ES2649840T3 - Uricasa tetramérica aislada - Google Patents

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ES2649840T3 ES10180672.7T ES10180672T ES2649840T3 ES 2649840 T3 ES2649840 T3 ES 2649840T3 ES 10180672 T ES10180672 T ES 10180672T ES 2649840 T3 ES2649840 T3 ES 2649840T3
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Michael S. Hershfield
Susan J. Kelly
Mark G. P. Saifer
Merry R. Sherman
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Mountain View Pharmaceuticals Inc
Duke University
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Abstract

Una disolución que comprende uricasa purificada, en la que al menos 90% de la uricasa presente en la disolución está en una forma tetramérica.

Description

imagen1
imagen2
et al., (1981). Las publicaciones de 1981 de Abuchowski et al. y Chen et al., indican que para reducir significativamente la inmunogenia de la uricasa, el PEG debe combinarse con aproximadamente el 60 % de los residuos de lisina disponibles (tabla 1). En la primera publicación en que se dio a conocer la eliminación de la inmunorreactividad no se reveló el exceso de combinación de PEG, la actividad uricolítica residual o la naturaleza 5 del enlace PEG-proteína. Veronese, FM, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society.
La conjugación de PEG con una pequeña fracción de residuos de lisina en uricasa redujo pero no eliminó su inmunorreactividad en el caso de los animales experimentales. Tsuji, J, et al., (1985) Int J Immunopharmacol 7:725730 (28-45 % de los grupos amino acoplados); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem Pharm Bull 38:2053-2056 (38 % de
10 los grupos amino acoplados). Las actividades uricolíticas residuales de los aductos correspondientes comprende desde 33 % (Tsuji, et al.) hasta el 60 % (Yasuda, et al.) de sus valores iniciales. Tsuji, et al. sintetizaron los conjugados de PEG-uricasa con PEG de 7,5 kDa y 10 kDa, además de PEG de 5 kDa. Todos los conjugados resultantes fueron de alguna manera inmunogénicos y antigénicos, si bien mostraban actividades enzimáticas notablemente reducidas (Tabla 1; figuras 1A-1B).
15 Se documentó que un preparado PEGilado de uricasa derivada de Candida utilis que se administró de manera segura dos veces a cinco seres humanos retuvo sólo el 11 % de su actividad inicial. Davis, et al., (1981). Varios años después, la uricasa modificada con PEG derivada de Arthrobacter protoformiae se administró cuatro veces a un paciente con linfoma avanzada e hiperuricemia severa. Chua, et al., (1988). Mientras que la activida residual de esta preparacion enzimatica no fue medida, Chua, et al., demostraron la ausencia de anticuerpos de antiuricasa en el
20 suero del paciente 26 días después de la primera inyección de PEG-uricasa, utilizando el ensayo inmunoenzimático (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay).
Como se resume en la tabla 1, estudios previos de uricasa PEGilada muestran que la actividad catalítica se reduce significativamente al combinar una cantidad suficiente de cadenas de PEG para reducir en un grado importante su inmunorreactividad. Además, la mayoría de los preparados anteriores de PEG-uricasa se sintetizaban utilizando el
25 PEG activado con cloruro de cianuro, un derivado de triazina (2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina) que introducía nuevos determinantes antigénicos, así como inducir anticuerpos en los conejos. Tsuji, et al., (1985).
