ES2374822T3

ES2374822T3 - Ensayo de selección de toxinas botul�?nicas.

Info

Publication number: ES2374822T3
Application number: ES05724048T
Authority: ES
Inventors: Ester Fernandez-Salas; Patton E. Gary; Kei Roger Aoki
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2004-02-24
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2025-02-23
Also published as: DK1718756T3; CA2558758A1; AU2009202136B2; US7645570B2; AU2005216547B2; WO2005082096A2; US7598027B2; CA2558758C; JP4970057B2; EP1718756B1; ATE533853T1; US20090317839A1; AU2009202136A1; US20080003240A1; US8257914B2; JP2007526770A; AU2005216547A1; EP1718756A4; WO2005082096A3; US20080182799A1

Abstract

Procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

Description

Ensayo de selección de toxinas botulínicas

La presente solicitud de patente reivindica la prioridad, de acuerdo con el título 35, artículo 119(e), del Código de Estados Unidos (U.S.C.), para la solicitud provisional con el número de serie 60/547.591, presentado el 24 de febrero de 2004.

Las propiedades miorrelajantes de las toxinas botulínicas (BoNT) se han explotado en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas; véase, por ejemplo, William J. Lipham, COSMETIC AND CLINICAL APPLICATIONS OF BOTULINUM TOXIN (Slack, Inc., 2004). Por ejemplo, se han propuesto terapias con BoNT para tratar distonia: véase, por ejemplo Kei Roger Aoki y col., Method for treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.319.505 (20 de noviembre, 2001); dolor: véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.464.986 (15 de octubre, 2002); lesiones musculares: véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.423.319 (23 de julio, 2002); enfermedades cardiovasculares: veáse, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxins, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2003/0185860 (2 de octubre, 2003); trastornos neuropsiquiátricos: véase, por ejemplo, Steven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2003/0211121 (13 de noviembre, 2003); lumbalgia: véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2004/0037852 (26 de febrero, 2004); así como otros trastornos neuromusculares: véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Multiple Botulinum Toxins for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2001/0021695 (13 de septiembre, 2001); Kei Roger Auki y col., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2002/0010138 (24 de enero, 2002); Kei Roger Auki y col., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and Associated Pain, publicación de patente de Estados Unidos Nº 2004/0013692 (22 de enero, 2004). Se han extendido otros usos propuestos de BoNT como neuromoduladores biofarmacéuticos, cubriendo una amplia variedad de tratamientos dirigidos a determinados trastornos que carecen de una base neuromuscular. Por ejemplo, los efectos sobre el sistema nervioso autónomo han permitido desarrollar la terapia con el serotipo A de la toxina botulínica (BoNT/A) para el tratamiento de hiperhidrosis o sudoración axilar, e informes indican que la BoNT/A puede ser un tratamiento eficaz para dolor y tensión miofacial, apoplejía, lesión cerebral traumática, parálisis cerebral, trastornos de motilidad grastrointestinal, incontinencia urinaria, cáncer y migrañas. Por último, se conocen ampliamente aplicaciones cosméticas o terapéuticas de otro tipo. De hecho, se prevé que el uso esperado de la BoNT tanto en tratamientos terapéuticos como cosméticos de seres humanos se extenderá a un abanico cada vez más amplio de enfermedades y alimentos que pueden beneficiarse de las propiedades miorrelajantes de estas toxinas.

El uso clínico y terapéutico creciente de toxinas botulínicas precisa de la industria farmacéutica para que realice ensayos precisos de la actividad de BoNT con el fin de, por ejemplo, asegurar formulaciones farmacéuticas precisas y llevar un seguimiento de las normas de control de calidad establecidos. Además, debido al riesgo potencial asociado a cantidades pequeñas de BoNT en productos alimentarios, la industria alimenticia precisa de ensayos de actividad de BoNT, por ejemplo, para validar procedimientos de envasado de nuevos alimentos y para asegurar la inocuidad de los alimentos. Adicionalmente, los ensayos sobre la actividad de BoNT son útiles para identificar moduladores de la actividad de BoNT, por ejemplo, moduladores que reducen la actividad de BoNT que pueden ser útiles como antídotos de tóxinas y moduladores que aumentan la actividad de BoNT que pueden ser útiles para crear formulaciones farmacéuticas más potentes o de mayor duración. La presente invención proporciona ensayos de BoNT novedosos para detectar la presencia de actividad de una BoNT útiles para diversas industrias, tales como, por ejemplo, la industria farmacéutica y la industria alimentaria, y también proporciona ventajas relacionadas.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1: muestra un esquema del paradigma actual del mecanismo de intoxicación con BoNT/A. Este proceso de intoxicación puede describirse como un proceso que comprende cuatro etapas: 1) unión al receptor, en la que la BoNT/A se une a un sistema receptor de BoNT/A iniciando el proceso de intoxicación; 2) internalización del complejo, en la que después de la unión de BoNT/A, se produce la endocitosis de una vesícula que contiene el complejo sistema toxina/receptor en la célula; 3) traslocación de la cadena ligera, en la que se piensa que tienen lugar multiples eventos, incluidos cambios en el pH externo de la vesícula, formación de un poro canal que comprende el dominio HN de la cadena pesada de BoNT/A, separación de la cadena ligera de BoNT/A de la cadena pesada, activación enzimática de la cadena ligera y liberación de la cadena ligera activada 4) modificación de la diana enzimática, en la que la cadena ligera activada de BoNT/A escinde proteolíticamente sus sustratos de SNARE diana, tales como, por ejemplo, SNAP-25.

FIG. 2: muestra un esquema de un FGFR3 y los exones empalmados alternativamente que dan como resultado FGFR3IIIb y FGFR3IIIc La parte superior del diagrama muestra un dibujo generalizado de un FGFR3. El dominio extracelular comprende un péptido señalizador (cuadro etiquetado como SP), tres dominios similares a Ig (bucles etiquetados como IgI, IgII e IgIII) y una caja de ácido (cuadro etiquetado como ácido). Una única región que abarca la membrana comprende el dominio transmembrana (cuadro etiquetado como TM). La porción citoplásmica del receptor comprende el dominio tirosina quinasa. El diagrama del medio muestra un dibujo generalizado de los exones que codifican una isoforma de FGFR3IIIb, en el que el exón 9 se separa del tránscrito primario durante el procesamiento. El diagrama inferior muestra un dibujo generalizado de los exones que codifican una isoforma de FGFR3IIIc, en el que el exón 8 se separa del tránscrito primario durante el procesamiento.

FIG. 3: muestra los resultados de electroporación de PURE-A en células HIT-T15. La figura 3 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de liberación de insulina. El gráfico indica que la adición de glucosa a una concentración 25 mM induce la secreción de insulina por parte de células no tratadas (control) y las células sometidas a electroporación sin la adicion de PURE-A (electroporación No PURE-A). No obstante, las células HIT-TI5 en las que se introdujo PURE-A (electroporación PURE-A) mostraron una disminución en la secreción de insulina que indicaba que estas células no eran sensibles a la inducción de secreción de insulina. La figura 3 muestra el resultado de un ensayo de escisión de SNAP-25. El análisis de inmunotransferencia (Western) identificó la presencia de un producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A en células tratadas con PURE-A (electroporación PURE-A), pero no en cada control (control y electroporación No PURE-A), con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizó con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A.

FIG. 4: muestra los efectos de electroporación de células HIT-T15 con respecto al tiempo. La figura 4a muestra los resultados de un ensayo de inhibición de liberación de insulina que demuestran que la presencia de la toxina retrasa el crecimiento de células HIT-T15 en comparación con los controles, pero las células tratadas con toxina fueron capaces de replicarse normalmente después de un periodo de recuperación. La figura 4b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que demuestra que la escisión de SNAP-25 se detectó en todos los puntos temporales analizados cuando se introdujo PURE-A en las células, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizó con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A.

FIG. 5: muestra células HIT-T15 transformadas con una biblioteca de ADNc cerebral humano y seleccionadas usando perlas magnéticas a las que se ha unido BoNT/A. Las colonias individuales son visibles en la placa y están rodeadas por perlas magnéticas.

FIG. 6: muestra los resultados de un ensayo de liberación de insulina a partir de células HIT-T15 que contenían el receptor de BONT/A putativo. Las células se expusieron a PURE-A 1 nM y se analizaron para evaluar la inhibición de la liberación de insulina después de estimulación con glucosa.

FIG. 7: muestra el análisis de dos aislados de células HIT-T15 C6 y C7. La figura 7a muestra la reducción de la liberación de insulina en transformantes HIT-T15 representativos C6 y C7 después de la incubación con BONT/A. La figura 7b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que demuestra que la escisión de SNAP-25 se detectó en clones C6 y C7 incubados con BoNT/A, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizó con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A.

FIG. 8: muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que identifica células con alta afinidad de captación por una toxina clostridial. La figura 8a muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) usado para identificar células capaces de captar BoNT/A. La mancha muestra cinco líneas celulares tratadas con una concentración 1 nM de PURE-A durante la noche, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizaron con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A. La figura 8b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) usado para evaluar el tiempo necesario para la captación de BoNT/A. Las manchas muestran bien células Neuro-2A o células SH-SY5Y tratadas con una concentración 1 nM de PURE-A durante varios periodos de tiempo, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizaron con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A. La figura 8c muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) usado para evaluar el intervalo de concentración necesario para la captación de BoNT/A. Las manchas muestran células Neuro-2A tratadas con un intervalo de concentraciones de PURE-A durante la noche, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizaron con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A.

FIG. 9: muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que evalúa los efectos de tratamientos con gangliósido usados para aumentar la captación de una toxina botulínica. La figura 9a muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que evalúa los efectos del tratamiento con gangliósido sobre la captación de BoNT/A.. La mancha muestra células Neuro-2A tratadas sin o con 25 µg/ml de GT1b (-o +) y que se expusieron durante la noche a tres concentraciones diferentes de BoNT/A (12,5 pM, 25 pM o 50 pM), con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizó con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A. La figura 9b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que evalúan los efectos del tratamiento con ganglósidos sobre la captación de BoNT/E. La mancha muestra células Neuro-2A tratadas con, en cada caso, 25 µg/ml de GT1b, GQ1b GD1a, GD1b o GD3 y expuestas durante aproximadamente 5 horas a una concentración 14 nM de BoNT/E bicatenario, con cantidades iguales de proteína cargadas por cada carril y analizadas con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD, Estados Unidos) que detecta el sustrato de SNAP25206 no escindido y el producto de escisión de SNAP-25180 de BoNT/E.

FIG. 10: muestra los resultados de un experimento de reticulación en células Neuro-2A usando toxina BoNT/ASBED. La figura 10a muestra el aislamiento de un complejo de aproximadamente 250 kDa a partir de células Neuro2A que contienen la nuerotoxina de 150 kDa reticulada con el receptor BONT/A putativo. Las bandas se visualizaron con tinción de plata. La figura 10b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) para identificar un receptor de BoNT/A. Las manchas muestran la presencia de una banda única correspondiente a FGFR3 de 97 kDa (primer panel) y dos bandas que corresponden a la holotoxina BoNT/A de 150 kDa y la cadena pesada de BoNT/A de 100 kDa (segundo panel), con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizaron con un anticuerpo que detecta bien FGFR3 o bien BoNT/A.

FIG. 11: muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) usado para determinar la presencia de FGFR en cinco líneas celulares diferentes. Sólo los anticuerpos que se unen selectivamente a FGFR3 detectaron bandas que se correlacionaron con líneas celulares que contenían receptor de BoNT/A.

FIG. 12: muestra los rsultados de un experimento de competición de receptores en células Neuro-2a usando ligandos PURE-A y FGF. Un análisis de inmunotransferencia (Western) muestra que FGF1 y FGF2 compiten eficazmente con BoNT/A por la unión al receptor de BoNT/A, con cantidades iguales de proteína cargadas por cada carril y se analizaron con un anticuerpo (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD, Estados Unidos) que detecta el sustrato de SNAP-25206 no escindido y el producto de escisión de SNAP-25180 de BoNT/E. La aparición del sustrato de SNAP-25206 no escindido se detectó cuando había presencia de una concentración tan pequeña como 1nM de ligando FGF y era claramente visible cuando se usó había presencia de una concentración 5 nM de ligando FGF. No hubo niveles detectables del producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A en tratamientos con ligando FGF a una concentración 200 mM.

FIG. 13: muestra los resultados de los estudios de fosforilación de FGFR3 en células Neuro-2A. La figura 13 a muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que indica la presencia de FGFR3 fosforilado después de una exposición a FGF2 o BoNT/A. La mancha muestra células Neuro-2A tratadas bien con FGF2 5 nM o bien PURE-A 5 nM durante varios periodos de tiempo, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril y se analizaron con un anticuerpo que detecta FGFR3. La figura 13b muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que indica al reducción de FGFR3 fosforilado cuando se expone a cantidades crecientes de DMBI. La mancha muestra células Neuro-2A tratadas con FGF2 5 nM durante 10 minutos, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril y se analizaron con un anticuerpo que detecta FGFR3 fosforilado. La figura 13c muestra un análisis de inmunotransferencia (Western) que indica la reducción del producto de escisión de SNAP-25197 cuando se expone a

cantidades crecientes de DMBI. Las manchas muestran en cada caso células Neuro-2A tratadas con una concentración 5 nM de PURE-A durante 10 minutos, con cantidades iguales de proteína cargadas por carril, y se analizaron con un anticuerpo que detecta el producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la identificación de un receptor de superficie celular al que se une selectivamente BoNT/A como primera etapa para la intoxicación selectiva de una neurona. La presente memoria descriptiva, en parte, divulga que el receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR3) es útil como receptor de BoNT, tal como, por ejemplo, un receptor de BoNT/A. Además, la presente divulgación identifica gangliósidos específicos que facilitan la unión de una BoNT a un receptor de BoNT y la internalización de estas toxinas dentro de la célula neuronal, tal como, por ejemplo, una unión potenciada de BoNT/A por un receptor de BoNT/A usando un gangliósido como GT1b; y una unión potenciada de BoNT/E por un receptor de BoNT/E usando un gangliósido como GQ1b, GD1a, GD1b o GD3.

La presente invención proporciona procedimientos novedosos para detectar la presencia o ausencia de una BoNT/A activa. Los procedimientos novedosos divulgados en la presente memoria descriptiva reducen la necesidad de estudios de toxicidad basados en animales, pero sirven, no obstante, para analizar múltiples funciones de las toxinas, es decir, la unión y la captación celular de la toxina, la translocación en el citosol celular y la actividad de proteasa. Tal como se debate más adelante, los procedimientos nuevos de la presente divulgación pueden usarse para analizar muestras en bruto y heterogéneas, así como toxinas bicatenarias muy purificadas y productos de toxinas formulados y, además, son susceptibles de automatizar formatos de ensayo de alto rendimiento.

Algunos aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para detectar la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene un FGFR3 exógeno, en los que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula que se ha puesto en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. Otros aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para detectar la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene de forma transitoria un FGFR3 exógeno, en los que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula que se ha puesto en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. Otros aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para detectar la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula que se ha puesto en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

Un aspecto de referencia proporciona procedimientos de reducción de la actividad de BoNT/A en un ser humano que comprenden administrar a dicho ser humano una composición farmacéutica que comprende una molécula que se une selectivamente a un FGFR3, en los que dicha unión selectiva reduce la capacidad de BoNT/A de unirse a dicho FGFR3.

Otro aspecto de la presente invención proporciona procedimientos para seleccionar una molécula capaz de competir con BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A poniendo en contacto dicha muestra con una composición que comprende un FGFR3 y detectando si dicha molécula se une selectivamente a dicho FGFR3, en los que la unión selectiva de dicha molécula a dicho FGFR3 indica que dicha molécula es capaz de competir con BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A y en los que si dicha molécula es BoNT/A, dichos procedimientos no comprenden un ensayo de DL50.

Un aspecto de referencia proporciona procedimientos de comercialización de una nuerotoxina capaz de unirse selectivamente al mismo FGFR3 que BoNT/A que comprenden obtener la aprobación de comercialización de una autoridad reguladora gubernamental o regional para una neurotoxina terapeútica, en los que dicha neurotoxina se analiza para evaluar su unión selectiva a una célula que comprende poner en contacto dicha neurotoxina con una composición que comprende un FGFR3 y detectar si dicha neurotoxina se une selectivamente a dicho FGFR3, en los que la unión selectiva de dicha neurotoxina a dicho FGFR3 indica que dicha neurotoxina es capaz de unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A y en los que si dicha molécula es BoNT/A, dichos procedimientos no comprenden un ensayo de DL50; envasar dicha neurotoxina para su venta de un modo consecuente con los requerimientos de dicha autoridad reguladora y vender dicha neurotoxina.

Un aspecto de referencia proporciona procedimientos de comercialización de una neurotoxina capaz de unirse selectivamente al mismo FGFR3 que BoNT/A que comprenden obtener la aprobación de comercialización de una autoridad reguladora gubernamental o regional para una neurotoxina terapeútica, en los que dicha neurotoxina se analiza para evaluar su unión selectiva a una célula que comprende poner en contacto dicha neurotoxina con una célula que contiene un FGFR3 exógeno en los que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con relación a una célula control, siendo indicativo de la actividad de BoNT/A una diferencia en la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control; envasar dicha neurotoxina para su venta de un modo consecuente con los requerimientos de dicha autoridad reguladora y vender dicha neurotoxina.

Las BoNT se traducen cada una como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que subsiguientemente se escinde mediante escisión proteolítica dentro de un bucle disulfuro por proteasas bacterianas

o hísticas. Este procesamiento postraduccional proporciona una molécula bicatenaria que comprende una cadena ligera (LC) de a proximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa que están unidas mediante un enlace disulfuro sencillo e interacciones no covalentes. Cada una de las moléculas bicatenarias maduras comprende tres dominios de distinta funcionalidad: 1) un dominio enzimático localizado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad de endopeptidasa dependiente de cinc que está dirigida específicamente a los componentes del núcleo del aparato de liberación de nuerotransmisores; 2) un dominio de translocación incluido dentro de la mitad amino-terminal de la HC (HN) que facilita la liberación de la toxina desde las vesículas intracelulares al citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión que se encuentra en la mitad carboxi-terminal de la HC (HC) que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina al complejo receptor localizado en la superficie de la célula diana.

Tanto la unión, como la translocación y la actividad enzimática de estos tres dominios funcionales son necesarias para la toxicidad. Aunque todos los detalles de este proceso no son aún conocidos con precisión, el mecanismo de intoxicación celular general por el que las BoNT se introducen en una neurona e inhiben la liberación de neurotransmisores es similar, independientemente del tipo. Aunque los solicitantes no desean estar limitados por la descripción siguiente, el mecanismo de intoxicación puede describirse como un mecanismo de cuatro etapas: 1) unión al receptor, 2) internalización del complejo 3) translocación de la cadena ligera y 4) modificación de la diana enzimática (véase la figura 1). El proceso se inicia cuando el dominio Hc de una BoNT de une a un complejo receptor específico de BoNT localizado en la superficie de la membrana plasmática de una célula diana. Se piensa que la especificidad de unión de un complejo receptor se logra, en parte, mediante combinaciones específicas de gangliósidos y receptores proteicos que parece que comprenden de forma diferente cada complejo receptor de BoNT/A. Una vez unido, los complejos BoNT/receptor se internalizan mediante endocitosis y las vesículas internalizadas se clasifican para rutas intracelulares específicas. La etapa de translocación parece que se desencadena mediante la acidificación del compartimiento de la vesícula. Este proceso parece que inicia dos reordenamientos estructuras dependientes del pH importantes que aumentan la hidrofobicidad y promueven la actividad enzimática de la toxina. Una vez activada, la endopeptidasa de cadena ligera de la toxina se libera desde la vesícula intracelular al citosol, en el que se dirige específicamente a de uno a tres componentes del núcleo conocidos del aparato de liberación de neurotransmisores. Tres de estas proteínas del núcleo, la proteína de membrana asociada a la vesícula (VAMP)/sinaptobrevina, la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa (SNAP25) y la sintaxina, son necesarias para el anclaje a la vesícula sináptica y la fusión en el nervio terminal y constituyen miembros de la familia del receptor de proteína de unión del factor sensible a N-etilmaleimida soluble (SNARE). La proteolisis selectiva de SNARE sinápticas tiene importancia en el bloqueo total de liberación de neurotransmisores provocado por toxinas clostridiales in vivo. Las dianas de proteínas SNARE de toxinas clostridiales son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neuronales, en estas células, así como neuronas, la actividad de la peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis, véase, por ejemplo, Yann Humeau y col., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton y col., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); M. Zouhair Atassi, Basic and Therapeutic Aspects of Botulinum and Tetanus Toxins, (Dirk W. Dressler y Joseph J. Jankovic ed., 2003); Giovanna Lalli y col., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003).

Las estructuras cristalinas tridimensionales de BoNT/A indican que los tres dominios funcionales de la toxina son estructuralmente distintos; veáse, por ejemplo, Humeau y col., supra, (2000), Turton y col, supra, (2002) y Lalli y col., supra, (2003). El motivo de consenso HEXXH de la cadena ligera forma el bolsillo de unión al cinc tetraédrico del sitio catalítico localizado en una hendidura profunda de la superficie de la proteína que es accesible por un canal. A este motivo de unión a cinc conservado se une al menos un átomo de cinc necesario para su función catalítica. La

estructura de los dominios HN y Hc consta principalmente de topologías de lámina □que están unidas por una hélice

□ única. El dominio HN comprende un plegamiento de rollo de gelatina de barrera □, que semeja el resto de unión a carbohidrato que se encuentra en lectinas, sugiriendo que este dominio puede reconocer moléculas que contienen oligosacáridos y tener un papel en el ordenamiento intracelular. Además de su similaridad estructural general con lectinas, el dominio HN también contiene dos características estructurales distintas que sugieren funciones. Primeramente, el dominio HN contiene un par de hélices anfifáticas largas que semejan el motivo de hélice superenrollada que se encuentra en algunas proteínas víricas. En virus, estas hélices favorecen la fusión de la membrana vírica a la membrana celular del huésped, sugiriendo que la región de hélice superenrollada puede favorecer la inserción del dominio HN en la membrana de una vesícula intracelular. En segundo lugar, un bucle largo denominado “cinturón de translocación” envuelve una hendidura cargada negativamente grande de la cadena ligera que bloquea el acceso del átomo de cinc al bolsillo de unión catalítica del sitio activo. El dominio Hc contiene un sitio de unión a gangliósido y un motivo de cinco restos de unión a gangliósido. Estas regiones adoptan una estructura de

plegamiento de tres hojas en □ modificada que forma cuatro regiones de unión a carbohidrato distintas que se cree que median en la unión a moléculas aceptoras específicas que contienen carbohidrato de la superficie celular. De acuerdo con esta función, el domino Hc muestra la mayor divergencia de secuencia entre toxinas clostridiales que puede considerarse para las distintas propiedades de unión y esquemas de selección de TeNT y BoNT. El dominio HC se inclina lejos del dominio HN exponiendo los bucles de superficie y haciéndolos accesibles para la unión. Parece que no tiene lugar ningún contacto entre la cadena ligera y el dominio Hc. El extremo N de la región Hc presenta una arquitectura de rollo de gelatina relacionada con la de las eslectinas, una familia de proteínas de unión a carbohidrato. Por el contrario, el extremo C de Hc está en una conformación de tres hojas seudo-triple que

presenta similaridad estructural con las interleucinas-1□ y 1□ no relacionadas secuncialmente, inhibidores de tripsina de tipo Kunitz, así como con los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Estas proteínas, en su mayor parte proteínas □están implicadas en interacciones proteína-proteína.

