ES2647828T3

ES2647828T3 - Polipéptidos de valenceno sintasa, moléculas de ácido nucleico que los codifican y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2647828T3
Application number: ES14718824.7T
Authority: ES
Inventors: Dayal Saran; Grace Eunyoung PARK
Original assignee: Evolva Inc
Current assignee: Evolva Inc
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: DK2970934T3; EP3085778A1; PL2970934T3; EP3085778B1; PT2970934T; US10000749B2; EP2970934B1; US20150007368A1; ES2891377T3; HUE035866T2; WO2014150599A1; EP2970934A1

Abstract

Un polipéptido de valenceno sintasa de Eryngium aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento catalíticamente activo de la misma, donde: el polipéptido de sintasa cataliza la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; y las células que expresan el polipéptido de valenceno sintasa de SEQ ID NO:1 catalizan mayores cantidades de valenceno en comparación con células que expresan la valenceno sintasa cítrica (Citrus sinensis) (CVS) cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO:14.

Description

Polipéptidos de valenceno sintasa, moléculas de ácido nucleico que los codifican y usos de los mismos

5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa, moléculas de ácido nucleico que codifican valenceno sintasas, células hospedadoras que contienen los ácidos nucleicos y procedimientos para producir productos cuya producción está catalizada por los polipéptidos. Se proporcionan también procedimientos para producir valenceno y nootkatona.

ANTECEDENTES

Valenceno y nootkatona son sesquiterpenos que aparecen en aceites esenciales tales como aceites cítricos, incluyendo naranja y uva. El valenceno se produce por ciclación del precursor terpénico de pirofosfato acíclico

15 difosfato de farnesilo (FPP) y la oxidación del valenceno da como resultado la formación de nootkatona. Valenceno y nootkatona se usan ambos en la industria de los perfumes y aromas.

El valenceno se extrajo originalmente de la piel de naranja de Valencia y la nootkatona se extrae de pieles de uva o se produce mediante la oxidación de valenceno extraído. Aunque se han intentado enfoques químicos para generar

20 valenceno y nootkatona, las estructuras altamente complejas de estos compuestos han vuelto inalcanzables procesos sintéticos económicamente viables para su preparación en grandes cantidades. El valenceno se ha producido en células hospedadoras catalizadas por ácido nucleico que codifica una valenceno sintasa cítrica (véase p.ej. la patente de EE.UU. nº 7.442.785). Se buscan mejoras en la producción y medios alternativos de producción y la producción de valenceno y otros terpenos.

25 Por tanto, entre los objetos de la presente memoria, está la provisión de polipéptidos de valenceno sintasa y procedimientos para la producción de productos terpénicos cuya producción está catalizada por los polipéptidos. El documento US2012/246767 divulga polipéptidos de valenceno sintasa modificados y procedimientos de uso de polipéptidos de valenceno sintasa modificados. Divulga también procedimientos para producir terpeno sintasas

30 modificadas. El número de secuencia GU987104.1, que puede recuperarse de la base de datos en línea EMBLE, se refiere a ARNm de alfa-copaeno sintasa (Cop) de Eleutherococcus trifoliatus, cds completa. Divulga una molécula de ARNm lineal con una longitud de secuencia de 1948.

35 RESUMEN

Se proporcionan valenceno sintasas de Eryngium (EgVS). Se proporcionan polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium aislados que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO:1 o con un fragmento

40 catalíticamente activo del mismo. La sintasa de Eryngium glaciale ejemplificada tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1. Las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria catalizan la producción de valenceno y otros productos a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico tal como, pero sin limitación, difosfato de farnesilo. La producción puede efectuarse in vitro poniendo en contacto la sintasa aislada con un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, o in vivo en una célula hospedadora adecuada que codifica la

45 sintasa. Las células hospedadoras adecuadas producen o se modifican para producir un precursor de pirofosfato acíclico. Si las células son de origen humano, son células aisladas o cultivadas o un cultivo celular. Las células, tales como células de levadura, particularmente células que expresan un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, que expresan EgVS producen muy altas cantidades de valenceno en comparación con las mismas células que expresan la valenceno sintasa cítrica (Citrus sinensis) (CVS) y variantes de la misma que se optimizan y/o modifican para

50 expresar altos niveles de valenceno. Se proporciona además un polipéptido de valenceno sintasa que es un fragmento catalíticamente activo del péptido de valenceno sintasa aislado de la presente invención, donde el fragmento catalíticamente activo cataliza la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico.

55 Se proporcionan también moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria. Las moléculas de ácido nucleico incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas y también ADNc. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria son aquellas que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1, y también cualquiera que codifique una secuencia de aminoácidos que tenga al menos

60 un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido de

valenceno sintasa cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento catalíticamente activo del mismo, donde el polipéptido codificado cataliza la producción de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico aislada se selecciona de entre moléculas de ácido nucleico que contienen: (a) la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO:2; (b) una secuencia de ácidos nucleicos 5 que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO:2 y que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO:1 y (c) degeneraciones de (a) y (b). Se proporcionan también polipéptidos aislados y fragmentos catalíticamente activos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Los polipéptidos codificados pueden producirse mediante expresión en cualquier célula hospedadora,

10 incluyendo células eucarióticas y procarióticas, tales como células de mamífero, células de levadura y células bacterianas. En ejemplos donde la célula hospedadora es una célula de mamífero que es una célula humana, la célula es una célula aislada o una célula en cultivo, tal como en un cultivo celular.

Se proporcionan también vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente

15 memoria. Los vectores incluyen vectores procarióticos y eucarióticos, incluyendo vectores víricos y vectores de levadura, tales como vectores de Saccharomyces.

Se proporcionan también células que contienen las moléculas de ácido nucleico que codifican una EgVS. Las células incluyen células procarióticas y células eucarióticas incluyendo, pero sin limitación, bacterias, células de levadura, 20 insecto, planta y mamífero. En ejemplos donde la célula hospedadora es una célula de mamífero que es una célula humana, la célula es una célula aislada o una célula cultivada. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es heterólogo de la célula. Las células de levadura proporcionadas en la presente memoria incluyen, pero sin limitación, células del género Saccharomyces y células del género Pichia. Las células bacterianas proporcionadas en la presente memoria incluyen células de Escherichia coli. Las células vegetales proporcionadas en la presente memoria incluyen 25 protoplastos. Las células pueden producir el precursor acíclico, tal como difosfato de farnesilo, de forma nativa o pueden modificarse para producirlo o para producir más de una célula no modificada. Entre las células proporcionadas en la presente memoria están aquellas que codifican un polipéptido de valenceno sintasa donde: la célula hospedadora produce un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; el polipéptido de valenceno sintasa es heterólogo del hospedador y la valenceno sintasa cataliza la producción de valenceno a partir del precursor

30 terpénico de pirofosfato acíclico, tal como difosfato de farnesilo. Se proporcionan también plantas transgénicas que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. Pueden incluir ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno sintasa o un vector adecuado que lo codifique. Las plantas transgénicas ejemplares incluyen plantas de tabaco.

35 Se proporcionan en la presente memoria procedimientos para producir un polipéptido de valenceno sintasa. Los procedimientos incluyen las etapas de introducir una molécula de ácido nucleico que codifica los polipéptidos de valenceno sintasa, o fragmentos catalíticamente activos de los mismos, proporcionados en la presente memoria, o un vector que codifica el polipéptido de valenceno sintasa o fragmentos catalíticamente activos del mismo, en una célula, por ejemplo mediante transfección o transformación; cultivar la célula in vitro o in vivo en condiciones

40 adecuadas para la expresión del polipéptido de valenceno sintasa o fragmento catalíticamente activo del mismo y, opcionalmente, aislar el polipéptido de valenceno sintasa. Las células para uso en los procedimientos incluyen células hospedadoras eucarióticas y procarióticas incluyendo, pero sin limitación, bacterias, células de levadura, insecto, planta y mamífero. Las células de levadura para uso en los procedimientos incluyen, pero sin limitación, células del género Saccharomyces y células del género Pichia.

45 Se proporcionan también procedimientos para producir valenceno. Los procedimientos implican poner en contacto un precursor terpénico de pirofosfato acíclico con un polipéptido de valenceno sintasa o fragmento catalíticamente activo del mismo, proporcionado en la presente memoria, in vitro o in vivo, en condiciones adecuadas para la formación de valenceno a partir del precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como difosfato de farnesilo. En

50 algunos ejemplos, el valenceno se aísla o purifica. En los procedimientos proporcionados, la etapa de puesta en contacto del precursor terpénico de pirofosfato acíclico con el polipéptido de valenceno sintasa o fragmento catalíticamente activo del mismo puede efectuarse in vitro o in vivo en una célula hospedadora adecuada proporcionada en la presente memoria. Cuando se efectúa in vivo, pueden introducirse los ácidos nucleicos o vectores en las células como se describe en la presente memoria, de tal modo que el polipéptido de valenceno

55 sintasa codificado o fragmento catalítico del mismo sea heterólogo de las células, y se cultivan las células en condiciones que se se exprese la valenceno sintasa codificada. Las células para uso en dichos procedimientos pueden modificarse para producir el precursor acíclico o para producir más del precursor acíclico que las células no modificadas. Las células y procedimientos ejemplares para seleccionar tales células incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. expedidas nº 8.609.371(pub. de EE.UU. nº 2010-0151555) y 8.481.286(pub. de EE.UU. nº

60 2010-0151519). El valenceno puede convertirse en nootkatona, tal como mediante oxidación, que puede practicarse mediante procedimientos conocidos, incluyendo procedimientos biosintéticos y químicos.

Por tanto, se proporcionan también en la presente memoria procedimientos de producción de nootkatona. Tales procedimientos implican producir valenceno usando las etapas expuestas en cualquiera de los procedimientos proporcionados en la presente memoria para producir valenceno; aislar el producto valenceno; oxidar el valenceno

5 para producir nootkatona y aislar la nootkatona. El valenceno puede oxidarse química o biosintéticamente.

En cualquiera de los procedimientos proporcionados, puede usarse cualquier procedimiento conocido por el especialista en la materia para aislar valenceno y/o nootkatona, así como cualquier otro producto de la reacción o reacciones, incluyendo aristoloqueno, que es el compuesto del pico 2 de la Figura 3A. Tales procedimientos de

10 aislamiento incluyen, pero sin limitación, extracción con un disolvente orgánico y/o cromatografía en columna.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La FIGURA 1 es el esquema de reacción para producción de valenceno y nootkatona. Las valenceno sintasas son

15 terpeno ciclasas o sintasas vegetales de clase 1 que convierten difosfato de farnesilo (FPP) en el sesquiterpeno valenceno. El valenceno puede oxidarse formando nootkatona. FIGURAS 2A-B. La Figura 2A representa la cromatografía de gases del extracto de aceite vegetal de Eryngium glaciale. Se detecta valenceno (pico 1) a los 10,18 minutos. La Figura 2B representa el espectro de masas del pico a 10,18 minutos que corresponde al valenceno.

20 FIGURAS 3A-B. La Figura 3A representa el cromatograma de gases de una cepa de levadura ejemplar designada cepa ALX7-95 transformada con un gen que codifica la valenceno sintasa de Eryngium glaciale. Se observa valenceno (pico 1) a los 12,46 minutos. Se observa un compuesto adicional (designado pico 2) a los 12,37 minutos. La Figura 3B representa el espectro de masas del pico a 12,46, que corresponde a valenceno. Las FIGURAS 4A-G representan alineamientos ejemplares de valenceno sintasa de Eryngium glaciale (EGVS) con

25 otras valenceno sintasas. quot;*quot; significa que los residuos o nucleótidos en esa columna son idénticos en todas las secuencias del alineamiento, quot;:quot; significa que se han observado sustituciones conservadas y quot;.quot; significa que se observan sustituciones semiconservadas. Por ejemplo, la Figura 4A representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con valenceno sintasa de Citrus sinensis (CVS) expuesta en la SEQ ID NO:14. La Figura 4B representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta

30 en la SEQ ID NO:1 con valenceno sintasa deCitrus x paradisi (CVS) expuesta en la SEQ ID NO:15. La Figura 4C representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con valenceno sintasa de Vitis vinifera (VVS) expuesta en la SEQ ID NO:16. La Figura 4D representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con valenceno sintasa de Chamaecyparis nootkatensis (CNVS) expuesta en la SEQ ID NO:17. La Figura 4E representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium

35 glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con una valenceno sintasa CVS modificada designada V277 (descrita en la publicación de nº de serie de EE.UU. nº 2012-0246767 en tramitación junto con la presente), cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO:31. La Figura 4F representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con valenceno sintasa de Chamaecyparis nootkatensis (CNVS) expuesta en la SEQ ID NO:29. La Figura 4G representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID

40 NO:1 con valenceno sintasa de Perilla frutescens (PFVS) expuesta en la SEQ ID NO:38. Las FIGURAS 5A-J representan alineamientos ejemplares de valenceno sintasa de Eryngium glaciale (EGVS) con otras terpeno sintasas. quot;*quot; significa que los residuos o nucleótidos en esa columna son idénticos en todas las secuencias del alineamiento, quot;:quot; significa que se han observado sustituciones conservadas y quot;.quot; significa que se observan sustituciones semiconservadas. Por ejemplo, la Figura 5A representa el alineamiento de valenceno

45 sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con alfa-copaeno sintasa de Eleutherococcus trifoliatus (ETACS) expuesta en la SEQ ID NO:18. La Figura 5B representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con germacreno-D sintasa de Actinidia deliciosa (ADGDS) expuesta en la SEQ ID NO:19. La Figura 5C representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con (-)-germacreno-D sintasa de Vitis vinifera (VDGS) expuesta en la SEQ ID NO:20. La Figura 5D

50 representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con sesquiterpeno sintasa de Santalum murrayanum (SMSS) expuesta en la SEQ ID NO:21. La Figura 5E representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con (+)-delta-cadineno sintasa de Ricinus communis (RCDCS) expuesta en la SEQ ID NO:22. La Figura 5F representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con delta-cadineno sintasa de Citrus x paradisi

55 (CDCS) expuesta en la SEQ ID NO:23. La Figura 5G representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con 5-epiaristoloqueno sintasa de Nicotiana tabacum (TEAS) expuesta en la SEQ ID NO:24. La Figura 5H representa el alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con premnaspirodieno sintasa de Hyoscyamus muticus (HPS) expuesta en la SEQ ID NO:25. La Figura 5I representa un alineamiento de valenceno sintasa de Eryngium glaciale expuesta en la SEQ ID NO:1 con

60 germacreno-D sintasa de Citrus hystrix expuesta en la SEQ ID NO:45. La Figura 5J representa un alineamiento de V277 expuesta en la SEQ ID NO:31 y valenceno sintasa cítrica expuesta en la SEQ ID NO:14.

La Figura 6 representa los parámetros cinéticos en estado estacionario de la valenceno sintasa de E. glaciale (EgVS), cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO:1 (izquierda) y la valenceno sintasa V277 (marcada CVS), cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO:31 (derecha); FPP= difosfato de farnesilo. La Figura 7 demuestra que el valenceno producido en levadura catalizado por EVS es significativamente mayor que

5 el producido en levadura catalizado por CVS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Esquema A. Definiciones

B. Visión general

1.: Estructura del valenceno y usos

2.: Nootkatona

15 3. Valenceno sintasas

a.: Estructura

b.: Actividades

4. Ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de valenceno sintasa

20 C. Moléculas de ácido nucleico que codifican valenceno sintasa de Eryngium glaciale y polipéptidos codificados

1. Aislamiento de ácido nucleico que codifica valenceno sintasas

a. Generación de un ácido nucleico modificado

2. Vectores y células para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa

: 25 3. Sistemas de expresión

a.: Células procarióticas

b.: Células de levadura

c.: Plantas y células vegetales

d.: Insectos y células de insecto 30 e. Células de mamífero

4. Purificación

D. Polipéptidos de valenceno sintasa

1. Polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

: 35 2. Modificaciones de polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

a.: Polipéptidos truncados

b.: Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

c.: Intercambios de dominio

d.: Variantes adicionales 40 e. Proteínas de fusión

E. Procedimientos para producir terpenos y procedimientos para detectar tales productos y la actividad de polipéptidos de valenceno sintasa

1. Producción de terpenos catalizada por valenceno sintasa de Eryngium glaciale 45 a. Células ejemplares

b.: Cultivo de células

c.: Aislamiento y valoración de productos

2. Producción de nootkatona

50 F. EJEMPLOS

A. DEFINICIONES

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria 55 tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la materia a la que pertenece la invención.

En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos de la presente memoria, prevalecen aquellos en esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro de tales identificadores o direcciones, se 60 entiende que tales identificadores pueden cambiar y la información particular en internet puede ir y venir, pero puede encontrarse información equivalente buscando en internet. La referencia a la misma evidencia la disponibilidad y

difusión pública de tal información.

Como se usa en la presente memoria, un precursor terpénico de pirofosfato acíclico es cualquier compuesto de pirofosfato acíclico que sea un precursor para la producción de al menos un terpeno incluyendo, pero sin limitación, 5 pirofosfato de farnesilo (FPP), pirofosfato de geranilo (GPP) y pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). Los precursores terpénicos de pirofosfato acíclico son por tanto sustratos de terpeno sintasas.

Como se usa en la presente memoria, un terpeno es un hidrocarburo insaturado basado en la unidad isopreno (C5H8), y que tiene una fórmula general C5xH8x, tal como C10H16. La referencia a un terpeno incluye terpenos

10 acíclicos, monocíclicos y policíclicos. Los terpenos incluyen, pero sin limitación, monoterpenos que contienen 10 átomos de carbono; sesquiterpenos que contienen 15 átomos de carbono; diterenos que contienen 20 átomos de carbono y triterpenos que contienen 30 átomos de carbono. La referencia a un terpeno incluye también estereoisómeros del terpeno.

15 Como se usa en la presente memoria, una terpeno sintasa es un polipéptido capaz de catalizar la formación de uno

o más terpenos a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, por ejemplo FPP, GPP o GGPP.

Como se usa en la presente memoria, el valenceno es un sesquiterpeno que tiene la siguiente estructura:

La referencia a valenceno incluye la referencia a cualquier isómero del mismo incluyendo, pero sin limitación, (+)valenceno.

25 Como se usa en la presente memoria, la nootkatona es un sesquiterpenoide que tiene la siguiente estructura:

La referencia a nootkatona incluye la referencia a cualquier isómero de la misma.

30 Como se usa en la presente memoria, una quot;valenceno sintasaquot; o quot;polipéptido de valenceno sintasaquot; es un polipéptido capaz de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como difosfato de farnesilo (FPP). Se incluyen entre los polipéptidos de valenceno sintasa divulgados en la presente memoria cualquiera que tenga más de o más de aproximadamente o un 63 %, 65 %, 70 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %,

35 79%, 80%, 81%, 82%,83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la valenceno sintasa expuesta en la SEQ ID NO:1 cuando se alinean en toda su longitud o un fragmento catalíticamente activo del mismo. Estos polipéptidos catalizan la producción de valencia como único producto o uno entre una mezcla de productos formados a partir de la reacción de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico con una valenceno sintasa. Típicamente, la valencia es el producto

40 más prevalente o está entre varios productos prevalentes. Por ejemplo, la cantidad de valenceno producida a partir de la reacción de una valenceno sintasa con un precursor terpénico de pirofosfato acíclico es típicamente de al menos o al menos aproximadamente un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de la cantidad total de terpeno producida en la reacción. En algunos aspectos, el valenceno es el producto terpénico predominante (es decir, presente en mayores cantidades que cualquier otro terpeno individual producido a partir de

45 la reacción de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico con una valenceno sintasa).

La referencia a una valenceno sintasa incluye cualquier polipéptido que catalice la producción de valenceno incluyendo, pero sin limitación, un polipéptido producido recombinantemente, un polipéptido producido sintéticamente y un polipéptido de valenceno sintasa extraído o aislado de células y material vegetal del que se ha

50 aislado valenceno incluyendo, pero sin limitación, las especies de cardo como se proporcionan en la presente memoria. Otros polipéptidos de valenceno sintasa ejemplares incluyen aquellos aislados de frutas cítricas, flores de parra (p.ej. Vitis vinifera L. cv. Gewürztraminer y Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (véanse Lucker y col., (2004) Photochemistry 65(19): 2649-2659 y Martin y col, (2009) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 106: 7245-7250) y Perilla (shiso verde). Las valenceno sintasas cítricas (CVS) incluyen, pero sin limitación, valenceno sintasa de Citrus

55 sinensis (naranja dulce) (SEQ ID NO: 14 y 34) y Citrus x paradisi (uva) (SEQ ID NO: 15, 26 y 27). Otros polipéptidos

de valenceno sintasa ejemplares incluyen valenceno sintasa aislada de flores de parra, incluyendo Vitis vinifera L.

cv. Gewürztraminer y Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (SEQ ID NO:16 y 28), valenceno sintasas aisladas de Chamaecyparis nootkatensis pendula (SEQ ID NO:17 y 29) y valenceno sintasa de Perilla frutescens (SEQ ID NO:38). La referencia a valenceno sintasa incluye valenceno sintasa de cualquier género o especie, e incluye

5 variantes alélicas o de especie, variantes codificadas por variantes de empalme y otras variantes de la misma, incluyendo polipéptidos que tienen al menos o al menos aproximadamente un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la valenceno sintasa expuesta en la SEQ ID NO: 1. Las valenceno sintasas incluyen también fragmentos de las mismas que retienen actividad valenceno sintasa.

10 Como se usa en la presente memoria, los fragmentos catalíticamente activos de los polipéptidos de valenceno sintasa son polipéptidos de sintasa truncados que retienen la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico. Un especialista en la materia puede identificar fácilmente un fragmento de una sintasa que retenga actividad catalítica ensayándolo en cualquier ensayo adecuado, tal como

15 cualquiera descrito en la presente memoria, y detectando la formación de valenceno a partir del precursor.

Como se usa en la presente memoria, quot;actividad valenceno sintasaquot; (a la que se hace referencia también en la presente memoria como actividad catalítica) hace referencia a la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como difosfato de farnesilo (FPP). Los procedimientos 20 para valorar la formación de valenceno a partir de la reacción de una sintasa con un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, son bien conocidos en la materia y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, la sintasa puede expresarse en una célula hospedadora, tal como una célula de levadura, que produce también FPP. La producción de valenceno puede valorarse y cuantificarse entonces usando, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse los ejemplos siguientes). Se considera que una

25 sintasa exhibe actividad valenceno sintasa o la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico tal como FPP si la cantidad de valenceno producida a partir de la reacción es de al menos o de al menos aproximadamente un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más que la cantidad total de terpenos producidos en la reacción.

30 Como se usa en la presente memoria, quot;actividad catalítica aumentadaquot; con referencia a la actividad de una valenceno sintasa significa que aumenta la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como difosfato de farnesilo (FPP), dando así como resultado una formación aumentada de valenceno. Con fines de la presente memoria, una valenceno sintasa exhibe actividad catalítica aumentada si la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa modificada es de 10 a

35 500 %, de 10 a 250 %, de 50 a 250 %, de 100 a 500 % o de 100 a 250 % mayor que la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa expuesta en la SEQ ID NO: 1, tal como un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 % o más mayor que la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa expuesta en la SEQ ID NO:1. Por ejemplo, una valenceno sintasa exhibe actividad catalítica

40 aumentada si la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa modificada es de al menos o de aproximadamente al menos un 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 1500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 % o 5000 % de la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por la valenceno sintasa de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO:1 en las mismas condiciones.

