrar el medio de fermentación recolectado por filtración;

(e): diluir el medio de fermentación concentrado añadiéndole un tampón;

(f): realizar una primera etapa de contacto en la que el medio de fermentación recogido diluido se pone en

5 contacto con un medio de cromatografía de intercambio aniónico de manera que la neurotoxina botulínica biológicamente activa en el medio se captura por el medio de intercambio aniónico;

(g): eluir la neurotoxina botulínica capturada del medio de intercambio aniónico para obtener un primer eluato;

(h): realizar una segunda etapa de contacto en la que el primer eluato se pone en contacto con un medio de

10 cromatografía de intercambio catiónico para eliminar las impurezas del primer eluato, obteniendo de este modo un segundo eluato;

(i): realizar una tercera etapa de contacto en la que el segundo eluato se pone en contacto con un medio de cromatografía de interacción hidrofóbica y se eluye para obtener un tercer eluato;

(j): procesar el tercer eluato por diafiltración; y

15 (k) filtrar el tercer eluato procesado para obtener un producto que contiene complejos de neurotoxina botulínica de tipo A biológicamente activa que tiene una potencia de 1,8 x 107 a 6,6 × 107 unidades/mg;

en el que al menos uno del medio de cultivo y el medio de fermentación incluye una proteína vegetal y no se usa ninguna enzima derivada de un animal para purificar la neurotoxina botulínica; y en el que el proceso se lleva a cabo en una semana o menos.

20 En ejemplos concretos, se puede obtener un complejo de neurotoxina botulínica tipo A que tiene una potencia comprendida entre aproximadamente 2,4 x 107 unidades/mg a aproximadamente 5,9 x 107 unidades/mg, por ejemplo.

En una realización particular, el proceso utiliza un medio de fermentación que comprende no más de aproximadamente 5% p/v de un producto proteico derivado de vegetales, no más de aproximadamente 2% p/v de un 25 extracto de levadura y no más de aproximadamente 2% p/v de glucosa, y en el que el nivel de pH del medio de fermentación es de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 8,0, más preferiblemente de aproximadamente pH 6,8 a aproximadamente pH 7,6, al comienzo de la etapa de fermentación. En una realización particular, la etapa de cultivo se lleva a cabo hasta que la densidad óptica del medio de cultivo a aproximadamente 540 nanómetros (nm) está entre aproximadamente 0,8 unidades de absorbancia (UA) y aproximadamente 4,5 UA. La etapa de cultivo se 30 inicia preferiblemente introduciendo un contenido del banco de células de trabajo APF de Clostridium botulinum en el medio de cultivo, donde el contenido del banco de células de trabajo comprende al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias, preferiblemente de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 5 x 107 unidades formadoras de colonias de Clostridium botulinum por mililitro del banco de células de trabajo, y donde la bacteria Clostridium botulinum en el banco de células de trabajo tiene una morfología sustancialmente uniforme. En

35 todavía otra realización, la etapa de fermentación se lleva a cabo durante aproximadamente 60 a 80 horas y hasta que una densidad óptica del medio de fermentación a aproximadamente 890 nm disminuye a entre aproximadamente 0,05 UA a aproximadamente 0,7 UA. En un aspecto, la neurotoxina botulínica obtenida mediante un proceso cromatográfico sustancialmente APF comprende menos de 1 ppm de ácido nucleico residual y el proceso se lleva a cabo en una semana o menos.

40 Otro aspecto de la invención es un sistema para producir una neurotoxina botulínica biológicamente activa que comprende:

un primer aparato para el cultivo anaerobio de bacterias de Clostridium botulinum, siendo el primer aparato capaz de contener de 180 mL a 1,1 L de un medio de cultivo que está completamente libre de productos derivados de animales o contiene productos derivados de animales en una cantidad inferior al 1% (p/v);

45 un segundo aparato para la fermentación anaeróbica de bacterias de Clostridium botulinum que ha sido cultivado en el primer aparato, siendo el segundo aparato capaz de contener de 1,8 a 82,5 L de un medio de fermentación que está completamente libre de productos derivados de animales o contiene productos derivados de animales en una cantidad inferior al 1% (p/v), y comprendiendo el segundo aparato al menos una sonda desechable seleccionada entre una sonda de reducción-oxidación, una sonda de pH y una

50 sonda de turbidez;

un tercer aparato para recoger el medio de fermentación;

un cuarto aparato para concentrar el medio de fermentación recogido por filtración y dilución del medio de fermentación filtrado;

un quinto aparato para llevar a cabo una primera purificación de neurotoxina botulínica obtenida del medio de fermentación recogido, comprendiendo el quinto aparato un medio de cromatografía de intercambio aniónico capaz de capturar neurotoxina botulínica;

un sexto aparato para llevar a cabo una segunda purificación de neurotoxina botulínica eluida del medio de 5 cromatografía de intercambio aniónico, comprendiendo el sexto aparato un medio de cromatografía de intercambio catiónico;

un séptimo aparato para llevar a cabo una tercera purificación de neurotoxina botulínica eluida del medio de cromatografía de intercambio catiónico, comprendiendo el séptimo aparato un medio de cromatografía de interacción hidrófoba; y

10 un octavo aparato para filtrar neurotoxina botulínica purificada del séptimo aparato, en el que el octavo aparato comprende una membrana de filtración, y en el que el producto que contiene toxina botulínica obtenido tiene una potencia de 1,8 x 107 a 6,6 × 107 unidades/mg, el producto comprende 1,1 ng o menos de ácido nucleico residual por mg del producto, y el proceso se puede llevar a cabo en una semana o menos;

15 en el que el sistema es capaz de purificar la neurotoxina botulínica sin el uso de una enzima derivada de un animal.

De acuerdo con los procesos y sistemas aquí descritos, se obtiene de este modo neurotoxina botulínica biológicamente activa. En realizaciones particulares, la neurotoxina botulínica biológicamente activa obtenida mediante el proceso y los sistemas aquí descritos tiene un peso molecular de aproximadamente 900 kDa.