Parece que los gangliósidos de la superficie cellular son parte del sistema receptor para la BoNT/A y parece que participan en la unión de la toxina a su receptor de la BoNT/A. Aunque la unión de toxinas no es estrictamente dependiente de la presencia de gangliósidos, la presencia de gangliósidos específicos parece necesaria para una unión de alta afinidad. En particular, se ha observado que los BoNT interactúan in vitro e in vivo con polisialogangliósidos, especialmente los de la serie G1b (GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b), véase, por ejemplo, Jane L. Halpern y Elaine A. Neale, Neurospecific binding, internalization, and retrograde axonal transport, 195 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 221-241 (1995). La preincubación de la toxina con estos gangliósidos protege la unión neuromuscular (NMJ) de ratones de la toxicidad producida por BoNT. Los sitios de unión a BoNT de alta afinidad sensibles a tripsina se encontraron en sinaptosomas aislados, véase, por ejemplo R. S. Williams y col., Radioiodination of botulinum neurotoxin type A with retention of biological activity and its binding to brain synaptosomes. 131(2) Eur. J. Biochem. 1437-1445 (1983). Debido a que las lectinas con alta afinidad por el ácido siálico antagonizan la unión de BoNT, sus receptores proteicos pueden ser glucoproteínas. Los receptores para BoNT los dirigirían a vesículas ácidas que permiten la translocación de la LC en el citosol de la neurona. La secuencia de aminoácidos en el extremo C de Hc está poco conservada entre diferentes neurotoxinas clostridiales y experimentos de competición han demostrado que serotipos de BoNT diferentes se unen a receptores proteicos diferentes en la superficie de células neuronales. Por lo tanto, este análisis es consecuente con la hipótesis de que las nuerotoxinas BoNT se unen a sistemas receptores que comprenden al menos dos componentes; un componente proteico y un componente carbohidrato.

Sobre la base de estos hallazgos y tal como da a conocer la presente divulgación, los solicitantes han descubierto que células que expresan el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 3 (FGFR3) pueden unirse a BoNT/A. La internalización de la toxina puede seguirse cuando las líneas celulares están expuestas a la toxina. Además, la internalización de BoNT/A se inhibe de un modo dependiente de la dosis cuando se añade a concentraciones crecientes FGF, tal como, por ejemplo FGF1, FGF2, FGF4, FGF8 y FGF9. Las células analizadas por los solicitantes que no mostraron el receptor de FGFR3 fueron incapaces de internalizar la toxina, aunque cuando se sometieron a electroporación en presencia de BoNT/A, la escisión intracelular de SNAP-25 podía detectarse, indicando que la actividad de endopeptidas de la toxina permanecía intacta, y que las células seguían siendo susceptibles a la

5 endopeptidasa. Además, los aplicantes han hallado que el pretratamiento con el polisialogangliósido GT1b aumenta la captación celular de BoNT/A.

Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) participan en muchos procesos de desarrollo, diferenciación y crecimiento y de reparación de células mediante las rutas de señalización combinatorias complejas. Actualmente, al menos se conocen 23 ligandos (FGF1-23) para señalizar a través de una familia de cinco receptores FGF de tirosina 10 quinasa transmembranales (FGFR1-4). La identidad de secuencia de aminoácidos está muy conservada entre miembros de la familia FGFR y cada uno comparte una organización estructural característica. La porción extracelular de FGFR comprende un péptido señalizador hidrófobo amino-terminal, tres dominios similares a Ig (IgI, IgII y IgIII) y un dominio de caja de ácido de aproximadamente ocho restos ácidos, seguidos de un dominio hidrófobo transmembrana único que, a su vez, está seguido de un dominio tirosina quinasa intracelular (véase la figura 2). La

15 afinidad de FGFR por sus ligandos es muy diversa con distintas afinidades por cada miembro de la familia de factores de crecimiento; véase, por ejemplo, C. J. Powers y col., Fibroblast growth factors, their receptors and signaling 7(3)Endocr. Relat. Cancer. 165-197 (2000). La tabla 1 enumera algunas relaciones de señalización FGFFGFR conocidas de diversos FGF y sus FGFR.

TABLA 1. Variantes de FGFR

Variantes: FGFR1 IIIb IIIc FGFR2 IIIb IIIc FGFR3 IIIb IIIc FGFR4 FGFR4

Ligandos: FGF-1 FGF-1 FGF-1 FGF-1 FGF-1 FGF-1 FGF-1 FGF-1

FGF-2 FGF-2: FGF-3 FGF-2 FGF-9 FGF-2 FGF-2 FGF-2

FGF-3 FGF-4: FGF-7 FGF-4 FGF-4 FGF-4

FGF-8 FGF-5: FGF-10 FGF-5 FGF-8 FGF-6

FGF-10 FGF-6: FGF-6 FGF-9 FGF-8

FGF-8
FGF-8: FGF-9

FGF-17: FGF-9

FGF-17

Tejidos: Cerebro, hueso, riñón, piel, pulmón, corazón, músculo, neurona Cerebro, riñón, piel, pulmón, hígado, células gliales Cerebro, SNC, riñón, piel, pulmón, testículo Pulmón, hígado, riñón Cerebro, piel pulmón, testículo

20 Tabla 1-Variantes de FGFR y afinidades de ligandos. Variantes de FGFR, ligandos asociados y distribución en tejidos, véase, por ejemplo, Powers y col., anteriormente, (2000) y Reuss y von Bohlen und Halbach, anteriormente, (2003).

La diversidad en la señalización de FGF más allá de los cinco receptores se logra en parte por la generación de variantes de ayuste alternativas que codifican distintas isoformas de receptores; véase, por ejemplo, Bernhard 25 Reuss y Oliver von Bohlen und Halbach, Fibroblast growth factors and their receptors in the central nervous system, 313(2) Cell Tissue Res. 139-157 (2003). La región proteica que parece que tiene la mayor influencia sobre la especificad de unión a ligandos es una porción del dominio IgIII, para el que se han identificado las isoformas codificadas por tres variantes de ayuste diferentes. Estas tres isoformas, denominadas IgIIIa, IgIIIb e IgIIIc, tienen afinidades de unión relativas por miembros diferentes de la familia FGFR. El ayuste alternativo en el dominio de

30 unión a ligando FGFR, denominado a y b, genera isoformas de receptor adicionales con afinidades por ligandos nuevos. Las isoformas para IgIIIa, IgIIIb e IgIIIc se han identificado tanto para FGFR1 como para FGFR2. Hasta ahora no se ha informado de la isoforma IgIIIa de FGFR3 ni de las isoformas IgIIIa e IgIIIb de FGFR4 y FGFR5.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el FGFR3 existe comúnmente en dos isoformas, FGFR3IIIc y FGFR3IIIb, que surgen siguiendo el ayuste alternativo del tránscrito principal en el que se omite bien el exón 8 o bien el exón 9, 35 respectivamente (véase la figura 2). No obstante, existen isoformas adicionales. Por ejemplo, se ha descrito una isoforma de FGFR3 que carece de caja ácida; véase, por ejemplo, Akio Shimizu y col., A novel alternatively spliced fibroblast growth factor receptor 3 isoform lacking the acid box domain is expressed during chondrogenic differentiation of ATDC5 cells, 276(14) J. Biol. Chem. 11031-11040 (2001). En otro ejemplo, se identificó recientemente una isoforma nueva potencialmente citoplásmica, denominada FGFR3S, en la que los exones 8, 9 y

40 10 están desempalmados creando un FGFR3 que carece de la segunda mitad de IgIIIc y del dominio transmembrana; véase, por ejemplo, L-M. Sturla y col., FGFR3IIIS: a novel soluble FGFR3 spliced variant that modulates growth is frequently expressed in tumour cells, 89(7) Br. J. Cancer 1276-1284 (2003).

Algunos aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A 5 de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En una realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con 10 dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otra realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de

15 BoNT/A.

Tal como se usa en el presente documento "serotipo A de toxina botulínica" es sinónimo de "BoNT/A," "tipo A," o terminología similar que se refiera de forma no ambigua a la nuerotoxina Clostridium botulinum de tipo A, significa cualquiera de entre una serie de neurotoxinas polipeptídicas y derivados de las mismas que pueden purificarse a partir de cepas de serotipo A de Clostridium botulinum y que comparten FGFR3 como receptor de superficie celular.

20 Dichas neurotoxinas incluyen las que se encuentran en, o que se corresponden con las cepas y números de acceso enumerados en, la tabla 2.

TABLA 2

Cepa: Nº de acceso

CL138: AAQ16535

137: AAQ16534

129: AAQ16533

13: AAQ16532

42N: AAQ16531

Hall A-hyper: AAM75961

667Ab: CAA61124

NCTC 2916: CAA36289

Allergan-Hall A: AAQ06331

62A: AAA23262

Kyoto-F: CAA51824

NIH NCTC 7272 7103-H tipo A: BAA11051

Kumgo: AAO21363

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "recepctor del factor de crecimiento de fibroblastos 3" es sinónimo de "FGFR3" y significa un péptido, o peptidomimético de, FGFR3 que se une a BoNT/A de un modo tal que 25 facilite una respuesta por intoxicación con BoNT/A. Los FGFR3 útiles en la presente invención abarcan, sin suponer limitación, FGFR3 natural, variantes de FGFR3 de origen natural, variantes de FGFR3 no naturales, tales como, por ejemplo, variantes producidas por ingeniería genética mediante mutagénesis aleatoria o diseño racional, y fragmentos activos derivados de FGFR3. Como ejemplo no limitantes, un FGFR3 humano, variantes de FGFR3 humano de origen natural, variantes de FGFR3 humano no naturales y fragmentos de FGFR3 humano que 30 mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante, un FGFR3 bovino, variantes de FGFR3 bovino de origen natural, variantes de FGFR3 bovino no naturales y fragmentos de FGFR3 bovino que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante, un FGFR3 35 de rata, variantes de FGFR3 de rata de origen natural, variantes de FGFR3 de rata no naturales y fragmentos de

FGFR3 de rata que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante más, un FGFR3 de ratón, variantes de FGFR3 de ratón de origen natural, variantes de FGFR3 de ratón no naturales y fragmentos de FGFR3 de ratón que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante, un FGFR3 de pollo, variantes de FGFR3 de pollo de origen natural, variantes de FGFR3 de pollo no naturales y fragmentos de FGFR3 de pollo que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante, un FGFR3 de rana, variantes de FGFR3 de rana de origen natural, variantes de FGFR3 de rana no naturales y fragmentos de FGFR3 de rana que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante, un FGFR3 de tritón, variantes de FGFR3 de tritón de origen natural, variantes de FGFR3 de tritón no naturales y fragmentos de FGFR3 de tritón que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. En otro ejemplo no limitante, un FGFR3 de pez cebra, variantes de FGFR3 de pez cebra de origen natural, variantes de FGFR3 de pez cebra no naturales y fragmentos de FGFR3 de pez cebra que mantienen la capacidad de unirse selectivamente a BoNT/A y median el proceso de intoxicación, pueden ser útiles como receptores de BoNT/A en aspectos de la presente invención. Se entiende también que ambas moléculas de ácido nucleico, ADN y ARN, que codifican un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva y moléculas peptídicas o peptidomiméticos que comprenden un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva son útiles en aspectos de la presente invención. SEC ID N.º 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 y 27 divulgan moléculas de ácido nucleico que codifican representantes de FGFR3 útiles en aspectos de la presente invención, mientras que SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 y 28 divulgan moléculas peptídicas representantes de FGFR3 útiles en aspectos de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término "peptidomimético" se usa de forma amplia para referirse a moléculas similares a péptidos que se unen selectivamente a BoNT/A como el receptor de BoNT/A peptídico sobre el que se basan estructuralmente. Dichos peptidomiméticos incluyen péptidos químicamente modificados, moléculas similares a péptidos que contienen aminoácidos de origen no natural y peptoides, que son moléculas similares a péptidos que son el resultado del ensamble oligomérico de glicinas N-sustituidas , y que se unen selectivamente a BoNT/A como el sustrato peptídico del que derivan los peptidomiméticos; véase, por ejemplo, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, en "Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol. 1 (ed. M.E. Wolff; John Wiley y Sons, 1995), páginas 803-861).

Se conocen en la técnica una variedad de peptidomiméticos, incluidos, por ejemplo, moléculas similares a péptidos que contienen un aminoácido constreñido, un componente no peptídico que imita la estructura secundaria peptídica

o un isóstero de enlace amida. Un peptidomimético que contiene un aminoácido de origen no natural constreñido puede incluir, por ejemplo, un aminoácido □-metilado; una □,□-dialquil-glicina o ácido □-aminocicloalcano carboxílico; un aminoácido N□-C□ ciclado; un aminoácido N□-metilado; un ácido G o □-amino cicloalcano carboxílico; un aminoácido □,□-insturado; un □,□-dimetil o □-metil aminoácido; un 2,3-metano aminoácido G-sustituido; un aminoácido NC□ o C□-C□ ciclado; o una prolina sustituida u otro mimético de aminoácido. Además, un peptidomimético que imita la estructura secundaria peptídica puede contener, por ejemplo, un imitador del giro □ no

peptídico; imitador de giro □; imitador de la estructura de lámina □; o imitador de la estructura helicoidal, cada uno de los cuales es bien conocido en la técnica. Un péptidomimético también puede ser una molécula similar a péptido que contiene, por ejemplo, un isóstero de enlace amida tal como una modificación retro-inversa; enlace amida reducido; enlaces metilentioéter o metilensulfóxido; enlace metilenéter; enlace etileno; enlace tioamida; enlace transolefínico o fluroolefínico; anillo de tetrazol 1,5-disustituido; enlace cetometileno o fluorocetometileno u otro isóstero de amida. Un experto en la técnica entiende que estos y otros peptidomiméticos están incluidos dentro del significado del término "peptidomimético" tal como se usa en el presente documento.

De este modo, en algunos aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIb humano que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 2, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 2, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 2, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 2, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 2 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 2. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIb humano que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 2.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIc humano que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 4, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 4, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 4, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 4, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 4 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 4. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIc humano que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 4.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIS humano que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 6, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 6, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 6, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 6, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 6 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 6. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIS humano que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 6.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIc bovino que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 8, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 8, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 8, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 8, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 8 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 8. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIc bovino que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 8.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIc de ratón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 10, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 10, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 10, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 10, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 10 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 10. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIc de ratón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 10.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIc de ratón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 12, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 12, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 12, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 12, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 12 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 12. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIc de ratón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 12.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3-delAcid de ratón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 14, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 14, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 14, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 14, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 14 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 14. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3-delAcid de ratón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 14.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIb de rata que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 16, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 16, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 16, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 16, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 16 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 16. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIb de rata que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituiciones aminoacídicas con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 16.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3IIIc de rata que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 18, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 18, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 18, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 18, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 18 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 18. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3IIIc de rata que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituiciones aminoacídicas con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 18.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de pollo que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 20, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 20, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 20, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 20, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 20 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 20. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3 de pollo que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 20.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3-1 de rana que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 22, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 22, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 22, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 22, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 22 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 22. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3 de rana que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 22.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3-2 de rana que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 24, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 24, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 24, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 24, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 24 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 24. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3 de rana que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 24.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de tritón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 26, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 26, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 26, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 26, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 26 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 26. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3 de tritón que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 26.

En otros aspectos de la presente invención, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de pez cebra que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, al menos el 70 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 28, al menos el 75 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 28, al menos el 80 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 28, al menos el 85 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 28, al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 28 o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con el FGFR3 de SEC ID Nº: 28. En otros aspectos de la presente realización, el FGFR3 es un FGFR3 de pez cebra que se une selectivamente a BoNT/A que tiene, por ejemplo, como máximo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos con relación al FGFR3 de SEC ID Nº: 28.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, el uso opcional de polisialogangliósidos, especialmente los de la serie G1b, tales como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b. Las composiciones celulares que comprenden un FGFR3 y un polisialogangliósido pueden aumentar la unión selectiva a BoNT/A con relación a un composición que no contiene un polisialigangliósido. De este modo, en una realización, una composición comprende un FGFR3 y opcionalmente un polisialogangliósido. En algunos aspectos de la presente realización, una composición comprende un FGFR3 y opcionalmente un polisialogangliósido G1b tal como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b

De este modo, en una realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene un FGFR3 exógeno y opcionalmente un polisialogangliósido G1b, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otra realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno y un polisialogangliósido G1b, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otra realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno y un polisialogangliósido G1b, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A que comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “que contiene transitoriamente" significa un FGFR3 que se introduce temporalmente en una célula con el fin de realizar los ensayos divulgados en la presente memoria descriptiva. De este modo, los aspectos de una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 divulgados en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula que contiene un FGFR3 durante, por ejemplo, como máximo aproximadamente cinco días y, como máximo, aproximadamente seis días, como máximo aproximadamente siete días, como máximo aproximadamente ocho días, como máximo aproximadamente nueve días y, como máximo, aproximadamente diez días.

En un aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser codificado por una molécula de ácido nucleico de un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de ave tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de mamífero, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de ave, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de anfibio, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de pez, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

En otro aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de ave tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. De este modo, en una realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En un aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de ave tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno de mamífero, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno de ave, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno de anfibio, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene transitoriamente un FGFR3 exógeno de pez, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A que comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “que contiene de forma estable" significa un FGFR3 que se introduce en una célula y se mantiene durante periodos largos con el fin de realizar los ensayos de la presente memoria descriptiva. Las moléculas de ácido nucleico mantenidas de forma estable abarcan moléculas de ácido nucleico mantenidas de forma estable que son extracromosómicas y se replican de forma autónoma y moléculas de ácido nucleico mantenidas de forma estable que están integradas en el material cromosómico de la célula y se replican de forma no autónoma. De este modo, aspectos de una célula que contiene de forma estable un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula que contiene un FGFR3 durante, por ejemplo, al menos diez días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos cuarente días, al menos 50 días y al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días y al menos cien días. Otros aspectos de una célula que contiene de forma estable un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptive pueden incluir una célula que contiene un FGFR3 durante, por ejemplo, al menos 100 días, al menos 200 días, al menos 300 días, al menos 400 días y al menos 500 días. Otros aspectos más de una célula que contiene de forma estable un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptive pueden incluir una célula que contiene un FGFR3 de forma permanente.

En un aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser codificado por una molécula de ácido nucleico de un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de pájaro tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de mamífero, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de ave, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de anfibio, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento de detección de la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 exógeno de pez, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

En otro aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de ave tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno de mamífero, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno de ave, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En un aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno de anfibio, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A. En otro aspecto de la presente realización, un procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A comprende poner en contacto una muestra con una célula que contiene de forma estable un FGFR3 exógeno de pez, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.

Tal como se ha mencionado anteriormente, una molécula de ácido nucleico puede usarse para expresar un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva. Se considera que puede usarse cualquier procedimiento para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula. Los procedimientos útiles para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula incluyen, sin suponer limitación, procedimientos mediados por fosfato de calcio, DEAD, procedimientos mediados por dextrano, mediados por lípidos, mediados por polibreno, mediados por polilisina, mediados víricamente, microinyección, fusión de protoplastos, biolísticos, electroporación y conjugación a un anticuerpo, gramacidina S, desarrollo vírico artificial u otros vehículos intracelulares tales como TAT; véase, por ejemplo, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, páginas 16.1-16.62 (Sambrook y Russell, ed., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3ª ed. 2001); Alessia Colosimo y col., Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells, 29(2) Biotechniques 314-318, 320-322, 324 (2000); Philip Washbourne y A. Kimberley McAllister, Techniques for gene transfer into neurons, 12(5) Curr. Opin. Neurobiol. 566-573 (2002); y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, páginas 9.16.4-9.16.11 (2000). Un experto en la técnica entiende que la selección de un procedimiento específico para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula dependerá, en parte, de si la célula contendrá transitoriamente un receptor de BoNT/A o si la célula contendrá de forma estable un receptor de BoNT/A.

Tal como se ha mencionado anteriormente, un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva puede introducirse en una célula. Se considra que puede usarse cualquier procedimiento que use un agente sde liberación para introducir un FGFR3 en una célula. Tal como usa en el presente documento, "agente de liberación" significa cualquier molécula que permita o potencie la internalización de un FGFR3 unido covalentemente, unido de forma no covalente o de asociado de cualquier otro modo a la célula. De este modo, la expresión “agente de liberación” abarca, sin suponer limitación, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, moléculas de ácido nucleico, liposomas, lípidos, virus, retrovirus y células que, sin suponer limitación, transportan un sustrato unido covalentemente o de forma no covalente a la membrana celular, al citoplasma celular o al núcleo. Se entiende, además, que la expresión "agente de liberación" abarca moléculas que se internalizan mediante cualquier mecanismo, incluidos agentes de liberación que actúan mediante endocitosis mediada por receptor y los que son independientes de endocitosis mediada por receptor.

Un agente de liberación útil en la invención también puede ser un agente que permita o potencie la captación celular de un FGFR3 unido covalentemente tal como, por ejemplo, proteínas de fusión producidas mediante conjugación química o genéticamente. En Steven F. Dowdy, Protein Transduction System and Methods of Use Thereof, Publicación de patente internacional Nº WO 00/34308 (15 de junio, 2000); Gérard Chassaing y Alain Prochiantz, Peptides which can be Used as Vectors for the Intracellular Addresing of Active Molecuels, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.080.724 (27 de junio, 2000); Alan Frankel y col., Fusion Protein Comprising TAT-derived Transport Moiert, documento de patente de Estados Unidos Nº 5.674.980 (7 de octubre, 1995); Alan Frankel y col., TAT-derived Transport Polypeptide Conjugates, documento de patente de Estados Unidos Nº 5.747.641 (5 de mayo, 1998); Alan Frankel y col., TAT-derived Transport Polypeptides and Fusion Proteins, documento de patente de Estados Unidos Nº 5.804.604 (8 de septiembre, 1998); Peter F. J. O’Hare y col., Use of Transport Proteins, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.734.167 (11 de mayo, 2004); Yao-Zhong Lin y Jack J. Hawiger, Method for importing biologically active molecules into cells, documento de patente de Estados Unidos Nº 5.807.746 (15 de septiembre, 1998); Yao-Zhong Lin y Jack J. Hawiger, Method for importing biologically active molecules into cells, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.043.339 (28 de marzo, 2000); Yao-Zhong Lin y col., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.248.558 (19 de junio, 2001); Yao-Zhong Lin y col., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, documento de patente de Estados Unidos Nº

6.432.680 (13 de agosto, 2002); Jack J. Hawiger y col., Method for importing biologically active molecules into cells, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.495.518 (17 de diciembre, 2002); Yao-Zhong Lin y col., Sequence and Method for Genetic Engineering of Proteins with Cell Membrane Translocating Activity, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.780.843 (24 de agosto, 2004); Jonathan B. Rothbard y Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, documento de patente de Estados Unidos Nº

6.306.993 (23 de octubre, 2001); Jonathan B. Rothbard y Paul A Wender, Method and Composition for Enhancing Transport Across Biological Membranes, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.495.663 (17 de diciembre, 2002) y Pamela B. Davis y col., Fusion proteins for protein delivery, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.287.817 (11 de septiembre, 2001) se describen, por ejemplo, procedimientos de agents de liberación de unión covalente y procedimientos para usar dichos agentes.

Un agente de liberación útil en la invención también puede ser un agente que permita o potencie la captación celula de un FGFR3 asociado de forma no covalente. En Gilles Divita y col., Peptide-mediated Transfection Agents and Methods of Use, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.841.535 (11 de enero, 2005); Philip L Felgner y Olivier Zelphati, Intracellular Protein Delivery Compositions and Methods of Use, documento de patente de Estados Unidos Nº 2003/0008813 y Michael Karas Intracellular Delivery of Small Molecules, Proteins and Nucleic Acids, documento de patente de Estados Unidos Nº 2004/0209797 (21 de octubre, 2004) se describen, por ejemplo, procedimientos que operan en ausencia de unión covalente y procedimientos para usar dichos agentes. Dichos agentes de liberación peptídicos pueden prepararse y usarse mediante procedimientos estándar y están disponibles en el mercado; véase, por ejemplo, el reactivo Chariot™ (Active Motif, Carlsbad, CA, Estados Unidos); reactivo BioPORTER® (Gene Therapy Systems, Inc., San Diego, CA, Estados Unidos), reactivo de suministro de proteínas BioTrek™ (Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos) y reactivo de transfección de proteínas Pro-Ject™ (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, Estados Unidos).