45 Como se usa en la presente memoria, quot;silvestrequot; o quot;nativaquot; con referencia a la valenceno sintasa hace referencia a un polipéptido de valenceno sintasa codificado por un gen de valenceno sintasa nativo o de origen natural, incluyendo variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluyendo una planta, en la naturaleza. La referencia a valenceno sintasa de tipo silvestre sin referencia a una especie pretende englobar cualquier especie de

50 una valenceno sintasa de tipo silvestre. La secuencia aminoacídica de valenceno sintasas ejemplares se expone en la SEQ ID NO:1 (aislada de Eryngium glaciale), SEQ ID NO: 14 (aislada de Citrus sinensis cv. Valencia, Citrus sinensis cv. Cara Cara y Citrus x paradisi), SEQ ID NO:34 (aislada de Citrus sinensis cv. Valencia), SEQ ID NO:27 (aislada de Citrus x paradisi), SEQ ID NO:26 (aislada de Citrus x paradisi), SEQ ID NO:16 y 28 (aislada de Vitis vinifera), SEQ ID NO:29 (aislada de Chamaecyparis nootkatensis pendula) y SEQ ID NO:38 (aislada de Perilla

55 frutescens).

Como se usa en la presente memoria, variantes de especie hace referencia a variantes en polipéptidos entre diferentes especies.

60 Como se usa en la presente memoria, variantes alélicas hace referencia a variaciones en las proteínas codificadas entre los miembros de la misma especie.

Como se usa en la presente memoria, una variante de empalme hace referencia a una variante producida mediante un procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.

5 Como se usa en la presente memoria, quot;polipéptido de valenceno sintasa modificadoquot; hace referencia a un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una o más diferencias aminoacídicas en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa no modificado o de tipo silvestre. La una o más diferencias aminoacídicas pueden ser mutaciones aminoacídicas tales como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones

10 aminoacídicos, o pueden ser inserciones o deleciones de dominios completos, y cualquier combinación de los mismos. Típicamente, un polipéptido de valenceno sintasa modificado tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa no modificado o de tipo silvestre. Por ejemplo, un polipéptido de valenceno sintasa modificado proporcionado en la presente memoria puede tener al menos 1, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

15 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135 o más diferencias aminoacídicas en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa no modificado. Se contempla cualquier modificación a condición de que el polipéptido resultante exhiba al menos una actividad valenceno sintasa asociada a un polipéptido de valenceno sintasa de tipo silvestre tal como, por ejemplo, actividad catalítica la

20 capacidad de unirse a FPP y/o la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de FPP.

Como se usa en la presente memoria, la referencia a un polipéptido de valenceno sintasa modificado productor de valenceno a partir de FPP en una cantidad que es mayor que la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por una valenceno sintasa de referencia, tal como una valenceno sintasa de tipo silvestre, indica que la valenceno 25 sintasa modificada produce al menos o aproximadamente un 10 % más de valenceno a partir de FPP de lo que produce la valenceno sintasa de referencia. Por ejemplo, tal polipéptido de valenceno sintasa modificada puede producir al menos o al menos aproximadamente un 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60%, 70%,80%, 90%, 100%, 110%,120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 600 %, 700 %, 800 %, 900 %, 1000 %, 2000 %, 5000 % o más de valenceno a 30 partir de FPP en comparación con la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por una valenceno sintasa de referencia. La cantidad de valenceno producida a partir de FPP por una valenceno sintasa puede valorarse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. Cuando se compara la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por dos valenceno sintasas, tales como una valenceno sintasa modificada y una valenceno sintasa de referencia, tal como como una valenceno sintasa de tipo silvestre, se entiende que el ensayo se practica en las 35 mismas condiciones para cada sintasa. En un ejemplo, la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por dos valenceno sintasas, tales como una valenceno sintasa modificada y una valenceno sintasa de referencia, se valora expresando la valenceno sintasa modificada y la valenceno sintasa de referencia separadamente en una célula de levadura de la misma cepa (donde la expresión es a partir del mismo vector de expresión) que produce también FPP, y cultivando las células en las mismas condiciones de tal modo que se produzca valenceno. La cantidad de

40 valenceno producida en el cultivo celular que expresa la valenceno sintasa modificada se compara con la cantidad de valenceno producida en el cultivo celular que expresa la valenceno sintasa de referencia, usando procedimientos de cuantificación bien conocidos en la materia, tales como GC-MS.

Como se usa en la presente memoria, residuos correspondientes hace referencia a los residuos que aparecen en

45 loci alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean mediante cualquier procedimiento conocido por los especialistas en la materia. Tales procedimientos maximizan típicamente los apareamientos, e incluyen procedimientos tales como usar alineamientos manuales y usar los numerosos programas de alineamientos disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los especialistas en la materia. Alineando las secuencias de polipéptidos, un especialista en la materia puede identificar los residuos correspondientes, usando residuos

50 aminoacídicos conservados e idénticos como guías. Las posiciones correspondientes pueden estar también basadas en alineamientos estructurales, por ejemplo usando alineamientos simulados informáticamente de la estructura proteica. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 4A, el Asp315 de valenceno sintasa de E. glaciale expuesta en la SEQ ID NO: 1 corresponde al Asp301 de valenceno sintasa de C. sinensis expuesta en la SEQ ID NO: 14.

55 Como se usa en la presente memoria, dominio o región (típicamente una secuencia de 3 o más, generalmente 5 o 7

o más aminoácidos) hace referencia a una porción de una molécula, tal como una proteína o los ácidos nucleicos codificantes, que es estructural y/o funcionalmente distinta de otras porciones de la molécula y es identificable. Una proteína puede tener uno, o más de uno, dominios distintos. Por ejemplo, un dominio puede identificarse, definirse o distinguirse por homología de la secuencia del mismo con miembros de la familia relacionados, tales como otras

60 terpeno sintasas. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Tales dominios son conocidos, y pueden

identificarse, por los especialistas en la materia. Para ejemplificación en la presente memoria, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está dentro de las competencias en la materia reconocer dominios particulares por el nombre. Si es necesario, puede emplearse un software apropiado para identificar dominios. Por ejemplo, como se discute anteriormente, pueden identificarse los dominios correspondientes en diferentes terpeno sintasas

5 por alineamientos de secuencia, tal como usando herramientas y algoritmos bien conocidos en la materia (por ejemplo, BLASTP).

Como se usa en la presente memoria, un dominio funcional hace referencia a aquellas porciones de un polipéptido que se reconocen gracias a una actividad funcional, tal como actividad catalítica. Un dominio funcional puede

10 distinguirse por su función, tal como por actividad catalítica, o una capacidad de interaccionar con una biomolécula, tal como unión a sustrato o unión a metal. En algunos ejemplos, un dominio puede exhibir independientemente una función o propiedad biológica, de tal modo que el dominio independientemente, o fusionado con otra molécula, pueda practicar una actividad tal como, por ejemplo, actividad catalítica o unión a sustrato.

15 Como se usa en la presente memoria, un dominio estructural hace referencia a aquellas porciones de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada independientemente en una proteína compuesta por uno o más motivos estructurales.

Como se usa en la presente memoria, quot;heterólogoquot; con respecto a una secuencia aminoacídica o de ácido nucleico

20 hace referencia a porciones de una secuencia que no están presentes en el polipéptido nativo ni codificadas por el polinucleótido nativo. Por ejemplo, una porción de aminoácidos de un polipéptido, tal como un dominio o región o porción del mismo, de una valenceno sintasa es heteróloga del mismo si tales aminoácidos no están presentes en una valenceno sintasa nativa o de tipo silvestre (p.ej. como se expone en la SEQ ID NO:1) ni codificados por el polinucleótido que codifica una valenceno sintasa nativa o de tipo silvestre. Se hace referencia a los polipéptidos que

25 contienen tales aminoácidos heterólogos o polinucleótidos que codifican los mismos como quot;polipéptidos quiméricosquot;

o quot;polinucleótidos quiméricosquot;, respectivamente.

Como se usa en la presente memoria, la frase quot;se mejora una propiedad de la terpeno sintasa modificada en comparación con la primera terpeno sintasaquot; hace referencia a un cambio deseable en una propiedad de una 30 terpeno sintasa modificada en comparación con una terpeno sintasa que no contiene la modificación o modificaciones. Típicamente, la propiedad o propiedades se mejoran de tal modo que la cantidad de un terpeno deseado producido a partir de la reacción de un sustrato con la terpeno sintasa modificada aumente en comparación con la cantidad del terpeno deseado producida a partir de la reacción de un sustrato con una terpeno sintasa que no está modificada así. Las propiedades ejemplares que pueden mejorarse en una terpeno sintasa modificada incluyen,

35 por ejemplo, producción de terpeno, actividad catalítica, distribución de producto, especificidad de sustrato, regioselectividad y estereoselectividad. Una o más de las propiedades pueden valorarse usando procedimientos bien conocidos en la materia para determinar si la propiedad había mejorado (es decir se había alterado para ser más deseable para la producción de un terpeno o terpenos deseados).

40 Como se usa en la presente memoria, la producción de terpeno (a la que se hace referencia también como rendimiento de terpeno) hace referencia a la cantidad (en peso o peso/volumen) de terpeno producida a partir de la reacción de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico con una terpeno sintasa. La referencia a producción de terpeno total hace referencia a la cantidad total de todos los terpenos producidos a partir de la reacción, mientras que la referencia a la producción de terpeno específica hace referencia a la cantidad de un terpeno específico (p.ej.

45 valenceno) producido a partir de la reacción.

Como se usa en la presente memoria, una producción de terpeno mejorada hace referencia a un aumento en la cantidad total de terpeno (es decir, producción de terpeno total mejorada) o a un aumento en la cantidad específica de terpeno (es decir, producción de terpeno específico mejorada) producida a partir de la reacción de un precursor 50 terpénico de pirofosfato acíclico con una terpeno sintasa modificada en comparación con la cantidad producida a partir de la reacción del mismo precursor terpénico de pirofosfato acíclico con una terpeno sintasa que no está modificada así. La cantidad de terpeno (total o específico) producida a partir de la reacción de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico con una terpeno sintasa modificada puede aumentarse en al menos o aproximadamente al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en comparación con la

55 cantidad de terpeno producida a partir de la reacción del mismo precursor terpénico de pirofosfato acíclico en las mismas condiciones con una terpeno sintasa que no está modificada así.

Como se usa en la presente memoria, especificidad de sustrato hace referencia a la preferencia de una valenceno sintasa por un sustrato diana frente a otro, tal como un precursor terpénico de pirofosfato acíclico (p.ej., pirofosfato 60 de farnesilo (FPP), pirofosfato de geranilo (GPP) o pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP)) frente a otro. La especificidad de sustrato puede valorarse usando procedimientos bien conocidos en la materia, tales como aquellos

que calculan kcat/Km. Por ejemplo, la especificidad de sustrato puede valorarse comparando la Kcat/Km relativa, que es una medida de la eficiencia catalítica, de la enzima frente a diversos sustratos (p.ej. GPP, FPP, GGPP).

Como se usa en la presente memoria, especificidad alterada hace referencia a un cambio en la especificidad de

5 sustrato de un polipéptido de terpeno sintasa modificado (tal como un polipéptido de valenceno sintasa modificado) en comparación con una terpeno sintasa que no está modificada así (tal como, por ejemplo, una valenceno sintasa de tipo silvestre). La especificidad (p.ej., kcat/Km) de un polipéptido de terpeno sintasa modificado por un sustrato, tal como FPP, GPP o GGPP, puede alterarse en al menos o aproximadamente al menos un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en comparación con la especificidad de una valenceno sintasa

10 de partida por el mismo sustrato.

Como se usa en la presente memoria, especificidad de sustrato mejorada hace referencia a un cambio o alteración en la especificidad de sustrato hacia una especificidad más deseada. Por ejemplo, especificidad de sustrato mejorada puede incluir un aumento de la especificidad de sustrato de un polipéptido de terpeno sintasa modificado

15 por un sustrato deseado, tal como FPP, GPP o GGPP. La especificidad (p.ej., kcat/Km) de un polipéptido de terpeno sintasa modificado por un sustrato, tal como FPP, GPP o GGPP, puede aumentarse en al menos o aproximadamente al menos un 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % o más en comparación con la especificidad de una terpeno sintasa que no está modificada así.

20 Como se usa en la presente memoria, quot;distribución de productoquot; hace referencia a las cantidades relativas de diferentes terpenos producidos a partir de la reacción entre un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, y una terpeno sintasa, incluyendo los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria. La cantidad de terpeno producida puede representarse como un porcentaje de los productos totales producidos por la terpeno sintasa. Por ejemplo, la distribución de producto resultante de la reacción de FPP

25 con una valenceno sintasa puede ser de 90 % (peso/volumen) de valenceno y 10 % (peso/volumen) de β-elemeno. Los procedimientos para valorar el tipo y cantidad de un terpeno en una solución son conocidos en la materia y se describen en la presente memoria e incluyen, por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) (véanse los ejemplos siguientes).

30 Como se usa en la presente memoria, una distribución de producto alterada hace referencia a un cambio en la cantidad relativa de terpenos individuales producidos a partir de la reacción entre un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, y una terpeno sintasa tal como valenceno sintasa. Típicamente, el cambio se valora determinando la cantidad relativa de terpenos individuales producidos a partir del precursor terpénico de pirofosfato acíclico usando una primera sintasa (p.ej. sintasa de tipo silvestre) y comparándola entonces con la

35 cantidad relativa de terpenos individuales producidos usando una segunda sintasa (p.ej. una sintasa modificada). Se considera que aparece una distribución de producto alterada si la cantidad relativa de uno cualquiera o más de los terpenos aumenta o disminuye en al menos o aproximadamente en al menos un 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10%, 15 %, 20 %, 25%, 30 %, 35 %, 40%, 50%, 60 %, 70 %, 80% o más.

40 Como se usa en la presente memoria, una distribución de producto mejorada hace referencia a un cambio en la distribución de producto hacia uno que sea más deseable, es decir que contenga cantidades relativas de terpenos más deseables. Por ejemplo, una distribución de producto mejorada puede contener una cantidad aumentada de un terpeno deseado y una cantidad disminuida de un terpeno que no es tan deseado. La cantidad de terpeno deseado en una distribución de producción mejorada puede aumentar en al menos o aproximadamente en al menos un 0,5

45 %, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%,80 % o más. La cantidad de un terpeno que no se desea en una distribución de producción mejorada puede disminuir en al menos o aproximadamente en al menos un 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30%, 35 %, 40%, 50 %, 60%, 70 %, 80 %o más.

50 Como se usa en la presente memoria, los ácidos nucleicos o moléculas de ácido nucleico incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos peptidonucleicos (APN) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmente marcados tales como con un marcador detectable tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas monocatenarias. Tales moléculas son típicamente de una longitud tal que

55 su diana es estadísticamente única o de bajo número de copias (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para sondear o cebar una colección. Generalmente, una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de largo.

60 Como se usa en la presente memoria, el término quot;polinucleótidoquot; significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y

ADN y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se da en la presente memoria en términos de nucleótidos (abreviado quot;ntquot;) o pares de bases (abreviado quot;pbquot;). El término nucleótido se usa para moléculas monocatenarias y bicatenarias donde lo permita el contexto. Cuando se aplica el término a moléculas

5 bicatenarias, se usa para denotar la longitud global y se entenderá que es equivalente al término pares de bases. Se reconocerá por los especialistas en la materia que las dos hebras de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en longitud, y que los extremos de las mismas pueden estar escalonados; por tanto pueden no estar apareados todos los nucleótidos en una molécula polinucleotídica bicatenaria. Tales extremos no apareados no superarán, en general, los 20 nucleótidos de longitud.

10 Como se usa en la presente memoria, un ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico que no se produce normalmente in vivo por la célula en que se expresa o que se produce por la célula pero está en un locus diferente o se expresa diferentemente, o que media o codifica mediadores que alteran la expresión del ácido nucleico endógeno, tal como ADN, afectando a la transcripción, traducción u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido

15 nucleico heterólogo es generalmente no endógeno de la célula en que se introduce, sino que se ha obtenido de otra célula o preparado sintéticamente. El ácido nucleico heterólogo puede ser endógeno, pero es un ácido nucleico que se expresa a partir de un locus diferente o alterado en su expresión. Generalmente, aunque no necesariamente, tal ácido nucleico codifica ARN y proteínas que no se producen normalmente por la célula o del mismo modo en la célula en que se expresa. Puede hacerse referencia también al ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, como

20 ácido nucleico extraño, tal como ADN. Por tanto, el ácido nucleico heterólogo o ácido nucleico extraño incluye una molécula de ácido nucleico no presente en la orientación o posición exacta en que se encuentra en un genoma la contrapartida de molécula de ácido nucleico, tal como ADN. Puede hacerse referencia también a una molécula de ácido nucleico de otro organismo o especie (es decir, exógena).

25 Cualquier ácido nucleico, tal como ADN, que un especialista en la materia reconocería o consideraría como heterólogo o extraño para la célula en que se expresa el ácido nucleico, está englobado en la presente memoria por ácido nucleico heterólogo; el ácido nucleico heterólogo incluye ácido nucleico añadido exógenamente que se expresa también endógenamente. Los ejemplos de ácido nucleico heterólogo incluyen, pero sin limitación, ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras trazables, tales como una proteína que confiere resistencia a fármacos,

30 un ácido nucleico que codifica sustancias terapéuticamente efectivas tales como agentes anticancerosos, enzimas y hormonas, y un ácido nucleico, tal como ADN, que codifica otros tipos de proteínas tales como anticuerpos. Los anticuerpos que se codifican por ácido nucleico heterólogo pueden secretarse o expresarse sobre la superficie de la célula en que se ha introducido el ácido nucleico heterólogo.

35 Como se usa en la presente memoria, un péptido hace referencia a un polipéptido que es de 2 a 40 aminoácidos de longitud.

Como se usa en la presente memoria, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente memoria se identifican de acuerdo con sus abreviaturas conocidas de tres letras o

40 una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que aparecen en diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las denominaciones de una letra estándares usadas rutinariamente en la materia.

Como se usa en la presente memoria, un quot;aminoácidoquot; es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o mas aminoácidos. Con fines de la presente memoria, los

45 aminoácidos incluyen los 20 aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos aminoacídicos (es decir, aminoácidos donde el carbono α tiene una cadena lateral).

Manteniendo la nomenclatura polipeptídica estándar descrita en J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), y adoptada en el título 37 del C.F.R. apartados 1.821-1.822, se muestran las abreviaturas para los residuos aminoacídicos en la

50 Tabla 1: Tabla 1-Tabla de correspondencia

SÍMBOLO

Una letra: Tres letras AMINOÁCIDO

Y: Tyr Tirosina

G: Gly Glicina

F: Phe Fenilalanina

M: Met Metionina

A: Ala Alanina

S: Ser Serina

I: Ile Isoleucina

L: Leu Leucina

T: Thr Treonina

V: Val Valina

P: Pro Prolina

K: Lys Lisina

H: His Histidina

Q: Gln Glutamina

E: Glu Ácido glutámico

Z: Glx Glu y/o Gln

W: Trp Triptófano

R: Arg Arginina

D: Asp Ácido aspártico

N: Asn Asparagina

B: Asx Asn y/o Asp

C: Cys Cisteína

X: Xaa Desconocido u otro

Todas las secuencias de residuos aminoacídicos representadas en la presente memoria por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de extremo amino a extremo carboxilo. Además, la frase quot;residuo aminoacídicoquot; se define ampliamente para incluir los aminoácidos listados en la Tabla de

5 correspondencia (Tabla 1) y aminoácidos modificados e inhabituales, tales como aquellos a los que se hace referencia en el título 37 del C.F.R. apartados 1.821-1.822.

Además, un guion en el inicio o el final de una secuencia de residuo aminoacídico indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más residuos aminoacídicos, o un grupo aminoterminal tal como NH2 o un grupo

10 carboxiterminal tal como COOH.

Como se usa en la presente memoria, quot;aminoácidos de origen naturalquot; hace referencia a los 20 L-aminoácidos que aparecen en polipéptidos.

15 Como se usa en la presente memoria, quot;aminoácido no naturalquot; hace referencia a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo ácido carboxílico que no es uno de los aminoácidos de origen natural listados en la Tabla 1. Los aminoácidos de origen no natural incluyen por tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los D-estereoisómeros de aminoácidos. Los aminoácidos no naturales ejemplares son conocidos por los especialistas en la materia y

20 pueden incluirse en cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, modificación es con referencia a una modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico, e incluye 25 deleciones, inserciones y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Con fines de la presente memoria, los reemplazos aminoacídicos (o sustituciones), deleciones y/o inserciones pueden realizarse en cualquiera de las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria. Las modificaciones pueden realizarse realizando reemplazos aminoacídicos conservativos y también sustituciones aminoacídicas no conservativas. Por ejemplo, pueden realizarse reemplazos aminoacídicos que alteran deseable o ventajosamente las propiedades de la

30 valenceno sintasa. Por ejemplo, pueden realizarse reemplazos aminoacídicos en la valenceno sintasa de tal modo que la valenceno sintasa modificada resultante pueda producir más valenceno a partir de FPP en comparación con una valenceno sintasa no modificada.

Los reemplazos o sustituciones aminoacídicos contemplados incluyen sustituciones conservativas incluyendo, pero

35 sin limitación, aquellas expuestas en la Tabla 2. Las sustituciones conservativas adecuadas de aminoácidos son conocidas por los especialistas en la materia y pueden realizarse en general sin alterar la conformación o actividad del polipéptido. Los especialistas en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones aminoacídicas individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p.ej., Watson y col. Molecular Biology of the Gene, 4ª edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224).

40 Las sustituciones aminoacídicas conservativas se realizan, por ejemplo, de acuerdo con las expuestas en la Tabla 2 como sigue:

TABLA 2

Residuo original: Sustitución conservativa

Ala (A): Gly; Ser; Abu

Arg (R): Lys; Orn

Asn (N): Gln; His

Cys (C): Ser

Gln (Q): Asn

Glu (E): Asp

Gly (G): Ala; Pro

His (H): Asn; Gln

Ile (I): Leu; Val

Leu (L): Ile; Val

Lys (K): Arg; Gln; Glu

Met (M): Leu; Tyr; Ile

Ornitina: Lys; Arg

Phe (F): Met; Leu; Tyr

Ser (S): Thr

Thr (T): Ser

Trp (W): Tyr

Tyr (Y): Trp; Phe

Val (V): Ile; Leu; Met

Son también permisibles otras sustituciones conservativas y pueden determinarse empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas. Los efectos de tales sustituciones pueden calcularse usando matrices de puntuación de sustitución tales como PAM120, PAM-200 y PAM-250 como se discute en Altschul (J. Mol. Biol. 219:

5 555-565 (1991)).

Como se usa en la presente memoria, quot;secuencia primariaquot; hace referencia a la secuencia de residuos aminoacídicos en un polipéptido.

10 Como se usa en la presente memoria, quot;similitudquot; entre dos proteínas o ácidos nucleicos hace referencia al parentesco entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias nucleotídicas de los ácidos nucleicos. La similitud puede estar basada en el grado de identidad y/u homología de secuencias de residuos y los residuos contenidos en las mismas. Los procedimientos para valorar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos son conocidos por los especialistas en la materia. Por ejemplo, en un procedimiento para valorar la

15 similitud de secuencia, se alinean dos secuencias aminoacídicas o nucleotídicas de manera que procure el máximo nivel de identidad entre las secuencias. quot;Identidadquot; hace referencia a la extensión en que las secuencias aminoacídicas o nucleotídicas son invariables. El alineamiento de secuencias aminoacídicas, y en cierta medida de secuencias nucleotídicas, puede tener en cuenta también diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Las diferencias conservativas son aquellas que conservan las propiedades

20 fisicoquímicas de los residuos implicados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas por toda la longitud de las secuencias e incluyendo todos los residuos) o locales (el alineamiento de una porción de las secuencias que incluye solo la región o regiones más similares).