Las composiciones farmacéuticas de APF se pueden preparar mezclando la neurotoxina botulínica biológicamente 20 activa obtenida mediante el proceso y el sistema aquí descritos.

La composición farmacéutica en la que el ingrediente activo es una neurotoxina botulínica biológicamente activa obtenida mediante el proceso APF (es decir, proceso IAPF y FAPF) descrito en la presente invención puede usarse para tratar una afección en un paciente. Los ejemplos de afecciones a tratar se seleccionan del grupo que consiste en cefalea, cefalea con migraña, cefalea tensional, cefalea sinusal, cefalea cervicogénica, trastorno sudoríaco, 25 hiperhidrosis axilar, hiperhidrosis palmar, hiperhidrosis plantar, síndrome de Frey, piel hipercinética una arruga facial, líneas glabelares, patas de gallo, líneas de marioneta, un pliegue nasolabial, un trastorno cutáneo, acalasia, estrabismo, fisura anal crónica, blefaroespasmo, dolor musculoesquelético, fibromialgia, pancreatitis, taquicardia, agrandamiento prostático, prostatitis, retención urinaria, incontinencia urinaria, vejiga hiperactiva, espasmo hemifacial, temblores, mioclonía, trastornos gastrointestinales, diabetes, sialorrea, disinergia detrusor-esfínter,

30 espasticidad post-accidente cerebrovascular, cicatrización de heridas, parálisis cerebral juvenil, espasmo de músculo liso, restenosis, distonía focal, epilepsia, distonía cervical , trastorno de la tiroides, hipercalcemia, trastorno obsesivo compulsivo, dolor artrítico, síndrome de Raynaud, estrías de distensión, adhesión peritoneal, vasoespasmos, rinorrea, contractura muscular, músculo lesionado, distonía laríngea, calambre del escritor y síndrome del túnel carpiano, por ejemplo.

35 La administración local de cantidades terapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica que comprende una neurotoxina botulínica biológicamente activa proporcionada por el proceso/sistema IAPF aquí descrito, puede repetirse a intervalos de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 6 meses o a intervalos de aproximadamente 2 meses a aproximadamente 3 meses, por ejemplo. Las dosis útiles ejemplares administradas localmente al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica sustancialmente

40 APF hecha de acuerdo con la presente descripción, pueden tener cantidades unitarias de neurotoxina botulínica de entre aproximadamente 0,01 unidades y aproximadamente 10.000 unidades. En casos particulares, la neurotoxina botulínica se administra en una cantidad de entre aproximadamente 0,01 unidades y aproximadamente 3.000 unidades. En ejemplos particulares, la neurotoxina botulínica biológicamente activa que es el ingrediente farmacéutico activo en la composición farmacéutica es la neurotoxina botulínica tipo A o tipo B, por ejemplo.

45 Nuestra invención incluye un proceso sustancialmente APF, que utiliza cromatografía, para obtener una neurotoxina botulínica biológicamente activa. El proceso comprende las etapas secuenciales de proporcionar un medio de fermentación sustancialmente APF, seguido de fermentación de bacterias Clostridium Botulinum en el medio de fermentación y recuperar la neurotoxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación utilizando un medio de cromatografía de intercambio aniónico seguido por el uso de un medio de cromatografía de intercambio

50 catiónico. La etapa de recuperación también incluye el uso de un medio de interacción hidrofóbico después del uso del medio de cromatografía de intercambio catiónico.

La neurotoxina botulínica obtenida es un complejo de neurotoxina botulínica tipo A.

En un aspecto de nuestra invención, la cantidad de medio de fermentación utilizado puede comprender de aproximadamente 2 L a aproximadamente 75 L de medio de fermentación sustancialmente APF, preferiblemente de 55 aproximadamente 2 L a aproximadamente 30 L de medio de fermentación sustancialmente APF. Como ejemplo, se obtiene del proceso de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 5 gramos, preferiblemente de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 gramos, más preferiblemente de aproximadamente 100 mg a

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aproximadamente 25 mg de neurotoxina botulínica por litro de medio de fermentación; de aproximadamente 6 mg a aproximadamente 20 mg de neurotoxina botulínica por litro de medio de fermentación.

Como una realización, el pH del medio de fermentación se puede ajustar entre aproximadamente pH 6,0 y aproximadamente pH 8, preferiblemente entre aproximadamente pH 6,8 y aproximadamente pH 7,6 al comienzo de la etapa de fermentación, más preferiblemente aproximadamente pH 7,3. En configuraciones particulares, se puede utilizar una columna de cromatografía aniónica que contiene de aproximadamente 600 ml a aproximadamente 800 ml de resina de cromatografía de intercambio aniónico. La columna de cromatografía aniónico puede tener un diámetro de aproximadamente 8 cm a aproximadamente 10 cm y una altura de lecho de resina de cromatografía de intercambio aniónico en la columna de aproximadamente 9 cm a aproximadamente 16 cm, por ejemplo. Una velocidad de flujo de medio de fermentación a través de la resina de cromatografía de intercambio aniónico puede ser de aproximadamente 140 cm/hora a aproximadamente 250 cm/hora, o de aproximadamente 150 cm/hora a aproximadamente 160 cm/hora, por ejemplo. En otro aspecto, puede utilizarse en el proceso de aproximadamente 150 ml a aproximadamente 300 ml de resina de cromatografía de intercambio catiónico en una columna de cromatografía en la que la columna de cromatografía de cationes tiene un diámetro de aproximadamente 5 cm a aproximadamente 8 cm y una altura de lecho de resina de cromatografía de intercambio catiónico de aproximadamente 5 cm a aproximadamente 11 cm, por ejemplo. El proceso puede incluir al menos una de una etapa de diafiltración y/o una etapa de reducción de la carga biológica. La etapa de reducción de la carga biológica puede utilizar un filtro de cápsula. La diafiltración de eluato purificado se realiza preferiblemente antes de una etapa de reducción de carga biológica. En un ejemplo, la etapa de diafiltrar el eluato purificado adicional se continúa o se sigue ajustando la concentración del eluato purificado adicionalmente diafiltrado y pasando el eluato purificado adicionalmente diafiltrado ajustado por concentración a través de un filtro de reducción de carga biológica. El proceso puede proporcionar una neurotoxina botulínica obtenida que tiene potencia, determinada por un bioensayo de DL50 de ratón, de al menos aproximadamente 2,0 x 107 unidades/mg de toxina botulínica, tal como aproximadamente 2,4 x 107 a aproximadamente 6,0 x 107 unidades/mg de neurotoxina botulínica. Por ejemplo, puede recuperarse una recuperación ejemplar al final del proceso de aproximadamente 4 mg a aproximadamente 25 mg de toxina botulínica por litro de medio de fermentación.