Tal como se ha mencionado anteriormente, una célula puede contener de forma estable un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva. En, por ejemplo, Elizabeth E. Plowright y col., Ectopic expression of fibroblast growth factor receptor 3 promotes myeloma cell proliferation and prevents apoptosis, 95(3) Blood 992-998 (2000); TC; véase, por ejemplo, Hiroyuki Onose y col., Over-expression of fibroblast growth factor receptor 3 in a human thyroid carcinoma cell line results in overgrowth of the confluent cultures, 140(2) Eur. J. Endocrinol. 169-173 (1999); M. Kana y col., Signal transduction pathway of human fibroblast growth factor receptor 3. Identification of a novel 66-kDa phosphoprotein, 272(10) J. Biol. Chem. 6621-6628 (1997) y Janet E. Henderson y col., Expression of FGFR3 with the G380R achondroplasia mutation inhibits proliferation and maturation of CFK2 chondrocytic cells, 15(1) J. Bone Miner. Res. 155-165 (2000) se describen procedimientos útiles para producir y usar células que contienen de forma estable un FGFR3.

Otro aspecto de la presente invención proporciona, en parte, un constructo de expresión que permite la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva. Estos constructos de expresión comprenden un marco de lectura abierto que codifica un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva, unido operativamente a secuencias control de un vector de expresión útil para la expresión de FGFR3 en una célula. La expresión "unido operativamente", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquiera entre una variedad de procedimientos de clonación que pueden ligar una molécula de ácido nucleico divulgada en la presente memoria descriptiva en un vector de expresión de tal modo que se exprese un péptido codificado por la composición cuando se introduzca en una célula. Las técnicas de biología molecula bien establecidas que pueden ser necesarias para fabricar un constructo de expresió divulgado en la presente memoria descriptiva incluyen, pero no están limitadas a, procedimientos que implican la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacciones enzimáticas de restricción de la amplificación, electroforesis en gel de agarosa, ligación de ácidos nucleicos, transformación bacteriana, purificación de ácidos nucleicos, secuenciación de ácidos nucleicos, son procedimientos rutinarios que están dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas del presente documento. En, por ejemplo, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, anteriormente, (2001) y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Frederick M. Ausubel y col., ed. John Wiley e hijos, 2004) se describen ejemplos no limitantes de protocolos específicos para fabricar un constructo de expresión. Estos protocolos son procedimientos rutinarios que están dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas del presente documento.

Puede usarse una amplia variedad de vectores de expresión para expresar un marco de lectura abierta que codifique un FGFR3 e incluyen, sin suponer limitación, vectores de expresión vírica, vectores de expresión procariótica y vectores de expresión procariótica, incluidos vectores de expresión de levaduras, insectos y mamíferos. Los ejemplos no limitantes de vectores de expresión, junto con reactivos y condiciones bien establecidas para fabricar y usar un constructo de expresión de dichos vectores de expresión están disponibles fácilmente en suministradores comerciales, que incluyen, sin suponer limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI, Estados Unidos; QIAGEN, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos; y Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos. La selección, fabricación y uso de un vector de expresión apropiado son procedimientos rutinarios dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas del presente documento.

Se considera que cualquiera entre una variedad de sistemas de expresión puede ser útil para expresar composiciones de constructo divulgadas en la presente memoria descriptiva. Un sistema de expresión abarca tanto los sistemas basados en células como los sistemas de expresión exentos de células. Los sistemas basados en células incluyen, sin suponer limitación, sistemas de expresión vírica, sistemas de expresión procariótica, sistemas de expresión de levaduras, sistemas de expresión baculovíricos, sistemas de expresión de insectos y sistemas de expresión de mamíferos. Los sistemas exentos de células incluyen, sin suponer limitación, extractos de germen de trigo, extractos de reticulocito de conejo y extractos de E. coli. La expresión usando un sistema de expresión puede incluir cualquiera entre una variedad de características que incluyen, sin suponer limitación, expresión inducible, expresión no inducible, expresión constitutiva, expresión mediada víricamente, expresión integrada de forma estable y expresión transitoria. Los sistemas de expresión que incluyen vectores, reactivos, condiciones y células bien caracterizados están bien establecidos y están fácilmente disponibles de suministradores comerciales que incluyen, sin suponer limitación, Ambion, Inc. Austin, TX, Estados Unidos; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos; QIAGEN, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos; Roche Applied Science, Indianapolis, IN, Estados Unidos y Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos. En, por ejemplo, PROTEIN EXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH

(S. J. Higgins y B. David Hames ed., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez y James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999) y Meena Rai y Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001), se describen ejemplos no limitantes de la selección y el uso de sistemas de expresión heterólogos apropiados. Estos protocolos son procedimientos rutinarios que están dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas del presente documentos.

Un constructo de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 divulgado en la presente memoria descriptiva puede unirse operativamente a una variedad de elementos reguladores que pueden modular positiva o negativamente, bien directa o bien indirectamente, la expresión de una molécula de ácido nucleico tal como, por ejemplo, promotores y potenciadores constitutivos, específicos de tejido, inducibles o sintéticos. Los ejemplos no limitantes de elementos reguladores constitutivos incluyen, por ejemplo, elementos reguladores de citomegalovirus (CMV), timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV TK), virus de simio 40

(SV40) temprano, repetición terminal larga 5’ (LTR), factor de elongación 1□(EF-1□) y polibiquitina (UbC). Ejemplos no limitantes de elementos reguladores inducibles útiles en aspectos de la presente invención incluyen, por ejemplo, elementos reguladores inducibles químicamente tales como, sin suponer limitación, regulados por alcohol, regulados por tetraciclina, regulados por esteroides, regulados por metal y relacionados con patogénesis y elementos reguladores inducibles físicamente tales como, sin suponer limitación, regulados por temperatura o regulados por la luz. Dichos elementos reguladores inducibles pueden prepararse y usarse mediante procedimientos estándar y están disponible en el mercado, incluidos, pero sin limitación elementos inducibles por tetraciclina y sensible a tetraciclina tales como, por ejemplo, Tet-On™ y Tet-Off™ (BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos) y el T-REx™ (expresión regulada por tetraciclina) y sistemas Flp-In™ T-REx™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, Estados Unidos); elementos reguladores inducibles por ecdisone tales como, por ejemplo, el sistema de expresión de mamífero inducible Complete Control® (Stratagene, Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos); elementos reguladores

inducibles por isopropil □-D-galactopiranósido (IPTG) tales como, por ejemplo, el sistema de expresión de mamífero inducible LacSwitch® II (Stratagene, Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos); y elementos inducibles por esteroides tales como, por ejemplo, el sistema inducible por receptor de progesterona quimérica GeneSwitch™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, Estados Unidos). El experto entiende que estos y una variedad de otros sistemas reguladores constitutivos e inducibles están disponibles en el comercio o son bien conocidos en la técnica y pueden ser útiles en la invención para controlar la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de BoNT/A.

En una realización, una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 puede unirse opcionalmente a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo. En aspectos de la presente realización, una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de mamífero puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo; una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de ave puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo; una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de anfibio puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo y una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de pez puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 puede unirse opcionalmente a un elemento regulador tal como un elemento regulador inducible. En aspectos de la presente realización, una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de mamífero puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador inducible; una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de ave puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador inducible; una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de anfibio puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador inducible y una molécula de ácido nucleico que codifica un FGFR3 de pez puede estar unido a un elemento regulador tal como un elemento regulador inducible. En otro aspecto de la presente realización, la expresión de la molécula de ácido nucleico se induce usando, por ejemplo, inducible por tetraciclina, inducible por ecdisona o inducible por esteroides.

Se entiende que un FGFR3 útil en aspectos de la presente invención puede incluir opcionalmente uno o varios componentes adicionales. Como ejemplo no limitante, una secuencia espaciadora flexible tal como secuencias de poliglicina puede estar incluida en un FGFR3 útil en la invención. Un FGFR3 útil puede incluir, sin suponer limitación, uno o varios de los siguientes: marcas de unión a epitope, tales como, por ejemplo, FLAG, Express™, hematoglutinina del virus de la gripe humana (HA), proteína p62c-Myc humana (c-MYC), glucoproteína del virus de estomatitis vesicular (VSV-G), precursor de glucoproteína-D de virus del herpes simple (HSV), V5 y AU1; unión de afinidad, tales como, por ejemplo, polihistidina (HIS), péptido de unión a estreptavidina (strep) y biotina o una secuencia de biotinilación; regiones de unión a péptido, tales como, por ejemplo, dominio de unión a glutation de glutation-S-transferasa, el dominio de unión a calmodulina de la proteína de unión a calmodulina y el dominio de unión a maltosa de la proteína de unión a maltosa; región bisagra de inmunoglobulina; un enlazador de Nhidroxisuccinimida; un giro en horquilla peptídico o peptidomimético; o una secuencia hidrófila u otro componente o secuencia que, por ejemplo, promueva la solubilidad o estabilidad de un FGFR3. En, por ejemplo, Epitope Tagging, páginas 17.90-17.93 (Sambrook y Russell, ed., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3ª ed. 2001); Antibodies: A Laboratory Manual (Edward Harlow y David Lane, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1998) y Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol Nº I (Edward Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998) se describen ejemplos no limitantes de protocolos específicos para seleccionar, fabricar y usar un péptido de unión apropiado. Además, ejemplos no limitantes de péptidos de unión así como reactivos, condiciones y protocolos bien caracterizados son fácilmente disponibles de suministradores comerciales que incluyen, sin suponer limitación, BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos; QIAGEN, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos y Stratagene, La Jolla, CA, Estados Unidos. Estos protocolos son procedimientos rutinarios que están dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas del presente documentos.

Algunos aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, una célula que contiene un FGFR3 exógeno siendo dicha célula capaz de intoxicarse con BoNT/A. Tal como se usa en el presente documento, el término "célula" significa cualquier célula eucariótica que expresa, o puede diseñarse para expresar, al menos un FGFR3 exógeno que se une a BoNT/A. el término célula abarca células de una variedad de organismos, tales como, por ejemplo, células murinas, de rata, porcinas, bovinas, equinas, de primate y humanas; de una variedad de tipos celulares tales como, por ejemplo, neuronales y no neuronales; y puede aislarse de, o parte de, una población celular heterogénea, tejido u organismo. Se entiende que las células útiles en aspectos de la invención pueden incluir, sin suponer limitación, células primarias; células cultivadas; células establecidas; células normales, células transformadas; células tumorales; células infectadas; células diferenciadas por proliferación y terminalmente y células transfectadas de forma estable o transitoria, incluidas las células transfectadas de forma estable y transitoria. Se entiende, además, que las células útiles en aspectos de la invención pueden estar en cualquier estado tal como de proliferación o quiescente, intactas o permeabilizadas como mediante transfección mediada químicamente, tal como, por ejemplo, mediada por fosfato de calcio, mediada por dietilaminoetilo (DEAD) dextrano, mediada por lípidos, mediada por polietilenoimina (PEI), mediada por polibreno, y agentes de suministro de proteínas; transfección mediada físicamente, tal como, por ejemplo, suministro de partículas biolísticas, microinyección y electroporación; y transfección mediada víricamente, tal como, por ejemplo, transfección mediada por retrovirales. Se entiende, además, que células útiles en aspectos de la invención pueden incluir las que expresan un FGFR3 bajo control de un elemento promotor, elemento potenciador o ambos, constitutivo, específico de tejido, específico de célula o inducible.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "célula capaz de intoxicarse con BoNT/A" significa una célula que puede permitir el mecanismo celular total por el que la BoNT/A escinde proteolíticamente un sustrato tal como, por ejemplo, SNAP-25, y abarca la unión de BoNT/A a un receptor de afinidad baja o alta, la internalización del complejo toxina/receptor, la traslocación de la cadena ligera de BoNT/A al interior del citoplasma y la modificación diana enzimática de un sustrato de BoNT/A. Por definición, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A debe expresar un FGFR3. Como ejemplo no limitante, una célula neuronal o no neuronal puede diseñarse de forma transitoria o estable para expresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un FGFR3. Como otro ejemplo no limitante, una célula neuronal o no neuronal puede diseñarse transitoriamente para que contenga un FGFR3 exógeno.

Las células útiles en aspectos de la invención incluyen tanto células neuronales como no neuronales. Las células neuronales útiles en aspectos de la invención incluyen, sin suponer limitación, células neuronales primarias; células neuronales inmortalizadas o establecidas; células neuronales transformadas; células tumorales neuronales; células neuronales transfectadas de forma estable o transitoria y además incluyen, sin estar limitadas a, células neuronales de mamífero, murinas, de rata, de primate y humanas. Ejemplos no limitantes de células neuronales útiles en aspectos de la invención incluyen, por ejemplo, células neuronales periféricas, tales como, por ejemplo, neuronas motoras y neuronas sensoriales; y células neuronales del SNC tales como, por ejemplo, neuronas de la médula espinal como neuronas de la médula espinal embriónicas, neuronas del ganglio espinal (DGR), neuronas del córtex cerebral, neuronas del cerebelo, neuronas del hipocampo y neuronas motoras. Las células neuronales útiles en la invención pueden ser, por ejemplo, neuronas del sistema nervioso central (SNC); células del nueroblastoma; neuronas motoras, neuronas del hipocampo o neuronas del cerebelo y además pueden ser, sin suponer limitación, células Neuro-2A, SH-SY5Y, NG108-15, N1E-115 o SK-N-DZ. El experto entiende que estas neuronas y neuronas adicionales primarias y establecidas pueden ser útiles en las células y procedimientos de la invención.

Las neuronas útiles en aspectos de la invención incluyen, sin suponer limitación, cultivos primarios tales como cultivos primarios de neuronas de ganglios espinales (DGR). Como ejemplo, en Mary J. Welch y col., Sensitivity of embryonic rat dorsal root ganglia neurons to Clostridium botulinum neurotoxins, 38(2) Toxicon 245 258 (2000) se describen cultivos primaries de neuronas DGR de rata embriónicas y en Elaine A. Neale y col., Botulinum neurotoxin A blocks synaptic vesicle exocytosis but not endocytosis at the nerve terminal, 147(6) J. Cell Biol. 1249-1260 (1999) y John A. Chaddock y col., Inhibition of vesicular secretion in both neuronal and non-neuronal cells by a retargeted endopeptidase derivative of Clostridium botulinum neurotoxin type A, 68(5) Infect. Immun. 2587-2593 (2000) se describen cultivos primarios de neuronas de médula espinal fetal, por ejemplo, cultivos primarios de neuronas de médula espinal fetal murina. De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una neurona que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de la presente realización, una neurona puede ser una neurona de, por ejemplo, un cultivo primario, un cultivo primario de ganglio espinal embriónico o un cultivo primario de médula espinal fetal. Como ejemplos no limitantes, las células útiles según un procedimiento divulgado en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula neuronal primaria que contenga un FGFR3 exógeno tal como, por ejemplo, una neurona de ganglio espinal (DRG) embriónico de rata que contenga un FGFR3 exógeno o una neurona de médula espinal fetal murina que contenga un FGFR3 exógeno.

Las líneas celulares neuronales útiles en aspectos de la invención incluyen, sin suponer limitación, líneas celulares de neuroblastoma, líneas celulares híbridas neuronales, líneas celulares de médula espinal, líneas celulares del sistema nervioso central, líneas celulares del córtex cerebral, líneas celulares de ganglio espinal, líneas celulares del hipocampo y líneas celulares de feocromocitoma.

Las líneas celulares de neuroblastoma, tales como, por ejemplo, líneas celulares de neuroblastoma murinas, de rata, de primate o humanas pueden ser útiles en aspectos de la invención. Las líneas celulares de nueroblastoma útiles en aspectos de la invención incluyen, sin suponer limitación, BE (2)-C (ATCC CRL-2268; ECACC 95011817), BE(2)M17 (ATCC CRL-2267; ECACC 95011816), C1300 (ECACC 93120817), CHP-212 (ATCC CRL-2273), CHP-126 (DSMZ ACC 304), IMR 32 (ATCC CRL-127; ECACC 86041809; DSMZ ACC 165), KELLY (ECACC 92110411; DSMZ ACC 355), LA-N-2; véase, por ejemplo, Robert C. Seeger y col., Morphology, growth, chromosomal pattern and fibrinolytic activity of two new human neuroblastoma cell lines, 37(5) Cancer Res. 1364-1371 (1977) y G. J. West y col., Adrenergic, cholinergic, and inactive human neuroblastoma cell lines with the action-potential Na+ ionophore, 37(5) Cancer Res. 1372-1376 (1977), MC-IXC (ATCC CRL-2270), MHH-NB-11 (DSMZ ACC 157), N18Tg2 (DSMZ ACC 103), N1E-115 (ATCC CCL-2263; ECACC 88112303), N4TG3 (DSMZ ACC 101), Neuro-2A (ATCC CCL-131; ECACC 89121404; DSMZ ACC 148), NB41A3 (ATCC CCL-147; ECACC 89121405), NS20Y (DSMZ ACC 94), SHSY5Y (ATCC CRL-2266; ECACC 94030304; DSMZ ACC 209), SIMA (DSMZ ACC 164), SK-NDZ (ATCC CRL-2149; ECACC 94092305), SK-N-F1 (ATCC CRL-2142, ECACC 94092304), SK-N-MC (ATCC HTB-10, DSMZ ACC 203) y SK-N-SH (ATCC HTB-11, ECACC 86012802). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula de neuroblastoma que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de la presente realización, una célula de neuroblastoma puede ser, por ejemplo, BE(2)-C, BE(2)-M17, C1300, CHP-212, CHP-126, IMR 32, KELLY, LA-N-2, MC-IXC, MHHNB-11, N18Tg2, N1E-115, N4TG3, Neuro-2A, NB41A3, NS20Y, SH-SY5Y, SIMA, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-MC y SK-N-SH. Como ejemplos no limitantes, las células útiles para detectar la actividad de BoNT/A según un procedimiento divulgado en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula de neuroblastoma que contiene un FGFR3 exógeno tal como una célula SH-SY5Y que contiene un FGFR3 exógeno; una célula Neuro-2a que contiene un FGFR3 exógeno y una célula N1E-115 que contiene un FGFR3 exógeno y una célula SK-N-DZ que contiene un FGFR3 exógeno.

Las líneas celulares híbridas neuronales, tales como, por ejemplo, líneas celulares neuronales híbridas, pueden ser útiles en aspectos de la invención. Dichas líneas celulares híbridas incluyen híbridos de neuroblastoma/glioma tales como, por ejemplo, N18 (ECACC 88112301), NG108-15 (ATCC HB-12317, ECACC 88112302) y NG115-401L (ECACC 87032003); híbridos de neuroblastoma/neurona motora tales como, por ejemplo, NSC-19 y NSC-34, que expresan características de nuerona motora, muestran un fenotipo similar a neurona multipolar, expresan niveles altos de colina acetiltransferasa (CHAT), generan potenciales de acción, expresan proteínas de triplete neurofilamentosas y sintetizan, almacenan y liberan acetilcolina; véase, por ejemplo, N. R. Cashman y col., Neuroblastoma x spinal cord (NSC) hybrid cell lines resemble developing motor neurons, 194(3) Dev. Dyn. 209-221 (1992) y Christopher J. Eggett y col., Development and characterisation of a glutamate-sensitive motor neuronal cell line, 74 (5) J. Neurochem. 1895-1902 (2000); híbridos de neuroblastoma/neurona de ganglio espinal, tales como, por ejemplo, F11; véase, por ejemplo, Doros Platika y col., Neuronal traits of clonal cell lines derived by fusion of dorsal root ganglia neurons with neuroblastoma cells, 82(10) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 3499-3503 (1985), ND-E (ECACC 92090915), ND-U1 (ECACC 92090916), ND7/23 (ECACC 92090903), ND8/34 (ECACC 92090904) y ND27 (ECACC 92090912); híbridos de neuroblastoma/neurona de hipocampo tales como, por ejemplo, HN-33; véase, por ejemplo, Henry J. Lee y col., Neuronal properties and trophic activities of immortalized hippocampal cells from embryonic and young adult mice. 10(6) J. Neurosci. 1779-1787 (1990). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con toxina BoNT/A puede ser una neurona híbrida que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de la presente realización, una neurona híbrida puede ser, por ejemplo, una célula híbrida neuroblastoma/glioma que contien un FGFR3 exógeno, una célula híbrida neuroblastoma/neurona motora que contiene un FGFR3 exógeno, una célula híbrida neuroblastoma/neurona de ganglio espinal que contiene un FGFR3 exógeno y una célula híbrida neuroblastoma/neurona de hipocampo que contiene un FGFR3 exógeno. En otros aspectos de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/glioma puede ser, por ejemplo, N18, NG108-15 y NG115401L. En otros aspectos de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona motora puede ser, por ejemplo, NSC-19 y NSC-32. En otros aspectos de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona de ganglio espinal puede ser, por ejemplo, F11, ND-E, ND-U1, ND7/23, ND8/34 y ND27. En otros aspectos de esta realización, un híbrido de neuroblastoma/neurona de hipocampo puede ser, por ejemplo, HN-33. Como ejemplos no limitantes, las células útiles para detectar la actividad de BoNT/A según un procedimiento divulgado en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula neuronal híbrida tal como, por ejemplo, una célula NG108-15 que contiene un FGFR3 exógeno.

Las líneas celulares de médula espinal tales como, por ejemplo, líneas celulares de médula espinal murinas, de rata, de primate o humanas pueden ser útiles en aspectos de la invención e incluyen, sin suponer limitación, TE 189.T (ATCC CRL-7947) y M4b; véase, por ejemplo, Ana M. Cardenas y col., Establishment and characterization of immortalized neuronal cell lines derived from the spinal cord of normal and trisomy 16 fetal mice, an animal model of Down syndrome, 68(1) J. Neurosci. Res. 46-58 (2002). Como ejemplo, una línea celular de médula espinal humana puede generarse a partir de precursores de células de médula espinal embriónicas humanas (embrión del primer trimestre) que se inmortalizan con un oncogén v-myc sensible a tetraciclina tal como se describe por Ronghao Li y col., Motoneuron differentiation of immortalized human spinal cord cell lines, 59(3) J. Neurosci. Res. 342-352 (2000). Dichas células pueden expandirse indefinidamente en condiciones de crecimiento proliferativas antes de una diferenciación rápida (4-7 días) en neuronas funcionales que expresan marcadores fenotípicos neuronales tales como colina acetiltransferasa. Como otro ejemplo, una línea celular de médula espinal murina puede prepararse inmortalizando un cultivo de médula espinal embriónica usando medio transformante. Dicha línea celular de médula espinal puede ser, por ejemplo, la línea M4b murina y puede expresar marcadores neuronales tales como NSE, sinaptofisina, MAP 2 y colina acetiltransferasa, y puede liberar acetilcolina después de la estimulación apropiada; véase, por ejemplo, Cardenas y col., anteriormente, (2002). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula de médula espinal que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de esta realización, una célula de médula espinal que contiene un FGFR3 exógeno puede ser, por ejemplo, una célula TE 189.T que contiene un FGFR3 exógeno y una célula M4b que contiene un FGFR3 exógeno.

Las líneas celulares del sistema nervioso central (SNC), tales como, por ejemplo, líneas celulares del SNC murinas, de rata, de primate y humanas pueden ser útiles en aspectos de la invención. Una línea celular de SNC puede ser, por ejemplo, una línea del SNC inmortalizada con un oncogén v-myc sensible a tetraciclina tal como se describe, por ejemplo, por Dinah W. Sah y col., Bipotent progenitor cell lines from the human CNS, 15(6) Nat. Biotechnol. 574-580 (1997). Después de la represión del oncogén, las células se diferencian en neuronas. De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula del SNC que contiene un FGFR3 exógeno.

