ES2649048T3 - Procedimiento de secado - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para conservar un principio activo que comprende las etapas de: a) preparar una muestra para conservación disolviendo/suspendiendo un principio activo en una solución de un agente estabilizante; b) someter la muestra para conservación a una condición de temperatura entre 5 ºC y 37 ºC y unas condiciones de presión por debajo de 2 kPa de manera que la muestra para conservación pierda disolvente por evaporación, sin congelación o burbujeo implicado en la formación de espuma, para formar un líquido viscoso, en el que un líquido viscoso es el producto de la fase primaria de la retirada del disolvente; c) someter además la muestra para conservación a una condición de temperatura entre 5 ºC y 37 ºC y tales condiciones de presión de manera que que el líquido viscoso se seque para formar un líquido altamente viscoso en el que la presión se reduce en la etapa c) comparado con la presión durante la etapa b), en el que el agente estabilizante comprende un poliol formador de vidrio, seleccionado del grupo que consiste en glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano, en el que la concentración del agente estabilizante usado está entre el 5 % y el 50 % en peso/volumen, en el que el líquido altamente viscoso tiene un contenido de disolvente menor de o igual al 15 % (p/p) y en el que el principio activo comprende una vacuna que comprende un virus.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de secado

La presente invencion se refiere a la conservacion de muestras biologicas y otras muestras labiles, a tales muestras conservadas y a un procedimiento novedoso para conservar tales muestras. El procedimiento novedoso comprende anadir una muestra que incluye un principio activo y un agente estabilizante a un recipiente, sometiendo la muestra a unas condiciones de temperatura y presion tales que provoquen la perdida de disolvente por evaporacion sin que la muestra se congele o burbujee para formar una espuma. Posteriormente, durante una fase de secado secundaria, las condiciones de presion y temperatura se mantienen o se ajustan de tal manera que se elimina el disolvente y la muestra de conservacion se seca para formar un lfquido altamente viscoso. Adicionalmente por la presente invencion se proporcionan composiciones conservadas por el procedimiento de la presente invencion y en particular composiciones de vacunas conservadas.

Se necesita aumentar la estabilidad y de esta forma la vida util de muestra labiles, particularmente de muestras biologicas. Tradicionalmente, esto se ha llevado a cabo usando el procedimiento de secado por congelacion en el que se elabora una solucion de la sustancia y la muestra se congela. Durante la fase de secado primaria, la mayor parte del agua se elimina por sublimacion a partir de hielo bajo condiciones de presion reducida y se forma una 'torta' porosa. A esto le sigue generalmente una fase de secado secundaria cuando la presion y temperatura cambian y el agua se evapora de la 'torta' solida. La muestra liofilizada resultante ha mejorado la estabilidad comparada con la formulacion lfquida. Sin embargo, el procedimiento de secado por congelacion es de larga duracion, caro y puede ser la etapa limitante de velocidad en un procedimiento de produccion.

El secado por congelacion puede conducir tambien a la perdida de actividad o antigenicidad de algunos principios activos. Para ciertos materiales biologicos como por ejemplo virus vivos, puede haber una perdida significativa de actividad durante el procedimiento de secado por congelacion (Pikal (1994) ACS Symposium 567:120-133). Muchas sustancias secadas por congelacion son todavfa inestables a temperatura ambiente (Carpenter y col (1994) ACS Symposium 567;134-147).

El dano provocado por el procedimiento de congelacion se puede evitar en alguna medida por el uso de agentes estabilizantes como polioles. Tambien se han realizado mejoras adicionales en el procedimiento de liofilizacion evitando la congelacion de la muestra durante el procedimiento y retirando agua por ebullicion (documento WO96/40077; US6306345). Este procedimiento implica preparar una mezcla de un material que forma matrices de vidrio en un disolvente adecuado junto con la muestra que se va a conservar, evaporar la mayor parte del disolvente de la mezcla para obtener un jarabe, exponer el jarabe a una presion y temperatura suficientes para provocar la ebullicion del jarabe y la retirada del disolvente residual. Se puede hacer referencia a procedimientos similares a este como tecnicas de secado por espuma. Tales tecnicas expondran la muestra que va a ser conservada a tensiones debido a la formacion y estallamiento de burbujas durante la etapa de 'ebullicion'. Especialmente cuando se van a conservar sustancias labiles, esto puede dar lugar a una perdida de actividad.

Un procedimiento similar se describio en el documento US5.766.520, en el que el procedimiento requiere retirar parcialmente el agua para formar un fluido viscoso y someter ademas el jarabe a vacfo para provocar que 'ebulla' y secar ademas a temperaturas sustancialmente inferiores a 100 °C. Este procedimiento todavfa sufre algunos de los problemas de secado por congelacion convencional. Cuando el procedimiento se lleva a cabo en un secador por congelacion de gran tamano, las muestras se secaran a diferentes velocidades dependiendo de su posicion en la bandeja y esto lleva a que diferentes muestras pierdan una cantidad diferente de actividad durante el procedimiento de secado. Esto lleva a una falta de consistencia dentro de un lote.

La trehalosa es un poliol que se favorece para sus propiedades estabilizantes. La trehalosa es un disacarido de origen natural, inerte, no reductor y no toxico, que forma vidrio que se encontro inicialmente que estaba asociado a la prevencion de dano por desecacion en algunas plantas y animales. La trehalosa es util en prevenir la desnaturalizacion de una amplia diversidad de sustancias incluyendo protemas, virus y materiales alimenticios durante la desecacion y posterior almacenamiento, en parte porque tiene una temperatura de transicion de vidrio relativamente alta (aproximadamente 120 °C en el estado anhidro) (documentos US4891319; US5149653; US5026566). La trehalosa tambien estabiliza enzimas (Argall y Smith (1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 30; 491). Se ha encontrado tambien que la trehalosa y una amplia variedad de polioles estabilizantes son utiles en la mejora de la conservacion de muestras secadas por congelacion, especialmente en casos donde la muestra es propensa a perder actividad durante el procedimiento de secado por congelacion. Otros azucares utiles en tecnicas de liofilizacion incluyen sacarosa y lactosa.

Worral y col. (Vaccine, Vol. 19, N.° 7-8, 2000, pp. 834-839) desvela un procedimiento que implica etapas de secado primario y secundario. Sin embargo, la etapa de secado primario esta acompanada de burbujeo drastico.

La presente invencion se refiere a un procedimiento mejorado de conservacion de un principio activo, particularmente si el principio activo es labil y propenso a perder actividad durante un procedimiento de secado mas convencional. El procedimiento comprende las etapas de preparar una muestra de conservacion disolviendo/suspendiendo un principio activo en una solucion y un agente estabilizante; someter la muestra de

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conservacion a unas condiciones de presion y temperatura tales que la muestra de conservacion pierda disolvente por evaporacion sin que la muestra se congele o burbujee para formar espuma; y retirar el disolvente hasta que la muestra de conservacion se seque para formar un lfquido altamente viscoso.

El procedimiento es muy suave y no expone el principio activo a congelacion o ebullicion, y por lo tanto es ventajoso respecto a tecnicas de secado por congelacion y de secado por espuma convencionales las cuales sometenan la muestra a una o ambas de estas tensiones. Cuando el principio activo que se va a conservar es labil, el uso del procedimiento de la invencion da lugar a una retencion aumentada de actividad y/o antigenicidad. Esto se puede medir reconstituyendo el principio activo secado en disolvente, preferentemente agua o una solucion acuosa, y midiendo la actividad o antigenicidad mediante un ensayo convencional (por ejemplo mediante ELISA) y comparando los resultados con aquello obtenido con una muestra no secada o con muestras secadas por tecnicas de secado por congelacion o secado por espuma, y luego reconstituidas.

Es particularmente ventajoso secar VPI (virus de la polio inactivado, el inmunogeno en vacuna de la polio inyectable) usando el procedimiento de la invencion. El VPI esta presente en vacunas conocidas en forma de una formulacion lfquida (documento WO99/48525). Han surgido problemas al intentar usar una formulacion solida de VPI en una vacuna ya que los procedimientos de secado por congelacion convencionales dan lugar a una perdida de antigenicidad de VPI. El procedimiento de la invencion da lugar a una retencion mucho mas alta de los antfgenos del virus de la polio, debido parcialmente al tiempo reducido requerido para el procedimiento de la invencion.

El procedimiento de la invencion es ventajoso respecto al secado por congelacion normal ya que el ciclo de puesta en marcha es mas corto y requiere menos refrigeracion haciendolo mas eficaz en cuanto a la energfa. Como el procedimiento de secado es a menudo la etapa limitante de velocidad de un procedimiento, el uso del procedimiento de la invencion da lugar a niveles de produccion mas altos a coste reducido.

Descripcion de las figuras

Figura 1 - Fotograffa del lfquido de alta viscosidad en viales invertidos.

Descripcion detallada

El procedimiento de la invencion se usa para conservar un principio activo y comprende las etapas de:

a) preparar una muestra para conservacion disolviendo/suspendiendo un principio activo en una solucion de un agente estabilizante;

b) someter la muestra para conservacion a una condicion de temperatura entre 5 °C y 37 °C y una condicion de presion por debajo de 2 kPa tal que la muestra para conservacion pierda disolvente por evaporacion, sin implicar congelarse o burbujear en la formacion espuma, para formar un lfquido viscoso, en el que un lfquido viscoso es el producto de la fase primaria de la retirada de disolvente;

c) someter ademas la muestra para conservacion a una condicion de temperatura entre 5 °C y 37 °C y tales condiciones de presion de tal manera que el lfquido viscoso se seca para formar un lfquido altamente viscoso en el que la presion se reduce en la etapa c) en comparacion con la presion durante la etapa b), en la que el agente estabilizante comprende un poliol formador de vidrio, seleccionado del grupo que consiste en glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, sorbitol, isomaltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, raffinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano, en la que la concentracion del agente estabilizante usado esta entre el 5 % y el 50 % peso/volumen, en la que el lfquido altamente viscoso tiene un contenido de disolvente menos de o igual al 15 % (p/p) y en el que el agente activo comprende una vacuna que comprende un virus.

El procedimiento para conservar un principio activo produce una forma del principio activo que es capaz de aguantar un almacenamiento prolongado durante el que se mantiene la actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad del principio activo. Preferentemente el principio activo retiene al menos un 40, 50, 60, 70, preferentemente un 80, 90, 95 % de su actividad, antigenicidad y/o inmunogenicidad originales durante un penodo de almacenamiento de al menos 3, 6, 9, 12, 24 meses a 4 °C. La antigenicidad o inmunogenicidad pueden medirse por ensayos convencionales como se describe posteriormente.