La neurotoxina botulínica puede combinarse con al menos un excipiente adecuado para producir una composición farmacéutica sustancialmente APF. En un ejemplo, el método incluye la etapa de secar la neurotoxina botulínica compuesta y al menos un excipiente adecuado para obtener una forma estable para su envío o almacenamiento, por secado por congelación o liofilización o secado al vacío, en el que el ingrediente activo es la neurotoxina botulínica biológicamente activa, donde el medio de fermentación comprende un producto proteico obtenido a partir de un vegetal. El vegetal a partir del cual se puede obtener el producto proteico puede ser una soja, maíz o malta, semilla debilitada de Lupinus campestris, o productos hidrolizados a partir de los mismos. En realizaciones particulares, el excipiente adecuado se selecciona del grupo que consiste en albúmina, albúmina de suero humano, albúmina de suero humano recombinante, gelatina, sacarosa, trehalosa, almidón hidroxietilo, colágeno, lactosa, sacarosa, aminoácido, cloruro de sodio, cloruro de potasio, polisacárido, caprilato, polivinilpirrolidona y citrato de potasio. En los ejemplos particulares, el secado al vacío tiene lugar a una temperatura de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 25ºC. En algunas realizaciones, el secado al vacío tiene lugar a una presión de aproximadamente 70 mmHg a aproximadamente 90 mmHg, por ejemplo. El tiempo para el secado al vacío puede ser de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas, por ejemplo.

En un ejemplo particular, una composición farmacéutica comprende una neurotoxina botulínica biológicamente activa, en la que la neurotoxina botulínica tiene una potencia entre aproximadamente 2,0 x 107 a aproximadamente 6,0 x 107 unidades/mg de neurotoxina botulínica biológicamente activa, y al menos un excipiente, donde la composición comprende menos de aproximadamente 12 ppm de ácido nucleico, preferiblemente menos de 1 ppm de ácido nucleico por mg de complejo de neurotoxina botulínica.

En una realización particular, un proceso cromatográfico sustancialmente APF para obtener una neurotoxina botulínica biológicamente activa comprende las siguientes etapas secuenciales de: cultivo de bacterias Clostridium botulinum en un medio de cultivo sustancialmente APF durante entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 12 horas, o hasta que una medición de biomasa del medio de cultivo tenga una densidad óptica, a una longitud de onda de aproximadamente 540 nanómetros (nm), de entre aproximadamente 0,8 UA y aproximadamente 4,5 UA ; fermentación de bacterias Clostridium botulinum del medio de cultivo en un medio de fermentación sustancialmente APF durante entre aproximadamente 65 horas a aproximadamente 75 horas o hasta que se una medición de biomasa tomada al final de la fermentación midiendo la densidad óptica del medio de fermentación usando una sonda de biomasa en línea a una longitud de onda de aproximadamente 890 nm está entre aproximadamente 0,05 UA y aproximadamente 0,7 UA; recoger el medio de fermentación durante aproximadamente 2,5 horas, eliminándose los residuos celulares en el medio de fermentación y reduciendo el peso del medio de fermentación a aproximadamente tres cuartos de su peso inicial al comienzo de la etapa de recolección; concentrar el medio de fermentación recogido mediante filtración de flujo tangencial a aproximadamente una cuarta parte de su volumen de partida al comienzo de la etapa de recolección; diluir el medio de fermentación concentrado por adición de un tampón, en el que las etapas de concentración y dilución tienen lugar durante entre aproximadamente 0,5 horas a aproximadamente 2 horas, por lo que durante la concentración el medio de fermentación se reduce a aproximadamente un cuarto de su peso inicial al comienzo de la etapa de recogida y luego se diluye, mediante la adición del tampón, de nuevo hasta su peso de partida original al comienzo de la etapa de

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recolección; poner en contacto el medio de fermentación diluido con un medio de cromatografía de intercambio aniónico para capturar la neurotoxina botulínica biológicamente activa, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas; poner en contacto el eluato del medio de cromatografía de intercambio aniónico con un medio de cromatografía de intercambio catiónico para llevar a cabo una primera operación de pulido para eliminar impurezas de la misma durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1,5 horas a aproximadamente 2,5 horas; llevar a cabo una segunda operación de pulido haciendo pasar el eluato del medio de cromatografía de pulido a través de un medio de interacción hidrofóbica durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1,5 horas a aproximadamente 2,5 horas; procesar el eluato a partir del medio de interacción hidrofóbica por diafiltración, durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4 horas; y filtrar el eluato procesado a través de un filtro de reducción de carga biológica, durante aproximadamente 0,5 horas, obteniendo de este modo neurotoxina botulínica biológicamente activa.