Como se usa en la presente memoria, los términos quot;homologíaquot; e quot;identidadquot; se usan para describir el parentesco

25 entre polipéptidos (o moléculas de ácido nucleico codificantes). Identidad hace referencia a secuencias idénticas; homología puede incluir cambios aminoacídicos conservativos. En general, para identificar las posiciones correspondientes, se alinean las secuencias aminoacídicas de modo que se obtenga el máximo orden de apareamiento (véanse, p.ej. :Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993;

30 Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo y col. (1988) SIAM J Applied Math

48: 1073).

35 Como se usa en la presente memoria, quot;identidad de secuenciaquot; hace referencia al número de aminoácidos o bases nucleotídicas idénticos o similares en una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de prueba y de referencia. La identidad de secuencia puede determinarse mediante alineamiento de secuencia de las secuencias de ácido nucleico o proteína para identificar regiones de similitud o identidad. Con fines de la presente memoria, se determina generalmente la identidad de secuencia por alineamiento para identificar residuos idénticos. El

40 alineamiento puede ser local o global, pero con fines de la presente memoria es generalmente un alineamiento global donde se compara toda la longitud de cada secuencia. Pueden identificarse los apareamientos, desapareamientos y huecos entre secuencias comparadas. Los huecos son aminoácidos o nucleótidos nulos insertados entre los residuos de secuencias alineadas de modo que se alineen caracteres idénticos o similares. Generalmente, puede haber huecos internos y terminales. La identidad de secuencia puede determinarse teniendo

en cuenta los huecos como el número de residuos idénticos/longitud de la secuencia más corta x 100. Cuando se usan penalizaciones de hueco, puede determinarse la identidad de secuencia sin penalización para huecos terminales (p.ej., los huecos terminales no se penalizan). Como alternativa, puede determinarse la identidad de secuencia sin tener en cuenta los huecos como el número de posiciones idénticas/longitud de la secuencia alineada

5 total x 100.

Como se usa en la presente memoria, un quot;alineamiento globalquot; es un alineamiento que alinea dos secuencias desde el inicio al final, alineando cada letra en cada secuencia solo una vez. Se produce un alineamiento independientemente de si hay similitud o identidad o no entre las secuencias. Por ejemplo, una identidad de 10 secuencias de 50 % en quot;alineamiento globalquot; significa que, en un alineamiento de toda la secuencia de dos secuencias comparadas, cada una de 100 nucleótidos de longitud, el 50 % de los residuos son los mismos. Se entiende que puede usarse también el alineamiento global en la determinación de la identidad de secuencia incluso cuando la longitud de las secuencias alineadas no sea la misma. Se tendrán en cuenta las diferencias en los extremos terminales de las secuencias en la determinación de la identidad de secuencia, a menos que se seleccione 15 quot;sin penalización para huecos terminalesquot;. Generalmente, se usa un alineamiento global en secuencias que comparten una similitud significativa por la mayoría de su longitud. Los algoritmos ejemplares para practicar un alineamiento global incluyen el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y col. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970). Los programas ejemplares para practicar alineamientos globales están públicamente disponibles e incluyen la Herramienta de Alineamiento de Secuencia Global disponible en el sitio web del Centro Nacional para Información

20 Biotecnológica (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), y el programa está disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.

Como se usa en la presente memoria, un quot;alineamiento localquot; es un alineamiento que alinea dos secuencias, pero solo alinea aquellas porciones de las secuencias que comparten similitud o identidad. Por ello, un alineamiento local 25 determina si están presentes subsegmentos de una secuencia en otra secuencia. Si no hay similitud, no se devolverá alineamiento. Los algoritmos de alineamiento local incluyen BLAST o el algoritmo de Smith-Waterman (Adv. . Math. 2: 482 (1981)). Por ejemplo, un 50 % de identidad de secuencia basada en quot;alineamiento localquot; significa que, en un alineamiento de la secuencia completa de dos secuencias comparadas de cualquier longitud, una región de similitud o identidad de 100 nucleótidos de longitud tiene un 50 % de los residuos que son iguales en

30 la región de similitud o identidad.

Con fines de la presente memoria, puede determinarse la identidad de secuencia mediante programas de algoritmo de alineamiento estándares usados con penalizaciones por hueco por defecto establecidas por cada suministrador. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que 35 contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y col. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pág. 353-358 (1979); (2) una penalización de 3,0 por cada hueco y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada hueco y (3) sin penalización por huecos terminales. Puede determinarse si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias 40 nucleotídicas, o dos polipéptidos cualesquiera tienen secuencias aminoacídicas, que son al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % quot;idénticasquot; u otras variaciones similares que enumeran una identidad porcentual, usando algoritmos informáticos conocidos basados en alineamiento local o global (véase p.ej. wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software, que proporciona enlaces a docenas de bases de datos y programas conocidos y públicamente disponibles). Generalmente, con fines de la presente memoria, se determina la 45 identidad de secuencia usando algoritmos informáticos basados en alineamiento global, tale como la herramienta de alineamiento de secuencia global de Needleman-Wunsch, disponible en NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome); LAlign (implementación por William Pearson del algoritmo de Huang y Miller (Adv. . Math. (1991) 12: 337-357)); y el programa de Xiaoqui Huang disponible en deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html. Generalmente, cuando se comparan las secuencias nucleotídicas de la

50 presente memoria, se usa un alineamiento con penalización por huecos terminales. El alineamiento local puede usarse también cuando las secuencias que se están comparando son sustancialmente de la misma longitud.

Por lo tanto, como se usa en la presente memoria, el término quot;identidadquot; representa una comparación o alineamiento entre un polipéptido o polinucleótido de prueba y de referencia. En un ejemplo no limitante, quot;al menos un 90 % 55 idéntico aquot; hace referencia a identidades porcentuales de 90 a 100 % respecto al polipéptido o polinucleótido de referencia. La identidad a un nivel del 90 % o más es indicativa del hecho de que, suponiendo con fines de ejemplificación que se compara una longitud de polipéptido o polipéptido de prueba y de referencia de 100 aminoácidos o nucleótidos, no más del 10 % (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos o nucleótidos en el polipéptido

o polinucleótido de prueba difiere de los de los polipéptidos de referencia. Pueden hacerse comparaciones similares

60 entre un polinucleótido de prueba y de referencia. Pueden representarse tales diferencias como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente por toda la longitud de una secuencia aminoacídica o pueden agruparse en

una o más localizaciones de longitud variable de hasta el máximo permisible, p.ej., diferencia aminoacídica de 10/100 (aproximadamente 90 % de identidad). Las diferencias pueden ser debidas también a deleciones o truncamientos de residuos aminoacídicos. Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácido nucleico o aminoácido. Dependiendo de la longitud de las secuencias comparadas, al nivel de homologías

5 o identidades por encima de aproximadamente un 85-90 %, el resultado puede ser independiente de los programas y parámetros de hueco fijados; tales altos niveles de identidad pueden valorarse fácilmente, a menudo sin confiar en software.

Como se usa en la presente memoria, se entiende también que los términos quot;sustancialmente idénticoquot; o quot;similarquot;

10 varían con el contexto como se entiende por los especialistas en la materia relevante, pero que los especialistas pueden valorarlos.

Como se usa en la presente memoria, una secuencia alineada hace referencia al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear las posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos.

15 Típicamente, se alinean dos o más secuencias que están relacionadas con un 50 % o más de identidad. Un conjunto alineado de secuencias hace referencia a 2 o más secuencias que están alineadas en las posiciones correspondientes y que pueden incluir alinear secuencias derivadas de ARN, tales como EST y otros ADNc, alineadas con la secuencia de ADN genómica.

20 Como se usa en la presente memoria, el polipéptido o proteína aislado o purificado o porción biológicamente activa del mismo está sustancialmente exento de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula de tejido de la que deriva la proteína, o sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Puede determinarse que las preparaciones son sustancialmente exentas si parecen exentas de impurezas fácilmente detectables como se determina por procedimientos estándares de análisis, tales como

25 cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), usados por los especialistas en la materia para valorar tal pureza, o suficientemente puras de tal modo que una purificación adicional no alteraría detectablemente las propiedades físicas y químicas, tales como actividades proteolíticas y biológicas, de la sustancia. Los procedimientos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros son conocidos por los especialistas en la materia. Sin embargo, un compuesto

30 sustancialmente químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales aspectos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.

El término sustancialmente exento de material celular incluye preparaciones de valenceno sintasa y productos de terpeno en que la valenceno sintasa o producto de terpeno se separa de los componentes celulares de las células

35 de las que se aísla o produce. En una realización, el término sustancialmente exento de material celular incluye preparaciones de valenceno sintasa o productos de terpeno que tienen menos de aproximadamente un 30 %, 20 %, 10 %, 5 % o menos (en peso seco) de proteínas o productos no de valenceno sintasa o terpeno, incluyendo medio de cultivo celular.

40 Como se usa en la presente memoria, la producción por procedimientos recombinantes usando procedimientos de ADN recombinante hace referencia al uso de los procedimientos bien conocidos de biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.

Como se usa en la presente memoria, vector (o plásmido) hace referencia a elementos de ADN discretos que se

45 usan para introducir ácido nucleico heterólogo en células para la expresión o replicación del mismo. Los vectores permanecen típicamente episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar la integración de un gen o porción del mismo en un cromosoma del genoma. Se contemplan también vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. La selección y uso de tales vehículos son bien conocidos para los especialistas en la materia.

50 Como se usa en la presente memoria, expresión hace referencia al proceso mediante el cual se transcribe el ácido nucleico a ARNm y se traduce a péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir, si se selecciona una célula u organismo hospedador eucariótico apropiado, procesamiento tal como empalme del ARNm.

55 Como se usa en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está conectado operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más

60 marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación y similares. Los vectores de expresión derivan generalmente de ADN de plásmido o vírico, o pueden contener elementos de ambos. Por tanto, un vector de

expresión hace referencia a un constructo de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la introducción en una célula hospedadora apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los especialistas en la materia e incluyen aquellos que son replicables en células eucarióticas y/o procarióticas y aquellos que permanecen

5 episómicos o aquellos que se integran en el genoma de la célula hospedadora.

Como se usa en la presente memoria, vector incluye también quot;vectores de virusquot; o quot;vectores víricosquot;. Los vectores víricos son virus genomanipulados que están conectados operativamente con genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a células.

10 Como se usa en la presente memoria, un adenovirus hace referencia a cualquiera de un grupo de virus que contienen ADN que causa conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio superior en seres humanos.

Como se usa en la presente memoria, ADN desnudo hace referencia a ADN exento de histona que puede usase

15 para vacunas y terapia génica. El ADN desnudo es el material genético que se pasa de célula a célula durante un proceso de transferencia génica llamado transformación o transfección. En la transformación o transfección, el ADN purificado o desnudo que se capta por la célula receptora dará a la célula receptora una nueva característica o fenotipo.

20 Como se usa en la presente memoria, conectado operativamente cuando se hace referencia a segmentos de ADN significa que los segmentos se organizan de modo que funcionen en sintonía con sus fines pretendidos, p.ej., la transcripción se inicia en el promotor y prosigue a lo largo del segmento codificante hasta el terminador.

Como se usa en la presente memoria, una quot;proteína quiméricaquot; o quot;proteína de fusiónquot; hace referencia a un

25 polipéptido conectado operativamente con un polipéptido diferente. Una proteína quimérica o de fusión proporcionada en la presente memoria puede incluir uno o más polipéptidos de valenceno sintasa, o una porción de los mismos, y uno o más polipéptidos distintos para una cualquiera o más de señales de control transcripcional/traduccional, secuencias señal, marcaje para localización, marcaje para purificación, parte de un dominio de una inmunoglobulina G y/o un agente de orientación. Un polipéptido de valenceno sintasa quimérico

30 incluye también aquellos que tienen sus dominios o regiones endógenos del polipéptido intercambiados con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen aquellas producidas por medios recombinantes como proteínas de fusión, aquellas producidas por medios químicos tales como por acoplamiento químico mediante, por ejemplo, acoplamiento con grupos sulfhidrilo, y aquellas producidas por cualquier otro procedimiento mediante el que se conecta al menos un polipéptido (es decir, valenceno sintasa) o una porción del mismo directa o indirectamente

35 mediante un conector o conectores con otro polipéptido.

Como se usa en la presente memoria, la enumeración de que un polipéptido quot;consiste esencialmente enquot; una secuencia enumerada de aminoácidos significa que solo está presente la secuencia enumerada, o un fragmento de la misma, del polipéptido de longitud completa. El polipéptido incluirá opcional y generalmente aminoácidos

40 adicionales de otra fuente o puede insertarse en otro polipéptido.

Como se usa en la presente memoria, las formas singulares quot;unquot;, quot;unaquot; y quot;el/laquot; incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un polipéptido que comprende quot;un reemplazo aminoacídicoquot; incluye polipéptidos con uno o una pluralidad de reemplazos

45 aminoacídicos.

Como se usa en la presente memoria, los intervalos y cantidades pueden expresarse como quot;aproximadamentequot; un valor o intervalo particular. Aproximadamente incluye también la cantidad exacta. Por ello, quot;aproximadamente 5 %quot; significa quot;aproximadamente 5%quot; y también quot;5 %quot;.

50 Como se usa en la presente memoria, quot;opcionalquot; u quot;opcionalmentequot; significa que el evento o circunstancia descrito a continuación ocurre o no, y que la descripción incluye aspectos en que dicho evento o circunstancia ocurre y aspectos en que no. Por ejemplo, una etapa opcional de aislamiento de valenceno significa que el valenceno se aísla o no se aísla.

55 Como se usa en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos están, a menos que se indique otra cosa, de acuerdo con su uso común, las abreviaturas reconocidas o la Comisión sobre Nomenclatura Bioquimica de la IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11: 1726).

60 B. VISIÓN GENERAL

Se proporcionan en la presente memoria valenceno sintasas de Eryngium glaciale, y variantes y fragmentos catalíticamente activos de las mismas, que catalizan la producción de terpenos a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico. Los terpenos incluyen valenceno y opcionalmente otros sesquiterpenos. Tales valenceno sintasas catalizan la producción biosintética de valenceno a partir de un precursor de pirofosfato acíclico, tal como 5 pirofosfato de farnesilo. Se proporcionan también en la presente memoria procedimientos para producir valenceno y otros sesquiterpenos a partir de tal precursor tales como, pero sin limitación, pirofosfato de farnesilo. Se proporcionan también en la presente memoria procedimientos para elaborar nootkatona a partir del valenceno resultante y a partir del precursor acíclico, tal como pirofosfato de farnesilo. Las valenceno sintasas de Eryngium glaciale (EgVS) proporcionadas proporcionan la producción de productos terpénicos valiosos, incluyendo valenceno,

10 en cantidades comercialmente útiles y de manera económica y energéticamente eficiente. En particular, las EgVS catalizan la producción de muy altos niveles de valenceno en comparación con otras valenceno sintasas, incluyendo CVS.

1. Estructura del valenceno y usos

15 El valenceno (1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-7-isopropenil-1,8a-dimetilnaftaleno (1) es un sesquiterpeno encontrado en aceites cítricos, tales como de naranja y uva. Hasta la fecha, se ha identificado valenceno en diversas plantas incluyendo frutas cítricas (Citrus sp.), flores de parra (Vitis vinifera), apio (Apium graveolens), mango (Mangifera indica), aceitunas (Olea europea) y coral. El valenceno se usa como aroma/fragancia de naranja en perfumes,

20 bebidas y gomas de mascar, y se usa como material de partida para la producción de nootkatona.

El valenceno se genera en plantas por la terpeno sintasa valenceno sintasa, que cataliza la reacción del precursor 25 terpénico de pirofosfato acíclico pirofosfato de farnesilo (FPP) a valenceno (véase la Figura 1).

2. Nootkatona

La nootkatona (4,4a,5,6,7,8-hexahidro-6-isopropenil-4,4-a-dimetil-2(3H)-naftalenona (2 es un sesquiterpenoide

30 encontrado en aceite de uva que proporciona el aroma a uva dominante. Típicamente, la nootkatona se aísla por extracción de la uva. La nootkatona se ha identificado también en diversas otras plantas incluyendo, por ejemplo, falso ciprés de Nootka (Cupressus nootkatensis), vetiver (Chrysopogon zizanioides)y Alpinia oxyphylla Miquel.

35 La nootkatona es un producto oxidado del valenceno. El valenceno puede experimentar hidroxilación regioselectiva formando 2-hidroxivalenceno, que se oxida adicionalmente formando nootkatona (como se describe con más detalle en la sección E siguiente). La nootkatona es apreciada por su sabor y aroma a uva y se usa ampliamente en las industrias de perfumería y aromas. Además, se ha mostrado que la nootkatona es un repelente e insecticida efectivo

40 contra garrapatas y mosquitos.

3. Valenceno sintasas

Las valenceno sintasas son terpeno ciclasas vegetales de clase 1, o terpeno sintasas, isoprenoide sintasas o

45 terpenoide ciclasas, que convierten el difosfato de farnesilo en el sesquiterpeno valenceno. Hasta la fecha, las valenceno sintasas se han aislado de frutos cítricos, flores de parra y Perilla (shiso verde). La valenceno sintasa cítrica (CVS) se ha identificado en flavedo (piel externa) de Citrus sinensis (naranjo dulce; naranjo de Valencia) (SEQ

ID NO:14 y 34) y Citrus x paradisi(uva) (SEQ ID NO:15, 26 y 27) (véanse Chappell (2004) Trends Plant Sci., 9: 266; Sharon-Asa y col., (2003) The Plant Journal 36: 664-674; documento AF411120 y patentes de EE.UU. nº 7.273.735; 7.442.785; 7.790.426 y las solicitudes PCT internacionales nº WO2005021705 y WO2003025193). Se ha descrito una variante de valenceno sintasa que contiene los reemplazos aminoacídicos A5171/1518V (Eyal, E. Master's 5 Thesis, Department of Plant Sciences, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel; enero de 2001; expuesta en la SEQ ID NO:37). Se han descrito una variedad de valenceno sintasas cítricas modificadas en la solicitud de patente de EE.UU . nº 2012-0246767. También se han identificado y aislado valenceno sintasas de flores de parra, incluyendo Vitis vinifera L. cv. Gewürztraminer y Vitis vinifera L. cv. Cabernet Sauvignon (véanse Lucker y col., (2004) Photochemistry 65(19): 2649-2659 y Martin y col, (2009) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 106: 7245-7250) (SEQ ID

10 NO:16 y 28). También se han aislado valenceno sintasas de Chamaecyparis nootkatensis pendula (véanse p.ej. las solicitudes PCT internacionales nº WO2011074954 y WO2012177129; SEQ ID NO: 17 y 29). La sintasa EgVS proporcionada en la presente memoria se muestra en la presente memoria que cataliza la producción de altos niveles de valenceno en comparación con otras valenceno sintasas, incluyendo otras cuyas secuencias se han modificado para producir niveles aumentados de valenceno.

a. Estructura

Las terpeno ciclasas vegetales de clase 1 incluyen un grupo diverso de terpeno sintasas monoméricas que comparten una arquitectura de hélice alfa común denominada pliegue de terpenoide ciclasa de clase 1 (véanse,

20 p.ej.,Christianson, D.W., (2008) Curr Opin Chem Biol 12(2): 141-150 y Bohlmann y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 4126-4133). Aunque existe una similitud de secuencia global relativamente baja, las terpeno ciclasas vegetales de clase 1 tienen estructuras homólogas y algunos motivos y/o residuos altamente conservados. En su sitio catalítico, cada terpeno ciclasa proporciona un molde que se une al sustrato isoprenoide flexible con una orientación y conformación tales que, tras ciclación, se forma un enlace carbono-carbono intramolecular. Por tanto,

25 la estructura de cada sitio catalítico de la enzima dicta los monoterpenos, diterpenos y sesquiterpenos cíclicos resultantes.

Las estructuras de cristal de rayos X de 5-epiaristoloqueno sintasa de tabaco y pentaleneno sintasa revelaron que las terpeno ciclasas vegetales de clase 1 están compuestas por hélices alfa interconectadas por bucles y giros

30 conectores cortos (véanse, p.ej., Starks y col., (1997) Science 277: 1815-1820 y Lesburg y col., (1997) Science 277: 1820-1824). Estas enzimas contienen dos dominios estructurales distintos, un dominio N-terminal, cuya estructura se asemeja a los núcleos catalíticos de las glicosilo hidrolasas, pero cuya función permanece desconocida en gran medida, y un dominio catalítico C-terminal. El dominio catalítico contiene dos motivos de unión a metal conservados, es decir regiones ricas en aspartato, que son responsables de la actividad catalítica de la enzima. El sitio catalítico

35 contiene una gran cavidad central formada mayoritariamente por hélices alfa antiparalelas con las dos regiones ricas en aspartato localizadas en paredes opuestas. Las regiones ricas en aspartato median la unión de difosfatos sustrato mediante puentes con iones Mg2+. La unión posterior del sustrato induce cambios conformacionales tales que la región N-terminal forma una caperuza sobre el núcleo catalítico que cierra el sitio activo al disolvente, estabilizando así los intermedios carbocatiónicos reactivos.

40 Las hélices alfa conservadas C, D, F, G y H constituyen el sitio catalítico o activo de las terpeno sintasas vegetales de clase 1. El sitio activo es un bolsillo hidrófobo revestido por residuos aromáticos para acomodar la cadena olefínica del sustrato. Los residuos aromáticos estabilizan los intermedios carbocatiónicos mediante interacciones catión-π. Una región rica en aspartato 1 está localizada en la hélice D y se caracteriza por la secuencia conservada

45 DDxxD (SEQ ID NO:35), que funciona también uniendo Mg2+ (véase, p.ej.,Starks y col., (1997), Science 277: 18151820). Una segunda región de unión a metal conservada está localizada en la hélice H y se caracteriza por la secuencia conservada [N/D]xxx[S/T]xxxE (SEQ ID NO:36), a la que se hace referencia también como quot;motivo NSE/DTEquot;. Estos dos motivos de unión a metal conservados coordinan la unión de tres iones Mg2+ al difosfato de isoprenoide.

50 La valenceno sintasa de Eryngium glaciale proporcionada en la presente memoria contiene un dominio N-terminal (aa 1-280 de SEQ ID NO:1) y un dominio catalítico C-terminal (aa 281-565 de SEQ ID NO:1). Dentro del dominio catalítico C-terminal está el sitio de unión a metal conservado que contiene las regiones ricas en aspartato 1 y 2. Basándose en el alineamiento con valenceno sintasas conocidas, tales como valenceno sintasa cítrica, la región rica

55 en aspartato 1 que contiene el motivo DDxxD conservado corresponde a los aminoácidos D315, D316, T317, Y318 y D319 de SEQ ID NO:1. Asp315 y Asp319 se unen a restos difosfato de FPP mediante coordinación con Mg2+. La región rica en aspartato 2, que contiene el motivo NSE/DTE, corresponde a los aminoácidos D461, D462, I463, G464, G465, H466, E467, F468 y E469 de SEQ ID NO:1. Esta región se une a un ión Mg2+ adicional mediante los aminoácidos Asp461, Gly465 y Glu469.

b. Actividades

La valenceno sintasa cataliza la formación de valenceno a partir de precursores de pirofosfato acíclicos, tales como el intermedio pirofosfato ubicuo difosfato de farnesilo (FPP), que se produce como parte de la ruta biosintética de isoprenoide dependiente de mevalonato en hongos y animales y la ruta biosintética de isoprenoide no dependiente

5 de mevalonato en bacterias y plantas superiores. Los productos terpénicos adicionales que pueden producirse por valenceno sintasa a partir de precursores terpénicos de pirofosfato acíclico tales como FPP incluyen, pero sin limitación, germacreno A, beta-elemeno (el beta-elemeno se forma por descomposición espontánea de germacreno A), β-selineno, τ-selineno, 7-epi-α-selineno y un compuesto adicional, aristoloqueno (véase, p.ej., el pico 2 en la Figura 3).