El procedimiento es particularmente util para alargar la vida util de productos labiles que pierden actividad rapidamente cuando se almacenan en forma de solucion o cuando se exponen a congelacion o burbujeo para formar espuma.

Un producto labil es propenso a una perdida de actividad y/o a una perdida de antigenicidad y/o inmunogenicidad, despues del almacenamiento en forma de solucion y/o congelacion y/o sometimiento a tensiones tales como por ejemplo aquellas involucradas en el burbujeo durante la formacion de espuma.

Es particularmente aplicable para su uso cuando es ventajosa una concentracion mas baja (por ejemplo del 3 %-15 % p/v) del poliol que forma vidrio y se prefiere un procedimiento de secado mas corto (menos de 4, 6, 8, 10 o 12 horas).

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Se define un Ifquido viscoso como el producto de la fase primaria de la retirada de disolvente, al final del cual la mayor parte del disolvente se ha perdido de la muestra. Este punto se puede reconocer porque la velocidad de evaporacion disminuye de tal forma que la temperatura de la muestra vuelve a la temperatura ambiente ya que el efecto endotermico de la mayor parte de la evaporacion se pierde.

Se produce un lfquido altamente viscoso despues de que el lfquido viscoso producido al final de la fase primaria de secado se haya expuesto a presion reducida durante un penodo adicional de tiempo despues del final de la fase primaria de secado. Un lfquido altamente viscoso tiene un contenido de disolvente de menos de o igual a un 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 o un 1 % (p/p), preferentemente como se determina por el analizador de humedad culombiometrico de Karl Fischer (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277-284). Los intervalos preferidos de contenido en disolvente son 1-3 %, 3-5 %, 5-10 % o 10-15 % (p/p). El lfquido altamente viscoso tiene un contenido en disolvente suficientemente bajo, de tal forma que el principio activo se conserva en un estado estable durante al menos 3, 6, 9, 12 o 24 meses a 4 °C, permitiendo al principio activo retener al menos un 40, 50, 60, preferentemente un 70, 80, 90, 95 % de su actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad durante este penodo. Preferentemente, el lfquido altamente viscoso tiene una apariencia solida pero es una goma o vidrio, preferentemente un vidrio, y es capaz de fluir muy lentamente durante un penodo de 2, 4 o 6 dfas, preferentemente 1, 2, 3 o 4 semanas, mas preferentemente 2, 4, 6, 8, 10 o 12 meses. Puede medirse el flujo extremadamente lento invirtiendo un receptaculo que contiene el lfquido altamente viscoso y dejandolo a temperatura ambiente hasta que el lfquido altamente viscoso se observa que fluye. En una realizacion preferida, el lfquido altamente viscoso no parecera fluir despues de 2, 4 o 6 dfas, preferentemente 1, 2, 3 o 4 semanas, mas preferentemente 2, 4, 6, 8, 10 o 12 meses en una posicion invertida.

Preparacion de la muestra para conservacion

Los agentes estabilizantes adecuados para su uso en la primera etapa de la presente invencion permiten al principio activo almacenarse sin perdida sustancial de actividad por desnaturalizacion, agregacion u otros medios. Los materiales adecuados comprenden un poliol que forma vidrio seleccionado del grupo que consiste en glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa o dextrano, mas preferentemente trehalosa, sacarosa, sorbitol, rafinosa, manitol, lactosa, lactitol o palatinit, mas preferentemente sacarosa, sorbitol, lactosa o trehalosa.

Los polisacaridos bacterianos se describen para su uso como un agente estabilizante en una composicion inmunogenica ya que pueden actuar como un agente estabilizante y como un inmunogeno.

Los carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, monosacaridos, disacaridos, trisacaridos, oligosacaridos y sus correspondientes alcoholes de azucares, compuestos polihidroxflicos como por ejemplo derivados de carbohidratos e carbohidratos qmmicamente modificados, almidon hidroxietilico y copolfmeros de azucares. Tanto los carbohidratos naturales como los sinteticos son adecuados para su uso. Los carbohidratos sinteticos incluyen, pero no se limitan a, aquellos los cuales tienen el enlace glucosfdico reemplazado por un enlace tiol o de carbono. Se pueden usar las formas D y L de los carbohidratos. El carbohidrato puede ser no reductor o reductor. Cuando se usa un carbohidrato reductor, se prefiere la adicion de inhibidores de la reaccion de Maillard.

Los carbohidratos reductores adecuados para su uso en la invencion son aquellos que se conocen en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, glucosa, maltosa, lactosa, fructosa, galactosa, manosa, maltulosa y lactulosa. Los carbohidratos no reductores incluyen pero no se limitan a, glucosidos no reductores de compuestos polihidroxflicos seleccionados de alcoholes de azucares y otros polialcoholes de cadena lineal. Otros carbohidratos utiles incluyen rafinosa, estaquiosa, melezitosa, dextrano, sacarosa, celobiosa, manobiosa y alcoholes de azucares. Los glucosidos de alcoholes de azucares son preferentemente monoglucosidos, en particular los compuestos que se obtienen por reduccion de disacaridos como por ejemplo lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa.

Son carbohidratos particularmente preferidos la trehalosa, sacarosa, sorbitol, maltitol, lactitol, palatinit y glucopiranosil-1^6-manitol.

Los aminoacidos pueden actuar como agentes estabilizantes en combinacion con el poliol que forma vidrio. Los aminoacidos preferidos incluyen glicina, alanina, arginina, lisina y glutamina, aunque cualquier aminoacido, o una combinacion de aminoacidos, peptido, protema hidrolizada o protema como por ejemplo la albumina del suero, puede actuar como un agente estabilizante.

La concentracion del agente estabilizante que se usa en el procedimiento de la invencion puede estar entre un 1 % y un 50 % p/v, preferentemente 5-10 %, 5-10 %, 15-20 %, 20-25 % o 25-50 %, mas preferentemente menos de o igual a un 15 % o un 10 % (p/v). Las cantidades de agente estabilizante requerido son proporcionales a las cantidades de sales presentes. Por lo tanto, aunque se prefieren niveles de agente estabilizante entre un 5 % y un 10 %, se pueden requerir concentraciones mas altas de un 10 % a un 25 % a muestras secas con un contenido en sales alto (por encima de 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM o 500 mM).

Preferentemente, la muestra para conservacion contendra un componente capaz de inhibir la formacion de cristales en el lfquido altamente viscoso de la invencion. Las sales y otras moleculas incluyendo aminoacidos y rojo de fenol inhiben la formacion de cristales.

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Recipiente

Pueden procesarse simultaneamente diferentes mezclas y diversas formas y tamanos de recipientes. Idealmente, el tamano del recipiente que se usa es suficiente para contener la mezcla inicial y acomodar el volumen del solido formado de la misma. Tfpicamente, este se determina mediante la masa del material que forma vidrio, el area de la superficie del recipiente y las condiciones de la formacion de vidrio. La masa del material que forma vidrio debe ser suficiente para dar un jarabe viscoso lo que practicamente se traduce como una minima masa por unidad de area de la superficie del recipiente. Esta relacion vana de mezcla a mezcla y al recipiente usado pero se determina facilmente de forma emprnca mediante un experto en la materia siguiendo los procedimientos establecidos en el presente documento. Puede usarse cualquier vial, incluyendo viales moldeados de tipo Wheaton y cortados en tubo.

El procedimiento de la invencion usa preferentemente recipientes con un repelente de disolventes, preferentemente una superficie interior repelente de agua. Esto se logra revistiendo la superficie interior con una composicion hidrofoba, por ejemplo por recubrimiento con silicona. El recubrimiento con silicona se logra por procedimientos que los expertos en la materia conocen bien. En un procedimiento, el recipiente se recubre con silicona haciendo subir una emulsion de silicona por el interior del recipiente, seguido del procesamiento a traves de un horno a elevada temperatura, tfpicamente 350 °C. Alternativamente, la superficie interior repelente de agua se obtiene haciendo el recipiente de una composicion repelente de agua.

La superficie interior repelente de agua del recipiente hace que el producto secado del procedimiento sea mas facil de reconstituir ya que la menor parte del agua se recoge en los lados del recipiente.

Aunque pueden usarse formas singulares en el presente documento, puede estar presente mas de un material formador de matrices de vidrio, mas de un aditivo y mas de una sustancia. Un experto en la materia determina facilmente las cantidades eficaces de estos componentes.

Solucion

El disolvente en el que se mezclan el agente estabilizante y el principio activo puede ser acuoso, organico o una mezcla de ambos. Puede usarse suficiente disolvente acuoso para disolver el material formador de matrices de vidrio y suficiente disolvente organico para disolver una sustancia hidrofoba, permitiendo la formacion de sustancia o sustancias hidrofobas que incorporan vidrio.

La eleccion del disolvente dependera de la naturaleza del material elegido para la formacion ce la matriz de vidrio, asf como de la naturaleza de cualquier aditivo y/o sustancia que se vaya a incorporar. El disolvente debena ser de una naturaleza y de un volumen suficiente para dar lugar a una adecuada solubilizacion del material formador de matrices de vidrio asf como cualquier aditivo y/o sustancia. Si la sustancia es un material hidrofilo, el lfquido sera preferentemente acuoso para evitar cualquier perdida potencial de actividad debido a interacciones indeseables del disolvente. Preferentemente, el disolvente acuoso incluye cualquier disolvente acuoso adecuado conocido en la tecnica, incluyendo, pero que no se limita a, agua y soluciones tamponadoras biologicas. Preferentemente, el disolvente acuoso esta presente en una cantidad de un 5 a un 98 % en volumen, mas preferentemente un 80-98 % en volumen, lo mas preferentemente un 85-98 % en volumen.

El volumen de disolvente puede variar y dependera del material formador de matrices de vidrio y de la sustancia que se va a incorporar asf como de cualquier aditivo. El volumen mmimo requerido es una cantidad necesaria para solubilizar los diversos componentes. Sin embargo, tambien pueden usarse suspensiones de la sustancia o sustancias homogeneamente dispersadas. Las cantidades adecuadas de los componentes en realizaciones espedficas son facilmente determinables por los expertos en la materia a la luz de los ejemplos que se proporcionan en el presente documento.