TABLA 1: Características de las PEG-uricasas derivadas de estudios previos
Fuente de la uricasa
Enlace de acoplamiento Peso molecular del PEG (kDa) Porcentaje de lisinas con PEG añadido Actividad uricolítica residual (%) Antigenia o inmunogenia Comentarios Referencia
No revelada
Azida 0,7 (diol) No revelado No revelada No revelada Patente estadounidense 4,179,337
Candida utilis
Triazina (cloruro de cianuro) 5 % de “98”: 20 26 43 48 31 21 15 5 Antigenia con suero de conejo (% de la enzima no modificada) 70 % 6 % 0 0 Nishimura, H, et al., 1979
Candida utilis
Triazina PEG2 2 x 5 22 25 87 70 86 % 49 % Nishimura, H, et al., 1981
36
45 0
46
31 0
50
27 0
Candida utilis
Triazina 5 71 11 Cinco hombres toleraron dos inyecciones en 30 días. Davis, S, et al., 1981
Fuente de la uricasa
Enlace de acoplamiento Peso molecular del PEG (kDa) Porcentaje de lisinas con PEG añadido Actividad uricolítica residual (%) Antigenia o inmunogenia Comentarios Referencia
Candida
Triazina de 5 49 No revelada Inmunogenia Abuchowski, A,
utilis
acuerdo con similar en aves a et al., 1981
Chen, R H-L,
uricasa nativa
et al., 1981
Inmunogenia
61
No revelada negativa
Hígado
Triazina 5 37 60 Eliminación Chen et al., 1981
porcino
acelerada en
ratones
47
45 Eliminación
acelerada en
ratones
Eliminación
58
28 constante
(hemivida ca. 8
horas)
Candida
Triazina 5 57 23 Eliminación
utilis
constante (hemivida ca. 8 horas)
Candida
Triazina de 5 35 No revelada Inmunogenia Savoca, KV, et
utilis
acuerdo con reducida PEG en al., (1984) Int
Chen, et al.,
conejos. Arch Allergy Appl
1981
70 No revelada Immunol 75:58
67
Candida
Triazina 5 No revelado No revelada PEG-uricasa se Nishida, Y, et al.,
utilis
administró vía (1984) J Pharm
oral a pollo en
Pharmacol
liposomas (una
36:354-355
vez)
Candida
Triazina 5 44 9,4 Inmunogenicidad Tsuji, et al. 1985
utilis
7,5 45 7,8 reducida, pero positiva en
10
28 32 conejos. (Los
anticuerpos no
37
11 son para uricasa:
41
3, reaccionan en
cruzado con
45
7,3 PEG-dismutasa
de superóxido).
La antigenicidad
ensayada con
anticuerpos de
cobaya se redujo.
Arthrobact
No revelada 5 No revelado No revelada ELISA no detectó Chua, CC, et al.,
er
ningún anticuerpo 1988
protoformi
26 días después
ae
de la primera de las cuatro inyecciones de PEG-uricasa.
Fuente de la uricasa
Enlace de acoplamiento Peso molecular del PEG (kDa) Porcentaje de lisinas con PEG añadido Actividad uricolítica residual (%) Antigenia o inmunogenia Comentarios Referencia
Candida
Triazina PEG2 2x5 10 90 No revelada Yasuda, Y, et al.,
utilis
12 89 No revelada 1990
15
80 No revelada
21
70 No revelada
38
60 Se redujo un 75
% la antigenia
probada con
suero de conejo.
Candida
Triazina PEG2 2x5 22 68 Una sola Fujita, T, et al.,
utilis
inyección. PEG 1991
incrementó la
hemivida de
1hora ca. a 8
horas ca. en
ratones. PEG
bloqueó la
eliminación por
hígado, bazo y
riñón (duración
del estudio 24 h.)
No
PEG No No revelado No revelada Se redujo la Veronese, FM, et
revelada
PEG2 revelado inmunogenecidad en ratones un al., 1997
No se informó
Se reveló que No revelada 98 % (PEG) o
el enlace
es el mismo 100 % (PEG2)
que para PEG
La patente japonesa 3-148298 de A Sano, et al., describe proteínas modificadas, incluyendo uricasa, derivatizada con PEG que tiene un peso molecular de 1-12 kDa que muestra una antigenia reducida y una acción «mejor y prolongada» así como métodos para realizar dichos péptidos derivatizados. Sin embargo, no existe información sobre el recuento de cadenas, ensayo de enzimas, pruebas biológicas o el significado de «mejor y prolongada». Las 5 patentes japonesas 55-99189 y 62-55079, ambas de Y Inada, incluyen conjugados de uricasa preparada con PEGtriazina o bis-PEG-triazina (denotado como PEG2 en la tabla 1), respectivamente (Nishimura, et al., (1979 y 1981). En el primer tipo de conjugado, los pesos moleculares de los PEG son 2 kDa y 5 kDa, mientras que en el segundo tipo de conjugado, sólo se utilizó 5 kDa. Nishimura et al. (1979) dieron a conocer la recuperación del 15 % de actividad uricolítica después de la modificación del 43 % de lisinas disponibles con PEG lineales de 5 kDa, en tanto
10 que Nishimura, et al., (1981) registraron la recuperación del 31 % o 45 % de la actividad uricolítica después de la modificación del 46 % o 36 % de lisinas, respectivamente, con PEG2.