10 En general, las terpeno ciclasas vegetales de clase 1, tales como valenceno sintasa, son ciclasas dependientes de metal que convierten difosfatos de isoprenoide todo-trans lineales, tales como difosfato de geranilo, difosfato de farnesilo y difosfato de geranilgeranilo, en monoterpenos, diterpenos y sesquiterpenos cíclicos. Las reacciones de ciclación proceden mediante alquilación electrófila en que se forman nuevos enlaces simples carbono-carbono

15 mediante reacción de un carbocatión alílico deficiente en electrones altamente reactivo y un doble enlace carbonocarbono rico en electrones.

Las terpeno sintasas contienen iones metálicos divalentes, típicamente iones Mg2+ o a veces Mn2+, en el centro activo de la enzima que son requeridos para catálisis enzimática. Más específicamente, son requeridos para la 20 apertura de pirofosfato. Generalmente, las enzimas contienen dos motivos de unión a metal conservados que revisten el sitio catalítico, incluyendo el motivo DDxxD rico en aspartato (SEQ ID NO:35) que coordina la unión de dos iones Mg2+ y el motivo NSE/DTE (SEQ ID NO:36) que coordina un tercer ión Mg2+ (véanse Starks y col., (1997), Science 277: 1815-1820 y Lesburg y col. (1997), Science 277: 1820-1824). Las regiones ricas en aspartato del sitio activo catalítico median la unión de difosfatos de prenilo a través de puentes de iones Mg2+. La unión de (Mg2+)3-PPi 25 induce cambios conformacionales tales que la región N-terminal forma una caperuza sobre el núcleo catalítico y por lo tanto estabiliza el sitio activo en una conformación cerrada que está exenta de disolvente bruto. La pérdida de pirofosfato (PPi) del sustrato unido a enzima da como resultado un carbocatión alílico altamente reactivo que ataca electrófilamente un doble enlace intramolecular más abajo de la cadena de terpeno efectuando el cierre de anillo. El anión PPi acepta enlaces de hidrógeno de residuos básicos conservados cuando se unen en conformación de

30 sintasa cerrada y un bolsillo hidrófobo revestido por residuos aromáticos envuelve la cadena lateral de prenilo y probablemente hace de molde de la reacción de ciclación al reforzar conformaciones de sustrato particulares y estabilizar carbocationes mediante interacciones de apilamiento π (Noel y col., (2010) ACS Chemical Biology 5(4): 377-392).

35 4. Ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de valenceno sintasa

Un especialista en la materia está familiarizado con procedimientos y ensayos para detectar la actividad enzimática de polipéptidos de valenceno sintasa. Los polipéptidos de valenceno sintasa pueden sobreexpresarse y purificarse como se describe en la Sección C siguiente. Típicamente, se determina la actividad de una valenceno sintasa 40 mediante incubación de una valenceno sintasa con un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como pirofosfato de farnesilo (FPP), e identificando, midiendo y/o cuantificando el valenceno y otros productos de reacción.

Por ejemplo, la actividad valenceno sintasa puede determinarse in vitro mediante incubación de una valenceno sintasa con un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, e identificando los productos de reacción.

45 Los productos de reacción, incluyendo relaciones de los productos, pueden determinarse mediante cualquier procedimiento conocido por el especialista en la materia, incluyendo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), GC-FID, cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), comparación con patrones conocidos y resonancia magnética nuclear de protón y carbono (RMN).

50 Como alternativa, la actividad valenceno sintasa puede determinarse in vivo mediante expresión de una valenceno sintasa en una cepa de levadura que produce un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, con lo que la expresión de la valenceno sintasa da como resultado la producción de valenceno y compuestos/productos de reacción o subproductos adicionales. El valenceno y compuestos adicionales pueden purificarse del medio de cultivo celular, por ejemplo, por extracción con un disolvente orgánico, con lo que el valenceno y otros productos se

55 reparten en la fase acuosa como se describe en el Ejemplo 4, y los productos de reacción pueden identificarse y cuantificarse como se describe anteriormente. Las células de levadura ejemplares para expresión de valenceno sintasas y los procedimientos para la generación de células de levadura modificadas que producen un precursor terpénico de pirofosfato acíclico se describen con más detalle en la Sección E siguiente.

60 La cinética de la producción de valenceno puede determinarse mediante procedimientos estándares, tales como por ensayos de sintasa en que se emplean sustratos isoprenoides radiactivos, tales como 3H FPP o 14C FPP, con

concentraciones variables de sintasa. Se extraen los productos de la reacción en una fase orgánica y se mide la radiactividad usando un contador de centelleo líquido. Se determinan las constantes cinéticas a partir de ajustes directos de la ecuación de Michaelis-Menton a los datos.

5 C. MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN VALENCENO SINTASA DE ERYNGIUM GLACIALE (EGVS) Y POLIPÉPTIDOS CODIFICADOS

Se proporcionan en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, incluyendo moléculas de ADNc. Se proporcionan también en la presente memoria polipéptidos de valenceno 10 sintasa, y fragmentos catalíticamente activos de los mismos, codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Las valenceno sintasas codificadas por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria catalizan la formación de valenceno a partir de cualquier precursor terpénico de pirofosfato acíclico adecuado, incluyendo pirofosfato de farnesilo (FPP), pirofosfato de geranilo (GPP) y pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP). Es de interés en la presente memoria la producción de valenceno a partir de

15 FPP. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa son aquellas que son iguales a las que se aíslan del cardo Eryngium glaciale. En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de valenceno sintasa codificados proporcionados en la presente memoria son variantes de aquellas aisladas a partir del cardo Eryngium glaciale.

20 Por ejemplo, se proporciona en la presente memoria una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, y degeneraciones de la misma, que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. Se proporcionan también en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:2 que codifica un polipéptido de valenceno sintasa. Por

25 ejemplo, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden exhibir al menos o al menos aproximadamente un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %,89 %, 90 %, 91 %,92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %

o 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID N:2, a condición de que los polipéptidos de valenceno sintasa codificados exhiban actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno). Puede determinarse la identidad porcentual por un especialista en la materia 30 usando programas de alineamiento estándares. Se proporcionan también en la presente memoria secuencias degeneradas de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 2, que codifica una valenceno sintasa que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de valenceno sintasa se aíslan del cardo Eryngium glaciale. En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico y polipéptidos de valenceno sintasa codificados son variantes de aquellas

35 aisladas a partir del cardo Eryngium glaciale.

Se proporcionan también en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa modificado proporcionado en la presente memoria. Las modificaciones pueden realizarse en cualquier región de un gen que codifica la valenceno sintasa a condición de que el polipéptido de valenceno sintasa 40 modificado codificado resultante retenga al menos actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, típicamente FPP). Las modificaciones pueden incluir optimización de codón de los ácidos nucleicos y/o cambios que dan como resultado una modificación aminoacídica única en el polipéptido de valenceno sintasa codificado, tal como reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones aminoacídicos únicos, o múltiples modificaciones aminoacídicas, tales

45 como múltiples reemplazos, inserciones o deleciones aminoacídicos, incluyendo intercambios de regiones o dominios del polipéptido.

La expresión de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria en un hospedador adecuado, por ejemplo una célula bacteriana o de levadura, da como resultado la expresión de valenceno sintasa.

50 Pueden usarse tales células para producir la valenceno sintasa y/o para practicar reacciones in vivo para producir valenceno. Por ejemplo, puede generarse valenceno en una célula de levadura a partir de FPP, particularmente una célula de levadura que sobreproduce el precursor terpénico de pirofosfato acíclico FPP.

En ejemplos particulares, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria pueden estar

55 optimizadas de codón, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. El uso de codón particular depende del organismo hospedador en que se expresa el polipéptido modificado. Un especialista en la materia está familiarizado con los codones óptimos para expresión en bacterias o levadura incluyendo, por ejemplo, E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, la información del uso de codón está disponible en la Base de Datos de Uso de codón disponible en kazusa.or.jp/codon (véase Richmond (2000) Genome Biology, 1: 241

60 para una descripción de la base de datos). Véanse también Forsburg (2004) Yeast, 10: 1045-1047; Brown y col. (1991) Nucleic Acids Research, 19: 4298; Sharp y col. (1988) Nucleic Acids Research, 12: 8207-8211; Sharp y col.

(1991) Yeast, 657-678. En algunos ejemplos, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que codifican un polipéptido de valenceno sintasa están optimizadas de codón para expresión en bacterias

o levadura. En ejemplos particulares, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria que

codifican una valenceno sintasa están optimizadas de codón para expresión basada en el uso de codón en 5 Saccharomyces cerevisiae.

Se proporcionan también en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa codificados por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente memoria. Los polipéptidos de valenceno sintasa y fragmentos activos de los mismos codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente 10 memoria pueden obtenerse mediante procedimientos bien conocidos en la materia para la generación y expresión de proteína recombinante. Pueden usarse tales polipéptidos de valenceno sintasa para producir valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, en la célula hospedadora en la que se expresa la sintasa, o in vitro después de la purificación de la sintasa. Puede usarse cualquier procedimiento conocido por los especialistas en la materia para la identificación de ácidos nucleicos que codifican genes deseados para obtener el 15 ácido nucleico que codifica una terpeno sintasa, tal como una valenceno sintasa. Por ejemplo, puede obtenerse un ácido nucleico que codifica polipéptidos de valenceno sintasa usando procedimientos bien conocidos a partir de un fuente vegetal, tal como cardo. Los polipéptidos de valenceno modificados pueden genomanipularse entonces usando cualquier procedimiento conocido en la materia para introducir mutaciones en polipéptidos de valenceno sintasa no modificados o de tipo silvestre, incluyendo cualquier procedimiento descrito en la presente memoria tal

20 como mutagénesis aleatoria del ácido nucleico codificante por PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida a sitio, PCR de superposición u otros procedimientos recombinantes. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos pueden introducirse entonces en una célula hospedadora para expresarse heterólogamente.

1. Aislamiento de ácido nucleico que codifica valenceno sintasas

25 Los ácidos nucleicos que codifican valenceno sintasas pueden clonarse o aislarse usando cualquier procedimiento disponible conocido en la materia para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Tales procedimientos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y cribado de colecciones, incluyendo cribado de hibridación de ácidos nucleicos. En algunos ejemplos, pueden usarse procedimientos para la amplificación de ácidos nucleicos para aislar

30 moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, incluyendo por ejemplo procedimientos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como material de partida del que puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica valenceno sintasa. Pueden usarse colecciones de ácido nucleico como fuente de material de partida. Los cebadores se diseñan para amplificar una molécula que codifica valenceno sintasa. Las moléculas proporcionadas en la presente memoria

35 pueden usarse como moldes para cebadores o hibridación o comparación.

Para aislar el ácido nucleico proporcionado aquí, se prepararon preparaciones de ADN y ARNm de cardo (Eryngium sp.), en este aspecto Eryngium glaciale, y se cribaron con cebadores basados en otras valenceno sintasas que se emplearon para cribado. Por ejemplo, se diseñaron cebadores basados en secuencias de ácido nucleico conocidas

40 que codifican un terpeno sintasa, tal como una valenceno sintasa, germacreno D sintasa y vetispiradieno (premnaspirodieno) sintasa, incluyendo aquellas cuyas secuencias se exponen en las SEQ ID NO: 39-44. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación pueden secuenciarse, e identificarse aquellas que codifican un polipéptido de valenceno sintasa.

45 Pueden unirse secuencias nucleotídicas adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica valenceno sintasa, incluyendo secuencias conectoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción con el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo un vector de expresión de proteína o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican la proteína central. Además, pueden conectarse operativamente secuencias nucleotídicas adicionales que especifican elementos de ADN funcionales con una molécula de ácido nucleico que

50 codifica valenceno sintasa. Es más, puede incluirse también ácido nucleico que codifica otros restos o dominios de modo que la sintasa resultante sea una proteína de fusión. Por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican otras enzimas, tales como FPP sintasa o marcajes de purificación de proteína, tales como marcajes His o Flag.

a. Preparación de un ácido nucleico modificado

55 Puede prepararse o generarse un ácido nucleico que codifica una valenceno sintasa modificada (descrita con más detalle en la Sección D siguiente) usando cualquier procedimiento conocido en la materia por efectuar modificación, particularmente inserciones, deleciones y reemplazos aminoacídicos. Los procedimientos para la modificación de moléculas de ácido nucleico incluyen mutagénesis racional y/o aleatoria de moléculas de ácido nucleico codificantes

60 (usando p.ej. PCR propensa a errores, mutagénesis de saturación dirigida a sitio aleatoria, barajado de ADN o mutagénesis dirigida a sitio racional tal como, por ejemplo, kits de mutagénesis (p.ej., QuikChange disponible en

Stratagene) o procedimientos de síntesis en fase sólida). Además, pueden utilizarse técnicas de ADN recombinante rutinarias para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que contienen aminoácidos heterólogos. Por ejemplo, pueden generarse ácidos nucleicos que codifican polipéptidos quiméricos o polipéptidos que contienen una secuencia aminoacídica heteróloga usando un procedimiento de PCR en dos etapas y/o usando enzimas de

5 restricción y metodologías de clonación para subclonación rutinaria de los componentes polipeptídicos quiméricos deseados.

Una vez generadas, las moléculas de ácido nucleico pueden expresarse en células para generar polipéptidos de valenceno sintasa modificados usando cualquier procedimiento conocido en la materia. Los polipéptidos de 10 valenceno sintasa modificados pueden valorarse entonces cribando una propiedad o actividad deseada, por ejemplo la capacidad de producir un valenceno a partir de un sustrato adecuado, p.ej. FPP, como se describe en la Sección

E. En ejemplos particulares, se generan las valenceno sintasas modificadas con las propiedades deseadas por mutación y se criba una propiedad de acuerdo con los ejemplos ejemplificados en la presente memoria. Típicamente, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados producen valenceno a partir de FPP.

2. Vectores y células para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa

Para la expresión recombinante de uno o más de los polipéptidos de valenceno sintasa codificados por los ácidos nucleicos proporcionados en la presente memoria, puede insertarse el ácido nucleico que contiene toda o una 20 porción de la secuencia nucleotídica que codifica la sintasa en un vector de expresión apropiado, es decir un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Dependiendo del sistema de expresión usado, pueden suministrarse también las señales transcripcionales y traduccionales necesarias para el promotor nativo por un gen de valenceno sintasa y/o sus regiones flanqueantes. Por tanto, se proporcionan también en la presente memoria vectores que contienen un ácido

25 nucleico que codifica cualquier polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria. Los vectores ejemplares incluyen pALX.63-71 expuesto en la SEQ ID NO:33 y descrito en el Ejemplo 4 siguiente.

Se proporcionan también células, incluyendo células procarióticas y eucarióticas, que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células vegetales, células de 30 insecto y células de animal. En ejemplos particulares, las células son levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae, que expresan un precursor terpénico de pirofosfato acíclico tal como FPP. Las células se usan para producir una valenceno sintasa, haciendo crecer las células anteriormente descritas en condiciones mediante las que se expresa la valenceno sintasa codificada por la célula. En algunos aspectos, se purifica la sintasa expresada. En otros aspectos, la valenceno sintasa expresada convierte FPP en uno o más sesquiterpenos (p.ej. valenceno) en

35 la célula hospedadora.

Puede usarse cualquier procedimiento conocido por los especialistas en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales transcripcionales/traduccionales y secuencias codificantes de proteína apropiadas. Estos procedimientos pueden 40 incluir técnicas de ADN recombinante in vitro y sintéticas y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos del mismo, puede regularse mediante una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los mismos se expresen en un hospedador transformado con la molécula o moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse por cualquier

45 promotor/potenciador conocido en la materia. En una realización específica, el promotor no es nativo de los genes que codifican una proteína valenceno sintasa. Los promotores que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, promotores procarióticos, de levadura, de mamífero y vegetales. El tipo de promotor depende del sistema de expresión usado, descrito con más detalle a continuación

50 En una realización específica, se usa un vector que contiene un promotor conectado operativamente con ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de valenceno sintasa, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo del mismo, uno o mas orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (p.ej., un gen de resistencia a antibiótico). Se describen vectores y sistemas de expresión de polipéptidos de valenceno sintasa.

55 3. Sistemas de expresión

Los polipéptidos de valenceno sintasa (modificados y no modificados) pueden producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia para la producción de proteína, incluyendo procedimientos in vitro e in vivo tales como, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican la valenceno sintasa en una 60 célula hospedadora o planta hospedadora para producción o expresión in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico que codifican la valenceno sintasa in vitro. Los polipéptidos de valenceno sintasa pueden expresarse en

cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de un polipéptido de sintasa. Los hospedadores de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los hospedadores de expresion pueden diferir en sus niveles de producción de proteína así como en los tipos de

5 modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección del hospedador de expresión puede realizarse basándose en estos y otros factores, tales como consideraciones regulatorias y de seguridad, costes de producción y la necesidad y procedimientos de purificación.

La expresión en células hospedadoras eucarióticas puede incluir la expresión en células de levadura tales como

10 aquellas del género Saccharomyces (p.ej., Saccharomyces cerevisiae) y el género Pichia (p.ej., Pichia pastoris), células de insecto tales como células de Drosophila y células de lepidópteros, plantas y células vegetales tales como cítricos, tabaco, maíz, arroz, algas y lemna. Las células eucarióticas para expresión incluyen también líneas de células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de riñón de hámster recién nacido (BHK). Los hospedadores de expresión eucarióticos incluyen también la producción en animales

15 transgénicos, por ejemplo, incluyendo la producción en suero, leche y huevos.

Están disponibles muchos vectores de expresión y son conocidos por los especialistas en la materia para la expresión de una terpeno sintasa, tal como valenceno sintasa. Es un vector de expresión ejemplar pALX31-180.2, expuesto en la SEQ ID NO:32 y descrito en otro lugar de la presente memoria. La elección del vector de expresión 20 está influida por la elección del sistema de expresión del hospedador. Tal selección está dentro del nivel de competencias del especialista en la materia. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales y opcionalmente potenciadores, señales traduccionales y señales de terminación transcripcional y traduccional. Los vectores de expresión que se usan para transformación estable tienen típicamente un marcador seleccionable que permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, puede

25 usarse un origen de replicación para amplificar el número de copias de los vectores en las células.

Los procedimientos de producción de polipéptidos de terpeno sintasa, incluyendo polipéptidos de valenceno sintasa, pueden incluir la coexpresión de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP, en la célula hospedadora. En algunos aspectos, la célula hospedadora expresa naturalmente FPP. Tal célula puede modificarse

30 para expresar cantidades mayores de FPP (véanse p.ej. las pat. de EE.UU. nº. 6.531.303, 6.689.593, 7.838.279 y 7.842.497). En otros aspectos, una célula hospedadora que no produce naturalmente FPP se modifica genéticamente para producir FPP.

a. Células procarióticas

35 Las células procarióticas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los especialistas en la materia. Los vectores de expresión ejemplares para transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pGEM, los vectores de

40 expresión pQE y los vectores de expresión pET (véase la patente de EE.UU. nº 4.952.496, disponible en Novagen, Madison, WI; véase también la bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Tales plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T7lac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible y el gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador T7 y la señal de secreción ompT de E. coli y pET 15b y pET 19b (Novagen, Madison, WI), que contienen una secuencia líder de His-Tag™ para uso en la purificación

45 con una columna de Ni y un sitio de escisión por trombina que permite la escisión después de la purificación en la columna, la región promotora T7-lac y el terminador T7.

Los vectores de expresión de E. coli pueden contener promotores inducibles que son útiles para inducir altos niveles de expresión de proteína y para expresar proteínas que exhiben cierta toxicidad por las células hospedadoras. Los

50 promotores procarióticos ejemplares incluyen, por ejemplo, el promotor de β-lactamasa (Jay y col., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5543) y el promotor tac (DeBoer y col., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25); véase también quot;Useful Proteins from Recombinant Bacteriaquot;: en Scientific American 242: 74-94 (1980)). Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor λPL regulado por temperatura.

55 Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden expresarse en el entorno citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Pueden usarse para resolubilizar las proteínas agentes reductores tales como ditiotreitol y β-mercaptoetanol y desnaturalizantes (p.ej., tales como HCl de guanidina y urea).

60 Es un enfoque alternativo la expresión de valenceno sintasas en el espacio periplásmico de bacterias, que proporciona un entorno oxidante y de tipo chaperonina y disulfuro isomerasas que conducen a la producción de

proteína soluble. Típicamente, se fusiona una secuencia líder con la proteína para expresar que dirige la proteína al periplasma. Se retira entonces la líder por peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder de orientación periplásmica incluyen la líder pelB del gen de pectato liasa y la líder derivada del gen de fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite el escape de la proteína expresada al medio de 5 cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y sencilla a partir del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan pueden obtenerse a partir del periplasma por lisis osmótica. De forma similar a la expresión citoplasmática, en algunos casos las proteínas pueden volverse insolubles y pueden usarse desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la resolubilización y replegado. La temperatura de inducción y el crecimiento pueden influir también en los niveles de expresión y solubilidad. Típicamente, se usan temperaturas de

10 entre 25 y 37 ºC. Pueden usarse también mutaciones para aumentar la solubilidad de las proteínas expresadas. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas.

b. Células de levadura

15 Pueden usarse sistemas de levadura tales como, pero sin limitación, aquellos del género Saccharomyces (p.ej. Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis,y Pichia pastoris para expresar los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. Pueden usarse también los sistemas de expresión de levadura para producir terpenos, p.ej. valenceno, cuyas reacciones se catalizan por las sintasas (p.ej. valenceno sintasas). La levadura puede transformarse con vectores de replicación

20 episómicos o por integración cromosómica estable por recombinación homóloga. En algunos ejemplos, se usan promotores inducibles para regular la expresión génica. Las secuencias promotoras ejemplares para expresión de polipéptidos de valenceno sintasa en levadura incluyen, entre otras, promotores de metalotionina, 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman y col. (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col. (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 y Holland y col. (1978) Biochem. 17: 4900) tales como enolasa, gliceraldehído fosfato

25 deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa.

Se describen adicionalmente otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura en Hitzeman, EPA-73.657 o en Fleer y col. (1991) Gene, 107: 285-195 y van den Berg y col. (1990) Bio/Technology, 8:

30 135-139. Otra alternativa incluye, pero sin limitación, el promotor ADH2 reprimible por glucosa descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) y Beier y col. (Nature 300: 724, 1982) o un promotor ADH1 modificado. Los vectores lanzadera replicables en levadura y E. coli pueden construirse, por ejemplo, insertando secuencias de ADN de pBR322 para selección y replicación en E. coli (gen y origen de replicación Ampr) en los vectores de levadura anteriormente descritos.

35 Los vectores de expresión de levadura pueden incluir un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Los vectores ejemplares incluyen pALX31-108.2, descrito en otro lugar de la presente memoria, que contiene un marcador URA3. Las proteínas expresadas en levadura son a menudo solubles y la coexpresión con chaperoninas, tales como Bip y proteína disulfuro isomerasa,

40 puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Adicionalmente, las proteínas expresadas en levadura pueden dirigirse para secreción usando fusiones de péptido señal de secreción tales como la señal de secreción de factor alfa de tipo apareamiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de superficie de célula de levadura tales como el receptor de adhesión por apareamiento Aga2p de glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Puede genomanipularse un sitio de escisión de proteasa (p.ej., la proteasa Kex-2) para retirar las

45 secuencias fusionadas de los polipéptidos a medida que salen de la ruta de secreción.