Pueden introducirse diversos aditivos en la muestra para conservacion. Un aditivo preferido es un inhibidor de la reaccion de Maillard. Preferentemente, si la sustancia y/o el material formador de matrices de vidrio contiene grupos carbonilo y amino, imino o guanidinio, las composiciones las composiciones contienen ademas al menos un inhibidor de la reaccion de Maillard fisiologicamente aceptable en una cantidad efectiva para prevenir sustancialmente la condensacion de grupos amino y grupos carbonilo reactivos en la composicion. El inhibidor de la reaccion de Maillard puede ser cualquiera conocido en la tecnica. El inhibidor esta presente en una cantidad suficiente para prevenir, o prevenir sustancialmente, la condensacion de grupos amino y grupos carbonilo reactivos. Tfpicamente, los grupos amino estan presentes en la sustancia y los grupos carbonilo estan presentes en el material formador de matrices de vidrio, o a la inversa. Sin embargo, los grupos aminoacido y carbonilo pueden ser intramoleculares dentro de la sustancia o del carbohidrato.

Se sabe que varias clases de compuestos muestran un efecto inhibidor en la reaccion de Maillard y por lo tanto, se usan en las composiciones descritas en el presente documento. Estos compuestos son generalmente inhibidores competitivos o no competitivos de la reaccion de Maillard. Los inhibidores competitivos incluyen, pero no se limitan a, residuos de aminoacidos (tanto D como L), combinaciones de restos de aminoacidos y peptidos. Son particularmente preferidos la lisina, arginina, histidina y el triptofano. La lisina y la arginina son los mas eficaces. Hay muchos inhibidores no competitivos conocidos. Estos incluyen, pero no se limitan a, aminoguanidina y derivados y amfotericina B. El documento EP-A-0 433 679 describe tambien inhibidores de Maillard adecuados, los cuales

incluyen derivados de 4-hidroxi-5,8-dioxoquinolina.

Resulta ventajoso incorporar un tinte coloreado en la muestra de conservacion para permitir una visualizacion mas facil del producto secado del procedimiento de la invencion. Esto es particularmente importante durante la reconstitucion para asegurar que el lfquido altamente viscoso se reconstituye en su totalidad previo al uso. 5 Preferentemente, el tinte coloreado mantiene su color a un pH neutral y es compatible con la inyeccion al paciente. Mas preferentemente el tinte coloreado es el rojo de fenol.

Perdida de disolvente por evaporacion (secado por evaporacion - etapa b)

El procedimiento de la invencion implica someter la muestra para conservacion a unas condiciones de presion y temperatura tales que la muestra para conservacion pierda disolvente por evaporacion, sin que la muestra se 10 congele o burbujee para formar espuma.

La temperatura dentro de la muestra para conservacion sera, a veces, diferente de la externa de la muestra debido a la naturaleza endotermica del procedimiento de evaporacion.

Las referencias a la temperatura son a las condiciones externas a la muestra para conservacion, por ejemplo, cuando se usa un secador por congelacion industrial, a la temperatura de la bandeja. Esto corresponde 15 generalmente a la temperatura fijada del secador por congelacion.

Opcionalmente esta presente en el procedimiento de la invencion una etapa preliminar de desgasificacion de la muestra para conservacion. La presion se reduce hasta o por debajo de 20 kPa, preferentemente entre 20 y 3,5 kPa, durante un penodo de al menos 5 minutos antes de que la presion se reduzca aun mas.

Una realizacion preferida de la invencion logra el secado evaporativo reduciendo la presion mientras se controlan las 20 condiciones de temperatura. La presion se ajusta hasta o por debajo de 2, preferentemente 1,5, 1,2, lo mas preferentemente 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 kPa, mientras que se mantiene la temperatura fijada a una temperatura de entre 5 °C a 37 °C, 5 °C a 10 °C, 10 °C a 15 °C; 15 °C a 20 °C; 20 °C a 25 °C; 25 °C a 30 °C o 30 °C a 37 °C. Estas condiciones se mantienen durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 o 24 horas, preferentemente durante entre 2-4 horas, 4-6 horas, 6-8 horas, 8-12 horas o 12-18 horas. En una realizacion particularmente 25 preferida, la presion se mantiene por encima de 0,2 kPa cuando la temperatura se ajusta a 15 °C para prevenir la congelacion de la muestra. En una realizacion preferida, la temperatura se mantiene a 15 °C y la presion se ajusta entre 0,5-1 kPa, mas preferentemente 0,6-0,9 kPa, de la forma mas preferida aproximadamente a 0,8 kPa. Cuando se usa una temperatura fijada mas alta, es posible una presion ligeramente inferior sin congelar la muestra y cuando se usa una temperatura fijada mas alta, la presion se debena mantener al nivel mas alto para prevenir la 30 congelacion. Las condiciones se mantienen preferentemente durante un penodo de tiempo suficiente de tal forma que la velocidad de evaporacion haya disminuido, de tal forma que la temperatura de la muestra sea aproximadamente la misma que la externa a la muestra.

Preferentemente, la muestra de conservacion no se congela o burbujea/ebulle para formar espuma y pierde disolvente para formar un lfquido viscoso o un lfquido altamente viscoso.

35 Retirar disolvente para formar un liquido altamente viscoso

Una etapa posterior del procedimiento de la invencion implica retirar el disolvente hasta que se seque la muestra para conservacion para formar un lfquido altamente viscoso. La muestra ni se congela ni burbujea para formar espuma durante la fase de secado secundaria.

Se define un lfquido altamente viscoso como un material con un contenido en disolvente de menos de o igual a un 40 15, 12, 10, mas preferentemente un 8, 5, 4, 3, 2 o un 1 % (p/p), medido preferentemente usando un analizador de

humedad culombiometrico de Karl Fischer. El lfquido altamente viscoso tiene un contenido suficientemente bajo en disolvente, de tal forma que el principio activo se conserva en un estado estable durante al menos 3, 6, 9, 12 o 24 meses a 4 °C, permitiendo al principio activo retener al menos un 40, 50, 60, preferentemente un 70, 80, 90 o un 95 % de su actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad durante este penodo. Preferentemente, el lfquido altamente 45 viscoso tiene una apariencia solida y/o transparente pero es un vidrio y es capaz de fluir muy lentamente durante un penodo de 2, 4 o 6 dfas, preferentemente 2, 3 o 4 semanas, mas preferentemente 2, 4, 6, 8, 10 o 12 meses en una posicion invertida. El flujo extremadamente lento puede medirse invirtiendo un receptaculo que contiene el lfquido altamente viscoso y dejandolo a temperatura ambiente hasta que se observe que el lfquido altamente viscoso fluya. En una realizacion preferida, el lfquido altamente viscoso no parecera fluir despues de 2, 4 o 6 dfas, preferentemente 50 2, 3 o 4 semanas, mas preferentemente 2, 4, 6, 8, 10 o 12 meses en una posicion invertida.

En una realizacion de la invencion, esto se logra manteniendo las condiciones de presion y temperatura a aquellas aplicadas en la primera etapa de secado evaporativo. Por ejemplo, la presion se mantiene a o por debajo de o por debajo de 2, preferentemente 1,5, 1,2, de la forma mas preferible 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 kPa, mientras se mantiene temperatura fijada a una temperatura de entre 5 °C y 37 °C, 5 °C a 10 °C, 10 °C a 15 °C; 15 °C 55 a 20 °C; 20 °C a 25 °C; 25 °C a 30 °C; o 30 °C a 37 °C. Para un ajuste de temperatura de 15 °C, se mantiene una presion de 0,5-1 kPa, preferentemente de 0,6-0,9 kPa, de la forma mas preferible aproximadamente 0,8 kPa durante entre 4-24 horas, preferentemente 1-4, 4-8, 8-12 o 12-16 horas. Estas condiciones de temperatura y presion se

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mantienen durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 18 horas o mas para obtener un Ifquido altamente viscoso con un contenido en disolvente de menos de o igual a un 15, 12, preferentemente un 10, 8, 5, 4, 3, 2 o un 1 % (p/p), medido preferentemente por un analizador de humedad culombiometrico de Karl Fischer.

Otra realizacion de la invencion aumenta la temperatura fijada durante la retirada del disolvente a una temperatura fijada mas alta que aquel que se mantiene anteriormente en el procedimiento. Esto permite al disolvente abandonar la muestra a una velocidad mas rapida de modo que el procedimiento de la invencion se puede completar en un tiempo mas corto. Por ejemplo, la temperatura fijada se aumenta por encima de 20 °C, preferentemente entre 5 °C y 37 °C, 5 °C y 10 °C, 10 °C y 20 °C; 20 °C y 30 °C; mientras que la presion se mantiene a o por debajo de 2, preferentemente 1,5, 1,2, de la forma mas preferible 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 kPa. Estas condiciones de temperatura y presion se mantienen durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 o 18 horas o mas, para obtener un solido con un contenido en disolvente de menos de o igual a un 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 o un 1 % (p/p) preferentemente medido por un analizador de humedad culombiometrico de Karl Fischer. Esta realizacion requiere calentar de manera estable al principio activo a la temperatura usada para que el procedimiento se lleve a cabo con exito.

La invencion reduce presion fijada durante la retirada del disolvente (etapa c) a una presion fijada mas baja que el usado anteriormente en el procedimiento (etapa b). Esto permite al disolvente abandonar la muestra a una velocidad mas rapida de tal forma que el procedimiento de la invencion se puede completar en un tiempo mas corto. Tambien permite una proporcion mayor del disolvente que se va a perder. Por ejemplo, la presion fijada se fija a o por debajo de 0,7, 0,6, preferentemente 0,5, 0,4, 0,3, mas preferentemente 0,2, 0,15, 0,1, de la forma mas preferida 0,08, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002, 0,001 o 0,0005 kPa, mientras que la temperatura se mantiene entre 5 °C y 37 °C, preferentemente entre 10 °C y 20 °C; 20 °C y 30 °C; 30 y 35 °C. Estas condiciones de temperatura y presion se mantienen durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 o 18 horas o mas para obtener un solido con un contenido en disolvente de menos de o igual a un 15, 12, preferentemente un 10, 8, 5, 4, 3, 2 o un 1 % (p/p), preferentemente como se determina por el analizador de humedad culombiometrico de Karl Fischer (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; 277284).

Preferentemente, las etapas b) y c) (o b) sola) se debenan completar en un tiempo igual a o menor de 18 horas, preferentemente 16, 12, 10 horas, de la forma mas preferible 8, 6, 5 o 4 horas.

Principio activo

El procedimiento de la invencion es para conservar un principio actico en el que el principio activo comprende una vacuna que comprende un virus. Es particularmente util en el caso de principios activos labiles que comprenden una vacuna que comprende un virus que pierden actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad durante otros procedimientos de conservacion.