En una realización del sistema de la invención, una columna de cromatografía con un diámetro entre aproximadamente 8 cm y aproximadamente 15 cm contiene los medios de cromatografía de intercambio aniónico y los medios de cromatografía de intercambio aniónico puede tener una altura de lecho en la columna de entre aproximadamente 8 cm y aproximadamente 15 cm, por ejemplo. En otro ejemplo más, el quinto aparato del sistema comprende una columna de cromatografía que funciona a una velocidad de flujo de entre aproximadamente 125 cm/hora y aproximadamente 200 cm/hora, y la columna puede tener un volumen de columna entre aproximadamente 500 ml y aproximadamente 1 L. En un aspecto, el quinto aparato puede tener un volumen de columna de aproximadamente 50 ml y aproximadamente 500 ml, y una altura del lecho de aproximadamente 8 cm y aproximadamente 15 cm, por ejemplo. En algunos ejemplos, la columna de cromatografía del quinto aparato tiene un diámetro de columna de aproximadamente 2 cm y aproximadamente 10 cm, por ejemplo. La columna de cromatografía del quinto aparato puede tener una velocidad de flujo ejemplar de entre aproximadamente 100 cm y aproximadamente 200 cm/hora. El octavo aparato del sistema comprende una membrana de filtración.

En otra realización, el sistema puede comprender además un noveno aparato, comprendiendo el noveno aparato una cámara anaeróbica para proporcionar una atmósfera anaeróbica en la que está contenido el primer aparato para cultivar bacterias Clostridium botulinum. Este noveno aparato incluye preferiblemente un filtro integrado de partículas de aire de alto rendimiento (HEPA) situado dentro de su cámara/estación de trabajo. El segundo aparato del sistema (para la fermentación) puede incluir al menos una sonda para detectar el potencial de oxidación-reducción o el pH o la densidad óptica. En un ejemplo particular, al menos una sonda desechable se selecciona del grupo que consiste en una sonda de reducción-oxidación, una sonda de pH y una sonda de turbidez. El octavo aparato del sistema puede comprender un aparato de filtración de flujo tangencial para la concentración y el intercambio de tampón. En una realización adicional, el sistema puede comprender un décimo aparato que incluye un aparato de reducción de la carga biológica para reducir la carga biológica. En un ejemplo, el aparato de reducción de la carga biológica comprende un filtro que tiene un tamaño de poro de aproximadamente entre 0,1 μm y 0,3 μm, preferiblemente 0,2 μm. El sistema también puede incluir un undécimo aparato para su uso después de obtener la segunda neurotoxina botulínica purificada, para almacenar la neurotoxina botulínica purificada. En un ejemplo, este aparato de almacenamiento proporciona una temperatura de almacenamiento entre aproximadamente -25ºC y aproximadamente -80ºC.

Un método para tratar una afección en un paciente puede utilizar una composición farmacéutica que comprende la neurotoxina botulínica obtenida de acuerdo con los métodos aquí descritos. Una afección puede incluir una enfermedad, dolencia, enfermedad o deformidad o aspecto cosmético. En un ejemplo, el método de tratamiento de una afección en un paciente comprende la etapa de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una neurotoxina botulínica y al menos un excipiente adecuado, donde la toxina botulínica tiene una potencia de aproximadamente 1 unidad ≥ aproximadamente 0,02 picogramos para así tratar la afección del paciente.

En una realización se incluye un sistema cromatográfico sustancialmente APF para obtener una neurotoxina botulínica biológicamente activa, comprendiendo el sistema un primer aparato para el cultivo anaeróbico de bacterias Clostridium botulinum, el primer aparato capaz de contener de aproximadamente 200 mL a aproximadamente 1 L de un medio de cultivo sustancialmente APF; un segundo aparato para la fermentación anaeróbica de bacterias Clostridium botulinum que han sido cultivadas en el primer aparato, el segundo aparato capaz de contener de aproximadamente 5 L a aproximadamente 75 L, o de aproximadamente 2 L a aproximadamente 75 L, o de aproximadamente 2 L a aproximadamente 30 L de un medio de fermentación sustancialmente APF e incluyendo al menos una sonda desechable seleccionada del grupo que consiste en una sonda de reducción-oxidación, una sonda de pH y una sonda de turbidez; un noveno aparato para proporcionar una atmósfera anaeróbica y capaz de contener el primer aparato, comprendiendo el noveno aparato una cámara anaeróbica que tiene un filtro de partículas de aire de alto rendimiento integrado dentro de la cámara, en el que dicha cámara puede contener el primer aparato para el cultivo anaeróbico de bacterias Clostridium botulinum; un tercer aparato para recoger el medio de fermentación; un cuarto aparato para llevar a cabo la concentración y dilución del medio recogido, un quinto aparato para llevar a cabo una primera purificación de la neurotoxina botulínica obtenida del cuarto aparato, el quinto aparato que comprende un medio de cromatografía de intercambio aniónico, obteniendo de este modo una primera neurotoxina botulínica purificada; un sexto aparato para llevar a cabo una segunda purificación de la primera neurotoxina botulínica purificada, comprendiendo el sexto aparato un medio de cromatografía de intercambio catiónico, obteniendo de este modo una segunda neurotoxina botulínica

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purificación pueden completarse en aproximadamente cuatro días o menos (por ejemplo, dentro de aproximadamente 80 a aproximadamente 144 horas o dentro de un tiempo/intervalo entre ellas).

Hemos inventado esta realización rápida y más preferida de nuestra invención desarrollando un proceso de nueve etapas (y el sistema para llevar a cabo el proceso) y encontrando que cada una de las nueve etapas puede ser completada dentro de los períodos de tiempo que se exponen a continuación:

aproximadamente 8 horas a aproximadamente 14 horas para el cultivo;

aproximadamente 60 horas a aproximadamente 80 horas para la fermentación;

aproximadamente 2,5 horas para la recogida;

aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas para concentrar y diluir;

aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 horas para la cromatografía de intercambio aniónico (esto incluye el tiempo para eluir la toxina botulínica capturada)

aproximadamente 2 horas para cromatografía de intercambio catiónico;

aproximadamente 2 horas para una tercera etapa de cromatografía (es decir, cromatografía de interacción hidrofóbica;

aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas para la concentración y diafiltración, y;

aproximadamente 1/2 hora para una posterior filtración. Por lo tanto, el tiempo total requerido para completar nuestra realización rápida, más preferida de 9 etapas de nuestra invención es de aproximadamente 75 horas a aproximadamente 150 horas.