La levadura expresa naturalmente las proteínas requeridas, incluyendo FPP sintasa (gen ERG20 que puede producir FPP) para la ruta biosintética de isoprenoide dependiente de mevalonato. Por tanto, la expresión de terpeno sintasas, incluyendo polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria, en células de 50 levadura puede dar como resultado la producción de sesquiterpenos tales como valenceno a partir de FPP. Las células de levadura ejemplares para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa incluyen levadura modificada para expresar niveles aumentados de FPP. Por ejemplo, las células de levadura pueden modificarse para producir menos escualeno sintasa o escualeno sintasa menos activa (p.ej.mutantes erg9; véanse p.ej. las patentes de EE.UU. nº 6.531.303 y 6.689.593 y las publicaciones de patente de EE.UU . nº. 2010-0151519 y 2010-0151555).

55 Esto da como resultado la acumulación de FPP en la célula hospedadora a mayores niveles en comparación con las células de levadura de tipo silvestre, lo que a su vez puede dar como resultado rendimientos aumentados de sesquiterpenos (p.ej. valenceno).

En otro ejemplo, las células de levadura pueden modificarse para producir más FPP sintasa mediante la introducción

60 de un gen de FPP sintasa, tal como FPPS de A. annua (véase, p.ej. Brodelius y col. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 3570-3579), FPP de N. crassa y FPS1 y FPS2 de A. thaliana. En algunos ejemplos, puede eliminarse el gen de FPP

nativo en tal levadura. Otras modificaciones que posibilitan una producción aumentada de FPP en levadura incluyen, por ejemplo pero sin limitación, modificaciones que aumentan la producción de acetil CoA, inactivan genes que codifican enzimas que usan FPP y GPP como sustrato y sobreexpresan HMG-CoA reductasas, como se describe en la patente de EE.UU. nº 7.842.497. Las células de levadura modificadas ejemplares incluyen, pero sin limitación, las

5 cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas CALI5-1 (ura3, leu2, his3, trp1, Δerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue), ALX7-95 (ura3, his3, trp1, Δerg9::HIS3, HMG2catITRP1::rDNA, dpp1 sue), ALX11-30 (ura3, trp1, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue), que son conocidas y se describen en una o más de las patentes de EE.UU. nº 6.531.303, 6.689.593, 7.838.279, 7.842.497 y solicitudes de patente de EE.UU. publicadas nº 2004-0249219 y 2011-0189717.

c. Plantas y células vegetales

Pueden usarse células vegetales transgénicas y plantas para la expresión de polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. Los constructos de expresión se transfieren típicamente a plantas usando 15 transferencia de ADN directa tal como bombardeo de microproyectiles y transferencia mediada por PEG a protoplastos, y con transformación mediada por Agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación transcripcional y elementos de control traduccional. Los vectores de expresión y técnicas de transformación se dividen habitualmente entre hospedadores dicotiledóneos tales como Arabidopsis y tabaco y hospedadores monocotiledóneos, tales como maíz y arroz. Los ejemplos de 20 promotores vegetales usados para expresión incluyen el promotor de virus del mosaico de la coliflor, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de bisfofato de ribosa carboxilasa y los promotores ubiquitina y UBQ3. Los marcadores seleccionables, tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa se usan a menudo para facilitar la selección y mantenimiento de células transformadas. Las células vegetales transformadas pueden mantenerse en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse hasta plantas enteras. Las plantas 25 transgénicas pueden incluir también algas genomanipuladas para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield y col. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100: 438-442). Las plantas transformadas incluyen, por ejemplo, plantas seleccionadas de entre los géneros Nicotiana, Solanum, Sorghum, Arabidopsis, Medicago (alfalfa), Gossypium (algodón) y Brassica (colza). En algunos ejemplos, la planta pertenece a la especie Nicotiana tabacum, y se transforma con vectores que sobreexpresan valenceno sintasa y difosfato de farnesilo sintasa, tal como se describe

30 en la publicación de patente de EE.UU . nº 2009-0123984 y la patente de EE.UU. nº 7.906.710.

d. Insectos y células de insecto

Los insectos y células de insecto, particularmente un sistema de expresión de baculovirus, pueden usarse para

35 expresar polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria (véase, por ejemplo, Muneta y col. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2): 219-223). Las células de insecto y larvas de insecto, incluyendo la expresión en hemolinfa, expresan altos niveles de proteína y son capaces de la mayoría de las modificaciones postraduccionales usadas por eucariotas superiores. Los baculovirus tienen un intervalo hospedador restringido, lo que mejora la seguridad y reduce los problemas regulatorios de la expresión eucariótica. Típicamente, los vectores de expresión

40 usan un promotor tal como el promotor de poliedrina de baculovirus para un alto nivel de expresión. Los sistemas de baculovirus usados comúnmente incluyen baculovirus tales como virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), y virus de la poliedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular de insecto tal como Sf9, derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para un alto nivel de expresión, se fusiona la secuencia nucleotídica de la molécula para expresar inmediatamente en dirección 3'

45 del codón de inicio de poliedrina del virus. Las señales de secreción de mamífero se procesan correctamente en células de insecto y pueden usarse para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas de células de mamífero.

50 Es un sistema de expresión alternativo en células de insecto el uso de células transformadas establemente. Pueden usarse para expresión líneas celulares tales como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus) El promotor de metalotioneína de Drosophila puede usarse para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción por metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.

e. Células de mamífero

Pueden usarse sistemas de expresión de mamífero para expresar polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria y pueden usarse también para producir valenceno y otros terpenos cuya formación se 60 cataliza por las valenceno sintasas. Pueden transferirse los constructos de expresión a células de mamífero mediante procedimientos estándares incluyendo, pero sin limitación, infección vírica tal como por adenovirus o por

transferencia de ADN directa tal como por liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen típicamente un sitio de caperuza de ARNm, una secuencia TATA, una secuencia de inicio traduccional (secuencia de consenso Kozak) y elementos de poliadenilación. Tales vectores incluyen a menudo promotores transcripcionales5 potenciadores para un alto nivel de expresión, por ejemplo el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV) o la repetición terminal larga del promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV). Estos promotores-potenciadores están activos en muchos tipos celulares. Pueden usarse también para expresión promotores de tipo tejido y célula y regiones potenciadoras. Las regiones promotoras/potenciadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación, aquella de genes tales como elastasa I, insulina, inmunoglobulina, virus de tumor 10 mamario de ratón, albúmina, alfa-fetoproteína, alfa-1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadena ligera 2 de miosina y control génico de la hormona liberadora de gonadotropina. Pueden usarse marcadores seleccionables para seleccionar y mantener células con el constructo de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforibosil transferasa, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa y timidina cinasa.

15 La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR-ξ y FcεRI-γ pueden dirigir la expresión de las proteínas en estado activo sobre la superficie celular.

Están disponibles muchas líneas celulares para expresión de mamífero, incluyendo células de ratón, rata, ser humano, mono y pollo y hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen, pero sin limitación, BHK (es decir células

20 BHK-21, 293-F, CHO, CHO Express (CHOX; Excellgene), Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretoras) y otras líneas celulares de mieloma, líneas celulares de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 y HKB. Las líneas celulares están también disponibles adaptadas a medios exentos de suero, lo que facilita la purificación de proteínas secretadas de los medios de cultivo celular. Es uno de tales ejemplos la línea celular EBNA-1 exenta de suero (Pham y col. (2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42).

4. Purificación

Los procedimientos de purificación de polipéptidos de valenceno sintasa a partir de células hospedadoras dependen de las células hospedadoras y los sistemas de expresión elegidos. Para moléculas secretadas, las proteínas se 30 purifican generalmente a partir de los medios de cultivo después de retirar las células. Para expresión intracelular, pueden lisarse las células y purificarse las proteínas a partir del extracto. Cuando se usan para expresión organismos transgénicos tales como plantas y animales transgénicos, pueden usarse tejidos u órganos como material de partida para realizar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción animal transgénica puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que pueden recogerse, y si es necesario pueden

35 extraerse las proteínas y purificarse además usando procedimientos estándares en la materia.

Las valenceno sintasas pueden purificarse usando técnicas de purificación de proteína estándares conocidas en la materia incluyendo, pero sin limitación, PAGE-SDS, cromatografía de fraccionamiento por tamaño y exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de quelato y cromatografía de intercambio iónico. Los

40 constructos de expresión pueden genomanipularse también para añadir un marcaje de afinidad tal como un epítopo myc, fusión GST o His6 y purificarse por afinidad con anticuerpo de myc, resina de glutation y resina de Ni, respectivamente, a una proteína. La pureza puede valorarse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia incluyendo electroforesis en gel y tinción y técnicas espectrofotométricas.

45 D. Polipéptidos de valenceno sintasa

Se proporcionan en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa. En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa están codificados por ácidos nucleicos aislados a partir del cardo Eryngium glaciale. En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa son variantes o fragmentos catalíticamente activos de aquellos

50 codificados por ácidos nucleicos aislados del cardo Eryngium glaciale. Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de valenceno a partir de un precursor adecuado, tal como un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, p.ej. pirofosfato de farnesilo (FPP).

Se proporcionan también en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa modificados. Las modificaciones

55 contempladas en la presente memoria incluyen, por ejemplo, reemplazos o sustituciones, adiciones o deleciones, truncamientos aminoacídicos o combinaciones de los mismos. Las modificaciones pueden realizarse en cualquier región de una valenceno sintasa a condición de que el polipéptido de valenceno sintasa modificado codificado resultante retenga al menos actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, típicamente FPP). Los polipéptidos de valenceno

60 sintasa proporcionados en la presente memoria pueden contener otras modificaciones, por ejemplo modificaciones fuera de la secuencia primaria del polipéptido incluyendo, por ejemplo, modificaciones postraduccionales.

Se proporcionan también en la presente memoria fragmentos catalíticamente activos de polipéptidos de valenceno sintasa. Por ejemplo, se proporcionan en la presente memoria fragmentos activos del polipéptido de valenceno sintasa que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1. Los fragmentos activos retienen la 5 capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como pirofosfato de farnesilo (FPP). En ejemplos particulares, los polipéptidos de valenceno sintasa están truncados en el extremo N o C como se describe con más detalle a continuación. En algunos ejemplos, los fragmentos activos de polipéptidos de valenceno sintasa están modificados como se describe en la presente memoria. Tales fragmentos retienen una o más propiedades de un polipéptido de valenceno sintasa de longitud completa. Típicamente, los

10 fragmentos activos exhiben actividad valenceno sintasa (es decir, catalizan la formación de valenceno).

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden generarse mediante cualquier procedimiento conocido por un especialista en la materia. En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se producen sintéticamente, tal como usando síntesis peptídica en

15 fase sólida o fase de solución. Típicamente, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria se expresan en una célula hospedadora a partir de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno sintasa, como se describe en la sección C anterior. Es una célula hospedadora ejemplar para la expresión de un polipéptido de valenceno sintasa una célula de levadura, p.ej., una célula de S. cerevisiae.

20 Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden usarse para catalizar la producción de valenceno. Típicamente, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación de valenceno a partir de FPP. Las reacciones pueden practicarse in vivo, tal como en una célula hospedadora en que se ha introducido un ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno sintasa (como se describe en la Sección C anterior). Al menos uno de los polipéptidos, p.ej. el polipéptido de valenceno

25 sintasa, será heterólogo del hospedador. Las reacciones pueden practicarse también in vitro poniendo en contacto el polipéptido de valenceno sintasa con el sustrato apropiado, p.ej. difosfato de farnesilo, en condiciones apropiadas para la generación de valenceno.

1. Polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

30 Se proporciona en la presente memoria un polipéptido de valenceno sintasa que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1. Se divulgan también en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa que exhiben al menos un 50 % de identidad de secuencia aminoacídica con el polipéptido de valenceno sintasa expuesto en la SEQ ID NO:1. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa divulgados en la presente memoria pueden

35 exhibir al menos o aproximadamente al menos un 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia aminoacídica con el polipéptido de valenceno sintasa expuesto en la SEQ ID NO:1, a condición de que el polipéptido de valenceno sintasa resultante retenga al menos actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, típicamente FPP).

40 Puede determinarse la identidad porcentual por un especialista en la materia usando programas de alineamiento estándares. De acuerdo con la presente invención, el polipéptido de valenceno sintasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido expuesto en la SEQ ID NO:1.

45 2. Modificaciones de polipéptidos de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

Se proporcionan en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa de Eryingium glaciale modificados. Se proporcionan también en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria. Las modificaciones pueden

50 realizarse en cualquier región de una valenceno sintasa a condición de que el polipéptido de valenceno sintasa modificado resultante retenga al menos actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, típicamente FPP).

Las modificaciones pueden ser una modificación aminoacídica única, tal como un reemplazo (sustitución), inserción

55 o deleción único, o modificaciones aminoacídicas múltiples tales como reemplazos, inserciones o deleciones aminoacídicas múltiples. En algunos ejemplos, se intercambian dominios o regiones enteros o parciales, tales como cualquier dominio o región descrito en la presente memoria a continuación, con los dominios o regiones o porciones de los mismos correspondientes de otra terpeno sintasa. Son modificaciones ejemplares reemplazos aminoacídicos, incluyendo reemplazos aminoacídicos únicos o múltiples. Típicamente, la modificación es un reemplazo

60 aminoacídico que puede ser una sustitución conservativa, tal como se expone en la Tabla 2, o una sustitución no conservativa. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente

memoria pueden contener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 o más posiciones modificadas en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa

5 que no contiene la modificación.

Las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en cualquier polipéptido de valenceno sintasa. Típicamente, las modificaciones se realizan en un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria. Por ejemplo, las modificaciones descritas en la presente memoria pueden estar en un polipéptido de

10 valenceno sintasa como se expone en la SEQ ID NO:1 o cualquier variante del mismo, incluyendo cualquiera que tenga al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de valenceno sintasa expuesto en la SEQ ID NO:1.

En particular, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria contienen

15 reemplazos o sustituciones, adiciones o deleciones, truncamientos aminoacídicos o combinaciones de los mismos con referencia al polipéptido de valenceno sintasa expuesto en la SEQ ID NO:1. Está dentro de nivel de un especialista en la materia realizar tales modificaciones en los polipéptidos de valenceno sintasa, tal como cualquiera expuesto en la SEQ ID NO:1 o cualquier variante del mismo. Los procedimientos ejemplares para generar polipéptidos de valenceno sintasa modificados se proporcionan en la Sección C.1.a anterior. Está dentro del nivel de

20 un especialista en la materia generar una valenceno sintasa que contenga una cualquiera o más de las mutaciones descritas, y ensayar en cada una la actividad valenceno sintasa como se describe en la presente memoria.

También, en algunos ejemplos, se proporcionan en la presente memoria fragmentos activos modificados de polipéptidos de valenceno sintasa que contienen cualquiera de las modificaciones proporcionadas en la presente

25 memoria. Tales fragmentos retienen una o más propiedades de una valenceno sintasa. Típicamente, los fragmentos activos modificados exhiben actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, p.ej. FPP).

Las modificaciones en un polipéptido de valenceno sintasa pueden realizarse también en un polipéptido de

30 valenceno sintasa que contiene también otras modificaciones, incluyendo modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones no en la secuencia primaria del polipéptido. Por ejemplo, la modificación descrita en la presente memoria puede ser en un polipéptido de valenceno sintasa que es un polipéptido de fusión o polipéptido quimérico, incluyendo híbridos de diferentes polipéptidos de valenceno sintasa o diferentes polipéptidos de terpeno sintasa (p.ej. que contienen uno o más dominios o regiones de otra terpeno sintasa) y también polipéptidos de valenceno

35 sintasa sintéticos preparados recombinantemente o sintetizados o construidos mediante otros procedimientos conocidos en la materia basándose en la secuencia de polipéptidos conocidos.

Para retener la actividad valenceno sintasa, las modificaciones no se realizan típicamente en aquellas posiciones que sean necesarias para la actividad valenceno sintasa, es decir, en el sitio activo de motivo DDxxD (SEQ ID

40 NO:35) o motivo NSE/DTE (SEQ ID NO:36). Por ejemplo, generalmente no se realizan modificaciones en una posición correspondiente a la posición D315, D316 o D319 o en una posición correspondiente a la posición D461, G465 o E469, con referencia a una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1.

Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden contener una o más sustituciones aminoacídicas, en

45 cualquier combinación, con o sin modificaciones adicionales. Generalmente, pueden combinarse múltiples modificaciones proporcionadas en la presente memoria por un especialista en la materia, siempre que el polipéptido modificado retenga la capacidad de catalizar la formación de valenceno y/u otros terpenos a partir de cualquier precursor terpénico de pirofosfato acíclico adecuado incluyendo, pero sin limitación, FPP, GPP y GGPP. Típicamente, los polipéptidos de valenceno modificados catalizan la formación de valenceno a partir de FPP. En

50 algunos ejemplos, el polipéptido de valenceno sintasa modificado resultante exhibe una producción de valenceno similar o aumentada a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa no modificado. En algunos aspectos, el polipéptido de valenceno sintasa modificado exhibe una producción de valenceno disminuida a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa no modificado.

55 Se proporcionan también en la presente memoria moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria. En ejemplos particulares, las moléculas de ácido nucleico pueden estar optimizadas de codón, por ejemplo, para aumentar los niveles de expresión de la secuencia codificada. En un ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de valenceno sintasa modificados proporcionados en la presente memoria están optimizados de codón basándose en el

60 uso de codón en S. cerevisiae.

Los polipéptidos modificados y moléculas de ácido nucleico codificantes proporcionados en la presente memoria pueden producirse por técnicas de ADN recombinante estándares conocidas por el especialista en la materia. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la materia para efectuar la mutación de uno cualquiera o más aminoácidos en una proteína diana. Se proporcionan procedimientos ejemplares en la Sección C anterior. En

5 algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados se producen sintéticamente, tal como usando síntesis peptídica en fase sólida o fase de solución.

a. Polipéptidos truncados

10 Se proporcionan también en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa truncados. Los polipéptidos de valenceno sintasa truncados pueden truncarse en el extremo N o el extremo C, siempre que los polipéptidos de valenceno sintasa truncados retengan la actividad catalítica de una valenceno sintasa. Típicamente, los polipéptidos de valenceno sintasa truncados exhiben actividad valenceno sintasa (es decir, la capacidad de catalizar la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP). En algunos ejemplos, los

15 polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria están truncados en el extremo N. En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria están truncados en el extremo C. En aun otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria están truncados en el extremo N y el extremo C.

20 En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa están truncados en el extremo N, el extremo C o ambos extremos de un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria, tal como el truncamiento de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1. En otros ejemplos, están truncados cualquiera de las valenceno sintasas modificadas proporcionadas en la presente memoria. En algunos ejemplos, los poliéptidos de valenceno sintasa están truncados en su extremo N. Por ejemplo, cualquier polipéptido de valenceno sintasa

25 proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o aproximadamente o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 o más residuos aminoacídicos en el extremo N, a condición de que el polipéptido de valenceno sintasa retenga la actividad valenceno sintasa.

30 En otros ejemplos, cualquier polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria puede estar truncado en o aproximadamente o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 o más residuos aminoacídicos en

35 el extremo C, a condición de que el polipéptido de valenceno sintasa retenga actividad valenceno sintasa.

b. Polipéptidos con actividades o propiedades alteradas

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden exhibir también cambios en

40 actividades y/o propiedades. La valenceno sintasa modificada puede exhibir, por ejemplo, una actividad catalítica aumentada, una unión a sustrato aumentada (p.ej. FPP), una estabilidad aumentada, una expresión aumentada en una célula hospedadora y/o una distribucion de producto alterada (es decir, cantidades relativas y/o tipos de terpenos alterados) en comparación con un polipéptido de valenceno sintasa de tipo silvestre. Tales actividades y propiedades alteradas pueden dar como resultado una producción de valenceno aumentada a partir de pirofosfato

45 de farnesilo. Típicamente, la distribución de producto de terpenos producidos por una valenceno sintasa de tipo silvestre incluye valenceno, así como una serie de otros productos de terpeno (p. ej., subproductos de terpeno o productos derivados de los mismos) incluyendo, por ejemplo, β-selineno, τ-selineno, eremofilona, 7-epi-α-selineno, germacreno A, β-elemeno y aristoloqueno (pico 2 en la Figura 3A).

50 En algunos ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden catalizar la formación terpenos distintos de valenceno a partir de cualquier sustrato adecuado tal como, por ejemplo, FPP, GPP o GGPP. Por ejemplo, las valenceno sintasas modificadas pueden producir uno o más monoterpenos, sesquiterpenos o diterpenos distintos de valenceno. Típicamente, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados producen más valenceno que cualquier otro terpeno. Esto puede dar como resultado una producción aumentada de nootkatona. Las

55 modificaciones que dan como resultado una producción aumentada de valenceno a partir de FPP pueden identificarse usando los ensayos descritos en la presente memoria y bien conocidos en la materia, permitiendo por tanto la identificación de polipéptidos de valenceno sintasa modificados con capacidad mejorada de producir valenceno a partir de FPP.

60 c. Intercambios de dominio

Se proporcionan en la presente memoria polipéptidos de valenceno sintasa modificados que son polipéptidos quiméricos que contienen un intercambio (deleción e inserción) por deleción de residuos aminoacídicos de uno o más dominios o regiones del mismo o porciones del mismo e inserción de una secuencia heteróloga de aminoácidos. En algunos ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia aleatorizada de aminoácidos. En otros 5 ejemplos, la secuencia heteróloga es una secuencia contigua de aminoácidos del dominio o región o porción del mismo correspondiente de otro polipéptido de terpeno sintasa. La secuencia heteróloga que se reemplaza o inserta incluye generalmente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más aminoácidos. En ejemplos en que la secuencia heteróloga es de un dominio correspondiente o porción del mismo de otra terpeno sintasa, la secuencia heteróloga

10 incluye generalmente al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o más aminoácidos contiguos del dominio o región o porción correspondiente. En tal ejemplo, los residuos adyacentes al dominio o región o porción del mismo correspondiente heterólogo pueden incluirse también en un polipéptido de valenceno sintasa modificado proporcionado en la presente memoria.

15 En un ejemplo de mutantes de intercambio proporcionados en la presente memoria, se reemplaza al menos un dominio o región o porción del mismo de un polipéptido de valenceno sintasa por una secuencia contigua de aminoácidos del dominio o región o porciones del mismo correspondiente de otro polipéptido de terpeno sintasa. En algunos ejemplos, se reemplazan 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dominios o regiones o porciones de los mismos por una secuencia contigua de aminoácidos del dominio o región o porciones del mismo correspondiente de otro

20 polipéptido de terpeno sintasa.

Puede reemplazarse cualquier dominio o región o porción del mismo de un polipéptido de valenceno sintasa por una secuencia heteróloga de aminoácidos, tal como una secuencia heteróloga del dominio o región correspondiente de otro terpeno. Un dominio o región puede ser un dominio estructural o un dominio funcional. Un especialista en la

25 materia está familiarizado con los dominios o regiones de las terpeno sintasas. Los dominios funcionales incluyen, por ejemplo, el dominio N-funcional y el dominio catalítico C-terminal o una porción del mismo. Un dominio estructural puede incluir todo o una porción de un bucle, bucle desestructurado o dominio de hélice alfa.