Las líneas de córtex cerebral tales como, por ejemplo, las líneas de córtex cerebral murinas, de rata, de primate y humanas pueden ser útiles en aspectos de la invención e incluyen, sin suponer limitación, CNh, véase, por ejemplo, Ana M. Cardenas y col., Calcium signals in cell lines derived from the cerebral cortex of normal and trisomy 16 mice, 10(2) Neuroreport 363-369 (1999), HCN-1a (ATCC CRL-10442) y HCN-2 (ATCC CRL-10742). Como ejemplo, cultivos primarios de córtex murino de embriones de 12-16 días pueden inmortalizarse, por ejemplo, cultivando las células en medio acondicionado a partir de líneas celulares de tiroides de rata que inducen transformación in vitro. Las células inmortalizadas pueden diferenciarse en neuronas que expresan marcadores neuronales usando el medio apropiado; estas células diferenciadas expresan colina acetiltransferasa y segregan acetilcolina y glutamato en respuesta a despolarización y estimulación nicotínica, véase, por ejemplo, David D. Allen y col., Impaired cholinergic function in cell lines derived from the cerebral cortex of normal and trisomy 16 mice, 12(9) Eur. J. Neurosci. 32593264 (2000). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula del córtex cerebral que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de esta realización, una célula de córtex cerebral que contiene un FGFR3 exógeno puede ser, por ejemplo, una célula CNh que contiene un FGFR3 exógeno, una célula HCN-1a que contiene un FGFR3 exógeno y una célula HCN-2 que contiene un FGFR3 exógeno.

Las líneas celulares de ganglio espinal tales como, por ejemplo, líneas celulares de ganglio espinal murinas, de rata, de primate y humanas pueden ser útiles en aspectos de la invención e incluyen, sin suponer limitación, G4b, véase, por ejemplo, David D. Allen y col., A dorsal root ganglia cell line derived from trisomy 16 fetal mice, a model for Down syndrome, 13(4) Neuroreport 491-496 (2002). Los cultivos primarios de ganglio espinal embrionario pueden inmortalizarse con medio acondicionado de transformación tal como se ha descrito anteriormente. Después de la diferenciación, la línea celular muestra rasgos neuronales y carece de marcadores gliales por inmunohistoquímica. La liberación de neurotransmisores tales como acetilcolina puede inducirse en respuesta a potasio y nicotina, Allen y col., anteriormente, (2002). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula del ganglio espinal que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de esta realización, una célula de ganglio espinal puede ser, por ejemplo, una célula G4b que contiene un FGFR3 exógeno.

Las líneas celulares de hipocampo tales como, por ejemplo, líneas de hipocampo murinas, de rata, de primate y humanas pueden ser útiles en aspectos de la invención e incluyen, sin suponer limitación, HT-4, véase, por ejemplo,

K. Frederiksen y col., Immortalization of precursor cells from the mammalian CNS, 1(6) Neuron 439-448 (1988) y HT22, véase, por ejemplo, John B. Davis and Pamela Maher, Protein kinase C activation inhibits glutamate-induced cytotoxicity in a neuronal cell line, 652(1) Brain Res. 169-173 (1994). Como ejemplo no limitante, la línea celular de hipocampo HT-22 murina puede ser útil en la invención. Como ejemplo no limitante, la línea celular de hipocampo HN33 inmortalizada puede ser útil en la invención. Esta línea celular de hipocampo se derivó de la fusión de neuronas primarias a partir del hipocampo de ratones de 21 días con la línea cellular de nueroblastoma N18TG2 y, cuando se diferencian, comparten propiedades de membrana con neuronas de hipocampo adulto en cultivos primarios, véase, por ejemplo, Henry J. Lee y col., Neuronal Properties and Trophic Activities of Immortalized Hippocampal Cells from Embryonic and Young Adult Mice, 19(6) J. Neurosci. 1779-1787 (1990) y Henry J. Lee y col., Immortalized young adult neurons from the septal region: generation and characterization, 52(1-2) Brain Res. Dev Brain Res. 219-228 (1990). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula del hipocampo que contiene un FGFR3 exógeno. En aspectos de esta realización, una célula de hipocampo que contiene un FGFR3 exógeno puede ser, por ejemplo, una célula HT-4 que contiene un FGFR3 exógeno, una célula HT-22 que contiene un FGFR3 exógeno y una célula HN33 que contiene un FGFR3 exógeno.

Una diversidad de células no neuronales son útiles en aspectos de la invención. Las células no neuronales útiles en aspectos de la invención incluyen, sin suponer limitación, células no neuronales primarias; células no neuronales inmortalizadas o establecidas; células no neuronales transformadas; células tumorales no neuronales; células no neuronales transfectadas de forma estable o transitoria y además incluyen, sin estar limitadas a, células no neuronales de mamífero, murinas, de rata, de primate y humanas. Las células no neuronales útiles en aspectos de la invención también incluyen, sin suponer limitación, cualquiera de las células primarias o establecidas siguientes: células de la pituitaria anterior; células suprarrenales tales como, por ejemplo, células de cromafina de la médula suprarrenal; células pancreáticas tales como, por ejemplo, células acinares pancreáticas, células de los islotes K pancreáticas e células HIT o INS-1 del insulinoma; células de ovario tales como, por ejemplo, células de ovario productoras de esteroides; células renales tales como, por ejemplo, células del conducto colector medular interno (IMCD); células estomacales tales como, por ejemplo, células de enterocromafina; células sanguíneas tales como, por ejemplo, euritrocitos, leucocitos, plaquetas, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos; células epiteliales tales como, por ejemplo, las de la membrana plasmática apical; fibroblastos; células del tiroide; condrocitos; células musculares; hepatocitos; céulas glandulares tales como, por ejemplo, células de pituitaria, células suprarrenales, célula de cromafina; y células implicadas en la translocación del transportador de glucosa (GLUT4). De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula no neuronal. En aspectos de esta realización, una célula no neuronal puede ser de una línea celular no neuronal primaria o establecida de, por ejemplo, células de pituitaria anterior, células suprarrenales, células pancreáticas, células de ovarios, células renales, células de estómago, células sanguíneas, células epiteliales, fibroblastos, células de tiroides, condrocitos, células musculares, hepatocitos y células glandulares.

Como ejemplos no limitantes, las células útiles para detectar la actividad de BoNT/A según un procedimiento divulgado en la presente memoria descriptiva pueden incluir una célula no neuronal primaria o establecida que contiene un FGFR3 exógeno, tal como, por ejemplo, una célula de cromafina que contiene un FGFR3 exógeno o una célula acinar pancreática que contiene un FGFR3 exógeno; una célula neuronal primaria que contiene un FGFR3 exógeno.

Tal como se ha debatido anteriormente, las células útiles en la invención incluyen células neuronales y no neuronales que expresan niveles bajos o indetectables de receptor endógeno pero que han sido transfectadas con,

o diseñadas de otro modo para expresar, una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican uno o varios FGFR3. Las células útiles en aspectos de la presente invención también incluyen, sin suponer limitación, células transformadas, tumorales o de otro tipo que sobreexpresan uno o varios FGFR3 exógenos. Se entiende que el receptor sobreexpresado puede ser una forma natural del receptor o puede incluir una o varias modificaciones de aminoácidos en comparación con el receptor natural, con la condición de que el proceso de intoxicación con BoNT/A puede tener lugar aún. Como ejemplo no limitante, las células útiles para detector la actividad de BoNT/A abarcan las que expresan o sobreexpresan un FGFR3 exógeno de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón. Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para detector la actividad de BoNT/A abarcan las que expresan o sobreexpresan un FGFR3 exógeno de ave, tal como, por ejemplo, FGFR3 de pollo. Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para detector la actividad de BoNT/A abarcan las que expresan o sobreexpresan un FGFR3 exógeno de anfibio, tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana. Como otro ejemplo no limitante, las células útiles para detector la actividad de BoNT/A abarcan las que expresan o sobreexpresan un FGFR3 exógeno de pez, tal como, por ejemplo, FGFR3 de pez cebra.

De este modo, en una realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula que expresa de forma estable un FGFR3 exógeno. En aspectos de esta realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula que expresa de forma estable un FGFR3 exógeno de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón. En otros aspectos de esta realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula que expresa de forma estable un FGFR3 exógeno de ave tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo. En otros aspectos de esta realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula que expresa de forma estable un FGFR3 exógeno de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana. En otros aspectos de esta realización, una célula capaz de intoxicarse con BoNT/A puede ser una célula que expresa de forma estable un FGFR3 exógeno de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra.

Aspectos de la presente invención proporcionan, en parte, detectar la presencia de actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con relación a la célula de control, siendo una diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula de control indicativo de actividad de BoNT/A. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula de control” significa una célula del mismo tipo o similar que la célula puesta en contacto y cultivada en las mismas condiciones pero que no se ha puesto en contacto con ninguna muestra o se ha puesto en contacto con una muestra definida negativa o una muestra definida positiva. Un experto en la técnica entiende que una diversidad de células de control son útiles en los procedimientos divulgados en la presente memoria descriptiva y que una célula de control puede ser una célula de control positivo o una célula de control negativo. Una célula de control puede ser, por ejemplo, una célula de control negativo tal como una célula similar o idéntica que contiene el mismo FGFR3 o similar que se pone en contacto con una muestra similar definida negativa que se sabe que carece de BoNT/A activo, o que no se pone en contacto con ninguna muestra. Una célula de control puede ser, por ejemplo una célula de control positive tal como una célula similar o identica que contiene el mismo FGFR3 o similar puesta en contacto con una muestra definida positiva que se sabe que incluye BoNT/A activo.

Puede usarse una amplia variedad de ensayos para determinar la presencia de actividad de BoNT/A, incluidos ensayos directos e indirectos de captación de toxina. Los ensayos para determinar las propiedades de unión o captación de BoNT/A pueden usarse para evaluar la actividad de BoNT/A. Dichos ensayos incluyen, sin suponer limitación, ensayos de reticulación usando BoNT/A etiquitada, tales como, por ejemplo, BoNT/ASBED; véase, por ejemplo, el ejemplo II de la presente memoria descriptiva y [125I] BoNT/A; véanse, por ejemplo, Noriko Yokosawa y col., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); Noriko Yokosawa y col., Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29 (2) Toxicon 261-264 (1991) y Tei-ichi Nishiki y col., Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes, 269(14) J. Biol. Chem. 10498-10503 (1994). Otros ensayos no limitantes incluyen ensayos inmunocitoquímicos que detectan la unión a toxina usando anticuerpos marcados o no marcados; véase, por ejemplo, Atsushi Nishikawa y col., The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells, 319(2) Biochem. Biophys. Res. Commun. 327-333 (2004), y ensayos de inmunoprecipitación; véase, por ejemplo, Yukako Fujinaga y col., Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes, 150(Pt 5) Microbiology 1529-1538 (2004). Los anticuerpos útiles para estos ensayos incluyen, sin suponer limitación, anticuerpos seleccionados contra una BoNT/A, anticuerpos seleccionados contra un receptor de BoNT/A, tal como, por ejemplo, FGFR3, anticuerpos seleccionados contra un gangliósido, tal como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b y anticuerpos seleccionados contra un compuesto de ensayo, tal como, por ejemplo, una molécula que se une selectivamente al receptor de BoNT/A, modulando la unión selectiva la actividad de BoNT/A. Si el anticuerpo está marcado, la unión de la molécula puede detectarse usando diversos medios, incluidos inmunotransferencia (Western), observación microscópica directa de la localización celular del anticuerpos, medición de anticuerpo unido a la célula o al sustrato seguido de etapa de lavado o electroforesis, usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Si el anticuerpo no está marcado, puede usarse un anticuerpo secundario marcado para la detección indirecta de la molécula unida y la detección puede realizarse como para un anticuerpo marcado. Se entiende que estos ensayos y otros similares que determinan las propiedades o características de captación de BoNT/A pueden ser útiles para detectar la actividad de BoNT/A.

Los ensayos de seguimiento de la liberación de una molécula tras exposición a BoNT/A también pueden ser útiles para evaluar la presencia de actividad de BoNT/A. En estos ensayos, la inhibición de la liberación de la molécula tendría lugar en células que expresan un FGFR3 después del tratamiento con BoNT/A. Como ejemplo no limitante, con el ensayo de inhibición de la liberación de insulina divulgado en la presente memoria descriptiva puede realizarse un seguimiento de la liberación de una molécula tras exposición a BoNT/A y, por lo tanto, ser útil en la evaluación de si una molécula se une selectivamente a un receptor BoNT/A (véase el ejemplo I). Otros ensayos no limitantes incluyen procedimientos que miden la inhibición de la liberación de catecolamina radiomarcada desde neuronas, tales como, por ejemmplo, la liberación de [3H] norsuprarrenalina o [3H] dopamine; véase, por ejemplo, A Fassio y col., Evidence for calcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F, 90(3) Neuroscience 893-902 (1999) y Sara Stigliani y col., The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin C1 and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool, 85(2) J. Neurochem. 409-421 (2003), o miden la liberación de catecolamina usando procedimientos flurométricos; véase, por ejemplo, Anton de Paiva y col., A role for the interchain disulfide or its participating thiols in the internalization of botulinum neurotoxin. A revealed by a toxin derivative that binds to ecto-acceptors and inhibits transmitter release intracellularly, 268(28) J. Biol. Chem. 20838-20844 (1993); Gary W. Lawrence y col., Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25-kDa synaptosomal-associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, 236(3) Eur. J. Biochem. 877-886 (1996); y Patrick Foran y col., Botulinum neurotoxin Cl cleaves both syntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation with its blockade of catecholamine release, 35(8) Biochemistry 2630-2636 (1996); y procedimientos que miden la inhibición de liberación de hormonas desde células endocrinas, tales como, por ejemplo células de la pituitaria anterior o células de ovarios. Se entiende que estos ensayos y otros similares de análisis de liberación de moléculas pueden ser útiles para evaluar la actividad de BoNT/A.

Como ejemplos no limitantes, un ensayo de inhibición de liberación de insulina puede usarse para determinar la presencia de actividad de BoNT/A en células que contienen un FGFR3 y son capaces de segregar insulina; puede usarse un ensayo de inhibición de liberación de norsuprarrenalina para determinar la actividad de BoNT/A en células que contienen un FGFR3 y son capaces de segregar norsuprarrenalina y puede usarse un ensayo de inhibición de liberación de estrógeno para determinar la actividad de BoNT/A en células que contienen un FGFR3 y son capaces de segregar estrógeno.

Los ensayos para detectar la escisión de un sustrato de BoNT/A después de exposición a BoNT/A también pueden usarse para evaluar la presencia de actividad de BoNT/A. En estos ensayos, la generación de un producto de escisión de BoNT/A se detectaría después del tratamiento con BoNT/A. Como ejemplo no limitante, en ensayo de escisión de SNAP-25 que se divulga en la presente memoria descriptiva puede detectar la escisión de un sustrato de BoNT/A después de la exposición a BoNT/A y, por lo tanto, ser útil para evaluar la actividad de BoNT/A (véase el ejemplo I). Otros procedimientos no limitantes útiles para detectar la escisión de un sustrato de BoNT/A después de la exposición a BoNT/A se describen por, por ejemplo, Lance E. Steward y col., FRET Protease Assays for Botulinum Serotype A/E Toxins, Publicación de patente de Estados Unidos Nº. 2003/0143650 (31 de julio, 2003) y Ester Fernandez-Salas y col., Cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Assays for Clostridial Toxins, Publicación de patente de Estados Unidos Nº 2004/0072270 (15 de abril, 2004). Se entiende que estos ensayos y otros similares para determinar la escisión del sustratao de BoNT/A pueden ser útiles para evaluar la actividad de BoNT/A.

Como ejemplos no limitantes, el análisis de inmunotransferencia (Western) usando un anticuerpo que reconoce el producto de escisión de SNAP-25 de BoNT/A puede usarse para determinar la presencia de actividad de BoNT/A. Los ejemplos de anticuerpos anti-SNAP-25 útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, antisuero antiSNAP25197 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 Nº 1 (Allergan, Inc., Irvine, CA, Estados Unidos), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón SMI-81 (Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD, Estados Unidos), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón CI 71.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón CI 71.2 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón SP12 (Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos), antisuero anti-SNAP-25 policlonal de conejo (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) y antisuero anti-SNAP-25 policlonal de conejo (Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos).

Los procedimientos divulgados en la presente memoria descriptiva incluyen, en parte, una muestra. Tal como se usa en el presente documento, el término "muestra" significa cualquier material biológico que contenga o contenga potencialmente una BoNT/A activa. Puede analizarse una diversidad de muestras según un procedimiento divulgado en la presente memoria descriptiva que incluye, sin limitación, BoNT/A purificada, parcialmente purificada o no purificada; toxina monocatenaria o bicatenaria recombinante con una secuencia de origin natural o no natural; BoNT/A recombinante con una especificidad de proteasA modificada; BoNT/A recombinante con una específicada celular alterada; toxina quimérica que contiene elementos estructurales de múltiples especies o subtipos de BoNT/A; BoNT/A a granel; producto de BoNT/A formulado y alimentos; células o lisados celulares brutos fraccionados o parcialmente purificados, por ejemplo, diseñados para incluir un ácido nucleico recombinante que codifica un BoNT/A; lisados bacterianos, baculovíricos y de levadura; alimentos crudos, cocinados, parcialmente cocinados o procesados; refrescos; productos de alimentación de animales; muestras de suelo; muestras de agua; sedimentos de estanques; lociones; cosméticos y formulaciones clínicas. Se entiende que el término muestra abarca muestras de tejidos, incluidas, sin limitación, muestras de tejidos de mamíferos, muestras de tejidos de ganado tales como muestras de tejidos de oveja, vaca o cerdo, muestras de tejidos de primates y muestras de tejidos humanos. Dichas muestras abarcan, sin limitación, muestras intestinales tales como muestras intestinales de niños, muestras de tejidos obtenidas de una herida. Otras muestras de este tipo incluyen tejido de mamífero, saliva de mamífero, excreciones de mamífero y heces de mamífero. Como ejemplo no limitante, un procedimiento de la presente invención puede ser útil para detectar la presencia o actividad de una BoNT/A en una muestra de comida o bebida; para evaluar una muestra de un ser humano o de un animal, por ejemplo, expuesta a una BoNT/A o que tiene uno o varios síntomas de exposición a BoNT/A; para realizar un seguimiento de la actividad durante la producción y purificación de BoNT/A o para analizar productos de BoNT/A formulados tales como productos farmacéuticos o cosméticos.

Se considera que puede usarse una amplia variedad de formatos de procesamiento junto con los procedimientos divulgados en la presente memoria descriptiva, incluidos, sin limitación, procesamiento manual, procesamiento parcialmente automatizado, procesamiento semiautomatizado, procesamientos totalmente automatizado, procesamiento de alto rendimientos, procesamiento de alto contenido y similares o cualquier combinación de los mismos.

Un aspecto de referencia proporciona procedimientos de reducción de la actividad de BoNT/A en un ser humano que comprenden administrar a dicho ser humano una composición farmacéutica que comprende una molécula que se une selectivamente a un FGFR3, en los que dicha unión selectiva reduce la capacidad de BoNT/A de unirse a dicho FGFR3. Se considera que cualquier molécula que puede unirse selectivamente a un FGFR3 de un modo que evita la unión de BoNT/A al mismo FGFR3 puede ser útil, incluidas, sin limitación, un anticuerpo anti-FGFR3, un FGF o un agonista de FGF. Además, un FGFR3, un fragmento de FGFR3 que mantiene la actividad de unión selectiva a BoNT/A o un peptidomimético del mismo también puede ser útil. Las moléculas que se unen selectivamente a FGFR3 y que, por lo tanto, son útiles en procedimientos para reducir la actividad de BoNT/A se describen por, por ejemplo, Avner Yayon y col., Antibodies that block receptor protein tyrosone kinase activation, methods of screening for and using thereof, Publicación internacional de patente WO 02/102972 (27 de diciembre, 2002); Avner Yayon y col., Antibodies that block receptor protein tyrosone kinase activation, methods of screening for and using thereof, Publicación internacional de patente Nº WO 02/102973 (27 de diciembre, 2002) y Elisabeth Thomassen-Wolf y col., Antibodies that block receptor protein tyrosone kinase activation, methods of screening for and using thereof, Publicación internacional de patente Nº WO 02/102854 (27 de diciembre, 2002)

Los aspectos de referencia proporcionan, en parte, un procedimiento para reducir la actividad de BoNT/A en un ser humano administrando una composición farmacéutica que comprende una molécula que se une selectivamente a un FGFR3. La composición administrada puede formularse en una variedad de medios farmacéuticamente aceptables, tal como se describe más adelante. Una dosis eficaz de una composición divulgada en la presente memoria descriptiva dependerá de la molécula particular seleccionada, la vía de administración y las características particulares del ser humano u otro mamífero, tales como la edad, el peso, el estado general de salud y similares.

Una dosis eficaz puede determinarse en un modelo animal antes de la administración a seres humanos. Las composiciones útiles en aspectos de la invención pueden administrarse usando una variedad de vías de estímulo y respuesta inmunitaria. Como ejemplo no limitante, la tolerancia oral está bien reconocida en la técnica (véase, por ejemplo, Weiner, Hospital Practice, páginas 53-58 (15 de septiembre, 1995). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente para una composición particular, una composición farmacológica adecuada, una carga útil de antígeno apropiada; la vía de administración; el volumen de la dosis y la pauta farmacéutica útil en un animal en particular, por ejemplo, seres humanos.

Tal como se divulga en el presente documento, una composición farmacéutica se administra a un ser humano o a otro mamífero para reducir la actividad de BoNT/A. Tal como se usa en el presente documento, el término "reducir" cuando se usa con referencia a la administración a un ser humano u otro mamífero de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica significa reducir un síntoma de una afección caracterizada por la exposición a la actividad de BoNT/A, o retrasar o evitar la aparición de un síntoma de una afección caracterizada por la exposición a la actividad de BoNT/A en el ser humano u otro mamífero. Por ejemplo, la expresión "que reduce" puede significar que reduce un síntoma de una afección caracterizada por la exposición a la actividad de BoNT/A en al menos el 30 %, 40 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 100 %. La eficacia de una composición farmacéutica en el tratamiento de una afección caracterizada por la exposición a la actividad de BoNT/A puede determinarse observando uno o varios síntomas clínicos o indicadores fisiológicos asociados con la afección. Una mejora en una afección caracterizada por la exposición a la actividad de BoNT/A también puede indicarse por una necesidad reducida de una terapia simultánea. Los expertos en la técnica conocerán los síntomas apropiados o indicadores asociados con afecciones específicas y sabrán como determinar si un ser humano u otro mamífero es candidato al tratamiento con una composición farmacéutica que se divulga en la presente memoria descriptiva. En particular, se entiende que los expertos en la técnica serán capaces de determinar si una afección está caracterizada por una exposición a la actividad de BoNT/A comparando, por ejemplo, los niveles de actividad de BoNT/A del ser humano u otro mamífero con unas células de control normales.

Los expertos pueden determinar la cantidad eficaz apropiada para administrar para una aplicación particular de los procedimientos usando las guías que se proporcionan en el presente documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede extrapolarse a partir de ensayos tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Un experto en la técnica reconocerá que puede realizarse un seguimiento de la condición del paciente a lo largo de la terapia y que la cantidad eficaz de una composición que se administra puede ajustarse consecuentemente.

Una composición farmacéutica útil en aspectos de la invención se administra generalmente en una composición farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier entidad molecular o composición que no produce una reacción adversa, alérgica o de otro tipo perjudicial o no deseado cuando se administra a un ser humano o a otro mamífero. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "composición farmacéuticamente aceptable" se refiere a una concentración terapéuticamente eficaz de un ingrediente activo. Una composición farmacéutica puede administrarse a un paciente sola o en combinación con otros ingredientes activos, agentes, fármacos u hormonas suplementarios. Las composiciones farmacéuticas pueden fabricarse usando cualquier procedimiento de una diversidad de los mismos, incluidos, sin limitación, mezclado convencional, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulamiento, atrapamiento y liofilación. La composición farmacéutica puede tomar cualquier forma entre una diversidad de las mismas, que incluyen, sin limitación, una solución estéril, suspensión, emulsión, liofilizado, comprimido, pastilla, pella, cápsula, polvo, jarabe, elixir o cualquier otra forma farmacéutica adecuada para su administración.