Nuestra invención es más eficiente y ahorra tiempo. En un aspecto, nuestro nuevo proceso utiliza líneas celulares pre-seleccionadas y verificadas, y por lo tanto elimina las etapas del proceso Shantz de la técnica anterior de plaquear y crecer células, seleccionar y recoger colonias y expandir la línea celular de las colonias recogidas (antes del cultivo celular y las etapas de fermentación) que se necesitaban para cultivar y luego inocular el medio de fermentación. En un aspecto, nuestra invención comienza directamente con el cultivo de células preseleccionadas para la inoculación de un medio de cultivo APF, ahorrando así tiempo y etapas del proceso.

A través de la experimentación desarrollamos un sistema de cromatografía de tres columnas ("FAPF"/"FIAPF") y un proceso para purificar la neurotoxina botulínica presente en el medio de fermentación, el medio de fermentación resultante de una fermentación de APF de bacterias Clostridium botulinum. De manera significativa, mientras que un proceso de fermentación de APF puede reducir o eliminar productos derivados de animales (tales como caseína y caldo de carne) como nutrientes de los medios utilizados para cultivar y fermentar bacterias clostridiales, los procesos de fermentación APF conocidos son típicamente seguidos por una o más etapas de purificación que usan productos derivados de animales, tales como las enzimas ADNasa y ARNasa. Nuestros sistemas y procesos para purificar la neurotoxina botulínica presente en un medio de fermentación de APF no utilizan enzimas derivadas de animales.

Nuestra invención puede abarcar cargar un medio de fermentación recogido (por ejemplo, clarificado por filtración) sobre una columna de intercambio aniónico tal como una resina de cromatografía de intercambio aniónico POROS® 50HQ de Applied Biosystems. En un aspecto, se puede usar un medio de intercambio aniónico fuerte, que tiene una matriz de base de poliestireno/divinilbenceno y diámetro de partícula de aproximadamente 50 μm y capacidad dinámica (BSA mg/ml) de aproximadamente 60-70. La columna de intercambio aniónico captura la neurotoxina Clostridial (tal como un complejo de toxina botulínica) y reduce los niveles de impurezas. Se encontró que una columna de intercambio aniónico proporcionaba una captura eficiente de un complejo de toxina botulínica a partir del medio de fermentación recogido con retención de la actividad biológica del complejo de toxina botulínica, al tiempo que separaba muchas impurezas presentes con la toxina botulínica en el medio de fermentación. Se utiliza un tampón adecuado para eluir la neurotoxina de clostridial capturada (unida) de la columna de intercambio aniónico.

El eluato (que contiene la neurotoxina botulínica) de la columna de intercambio aniónico se carga sobre una columna de intercambio catiónico para purificar adicionalmente la neurotoxina botulínica de las impurezas. La columna de intercambio catiónico puede ser una resina de intercambio catiónico POROS® 20HS de Applied Biosystems. En un aspecto, se puede usar un medio de intercambio catiónico fuerte, que tiene una matriz de base de poliestireno/divinilbenceno y diámetro de partícula de aproximadamente 20 μm y capacidad de unión dinámica (lisosima mg/ml) de aproximadamente >75. En la realización de tres columnas (FAPF) de nuestra invención, el eluato de la columna de intercambio catiónico se carga sobre una columna de interacción hidrofóbica tal como resina de Fenil Sepharose HP de GE Healthcare para purificar adicionalmente la neurotoxina botulínica. En un aspecto, puede utilizarse una matriz de perlas de agarosa altamente reticuladas con un tamaño de partícula de aproximadamente 34 μm, que han sido derivatizadas con grupos fenilo y tienen una capacidad de unión dinámica (quimotripsinógeno mg/ml) de aproximadamente 45.

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para cultivo, caseína en el medio de fermentación y uso de enzimas ARNasa y ADNasa para la purificación de neurotoxina botulínica). La figura 1A es un diagrama de flujo que muestra las etapas principales del proceso de Schantz. El proceso de Schantz tiene alrededor de 16 a 20 etapas principales, para el trabajo de la escala de la producción utiliza un fermentador de 115 L y tarda cerca de 3 semanas para terminar. El proceso de Schantz se inicia descongelando un vial de banco de células madre de Clostridium botulinum no APF (MCB) a temperatura ambiente seguido por cuatro etapas de cultivo. Antes de seleccionar colonias con una morfología adecuada, se sembraron en estrías alícuotas del vial de MCB descongelado en placas de agar de sangre Columbia (CBA) prereducido y se incubaron anaeróbicamente durante 30-48 horas a 34°C ± 1°C. En segundo lugar, se inocularon colonias seleccionadas en tubos de ensayo de 9 ml que contenían un medio de crecimiento de caseína durante 6-12 horas a 34°C. El contenido del tubo de 9 ml con el crecimiento más rápido y la densidad más alta (etapa de selección del crecimiento) se cultivaron posteriormente a través de dos incubaciones anaeróbicas escalonadas (la tercera y cuarta etapas de cultivo), siendo una incubación de 12-30 horas a 34ºC en una botella de cultivo de siembra de 600 mL a 1L, seguido por un cultivo en un fermentador de siembra de 15L a 25L que contiene un medio de crecimiento de caseína durante 6-16 horas a 35ºC. Estos dos cultivos escalonados se llevaron a cabo en un medio nutritivo que contenía 2% de hidrolizado de caseína (una digestión de caseína [proteína de leche]), 1% de extracto de levadura y 1% de glucosa (dextrosa) en agua a pH 7,3.