Un especialista en la materia está familiarizado con las diversas terpeno sintasas y puede identificar los dominios o

30 regiones correspondientes o porciones de aminoácidos del mismo. Por ejemplo, se describen dominios y regiones ejemplares de valenceno sintasa cítrica en la solicitud de patente de EE.UU . nº 2012-0246767. Las terpeno sintasas ejemplares incluyen, por ejemplo, sesquiterpeno sintasas. En ejemplos particulares de la presente memoria, los mutantes de intercambio de dominio polipeptídico de valenceno sintasa modificado proporcionados en la presente memoria contienen secuencias heterólogas de un dominio o región correspondiente o porción del mismo de un

35 polipéptido de terpeno sintasa que es una valenceno sintasa de Citrus sp. (SEQ ID NO: 14-15, 26-27, 34 o 37), valenceno sintasa de V. vinifera (SEQ ID NO:16 o 28), valenceno sintasa de P. frutescens (SEQ ID NO:38) o valenceno sintasa de C. nootkatensis (SEQ ID NO: 17 o 29).

Típicamente, la valenceno sintasa modificada resultante exhibe actividad valenceno sintasa y la capacidad de

40 producir valenceno a partir de FPP. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados exhiben de 50 % a 5000 %, tal como de 50 % a 120 %, de 100 % a 500 % o de 110 % a 250 % de producción de valenceno a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación (p.ej., el reemplazo aminoacídico o intercambio de residuos aminoacídicos de un dominio o región) y/o en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa de tipo silvestre expuesto en la SEQ ID NO:1. Típicamente, los polipéptidos de

45 valenceno sintasa exhiben una producción de valenceno aumentada a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación, tal como en comparación con la valenceno sintasa de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO:1.

Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden producir valenceno a partir de FPP en una

50 cantidad que es al menos o aproximadamente un 101 %, 102 %, 103 %, 104 %, 105 %, 106 %, 107 %, 108 %, 109 %, 110 %, 115 %, 120 %, 125 %, 130 %, 135 %, 140 %, 145 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 500 %, 1500 %, 2000 %, 3000 %, 4000 % o 5000 % de la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por valenceno sintasa de tipo silvestre que no contiene la modificación en las mismas condiciones. Por ejemplo, la producción de valenceno aumenta al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6

55 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más.

En otros ejemplos, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados exhiben una producción de valenceno disminuida a partir de FPP en comparación con el polipéptido de valenceno sintasa que no contiene la modificación, 60 tal como en comparación con la valenceno sintasa de tipo silvestre expuesta en la SEQ ID NO:1. Por ejemplo, los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden producir valenceno a partir de FPP en una cantidad que es

como máximo o de aproximadamente un 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94, %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o menos de la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por valenceno sintasa de tipo silvestre que no contiene la modificación en las mismas condiciones. Por ejemplo, la producción de valenceno sintasa disminuye de tal modo que la producción

5 de FPP por una valenceno sintasa de tipo silvestre que no contiene la modificación en las mismas condiciones es de al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces 14 veces 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces o más mayor que la cantidad de valenceno producida a partir de FPP por el polipéptido de valenceno sintasa modificado.

10 Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la materia para generar polipéptidos quiméricos para reemplazar todo o una porción contigua de un dominio de una primera terpeno sintasa por todo o una porción contigua del dominio correspondiente de una segunda sintasa (véanse las patentes de EE.UU. nº 5.824.774, 6.072.045,

7.186.891 y 8.106.260 y la publicación de patente de EE.UU . nº 2011-0081703). También pueden emplearse

procedimientos de barajado génico para generar polipéptidos quiméricos y/o polipéptidos con intercambios de 15 dominio o región.

Por ejemplo, pueden intercambiarse los dominios o regiones correspondientes de dos terpeno sintasas cualesquiera usando cualquier procedimiento recombinante adecuado conocido en la materia, o por síntesis in vitro. Es un ejemplo de un procedimiento recombinante un procedimiento de PCR de superposición de dos etapas tal como se 20 describe en la presente memoria. En tales procedimientos, pueden emplearse cebadores que introducen mutaciones en una pluralidad de posiciones de codón en los ácidos nucleicos que codifican el dominio diana o porción del mismo en la primera terpeno sintasa, donde las mutaciones forman conjuntamente la región heteróloga (es decir, la región correspondiente de la segunda terpeno sintasa). Como alternativa, por ejemplo, pueden usarse aminoácidos aleatorizados para reemplazar dominios o regiones específicos. Se entiende que los errores de cebador, errores de

25 PCR y/u otros errores en los procedimientos de clonación o recombinantes pueden dar como resultado errores tales que la región o dominio intercambiado o reemplazado resultante no exhiba una secuencia aminoacídica que sea idéntica a la región correspondiente de la segunda terpeno sintasa.

En un procedimiento basado en PCR ejemplar, la PCR de primera etapa usa (i) un cebador en dirección 3' que se

30 reasocia en dirección 3' de la región que se está reemplazando con un cebador mutagénico que incluye aproximadamente 15 nucleótidos (o un número efectivo para efectuar la reasociación, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga en cada lado del dominio o región para intercambiar o aleatorizar flanqueante de la región para impportar al gen diana y (ii) un cebador en dirección 5' que se reasocia en dirección 5' de la región que se está reemplazando junto con un cebador mutagénico de la hebra

35 contraria que incluye también aproximadamente 15 nucleótidos (o un número efectivo para efectuar la reasociación, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 25 nucleótidos o más) de secuencia homóloga en cada lado del dominio o región para intercambiar o aleatorizar flanqueante de la región para importar al gen diana. Si se practica un reemplazo en que se reemplaza un dominio o región de un primer gen de terpeno sintasa por el dominio

o región correspondiente de una segunda terpeno sintasa, los nucleótidos de los cebadores mutagénicos entre las

40 regiones flanqueantes de la primera terpeno sintasa contienen codones de la región correspondiente de la segunda terpeno sintasa. En aspectos donde los aminoácidos en un dominio o región se vayan a aleatorizar, los nucleótidos de los cebadores mutagénicos entre las regiones flanqueantes de la primera terpeno sintasa contienen nucleótidos aleatorios. Se practica entonces una PCR de superposición para unir los dos fragmentos, usando los oligos en dirección 5' y dirección 3'. El producto de PCR resultante puede clonarse entonces en cualquier vector adecuado

45 para la expresión de la terpeno sintasa modificada.

Además, cualquiera de los polipéptidos de valenceno sintasa modificados que contienen mutaciones de intercambio en la presente memoria puede contener uno o más reemplazos aminoacídicos adicionales.

50 d. Variantes adicionales

Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria pueden modificarse mediante cualquier procedimiento conocido por un especialista en la materia para generar variantes proteicas incluyendo, pero sin limitación, barajado de ADN o génico, PCR propensa a errores, PCR de superposición u otros procedimientos 55 recombinantes. En un ejemplo, pueden modificarse por barajado génico moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier polipéptido de valenceno sintasa o polipéptido de valenceno sintasa variante proporcionado en la presente memoria. El barajado génico implica uno o más ciclos de fragmentación aleatoria y reconstrucción de al menos dos secuencias nucleotídicas, seguido de cribado para seleccionar las secuencias nucleotídicas que codifican polipéptidos con las propiedades deseadas. La recombinación puede practicarse in vitro (véanse Stemmer y col. 60 (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747-10751; Stemmer y col. (1994) Nature 370: 389-391; Cramieri y col. (1998) Nature 391: 288-291; patentes de EE.UU. nº 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458) o in

vivo(véase la publicación de patente internacional . nº WO199707205). Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos pueden introducirse entonces en una célula hospedadora para expresar heterólogamente y ensayarse su actividad valenceno sintasa mediante cualquier procedimiento descrito en la sección E siguiente.

5 e. Proteínas de fusión

Los polipéptidos de valenceno sintasa pueden utilizarse también o expresarse como fusiones proteicas. Por ejemplo, puede generarse una fusión para añadir una funcionalidad adicional a un polipéptido. Los ejemplos de proteínas de fusión incluyen, pero sin limitación, fusiones de una secuencia señal, un marcaje tal como para localización, p.ej. un

10 marcaje his6 o un marcaje myc, o un marcaje para purificación, por ejemplo una fusión de GST, fusión de GFP o fusión de CBP, y una secuencia para dirigir la secreción de proteína y/o la asociación a membrana. En otros ejemplos, puede fusionarse una sesquiterpeno sintasa, tal como un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria, con una FPP sintasa (véase, p.ej., Brodelius y col. (2002) Eur. J. Biochem. 269: 35703579).

15 Se proporcionan también proteínas de fusión que contienen un polipéptido de valenceno sintasa y uno o más de otros polipéptidos. La conexión de un polipéptido de valenceno sintasa con otro polipéptido puede efectuarse directa

o indirectamente a través de un conector. En un ejemplo, la conexión puede ser por conexión química, tal como a través de agentes heterobifuncionales o conexiones de tiol u otras de tales conexiones. La fusión puede efectuarse

20 también por medios recombinantes. La fusión de una terpeno sintasa, tal como un polipéptido de valenceno sintasa, con otro polipéptido puede ser con el extremo N o C del polipéptido de valenceno sintasa.

Puede producirse una proteína de fusión mediante técnicas recombinantes estándares. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias polipeptídicas pueden ligarse conjuntamente en fase de acuerdo con 25 técnicas convencionales, p.ej. empleando extremos romos o escalonados para ligamiento, digestión con enzima de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables y ligamiento enzimático. En otra realización, puede sintetizarse el gen de fusión mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Como alternativa, puede llevarse a cabo la amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de 30 anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden reasociarse y reamplificarse posteriormente, generando una secuencia génica quimérica (véase, p.ej., Ausubel y col (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992). Además, están comercialmente disponibles muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (p.ej., un polipéptido de GST). Por ejemplo, puede clonarse un ácido nucleico que codifica un polipéptido de valenceno sintasa en un vector de expresión tal que el

35 resto de fusión esté conectado en fase con la proteína valenceno sintasa. La valenceno sintasa y el resto de fusión pueden estar conectados directamente, sin un conector, o como alternativa conectados indirectamente en fase con un conector.

E. PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR TERPENOS Y PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR TALES 40 PRODUCTOS Y LA ACTIVIDAD DE POLIPÉPTIDOS DE VALENCENO SINTASA

Las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria pueden usarse para, y valorarse por, su capacidad de producir terpenos tales como monoterpenos, sesquiterpenos y diterpenos, a partir de cualquier precursor terpénico de pirofosfato acíclico adecuado incluyendo, pero sin limitación, difosfato de geranilo (GPP), difosfato de

45 farnesilo (FPP) o difosfato de geranilgeranilo (GGPP). Típicamente, los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan la formación del sesquiterpeno valenceno a partir de FPP. Los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria catalizan también la formación de un compuesto adicional, aristoloqueno (designado pico 2; véase la Figura 3A) a partir de FPP.

50 Puede usarse cualquier procedimiento conocido por un especialista en la materia para producir terpenos, incluyendo valenceno, con las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria. Puede valorarse la capacidad de las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria de catalizar la formación de valenceno u otros terpenos a partir de FPP usando estos procedimientos. En algunos ejemplos, se compara la cantidad de terpeno, tal como valenceno, producida a partir de FPP usando las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria con la

55 cantidad de terpeno, tal como valenceno, producida a partir del mismo sustrato usando una valenceno sintasa diferente, tal como una valenceno sintasa de una especie diferente, por ejemplo una valenceno sintasa cítrica, o cualquier otra valenceno sintasa conocida por un especialista en la materia.

Pueden valorarse también otras actividades y propiedades de las valenceno sintasas, tales como los polipéptidos de

60 valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria, usando procedimientos y ensayos bien conocidos en la materia. Además de valorar la actividad de las valenceno sintasas y su capacidad de catalizar la formación de

terpenos, puede valorarse la cinética de la reacción, regioquímica o estereoquímica modificada, utilización de sustrato alterada y/o distribución de producto alterada (es decir, cantidad alterada de los diferentes terpenos producidos a partir de FPP u otro sustrato) en comparación con las valenceno sintasas usando procedimientos bien conocidos en la materia. Por ejemplo, puede valorarse el tipo y la cantidad de los diversos terpenos producidos a

5 partir de FPP, GPP o GGPP por los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria por procedimientos de cromatografía de gases (p.ej., GC-MS), tales como aquellos descritos a continuación y en el Ejemplo 4. En algunos ejemplos, el perfil de los terpenos producidos por los polipéptidos de valenceno sintasa a partir de FPP incluye, pero sin limitación, valenceno, β-elemeno y aristoloqueno (pico 2). Se producen también por las células hospedadoras los alcoholes terpénicos acíclicos nerolidol y farnesol.

10 Se proporcionan a continuación procedimientos para la producción de terpenos, incluyendo valenceno y nootkatona, a partir de FPP usando las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria.

1. Producción de terpenos catalizada por valenceno sintasa de Eryngium glaciale

15 Los polipéptidos de valenceno sintasa modificados pueden usarse para catalizar la formación de valenceno y otros terpenos a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico, tal como FPP. En algunos ejemplos, las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria se expresan en células que producen o sobreproducen FPP, de tal modo que se produce valenceno mediante la ruta descrita anteriormente. En otros ejemplos, las valenceno sintasas

20 proporcionadas en la presente memoria se expresan y purifican a partir de cualquier célula hospedadora adecuada, tal como se describe en la Sección C. Se combinan entonces las sintasas purificadas in vitro con FPP para producir valenceno.

En algunos ejemplos, la valenceno sintasa proporcionada en la presente memoria se sobreexpresa y purifica como

25 se describe en la Sección C anterior. Se incuba entonces la valenceno sintasa con el sustrato difosfato de farnesilo y se produce valenceno. El pH de la solución que contiene FPP y valenceno sintasa puede afectar a la cantidad de valenceno producida (véase, p.ej.la publicación de patente de EE.UU . nº 2010-0216186). Se añade un disolvente orgánico para repartir el valenceno en la fase orgánica para análisis. Se determinan entonces la producción de valenceno y la cuantificación de la cantidad de producto usando cualquier procedimiento proporcionado en la

30 presente memoria, tal como cromatografía de gases (p.ej. GC-MS) usando un patrón interno. Como alternativa, se expresa la valenceno sintasa en células hospedadoras que producen también FPP, dando como resultado la producción de valenceno. El valenceno puede entonces extraerse del medio de cultivo celular con un disolvente orgánico y aislarse y purificarse posteriormente mediante cualquier procedimiento conocido, tal como cromatografía en columna o HPLC, y valorarse la cantidad y la pureza del valenceno recuperado. En algunos ejemplos, se

35 convierte el valenceno por oxidación en nootkatona antes o después de la purificación.

a. Células ejemplares

El valenceno puede producirse expresando un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente

40 memoria en una línea celular que produce FPP como parte de la ruta biosintética de isoprenoide dependiente de mevalonato (p.ej. hongos, incluyendo células de levadura y células animales) o la ruta biosintética de isoprenoide independiente de mevalonato (p.ej. bacterias y plantas superiores). En ejemplos particulares, se produce valenceno expresando un polipéptido de valenceno sintasa proporcionado en la presente memoria en una línea celular que se ha modificado para sobreproducir FPP. Son ejemplos de tales células las células de levadura modificadas. Por

45 ejemplo, las células de levadura que se han modificado para producir menos escualeno sintasa o escualeno sintasa menos activa (p.ej.mutantes erg9; véanse p.ej. las patentes de EE.UU. nº 6,531,303 y 6.689.593 y las publicaciones de patente de EE.UU . nº 2010-0151519 y 2010-0151555) son útiles en los procedimientos proporcionados en la presente memoria para producir valenceno. Una actividad escualeno sintasa reducida da como resultado la acumulación de FPP en la célula hospedadora a mayores niveles en comparación con células de levadura de tipo

50 silvestre, lo que a su vez puede dar como resultado rendimientos aumentados de la producción de valenceno. Las células de levadura modificadas ejemplares incluyen, pero sin limitación, las cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas CALI5-1 (ura3, leu2, his3, trp1, Δerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1), ALX7-95 (ursa3, his3, trpl, Δerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dppl, sue), ALX11-30 (ura3, trp1, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue) y aquellas descritas en las patentes de EE.UU. nº 6.531.303 y 6.689.593y las publicaciones de patente de EE.UU.

55 publicadas nº 2004-0249219, 2010-0151519 y 2010-0151555.

La cepa de Saccharomyces cerevisiae CALI5-1 es un derivado de SW23B#74 (descrita en las patentes de EE.UU. nº 6.531.303 y 6.689.593 y Takahashi y col. (2007) (Biotechnol Bioeng. 97(1): 170-181), que derivaba de la cepa de tipo silvestre ATCC 28383 (MATa). Se generó CALI5-1 que tiene una actividad DPP1 fosfatasa disminuida (véase 60 p.ej. la solicitud publicada de EE.UU. nº 2004-0249219). La cepa de Saccharomyces cerevisiae CALI5-1 contiene, entre otras mutaciones, una mutación erg9 (el alelo Δerg9::HIS3) así como una mutación que apoya la potenciación

de la captación aeróbica de esterol (sue). Contiene también aproximadamente 8 copias del gen HMG2 truncado. La forma activada de HMG2 se activa por el promotor GPD y por lo tanto ya no está bajo una estrecha regulación, permitiendo un aumento del flujo de carbono hasta FPP. Contiene también una deleción en el gen que codifica la enzima pirofosfato de diacilglicerol (DGPP) fosfatasa (dppl), que limita la desfororilación de FPP.

5 ALX7-95 y ALX11-30.1 son derivados de CALI5-1. ALX7-95 derivaba de CALI5-1 por corrección de la deficiencia Δleu2 de CALI5-1 con un gen LEU2 funcional, de modo que no se requiere suplementar leucina a los medios (véase p.ej. el documento US2010/0151519). Se construyó ALX11-30 a partir de CAL5-1 en varias etapas, descritas en el Ejemplo 4 siguiente.

b. Cultivo de células

En procedimientos ejemplares, se expresa una valenceno sintasa proporcionada en la presente memoria en una línea de células hospedadoras que se ha modificado para sobreproducir difosfato de farnesilo, con lo que, tras la 15 expresión de la valenceno sintasa, se convierte difosfato de farnesilo en valenceno. Se cultiva la célula hospedadora usando cualquier procedimiento adecuado bien conocido en la materia. En algunos ejemplos, tales como para cribado de alto rendimiento de células que expresan diversas valenceno sintasas, se cultivan las células que expresan las valenceno sintasas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos (véase, p.ej. el Ejemplo 4 siguiente). En otros ejemplos en que la célula hospedadora es levadura, se cultiva la célula que expresa los

20 polipéptidos de valenceno sintasa y FPP usando procedimientos de fermentación tales como los descritos en los Ejemplos siguientes (véase, p.ej., el Ejemplo 5).

Pueden utilizarse una variedad de metodologías de fermentación para la producción de valenceno a partir de células de levadura que expresan los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria. Por 25 ejemplo, puede efectuarse la producción a gran escala por fermentación por lotes o continua. Es una fermentación por lotes clásica un sistema cerrado donde se fija la composición del medio al inicio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por tanto, al inicio de la fermentación, se inocula el medio con el microorganismo o microorganismos deseados y se permite que ocurra la fermentación sin adición posterior de nutrientes. Típicamente, la concentración de la fuente de carbono en una fermentación por lotes está limitada y se

30 controlan factores tales como pH y concentración de oxígeno. En sistemas por lotes, las composiciones de metabolito y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se detiene la fermentación. En los cultivos por lotes, las células se modulan típicamente mediante una fase de latencia estática hasta una fase de alto crecimiento logarítmico y finalmente una fase estacionaria donde la tasa de crecimiento disminuye o se detiene. Si no se tratan, las células en la fase estacionaria eventualmente morirán.

35 Es una variación del sistema por lotes estándar el sistema por lotes alimentado, que es similar a un sistema por lotes estándar con la excepción de que se añaden nutrientes a medida que progresa la fermentación. Los sistemas por lotes alimentados son útiles cuando la represión del catabolito tiende a inhibir el metabolismo de las células y donde sea deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. También la capacidad de alimentar nutrientes dará

40 a menudo como resultado mayores densidades celulares en los procesos por lotes alimentados en comparación con procesos de fermentación por lotes. Generalmente, se miden y controlan factores tales como pH, oxígeno disuelto, concentraciones de nutriente y la presión parcial de gases de desecho tales como CO2 en las fermentaciones por lotes alimentadas.

45 La producción de valenceno puede lograrse también con fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto donde se añade continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se retira una cantidad igual de medio acondicionado simultáneamente para procesamiento. El sistema mantiene generalmente los cultivos a una densidad alta constante donde las células están principalmente en su fase de crecimiento logarítmico. La fermentación continua permite la modulación de cualquier número de factores que afecten al crecimiento celular o

50 a la concentración de producto final. Por ejemplo, un procedimiento mantendrá un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno a una tasa fija y permitirá moderar todos los demás parámetros. En otros sistemas, pueden alterarse continuamente una serie de factores que afectan al crecimiento mientras que la concentración celular, medida por la turbidez del medio, permanece constante. Los sistemas continuos aspiran a mantener condiciones de crecimiento en estado estacionario, y por tanto la pérdida celular debida a la retirada de

55 medio debe equilibrarse frente a la tasa de crecimiento celular en la fermentación. Los procedimientos de modulación de nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la tasa de formación de producto, son bien conocidos en la materia. Después del cultivo celular, puede recolectarse entonces el cultivo celular para obtener el valenceno producido.

60 En un procedimiento ejemplar, se hacen crecer las células hospedadoras que expresan los polipéptidos de valenceno sintasa (p.ej. Saccharomyces cerevisiae cepa CALI51, ALX7-95 o ALX11-30) en tanque de fermentación

de 3 l a 28 ºC, pH 4,5, durante aproximadamente 132 horas, manteniendo la glucosa a entre 0 y 1 g/l. Después de la fermentación, se añade sulfato de sodio a una concentración final de 10-15 %. Se añade también aceite de soja y se agita, y se recupera el aceite que contiene el valenceno (y otros terpenos) por centrifugación.

5 c. Aislamiento y valoración de productos

El valenceno producido usando los procedimientos anteriores con los polipéptidos de valenceno sintasa proporcionados en la presente memoria puede aislarse y valorarse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia. En un ejemplo, se extrae el medio de cultivo celular con un disolvente orgánico para repartir el valenceno, y

10 cualquier otro terpeno producido, en la fase orgánica. La producción de valenceno puede valorarse y/o aislarse el valenceno de otros productos usando cualquier procedimiento conocido en la materia tal como, por ejemplo, cromatografía de gases. Por ejemplo, la fase orgánica puede analizarse por cromatografía de gases usando cedreno y hexadecano como patrones internos. Este procedimiento se ejemplifica en los Ejemplos 3 y 4 siguientes.

15 La cantidad de valenceno producida puede determinarse mediante cualquier técnica cromatográfica estándar conocida útil para separar y analizar compuestos orgánicos. Por ejemplo, la producción de valenceno puede ensayarse mediante cualquier técnica cromatográfica conocida útil para la detección y cuantificación de hidrocarburos, tales como valenceno y otros terpenos incluyendo, pero sin limitación, cromatografía de gases acoplada con espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía de gases usando un detector de ionización de llama

20 (GC-FID), GC-MS capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía en columna. Típicamente, se llevan a cabo estas técnicas en presencia de patrones internos conocidos, por ejemplo cedreno o hexadecano, que se usan para cuantificar la cantidad de terpeno producida.

Por ejemplo, los terpenos, incluyendo sesquiterpenos tales como valenceno, pueden identificarse por comparación

25 de los tiempos de retención y los espectros de masas con los de patrones auténticos en cromatografía de gases con detección de espectrometría de masas. Los patrones típicos incluyen, pero sin limitación, cedreno y hexadecano. En otros ejemplos, puede conseguirse la cuantificación por cromatografía de gases con detección por ionización de llama basada en curvas de calibración con cantidades conocidas de patrones auténticos y normalización al área de pico de un patrón interno. Estas técnicas cromatográficas permiten la identificación de cualquier terpeno presente en

30 la fase orgánica incluyendo, por ejemplo, otros terpenos producidos por la valenceno sintasa modificada incluyendo, por ejemplo, β-elemeno y aristoloqueno (pico 2) y otros compuestos producidos por la células, incluyendo nerolidol y farnesol (véase, p.ej. el Ejemplo 4).