Se contempla también que una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria descriptiva puede incluir, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable que facilita el procesamiento de un ingrediente activo en composiciones farmacéuticamente aceptables. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “vehículo farmacológicamente aceptable” se refiere a cualquier vehículo que no tenga un efecto negativo a largo plazo o permanente cuando se administra y abarca expresiones tales como “vehículo, estabilizante, diluyente, auxiliar o excipiente farmacológicamente aceptable”. Un vehiculo de este tipo se mezcla generalmente con un compuesto activo, o permite diluir o incluir el compuesto activo y puede ser un agente sólido, semisólido o líquido. Se entiende que los ingredientes activos pueden ser solubles en, o pueden proporcionarse en forma de suspensión a, el vehículo o diluyente deseado. Puede usarse cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable entre una diversidad de los mismos, incluidos, sin limitación, medios acuosos tales como, por ejemplo agua destilada, agua desionizada, solución salina; disolventes; medios dispersantes; recubrimientos; agentes antibacterianos y antifúngicos; agentes isotónicos y retardantes de la absorción o cualquier otro ingrediente inactivo. La selección de un vehículo farmacológicamente aceptable puede depender de la vía de administración. Excepto en la medida en que cualquier vehículo farmacológicamente aceptable sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticamente aceptables. Ejemplos no limitantes de usos específicos de dichos vehículos farmacéuticos pueden encontrarse en PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (Howard C. Ansel y col., ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7ª ed., 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20ª ed. 2000); GOODMAN & GILMAN’S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS (Joel G. Hardman y col., eds., McGraw-Hill Professional, 10ª ed., 2001) y HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS (Raymond C. Rowe y col., APhA Publications, 4ª edición, 2003). Estos protocolos son procedimientos rutinarios y cualquier modificación está dentro del alcance de un experto en la técnica y de las enseñanzas del presente documento.

Se considera además que una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria descriptiva puede incluir opcionalmente, sin limitación, otros componentes farmacéuticamente aceptables, incluidos, sin limitación, tampones, conservantes, ajustadores de la tonicidad, sales, antioxidantes, sustancias fisiológicas, sustancias farmacéuticas, agentes voluminizadores, agentes emulsionantes, agentes humectantes, edulcorantes o aromas y similares. Pueden usarse diversos tampones y medios para ajustar el pH para preparar una composición farmacéutica divulgada en la presente memoria descriptiva, siempre que la preparación resultante sea farmacéuticamente aceptable. Dichos tampones incluyen, sin limitación, tampones de acetato, tampones de fosfato, soluciones salinas tamponadas a pH neutro, solución salina tamponada con fosfato y tampones de borato. Se entiende que pueden usarse ácidos o bases para ajustar el pH de una composición como sea necesario. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, acetilcisteína, hidroxianisol butilado e hidroxitolueno butilado. Los conservantes útiles incluyen, sin limitación, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico y una composición de oxicloro estabilizada, por ejemplo, PURITE®. Los ajustadores de la tonicidad en una composición farmacéutica incluyen, sin limitación, sales tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol o glicerina y otros ajustadores de la tonicidad farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica puede proporcionarse en forma de sal y puede formarse con muchos ácidos, incluidos, pero no limitados a, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos o protónicos de otro tipo que las formas de base libre correspondientes. Se entiende que estas y otras sustancias conocidas en la técnica de la farmacología pueden incluirse en una composición farmacéutica útil en la invención.

Una composición farmacéutica útil en un procedimiento de la divulgación se administra a un ser humano o a otro mamífero en una cantidad eficaz. Dicha cantidad eficaz, generalmente, es la dosis mínima necesaria para lograr el efecto terapéutico deseado, que puede ser, por ejemplo, la cantidad aproximadamente necesaria para reducir los síntomas asociados con la exposición a la actividad de BoNT/A. Por ejemplo, la expresión "cantidad eficaz" cuando se usa con respecto al tratamiento de la exposición a la actividad de BoNT/A puede ser una dosis suficiente para reducir los síntomas, por ejemplo, en al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 100 %. Dicha dosis, generalmente, se encuentra en el intervalo de 0,1-1.000 mg/día y puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,1-500 mg/día, 0,5-500 mg/día, 0,5-100 mg/día, 0,5-50 mg/día, 0,5-20 mg/día, 0,5-10 mg/día o 0,5-5 mg/día, con la cantidad real que se va a administrar determinada por un médico que tenga en cuenta las circunstancias pertinentes, incluida la gravedad de la exposición a la BoNT/A, la edad y el peso del paciente, la condición física general del paciente, la causa de la exposición a BoNT/A y la vía de adminstración. Cuando se usa una administración repetida, la frecuencia de la administración depende, en parte, de la semivida de la composición farmacéutica. Los supositorios y las formulaciones de liberación prolongada pueden ser útiles en la invención, e incluyen, por ejemplo, parches dérmicos, formulaciones para depositar sobre o debajo de la piel y formulaciones para inyección intramuscular. Se entiende que las formulaciones de liberación lenta también pueden ser útiles en los procedimientos de la invención. El sujeto que recibe la composición farmacéutica puede ser cualquier mamífero u otro vertebrado capaz de experimentar una exposición a la actividad de BoNT/A, por ejemplo, un ser humano, primate, caballo, vaca, perro, gato o ave.

Pueden ser útiles diversas vías de administración para reducir la actividad de BoNT/A según un procedimiento de la invención. Una composición farmacéutica útil en los procedimientos de la invención puede administrarse a un mamífero mediante cualquiera de entre una diversidad de medios dependiendo de, por ejemplo, el tipo y localización de la exposición a BoNT/A que se va a tratar, la composición farmacéutica u otro compuesto que está incluido en la composición, y el historial, factores de riesgo y síntomas del sujeto. Las vías de administración adecuadas para los procedimientos de la invención incluyen tanto la administración sistémica como la local. Como ejemplos no limitantes, una composición farmacéutica útil para reducir la actividad de BoNT/A puede administrarse oralmente o mediante bomba subcutánea; mediante parche dérmico; mediante inyección intravenosa, subcutánea o intramuscular; mediante gotas, cremas, geles o pomadas tópicas; como una formulación de liberación prolongada implantada o inyectada; como un sistema de liberación bioerodibles o no bioerodibles; mediante minibomba subcutánea u otro dispositivo implantado; mediante bomba o inyección intratecal o mediante inyección epidural. Una lista de ejemplos de polímeros biodegradables y de procedimientos de uso se describe, por ejemplo, en HANDBOOK OF BIODEGRADABLE POLYMERS (Abraham J. Domb y col., ed., Overseas Publishers Association, 1997); CONTROLLED DRUG DELIVERY: DESIGNING TECHNOLOGIES FOR THE FUTURE (Kinam Park y Randy

J. Mrsny ed., American Chemical Association, 2000); Vernon G. Wong, Method for Reducing or Preventing Transplant Rejection in the Eye and Intraocular Implants for Use Therefor, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.699.493 (2 de marzo, 2004); Vernon G. Wong y Mae W. L. Hu, Methods for Treating Inflammation-mediated Conditions of the Eye, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.726.918 (27 de abril, 2004); David A. Weber y col., Methods and Apparatus for Delivery of Ocular Implants, documento de patente de Estados Unidos Nº US2004/0054374 (18 de marzo, 2004); Thierry Nivaggioli y col., Biodegradable Ocular Implant, documento de patente de Estados Unidos Nº US2004/0137059 (15 de julio, 2004). Se entiende que la frecuencia y duración de la dosificación dependerá, en parte, del alivio deseado y de la semivida de la composición tolerogénica.

En realizaciones particulares, un procedimiento de la invención se pone en práctica mediante administración periférica de una composición farmacéutica. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "administración periférica" o "administrado periféricamente" significa introducir un agente en un sujeto fuera del sistema nervioso central. La administración periférica abarca cualquier vía de administración diferente a la administración directa a la médula espinal o al cerebro. Como tal, está claro que la administración intratecal y epidural, así como la inyección o implantación craneal no están dentro del ámbito de la expresión "administración periférica" o "administrado periféricamente".

La administración periférica puede ser local o sistémica. La administración local da como resultado que se administran más de una composición farmacéutica a, y alrededor de, el sitio de administración local que a regiones que distan del sitio de administración. La administración local da como resultado el suministro de una composición farmacéutica a esencialmente la totalidad del sistema nervios periférico del sujeto y también puede dar como resultado el suministro al sistema nervioso central dependiendo de las propiedades de la composición.

Las vías de administración periférica útiles en los procedimientos de la invención abarcan, sin limitación, administración oral, administración tópica, intravenosa u otra inyección, y minibombas implantadas y otros dispositivos o formulaciones de liberación prolongada. Una composición farmacéutica útil en la invención puede administrarse periféricamente, por ejemplo, oralmente en cualquier forma aceptables tal como en un comprimido, líquido, cápsula, polvo o similar; mediante inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o parenteral; mediante difusión transdérmica o electroforesis; tópicamente en cualquier forma aceptables tal como en gotas, cremas, geles o pomadas; y mediane una minibomba u otro dispositivo o formulación de liberación prolongada implantado.

Otros aspectos de la presente invención proporcionan procedimientos para seleccionar una molécula capaz de competir con el BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A poniendo en contacto dicha muestra con una composición que comprende un FGFR3 y detectando si dicha molécula se une selectivamente a dicho FGFR3, en los que la unión selectiva de dicha molécula a dicho FGFR3 indica que dicha molécula es capaz de competir con BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intocarse con BoNT/A y en los que si dicha molécula es BoNT/A, dichos procedimientos no comprenden un ensayo de DL50. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "unión selectiva" significa que un agente de unión es capaz de unirse a su diana en condiciones fisiológicas, o en condiciones in vitro que sustancialmente se aproximen a las condiciones fisiológicas (es decir, tiene una Kd o constante de disociación inferior) que a otra molécula no diana de la superficie de la célula neuronal. "Kd" es la concentración molar del agente de unión a la que están unidas la mitad de las moléculas diana al agente de unión. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "ensayo DL50" significa un ensayo in vivo sobre la base de animales vivos de la actividad de nuerotoxinas que comprende detectar la dosis de nuerotoxina a la que el 50 % de los animales tratados muere, véase, por ejemplo, el ensayo de protección de ratones (MPA), Charles L. Hatheway y Carol Dang, Immunogenicity of the Neurotoxins of Clostridium botulinum, 93-107 (Neurological Disease and Therapy-THERAPY WITH BOTULINUM TOXIN, Joseph Jankovic y Mark Hallett ed., Marcel Dekker, 1994).

Se considera que cualquiera de las condiciones de ensayo, y todas ellas, adecuados para analizar una molécula capaz de competir con BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A puede ser útil, por ejemplo, en ensayos in vitro e in vivo. Además, se prevé también que puede usarse una amplia diversidad de formatos de procesamiento junto con los procedimientos divulgados en la presente memoria descriptiva, incluidos, sin limitación, procesamiento manual, procesamiento parcialmente automatizado, procesamiento semiautomatizado, procesamiento totalmente automatizado, procesamiento de alto rendimiento, procesamiento de alto contenido y similares o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se ha divulgado anteriormente, cualquiera de los procedimientos útiles para detectar la actividad de BoNT/A divulgado en la presente memoria descriptiva y cualquiera de las composiciones útiles para poner en práctica los procedimientos útiles para detectar la actividad de BoNT/A divulgado en la presente memoria descriptiva puede ser útil para analizar una molécula que compita con BoNT/A para unirse selectivamente a un FGFR3. Así, en un aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser codificado por una molécula de ácido nucleico de un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de pájaro tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. En otro aspecto de la presente realización, el FGFR3 puede ser un FGFR3 de mamífero tal como, por ejemplo, un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de rata o un FGFR3 de ratón; un FGFR3 de ave tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pollo; un FGFR3 de anfibio tal como, por ejemplo, un FGFR3 de tritón o un FGFR3 de rana; y un FGFR3 de pez tal como, por ejemplo, un FGFR3 de pez cebra. En otro aspecto de esta realización, un FGFR3 útil para analizar una molécula que compita con BoNT/A para unirse selectivamente al FGFR3 puede estar incluido de forma transitoria o estable en una célula. En otro aspecto de esta realización, una composición útil para analizar una molécula que compite con BoNT/A por unirse selectivamente a un FGFR3 comprende un FGFR3 y opcionalmente un poliisaligangliósido G1b tal como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b.

En otro aspecto de esta realización, una célula puede incluir células, tales como, por ejemplo, células neuronales que incluyen, sin limitación, células neuronales primarias; células neuronales inmortalizadas o establecidas; células neuronales transformadas; células tumorales neuronales; células neuronales transfectadas de forma estable o transitoria que expresan un FGFR3, y también incluyen, aunque no están limitadas a, células neuronales de mamífero, murinas, de rata, de primate y humanas. Otros aspectos de la invención incluyen células de, tales como, por ejemplo, líneas celulares neuronales que incluyen, sin limitación, líneas celulares de neuroblastoma, líneas celulares híbridas neuronales, líneas celulares de médula espinal, líneas celulares del sistema nervioso central, líneas celulares del córtex cerebral, líneas celulares de ganglio espinal, líneas celulares del hipocampo y líneas celulares de feocromocitoma. Los ejemplos de líneas celulares neuronales incluyen, por ejemplo, las líneas celulares de neuroblastoma BE(2)-C, BE(2)-M17, C1300, CHP-212, CHP-126, IMR 32, KELLY, LA-N-2, MC-IXC, MHH-NB-11, N18Tg2, N1E-115, N4TG3, Neuro-2A, NB41A3, NS20Y, SH-SY5Y, SIMA, SK-N-DZ, SK-N-F1, SK-N-MC y SK-NSH; las líneas celulares híbridas de neuroblastoma/glioma N18, NG108-15 y NG115-401L; las líneas celulares híbridas de neuroblastoma/neurona motora NSC-19 y NSC-32; las líneas celulares híbridas de neuroblastoma/neurona de ganglio espinal F11, ND-E, ND-U1, ND7/23, ND8/34 y ND27; la línea celular híbrida de neuroblastoma/neurona de hipocampo HN-33; las líneas celulares de médula espinal TE 189.T y M4b; las líneas celulares de córtex cerebral CNh, HCN-1a y HCN-2; la línea celular de ganglio espinal G4b; las líneas celulares de hipocampo HT-4, HT-22 y HN33; las líneas celulares que expresan FGFR3 H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 y UTMC-2. En otros aspectos de esta realización, una célula que expresa FGFR3 puede ser, por ejemplo, H929, JIM-3, KMS-11, KMS-18, LB278, LB375, LB1017, LB2100, LP-1, OPM-2, PCL1 UTMC-2, B9, TC, L6 y CFK2. Otros aspectos de esta realización incluyen células, tales como, por ejemplo, células neuronales que incluyen, sin limitación, células no neuronales primarias; células no neuronales inmortalizadas o establecidas; células no neuronales transformadas; células tumorales no neuronales; células no neuronales transfectadas de forma estable o transitoria que expresan un FGFR3, y también incluyen, aunque no están limitadas a, células no neuronales de mamífero, murinas, de rata, de primate y humanas. Otros aspectos de esta realización incluyen células tales como, por ejemplo, células no neuronales útiles en aspectos de la invención que incluyen, sin limitación, células de la pituitaria anterior; células suprarrenales, células pancreáticas, células de ovario, células renales, células de estómago, células sanguíneas, células epiteliales, fibroblastos, células de tiroides, condrocitos, células musculares, hepatocitos, células glandulares y células implicadas en la translocación del transportador de glucosa (GLUT4).

La molécula que se va a analizar en el procedimiento de análisis puede ser un compuesto orgánico "pequeño” de origen sintético, o puede ser una macromolécula (bien de origen sintético o bien natural), incluido, sin limitación, un polipéptido, tal como, por ejemplo, un factor del crecimiento, una neurotoxina, una neurotoxina modificada, un anticuerpo o un derivado de anticuerpo, un ácido nucleico, tal como, por ejemplo un aptámero; y un polisacárido, tal como, por ejemplo, un gangliósido o una lectina. En una realización, la molécula es una molécula sintética diseñada sobre la base de la estructura terciaria y conformación tridimensional de FGF o un anticuerpo que inhibe la unión de BoNT/A a un FGFR3. Dicha análisis de SAR (relación estructura/actividad) es rutinario en la técnica de la química medicinal, entre otros campos.

Puede usarse una amplia diversidad de ensayos para determinar si una molécula se une selectivamente a FGFR3, incluidos ensayos directos e indirectos de captación de toxina. Los ensayos para determinar las propiedades de unión o captación de BoNT/A pueden usarse para evaluar si una molécula se une selectivamene a un FGFR3. Dichos ensayos incluyen, sin limitación, ensayos de reticulación usando BoNT/A marcada, tales como, por ejemplo, T/ASBED; véase, por ejemplo, el ejemplo II de la presente memoria descriptiva y [125I] BoNT/A; véanse, por ejemplo, Noriko Yokosawa y col., Binding of Clostridium botulinum type C neurotoxin to different neuroblastoma cell lines, 57(1) Infect. Immun. 272-277 (1989); Noriko Yokosawa y col., Binding of botulinum type Cl, D and E neurotoxins to neuronal cell lines and synaptosomes, 29 (2) Toxicon 261-264 (1991) y Tei-ichi Nishiki y col., Identification of protein receptor for Clostridium botulinum type B neurotoxin in rat brain synaptosomes, 269(14) J. Biol. Chem. 10498-10503 (1994). Otros ensayos no limitantes incluyen ensayos inmunocitoquímicos que detectan la unión a toxina usando anticuerpos marcados o no marcados; véase, por ejemplo, Atsushi Nishikawa y col., The receptor and transporter for internalization of Clostridium botulinum type C progenitor toxin into HT-29 cells, 319(2) Biochem. Biophys. Res. Commun. 327-333 (2004), y ensayos de inmunoprecipitación; véase, por ejemplo, Yukako Fujinaga y col., Molecular characterization of binding subcomponents of Clostridium botulinum type C progenitor toxin for intestinal epithelial cells and erythrocytes, 150(Pt 5) Microbiology 1529-1538 (2004). Los anticuerpos útiles para estos ensayos incluyen, sin suponer limitación, anticuerpos seleccionados contra una BoNT/A, anticuerpos seleccionados contra un receptor de BoNT/A, tal como, por ejemplo, FGFR3, anticuerpos seleccionados contra un gangliósido, tal como, por ejemplo, GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b y anticuerpos seleccionados contra un compuesto de ensayo, tal como, por ejemplo, una molécula que se une selectivamente al receptor de BoNT/A, modulando la unión selectiva la actividad de BoNT/A. Si el anticuerpo está marcado, la unión de la molécula puede detectarse usando diversos medios, incluidos inmunotransferencia (Western), observación microscópica directa de la localización celular del anticuerpos, medición de anticuerpo unido a la célula o al sustrato seguido de etapa de lavado o electroforesis, usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Si el anticuerpo no está marcado, puede usarse un anticuerpo secundario marcado para la detección indirecta de la molécula unida y la detección puede realizarse como para un anticuerpo marcado. Se entiende que estos y otros ensayos similares que determinan las propiedades o características de captación de BoNT/A pueden ser útiles para seleccionar una neurona u otras células en aspectos de la invención.

Los ensayos de seguimiento de la liberación de una molécula tras exposición a BoNT/A también pueden ser útiles para evaluar si una molécula se une a FGFR3. En estos ensayos, la inhibición de la liberación de la molécula tendría lugar en células que expresan un FGFR3 después del tratamiento con BoNT/A. Como ejemplo no limitante, con el ensayo de inhibición de la liberación de insulina divulgado en la presente memoria descriptiva puede realizarse un seguimiento de la liberación de una molécula tras exposición a BoNT/A y, por lo tanto, ser útil en la evaluación de si una molécula se une selectivamente a FGFR3 (véase el ejemplo I). Otros ensayos no limitantes incluyen procedimientos que miden la inhibición de la liberación de catecolamina radiomarcada desde neuronas, tales como, por ejemplo, la liberación de [3H] norsuprarrenalina o [3H] dopamine; véase, por ejemplo, A Fassio y col., Evidence for calcium-dependent vesicular transmitter release insensitive to tetanus toxin and botulinum toxin type F, 90(3) Neuroscience 893-902 (1999) y Sara Stigliani y col., The sensitivity of catecholamine release to botulinum toxin C1 and E suggests selective targeting of vesicles set into the readily releasable pool, 85(2) J. Neurochem. 409-421 (2003), o miden la liberación de catecolamina usando procedimientos flurométricos; véase, por ejemplo, Anton de Paiva y col., A role for the interchain disulfide or its participating thiols in the internalization of botulinum neurotoxin. A revealed by a toxin derivative that binds to ecto-acceptors and inhibits transmitter release intracellularly, 268(28) J. Biol. Chem. 20838-20844 (1993); Gary W. Lawrence y col., Distinct exocytotic responses of intact and permeabilised chromaffin cells after cleavage of the 25-kDa synaptosomal-associated protein (SNAP-25) or synaptobrevin by botulinum toxin A or B, 236(3) Eur. J. Biochem. 877-886 (1996); y Patrick Foran y col., Botulinum neurotoxin Cl cleaves both syntaxin and SNAP-25 in intact and permeabilized chromaffin cells: correlation with its blockade of catecholamine release, 35(8) Biochemistry 2630-2636 (1996); y procedimientos que miden la inhibición de liberación de hormonas desde células endocrinas, tales como, por ejemplo células de la pituitaria anterior o células de ovarios. Se entiende que estos ensayos y otros similares de análisis de liberación de moléculas pueden ser útiles para evaluar si una molécula se une selectivamente a FGFR3.

Como ejemplos no limitantes, un ensayo de inhibición de liberación de insulina puede usarse para analizar si una molécula se une selectivamente a FGFR3 en una célula que contiene FGFR3 capaz de segregar insulina; un ensayo de inhibición de liberación de noradrelanina puede usarse para analizar si una molécula se une selectivamente a FGFR3 en una célula que contiene FGFR3 capaz de segregar noradrelanina y un ensayo de inhibición de liberación de estrógeno puede usarse para analizar si una molécula se une selectivamente a FGFR3 en una célula que contiene FGFR3 capaz de segregar estrógeno.

Los ensayos para detectar la escisión de un sustrato de BoNT/A después de exposición a BoNT/A también pueden usarse para evaluar si una molécula se une selectivamente a un FGFR3. En estos ensayos, la generación de un producto de escisión de BoNT/A se detectaría en células que expresan un FGFR3 después del tratamiento con BoNT/A. Como ejemplo no limitante, en ensayo de escisión de SNAP-25 que se divulga en la presente memoria descriptiva puede detectar la escisión de un sustrato de BoNT/A después de la exposición a BoNT/A y, por lo tanto, ser útil para evaluar si una molécula se une selectivamente a un receptor de BoNT/A (véase el ejemplo I). Otros procedimientos no limitantes útiles para detectar la escisión de un sustrato de BoNT/A después de la exposición a BoNT/A se describen por, por ejemplo, Lance E. Steward y col., FRET Protease Assays for Botulinum Serotype A/E Toxins, Publicación de patente de Estados Unidos Nº. 2003/0143650 (31 de julio, 2003) y Ester Fernandez-Salas y col., Cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Assays for Clostridial Toxins, Publicación de patente de Estados Unidos Nº 2004/0072270 (15 de abril, 2004). Se entiende que estos ensayos y otros similares de escisión de sustrato de BoNT/A pueden ser útiles para evaluar si una molécula se une selectivamente a FGFR3.

Como ejemplos no limitantes, el análisis de inmunotransferencia (Western) usando un anticuerpo que reconoce el producto de escisión de SNAP-25 de BoNT/A puede usarse para determinar si una molécula se une selectivamente a FGFR3. Los ejemplos de anticuerpos anti-SNAP-25 útiles para estos ensayos incluyen, sin limitación, antisuero anti-SNAP25197 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 Nº 1 (Allergan, Inc., Irvine, CA, Estados Unidos), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón SMI-81 (Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD, Estados Unidos), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón CI 71.1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo antiSNAP-25 monoclonal de ratón CI 71.2 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania), anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón SP12 (Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos), antisuero anti-SNAP-25 policlonal de conejo (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) y antisuero anti-SNAP-25 policlonal de conejo (Abcam, Cambridge, MA, Estados Unidos).