El principio activo que comprende una vacuna que comprende un virus que se va a conservar usando un procedimiento de la invencion puede comprender un sistema biologico seleccionado del grupo que consiste en celulas, composiciones subcelulares, bacterias, preparaciones de vesmulas de membranas externas y virus, componentes vmcos o partmulas tipo virus. Tambien puede comprender moleculas, por ejemplo protemas, peptidos, aminoacidos, acidos polinucleicos, oligonucleotidos, polisacaridos, oligosacaridos, conjugados polisacarido - protema, conjugados oligosacarido - protema.

Los ejemplos de agentes activos descritos en el presente documento incluyen sustancias bioactivas tales como sustancias farmaceuticamente eficaces, incluyendo, pero no limitado a, farmacos antiinflamatorios, analgesicos, tranquilizantes, farmacos contra la ansiedad, antiespasmodicos, antidepresivos, antipsicoticos, tranquilizantes, farmacos contra la ansiedad, antagonistas de narcoticos, agentes antiparkinsonianos, agonistas colinergicos, farmacos quimioterapeuticos, agentes inmunosupresores, agentes antivmcos, agentes antimicrobianos, supresores del apetito, anticolinergicos, antimetricos, antihistammicos, agentes antimigrana, vasodilatadores coronarios, cerebrales y perifericos, agentes hormonales, contraceptivos, agentes antitromboticos, diureticos, agentes antihipertensivos, farmacos cardiovasculares, opioides y similares.

Los agentes adecuados que comprenden una vacuna que comprende un virus tambien incluyen agentes terapeuticos y profilacticos. Estos incluyen, pero no se limitan a, cualquier modificador biologico terapeuticamente efectivo. Tales sustancias incluyen, pero no se limitan a, composiciones subcelulares, celulas, bacterias, preparaciones vesiculares de membrana externa, virus y moleculas que incluyen pero no se limitan a, lfpidos, compuestos organicos, protemas y peptidos (sinteticos y naturales), mimeticos de peptidos, hormonas (peptido, esteroide y corticosteroide), polfmeros de aminoacidos D y L, oligosacaridos, polisacaridos, nucleotidos, oligonucleotidos y acidos nucleicos, incluyendo ADN y ARN, hfbridos de protema y acido nucleico, pequenas moleculas y analogos fisiologicamente activos de los mismos. Ademas, los modificadores pueden derivar de fuentes naturales o elaborarse por medios recombinantes o sinteticos e incluyen analogos, agonistas y homologos.

Como se usa en el presente documento, “protema” se refiere tambien a peptidos y a polipeptidos. Tales protemas incluyen, pero no se limitan a, enzimas, compuestos biofarmaceuticos, hormonas de crecimiento, factores de crecimiento, insulina, anticuerpos, tanto fragmentos monoclonales como policlonales de los mismos, interferones,

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interleucinas y citocinas.

La invencion tambien abarca agentes terapeuticos basados en acidos nucleicos que comprenden una vacuna que comprende un virus preparado por los metodos que se describen en el presente documento. Como se usa en el presente documento, “acidos nucleicos” incluye cualquier acido nucleico terapeuticamente efectivo conocido en la tecnica que incluye, pero no se limita a, ADN, ARN, y analogos fisiologicamente activos de los mismos. Los nucleotidos pueden codificar genes o puede ser cualquier vector conocido en la tecnica de ADN recombinante que incluye, pero no se limita a, plasmidos, retrovirus y virus adenoasociados.

La invencion abarca ademas la conservacion de sustancias que son fisiologicamente activas, y vehmulos de las mismas. Las composiciones preferibles incluyen inmunogenos tales como vacunas. Las vacunas pueden ser para administracion oral o pueden ser para inyeccion despues de reconstitucion. Las vacunas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, virus vivos y atenuados, antigenos que codifican vectores de nucleotidos, antigenos de tipo protema, bacterias vivas y atenuadas, polisacarido, oligosacarido, y/o lipopolisacarido, antigenos mas adyuvantes y antigenos y/o haptenos acoplados a vehmulos. Son particularmente preferidas las vacunas eficaces contra difteria, tetanos, pertussis, botulinum, colera, Dengue, Hepatitis A, B, C y E, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, estreptococos de Grupo B, estreptococos de Grupo A, virus del herpes, Helicobacterium pylori, gripe, encefalitis japonesa, meningococos A, B, C, Y, W, sarampion, paperas, virus del papiloma, neumococos, virus de la polio, virus de la polio inactivado (VPI - preferentemente que comprende los tipos 1, 2 y 3 como es convencional en la vacuna de la tecnica, de la forma mas preferible la vacuna de la polio de Salk), rubeola, rotavirus, virus sincitial respiratorio, Shigella, tuberculosis, virus de varicela-zoster, fiebre amarilla y combinaciones de los mismos. El componente antigenico de las vacunas tambien puede producirse por tecnicas de biologfa molecular para producir peptidos recombinantes o protemas de fusion que contienen una o mas partes de una protema derivada de un patogeno. Por ejemplo, se ha visto que las protemas de fusion que contienen un antfgeno y la subunidad B de la toxina del colera inducen una respuesta inmune al antfgeno. Sanches y col (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:481-485. Las vacunas son particularmente adecuadas para su incorporacion en una composicion de dosificacion unica. Son estables indefinidamente en condiciones ambientales y se pueden redisolver en un diluyente esteril inmediatamente antes de la inoculacion.

En una realizacion preferida, la composicion inmunogenica comprendena polisacaridos capsulares derivados de uno o mas de los serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria meningitidis. Una realizacion preferida adicional comprendena polisacaridos capsulares derivados de Streptococcus pneumoniae. Los antfgenos de polisacarido capsulares de neumococo se seleccionan preferentemente de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12 F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (de la forma mas preferible de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares PRP de Haemophilus influenzae de tipo b. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares Tipo 5, Tipo 8, 336 o PNAG de Staphilococcus aureus. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares Tipo I, Tipo II, Tipo III y PIA de Streptococcus epidermis. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II o Tipo III de Estreptococos del Grupo B. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares de estreptococos del Grupo A, preferentemente comprendiendo ademas al menos una protema M y, mas preferentemente, multiples tipos de protema M.

En una realizacion de la invencion, los polisacaridos bacterianos son de longitud completa, purificandose polisacaridos nativos. En una realizacion alternativa de la invencion, se mide el tamano de los polisacaridos entre 2 y 20 veces, preferentemente 2-5 veces, 5-10 veces, 10-15 veces o 15-20 veces, de tal forma que los polisacaridos son mas pequenos en tamano para una mayor manejabilidad. Los oligosacaridos se usan en una realizacion preferida. Los oligosacaridos contienen tfpicamente entre 2 y 20 unidades de repeticion.

Los polisacaridos y oligosacaridos pueden ser no conjugados o conjugados tal y como se describe posteriormente.

Pueden conservarse combinaciones de dos o mas de los principios activos anteriores usando el procedimiento de conservacion de la invencion. Parte o el total de la vacuna puede conservarse usando el procedimiento de conservacion de la invencion.

Un principio activo preferido a conservarse usando el procedimiento de la invencion comprende VPI (una mezcla inactivada de cepas del virus de la polio). El VPI, particularmente el componente de tipo 3, es sensible a las tecnicas convencionales de secado por congelacion y secado por espuma como se muestra por la perdida de antfgenos despues del secado por congelacion o por espuma y posterior reconstitucion.

VPI se define como virus de la polio inactivado (preferentemente que comprende los tipos 1,2 y 3 como es tfpico en la tecnica de vacuna, de la forma mas preferible la vacuna de la polio Salk). Una dosis de vacuna de VPI contiene 20-80, preferentemente 40 u 80 unidades de D-antfgeno de tipo 1 (Mahoney), 4-16, preferentemente 8 o 16 unidades de D-antfgeno de tipo 2 (MEF-1) y 20-64, preferentemente 32 o 64 unidades de D-antfgeno de tipo 3 (Saukett).

Cuando se seca por el procedimiento de la invencion, preferentemente se retiene la antigenicidad de 1,2 o los 3 de los tipos 1, 2, y 3 del virus de la polio; mas preferentemente la antigenicidad de tipo1; tipo 2; tipo 3; tipo 1 y tipo 2;

tipo 1 y tipo 3; tipo 2 y tipo 3; o tipo 1, tipo 2 y tipo 3 se retiene a un nivel de al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 98 % de la antigenicidad de una muestra referencia que no se ha sometido al procedimiento de secado. Esto puede medirse, despues de la reconstitucion del lfquido altamente viscoso en una solucion acuosa, por cualquier metodo adecuado, incluyendo por ELISA usando anticuerpos policlonales y/o monoclonales contra el virus 5 de la polio de tipo 1, 2 y/o 3.

Cuando se seca por el procedimiento de la invencion, preferentemente se retiene la antigenicidad de 1,2 o los 3 de los tipos 1, 2, y 3 del virus de la polio; mas preferentemente la antigenicidad de tipo1; tipo 2; tipo 3; tipo 1 y tipo 2; tipo 1 y tipo 3; tipo 2 y tipo 3; o tipo 1, tipo 2 y tipo 3 se retiene a un nivel de al menos un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o un 98 % de la antigenicidad de una muestra referencia que no se ha sometido al procedimiento de 10 secado. Esto se puede medir, despues de la reconstitucion del lfquido altamente viscoso en una solucion acuosa, por cualquier procedimiento adecuado. En un procedimiento preferido, el lfquido altamente viscoso se reconstituye en una solucion acuosa y se inocula en un animal, preferentemente una rata. Despues de un penodo de tiempo adecuado, se recogen los antisueros de los animales inoculados y se ensaya la seroconversion. Preferentemente se logra una potencia relativa de al menos 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9, comparado con una muestra de referencia no 15 secada.

Preferentemente, el VPI se combina con uno o mas polisacaridos PRP u oligosacaridos de Hib (Haemophilus influenzae tipo b) y/o polisacaridos u oligosacaridos de meningococo A, C, W y/o Y, y/o polisacaridos u oligosacaridos de neumococo. De la forma mas preferida, los principios activos comprenden VPI y Hib; VPI y Men C; VPI, Hib y Men C; Hib y Men C; VPI y Men A y C; Hib y Men A y C; VPI, Hib, Men A y C; Hib, Men C e Y; o VPI, Hib, 20 Men C e Y.

Los principios activos particularizados anteriormente pueden comprender tambien uno o mas polisacaridos capsulares de neumococo como se describe a continuacion.

En las composiciones anteriores donde se usan polisacaridos, tambien se pueden emplear oligosacaridos (como se define a continuacion).

25 Aunque estas composiciones pueden ir acompanadas de adyuvante (como se describe posteriormente), preferentemente no van acompanadas de adyuvante, o preferentemente, no comprenden sales de aluminio.