En algunos ejemplos, puede determinarse la cinética de la producción de valenceno por ensayos de sintasa en que

35 se utilizan sustratos isoprenoides radiactivos, tales como 3H FPP o 14C FPP, con concentraciones variable de sintasa. Los productos se extraen en una fase orgánica y se mide la radiactividad usando un contador de centello líquido. Se determinan las constantes cinéticas a partir de ajustes directos de la ecuación de Michaelis-Menton a los datos.

40 2. Producción de nootkatona

La nootkatona, que es al aroma dominante de la uva, es un producto oxidado del valenceno. Las valenceno sintasas proporcionadas en la presente memoria catalizan la producción de valenceno, que puede oxidarse entonces hasta nootkatona. El valenceno puede experimentar hidroxilación regioselectiva formando 2-hidroxivalenceno, que se 45 oxida adicionalmente formando nootkatona. La oxidación de valenceno puede llevarse a cabo mediante medios químicos o biosintéticos (véanse, p.ej. la patente de EE.UU. nº 5.847.226, Eur. Pat. nº EP1083233; Girhard y col., (2009) Microb. Cell. Fact. 8: 36; Fraatz y col., (2009) Appl Microbiol Biotechnol. 83(1): 35-41; Furusawa y col. (2005) Chem Pharm. Bull. 53: 1513-1514; Salvador y col., (2002) Green Chemistry, 4, 352-356). La oxidación bioquímica puede efectuarse por una lacasa, hidroxilasa u otra enzima oxidativa. En algunos ejemplos, se convierte valenceno 50 en nootkatona usando trióxido de cromo o un catalizador de cromo (III) inmovilizado en fosfonato de sílice (como se describe, por ejemplo en la publicación de patente de EE.UU . nº 2012-0246767). La formación de nootkatona puede confirmarse y/o cuantificarse mediante cualquiera de las técnicas cromatográficas descritas en la presente memoria.

F. EJEMPLOS

55 Los siguientes ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Los ejemplos que caen fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan solo con fines informativos.

60 Ejemplo 1

Extracción e identificación de valenceno de Eryngium glaciale

Para confirmar que Eryngium glaciale produce valenceno, se ensayó en extractos de hojas de Eryngium glaciale la presencia de valenceno. Se adquirieron las hojas y ramas de Eryngium glaciale en el vivero alpino Wrightman 5 (Ontario, Canadá). Se diseccionaron varias hojas y se sumergieron en acetato de etilo durante varios días. Se analizó posteriormente el aceite vegetal en acetato de etilo por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Se practicó el análisis de GC-MS con el PerkinElmer AutoSystem XL equipado con el espectrómetro de masas TurboMass™. Se muestra el cromatógrafo de gases del extracto de aceite vegetal en la Figura 2A. Se detectó valenceno aproximadamente a los 10,18 minutos (pico 1) y era el pico principal. Se muestra en la Figura 2B

10 el espectro de masas del pico a ls 10,18 minutos (valenceno).

Ejemplo 2

Identificación del ácido nucleico que codifica valenceno sintasa de Eryngium glaciale

15 Se identificó valenceno sintasa de Eryngium glaciale por secuenciación del transcriptoma total de Eryngium glaciale usando pirosecuenciación 454 de alto rendimiento (Roche Diagnostics, Branford, CT) y buscando homología con terpeno sintasas conocidas.

20 Purificación de ARN

Se aisló ARN de un gramo de material vegetal, se ultracongeló en nitrógeno líquido y se molió posteriormente hasta un polvo usando mortero y almirez. Se descongeló la muestra en polvo en 10 ml de reactivo TRIzol® (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) para extraer ARN del tejido, siguiendo las instrucciones del fabricante con modificaciones 25 menores. Se centrifugaron la mezcla de muestra en polvo y TRIzol® a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 ºC para retirar los desechos celulares. Se transfirió el sobrenadante a tubos nuevos, se añadió cloroformo:alcohol isoamílico

(24:1) y se agitó con vórtex la muestra. Después de centrifugación adicional, se añadieron dos volúmenes de isopropanol y se incubó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se precipitó ARN por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4 ºC. Se lavó el ARN precipitado una vez con etanol al 75 % y se resuspendió en

30 20 µl de agua exenta de ARNasa. Se trató además el ARN con ADNasa I (New England Biolabs, Ipswich, MA) para retirar el ADN y se purificó y concentró posteriormente usando el kit de limpieza de ARN Qiagen MinElute (Qiagen, Hilden, Alemania).

Secuenciación del transcriptoma total

35 Se secuenció el transcriptoma total de Eryngium glaciale usando pirosecuenciación 454. Se remitió el ARN total extraído al Centro de Tecnología Genética Avanzada (AGTC) de la Universidad de Kentucky (UK) para análisis de secuenciación de transcriptoma. El conjunto de un total de 5512221 lecturas generó 15717 cóntigos, con un tamaño medio de cóntigo que era de 847 pares de bases. Se buscó en la base de datos resultante con BLAST frente a las

40 secuencias de varias terpeno sintasas conocidas. Estas sintasas incluían: Valenceno sintasa de Perilla frutescens var. frutescens (SEQ ID NO:39; nº de acceso a GenBank AY917195.1); valenceno sintasa de Citrus sinensis (SEQ ID NO:40; nº de acceso a GenBank AF441124.1); vetispiradieno (o premnaspirodieno) de Hyoscyamus muticus (SEQ ID NO:41; nº de acceso a GenBank U20188.1); germacreno D sintasa de Citrus hystrix (ácido nucleico expuesto en la SEQ ID NO:42; nº de acceso a GenBank HQ652871.1; proteína expuesta en la SEQ ID NO:45) y

45 valenceno sintasa de Chamaecyparis nootkatensis (SEQ ID NO:44). La homología entre estas oscilaba de aproximadamente 35 a 50 % de identidad al nivel nucleotídico. Se buscó en la base de datos BLAST generada usando las cinco secuencias. Se identificaron cinco secuencias parciales diferentes que codifican terpeno sintasas candidatas a partir de la base de datos generada para búsquedas BLAST. Después de la amplificación (descrita en el Ejemplo 3 para el gen que codifica la sintasa activa), se produjeron moléculas de ADN que codifican cada uno de

50 los cinco posibles genes. Un gen, descrito en el Ejemplo 3, codificaba una sintasa activa que cataliza la producción de valenceno.

Ejemplo 3

55 Aislamiento de un gen que codifica la valenceno sintasa de Eryngium glaciale

Basándose en la secuencia de cóntigo seleccionada (SEQ ID NO:4), se diseñaron cebadores para la amplificación de los fragmentos de RACE 3' y 5' de tal modo que hubiera aproximadamente una superposición de 150 pb entre los fragmentos de RACE 5' y 3'. Se practicaron las síntesis de ADN complementario (ADNc) y PCR como se describe en 60 los protocolos del kit (kit de amplificación de ADNc por RACE SMARTer™ (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.)) con algunas modificaciones de las condiciones de PCR. Se clonaron los fragmentos de PCR por RACE 5' y 3' en el

vector TOPO-TA (Invitrogen, San Diego) y se secuenció cada producto de amplificación.

Se usaron las siguientes condiciones de PCR para amplificar los fragmentos de RACE 3' y 5': desnaturalización inicial a 94 ºC durante 2 minutos, 10 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, reasociación a 61 ºC durante 45 5 segundos, extensión a 72 ºC durante 1 minuto y 20 segundos, seguido de 25 ciclos a 94 ºC durante 30 segundos, reasociación a 55 ºC durante 40 segundos, extensión a 72 ºC durante 1 minuto y 20 segundos. Los cebadores usados para amplificar el gen que codifica la valenceno sintasa activa se exponen en la Tabla 3 siguiente y se incluyen como cebador directo 63-1-2-Fwd2 (SEQ ID NO:5) y cebador inverso 63-1-2-Rev2 (SEQ ID NO:6). Se usaron los cebadores anidado directo 63-1-2-NestFwd2 (SEQ ID NO:7) y anidado inverso 63-1-2-NestRev2 (SEQ ID

10 NO: 8) para aumentar la especificidad de los productos de amplificación en la PCR.

Tabla 3 Cebadores para RACE-PCR

Cebador: Secuencia SEQ ID NO

63-1-2-Fwd2: GCTAGCTCATGTTGATACATTTTCTGCAGTCG 5

63-1-2-Rev2: GCTGTCAGTAACAACCTCTCGTCTTGAGC 6

63-1-2-NestFwd2: CGGTTAAAATCTAGTTTTGCAAACTCCAAAAGC 7

63-1-2-NestRev2: CCCACGTGAAGTACCCTCTTGAGGACG 8

La secuencia nucleotídica completa del gen, designado EGVS y confirmado posteriormente que codifica una 15 valenceno sintasa (véase el Ejemplo 3 siguiente), se expone en la SEQ ID NO:2 y la secuencia aminoacídica codificada se expone en la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 4

20 Clonación de EGVS en el vector de expresión pAlx31-108.2

Se clonó el gen EGVS completo aislado en el vector de expresión pAlx31-108.2 (SEQ ID NO:32). Se amplificó el gen EGVS usando dos conjuntos de cebadores (véase la Tabla 4 siguiente) para retirar el sitio de restricción KpnI en la posición 964 de la secuencia codificante que incluye el cebador directo 63-52EG2FwdPart1 (SEQ ID NO:9) y el

25 cebador inverso 63-52-EG2RevPart1 (SEQ ID NO:10); el cebador directo 63-52-EG2FwdPart2 (SEQ ID NO:11) y el cebador inverso 63-52-EG2RevPart2 (SEQ ID NO:12).

Tabla 4 Cebadores

Cebador: Secuencia SEQ ID NO

63-52-EG2FwdPart1: 9

63-52-EG2RevPart1: GAAGTTCTTTGAATGTACCATACACATCATACG 10

63-52-EG2FwdPart2: 11

63-52-EG2RevPart2: 12

Se retiró un sitio de restricción KpnI que empieza en la posición 964 de la secuencia codificante, ya que los sitios

30 KpnI y XbaI se usan frecuentemente para clonar genes en el vector de expresión pAlx31-108.2. Se alteró el sitio KpnI sin afectar a la secuencia aminoacídica de EGVS, reemplazando la C en posición 969 del gen EGVS de tipo silvestre por una A, cambiando así el codón ACC (que codifica treonina) por un ACA (que codifica treonina) (secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO:3). Se construyó el vector de expresión de EGVS final, designado pAlx63-71 (SEQ ID NO:33) usando la mezcla maestra Gibson Assembly™ (New England Biolabs) con los

35 productos de PCR amplificados usando los cebadores 63-52-EG2FwdPart1, 63-52-EG2RevPart1, 63-52-EG2FwdPart2 y 63-52-EG2RevPart2 (véase la Tabla 4 anterior).

Ejemplo 5

40 Expresión de EGVS en levadura y cribado de alto rendimiento de células que expresan valenceno

Se transformó el vector de expresión pAlx63-71 que codifica EGVS en las cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas ALX7-95 (ura3, his3, trp1, Δerg9::HIS3, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue) y ALX11-30 (ura3, trp1, erg9def25, HMG2cat/TRPl::rDNA, dpp1, sue) para expresión de valenceno sintasa y producción de valenceno

5 usando un ensayo de cribado de alto rendimiento.

A. Generación de las cepas de Saccharomyces cerevisiae modificadas ALX7-95 y ALX7-95

Como se señala anteriormente, se derivaron ALX7-95 y ALX11-30 de la cepa de Saccharomyces cerevisiae CALI5

10 1, que es una cepa bien conocida y difundida (véase, p.ej., la solicitud de patente de EE.UU. nº 2012-0246767). La cepa CALI5-1 es un derivado de la cepa designada SW23B#74 (descrita, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº

6.531.303 y 6.689.593; véase también Takahashi y col. (2007) Biotechnol Bioeng. 97(1): 170-181), que deriva de la cepa de tipo silvestre MATa, depositada con el número de acceso ATCC 28383. Se generó CALI5-1 que tiene una actividad DPP1 fosfatasa disminuida (véase, p.ej., la publicación de patente de EE.UU . nº 2004-0249219). La cepa 15 CALI5-1 de Saccharomyces cerevisiae contiene, entre otras mutaciones, una mutación erg9 (el alelo Δerg9::HIS3) así como una mutación que apoya la potenciación de la captación aeróbica de esterol (sue). Contiene también aproximadamente 8 copias del gen HMG2 truncado. La forma activada de HMG2 se activa por el promotor GPD y por lo tanto ya no está bajo una estrecha regulación, permitiendo un aumento del flujo de carbono hasta FPP. Contiene también una deleción en el gen que codifica la enzima pirofosfato de diacilglicerol (DGPP) fosfatasa (dpp1),

20 que limita la desfororilación de FPP.

Se generó ALX7-95 a partir de CALI5-1 corrigiendo la deficiencia Δleu2 de CALI5-1 con un gen LEU2 funcional de modo que no se requiera el suplemento de leucina (véase, p.ej. el documento US2010/0151519). Se construyó ALX11-30 a partir de CALI5-1 en varias etapas a partir de una cepa designada ALX7-175.1 que se describe en la

25 publicación de patente de EE.UU . nº 2010-0151519.

Brevemente, se produjo ALX7-175.1 como sigue. Se obtuvo HPS de ALX7-95 transformando un plásmido que contiene la premnaspirodieno sintasa (HPS) de Hyoscyamus muticus en la cepa ALX7-95. Se obtuvo el plásmido YEp-HPS clonando el gen de HPS en Yep-GW-URA, dando YEp-HPS-ura (YEp-HPS). Se practicó entonces una 30 reacción de PCR propensa a errores del gen ERG9 y se transformó el ADN resultante en ALX7-95 que alberga YEpHPS. Se sembraron los transformantes en medio YP que carece de ergosterol y se cribó la producción de premnaspirodieno. Se guardaron aquellos que producían altos niveles de premnaspirodieno. Se transformó una cepa, ALX7-168.25 [ura3, trp1, his3, erg9 def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue, YEpHPS] con un fragmento de PCR del gen HIS3 completo para crear un gen HIS3 funcional. Se aislaron los transformantes que eran capaces de 35 crecer en ausencia de histidina en el medio. A partir de esta transformación, se aisló ALX7-175.1 [ura3, trp1, erg9def25, HMG2cat/TRP1::rDNA, dpp1, sue YEpHPS]. Finalmente, se retiró el plásmido YEpHPS haciendo crecer ALX7-175.1 varias generaciones en YPD (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, glucosa 20 g/l) y sembrando células en placas de YPD. Se identificaron las colonias que eran incapaces de crecer en medio SD sin uracilo (0,67 % de base nitrogenada de levadura Bacto sin aminoácidos, 2 % de glucosa, 0,14 % de medio defectivo sintético de

40 levadura sin uracilo). Se designó esta cepa ALX11-30.

B. Cribado de alto rendimiento para la producción de valenceno

Se analizó en ocho colonias de cada transformación del vector pALx63-71 en ALX7-95 y ALX11-30 la producción de

45 sesquiterpeno en placas de microvaloración de pocillos profundos. Se cribó en los transformantes la producción de valenceno mediante análisis de microcultivo usando placas de 96 pocillos profundos. Se inocularon transformantes individuales en pocillos individuales de placas de microvaloración de 96 pocillos rellenos con 200 µl de medio definido sintético (SD: 0,67 % de base nitrogenada de levadura Bacto sin aminoácidos, 2 % de glucosa y 0,14 % de suplemento de medio defectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano o uracilo) para las cepas

50 ALX11-30 y medios definidos sintéticos con ergosterol (SDE: 0,67 % de base nitrogenada de levadura Bacto sin aminoácidos, 2 % de glucosa, 0,14 % de suplemento de medio defectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano o uracilo y ergosterol 40 mg/l) para las cepas ALX795 deficientes en erg9. Se incubaron las placas durante 2 a 3 días a 28 ºC. Después del crecimiento hasta saturación, se usaron 10 µl del cultivo saturado de cada pocillo para inocular una placa de 96 pocillos profundos que contiene 300 µl de medio adecuado para el crecimiento y la

55 producción de valenceno. Se selló la placa con cinta Airpore (Qiagen) y se incubó con agitación durante 3 días.

Se extrajeron los productos biosintéticos en primer lugar mediante la adición de 250 µl de acetona que contiene cedreno en cada pocillo, sellando con sellador de placa de caucho y agitando con vórtex, seguido de la adición de 500 µl de n-hexano que contiene hexadecano y agitación con vórtex adicional. Después de la separación de fases, 60 se selló la placa con película de aluminio y se colocó en una bandeja de muestras de un automuestreador de cromatografía de gases, que retiraba un microlitro de la fase orgánica por cada pocillo para análisis de

sesquiterpenos. Se adicionaron a cada uno de la acetona y el hexano usados para extracción los patrones internos cedreno y hexadecano, respectivamente, para ayudar a la cuantificación de las muestras. Se analizaron las muestras extraídas por cromatografía de gases y se calculó la cantidad de valenceno a partir del área bajo el pico que representa valenceno.

C. Resultados

La Tabla 5 siguiente proporciona los perfiles de distribución de producto y cantidad de valenceno producidos por valenceno sintasa de Eryngium glaciale, como se determina por cromatografía de gases, para los tres mayores 10 productores de valenceno a partir de ALX7-95 y los cuatro mayor productores de valenceno a partir de ALX11-30, y sus denominaciones de nombre de cepa. Como se indica en la Tabla 5, se observaron diversos compuestos adicionales además de valenceno, incluyendo nerolidol, farnesol y el compuesto aristoloqueno, en el pico 2, que es aristoloqueno. El resultado demuestra que esta valenceno sintasa cataliza la producción de un perfil de producto diferente de la valenceno sintasa cítrica. Cedreno y hexadecano representan patrones internos usados para

15 cuantificar la cantidad de valenceno producida. Se analizaron además las 7 cepas en el ensayo de matraz agitado descrito en el Ejemplo 4.

Tabla 5 Distribución de producto para el ensayo de microcultivo

Cepa de levadura: Área de pico Valenceno mg/ml Nombre de cepa

Cedreno: Aristoloqueno Valenceno Nerolidol Hexadecano Farnesol

7-95: 15794 23576 75056 6718 15085 7475 120,10 Alx-63-70.1

14916: 18809 59731 6057 14930 7057 101,20 Alx-63-70.2

14443: 19245 61326 5368 13706 6378 107,31 Alx-63-70.3

11-30: 14151 26590 80470 15281 143,71 Alx-63-70.4

14491: 33936 107516 16152 187,51 Alx-63-70.5

14428: 33512 105465 15969 184,73 Alx-63-70.6

16093: 19851 60353 17711 94,78 Alx-63-70.7

Ejemplo 6

5 Ensayo de matraz agitado de células que expresan valenceno

Se iniciaron cultivos de semilla en matraces de 250 ml inoculando 15 ml de medio SD o SDE (para cepas ALX11-30 y ALX7-95, respectivamente) con colonias de crecimiento reciente de las 7 cepas mostradas en la Tabla 5 anterior). Se hicieron crecer los cultivos durante 24 horas, y se usaron 2,5 ml de cada cultivo para inocular 50 ml de medio de 10 fermentación (2 % de sulfato de amonio, 2 % de fosfato de potasio, 0,1 % de NaCl, 0,6 % de MgSO4•7H2O, 0,4 % de extracto de levadura, 1 ml de solución mineral [0,028 % de FeSO4•7H2O, 0,029 % de ZnSO4•7H2O, 0.008 % de CuSO4•5H2O, 0.024 % de Na2MoO4•2H2O, 0,024 % de CoCl2•6H2O, 0.017 % de MnSO4•H2O, HCl 1 ml], 0,5 ml de glucosa al 50 %, 1,5 ml de solución de vitamina [0,001 % de biotina, 0,012 % de pantotenato de Ca, 0,06 % de inositol, 0,012 % de HCl de piridoxina, 0,012 % de HCl de tiamina] y 0,5 ml de CaCl2 al 10 %) en un matraz con 15 deflectores de 250 ml. Se hicieron crecer los cultivos a 28 ºC. Después de 16 horas de incubación, se alimentaron a los cultivos 3,6 ml de glucosa al 50 % y 0,667 ml de extracto de levadura al 12,5 %. Se alimentaron los cultivos cada 24 h después de la alimentación inicial. Se ajustó el pH de los cultivos a 4,5 cada 24 horas con la adición de NaOH al 30 %. Después de aproximadamente 88 horas de incubación, se añadieron 0,1 ml de IGEPAL CA-630 y se incubó el cultivo con agitación para dispersar completamente el aceite vegetal. Después de 30 minutos, se tomó una 20 muestra de cultivo de 2 ml para análisis. Se extrajo la muestra con 2 ml de solución de acetona/cedreno y se extrajo entonces con 4 ml de solución de hexano/hexadecano. Se analizó una alícuota de la fase orgánica por cromatografía de gases y se cuantificó la cantidad de valenceno producida calculando el área bajo el pico que representa valenceno. Se compararon los perfiles de distribución de producto y la producción de valenceno para cada una de las 2 cepas que contienen EGVS con una valenceno sintasa cítrica (CVS) de control y una valenceno sintasa V277

25 (descrita en la publicación de EE.UU. en tramitación junto con la presente de nº de serie 2012-0246767) que tiene una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:30 y una secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:31. V277 tiene aproximadamente un 83 % de identidad de secuencia con la CVS de tipo silvestre. Las células que expresan V277 producen más valenceno que las células que expresan CVS de tipo silvestre (secuencia aminoacídica expuesta en la SEQ ID NO:14).

30 La Tabla 6a siguiente proporciona perfiles de distribución de producto que incluyen la cantidad de valenceno producida a partir del ensayo de matraz agitado, como se determina por cromatografía de gases, de CVS 277 en comparación con dos cepas que producen EGVS en la cepa ALX11-30 (como se describe en el Ejemplo 3). Como se muestra en la Tabla 6, las cepas de valenceno sintasa de Eryngium glaciale producían más valenceno por ml en

35 comparación con el mutante CVS V277, que a su vez produce más valenceno que la CVS de tipo silvestre.

Cedreno y hexadecano representan patrones internos usados para cuantificar la cantidad de valenceno producida. La Figura 3A muestra un cromatograma de gases ejemplar de una cepa ALX7-95 ejemplar, Alx-64-703, teniendo el valenceno un tiempo de retención de 12,46 min, y la Figura 3B muestra el espectro de masas del valenceno (pico a

40 12,46 min). La Figura 7 representa los resultados gráficamente.

Tabla 6 Distribución de producto para el ensayo de matraz agitado

Cepa de levadura: Área de pico Valenceno mg/ml Nombre de cepa

Cedreno: Valenceno Hexadecano

ALX11-30: 13743 2565260 15877 356,1 YC33-11

9770: 378154 18747 714,2 Alx-63-70.6

11179: 472779 19251 780,3 Alx-63-70.7

La Figura 7 representa los datos de la Tabla 6b y muestra una comparación entre la producción de valenceno en

células que expresan la valenceno sintasa cítrica con células que expresan la sintasa de Eryngium glaciale. Las 45 células que expresan EG sintasa producen más de dos veces de cantidad de valenceno en comparación con la CVS

sintasa. 40

Ejemplo 7

Aislamiento de valenceno

Se filtraron a vacío los caldos de dos fermentaciones de ALX63-70.7 (2 l cada una) a través de un embudo de filtración grueso. Se transfirió la torta de filtrado (aceite de soja, células y desechos celulares) a un matraz de 4 l y se añadió acetona (2 l cada vez) a la torta de filtración y el filtrado (aceite de soja y células), respectivamente, y se agitaron las soluciones durante 1 h. Se filtraron las mezclas heterogéneas resultantes y se retiró el disolvente a 10 presión reducida. Se sometió entonces el extracto orgánico bruto a cromatografía en gel de sílice usando hexanos como único disolvente. Después de la retirada del disolvente a presión reducida, se disolvió el material oleoso amarillo en acetona y se precipitaron los fosfolípidos a -20 ºC. Se filtraron los fosfolípidos y se retiró la acetona en el filtrado a presión reducida, procurando un aceite transparente (25 g). Se purificó adicionalmente entonces el aceite transparente mediante destilación de película descendente (0,1 torr, 125 ºC), procurando una fracción de valenceno

15 enriquecida (3,13 g). Se purificó entonces el valenceno a partir de la fracción enriquecida por HPLC en fase inversa (C18) usando acetonitrilo isocrático como disolvente y un detector del índice de refracción.