Los ensayos que detectan la unión competitiva de una molécula con BoNT/A para unirse selectivamente a un FGFR3 también pueden usarse para evaluar si una molécula se une selectivamente a un FGFR3. En estos ensayos, una reducción en la actividad de BoNT/A se detectaría como que la cantidad de una molécula que compite con BoNT/A para unirse selectivamente a un BoNT/A aumentaría. En un ejemplo no limitante, el ensayo de inhibición competitiva usando ligandos FGF divulgados en la presente memoria descriptiva puede usarse para detectar la unión competitiva de una molécula con BoNT/A para unirse selectivamente a un FGFR3 y, por lo tanto, ser útil para evaluar si una molécula se une selectivamente aun receptor de BoNT/A (véase el ejemplo II). De este modo, en un aspecto de esta realización, los ensayos de unión competitiva que usan una molécula de unión a FGFR3 con BoNT/A para unirse selectivamente a FGFR3 pueden usarse para evaluar si una molécula se une selectivamente a un FGFR3.

Otros aspectos de referencia proporcionan procedimientos para hacer una célula susceptible de escindir proteínas SNARE mediante BoNT/A, que comprenden inducir dicha célula a expresar un FGFR3. Otros aspectos de referencia proporcionan procedimientos para hacer una célula susceptible de escindir proteínas SNARE mediante BoNT/A, que comprenden inducir de forma transitoria a dicha célula a expresar un FGFR3. Otros aspectos de referencia proporcionan procedimientos para hacer una célula susceptible de escindir proteínas SNARE mediante BoNT/A, que comprenden inducir de forma estable a dicha célula a expresar un FGFR3.

Otros aspectos de referencia proporcionan procedimientos de comercialización de una neurotoxina capaz de unirse selectivamente al mismo FGFR3 que BoNT/A que comprenden obtener la aprobación de comercialización de una autorizad reguladora gubernamental o regional para una neurotoxina terapeútica, en los que dicha neurotoxina se analiza para evaluar su unión selectiva a una célula que comprende poner en contacto dicha neurotoxina con una composición que comprende un FGFR3 y detector si dicha neurotoxina se une selectivamente a dicho FGFR3, en los que la unión selectiva de dicha neurotoxina a dicho FGFR3 indica que dicha neurotoxina es capaz de unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A y en los que si dicha molécula es BoNT/A, dichos procedimientos no comprenden un ensayo de DL50; envasar dicha neurotoxina para su venta de un modo consecuente con los requerimientos de dicha autoridad reguladora y vender dicha neurotoxina.

Otros aspectos de referencia proporcionan procedimientos de comercialización de una neurotoxinacapaz de unirse selectivamente al mismo FGFR3 que BoNT/A que comprenden obtener la aprobación de comercialización de una autoridad reguladora gubernamental o regional para una neurotoxina terapeútica, en los que dicha neurotoxina se analiza para evaluar su unión selectiva a una célula que comprende poner en contacto dicha neurotoxina con una célula que contiene un FGFR3 exógeno en los que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectar la presencia de actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con relación a una célula control, siendo indicativo de la actividad de BoNT/A una diferencia en la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control; envasar dicha neurotoxina para su venta de un modo consecuente con los requerimientos de dicha autoridad reguladora y vender dicha neurotoxina.

En otro aspecto de referencia, la memoria descriptiva se refiere a un polipéptido que comprende al menos la región Hc de BONT/A, que se produce a partir de una preparación en masa o formulada, en el que la preparación en masa

o formulada se analiza para evaluar la unión específica a células neuronales usando un procedimiento que comprende poner en contacto dicho polipéptido con una composición que comprende un receptor FGFR3 y, opcionalmente, un gangliósido GT1b y detectar si dicho polipéptido se une selectivamente a FGFR3.

En otra realización similar al aspecto de la invención anterior, el polipéptido comprende al menos un dominio de unión a FGFR3 diferente al dominio Hc de BoNT/A. Dicho dominio de unión puede comprender, por ejemplo, un FGF, tal como FGF 1, FGF2, FGF4, FGF8 o FGF 9, o un anticuerpo anti-FGFR3. Además, el polipéptido puede contener opcionalmente un dominio de traslocación tal como el domino HN de BoNT/A. Adicionalmente, el polipéptido contendrá generalmente una cadena ligera de nuerotoxina clostridial o variación de la misma, la naturaleza y/o fuente de la cadena ligera puede proporcionar diferencias en la amplitud y la semivida del efecto terapéutico del polipéptido.

De este modo, en esta realización, el polipéptido reivindicado se produce (producción que puede incluir etapas de purificación, tratamiento enzimático y/o oxidación) a partir de una preparación en masa o en formulación. En una realización, la preparación puede ser, por ejemplo, un lisado celular producido a partir de la fermentación de una cepa de Clostridium botulinum productora de BoNT/A, o a partir de de una célula huésped de mamífero, de insecto o bacteriana que produce una versión recombinante de BoNT/A. Dicha preparación en masa tambiénpuede producirse usando metodologías de transcripción exentas de células. En otra realización, la preparación puede ser BoNT/A purificada formulada con proteínas estabilizantes asociadas, tales como albúmina de suero. En cada caso, la preparación puede comprender moléculas de BoNT/A que se desnaturalizan o se pliegan incorrectamente de otro modo de tal modo que no se unen a las células diana. La potencia y/o actividad específica de la preparación, o de las fracciones purificadas de la preparación, puede detectarse usando el procedimiento de ensayo reivindicado.

Alternativamente, el polipéptido que se va a analizar puede comprender sólo una porción de la molécula de BoNT/A completa. Por ejemplo, la preparación en masa puede contener solo la cadena pesada de BoNT/A, como producción por separado de las cadenas pesada y ligera de la toxina puede ser una ruta preferente de evitar la exposición accidental a la neurotoxina por parte de técnicos de laboratorio.

Como otro ejemplo de la realización anterior, el polipéptido puede comprender un polipéptido recombinante quimérico que contiene la región Hc de la cadena pesada de BoNT/A (o algún otro resto de unión a FGFR3, tal como e mismo FGF). El polipéptido quimérico comprende regiones de secuencias de aminoácidos adicionales a, o distintas a, las que están presentes en una molécula de BoNT/A natural. Por ejemplo, las toxinas botulínica y del tetanus pueden usarse como base para la creación de proteínas de transporte, véase, por ejemplo, James Oliver Dolly y col., Modification of clostridial toxins for use as transport proteins, documento de patente de Estados Unidos Nº 6.203.794 (20 de marzo, 2001). La cadena ligera de estas proteínas de transporte generalmente o bien se reemplazan por un resto terapéutico o se inactivan y se acoplan a dicho resto terapéutico. Adicionalmente, las neurotoxinas quiméricas pueden fabricarse de modo que comprendan polipéptidos que contienen dominios de más de una neurotoxina., James Oliver Dolly y col., Activatable Recombinant Neurotoxins, Publicación internacional Nº WO 01/14570 (1 de marzo, 2001). De este modo, este aspecto de la invención también comprende, como una realización, neurotoxinas quiméricas que contienen al menos el dominio HC de BoNT/A. Dichas moléculas pueden ser útiles en la modulación del tiempo o la extensión de la inhibición de la liberación de vesículas secretoras. Además, puede ser deseable para dirigir agents, tales como agentes terapéuticos, a la superficie extracelular de la membrana celular neuronal. De este modo, un agente puede unirse (por ejemplo, como una proteína de fusión o mediante conjugación postraslacional) a la porción Hc de BoNT/A. En tal caso, el lisado celular o mezcla de reacción de conjugación puede comprender una preparación en lote según este aspecto de la invención.

Los polipéptidos a los que se ha hecho referencia anteriormente se analizan para evaluar su unión y/o internalización esencialmente como se ha mencionado anteriormente en la realización del procedimiento de análisis descrito.

En otra realización más, un aspecto de referencia se refiere a un procedimiento de comercialización de un polipéptido que contiene una región capaz de unirse al receptor FGFR3 que comprende obtener el permiso de una autoridad reguladora de fármacos regional o gubernamental para vender dicho polipéptido, en el que dicho polipéptido se produce primeramente como una preparación en masa que se analiza para evaluar la unión selectiva de dicho polipéptido a células neuronales poniendo en contacto la preparación en masa que contiene dicho polipéptido con una composición que comprende un receptor FGFR3 y, opcionalmente, el gangliósido GT1b y detectar si dicho polipéptido se une selectivamente a FGFR3 en dichas condiciones, envasar dicho polipéptido para su venta de un modo consecuente con los requerimientos de dicha autoridad reguladora y ofrecer dicho polipéptido en el mercado.

Este aspecto se refiere a un procedimiento de comercialización de un polipéptido que contiene la región HC de una toxina BoNT/A. El polipéptido en cuestión es esta realización de la invención se produce a partir de una preparación en masa que se analiza para evaluar la pureza o actividad usando el procedimiento de análisis descrito previamente. En una etapa de este procedimiento, el permiso se obtiene de un organismo regulador para la comercialización de dicho polipéptido. En este contexto "permiso" puede ser tácito o expreso; es decir, el permiso o la aprobación pueden obtenerse de la autoridad reguladora para la venta de un agente terapéutico o composición que comprende dicho polipéptido, en cuyo caso ”permiso” es aprobación de comercialización para la venta de dicho agente o composición. Alternativamente, "permiso", tal como se usa en el presente documento puede comprender el asentimiento, tanto dado de forma afirmativa o manifestado en su falta de objeciones, de dicha autoridad reguladora para la venta continua de un producto que contiene un polipéptido analizado de este modo nuevo. Como anteriormente, el polipéptido puede comprender BoNT/A, o un derivado de la misma, o una proteína de fusión o conjugado que contiene la región Hc de la cadena pesada de BoNT/A.

El producto terapéutico que comprende el polipéptido contenido originalmente en la preparación en masa analizado de este modo se etiqueta según los requerimientos de al autoridad reguladora. Después, el producto se ofrece para su venta. Ofrecer para su venta puede comprender actividad de promoción o venta, seminarios educativos dirigidos a médicos, hospitales, mutuas o pacientes, conversaciones con organismos oficiales locales, regionales o gubernamentales que tratan el reembolso de ayudas (tales como Medicare o Medical en Estados Unidos).

Ejemplos

Ejemplo I

Identificación de un receptor de BoNT/A usando una complementación genética

Procedimiento 1. Identificación de células útiles en el cribado de un receptor de BoNT/A

1a. Identificación de células que carecen del receptor de BoNT/A usando un ensayo de inhibición de la liberación de insulina

Para determinar si las células HIT-T15 expresan un receptor para BoNT/A, se realizó un ensayo de inhibición de liberación de insulina. En respuesta a la estimulación con glucosa, la línea celular de insulinoma de hámster HIT-T15 segrega insulina en un proceso exocítico que depende de la actividad de SNAP-25 para el anclaje y fusión a la vesícula. Si las células HIT-T15 carecen de un receptor de BoNT/A, estas células serían incapaces de captar BoNT/A después de una exposición a esta toxina y la secreción de insulina podría tener lugar en presencia de alta glucosa en el medio. No obstante, si las células HIT-T15 contienen un receptor de BoNT/A, la secreción de insulina sería inhibida después del tratamiento con BoNT/A debido a que la toxina podría intoxicar la célula y escindir el SNAP-25.

Para realizar un ensayo de inhibición de la liberación de insulina, se plaqueó una densidad celular adecuada de aproximadamente 1,5 x 105 células/ml de células HIT-T15 en pocillos individuales de placas de cultivo hístico recubiertas con poli-D-lisina/laminina de 6 pocillos que contenían 3 ml de medio Tagle modificado de Dulbecco completo (DMEM), suplementado con suero de bovino fetal (FBS) al 10 %, 1 x solución de penicillina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), y se cultivó en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las células alcanzaron una densidad de aproximadamente 5 x 105 células/ml (6-16 horas). Un grupo de células HIT-T15 se trató con una concentración aproximadamente 1 nM de PURE-A mediante introducción de la toxina por electroporación usando un juego GENE PULSER® II a 960 µF y 0,28 kV (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Estados Unidos). Un grupo de control no tratado se sometió a electroporación sin PURE-A. El medio de los pocillos que contenía células electroporadas tratados y no tratadas se reemplazó por 3 ml de DMEM completo nuevo suplementado con bien glucosa 5,6 mM (baja glucosa) o bien glucosa 25 mM (alta glucosa) y estas células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 1 hora para inducir la secreción de insulina. El medio acondicionado se transfirió a tubos de 15 ml y se determinó la cantidad de insulina presente en las muestras de medio acondicionado usando un ensayo ELISA de insulina (Peninsula Laboratories, Inc., San Carlos, CA, Estados Unidos). La exocitosis se expresa como la cantidad de insulina segregada por 1,5 x 105 células/hora. La liberación de insulina se detectó en células no tratadas con BoNT/A estimuladas por glucosa 25 mM, pero la secreción de insulina se inhibió en células tratadas con BoNT/A (véase la figura 3a). Estos datos indican que la liberación de insulina en células HIT-T15 está mediada, en parte, por SNAP-25, pero que éstas carecen de un receptor de BoNT/A.

1b. Identificación de células que carecen del receptor de BONT/A usando un ensayo de escisión de SNAP-25

Para determinar si las células HIT-T15 expresan un receptor para BoNT/A, se realizó un ensayo de escisión de SNAP-25. Si las células HIT-T15 carecen de un receptor de BoNT/A, entonces solo se detectaría la presencia de sustrato SNAP-25 mediante un análisis de inmunotransferencia (Western). Sin embargo, si las células FUT-T15 contienen un receptor de BoNT/A, entonces la toxina podría intoxicar la célula y se detectaría la presencia de producto de SNAP-25197 de BoNT/A escindido.

Para realizar un ensayo de escisión de SNAP-25, las células se cultivaron en placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina/laminita y se trataron con PURE-A tal como se ha descrito en el ejemplo I, 1a. Las células se recogieron en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y se transfirieron a tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Las células se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía N-(2hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de

magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(□-aminoetil éter) N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10 % y Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol) al 1 % (V/V), con rotación durante 1 hora a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechos y el sobrenadante se transfirió a tubos siliconizados nuevos. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o una concentración superior.

Para detectar la presencia de sustrato BoNT/A escindido, las muestras se hirvieron durante 5 min, y se separaron partes alícuotas de 40 µl por electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida preformados con bis-tris al 4-12 % NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) en condiciones reductoras desnaturalizantes. Los péptidos separados se transfirieron del gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) mediante inmunotransferencia (Western) usando un aparato celular de transferencia electroforética semiseca Trans-Blot® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Estados Unidos). Las membranas de PVDF se bloquearon incubando a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contenía solución salina tamponada con tris 25 mM (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol clorhídrico 25 mM (Tris-HCI)(pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM), TWEEN-20® al 0,1 %, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán, albúmina de suero bovino al 2 %, leche desnatada seca al 5 %. Las membranes bloqueadas se incubaron a 4 °C durante la noche en solución salina tamponada con tris TWEEN-20® (solución salina tamponada con tris 25 mM, TWEEN-20® al 0,1 %, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán) que contenía una dilución 1:5.000 de antiseurpo anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 Nº 1, un anticuerpo policlonal que es específico para el producto de escisión de SNAP25197 y no reacciona de forma cruzada con SNAP-25206 de longitud completa (Allergan, Inc., generado mediante contrato con Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos). Las manchas analizadas de anticuerpo primario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con tris TWEEN-20®. Las membranes lavadas se incubaron a temperature ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada con tris TWEEN-20® que contenía una dilución 1:20.000 de anticuerpo de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina G (IgG, H+L) anti-conejo policlonal de cabra, conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos) como anticuerpo secundario. Las manchas analizadas de anticuerpo secundario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con tris TWEEN-20®. La detección del producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se visualizó usando el sistema de detección mediante inmunotransferencia (Western) ECL Plus™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos) y se realizó una imagen de la membrana y el producto de escisión se cuantificó con un programa informático captador de imágenes en modo variable y de análisis del captador de imágenes Typhoon 9410 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos). La elección del tamaño en píxeles (100 a 200 píxeles) y los ajustes de voltaje PMT (350 a 600, normalmente 400) dependió de la mancha individual. Se detectó un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A en células HIT-T15 tratadas con BoNT/A, pero no en células no tratadas, lo que indica que las células HIT-T15 expresan SNAP-25 pero no el receptor de BoNT/A (véase la figura 3b).

1c. Evaluación de la exposición a la BoNT/A sobre el crecimiento de HIT-T15

Para evaluar si la presencia de toxina en las células afecta al crecimiento celular, se electroporaron células HIT-T15 tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 1a y se realizó un seguimiento durante 10 días. La figura 4a demuestra que la presencia de la toxina retrasa el crecimiento en comparación con los controles, pero las células tratadas con toxina eran capaces de replicarse normalmente después de un periodo de recuperación. También se analizaron partes alícuotas celulares durante los días 3, 5, 7 y 10 para evaluar la presencia del producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A usando el ensayo de escisión de SNAP-25 tal como se ha descrito en el ejemplo I, 1b. La figura 4b muestra que la escisión de SNAP-25 se detectó mediante análisis de inmunotransferencia (Western) en todos los puntos temporales analizados cuando se introdujo PURE-A en las células.

2. Identificación del receptor de BoNT/A usando complementación genética

Para identificar un receptor de BoNT/A se clonó una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de BoNT/A por complementación genética. Este procedimiento implica la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica el receptor de BoNT/A en una línea celular que no contiene el receptor de forma natural por transducción retroviral; véase, por ejemplo, Mitchell H. Finer y col., Methods for Production of High Titer Virus and High Efficiency Retroviral Mediated Transduction of Mammalian Cells, documento de patente de Estados Unidos Nº 5.858.740 (12 de julio, 1999).

2a. Producción de una solución madre retroviral que contiene los constructos de expresión pLIB

Para producir una solución madre retroviral que contiene los constructos de expresión que codifican moléculas de ácido nucleico de cerebro humano, se plaquearon aproximadamente 5x105 células basadas en HEK 293 (células AmphoPack™ 293; BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos) en placas de cultivo hístico de 60 mm que contenían 5 ml medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) completo, suplementado con suero de bovino fetal (FBS) al 10 %, 1x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y glutamina 4mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las células alcanzaron del 60 % al 80 % de confluencia o una densidad de aproximadamente 1 a 2 x 106 células/ml (12-24 horas). El día de la transfección, el medio DMEM completo suplementado se reemplazó por 3 ml de medio en suero reducido OPTI-MEM. Se preparó una solución de transfección de 500 µl añadiendo 250 µl de medio en suero reducido OPTI-MEM que contenía 15 µl de LipofectAmine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos a 250 µl de medio en suero reducido OPTI-MEM que contenía 5 µg de moléculas de acido derivadas de células cerebrales humanas que contenían constructos de expresión retroviral pLIB (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos). Esta transfección se incuba a temperature ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Después, la solución de transfección de 500 µl se añadió a las células AmphoPack™ 293 y las células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 8-10 horas. El medio de transfeccion se reemplazó por 3 ml de DMEM completo suplementado nuevo y las células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 48-72 horas. Las células que contienen retrovirus se recogen separando las células usando el medio de cultivo y raspando células de la placa de cultivo. Las células separadas y el medio se transfieren a un tubo de 15 ml y se centrifugan (5,000x g a 20 °C durante 15 minutos) para formar pellas con los desechos celulares. El sobrenadante clarificado que contiene las partículas retrovirales se transfiere a crioviales de 2 ml en partes alícuotas de 1 ml y debería contener aproximadamente de 5 x 104 a 5 x 106 ut/ml de particulas retrovirales. Las partes alícuotas pueden almacenarse a 80 °C hasta que se necesiten.

2b. Transducción de células con una solución madre retroviral que contiene los constructos de expresión pLIB

Para transducir células con una solución madre retroviral que contiene los constructos de expresión que codifican moléculas de ácido nucleico de cerebro humano, se plaquearon aproximadamente 5x105 células HIT-T15 en placas de cultivo hístico de 60 mm que contenían 5 ml medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) completo, suplementado con suero de bovino fetal (FBS) al 10 %, 1x solución de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y glutamina 4 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las células alcanzaron del 60 % al 80 % de confluencia o una densidad de aproximadamente 5 x 105 células/ml (6-16 horas). Se inocula a las células solución madre retroviral que contiene moléculas de ácido nucleico derivadas de células cerebrales humanas (véase el ejemplo I, 2a), usando una multiplicidad de infección adecuada. Después se añadieron aproximadamente 4-8 µg/ml de polibreno y las células se incubaron durante aproximadamente 16-24 horas en una incubadora a 37 ºC en atmósfera de dióxido de carbono al 5 %. El medio de transfeccion se reemplazó por 5 ml de DMEM completo suplementado nuevo y las células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 4 días. Las células transducidas se usaron después para realizar un ensayo de cribado para identificar un receptor de BoNT/A. Para más detalles sobre los procedimientos descritos en este ejemplo, véase Retroviral Gene Transfer and Expresion User Manual PT3132-1 (PR43789), BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos (3 de marzo, 2004).

2c. Cribado de células HIT-T15 que expresan una biblioteca de ADNc retroviral

Para cribar células que expresan un receptor de BoNT/A, se analizaron células HIT-T15 transducidas tal como se describe en el ejemplo I, 2b sobre la base de su capacidad de unirse a perlas Dynex recubiertas con Pure A (ref). Se añadieron aproximadamente 7,5 mg de perlas magnéticas Dynabeads® (Dynal Biotechnology, LLC, Brown Deer, WI, Estados Unidos) recubiertas con un anticuerpo contra la cadena ligera de BONT/A al medio durante 30 minutos a 4 °C y las células unidas a la cadena ligera de BoNT/A se aislaron como grupos de células después de la exposición a un imán. Estas células aisladas se lavaron una vez con PBS y se transfirieron a placas de cultivo hístico nuevas de 60 mm que contenían 5 ml de DMEM completo. Estas células se volvieron a cribar con 7,5 mg de perlas magnéticas Dynabeads® recubiertas con PURE-A durante 30 minutos a 4 °C y las células unidas a PURE-A se aislaron como grupos de células después de la exposición a un imán (véase la figura 5). Estas colonias celulares reaisladas se transfirieron a placas de 96 pocillos que contenían 0,25 ml de DMEM complete y las células se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta confluencia.

El análisis de la presencia de un receptor de BoNT/A en células individuales contenidas en placas de 96 pocillos se llevó a cabo usando el ensayo de inhibición para el ensayo de liberación de insulina, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 1a. Las líneas celulares que contenían un receptor de BoNT/A se seleccionaron sobre la base de la detección de la inhibición de liberación de insulina. La figura 6 muestra que las líneas celulares HITT15 transducidas C6 y C7 como líneas celulares candidatas que expresan un receptor de BoNT/A. Para confirmar estos resultados, los cultivos de clones C6 y C7 se expanden tal como se han descrito anteriormente en el ejemplo I, 2a y se analizan usando el ensayo de inhibición de liberación de insulina y el ensayo de escisión de SNAP-25 tal como se han descrito en el ejemplo I, 1b. Los resultados indican que un receptor BoNT/A está presente en estas líneas celulares sobre la base de la inhibición de la liberación de insulina (véase la figura 7a) y la presencia de una producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A (véase la figura 7b).