Los polisacaridos u oligosacaridos se conjugan preferentemente con un peptido o protema transportadora que comprende epttopos de linfocitos T auxiliares (como se describe posteriormente).

Componentes adicionales

30 Las combinaciones preferidas, secadas por el procedimiento de la invencion, se pueden combinar con otros antfgenos en una vacuna de combinacion la cual se diseca, o es preferentemente una formulacion lfquida la cual puede usarse para reconstituir los componentes secados. Los antfgenos preferidos para combinarse con los principios activos que comprenden una vacuna que comprende un virus incluyen uno o mas de toxoide difterico, toxoide tetanico, pertusis de celula completa (Pw), pertusis acelular (Pa) (como se describe posteriormente) antfgeno 35 de superficie de Hepatitis B, virus de la Hepatitis A, polisacaridos de Haemophilus influenzae b, polisacaridos de neiseria, protemas de N. meningitidis de serotipo B, polisacaridos de neumococo, protemas de neumococo o cualquiera de los antfgenos de la lista posterior. Los polisacaridos bacterianos se pueden conjugar con una protema transportadora como por ejemplo el toxoide tetanico, fragmento C del toxoide tetanico, toxoide difterico, CRM197, pneumolisina, Protema D (US6342224) como se describe posteriormente.

40 Los principios activos que comprenden una vacuna que comprende un virus conservado usando el procedimiento de la invencion pueden formularse con polisacaridos capsulares derivados de uno o mas de Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Streptococos del Grupo A, Streptococos del Grupo B, Staphilococcus aureus o Staplilococcus epidermis. En una realizacion preferida, la composicion inmunogenica comprendena polisacaridos capsulares derivados de uno o mas de serogrupos A, C, W-135 e Y de Neisseria 45 meningitidis. Una realizacion preferida adicional comprendena polisacaridos capsulares derivados de Streptococcus pneumoniae. Los antfgenos de polisacaridos capsulares de neumococos se seleccionan preferentemente a partir de los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12 F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F (de la forma mas preferible de los serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F). Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares PRP de Haemophilus influenzae de tipo b. Una realizacion preferida 50 adicional contendna los polisacaridos capsulares Tipo 5, Tipo 8, 336 o PNAG de Staphilococcus aureus. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares Tipo I, Tipo II, Tipo III y PIA de Streptococcus epidermis. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares Tipo Ia, Tipo Ic, Tipo II o Tipo III de Estreptococos del Grupo B. Una realizacion preferida adicional contendna los polisacaridos capsulares de estreptococos del Grupo A, preferentemente comprendiendo ademas al menos una protema M y, mas 55 preferentemente, multiples tipos de protema M.

En una realizacion de la invencion, los polisacaridos bacterianos son de longitud completa, purificandose polisacaridos nativos. En una realizacion alternativa de la invencion se mide el tamano de los polisacaridos entre 2 y 20 veces, preferentemente 2-5 veces, 5-10 veces, 10-15 veces o 15-20 veces, de tal forma que los polisacaridos son

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mas pequenos en tamano para una mayor manejabilidad. Los oligosacaridos se usan en una realizacion preferida. Los oligosacaridos contienen tipicamente entre 2 y 20 unidades de repeticion.

Tales polisacaridos capsulares pueden ser no conjugados o conjugados con una protema transportadora como por ejemplo toxoide tetanico, fragmento C del toxoide tetanico, toxoide difterico, CRM197, pneumolisina, Protema D (US6342224). La toxina tetanica, toxina difterica y la pneumolisina se detoxifican por mutacion genetica y/o preferentemente por tratamiento qmmico.

El conjugado de polisacarido se puede preparar por cualquier tecnica de acoplamiento conocida. Por ejemplo, el polisacarido se puede acoplar a traves de una union tioeter. Este procedimiento de conjugacion se basa en la activacion del polisacarido con tetrafluoroborato de 1 -ciano-4-dietilaminopiridinio (CDAP) para formar un ester de cianato. El polisacarido activado puede acoparse por lo tanto directamente o a traves de un grupo espaciador a un grupo amino a la protema transportadora. Preferentemente, el ester de cianato se acopla con hexanodiamina y el polisacarido aminoderivatizado se conjuga con la protema transportadora usando qmmica de heteroligacion, requiriendo la formacion de la union tioeter. Tales conjugados se describen en la solicitud publicada del PCT WO 93/15760 Uniformed Services University.

Los conjugados se pueden preparar tambien por procedimientos de aminacion reductiva directa como se describe en los documentos US 4365170 (Jennings) y US 4673574 (Anderson). Se describen otros procedimientos en los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508.

Un procedimiento adicional requiere el acoplamiento de un polisacarido activado con bromuro de cianogeno derivatizado con azida de acido adfpico (ADH) con la protema transportadora por condensacion de carbodiimida (Chu C. y col Infect. Immunity, 1983 245 256).

Los antfgenos proteicos de neumococo son aquellas protemas de Neumococo que quedan expuestas en la superficie externa del neumococo (capaz de ser reconocido por un sistema inmune del huesped durante al menos parte del ciclo vital del neumococo), o son protemas que el neumococo secreta o libera. De la forma mas preferida, la protema es una toxina, adhesina, transductor de senales de 2 componentes o lipoprotema de Streptococcus pneumoniae o fragmentos de los mismos. Particularmente las protemas preferidas incluyen, pero no se limitan a: pneumolisina (preferentemente detoxificada por tratamiento qmmico o mutacion) [Mitchell y col. Nucleic Acid Res. 1990 Jul 11; 18 (13):4010 “Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”, Mitchell y col. Biochim Biophys Acta 1989 Jan 23; 1007 (1):67-72 “Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.”, WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton y col), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA y variantes de delecion transmembrana de la misma (US 5804193 - Briles y col); PspC y variantes de delecion transmembrana de la misma (WO 97/09994 - Briles y col); PsaA y variantes de delecion transmembrana de la misma (Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec; 64 (12) :5255-62 “Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); protemas de union a colina de neumococo y variantes de delecion transmembrana de las mismas; CbpA y variantes de delecion transmembrana de la misma (WO 97/41151; WO 99/51266); gliceraldefndo-3-fosfato-deshidrogenasa (Infect. Immun. 1996 64:3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato y col. FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14); protema de tipo M, (EP 0837130) y adhesina 18627, (EP 0834568). Los antfgenos proteicos de neumococo preferidos adicionales son aquellos que se describen en el documento WO 98/18931, particularmente aquellos seleccionados en los documentos WO 98/18930 y PCT/US99/30390.

Las protemas de Neisseria preferidas para ser formuladas con la composicion inmunogenica de la invencion incluyen TbpA (WO 93/06861; EP 586266; WO 92/03467; US 5912336), TbpB (WO 93/06861; EP 586266), Hsf (WO 99/31132), NspA (WO 96/29412), Hap (PCT/EP 99/02766), PorA, PorB, OMP85 (tambien conocido como D15) (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP 99/03603), PldA (PCT/EP 99/06718), FrpB (WO 96/31618 ver SEQ ID n.° 38), FrpA o FrpC o una parte conservada en comun a ambas de al menos 30, 50, 100, 500, 750 aminoacidos (WO 92/01460), LbpA y/o LpbB (PCT/EP 98/05117; Schryvers y col Med. Microbiol. 1999 32:1117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP 99/05989), lipo02 (PCT/EP 99/08315), MltA (WO 99/57280) y ctrA (PCT/EP 00/00135). Las protemas de Neisseria se anaden preferentemente en forma de protemas purificadas como parte de una preparacion de membranas externas.

La vacuna se formula preferentemente con antfgenos que proporcionan proteccion contra una o mas infecciones por Difteria, Tetanos y Bortedella pertussis. En cuanto al componente de pertusis, se pueden matar B. Pertussis de celula completa (Pw) o pertusis acelulares (Pa) los cuales contienen al menos (preferentemente 2 o hasta 3) a partir de PT, FHA y pertactina de 69 kDa. Otras vacunas acelulares contienen tambien aglutinogenos como por ejemplo Fim 2 y Fim 3, y estas vacunas se contemplan tambien para uso en la invencion. Tfpicamente, los antigenos que proporcionan proteccion contra Difteria y Tetanos son el toxoide difterico y el toxoide tetanico. Los toxoides son toxinas inactivadas qmmicamente (por ejemplo, despues de un tratamiento con formaldefndo), o toxinas inactivadas por la introduccion de una o mas mutaciones puntuales.

Alternativamente, el lfquido altamente viscoso de la invencion se puede proporcionaren forma de kit con el vidrio del lfquido altamente viscoso en un recipiente y DTPa y DTPw en otro recipiente. Tales kits pueden comprender por ejemplo una jeringa de doble camara con los componentes secado y lfquido contenidos en la misma jeringa pero en diferentes camaras. El componente secado se reconstituye luego con la vacuna lfquida inmediatamente anterior a la

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inyeccion en forma de una vacuna unica. De esta forma, por ejemplo, la composicion de Kquido altamente viscoso de la invencion se reconstituye con la vacuna lfquida de DTPa DTPw (preferentemente extemporaneamente) y se administra en forma de una vacuna unica. La vacuna de DTPa o DTPw va acompanada tfpicamente de adyuvante al menos en parte con hidroxido de aluminio (por ejemplo vacunas Infanrix® y Tritanrix® de GlaxoSmithKline Biologicals S.A.).

La vacuna puede comprender opcionalmente tambien uno o mas antigenos que pueden proteger al huesped contra Haemophilus influenzae no tipificables, RSV y/o uno o mas antigenos que pueden proteger a un huesped contra el virus de la gripe.

Antfgenos proteicos preferidos de H. influenzae no tipificables incluyen protema Fimbrina (US 5766608) y fusiones que comprenden peptidos (por ejemplo Fusion LB1) (US 5832464-Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, protema D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap y D 15.

Los antigenos del virus influenza preferidos incluyen virus completos, vivos o activados, virus de la gripe partido, crecido en huevos o en celulas MDCK o celulas Vero o virosomas de la gripe completos (como se describe en R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o protemas purificadas o recombinantes de los mismos, como por ejemplo protemas HA, NP, NA o M o combinaciones de las mismas.

Los antigenos del VSR (virus sincitial respiratorio) preferidos incluyen la glicoprotema F, la glicoprotema G, la protema HN, la protema M o derivados de las mismas.

Se debena apreciar que las composiciones antigenicas de la invencion pueden comprender uno o mas polisacaridos capsulares a partir de una unica especie de bacteria. Las composiciones antigenicas pueden comprender tambien polisacaridos capsulares derivados a partir de una o mas especies de bacterias.