Los cultivos escalonados fueron seguidos por una incubación adicional durante 60-96 horas a 35ºC en un fermentador de producción de escala comercial (es decir, 115 L) en un medio que contiene caseína bajo una atmósfera anaeróbica controlada. El crecimiento de la bacteria está normalmente completo después de 24 a 36 horas y durante la etapa de fermentación llevada a cabo durante aproximadamente 65 a aproximadamente 72 horas, donde la mayoría de las células experimentan lisis y liberan neurotoxina botulínica. Se cree que la toxina se libera por lisis celular y se activa por las proteasas presentes en el medio. Se puede preparar un filtrado del medio de cultivo usando un filtro de profundidad de una sola capa para eliminar impurezas groseras (es decir, células enteras y rotas) obteniendo de este modo una solución clara denominada cultivo clarificado. La recolección de neurotoxina botulínica del cultivo clarificado se consiguió reduciendo el pH del cultivo clarificado a pH 3,5 con ácido sulfúrico 3M para precipitar la toxina cruda a 20ºC (precipitación por acidificación). La neurotoxina botulínica cruda se concentró entonces (para lograr una reducción de volumen) mediante ultramicrofiltración (microfiltración) (denominada MF o UF) seguida de diafiltración (DF). Se utilizó un filtro de 0,1 μm para la etapa de microfiltración.

La toxina cruda o en bruto recogida se transfirió entonces a un recipiente de digestión y se estabilizó por adición del inhibidor de proteasa hidrocloruro de benzamidina. Se añadieron ADNasa y ARNasa para digerir (hidrolizar) ácidos nucleicos. A continuación, se eliminaron los ácidos nucleicos hidrolizados y las impurezas de bajo peso molecular mediante etapas adicionales de UF y DF. La toxina se extrajo entonces con tampón de fosfato de pH 6,0 y se eliminaron los restos celulares por clarificación. A continuación, se llevaron a cabo las siguientes tres etapas de precipitación secuencial (precipitaciones con etanol frío, ácido clorhídrico y sulfato de amoníaco). El complejo de neurotoxina botulínica purificada (toxina a granel) se almacenó como una suspensión en un tampón de fosfato de sodio/sulfato de amonio a 2ºC a 8ºC.

La terminación de este Ejemplo 1 del proceso de Schantz (no APF), incluyendo las etapas de recolección y purificación, dura aproximadamente de dos a tres semanas. La neurotoxina botulínica a granel resultante fue una suspensión de alta calidad del complejo de toxina botulínica tipo A de 900 kDa preparado a partir de la cepa Hall A de Clostridium botulinum con una potencia específica de ≥ 2 x 107 U/mg, una A260/A278 de menos de 0,6 y un patrón claro de bandas sobre electroforesis en gel, y adecuado para uso para la composición de una composición farmacéutica de toxina botulínica.

La neurotoxina botulínica también se puede obtener a partir de un proceso APF, no cromatográfico, como se expone en el Ejemplo 7 de la patente U.S. 7.452.697, tardando el proceso completo de APF, no cromatográfico (desde el inicio del cultivo hasta el final de todas las etapas de purificación y procesamiento) aproximadamente dos a tres semanas en completarse. Alternativamente, la neurotoxina botulínica también puede obtenerse a partir de un proceso cromatográfico APF, como se expone en el Ejemplo 16 de la patente U.S. 7.452.697, tardando el proceso APF, cromatográfico (desde el inicio del cultivo hasta el final de todas las etapas de purificación y procesamiento) una semana o más en completarse.

Ejemplo 2

Sistemas y procesos APF, cromatográficos de dos y tres columnas para la obtención de una neurotoxina botulínica

Desarrollamos sistemas y procesos rápidos APF, basados en cromatografía aniónica-catiónica para obtener neurotoxina botulínica de alto rendimiento y alta pureza. El proceso de este Ejemplo 2 tenía solamente 8-10 etapas principales, para propósitos de producción (es decir, para obtener cantidades en gramos de la neurotoxina botulínica final) usó un recipiente de fermentación de 20 L y tarda sólo 4-7 días, preferiblemente aproximadamente 4 a aproximadamente 6 días, para completar todas las etapas del proceso desde el inicio del cultivo hasta completar la purificación final y el almacenamiento de toxinas. El aparato utilizado en los sistemas aquí descritos se discute a continuación. Se desarrollaron un proceso de dos medios cromatográficos (proceso de referencia) y un proceso de tres medios cromatográficos y se exponen en la presente memoria. El proceso de dos medios usó cromatografía de intercambio aniónico seguido de cromatografía de intercambio catiónico. El proceso de tres medios usó

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seguido de elución con acetato de sodio 50 mM, pH 4,8 a 230 cm/hora. Se recogió el grupo de productos, cuando la absorbancia a 280 nm (A280) aumenta hasta al menos aproximadamente 0,15 UA y a través del máximo de pico a igual o inferior a aproximadamente 0,2 UA en el borde de salida, en un recipiente que contiene 1 volumen de columna de acetato de sodio 50 mM, pH 4,8. Este combinado de elución se almacenó a aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC durante hasta 48 horas.

La segunda etapa de cromatografía en el proceso aguas abajo de este Ejemplo 2 usó una resina de cromatografía de intercambio catiónico POROS® 20HS empaquetada en una columna con un diámetro interior de 8 cm y una altura de columna de 5 cm. La operación completa de la columna POROS® 20HS se completó a temperatura ambiente, y el flujo fue en dirección descendente. El complejo de neurotoxina botulínica tipo A se asocia con la resina de columna POROS® 20HS. El complejo de neurotoxina botulínica de tipo A se eluyó después de la columna usando un cambio en la etapa salina. Las impurezas relacionadas con el producto se eluyeron con el tampón de lavado y la solución de descontaminación.