Resumen de la invención
Estudios previos muestran que cuando una reducción importante en la inmunogenia o antigenia de uricasa se logra mediante la PEGilación, de manera invariable se asocia con una pérdida sustancial de la actividad uricolítica. La
15 seguridad, conveniencia y la relación coste-eficacia de los productos biofarmaceúticos se ven negativamente afectados por las reducciones en sus potencias y la necesidad resultante de aumentar la dosis administrada. Por lo tanto, existe la necesidad de contar con medios alternativos seguros y eficaces para reducir los elevados niveles de ácido úrico en los fluidos corporales, incluyendo la sangre y la orina. La presente descripción presenta una PEGuricasa esencialmente no inmunogénica que retiene toda o casi toda la actividad de la enzima no modificada.
20 Un ejemplo de la presente descripción es un conjugado de oxidasa de urato (uricasa). La presente invención y sus realizaciones se fijan en las reivindicaciones adjuntas. La uricasa de este aspecto de la invención puede ser recombinante. Ya sea o no recombinante, la uricasa puede ser de origen mamífero. En un aspecto de esta realización, la uricasa puede ser uricasa de hígado porcino, bovino u ovino. En otro aspecto de esta realización, la uricasa puede ser quimérica. Es posible que la uricasa quimérica contenga porciones del hígado porcino o uricasa
25 de hígado de babuino. Por ejemplo, la uricasa quimérica puede ser uricasa quimérica de cerdo-babuino (uricasa PBC, por sus siglas en inglés) o uricasa porcina que contenga las mutaciones R291K y T301S (uricasa PKS) (véase secuencias de la figura 6 y los resultados de los estudios fisiológicos e inmunológicos de las figuras 7-12).
5
15
25
35
45
55
Alternativamente, la uricasa puede ser uricasa de bazo e hígado en la cual la tirosina 97 se reemplaza por histidina, por medio de lo cual la actividad específica de la uricasa puede aumentarse al menos en casi un 60 %. La uricasa de la invención, cualquiera que sea su origen, puede también tener una forma que sea truncada, ya sea en el terminal de amino, en el terminal de carboxilo o en ambos terminales. Asimismo, la uricasa puede ser uricasa fúngica o microbiana. En un aspecto de esta realización, la uricasa fúngica o microbiana puede ser una forma naturalmente ocurrente o recombinante de uricasa derivada de Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis o Candida utilis. De manera alternativa, la uricasa puede ser una uricasa invertebrada, como una forma naturalmente ocurrente o recombinante de uricasa derivada de Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura. Asimismo, es posible que esta uricasa de la invención sea una uricasa vegetal, por ejemplo una forma naturalmente ocurrente o recombinante de uricasa derivada del nódulo de la raíz de la soja (Glycine max). El PEG puede tener un peso molecular promedio de entre 5 kDa y 100 kDa; preferiblemente, el PEG puede tener un peso molecular promedio de entre 10 kDa y 60 kDa; idealmente, el PEG puede tener un peso molecular promedio de entre 20 kDa y 40 kDa, por ejemplo 30 kDa. La cantidad promedio de las cadenas combinadas covalentemente de PEG puede ser de 2 a 10 cadenas por subunidad de uricasa; preferiblemente, la cantidad promedio de las cadenas combinadas covalentemente de PEG pueden ser de 3 a 8 cadenas por subunidad de uricasa; idealmente, la cantidad promedio de las cadenas combinadas covalentemente de PEG pueden ser de 4 a 6 cadenas por subunidad de uricasa. En un aspecto de esta realización, la uricasa puede ser tetramérica. Las cadenas de PEG pueden unirse covalentemente a la uricasa por vía de enlaces de uretano (carbamato), enlaces secundarios de amina y/o enlaces de amida. Cuando la uricasa es una forma recombinante de cualesquiera de las uricasas aquí mencionadas en el presente, la forma recombinante puede tener sustancialmente la secuencia de la forma naturalmente ocurrente.
Otro caso de la presente descripción es una composición farmacéutica. La composición puede ser estabilizada por liofilización y disuelta inmediatamente después de la reconstitución para ofrecer soluciones aconsejables en la administración parenteral.