Composiciones y vacunas inmunogenicas

Un aspecto adicional de la invencion incluye composiciones o vacunas inmunogenicas que comprenden el lfquido altamente viscoso obtenido mediante el procedimiento de la invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable

Preferentemente, la composicion o vacuna inmunogenica contiene una cantidad de un adyuvante suficiente para mejorar la respuesta inmune al inmunogeno. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio, mezclas de escualeno (SAF-1), peptido de muramilo, derivados de saponina, preparaciones de paredes celulares de micobacterias, lfpido monofosfonlico A, derivados del acido micolico, agentes tensoactivos de copolfmeros en bloques no ionicos, Quil A, subunidad B de la toxina del colera, polifosfazeno y derivados y complejos inmunoestimulantes (ISCOM) como por ejemplo aquellos que se describen en Takahashi y col. (1990) Nature 344:873-875. Se pueden usar componentes mitogenicos del adyuvante de Freund para la produccion de anticuerpos en animales.

Como con las composiciones o vacunas inmunogenicas, las cantidades de inmunogenos inmunologicamente efectivas se deben determinar empmcamente. Los factores que se deben considerar incluyen la inmunogenicidad, si el inmunogeno se complejara o no con, o se unira covalentemente a un adyuvante o a una protema transportadora u a otro vehmulo, ruta de administraciones y el numero de dosis inmunizantes que se van a administrar. Tales factores se conocen en la tecnica de la vacuna y esta bien dentro de la habilidad de los inmunologos hacer tales determinaciones sin experimentacion indebida.

El principio activo puede estar presente en concentraciones que vanan en el lfquido altamente viscoso o vacuna de la invencion. Tfpicamente, la concentracion minima de la sustancia es una cantidad necesaria para lograr su uso propuesto, mientras que la concentracion maxima es la cantidad maxima que permanecera en disolucion u homogeneamente suspendida dentro de la mezcla inicial. Por ejemplo, la cantidad minima de un agente terapeutico es preferentemente una que proporcionara una unica dosis terapeuticamente eficaz. Para sustancias bioactivas, la concentracion minima es una cantidad necesaria para bioactividad en la reconstitucion, y la concentracion maxima es al punto al cual no se puede mantener una suspension homogenea. En el caso de unidades de dosis unicas, la cantidad es aquella de una unica aplicacion terapeutica. Generalmente, se espera que cada dosis comprendera de 1 a 100 |ig de antfgeno proteico, preferentemente de 5 a 50 |ig y de la forma mas preferible de 5 a 25 |ig. Las dosis preferidas de polisacaridos bacterianos son de 10 a 20 |ig, de 10 a 5 |ig, de 5 a 2,5 |ig o de 2,5 a 1 |ig. La cantidad preferida de la sustancia vana de unas sustancias a otras, pero es facilmente determinable por uno de los expertos en la materia.

Liquido altamente viscoso que comprende un principio activo

Otro aspecto de la invencion es un lfquido altamente viscoso que comprende un principio activo, el cual es obtenible preferentemente o se obtiene usando un procedimiento de la invencion. El principio activo retiene preferentemente su actividad y/o antigenicidad y/o inmunogenicidad despues del secado usando el procedimiento de la invencion y posterior reconstitucion. Preferentemente se retiene al menos un 40, 50, 60, 70, 80, 90 o un 95 % de la actividad del principio activo, antigenicidad o inmunogenicidad.

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Los Kquidos altamente viscosos de la invencion comprenden preferentemente un poliol que forma vidrio seleccionado del grupo que consiste en glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano.

El lfquido altamente viscoso de la invencion puede contener cualquiera de los principios activos que comprenden una vacuna que comprenden un virus descrito anteriormente. El principio activo conservado por el lfquido altamente viscoso puede comprender un sistema biologico, por ejemplo, virus. Puede comprender alternativamente o ademas moleculas, por ejemplo protemas, peptidos, aminoacidos, acidos polinucleicos, oligonucleotidos, polisacaridos, oligosacaridos, conjugados polisacarido-protema, conjugados oligosacarido-protema. Puede comprender tambien combinaciones que comprenden dos o mas de los principios activos anteriores.

Las realizaciones preferidas incluyen un lfquido altamente viscoso obtenido por un metodo de la invencion en el que el principio activo es o comprende una vacuna o componente de vacuna. Los componentes preferidos de la vacuna se describen anteriormente e incluyen VPI, mas preferentemente VPI y polisacaridos bacterianos, preferentemente polisacaridos u oligosacaridos de Haemophilus influenzae b y Neisseria meningitidis A, C W e Y.

Los componentes de vacuna preferidos incluyen VPI (una mezcla inactivada de cepas del virus de la polio). Preferentemente, el VPI se combina con uno o mas polisacarido PRP de Hib y/o polisacaridos de meningococo A, C W y/o Y y/o polisacaridos de neumococo (como se ha descrito anteriormente), mas preferentemente VPI y Hib; VPI y Men C; VPI, Hib y Men C; Hib y Men C; VPI y Men A y C; Hib y Men A y C; VPI, Hib, Men A y C; Hib, Men C e Y; o VPI, Hib, Men C e Y.

En las composiciones anteriores donde se usan polisacaridos, tambien se pueden usar polisacaridos (como se ha definido anteriormente).

Aunque estas composiciones pueden ir acompanadas de adyuvante (como se ha descrito anteriormente), preferentemente no van acompanadas de adyuvante, o preferentemente, no comprenden sales de aluminio.

Los polisacaridos u oligosacaridos se conjugan preferentemente con un peptido o protema transportadora que comprende epttopos de linfocitos T auxiliares (como se ha descrito anteriormente).

El lfquido altamente viscoso de la invencion se combina preferentemente con otros antfgenos en una vacuna de combinacion, la cual se diseca opcionalmente, o preferentemente formulaciones lfquidas, las cuales se pueden usar para reconstituir los componentes secados. Los antfgenos preferidos para ser combinados con los contenidos del recipiente de la invencion incluyen uno o mas de toxoide difterico, toxoide tetanico, pertusis de celula completa (Pw), pertusis acelulares (Pa) (como se ha descrito anteriormente), antfgeno de superficie de Hepatitis B, polisacaridos de neumococo, protemas de neumococo, polisacaridos de neiseria, protemas de neiseria. Los polisacaridos bacterianos se pueden conjugar con una protema transportadora como por ejemplo el toxoide tetanico, fragmento del toxoide tetanico, toxoide difterico, CRM197, pneumolisina, Protema D (US 6342224) como se ha descrito anteriormente.

Un aspecto adicional de la invencion es un procedimiento para elaborar una vacuna que comprende la etapa de reconstitucion del lfquido altamente viscoso en una solucion acuosa. En una realizacion preferida, la solucion acuosa comprende los antfgenos toxoide difterico, toxoide tetanico y Pertusis (acelular o celula completa) y adicionalmente comprende ademas antfgeno de superficie de Hepatitis B. La vacuna de DTP va opcionalmente al menos en parte acompanada de adyuvante con una sal de aluminio, preferentemente hidroxido de aluminio o fosfato de aluminio.

Otra realizacion de la invencion es un kit que comprende el lfquido altamente viscoso de la invencion contenido en un primer recipiente y una vacuna que comprende DTP lfquido (acelular o celula completa) en un segundo recipiente. Puede usarse una jeringa de doble camara como se ha descrito anteriormente.

Se proporcionan divulgaciones adicionales dentro de los siguientes parrafos numerados:

Parrafo 1. Un procedimiento para conservar un agente activo que comprende las etapas de:

a) preparar una muestra para conservacion disolviendo/suspendiendo un principio activo en una solucion de un agente estabilizante;

b) someter la muestra para conservacion a unas condiciones de temperatura y presion tales que la muestra para conservacion pierda disolvente por evaporacion, sin congelacion o burbujeo asociado a la formacion de espuma, para formar un lfquido viscoso.

Parrafo 2. El procedimiento del parrafo 1, que comprende ademas una etapa de:

c) someter ademas la muestra para conservacion a unas condiciones de temperatura y presion tales que el lfquido viscoso se seque para formar un lfquido altamente viscoso.

Parrafo 3. El procedimiento del parrafo 1 o 2 en el que la presion se reduce a 2000 Pa o por debajo durante la etapa b).

Parrafo 4. El procedimiento de los parrafos 1-3 en el que la temperatura externa a la muestra para conservacion

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esta entre 5 °C y 37 °C durante la etapa b).

Parrafo 5. El procedimiento de los parrafos 2-4 en el que la temperatura externa a la muestra para conservacion esta entre 5 °C y 37 °C durante la etapa c).

Parrafo 6. El procedimiento de los parrafos 2-5 en el que la temperatura externa a la muestra para conservacion es mas alta durante la etapa c) que lo que lo es en la etapa b).

Parrafo 7. El procedimiento del parrafo 6 en el que la temperatura externa a la muestra para conservacion se aumenta por encima de 20 °C durante la etapa c).

Parrafo 8. El procedimiento de los parrafos 2-7 en el que la presion se reduce en la etapa c) comparado con la presion durante la etapa b).

Parrafo 9. El procedimiento del parrafo 8, en el que la presion se reduce a 100 Pa o por debajo durante la etapa

c).

Parrafo 10. El procedimiento de los parrafos 1-9 en el que la etapa b) se completa en menos de 4 horas.

Parrafo 11. El procedimiento de los parrafos 2-10 en el que las etapas b) y c) se completan en menos de 12 horas.

Parrafo 12. El procedimiento de los parrafos 1-11 en el que el agente estabilizante comprende un poliol formador de vidrio, seleccionado del grupo que consiste en glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano.

Parrafo 13. El procedimiento del parrafo 12 en el que el agente estabilizante es sacarosa.

Parrafo 14. El procedimiento de los parrafos 12-13 en el que la concentracion de agente estabilizante es menos de un 15 %.

Parrafo 15. El procedimiento de los parrafos 1-14 en el que la muestra para conservacion comprende rojo de fenol.

Parrafo 16. El procedimiento de los parrafos 1-15, en el que la muestra para conservacion se seca en un recipiente con una superficie interior repelente de disolvente.

Parrafo 17. El procedimiento de los parrafos 1-16 en el que el principio activo comprende una molecula que se selecciona a partir del grupo que consta de protema, peptido, aminoacido, polinucleotido, oligonucleotido, polisacarido, oligosacarido, conjugado polisacarido-protema y conjugado oligosacarido-protema.

Parrafo 18. El procedimiento de los parrafos 1-16 en el que el principio activo comprende un sistema biologico que se selecciona a partir del grupo que consta de celulas, composiciones subcelulares, bacterias, componentes virales y partfculas de tipo vmco.