Los detalles de la etapa de intercambio de cationes fueron: uso de la columna POROS® 20HS usando solución de hidróxido de sodio 0,1 N durante un tiempo de contacto mínimo de 30 minutos (al menos aproximadamente 3 volúmenes de columna, a 230 cm/hora). La columna se equilibró después con un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 4,8 (al menos aproximadamente 5 volúmenes de columna). A continuación, se cargó el conjunto de productos POROS® 50HQ (recogido como se describe anteriormente, fresco o de refrigeración) en la columna POROS® 20HS. La columna se lavó a continuación con un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 4,8 (al menos aproximadamente 3 volúmenes de columna) y luego se lavó de nuevo con un tampón de acetato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 4,8. El complejo de neurotoxina botulínica de tipo A se eluyó de la columna POROS® 20HS con un tampón de acetato sódico 50 mM, cloruro de sodio 250 mM, pH 4,8 a 200 mL/min, el eluato se desvió en una bolsa de recogida de bioprocesos (que contenía 1 volumen de columna de 50 mM NaH3C2O2, pH 4,8) cuando la A280 aumenta hasta aproximadamente ≥ 0,1 UA hasta el pico máximo hasta que la A280 del borde de salida del pico de elución disminuye hasta un valor del borde de salida de ≤ 0,1 UA. El combinado de productos POROS® 20HS se almacenó en la bolsa de recogida a temperatura ambiente durante hasta aproximadamente 6 horas.

En el proceso de medios de cromatografía de tres columnas de este Ejemplo 2, el eluato de la segunda columna (intercambio catiónico) se hizo pasar a través de una columna HIC. La columna de HIC utilizada fue una resina de cromatografía de interacción hidrofóbica de Fenil Sepharose HP empaquetada en una columna con un diámetro interno de aproximadamente 8 cm y una altura de columna de aproximadamente 5 cm. La operación completa de la columna Fenil Sepharose HP se completó a temperatura ambiente, y el flujo fue en dirección descendente. El complejo de neurotoxina botulínica de tipo A se eluyó de la columna usando un cambio de etapa de sal decreciente. Las impurezas se eluyeron durante la carga y con el tampón de lavado y solución de descontaminación.

Los detalles de la etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica fueron:

una columna de Fenil Sepharose HP se desinfectó inicialmente con una solución de hidróxido sódico 0,1 N durante un tiempo de contacto mínimo de 30 minutos (con al menos aproximadamente 3 volúmenes de columna de una solución de hidróxido de sodio 0,1 N a 200 cm/hora). La columna se equilibró entonces con al menos aproximadamente 5 volúmenes de columna de tampón de acetato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,4 M, tampón de pH 4,8. A continuación, el conjunto de productos POROS® 20HS (columna de intercambio catiónico) (de arriba) se combinó 1:1 con un tampón de acetato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,8 M, pH 4,8 y se cargó en la columna Fenil Sepharose HP. La columna se lavó primero con al menos aproximadamente 3 volúmenes de columna de un tampón de acetato de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,4 M, pH 4,8, y luego se lavó con un tampón de sodio 50 mM, sulfato de amonio 0,4 M, pH 6,5. El complejo de neurotoxina botulínica de tipo A se eluyó de la columna con un tampón de fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 0,14 M, pH 6,5. El eluato se desvió en una bolsa de recogida de bioprocesos cuando la A280 aumentó a ≥ 0,05 UA. El eluato se recogió hasta que la A280 del borde de salida del pico de elución disminuyó hasta un valor de ≤ 0,05 UA. El combinado de productos de Fenil Sepharose HP se almacenó en la bolsa de recogida a temperatura ambiente durante hasta 6 horas.

Se usó un sistema de filtración de flujo tangencial para concentrar y diafiltrar el combinado de productos de la etapa de cromatografía de Fenil Sepharose HP en el tampón de formulación de fármaco. Se utilizaron casetes Pall® Filtron Minimate con una membrana de corte de peso molecular de 100 kDa para las etapas de concentración y diafiltración. El material formulado se hizo pasar luego a través de un filtro Pall Mini Kleenpak® de 0,2 μm para reducir la carga biológica potencial. Como se ha indicado anteriormente, la etapa de UF/DF concentró el combinado de productos de Fenil Sepharose HP (eluato de la columna HIC) a una concentración del complejo BoNT/A de 0,7 g/L y diafiltró el material concentrado con un tampón citrato de potasio 10 mM, tampón pH 6,5.

Los detalles del proceso de ultrafiltración/diafiltración utilizado fueron los siguientes. La unidad de UF/DF y la membrana de poliéter sulfona Pall de 100 kDa se enjuagaron inicialmente con un mínimo de 5 L de agua para inyección (WFI) para eliminar la solución de relleno y se desinfectaron con un mínimo de 200 ml de una solución de hidróxido de sodio 1N bajo condiciones de recirculación durante un mínimo de 10 minutos, preferiblemente al menos 30 minutos, para desinfectar la unidad UF/DF. A continuación, se equilibraron la membrana y el sistema UF/DF con volúmenes suficientes del tampón de formulación citrato de potasio 10 mM, pH 6,5, hasta que el pH del permeato y del retenido fueron de pH 6,5. Después de esto, el combinado de productos de Fenil Sepharose HP se cargó en el

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casete de filtración de flujo tangencial Minimate® y el eluato de HIC se concentró hasta 0,7 g/l. Después de la etapa de concentración, el combinado retenido se diafiltró contra un mínimo de 5 volúmenes de diafiltración del tampón de formulación de fármaco (citrato de potasio 10 mM, pH 6,5) a una presión transmembrana de 7,5 psig (libras por pulgada cuadrada). La salida de permeado se cerró entonces y el sistema UF/DF funcionó durante al menos 2 minutos y el sistema se enjuagó con 50 ml de tampón de formulación citrato de potasio 10 mM, pH 6,5. Después del enjuague, se determinó la concentración de complejo de BoNT/A en el combinado de retención midiendo el valor de A278 fuera de la línea y basado en la lectura de A278 , la concentración del combinado retenido se ajustó a 0,5 g/l con tampón citrato de potasio 10 mM, pH 6,5. El combinado retenido ajustado a la concentración se filtró a continuación a través de un filtro Pall Mini Kleenpak de 0,2 μm para reducir la carga biológica potencial. El combinado retenido ajustado a la concentración filtrado se almacenó en una bolsa de recogida a 2ºC-8ºC durante hasta 2 días.