2d. Clonación de un receptor de BoNT/A

Para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de BoNT/A, se purificará ADN de aislados de células HIT-T15 que contienen receptor de BoNT/A identificados anteriormente en el ejemplo I, 2c y la molécula de ácido nucleico que codifica el receptor de BoNT/A se clonará usando el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El AND genómico de la línea cellular C7 se aislará mediante un procedimiento de lisis alcalina y se amplificará mediante reacciones PCR usando el kit de PCR ADVANTAGE® Genomic (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, Estados Unidos) y los dos oligonucleótidos siguientes 5’-AGCCCTCACTCCTTCTCTAG-3’ (SEC ID Nº: 29) y 5’-ACCTACAGGTGGGGTCTTTC ATTCCC-3’ (SEC ID Nº: 30). Las reacciones se incubarán a 95 °C durante 1 minuto, seguido por 25 ciclos a 68 °C durante 30 segundos y 95 °C durante 30 segundos, seguido por 1 ciclo a 68 °C de 6 minutos y una incubación final a 4 °C. El producto de PCR resultante se purificará mediante reacción PCR usando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN, Inc., Valencia, CA, Estados Unidos) y se someterán a una segunda amplificación PCR. Los oligonucleótidos usados en la segunda PCR serán cebadores anidados diseñados para hibridarse a secuencias encontradas dentro del producto de PCR purificado originalmente y tendrán las secuencias de nucleótidos siguientes: 5’-CCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACC-3’ (SEC ID Nº: 31) y 5’-TGCCAAACCTACA GGTGGGGTCTTT-3’ (SEC ID Nº: 32). El producto de ADN anidado resultante se subclonará en un vector pTOPO®-XL usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos). La mezcla de ligación se transformará en células E. coli TOP10 químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estaods Unidos) usando un procedimiento de choque térmico, se plaqueará en placas de agar Luria-Bertani al 1,5 % (pH 7,0) que contenína 100 µg/ml de ampicilina, y se situarán en una incubadora a 37 °C para su cultivo durante la noche. Las colonias resistentes a ampilicina se analizarán usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se cribarán constructo de receptores candidatos por cartografiado de endonucleasa de restricción para determinar la presencia y la orientación del fragmento de inserto correcto. Los cultivos que contienen el constructo de expresión deseado se usarán para inocular matraces con deflectores de 1 l que contienen 200 ml de medio Luria-Bertani que contiene 100 µg/ml de ampicilina y se situarán en una incubadora a 37 °C, agitando a 250 rpm, para un cultivo durante la noche. El ADN del plásmido purificado correspondiente a un constructo de expresión se aislará usando el procedimiento QIAGEN Maxi-prep (QIAGEN, Inc., Valencia, CA, Estados Undiso) y se secuenciará para verificar que se ha fabricado el constructo de expresión correcto (contrato de servicio con Sequetech Corp., Mountain View, CA, Estados Unidos). Esta estrategia de clonación identificará la composición de secuencia del receptor de BoNT/A contenido en el aislado HIT-T15 C7.

Ejemplo II

Identificación de un receptor de BoNT/A usando un procedimiento de reticulación

Procedimiento 1. Identificación de líneas celulares con captación de alta afinidad para BoNT/A

Pueden esperarse diversas sensibilidades para cada uno de los serotipos de BoNT sobre la base de los sistemas de receptores individuales para cada una de los diferentes serotipos de toxina y su expresión diferente en diferentes líneas celulares. La presencia en una célula de un sistema receptor de alta afinidada para BoNT puede caracterizarse mediante dos atributos: una captación rápida de la neurotoxina por parte de la célula y una concentración baja de neurotoxina necesaria para la intoxicación celular. Para identificar una línea celular que tenga un sistema receptor de alta afinidad por una BoNT/A, analizamos líneas celulares usando uno de dos ensayos de escisión in vitro diferentes, uno para determinar la cantidad de toxina requerida para la intoxicación y otro para determinar la duración de tiempo necesario para que la célula capte la neurotoxina.

1a. Ensayo para determinar la concentración de BoNT/A necesaria para la intoxicación de la célula

Con el fin de evaluar la cantidad de BoNT/A necesaria para intoxicar una célula, se cribó un panel de líneas celulares de mamífero de origen neuronal (véase la tabla 3) para determinar si la exposición a la toxina daría como resultado la escisión de SNAP-25 expresado de forma endógena. Una densidad de semillas adecuada de células de cada línea se plaqueó en pocillos individuales de placas de cultivo hístico de 6 pocillos recubiertas con poli D5 lisina/laminina que contenían 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 3) y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante 24 horas. Se añadió BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos) a diferentes concentraciones (0 nM, 1 nM, 5 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50nM) al medio de cultivo que contenía las células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Las células se recogieron en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y después se 10 transfirieron a tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Las células se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(K-aminoetil éter) N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10 % y Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol) al 1 % (V/V), con rotación durante 1 hora a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechos y el sobrenadante se transfirió a

15 tubos siliconizados nuevos. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o una concentración superior.

La presencia de un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se determinó mediante inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 1b. Un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se detectó en las líneas celulares SH-SY5Y, NG108-15, N1E-115, Neuro-2A y SK-N-BE(2) después de una

20 incubación de al menos 8 horas con al menos BoNT/A 5 nM, indicando de este modo la capacidad de BoNT/A de intoxicar estas líneas celulares (véase la figura 8a).

La línea celular de neuroblastoma de ratón Neuro-2A se analizó adicionalmente con bajas concentraciones de BoNT/A para determinar la concentración de neurotoxina necesaria para escindir SNAP-25 expresado de forma endógena. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos recubiertos con poli-D-lisina/laminina tal como se ha 25 descrito en el ejemplo II, 1a. Se añadió BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos) a diferentes concentraciones (0 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,2 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM y 20 nM) al medio de cultivo que contenía las células durante aproximadamente 8 o aproximadamente 16 horas. Las células tratadas con toxina se recogieron y se lisaron tal como se ha descrito anteriormente en el ejeplo II, 1a. La presencia de un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se determinó usando análisis de inmunotransferencia tal como se ha descrito anteriormente

30 en el ejemplo II, 1a. Se detectó un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A en la línea celular Neuro-2A después de una incubación de al menos 8 horas con al menos BoNT/A 0,5 nM, indicando de este modo la capacidad de BoNT/A de intoxicar estas líneas celulares (véase la figura 8c).

1b. Ensayo para determinar el tiempo requerido por una célula para captar BoNT/A

Con el fin de evaluar la cantidad de tiempo necesario para que una línea celular capte BoNT/A, se cribó un panel de

35 líneas celulares de mamífero de origen neuronal para determinar la duración de la exposición a la toxina necesaria para escindir el SNAP-25 expresado de forma endógena. Las células de cada línea se cultivaron en placas de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina/laminina tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se añadió BoNT/A aproximadamente 1 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos) al medio de cultivo durante 10 min, 20 min, 30 min, 60 min, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas o 16 horas. Las células tratadas con toxina se

40 recogieron y se lisaron tal como se ha descrito anteriormente en el ejeplo II, 1a. La presencia de un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se determinó usando análisis de inmunotransferencia tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 1a. Se detectó un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A en las líneas celulares Neuro-2A, SH-SY5Y y NG108-15 después de una incubación de al menos 8 horas con BoNT/A 1 nM, indicando de este modo la capacidad de estas líneas celulares para captar rápidamente BoNT/A (véase la figura 8b).

TABLA 3 Condiciones de cultivo para líneas celulares

Línea celular: Medio de cultivo completo Condiciones de paso Densidad de siembra (células/mm2)

SK-N-DZ: DMEM al 90 %, A Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:4 división cada 2-3 días 4,25 x 103

SK-N-F1: DMEM al 90 %, A Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:4 división 2 veces por semana 4,25 x 103

SK-N-SH: de Ham F12, DMEM o EMEM, B Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:20 división cada 4-7 días 4,25 x 103

SH-SY5Y: EMEM y de Ham F12 1:1, C Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:6 división cada 2-3 días 4,25 x 103

SK-N-BE(2): EMEM y de Ham Tratamiento con tripsina/EDTA, 4,25 x 103

F12 1:1, D: dilución 1:6 división cada 3 días

BE(2)-C: EMEM y de Ham F12 1:1, D Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:4 división cada 2-3 días 4,25 x 103

BE(2)-M17: EMEM y de Ham F12 1:1, D Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:20 división cada 4-7 días 4,25 x 103

Neuro 2a: EMEM, E Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

C1300: RPMI 1640, B Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

NB4 1A3: de Ham F10,F Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

NIE-115: EMEM, G Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

NG1O8-15: EMEM, B Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:4 división cada 2 4,25 x 103

HCN-1A: EMEM, H dilución 1:4 división cada 1-2 días 4,25 x 103

HCN-2: EMEM, H Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

TE 189.T: EMEM, H Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

ND8/34: EMEM, B Tratamiento con tripsina/EDTA, dilución 1:3 división cada 3 días 4,25 x 103

A contiene 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, aminoácidos no esenciales (NEAA) 0,1 nM, glutamina 4 nM y suero de carnero fetal (FCS) al 10 % B contiene glutamina 2mM y FCS al 10 % C contiene 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, aminoácidos no esenciales (NEAA) 0,1 nM, glutamina 4 nM, piruvato de sodio al 1 %, penicilina/estreptomicina al 1 % y FCS al 10 % D contiene NEAA 0,1 nM, glutamina 4mM y FCS al 10 % E contiene 1,5 g/l de bicarbonato de sodio, aminoácidos no esenciales (NEAA) 0,1 nM, glutamina 2 nM, piruvato de sodio al 1 % y FCS al 10 % F contiene glutamine 2 nM, suero de caballo al 15 % y FCS al 2,5 % G contiene 4,5 g/l de glucosa FCS al 10 % H contiene glucosa 4 nM y FCS al 10 % El medio de congelación comprende medio de cultivo al 95 % y DMSO al 5 %

1c. Tratamiento con gangliósidos para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/A por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido sobre la capacidad de BoNT/A para intoxicar una célula, se trató previamente una línea celular Neuro-2A con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos 5 de azúcar podrían aumentar la captación de BoNT/A por estas células. Las células Neuro-2A se plaquearon a una densidad adecuada en pocillos individuales de placas de cultivo hístico de seis pocillos recubiertas con poli-Dlisina/laminina que contenían 3 ml de un medio adecuado (véase la tabla 3) y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 %. Después de aproximadamente 24 horas, el medio se reemplaza por un medio exento de suero y se añadieron 25 µg/ml de uno de los gangliósidos siguientes a pocillos indivuales: 10 GD1a, GD1b, GD3, GQ1b or GT1b (AXXORA, LLC, San Diego, CA, Estados Unidos). Después de un periodo de incubación a 37 °C, las células tratadas con gangliósidos se lavaron tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfatos, pH 7,4 y después se incubaron a 37 °C con medio de suero al 1 % que contenía distintas concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50nM) de BoNT/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados UNidos) durante aproximadamente 8 horas o aproximadamente 16 horas. Las células se recogieron en tubos de 15 ml, se 15 lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y se transfirieron a tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Las células se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(□-aminoetil éter) N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10 % y Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol) al 1 % (V/V), con rotación durante 1 hora a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a

20 5.000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechos y el sobrenadante se transfirió a tubos siliconizados nuevos. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o una concentración superior. La presencia de un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se determinó usando análisis de inmunotransferencia tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 1a. Un aumento de producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se detectó en la línea celular

25 Neuro-2A tratada con el gangliósido GT1b, indicando de este modo que el tratamiento con GTIb puede aumentar la captación de BoNT/A por células Neuro-2A (véase la figura 9a).

1d. Tratamiento con gangliósidos para aumentar la captación de alta afinidad de BoNT/E por una célula

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento con gangliósido sobre la capacidad de BoNT/E para intoxicar una célula, se pretrató una línea celular Neuro-2A con diferentes gangliósidos para determinar si estos restos de azúcar podrían aumentar la captación de BoNT/A por estas células. Las células Neuro-2A se cultivaron en placas de seis pocillos recubiertas con poli-D-lisina/laminina y se trató con gangliósidos tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 1c. Las células tratadas con gangliósidos se incubaron con BoNT/E (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos) a distintas concentraciones (0 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM) en medio de suero al 1 % durante bien aproximadamente 6 horas o bien aproximadamente 16 horas. Las células tratadas con toxina se recogieron y se lisaron tal como se ha descrito anteriormente en el ejeplo II, 1c. La presencia de un producto de escisión de SNAP25180 de BoNT/E se determinó mediante análisis inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 1b, con la excepción de que las membranas PVDF bloqueadas se incubaron en un solución de anticuerpo primario que contenía una dilución 1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD, Estados Unidos) mejor que el antisuero anti-SNAP25 policlona de conejo pAb anti-SNAP25197 Nº 1 y una solución de anticuerpo secundario que contenía una dilución 1:20.000 de anticuerpo de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina G (IgG, H+L) anti-ratón policlonal de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos) mejor que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra con el fin de detectar el producto de escisión de SNAP25180 de BoNT/E. Un aumento de producto de escisión de SNAP25180 de BoNT/E se detectó en la línea celular Neuro-2A tratada con los gangliósidos GD3, GD1b y GD1a, indicando de este modo que el tratamiento con GD3, el tratamiento con GD1b o el tratamiento con GD1a puede aumentar la captación de BoNT/E por células Neuro-2A (véase la figura 9b).

2. Aislamiento del receptor de BoNT/A a partir de células Neuro-2A

Las células Neuro-2A se eligieron para realizar experimentos de reticulación de ligandos usando BoNT/A debido a que estas células tienen un perfil de captación de toxina rápido (aproximadamente 10 minutos) y alta afinidad por BoNT/A. Se usó el sulfo-SBED (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos) trifuncional. El reactivo sulfo-SBED contiene tres grupos reactivos (uno de ellos diseñada para ser activado mediante UV) y está diseñado para biotinilar una proteína diana.

Para conjugar un agente de reticulación a un BoNT/A, se centrifugan aproximadamente 100 µg de Pure A a 10,000 x g a 4 °C durante 10 minutos para formar pellas de toxina y se lleva a un volumen final de 900 µl de solución salina tamponada con fosfatos (pH 7,4). La solución se lleva a continuación a la oscuridad y se añaden 900 µl de SBED 0,25 mM, solución de DMSO al 1 % y se incuba a 4 °C durante dos horas en un recipiente secundario sobre un aparato agitador. La reacción se detiene añadiendo 50 µl de TRIS 1 M (pH 7,4). La solución se invierte 6 veces y se incuba sobre hielo durante 30 minutos. La solución PURE-ASBED resultante se usó para realizar los experimentos de reticulación para identificar un receptor BoNT/A.

Para reticular PURE-A a receptores de BoNT/A presentes en células Neuro-2A, se plaqueron 1,5 x 105 células Neuro-2A en una placa de cultivo hístico de 35 mm que contenía 3 ml de EMEM completo, suplementado con FBS al 10 %, glutamine 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 1,5 g/l de carbonato de sodio y 1 x MEM de solución de aminoácidos no esenciales (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y se cultiva en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5 x 105 células/ml. Las células Neuro-2A se recogieron separando las células con un tratamiento de tripsina, transfiriendo las células a tubos de 15 ml y centrifugando las células a 5,000 x g a 4 °C durante 10 min. El sedimento de células se lava tres veces con 9 ml de solución salina tamponada con Tris y después se divide en partes alícuotas de 4 X 108 células. Cada parte alícuota de células se suspende en 12 ml de solución salina tamponada con Tris para dar una densidad final de 2 x 107 células/ml y se situaron sobre hielo durante 15 minutos. A una parte alícuota de suspensión celular, se añade 1 ml de PURE-A-SBED, siendo la concentración final de aproximadamente 100 µg de PURE A (33 nM). A una segunda parte alícuota, solo se añade sulfo-SBED y sirve como control para positivos falsos. Ambas suspensiones de células Neuro-2 se incubaron a 4 °C durante dos horas en un recipiente secundario usando un aparato agitador y, después, cada solución celular se distribuye en 13 partes alícuotas de 1,0 ml. Estas partes alícuotas se expusieron a radiación ultravioleta (365 nm) a 4 °C durante 15 minutos.

Las células se centrifugaron a 5,000 x g a 4 °C durante 15 minutos y se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con Tris. Las células lavadas se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(□-aminoetil éter) N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10 % y Triton-X® 100 (polietoxilato de 4-octilfenol) al 1 % (V/V) y los inhibidores de proteasa adecuados, con rotación durante 1 hora a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechos y el sobrenadante se transfirió a tubos siliconizados nuevos y se añadieron perlas de avidina a los sobrenadantes eliminados. Esta mezcla se incubó a 4°C durante 3 horas. A continuación, las perlas de avidina se lavaron dos veces por centrifugación a 1000 x g a 4°C durante 10 min dando perlas de pellas, se decantó el sobrenadante, se añadieron 0,5 ml de tampón de lisis y se incubó la solución a 4 °C durante 10 minutos. Las perlas de avidina se lavaron después dos veces con 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). Se añadieron aproximadamente 100 µl de tampón de carga SDS-PAGE a las perlas de avidina en forma de pellas y se hirvió durante 10 minutos. A continuación se sometieron 40 µl de una parte alícuota a electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliacrilamida pretransformados con bis-Tris la 4-12 % NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) en condiciones reductoras no desnaturalizantes y desnaturalizantes. La figura 10a muestra una proteína de aproximadamente 250 kDa en geles no reductores que representa la toxina PURE-A-SBED del reactivo de reticulación intacta unida al receptor de BoNT/A putativo. Las mismas muestras se procesaron en condiciones desnaturalizantes y revelaron una proteína de aproximadamente 100 kDa que se purificó con PURE-A-SBED.

Para determinar la identidad del receptor de BoNT/A aislado a partir de los experimentos de reticulación se realizaron análisis de inmunotransferencia (Western) usando anticuerpos a la región citoplásmica del receptor FGF 1 (FGFR1), receptor FGF 2 (FGFR2), receptor FGF 3 (FGFR3) y receptor FGF 4 (FGFR4) de los polipéptidos. Aproximadamente 40 µl de partes alícuotas del complejo receptor-PureA, obtenido tal como se describe en el ejemplo II, 2, se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS usando geles de poliamida pretransformados con bis-Tris al 4-12 % NuPAGE® Novex (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) en condiciones no reductoras y desnaturalizantes reductoras. Los péptidos separados se transfirieron del gel a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) mediante inmunotransferencia (Western) usando un aparato celular de transferencia electroforética semiseca Trans-Blot® SD (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Estados Unidos). Las membranas de PVDF se bloquearon incubando a temperatura ambiente durante 2 horas en una solución que contenía solución salina tamponada con tris 25 mM (ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol clorhídrico 25 mM (Tris-HCI)(pH 7,4), cloruro de sodio 137 mM, cloruro de potasio 2,7 mM), TWEEN-20® al 0,1 %, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán, albúmina de suero bovino al 2 %, leche desnatada seca al 5 %. Las membranes bloqueadas se incubaron a 4 °C durante la noche en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® (solución salina tamponada con Tris 25 mM, TWEEN-20® al 0,1 %, monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán) que contenía una de las soluciones de anticuerpos primarios siguientes: 1) una dilución 1:1000 de antisuero anti-FGFR1 policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos); 2) una dilución 1:1000 de antisuero anti-FGFR2 policlonal de cabra (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos); 3) una dilución 1:1000 de antisuero (C15) anti-FGFR3 policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos) o 4) una dilución 1:1000de antisuero anti-FGFR4 policlonal de cabra (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos). Las manchas analizadas de anticuerpo primario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con tris TWEEN-20®. Las membranas lavadas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas en solución salina tamponada con Tris TWEEN-20® que contenía bien una dilución 1:20.000 de anticuerpo de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina G (IgG, H+L) anti-conejo policlonal de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos) como anticuerpo secundario para las manchas FGFR1 y FGFR3 o bien una dilución 1:20.000 de anticuerpo de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina G (IgG, H+L) anti-cabra policlonal de conejo conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos) para las manchas FGFR2 y FGFR4. Las manchas analizadas de anticuerpo secundario se lavaron tres veces durante 15 minutos cada vez en solución salina tamponada con tris TWEEN-20®. La detección del producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se visualizó usando el sistema de detección mediante inmunotransferencia (Western) ECL Plus™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos) y se realizó una imagen de la membrana y el producto de escisión se cuantificó con un programa informático captador de imágenes en modo variable y de análisis del captador de imágenes Typhoon 9410 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, Estados Unidos). La elección del tamaño en píxeles (100 a 200 píxeles) y los ajustes de voltaje PMT (350 a 600, normalmente 400) dependió de la mancha individual. Se detectó una banda en la muestra de receptor de toxina analizada con antisuero anti-FGFR3 de aproximadamente 97 kDa que es consecuente con el tamaño de FGFR3, lo que indica que FGFR3 es un receptor de BoNT/A (vése la figura 10b).

3. Identificación del receptor de BoNT/A de diversas células

Se analizaron varias líneas celulares que responden a la captación de BoNT/A con anticuerpos diseñados contra FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4 con el fin de determinar que FGFR expresan estas líneas celulares. Además, se examinaron las células de la línea celular natural HIT-T15 que no responden a BoNT/A y la línea cellular C7 aislada de HIT-T15 que responde a BoNT/A, tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 2c y 2d.

Para determinar la presencia de FGFR en líneas celulares que responden a la exposición a BoNT/A, las células se cultivaron, se recogieron y se lisaron tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 1a,1b o 2c y se sometieron 40 µl de partes alícuotas al análisis de inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 2. Estos resultados indican que las líneas celulares sensibles a BoNT/A Neuro-2A, SH-SY5Y y HIT-T15-C7 expresan todas FGFR3, mientras que HIT-T15 natural no sensible a BoNT/A no lo hace (véase la figura 11). Los datos también revelaron que FGFR2 y FGFR4 no se detectaron en ninguna de las líneas celulares analizadas, mientras que FGFR1 se presentó en todas las líneas celulares analizadas, incluidas las células HIT-T15 naturales que no son sensibles a la exposición a BoNT/A (véase la figura 11).

4. Ensayos de competición competitiva

Para corroborar que la toxina BoNT/A penetra en células Neuro-2A a través del FGFR3 realizamos un experimento de competición con PURE-A y analizamos la respuesta de los productos analizados usando el ensayo de escisión SNAP-25 tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 1b. Si BoNT/A y un ligando de FGFR3 se unen al mismo receptor, entonces las cantidades aumentadas de ligando FGF deberían dar como resultado una respuesta reducida de una célula a la exposición de BoNT/A. No obstante, si BoNT/A y un ligando de FGFR3 se unen a receptores diferentes, entonces las cantidades aumentadas de ligando FGF no deberían dar como resultado ningún efecto sobre la respuesta de una célula a la exposición de BoNT/A. La tabla 1, que los solicitantes no reivindican es una tabulación completa de receptores y especies de FGF, muestra determinados miembros de la familia de FGFR y sus ligandos conocidos y distribución en tejidos.

Para determinar si ligandos para FGFR3 pueden competir competitivamente con BoNT/A para unirse a FGFR3, se plaquearon aproximadamente 5x105 células Neuro-2A en pocillos individuales de placas de cultivo hístico de 6 pocillos recubiertas con poli-D-lisina/laminina que contenían 3 ml de EMEM, suplementado con glutamina 2 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio y 1 x solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las células alcanzaron confluencia. Se añadió PURE-A aproximadamente 5 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos) junto con FGF1, FGF2 o tanto FGF1 como FGF2 a distintas concentraciones (0 nM, 0,1 nM, 1 nM, 5 nM, 50 nM, 200 nM) al medio de cultivo que contenía las células y se incubó durante aproximadamente 10 minutos a 37 °C. Las células se recogieron en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 y después se transfirieron a tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Las células se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(K-aminoetil éter) N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10 % y Triton-X® 100 (polietoxilato de 4octilfenol) al 1 % (V/V), con rotación durante 1 hora a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechos y el sobrenadante se transfirió a tubos siliconizados nuevos. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o una concentración superior.

La presencia de un producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A se determinó mediante análisis de inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 1a, con la excepción de que las membranas PVDF bloqueadas se incubaron en un solución de anticuerpo primario que contenía una dilución

1:50.000 de anticuerpo anti-SNAP-25 monoclonal de ratón (SMI-81; Sternberger Monoclonals, Lutherville, MD, Estados Unidos) mejor que el antisuerpo anti-SNAP25 policlonal de conejo pAb anti-SNAP25197 Nº 1 y una solución de anticuerpo secundario que contenía una dilución 1:20.000 de anticuerpo de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina G (IgG, H+L) anti-ratón policlonal de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos) mejor que el anticuerpo IgG-HRP anti-conejo policlonal de cabra con el fin de detectar tanto el sustrato de SNAP-25 y el producto de escisión de SNAP25197 de BoNT/A. Una cantidad aumentada de ligandos de FGF indicó que estos FGF1 y FGF2 compiten por el mismo receptor que BoNT/A y se confirmó posteriormente que FGFR3 es un receptor de BoNT/A (véase la figura 12).