Las resonancias magnéticas (RMN) de protón (1H) y carbono 13 (13C) de la muestra purificada mostraron que la muestra purificada tenía idénticos desplazamientos químicos que un patrón auténtico de valenceno (véanse los

20 datos de RMN siguientes). Además, los experimentos de 1D-NOESY donde se irradió el grupo metilo cuaternario (C11) mostraron correlaciones con la metina en C9 y el grupo metilo en C12, sugiriendo por tanto que lo grupos metilo de C11 y C12 y la metina de C9 estaban todos en la misma cara de la molécula. Se muestra a continuación la estructura del valenceno con la numeración de carbono asignada:

Finalmente, la cromatografía de gases (GC-FID), cromatografía de gases quiral y cromatografía de gasesespectrometría de masas de la muestra purificada mostraron que el presunto pico de valenceno tenía idénticos tiempos de retención y espectros de masas que un patrón auténtico de valenceno. Estos datos demuestran 30 conjuntamente que la estructura del pico aislado es (+)-valenceno. RMN 1H (BENCENO-d6) δ: 5,36 (dt, J= 4,8, 2,6 Hz, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 2,23-2,31 (m, 1H), 2,21 (s, 1H), 2,06 (ddd, J= 13,9, 4,1, 2,6 Hz, 2H), 1,90-1,96 (m, 2H), 1,69 (d, J= 0,9 Hz, 1H), 1,66 (s, 3H), 1,31-1,46 (m, 2H), 1,26 (d, J= 4,4 Hz, 2H), 1,05 (t, J= 12,7 Hz, 1H), 0,91 (s, 3H), 0,83 (d, J= 6,6 Hz, 3H); RMN 13C (BENCENO-d6) δ: 150,8, 143,3, 120,9, 109,3, 45,7, 41,6, 41,7, 38,5, 33,8, 33,5, 27,9, 26,7, 21,3, 18,9, 16,2. GC-MS (EI+, 70 eV); (%): 55(44),

35 67(38), 79(82), 91(80), 93(77), 105(75), 107(73), 119(66), 133(56), 147(33), 161(100), 175(17), 189(34), 204(29).

Ejemplo 8

Comparación de los parámetros cinéticos de valenceno sintasa de E. glaciale (EgVS) y valenceno sintasa 40 V277

En este ejemplo, se evaluó la actividad de valenceno sintasa de E. glaciale (EgVS; SEQ ID NO:1) y de la valenceno sintasa cítrica denominada V277 (SEQ ID NO:31) por análisis cinético del estado estacionario. Para comparar las actividades de estas enzimas in vitro, se marcaron con histidina las valenceno sintasas en el extremo C, se

45 expresaron en E. coli se purificaron por cromatografía de quelato de níquel y se evaluó la actividad por análisis cinético en estado estacionario. Las condiciones de reacción eran las siguientes: EgVS 50 nM o valenceno sintasa V277 250 nM , Bis-Tris-propano 50 mM (pH 7,5), MgCl2 20 mM, KCl 50 mM. T= 30 ºC. Detección: GC/MS-SIM.

Como se muestra en la Figura 6 y la Tabla 7 siguiente, EgVS exhibe una actividad total y específica drásticamente 50 mayor cuando se compara directamente con la valenceno sintasa cítrica designada V277. Además de una actividad aumentada, la EgVS se recambiaba también significativamente más veces que la valenceno sintasa V277.

Tabla 7 Parámetros cinéticos en estado estacionario de CVS y EgVS

Enzima (purificada por marcaje de His): Km, FPP(µM) kcat (min1) Vmáx (µmol (g de proteína)-1 min-1)

Valenceno sintasa V277: 7,8 1,5 23,4

EgVS: 21,4 ± 10,5 25,2 ± 3,8 376 ± 57

La EgVS sintasa proporcionada en la presente memoria, por tanto, no solo produce un perfil de terpeno diferente en comparación con otras sintasas tales como CVS, sino que también exhibe mayor actividad, incluso cuando se 5 compara con una CVS sintasa que se ha modificado y optimizado para exhibir una actividad aumentada.

Puesto que las modificaciones resultarán evidentes para los especialistas en la materia, se pretende que esta invención esté limitada solo por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

10 LISTADO DE SECUENCIAS

lt;110gt; Allylix, Inc. Saran, Dayal Park, Grace Eunyoung

15 lt;120gt; POLIPÉPTIDOS DE VALENCENO SINTASA,MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE LOS CODIFICAN Y USOS DE LOS MISMOS

lt;130gt; 33322-237PC

lt;140gt; Todavía no asignado

lt;141gt; Con la presente 20 lt;150gt; 61/852.462

lt;151gt; 14/03/2013

lt;160gt; 45

lt;170gt; FastSEQ para Windows versión 4.0

lt;210gt; 1 25 lt;211gt; 565

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Eryngium glaciale

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa 30 lt;400gt; 1

lt;210gt; 2

lt;211gt; 1698 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Eryngium glaciale

lt;220gt;

lt;223gt; ADN WT de valenceno sintasa

lt;400gt; 2 10

lt;210gt; 3

lt;211gt; 1698 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Eryngium glaciale

lt;220gt;

lt;223gt; ADN c969a de valenceno sintasa

lt;400gt; 3 10

lt;210gt; 4

lt;211gt; 847 15 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Eryngium glaciale

lt;220gt;

lt;223gt; Secuencia de cóntigo que contiene EGVS parcial

lt;400gt; 4

lt;210gt; 5

lt;211gt; 32 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador de RACE 63-1-2-Fwd2

lt;400gt; 5 10 gctagctcat gttgatacat tttctgcagt cg 32

lt;210gt; 6

lt;211gt; 29

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial 15 lt;220gt;

lt;223gt; Cebador de RACE 63-1-2-Rev2

lt;400gt; 6 gctgtcagta acaacctctc gtcttgagc 29

lt;210gt; 7 20 lt;211gt; 33

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador de RACE 63-1-2-NestFwd2

25 lt;400gt; 7 cggttaaaat ctagttttgc aaactccaaa agc 33

lt;210gt; 8

lt;211gt; 27

lt;212gt; ADN 30 lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador de RACE 63-1-2-NestRev2

lt;400gt; 8

cccacgtgaa gtaccctctt gaggacg 27 35 lt;210gt; 9

lt;211gt; 60

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt; 40 lt;223gt; 63-52-Cebador de ensamblaje de Gibson EG2FwdPart1

lt;400gt; 9 gctgaattcg agctcggtac cattaaaaaa aatgtctctt aatgtactta gtacgtcagg 60

lt;210gt; 10

lt;211gt; 33 45 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador de ensamblaje de Gibson 63-52-EG2RevPart1

lt;400gt; 10

gaagttcttt gaatgtacca tacacatcat acg 33

lt;210gt; 11

lt;211gt; 40

lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Cebador de ensamblaje de Gibson 63-52-EG2FwdPart2

lt;400gt; 11

gatgtgtatg gtacattcaa agaacttcta ctgttcactg 40 10 lt;210gt; 12

lt;211gt; 56

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt; 15 lt;223gt; 63-52-EG2RevPart2

lt;400gt; 12 tacgcgcaca aaagcagaga ttctagatta caaaggaata ggatccacga gcagtg 56

lt;210gt; 13

lt;211gt; 1647 20 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Citrus sinensis

lt;220gt;

lt;223gt; ADN de valenceno sintasa cítrica

lt;300gt; 25 lt;308gt; GenBank GQ988384.1

lt;309gt; 20/10/2009

lt;400gt; 13

lt;210gt; 14

lt;211gt; 548 35 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus sinensis

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa cítrica

lt;400gt; 14

lt;210gt; 15

lt;211gt; 548 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus x paradisi

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa cítrica AAM00426

lt;300gt; 10 lt;308gt; Genbank AAM00426

lt;309gt; 02/04/2002

lt;400gt; 15

lt;210gt; 16

lt;211gt; 556 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Vitis vinifera

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;300gt;

lt;308gt; Uniprot C1JXK7

lt;309gt; 21/09/2011

lt;400gt; 16

lt;210gt; 17

lt;211gt; 573 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Chamaecyparis nootkatensis

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;400gt; 17 10

lt;210gt; 18

lt;211gt; 556 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Eleutherococcus trifoliatus

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína alfa-copaeno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank ADK94034.1

lt;309gt; 01/04/2012

lt;400gt; 18

5 lt;210gt; 19

lt;211gt; 565

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Actinidia deliciosa

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína germacreno D sintasa

lt;300gt;

lt;308gt; GenBank AAX16121.1 5 lt;309gt; 01/11/2005

lt;310gt; US7312323

lt;311gt; 25/12/2007

lt;400gt; 19

lt;210gt; 20

lt;211gt; 557 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Vitis vinifera

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína (-)-germacreno D sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; NCBI XP_003634696.1

lt;309gt; 07/12/2011

lt;400gt; 20

lt;210gt; 21

lt;211gt; 562 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Santalum murrayanum

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína sesquiterpeno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; Uniprot F6M8H7.1

lt;309gt; 03/10/2012

lt;400gt; 21

lt;210gt; 22

lt;211gt; 550 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Ricinus communis

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína (+)-delta-cadineno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank EEF38721.1

lt;309gt; 12/02/2009

lt;400gt; 22

lt;210gt; 23

lt;211gt; 562 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus x paradisi

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína delta-cadineno sintasa

lt;300gt; 10 lt;310gt; US7273735

lt;311gt; 25/09/2007

lt;400gt; 23

lt;210gt; 24

lt;211gt; 548 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Nicotiana tabacum

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína 5-epiaristoloqueno sintasa de tabaco

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank L04680.1

lt;309gt; 27/06/1994

lt;400gt; 24

lt;210gt; 25

lt;211gt; 520 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Hyoscyamus muticus

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína premnaspirodieno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank: AAA86337.1

lt;309gt; 30/01/1996

lt;400gt; 25 lt;210gt; 26

lt;211gt; 548 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus x paradisi

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;300gt; 10 lt;310gt; US7273735

lt;311gt; 25/09/2007

lt;400gt; 26 lt;210gt; 27

lt;211gt; 548 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus x paradisi

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;300gt; 10 lt;310gt; US7442785

lt;311gt; 28/10/2008

lt;400gt; 27

lt;210gt; 28

lt;211gt; 556 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Vitis vinifera

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; Uniprot Q6Q3H2

lt;309gt; 21/09/2011

lt;400gt; 28 lt;210gt; 29

lt;211gt; 589 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Chamaecyparis nootkatensis

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;400gt; 29 10 lt;210gt; 30

lt;211gt; 1674 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; ADN de valenceno sintasa cítrica V277

lt;300gt; 10 lt;310gt; US20120246767

lt;311gt; 27/09/2012

lt;400gt; 30

lt;210gt; 31

lt;211gt; 557

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial 10 lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa cítrica V277

lt;300gt;

lt;310gt; US20120246767

lt;311gt; 27/09/2012 15 lt;400gt; 31

lt;210gt; 32

lt;211gt;: 7927 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; ADN del vector de expresión pALx31-108.2

lt;400gt; 32 71

lt;210gt; 33

lt;211gt;: 7902 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; ADN del constructo de expresión pALX63-71

lt;400gt; 33 10

lt;210gt; 34

lt;211gt; 548 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus sinensis

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa cítrica

lt;300gt; 10 lt;308gt; Genbank AAQ04608

lt;309gt; 12/01/2004

lt;400gt; 34 lt;210gt; 35

lt;211gt; 5 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Motivo de la región 1 rico en aspartato

lt;220gt; 10 lt;221gt; VARIANTE

lt;222gt; 3, 4

lt;223gt; Xaa= cualquier aminoácido

lt;400gt; 35

lt;210gt; 36

lt;211gt; 9

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia artificial 5 lt;220>

lt;223gt; Motivo NSD/DTE

lt;220gt;

lt;221gt; VARIANTE

lt;222gt; 1 10 lt;223gt; Xaa= Asn o Asp

lt;220gt;

lt;221gt; VARIANTE

lt;222gt; 2, 3, 4, 6, 7, 8

lt;223gt; Xaa= cualquier aminoácido 15 lt;220gt;

lt;221gt; VARIANTE

lt;222gt; 5

lt;223gt; Xaa= Ser o Thr

lt;400gt; 36 20

lt;210gt; 37

lt;211gt; 548 25 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus sinensis

lt;220gt;

lt;223gt; Valenceno sintasa A517I, I518V

lt;300gt; 30 lt;308gt; GenBank AAQ04608.1

lt;309gt; 12/01/2004

lt;400gt; 37 lt;210gt; 38

lt;211gt; 550 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Perilla frutescens var. frutescens

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína valenceno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank AAX16077.1

lt;309gt; 01/03/2005

lt;400gt; 38

lt;210gt; 39

lt;211gt; 1653 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Perilla frutescens var. frutescens

lt;220gt;

lt;223gt; ADN de valenceno sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank AY917195.1

lt;309gt; 01/03/2005

lt;400gt; 39

lt;210gt; 40

lt;211gt; 1647

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Citrus sinensis 20 lt;220gt;

lt;223gt; ADN de valenceno sintasa cítrica

lt;300gt;

lt;308gt; GenBank AF441124.1

lt;309gt; 12/01/2004

lt;400gt; 40

5 lt;210gt; 41

lt;211gt; 1750

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Hyoscyamus muticus

lt;220gt; 10 lt;223gt; ADN de premnaspirodieno sintasa

lt;300gt;

lt;308gt; GenBank U20188.1

lt;309gt; 31/01/1996

lt;400gt; 41 15 lt;210gt; 42

lt;211gt; 1839 5 lt;212gt; ADN

lt;213gt; Citrus hystrix

lt;220gt;

lt;223gt; ADN de germacreno D sintasa

lt;300gt;: 10 lt;308gt; GenBank HQ652871.1

lt;309gt; 28/06/2011

lt;400gt; 42

lt;210gt; 43

lt;211gt; 1722

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Chamaecyparis nootkatensis

lt;220gt;

lt;223gt; ADN de valenceno sintasa

lt;300gt;: 5 lt;310gt; WO 2011/074954

lt;311gt; 15/12/2010

lt;400gt; 43

lt;210gt; 44

lt;211gt; 1770

lt;212gt; ADN

lt;213gt; Chamaecyparis nootkatensis 15 lt;220gt;

lt;223gt; ADN de valenceno sintasa

lt;300gt;

lt;310gt; WO 2011/074954

lt;311gt; 15/12/2010 20 lt;400gt; 44

lt;210gt; 45

lt;211gt; 541 5 lt;212gt; PRT

lt;213gt; Citrus hystrix

lt;220gt;

lt;223gt; Proteína germacreno D sintasa

lt;300gt; 10 lt;308gt; GenBank ADX01384.1

lt;309gt; 28/06/2011

lt;400gt; 45

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipéptido de valenceno sintasa de Eryngium aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento catalíticamente activo de la misma, donde: el polipéptido de sintasa cataliza la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; y

las células que expresan el polipéptido de valenceno sintasa de SEQ ID NO:1 catalizan mayores cantidades de valenceno en comparación con células que expresan la valenceno sintasa cítrica (Citrus sinensis) (CVS) cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO:14.
2.

El polipéptido de valenceno sintasa aislado de la reivindicación 1, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento catalíticamente activo de la misma.
3.

El polipéptido de valenceno sintasa aislado de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el precursor terpénico de pirofosfato acíclico es difosfato de farnesilo.
4.

Un polipéptido de valenceno sintasa que es un fragmento catalíticamente activo del péptido de valenceno sintasa aislado de cualquiera de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde el fragmento catalíticamente activo cataliza la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico.
5.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de valenceno sintasa de Eryngium glaciale o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6.

Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de valenceno sintasa de Eryngium glaciale

o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la molécula de ácido nucleico es ADNc.
7. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, donde:

el polipéptido de valenceno sintasa codificado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:1, o el polipéptido de valenceno sintasa codificado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO: 1

o con un fragmento catalíticamente activo de la misma.
8.

La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 5, donde el polipéptido de valenceno sintasa codificado exhibe al menos un 95 % de identidad de secuencia aminoacídica con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento catalíticamente activo de la misma.
9.

La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, seleccionada de entre moléculas de ácido nucleico que comprenden:

(a)

la secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO: 2,

(b)

una secuencia de ácidos nucleicos que tiene al menos un 85 % identidad de secuencia con una secuencia de ácidos nucleicos expuesta en la SEQ ID NO:2 y que codifica un polipéptido de valenceno sintasa que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO:1; y

(c)

degeneraciones de (a) y (b).
10.

La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 5-9, que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
11.

La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 5-10, donde el polipéptido de valenceno sintasa codificado comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.
12.

Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11.
13.

El vector de la reivindicación 12, donde el vector es un vector procariótico, un vector vírico o un vector eucariótico, preferiblemente donde el vector es un vector de levadura.
14.

Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, donde la molécula de ácido nucleico es heteróloga de la célula y, si la célula es una célula humana, es una célula aislada o está en un cultivo celular; o una célula hospedadora que:

a) codifica un polipéptido de valenceno sintasa o fragmento catalíticamente activo del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la célula hospedadora produce un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; el polipéptido de valenceno sintasa es heterólogo del hospedador; el polipéptido de valenceno sintasa cataliza la producción de valenceno a partir del precursor y, si la célula hospedadora es una célula humana, es una célula aislada o una célula cultivada; b) comprende el vector de la reivindicación 12 o la reivindicación 13, donde si la célula es una célula humana, es una célula aislada o está en un cultivo celular; o c) comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido de valenceno de la reivindicación 1, donde el polipéptido de valenceno sintasa codificado tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con el polipéptido de valenceno sintasa cuya secuencia se expone en la SEQ ID NO: 1 o con un fragmento catalíticamente activo del mismo; el polipéptido de valenceno sintasa o fragmento catalíticamente activo del mismo cataliza la formación de valenceno a partir de un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; el ácido nucleico es heterólogo de la célula hospedadora y si la célula es una célula humana, es una célula aislada o está en un cultivo celular.
15.

La célula de la reivindicación 14, que es una célula procariótica o una célula eucariótica.
16.

La célula de la reivindicación 14 o la reivindicación 15, que se selecciona de entre una bacteria, preferiblemente Escherichia coli, células de levadura, insecto, planta y mamífero.
17.

La célula de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que es una célula de levadura y que es una célula del género Saccharomyces, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae o un célula del género Pichia.
18.

La célula de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, que produce difosfato de farnesilo nativamente

o está modificada para producir más difosfato de farnesilo en comparación con una célula no modificada.
19.

La célula hospedadora de la reivindicación 14 que es una célula hospedadora de levadura, preferiblemente una célula de Saccharomyces cerevisiae.
20.

La célula hospedadora de la reivindicación 14 o la reivindicación 19, donde el precursor es difosfato de farnesilo.
21.

Una planta transgénica que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 12-13 o una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, donde la molécula de ácido nucleico es heteróloga de la planta.
22.

La planta transgénica de la reivindicación 21 que es una planta de tabaco.
23.

Un procedimiento para producir un polipéptido de valenceno sintasa, que comprende:

a) cultivar una célula de cualquiera de las reivindicaciones 14-20 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de valenceno sintasa, produciendo el polipéptido de valenceno sintasa o un fragmento catalíticamente activo del mismo; b) introducir una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11 o un vector de la reivindicación 12 o la reivindicación 13 en una célula; cultivar la célula in vitro o in vivo en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de valenceno sintasa, con lo que se expresa el polipéptido de valenceno sintasa codificado o un fragmento catalíticamente activo del mismo.
24.

El procedimiento de la reivindicación 23, que comprende además aislar el polipéptido de valenceno sintasa y/o fragmento catalíticamente activo del mismo.
25.

Un procedimiento para producir valenceno que comprende:

a) poner en contacto un precursor terpénico de pirofosfato acíclico con el polipéptido de valenceno sintasa o fragmento catalíticamente activo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o el polipéptido o fragmento codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en condiciones adecuadas para la

formación de valenceno a partir del precursor terpénico de pirofosfato acíclico, donde la etapa de puesta en contacto del precursor terpénico de pirofosfato acíclico con el polipéptido de valenceno sintasa se efectúa in vitro o in vivo, con la condición de que, si se pone en contacto in vivo en una célula, el polipéptido de valenceno sintasa codificado es heterólogo de la célula hospedadora, y si la célula es una célula humana, es una célula aislada o está en un cultivo celular; o b) cultivar una célula que contiene la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11 o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 para producir valenceno, donde:

la molécula de ácido nucleico es heteróloga de la célula; la célula produce un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; el polipéptido de valenceno sintasa codificado por la molécula de ácido nucleico o vector se expresa y el polipéptido de valenceno sintasa cataliza la formación de valenceno a partir de el precursor terpénico de pirofosfato acíclico para producir valenceno.
26.

El procedimiento de la reivindicación 25, donde el precursor terpénico de pirofosfato acíclico es difosfato de farnesilo.
27.

El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, donde la célula es una célula procariótica o una célula eucariótica que se selecciona de entre una bacteria, célula de levadura, insecto, planta o mamífero.
28.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 25-27, donde la célula es una célula de levadura que es una célula del género Saccharomyces, preferiblemente Saccharomyces cerevisiae, o una célula del género Pichia.
29.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 25-28, donde la célula produce difosfato de farnesilo o se modifica para producir más difosfato de farnesilo en comparación con una célula no modificada.
30.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 25-29, que comprende además aislar el valenceno.
31.

Un procedimiento para producir nootkatona, que comprende:

(i)

(a)

poner en contacto difosfato de farnesilo con el polipéptido de valenceno sintasa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y/o el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, con lo que se produce valenceno;

(b)

aislar el valenceno producido en la etapa (a);

(c)

oxidar el valenceno para producir nootkatona; y

(d)

aislar la nootkatona; o

(ii)

(a)

cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-11, o un vector de las reivindicaciones 12-13, en condiciones resultantes en la producción de valenceno;

(b)

aislar el valenceno producido en la etapa (a);

(c)

oxidar el valenceno para producir nootkatona; y

(d)

aislar la nootkatona, donde la célula produce un precursor terpénico de pirofosfato acíclico; el polipéptido de valenceno sintasa codificado por la molécula de ácido nucleico o vector se expresa y el polipéptido de valenceno sintasa cataliza la formación de valenceno a partir del precursor terpénico de pirofosfato acíclico.
32.

El procedimiento de la reivindicación 30 o 31, donde se aísla el valenceno mediante extracción con un disolvente orgánico y/o cromatografía en columna.
33.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24-32, donde la oxidación se practica biosintética o químicamente.
34.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 24-30 o 32, que comprende ademas oxidar el valenceno para producir nootkatona y aislar la nootkatona.
35.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 31-34, donde se aísla la nootkatona mediante extracción con un disolvente orgánico y/o cromatografía en columna.
36. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 31 (ii), 32 o 33, que comprende además aislar 5 aristoloqueno, que es el compuesto del pico nº 2 en la Figura 3A.

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