Parrafo 19. El procedimiento del parrafo 18, en el que el principio activo comprende VPI (virus de la polio inactivado).

Parrafo 20. El procedimiento de los parrafos 18-19 en el que el principio activo comprende un polisacarido u oligosacarido de Hib (Haemophilus influenzae de tipo b)

Parrafo 21. El procedimiento de los parrafos 18-20 en el que el principio activo comprende un polisacarido u oligosacarido de Neisseria meningitidis C.

Parrafo 22. El procedimiento de los parrafos 1-21 en el que el principio activo comprende una vacuna.

Parrafo 23. Un lfquido altamente viscoso que comprende un principio activo en el que se conserva la antigenicidad o actividad del principio activo.

Parrafo 24. El lfquido altamente viscoso del parrafo 23 que puede obtenerse por el procedimiento de las reivindicaciones 1-22.

Parrafo 25. El lfquido altamente viscoso del parrafo 23 o 24 que comprende un poliol formador de vidrio seleccionado a partir de un grupo que consta de glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano.

Parrafo 26. El lfquido altamente viscoso del parrafo 25 en el que el poliol formador de vidrio es sacarosa.

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Parrafo 27. El Kquido altamente viscoso de los parrafos 23-26, en el que el principio activo comprende una molecula que se selecciona a partir del grupo que consta de protema, peptido, aminoacido, polinucleotido, oligonucleotido, polisacarido, oligosacarido, conjugado polisacarido-protema y conjugado oligosacarido protema.

Parrafo 28. El lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-27, en el que el principio activo comprende un sistema biologico que se selecciona a partir del grupo que consta de celulas, composiciones subcelulares, bacterias, componentes vmcos y partmulas de tipo vmico.

Parrafo 29. El lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-28 en el que el principio activo comprende una vacuna.

Parrafo 30. El lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-29 en el que el principio activo comprende VPI.

Parrafo 31. El lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-30 en el que el principio activo comprende un polisacarido u oligosacarido bacteriano.

Parrafo 32. El lfquido altamente viscoso del parrafo 31 en el que el principio activo comprende un polisacarido u oligosacarido de Hib (Haemophilus Influenzae b), preferentemente conjugado con una protema transportadora.

Parrafo 33. El lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-32 en el que el principio activo comprende un polisacarido u oligosacarido del serogrupo C de Neisseria meningitidis, preferentemente conjugado con una protema transportadora.

Parrafo 34. El lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-33 contenido dentro de un recipiente con una superficie interior repelente de disolvente.

Parrafo 35. Una composicion o vacuna inmunogenica que comprende el lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-24 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Parrafo 36. Un procedimiento para elaborar una vacuna que comprende la etapa de reconstituir el lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-35 en una solucion acuosa.

Parrafo 37. El procedimiento del parrafo 36, en el que la solucion acuosa comprende antfgeno difterico, antfgeno tetanico y antfgenos de Pertusis (acelular o celulas completas).

Parrafo 38. El procedimiento del parrafo 37 donde la vacuna de DTP esta al menos en parte acompanada de adyuvante con hidroxido de aluminio.

Parrafo 39. Un kit que comprende el lfquido altamente viscoso de los parrafos 23-34 contenido en un primer recipiente y un componente de vacuna lfquido en un segundo contenedor.

Ejemplos

Los ejemplos posteriores se llevan a cabo usando tecnicas convencionales que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la materia, excepto donde se describa en detalle de otra manera. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invencion.

Ejemplol. Establecimiento de las condiciones de congelacion

Las muestras se elaboraron disolviendo sacarosa en agua para dar soluciones al 1 %, 5 %, 10 % y a un 20 %. Las muestras se pusieron en un secador por congelacion Heto Drywinner 8-85 en el que la temperatura en la bandeja se puede regular hasta a 1 °C, la temperatura final del condensador es -85 °C, la presion se regula con una valvula de sangrado y 6 termopares estan disponibles para medirla temperatura del producto. La temperatura fijada en la bandeja se mantuvo a 15 °C durante todo el procedimiento. La presion se redujo inicialmente a 20 kPa y se mantuvo a este nivel durante 10 minutos antes de reducir la presion adicionalmente a 5000 Pa, 500 Pa, 250 Pa, 75 Pa, 40 Pa y 20 Pa. Cada nivel de presion se mantuvo durante 20 minutos para permitir que temperatura se equilibrase y se leyo la temperatura de la muestra usando un termopar. Los termopares se pusieron unidos a las muestras con diferentes concentraciones de sacarosa y las temperaturas registradas en la tabla 1 son valores medios de las temperaturas.

Resultados

Todas las muestras se congelaron entre 166 y 111 Pa, sin tener en cuenta la concentracion de sacarosa presente. Las temperaturas medidas a diferentes presiones estuvieron muy proximas a aquellas predichas a partir de la curva de triple punto. Por lo tanto la presencia de sacarosa no tiene un gran efecto sobre la temperatura de las muestras a diferentes presiones.

Para evitar la congelacion de la muestra, la presion se debena mantener por encima de 200 Pa para una temperatura fijada en la bandeja de 15 °C. A temperaturas inferiores la presion se debena mantener a un nivel mas

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alto mientras que el uso de una temperatura mas alta permitina que la presion se redujera aun mas sin que las muestras se congelasen.

Tabla 1

Presion

Temperatura medida Temperatura teorica Lfquido/congelado

105 Pa

15 °C lfquido

5000 Pa

15 °C lfquido

500 Pa

1 °C 1 °C lfquido

250 Pa

-5 °C -7 °C lfquido

75 Pa

-21 °C -21 °C congelado

40 Pa

-22 °C -27 °C congelado

20 Pa

-27 °C -32 °C congelado

Ejemplo 2. Procedimiento para secar sin congelar y sin formacion de espuma

Se prepararon muestras para conservacion que contienen un 5 %, 10 %, 15 % y un 25 % de sacarosa y se anadieron a viales. Las muestras se pusieron en un secador por congelacion a una temperatura fijada de 15 °C durante todo el procedimiento. La presion se redujo inicialmente a 20 kPa y se mantuvo a este nivel durante 10 minutos para permitir la desgasificacion antes de reducir aun mas la presion. La presion se redujo aun mas a 800 Pa durante dos a tres horas, tiempo durante el cual los termopares del interior de las muestras mostraron que la temperatura de la muestra se redujo a 4 °C debido al enfriamiento evaporativo. Despues de 2 a 3 horas, la temperatura de las muestras volvio a 15 °C, indicando que la evaporacion en estas condiciones de temperatura y presion era practicamente completa. Durante esta etapa del procedimiento, la muestra no ebullo para formar espuma ni se congelo, de tal forma que un principio activo dentro de la muestra queda expuesto a la menor tension (estres) posible.

Se alcanzo un secado de las muestras aun mayor al reducir la presion aun mas a 10 Pa mientras se conservaba la temperatura fijada a 15 °C. Estas condiciones se mantuvieron durante unas 10 a 16 horas adicionales. Durante esta fase, la temperatura de la muestra permanecio a 15 °C ya que la velocidad de evaporacion era lenta. Tuvo lugar un secado adicional y la muestra resultante tema un aspecto solido. Si la muestra se colocaba en su lado, los contenidos de la muestra descendieron muy lentamente, durante un penodo de dfas, mostrando que la muestra es un vidrio lfquido de elevada viscosidad. La Figura 1 muestra el aspecto del lfquido de elevada viscosidad.

Ejemplo 3. Retencion de inmunogenicidad frente al VPI despues del secado sin congelacion o formacion de espuma.

Tales muestras no se han sometido a tensiones asociadas con el burbujeo que acompana a la formacion de espuma o congelacion. Los experimentos se llevaron a cabo para determinar si este procedimiento produda un elevado nivel de retencion de antigeno cuando se usaba para secar VPI.

Se llevaron a cabo tres experimentos por separado en los que se resuspendio el VPI en una solucion acuosa con un 10 % de sacarosa o un 10 % de trehalosa en forma de agente estabilizador. Las muestras se colocaron en viales recubiertos de silicona, los cuales se colocaron en un secador por congelacion Heto Drywinner 8-85 y la temperatura se ajusto a 15 °C. La presion se redujo inicialmente a 3500 Pa para desgasificar la muestra. Despues de10 minutos, la presion se redujo aun mas a 800 pa y se mantuvo a este nivel durante dos horas. Durante este penodo la temperatura fijada se mantuvo a 15 °C y se controlo la temperatura dentro de la muestra. Como el agua se evaporo de la muestra, la temperatura cayo a 4 °C pero hacia el final de las dos horas la temperatura volvio a los 15 °C ya que la velocidad de evaporacion disminuyo. En estas condiciones no se dieron ni burbujeo ni formacion de espuma. La presion se redujo entonces aun mas a 10 Pa, y se mantuvieron estas condiciones durante 16 horas mas en los dos primeros experimentos y durante 10 horas mas en el tercer experimento.

Las muestras se reconstituyeron en agua y se uso un ELISA para calcular la retencion de antigenicidad de las tres cepas del virus de la polio. El anticuerpo monoclonal contra el VPI de tipo 3 se uso en un ELISA para calcular el grado de retencion de antfgeno en la muestra reconstituida secada por congelacion, comparado con una muestra referencia que no se habfa congelado. Los resultados se presentaron como porcentaje de la lectura dada para un ejemplo, el cual no habfa sufrido un procedimiento de secado.

Resultados

Las muestras secadas teman un aspecto solido, sin embargo, paredan estar en forma de un lfquido/vidrio altamente viscoso ya que, durante un penodo de dfas, la muestra secada era capaz de fluir si el recipiente se invertfa.

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Tabla 2. Retencion de antiaeno VPI de tipo 3 como se determina por ELISA usando un anticuerpo monoclonal

(secado sin conaelacion o formacion de espuma).

Formulacion

1er experimento (ciclo de 18 horas) 2° experimento (ciclo de 18 horas) 3er experimento (ciclo e 12 horas)

Sin azucar

0 %

2,5 % de sacarosa

0 %

10 % de sacarosa

75 % 78 % 91 %

10 % de trehalosa

82 % 79 % 93 %

Estos niveles de retencion de antigeno VPI de tipo 3 se comparan muy favorablemente con los resultados de secado por conaelacion mostrados posteriormente donde generalmente se encontraron valores muy bajos en el mismo formato de ELISA cuando se uso un anticuerpo monoclonal contra el tipo 3.

Tabla 3. Retencion de antiaenos VPI de tipo 1, 2 y 3 como se determina por ELISA usando anticuerpos monoclonales y policlonales (secado por conaelacion).