El complejo final de neurotoxina botulínica tipo A purificado obtenido se utilizó para llenar crioviales Nunc® de 1 mL a 700 μl por vial y se almacenó congelado. La operación de llenado se llevó a cabo en una cabina de bioseguridad de clase 100 a temperatura ambiente.

El proceso aguas abajo (incluyendo el uso de 2 o 3 columnas de cromatografía) se completó en solo 1 a 3 días y el complejo de neurotoxina botulínica tipo A obtenido se almacenó congelado en un tampón de citrato de potasio, pH 6,5 a una concentración de 0,5 g/L como una solución. En comparación, el proceso de Schantz aguas abajo (purificación de toxinas) de la técnica anterior utiliza etapas múltiples de filtración, precipitación, extracción y centrifugación para purificar el complejo de neurotoxina botulínica de tipo A y requiere 1-2 semanas para completar sólo las etapas aguas abajo y la sustancia fármaco resultante (neurotoxina botulínica recuperada) se almacena refrigerada como una suspensión de sulfato amónico a una concentración de aproximadamente 2,7 g/l. El uso de la cromatografía en lugar de la precipitación y el reducido tiempo de procesado dieron lugar a un proceso aguas abajo significativamente mejorado, consistente como se describe en la presente memoria.

De acuerdo con un aspecto, las concentraciones de productos a base de vegetales, tales como productos a base de soja, pueden ser Peptona de Soja Tipo II Hy-Soy® o SE50MK (una peptona de soja Kosher) en los medios de cultivo y fermentación. Hy-Soy® en el medio de cultivo de siembra puede oscilar entre 10-200 g/l. Preferiblemente, la concentración de Hy-Soy® en el medio de siembra oscila entre 15-150 g/l. Más preferiblemente, la concentración de Hy-Soy® en el medio de siembra está aproximadamente entre aproximadamente 20-30 g/L o una cantidad entre ellos. La concentración de glucosa en medio de siembra puede oscilar entre 0,1 g/l y 20 g/l. Preferiblemente, la concentración de glucosa oscila entre 0,5-15 g/l. Más preferiblemente, la concentración de glucosa en el medio de cultivo es de aproximadamente 10 g/l. Las cantidades de extracto de levadura pueden ser de aproximadamente 5-20 g/l, más preferiblemente de aproximadamente 10-15 g/l o una cantidad entre ellas. Por ejemplo, el pH del medio de cultivo antes del crecimiento de Clostridium botulinum puede ser aproximadamente de pH 7,0-7,5, o entre ellos, preferiblemente pH 7,3.

Como ejemplo, las cantidades de Hy-Soy® en el medio de fermentación de producción pueden oscilar entre 10-200 g/l. Preferiblemente, la concentración de Hy-Soy® en el medio de fermentación oscila entre 15-150 g/l. Más preferiblemente, la concentración de Hy-Soy® en el medio de fermentación está aproximadamente entre aproximadamente 20-40 g/L o una cantidad entre ellos. La concentración de glucosa en medio de fermentación puede oscilar entre 0,1 g/l y 20 g/l. Preferiblemente, la concentración de glucosa oscila entre 0,5-15 g/l o una cantidad entre ellos. No necesariamente, pero como antes, la glucosa se puede esterilizar por autoclave junto con los otros componentes del medio de fermentación. El nivel de pH del medio de fermentación antes del crecimiento puede ser de pH 7,0-7,8, preferiblemente de aproximadamente 7,0-7,5 o entre ellos, más preferiblemente pH 7,3.

Como se muestra por el lado derecho de la FIG. 1, el proceso APF de referencia de dos columnas utilizado en este Ejemplo 2 para obtener un complejo de neurotoxina botulínica biológicamente activo comprende las siguientes etapas: (a) cultivo de bacterias, tales como bacterias Clostridium botulinum de un vial WCB APF, en una botella de siembra/cultivo, (b) luego fermentación de bacterias Clostridium botulinum en un fermentador (fermentador de producción de toxina) que tiene un medio de fermentación APF para expandir la línea celular, procediendo con la fermentación y la producción de toxina botulínica hasta que se alcanza una fase de lisis celular deseada, (c) recogida (por ejemplo, clarificar por filtración) del medio de fermentación APF para obtener un medio de fermentación recogido, (d) proceder con concentración y dilución dando como resultado un medio de fermentación recogido diluido que se (e) pasa a través de una columna de captura aniónica para eliminar las impurezas, (f) poner en contacto el eluato de la columna de captura con una columna de pulido catiónico para eliminar adicionalmente las impurezas, (g) concentración y el intercambio de tampón del eluato de la columna de pulido, (h) seguido de filtración para la reducción de carga biológica y el (i) llenado de viales El proceso APF de tres columnas de la invención comprendía una etapa de cromatografía de interacción hidrofóbica después de la etapa de cromatografía catiónica.

En un ejemplo, el volumen de fermentación es de 20 l, el tiempo de proceso total para todas las etapas fue de sólo 4 a 6 días, y se obtuvo un alto rendimiento de neurotoxina botulínica.

A continuación, se proporcionan más detalles de una realización particular dentro del alcance de nuestra invención. La etapa de fermentación se llevó a cabo en medio APF utilizando un fermentador de acero inoxidable de 30 L.

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