Ejemplo III

Una proteína de fusión que comprende la porción C teminal de la cadena pesada de BoNT/A y la cadena ligera de BoNT/E se analiza para evaluar su capacidad de unirse selectivamente a células susceptibles de ser intoxicadas con BoNT/A. Se incuba una preparación que comprende diluciones de la proteína de fusión con células de insulinita HITT15 que expresan FGFR3 exógeno en presencia de gangliósido GT1b. La capacidad del péptido de fusión para unirse a y penetrar en las células de insulinota se detecta detectando la secreción de insulina en respuesta a la presencia de glucosa, tal como se ha descrito en el ejemplo I, 1a. Por el contrario, la secreción de insulina no afecta a células que expresan FGFR3.

Los resultados de este ensayo muestran que la cantidad de insulina segregada en el medio de cultivo es decreciente de una modo dependiente de la dosis cuando la proteína de fusión se agrega al medio de cultivo. Los análisis de inmunotransferencia (Western) de lisados celulares mostrarán la conversión de SNAP-25 de longitud completa en la forma escindida típica de la actividad proteolítica de la proteasa de cadena ligera de BoNT/E. Este ensayo, por lo tanto, es útil para mostrar que el péptido de fusión es capaz de unirse a y de penetrar en células susceptibles a BoNT/A.

La misma proteína de fusión es capaz de intoxicar células de la unión neuromuscular.

Ejemplo IV

Una proteína de fusión que comprende una porción de unión al receptor de una especie de FGF capaz de unirse a FGFR3 (que incluye FGF1, FGF2, FGF4 y FGF9) y el dominio de translocación y la cadena ligera de BoNT/E se analiza para evaluar su capacidad de unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A. El ensayo se realiza tal como se ha descrito en el ejemplo 1 anteriormente, con resultados similares; los fragmentos de SNAP-25 escindidos detectados son caracterísiticos de intoxicación con BoNT/A.

Ejemplo V

La BoNT/A producida a partir de la fermentación de Clostridium botulinum se produce usando técnicas de fermentación estándar. Tanto la preparación en masa como las versiones formuladas purificadas de toxina expresada, o ambas, se analizan para evaluar la pureza y la actividad tal como sigue. Se incuba una preparación que comprende diluciones de la preparación de BoNT/A con células de insulinoma HIT-T15 que expresan FGFR3 exógeno en presencia de gangliósido GT1b. La capacidad de la toxina para unirse a y penetrar en las células de insulinoma se detecta detectando la secreción de insulina en respuesta a la presencia de glucosa, tal como se ha descrito en el ejemplo I, 1a. La actividad específica de la preparación puede calcularse a partir de la concentración de una proteína determinada y la actividad de la preparación a diversas dosis.

Estos datos se comunican a la Administración de fármacos y alimentos de Estados Unidos (FDA) por una compañía farmacéutica como parte de datos que demuestran como se fabrica y se analiza la BoNT/A. Esta información es considerada por la FDA, que decide permitir la fabricación y venta de este lote de BoNT/A y lotes subsiguientes fabricados y analizados de forma similar, como producto farmacéutico terapéutico basado en parte en estos datos de ensayo del producto bruto y/o la formulación.

El producto farmacéutico que comprende la BoNT/A se ofrece a continuación para su venta como medicación con prescripción médica.

Ejemplo VI

Lo mismo que en el ejemplo V, pero el polipéptido producido es la neurotoxina de fusión del ejemplo III, producida en

E. coli. Los lotes del producto bruto y/o de formulación de la neurotoxina de fusión se analizan tal como se ha indicado anteriormente, los datos se comunican a la FDA, y la decisión de aprobar la comercialización o la venta continuada de dicho polipéptido de fusión como agente terapéutico se realiza por parte de la FDA sobre la base, al menos en parte, de dichos datos. La compañía farmacéutica ofrece entonces la neurotoxina de fusión para su venta como agente terapéutico con prescripción médica.

Ejemplo VII

Se realiza un ensayo in vitro usando FGFR3 clonado unido a un soporte sólido en presencia de gangliósido GT1b. El FGFR3 unido se satura primeramente con cadena pesada de BoNT/A (cadena H) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lava exento de FGF no unido. Un compuesto de ensayo a partir de una biblioteca combinatoria de compuestos se pone en contacto con el receptor en condiciones sustancialmente fisiológicas (por ejemplo, PBS) y el eluido se recoge. La concentración de cadena H en el eluido se compara con la concentración de cadena H de un eluido control en el que la cadena H no se unió primeramente a FGFR3.

Los compuestos de ensayo que son capaces de unirse fuertemente a FGFR3 y compiten con la cadena H por unirse a FGFR3 (por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en esta sección) son compuestos candidatos para el desarrollo de un antídoto para la intoxicación por botulismo agudo.

Ejemplo VIII

Generación de células que contienen FGFR3 de forma estable

1. Construcción de pQBI25/FGFR3

Para construir pQBI-25/FGFR3, un fragmento de ácido nucleico que codifica la región de aminoácidos que comprende FGFR3 de SEC ID Nº: 4 se amplifica a partir de una biblioteca de ADNc cerebral humano usando un procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa y se subclona dando un vector pCR2.1 usando el procedimiento de clonación TOPO® TA (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los cebadores de oligonucleótidos directo e inverso que se usan para esta reacción se diseñan para que incluyan sitios de enzima de restricción únicos útiles para las etapas de subclonación subsiguientes. El constructo pCR2.1/FGFR3 resultante se digiere con enzimas de restricción que 1) causan la escisión del inserto que contiene el marco de lectura abierto completo que codifica el FGFR3 y 2) posibilita que este inserto se una operativamente a un vector pQBI-25 (Qbiogene, Inc., Irvine, CA, Estados Unidos). Este inserto se subclona usando un procedimiento de ADN ligasa T4 dando un vector pQBI-25 que se digiere con las endonucleasas de restricción apropiadas para proporcionar pQBI25/FGFR3. La mezcla de ligación se transforma en células de E. coli BL21 (DE3) químicamente competentes (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estaods Unidos) usando un procedimiento de choque térmico, se plaquea en placas de agar al 1,5 % Luria-Bertani (pH 7,0) que contiene 100 µg/ml de ampicilina, y se situan en una incubadora a 37 °C para su cultivo durante la noche. Las bacterias que contienen constructos de expresión se identifican como colonias resistentes a ampicilina. Los constructos candidatos se aislan usando un procedimiento de minipreparación de plásmido de lisis alcalino y se analizan mediante cartografiado de digestión de endonucleasa de restricción para determinar la presencia y orientación del inserto. Esta estrategia de clonación proporciona un constructo de expresión de mamífero que codifica el FGFR3 de SEC ID Nº: 4 unido operativamente a los elementos de expresión del vector pQBI-25.

2. Células transformadas de forma estable usando un procedimiento de cruce recombinante

Para generar una línea celular integrada de forma estable que exprese un FGFR3 usando un procedimiento de cruce, se plaquea una densidad adecuada (1 x 105 a 1 x 105 células) de células apropiadas, tales como, por ejemplo, HIT-T15 o Neuro2A, en una placa de cultivo místico de 35 mm que contiene 3 ml de medio de cultivo completo suplementado y se cultivan en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las

células alcanzan una densidad apropiada para la transfección. Se prepara una solución de transfección de 500 µl

añadiendo 250 µl de medio en suero reducido OPTI-MEM que contiene 15 µl de LipofectAmine 2000 (Invitrogen,

Carlsbad, CA, Estados Unidos) incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos a 250 µl de medio en suero

reducido OPTI-MEM que contiene 5 µg de constructo de expresión que codifica un FGFR3, tal como, por ejemplo

pQBI-25/FGFR3 (véase el ejemplo VIII, 1). Esta transfección se incubó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. El medio completo suplementado se reemplaza por 2 ml de medio de suero reducido OPTI-MEM y los 500 µl de solución de transfección se añaden a las células y las células se incuban en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 16 horas. El medio de transfeccion se reemplaza por 3 ml de medio de cultivo completo suplementado nuevo y las células se incuban en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 48 horas. El medio se reemplaza por 3 ml de medio de cultivo completo suplementado nuevo que contiene aproximadamemente 5 µg/ml de G418. Las células se incuban en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 4 semanas, reemplazándose el medio viejo por medio selectivo de G418 completo, suplementado, nuevo cada 4 a 5 días. Una vez establecidas las colonias resistentes a G418, los clones resistentes se vuelven a plaquear en placas de cultivo de 35 mm nuevas que contienen medio de cultivo completo nuevo,

suplementado con aproximadamente 5 µg/ml de G418 hasta que estas células alcanzan una densidad de 6 a 20 x 105 células/ml.

Para analizar la expression de un FGFR3 a partir de líneas celulares aisladas que integraron de forma estable un constructo de expression que codifica un FGFR3, tales como, por ejemplo, pQBI-25/FGFR3 (veáse el ejemplo VIII, 1), aproximadamente 1,5 x 105 células de cada línea celular se plaquean en una placa de cultivo hístico de 35 mm que contiene 3 ml de DMEM selectivo de G418 completo suplementado y se cultivan en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las células alcanzan una densidad de aproximadamente 5 x 105 células/ml (6-16 horas). El medio se reemplazó con 3 ml de medio de cultivo selectivo de G418 completo suplementado y las célula se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 %. Después de 48 horas, las células se recogen enjuagando las células una vez con 3,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 100 mM, pH 7,4, y se lisan con un tampón que contiene ácido 2-amino-2-hidroximetil-1,3propanodiol clorhídrico (Tris-HCl) 62,6 mM, pH 6,8, y lauril sulfato de sodio 2 % (SDS). Las células lisadas se centrifugan a 5000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechso y los sobrenadantes se transfieren a tubos siliconados nuevos. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o una concentración superior.

Para detectar la presencia de un FGFR3, las muestras se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida MOPS y se analizan mediante procedimientos de inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 2 usando una dilución 1:1000 de antisuero (C15) anti-FGFR3 policlonal de conejo (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos), con el fin de identificar líneas celulares que han integrado de forma estable y expresan el sustrato de FGFR3.

Ejemplo IX

Estudios de fosforilación de FGFR3

1. Fosforilación de FGFR-3 expuesto a FGF o BoNT/A

Cuando se unen a ligandos específicos, los FGFR se autofosforilan sobre residuos de tirosina específicos. Esto comienza el proceso de internalización del receptor y del ligando en la ruta endosómica. Si BoNT/A se une a FGFR3, entonces la exposición a BoNT/A debería provocar la autofosforilación de FGFR3 en células expuestas.

Para determinar si la unión de BoNT/A daba como resultado la fosforilación de FGFR3, se plaquearon aproximadamente 1,5 x 105 células Neuro-2A en placas de cultivo hístico de 6 pocillos recubiertas con poli-Dlisina/laminina que contenían 3 ml de EMEM exento de suero, suplementado con piruvato de sodio 1 mM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos), 1,5 g/l de bicarbonato de sodio y 1x solución de aminoácidos no esenciales MEM (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % hasta que las células alcanzaron una densidad de 5 x 105 células/ml. El medio exento de suero se reemplazó por EMEM suplementado nuevo que contenía FBS al 1 % (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y bien FGF-2 5 nM (Biosource International, Camarillo, CA, Estados Unidos) o una concentración 5 nM de PURE/A (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos). A continuación, las células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante 5 min, 10 min, 20 min y 30 min, con células no expuestas usadas como tiempo 0. Las células se recogieron en tubos de 15 ml, se lavaron una vez con 1 ml de solución salina tamponada con fosfatos, pH 7,4, y a continuación se transfirieron a tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Las células se lisaron en 0,5 ml de tampón de lisis que contenía N-(2-hidroxietil) piperazina-N’-(ácido 2etanosulfónico) (HEPES) 50 mM, pH 6,8, cloruro de sodio 150 mM, cloruro de magnesio 1,5 mM, ácido etilenglicol bis(□-aminoetil éter) N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) 1 mM, glicerina al 10 % y Triton-X® 100 (polietoxilato de 4octilfenol) al 1 % (V/V), con rotación durante 1 hora a 4 °C. Las células lisadas se centrifugaron a 5.000 rpm durante 10 min a 4 °C para eliminar desechos y el sobrenadante se transfirió a tubos siliconizados nuevos. Las concentraciones de proteínas se midieron usando el procedimiento de Bradford y se resuspendieron en 1 x tampón de muestra SDS a 1 mg/ml o una concentración superior.

El sobrenadante que contenía 100 µg de proteína se inmunoprecipitó usando 5 µg de anticuerpo anti-fosfotirosina unido a una perla de sefarosa (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, Estados Unidos). El producto inmunoprecipitado se sometió a un análisis de inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 4, siendo analizadas las manchas para evaluar FGFR3 (Santa Cruz Biotechnologies, Inc., Santa Cruz, CA, Estados Unidos). Estos experimentos muestran que el FGFR3 se fosforila después de su exposición a FGF2 o a BoNT/A, lo que indica que BoNT/A se une a FGFR3 (véase la figura 13a).

2. Inhibición con DMBI de la fosforilación de FGFR-3 expuesto a FGF

Para determinar si el DMBI inhibe la fosforilación inducida por BoNT/A de FGFR3, se plaquearon células Neuro-2A y se cultivaron tal como se describe en el ejemplo IX, 1. Las células Neuro-2A se plaqueron a una densidad de 5 x 105 células/pocillo (placa de 6 pocillos) y se incubaron durante la noche en medio exento de suero. El medio se reemplazó por EMEM suplementado exento de suero nuevo que contenía concentraciones 0, 1 µM, 5 µM, 20 µM o 100 µM de DMBI (EMD Calbiochem, San Diego, CA, Estados Unidos) durante 1 hora. El DMBI inhibe la autofosforilación y la dimerización de receptores de tipo FGFR y PDGF. Las células se lavaron después y se dispusieron en EMEM suplementado nuevo que contenía FBS al 1 % (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y FGF-2 5 nM (Biosource International, Camarillo, CA, Estados Unidos). A continuación, las células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 5 min, 10 min y se recogieron y se inmunoprecipitaron tal como se ha descrito anteriormente en ejemplo IX, 1. Los productos inmunoprecipitados se sometieron a un análisis de inmunotransferencia (Western) tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo II, 4, con la excepción de que las manchas se analizaron con una solución de anticuerpo primario que contenía una dilución 1:1000 de un antisuero anti-fosfotirosina policlonal de conejo (Upstate USA, Inc., Charlottesville, VA, Estados Unidos) y una solución de anticuerpo secundario que contenía una dilución 1:20.000 de anticuerpo de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina G (IgG, H+L) anticonejo policlonal de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP; Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, Estados Unidos). Estos resultados indican que el DMBI inhibe eficazmente la fosforilación de FGFR3 después de exposición a FGF2 (véase la figura 13b).

3. Inhibición con DMBI de la actividad de BoNT/A

Para determinar si el DMBI puede inhibir la actividad de BoNT/A, se plaquearon células Neuro-2A y se cultivaron tal como se describe en el ejemplo IX, 1. El medio se reemplazó por EMEM suplementado exento de suero nuevo que contenía concentraciones 0,1 µM, 5 µM, 20 µM o 100 µM de DMBI (EMD Calbiochem, San Diego, CA, Estados Unidos) durante 1 hora. El DMBI inhibe la autofosforilación y la dimerización de receptores de tipo FGFR y PDGF. Las células se lavaron después y se dispusieron en EMEM suplementado nuevo que contenía FBS al 1 % (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA, Estados Unidos) y PURE/A 5 nM (Metabiologics, Inc., Madison, WI, Estados Unidos). A continuación, las células se incubaron en una incubadora a 37 °C en atmósfera de dióxido de carbono al 5 % durante aproximadamente 5 min, 10 min y se recogieron tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo IX, 1. Se analizaron partes alícuotas para evaluar la presencia de producto de escisión de SNAP-25197 de BoNT/A usando el ensayo de escisión de SNAP-25 tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I, 1b. Estos resultados indican una reducción en la cantidad de producto de escisión de SNAP-25 presente, indicando de este modo que el DMBI inhibe eficazmente la actividad de BoNT/A y confirmando que esta toxina se internaliza por medio de FGFR3 (véase la figura 13c).

Los ejemplos proporcionados en el presente documento son simplemente ilustraciones de diversos aspectos de la invención, que debe entenderse que se define sólo mediante las reivindicaciones que siguen a la presente memoria descriptiva.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Fernandez-Salas, Ester Garay, Patton Aoki, Kei Roger

5 <120> Ensayo de selección de toxinas botulínicas

<130> 17596 (BOT)

<150> US 60/547.591

<151> 24/02/2004 <160>32

10 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210>1

<211> 2427

<212> DNA

<213> Homo sapiens FGFR3IIIb 15 <400> 1

<210>2

<211> 808

<212> PRT

<213> Homo sapiens FGFR3IIIb

<400> 2

<210>3

<211> 2421

<212> ADN

<213> Homo sapiens FGFR3IIIc

<400> 3

<210>4

<211> 806

<212> PRT

<213> Homo sapiens FGFR3IIIc <400>4

<210>5

<211> 2085

<212> ADN

<213> Homo sapiens FGFR3IIIS

<400> 5

<210>6

<211> 694

<212> PRT

<213> Homo sapiens FGFR3IIIS

<400> 6

<210>7

<211> 2409

<212> ADN

<213> Bos taurus FGFR3IIIc

<400> 7

<210>8 <211>802

<212> PRT

<213> Bos taurus FGFR3IIIc

<400> 8

<210>9

<211> 2409

<212> ADN

<213> Mus musculus FGFR3IIIb

<400> 9

<210>10

<211> 802

<212> PRT

<213> Mus musculus FGFR3IIIb <400>10

<210>11

<211> 2403

<212> ADN

<213> Mus musculus FGFR3IIIc <400>11

<210>12

<211> 800

<212> PRT

<213> Mus musculus FGFR3IIIc

<400> 12

<210>13

<211> 2349

<212> ADN

<213> Mus musculus FGFR3III-delAcid <400>13

<210>14

<211> 782

<212> PRT

<213> Mus musculus FGFR3III-delAcid

<400> 14

<210>15

<211> 2409

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus FGFR3IIIb <400>15

<210>16

<211> 802

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus FGFR3IIIb

<400>16 64

<210>17 <211>2403

<212> ADN

<213> Rattus norvegicus FGFR3IIIc <400>17

<210>18 <211>800

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus FGFR3IIIc <400>18

<210>19

<211> 2421

<212> ADN

<213> GaIlus gallus FGFR3 <400>19

<210>20

<211> 806

<212> PRT

<213> GaIlus gallus FGFR3

<400> 20

<210> 21

<211> 2484

<212> ADN

<213> Xenopus Iaevis FGFR3-1

<400> 21

<210>22

<211> 827

<212> PRT

<213> Xenopus Iaevis FGFR3-1

<400> 22

<210>23

<211> 2409

<212> ADN

<213> Xenopus Iaevis FGFR3-2

<400> 23

<210>24

<211>802

<212> PRT

<213> Xenopus Iaevis FGFR3-2

<400> 24

<210>25

<211> 2391

<212> ADN

<213> Pleurodeleswaltlii FGFR3

<400> 25

<210>26

<211> 796

<212> PRT

<213> Pleurodeles waltlii FGFR3

<400> 26

<210>27

<211> 2403

<212> ADN

<213> Danio rerio FGFR3

<400> 27

<210>28 <211>800

<212> PRT

<213> Danio rerio FGFR3

<400> 28

<210>29 <211>20

<212> ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador de PCR 1

<400> 29 agccctcact ccttctctag 20

10 <210>30 <211>26

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 15 <223> cebador de PCR 2

<400> 30 acctacaggt ggggtctttc attccc 26 <210>31 <211>25

20 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador de PCR 3

<400> 31 5 ccctgggtca agccctttgt acacc 25 <210>32 <211>25

<212> ADN

<213> secuencia artificial 10 <220>

<223> cebador de PCR 4

<400> 32 tgccaaacct acaggtgggg tcttt 25

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para detectar la actividad de BoNT/A poniendo en contacto una muestra con una célula que contiene un FGFR3 exógeno, en el que dicha célula puesta en contacto es capaz de intoxicarse con BoNT/A, y detectando la presencia de la actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto con respecto a una célula control, siendo la diferencia en dicha actividad de BoNT/A de dicha célula puesta en contacto en comparación con dicha célula control indicativa de actividad de BoNT/A.
2.

Procedimiento para seleccionar una molécula capaz de competir con el BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A poniendo en contacto dicha muestra con una composición que comprende un FGFR3 y detectando si dicha molécula se une selectivamente a dicho FGFR3, en el que la unión selectiva de dicha molécula a dicho FGFR3 indica que dicha molécula es capaz de competir con BoNT/A para unirse selectivamente a células susceptibles de intoxicarse con BoNT/A y en el que si dicha molécula es BoNT/A, dicho procedimiento no comprende un ensayo de DL50.
3.

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de puesta en contacto se realiza in vitro.
4.

Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho FGFR3 se expresa en la superficie de una célula.
5.

Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha molécula es BoNT/A.
6.

Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha molécula comprende un dominio de unión del receptor de una cadena pesada de BoNT/A.
7.

Procedimiento según una cualquiera de la reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha molécula es una molécula que se une selectivamente al dominio de unión del receptor de FGFR3 y no es BoNT/A.
8.

Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha molécula comprende un anticuerpo anti-FGFR3 que se une al dominio de unión del receptor de FGFR3.
9.

Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha molécula comprende un FGF que se une al dominio de unión del receptor de FGFR3.
10.

Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha molécula de FGF se selecciona del grupo constituido por FGF1, FGF2, FGF4, FGF8 y FGF9.
11.

Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha molécula es una molécula que se une selectivamente al dominio de unión del receptor de FGFR3 y comprende un dominio de proteasa que escinde una proteína SNARE en un sitio diferente al que se escinde por la cadena ligera de BoNT/A.
12.

Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho dominio de proteasa comprende el sitio activo de la cadena ligera de una toxina Clostridial diferente a la BoNT/A.
13.

Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho dominio de proteasa comprende el sitio activo de la cadena ligera de BoNT/E.
14.

Procedimiento para determinar la actividad de BoNT/A a partir de una preparación que comprende BoNT/A que comprende el procedimiento de la reivindicación 2.
15.

Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula contiene de forma transitoria un FGFR3 exógeno.
16.

Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula contiene de forma estable un FGFR3 exógeno.
17.

Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicho FGFR3 es un FGFR3 de mamífero, un FGFR3 de ave, un FGFR3 de anfibio o un FGFR3 de pez.
18.

Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho FGFR3 de mamífero es un FGFR3 humano, un FGFR3 bovino, un FGFR3 de ratón o un FGFR3 de rata.
19.

Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha composición contiene además un polisialogangliósido G1b.
20.

Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho polisialogangliósido se selecciona del grupo constituido por GD1a, GD1b, GD3, GQ1b o GT1b.
21.

Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula es una célula neuronal.
22.

Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha célula neuronal es una célula neuronal primaria, una célula neuronal inmortalizada o una célula neuronal transformada.
23.

Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicha célula neuronal se selecciona del grupo constituido por una célula del neuroblastoma, una célula híbrida neuronal, una célula de la médula espinal, una célula del sistema

5 nervioso central, una célula del córtex cerebral, una célula del ganglio espinal, una célula del hipocampo y una célula de feocromocitoma.
24. Procedimiento según bien la reivindicación 1 o bien la reivindicación 2, en el que dicha célula es una célula no neuronal.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha célula no neuronal es una célula no neuronal primaria, 10 una célula no neuronal inmortalizada o una célula no neuronal transformada.
26. Procedimiento según la reivindicación 24, en el que dicha célula no neuronal se selecciona del grupo constituido por una célula de la pituitaria anterior, una célula suprarrenal una célula pancreática, una célula de ovario, una célula de riñón, una célula del estómago, una célula sanguínea, una célula epitelial, un fibroblasto, una célula del tiroides, un condrocito, una célula muscular, un hepatocito, una célula glandular.

FIGURAS