Procedimiento de secado

Contenido en polioles ELISA-tipo 1/2/3 % Policlonal Monoclonal

Secado por conaelacion

3,15 % de sacarosa 46/49/58* 19/25/0

Secado por conaelacion

10 % de sacarosa 47/43/58 25/0/0

* El secado por conaelacion del experimento en presencia de un 3,15 % de sacarosa se repitio cinco veces y los resultados mostrados son de un experimento representativo

Ejemplo 4. Estabilidad de almacenamiento a largo plazo de VPI secado almacenado en forma de un liquido/vidrio altamente viscoso.

Se almaceno VPI secado usando el procedimiento que se describe en el Ejemplo 3 a 4 °C durante 9 meses. Las muestras se reconstituyeron en aaua con NaCl 150 mM y se uso un ELISA para calcular la retencion de antiaenicidad de las tres cepas del virus de la polio. Se usaron tres anticuerpos monoclonales, uno contra cada cepa, en ELISA separados para calcular el arado de retencion de antiaeno en la muestra almacenada reconstituida. Se habfa llevado a cabo un ELISA similar sobre muestras reconstituidas a partir del mismo lote previo al almacenamiento. Todos los resultados se compararon con una muestra referencia que no se habfa secado. Los resultados se presentan en forma de porcentaje de la lectura dada para una muestra, la cual no habfa sufrido un procedimiento de secado.

Resultados

Tabla 4. Retencion de antiaenos VPI despues del almacenamiento en forma de liquido viscoso durante 9 meses

Tratamiento

ELISA de Tipo 1 ELISA de Tipo 2 ELISA de Tipo 3

Secado/reconstituido No almacenado

72 % 75 % 88 %

Secado/reconstituido 9 meses a 4 °C

70 % 94 % 90 %

Por lo tanto, el VPI que se ha secado por el procedimiento que se describe en el Ejemplo 3 se almacena a 4 °C durante al menos 9 meses sin perdida de antiaenicidad.

Ejemplo 5. Comparacion de la inmunogenicidad in vivo de VPI despues del secado para formar un liquido altamente viscoso y reconstitucion comparada con el VPI no secado.

Se inocularon arupos de 10 ratas Wistar con varias diluciones de VPI, las cuales se habfan secado en presencia de sacarosa al 10 % para formar un lfquido altamente viscoso usando el procedimiento que se describe en el Ejemplo 2 y se reconstituyo. Se inocularon arupos adicionales de 10 ratas Wistar con muestras de referencia de VPI, las cuales se habfan preparado de la misma forma, pero no se habfan secado.

Despues de 21 dfas, se tomaron los sueros de todas las ratas y los sueros se sometieron a ensayo en ensayos de inmunoprecipitacion separados usando virus de la polio de Tipo 1, Tipo 2 y Tipo 3.

Los resultados se muestran en la tabla 5 que contiene: - a) el numero de ratas que responden para cada dilucion de VPI, b) la DE50, la cual es la dosis que se requiere para aseaurar que se seroconvierte el 50 % de las ratas como se ha calculado por el ensayo de inmunoprecpitacion y c) la potencia relativa del VPI secado y reconstituido comparado

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con el VPI de referencia no secado.

Tabla 5. Inmunogenicidad de VPI despues de secar para formar un liquido de alta viscosidad (JLE017/05) y reconstitucion comparado con el VPI de referencia no secado (JLE097)

Muestra

Numero de ratas que responden DE50 PR Potencia relativa

No diluida 1/1,25 1/3,125 1/7,81

JLE017/05

Tipo 1

10 9 6 5 6,37 0,956

Tipo 2

6 4 3 3 7,14 0,825

Tipo 3

6 8 2 1 18,18 1,051

JLE097

Tipo 1

10 10 10 7 3,33 1,120

Tipo 2

8 6 5 2 3,12 0,951

Tipo 3

7 6 4 1 16,91 1,172

Referencia

Tipo 1

10 8 4 6,37

Tipo 2

7 5 2 2,93

Tipo 3

5 3 0 22,57

JLE017/05 es un lote de VPI que se seco para formar un lfquido altamente viscoso y posteriormente se reconstituyo. El JLE097 es la referencia no secada.

La tabla 5 muestra que el numero de ratas que responden inoculadas con cada dilucion de VPI es similar entre los dos lotes de VPI secado y reconstituido y la muestra de referencia no secada. En general, el VPI de Tipo 1 mostro la mejor respuesta inmune, mostrando el Tipo 2 una respuesta inmune en apenas unas pocas ratas. El Tipo 3 mostro la respuesta inmune mas debil.

El procedimiento de secado para formar un lfquido altamente viscoso no altera la capacidad del VPI para dar anticuerpos por inmunoprecipitacion in vivo. Una lectura de potencia relativa (PR) de 1,0 indica que la muestra desencadena una respuesta equivalente a la de la muestra de referencia. Ambas muestras secadas producen lecturas de PR de casi 1,0 para los tres tipos del virus de la polio, indicando que el procedimiento de secado no afecta a la capacidad de la muestra para desencadenar una respuesta inmune.

Ejemplo 6. Efecto del secado para formar un liquido altamente viscoso usando sacarosa o trehalosa a modo de agente estabilizante sobre la capacidad del VPI para desencadenar una respuesta inmune por inmunoprecipitacion in vivo

Se inocularon grupos de 10 ratas Wistar con VPI, el cual se habfa secado en presencia de sacarosa al 10 % o trehalosa al 10 % como se describe en el Ejemplo 2, y luego se reconstituyo. Se inocularon grupos adicionales de 10 ratas Wistar con una cantidad equivalente de VPI que no se habfa secado, como muestras de referencia.

Despues de 21 dfas, se recogieron los sueros de todas las ratas y se uso un ensayo de inmunoneutralizacion, como se describe en el Ejemplo 5, para calcular la cantidad de anticuerpo inmunoneutralizante que se habfa liberado contra el virus de la polio de Tipo 1, Tipo 2 y Tipo 3.

Las potencias relativas se calcularon para cada muestra comparando la respuesta inmune con la desencadenada por la muestra de referencia no secada.

Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Comparacion de secado en sacarosa y en trehalosa

Numero de lote

Azucar presente Potencia relativa in vivo Tipo 1/Tipo 2/Tipo 3 % de humedad de Karl Fischer Duracion (horas)

JLE017

10 % de trehalosa 0,95/0,82/1,05 n. d. 7

31C03/01

10 % de sacarosa 0,69/1,20/0,97 4,6 % 18

31C03/02

10 % de trehalosa 0,60/0,94/0,9 11,5 % 18

03D02/01

10 % de sacarosa 0,74/1,05/0,96 5,9 % 12

03D02/02

10 % de trehalosa 0,58/0,98/1,06 10,6 % 12

La cantidad de agua que queda en las muestras fue inferior cuando se uso sacarosa como agente estabilizante con una humedad remanente de aproximadamente un 5 % comparado con aproximadamente un 10 % cuando se usa trehalosa como agente estabilizante medido por un analizador de humedad culombiometrico de Karl Fischer.

Tanto la trehalosa como la sacarosa resultaron efectivos al estabilizar el VPI durante el procedimiento de secado, de 5 tal forma que el VPI reconstituido dio lecturas de potencia relativa que se aproximaban a 1,0 para la mayona de los diferentes tipos de virus de la polio. Las potencias relativas resultaron particularmente buenas para el virus de la polio de Tipo 3, el cual pierde su inmunogenicidad relativamente con facilidad.

Ejemplo 7: Medida de la humedad por Karl Fischer

El analisis se llevo a cabo en un analizador de Karl Fischer (Aqua 30.00 - Elektrochemie Halle). La muestra se peso 10 fuera y se coloco en el horno a una temperatura de 80 °C. La muestra se desplazo con nitrogeno gas y luego se anadio a un reactivo hidranal (Riedel de Hahn) para llevar a cabo el analisis por culombiometna.

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para conservar un principio activo que comprende las etapas de:

   a) preparar una muestra para conservacion disolviendo/suspendiendo un principio activo en una solucion de un agente estabilizante;

   b) someter la muestra para conservacion a una condicion de temperatura entre 5 °C y 37 °C y unas condiciones de presion por debajo de 2 kPa de manera que la muestra para conservacion pierda disolvente por evaporacion, sin congelacion o burbujeo implicado en la formacion de espuma, para formar un Kquido viscoso, en el que un lfquido viscoso es el producto de la fase primaria de la retirada del disolvente;

   c) someter ademas la muestra para conservacion a una condicion de temperatura entre 5 °C y 37 °C y tales condiciones de presion de manera que que el lfquido viscoso se seque para formar un lfquido altamente viscoso en el que la presion se reduce en la etapa c) comparado con la presion durante la etapa b),

   en el que el agente estabilizante comprende un poliol formador de vidrio, seleccionado del grupo que consiste en glucosa, maltulosa, iso-maltulosa, lactulosa, sacarosa, maltosa, lactosa, sorbitol, iso-maltosa, maltitol, lactitol, palatinit, trehalosa, rafinosa, estaquiosa, melezitosa y dextrano, en el que la concentracion del agente estabilizante usado esta entre el 5 % y el 50 % en peso/volumen, en el que el lfquido altamente viscoso tiene un contenido de disolvente menor de o igual al 15 % (p/p) y en el que el principio activo comprende una vacuna que comprende un virus.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la concentracion de agente estabilizante es menos del 15 %.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que el principio activo comprende VPI (virus de la polio inactivado).
4. 4. Un lfquido altamente viscoso que comprende un principio activo en el que se conserva la antigenicidad o actividad del principio activo, que se puede obtener por el procedimiento de las reivindicaciones 1-3, en el que el lfquido altamente viscoso tiene un contenido de disolvente menor de o igual al 15 % (p/p) y en el que el principio activo comprende una vacuna que comprende un virus.
5. 5. Una composicion inmunogenica o vacuna que comprende el lfquido altamente viscoso de la reivindicacion 4 y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
6. 6. Un procedimiento de fabricacion de una vacuna que comprende la etapa de reconstituir el lfquido altamente viscoso de la reivindicacion 4 en una solucion acuosa.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 6, en el que la solucion acuosa comprende antfgeno difterico, antfgeno tetanico y antfgenos de Pertusis (acelular o celulas completas).
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que la vacuna de DTP esta al menos en parte acompanada de adyuvante con hidroxido de aluminio.
9. 9. Un kit que comprende el lfquido altamente viscoso de la reivindicacion 4 mantenido en un primer recipiente y un componente de vacuna lfquido en un segundo recipiente.