La presente descripción también presenta el uso de PEG-uricasa para reducir los niveles de ácido úrico en los fluidos y tejidos del cuerpo de un mamífero. El uso abarca la administración a un mamífero de una cantidad de PEGuricasa que reduce con eficacia el ácido úrico. La PEG-uricasa puede ser una uricasa purificada de dos o más subunidades en la que cada subunidad puede unirse covalentemente con un promedio de 2 a 10 cadenas de PEG lineal o ramificado, en el que cada molécula de PEG puede tener un peso molecular medio de entre aproximadamente 5 kDa y 100 kDa, en un portador aceptable farmacéuticamente. El mamífero puede ser un ser humano. La fase de administración puede ser, por ejemplo, una inyección vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal; o bien, una presentación en aerosol para su inhalación. Los elevados niveles de ácido úrico pueden encontrarse en la sangre, orina u otros fluidos y tejidos corporales, así como estar relacionados con la gota, tofos, insuficiencia renal, transplante de órgano o cualquier otra enfermedad maligna.
Otros casos de la presente invención son un método para aislar un forma tetramérica de uricasa. Inicialmente, la disolución puede contener agregados de uricasa y uricasa tetramérica. El método puede incluir las siguientes fases: aplicar la disolución a por lo menos una columna de separación en un pH de entre casi 9 y 10,5, por ejemplo 10,2; recuperar las fracciones del eluato e identificar aquellos que puedan contener uricasa tetramérica separada, en la que las fracciones están básicamente libres de agregados de uricasa; y combinar las fracciones de la uricasa tetramérica separada. La columna de separación puede fundamentarse en un intercambio de iones, exclusión de tamaño o cualquier otro criterio de separación válido. De igual manera, el método puede abarcar un análisis de las fracciones para determinar la presencia de uricasa tetramérica o la ausencia de agregados de uricasa. Por ejemplo, dicho análisis puede incluir cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC: high performance liquid chromatography), otros métodos de cromatografía, dispersión de la luz, centrifugación y/o electroforesis. En un aspecto de esta realización, la uricasa tetramérica purificada puede contener menos del 10 % de agregados de uricasa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis como una función del número de cadenas de PEG acoplado por subunidad.
La figura 1B muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis como una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 2A muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada derivada del hígado porcino como una función del número de cadenas de PEG acoplado por subunidad.
La figura 2B muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada derivada del hígado porcino como una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 3A muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada quimérica de cerdo-babuino (PBC: pig-baboon chimeric) como una función del número de cadenas de PEG acoplado por subunidad.
La figura 3B muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada PBC como una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
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15
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50
La figura 4A muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada derivada de Aspergillus flavus como una función del número de cadenas de PEG acoplado por subunidad.
La figura 4B muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada derivada de Aspergillus flavus como una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 5A muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada recombinante derivada del nódulo de la raíz de soja como una función del número de cadenas de PEG acoplado por subunidad.
La figura 5B muestra la retención de la actividad por medio de la uricasa PEGilada recombinante derivada del nódulo de la raíz de soja como una función de la masa total de PEG acoplado por subunidad.
La figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos dedicidas de uricasa quimérica de cerdo-babuino (uricasa PBC), la uricasa PBC que se trunca en terminales amino y carboxilo (PBC-NT-CT) y la uricasa porcina que contiene las mutaciones R291K y T301S (uricasa PKS), en comparación con las secuencias porcinas y de babuino.
La figura 7 muestra la actividad de uricasa en el suero de ratón 24 horas después de cada cuatro o cinco inyecciones intraperitoneales de uricasa modificada-PEG PBC, en relación con el valor de 24 horas después de la primera inyección.
La figura 8 muestra la relación inversa entre la actividad de la uricasa inyectada modificada-PEG PBC en el suero de un ratón carente de uricasa y la concentración del ácido úrico en el suero y la orina.
La figura 9 muestra una menor gravedad de un defecto concentrante en la orina en ratones (uox-/-) carentes de uricasa que fueron tratados con uricasa modificada-PEG PBC.
La figura 10 muestra la menor gravedad de la diabetes insípida nefrogénica en ratones (uox-/-) carentes de uricasa que fueron tratados con uricasa modificada-PEG PBC.
La figura 11 muestra la menor gravedad de la nefropatía inducida por ácido úrico, según se observó a través del microscopio de resonancia magnética, en ratones (uox-/-) carentes de uricasa que fueron tratados con uricasa modificada-PEG PBC.
La figura 12 muestra la eliminación acelerada derivada de la circulación de ratones BALB/c de octámero de uricasa PBC inyectada, en comparación con el tetrámero, cuando ambos están acoplados con 5-6 cadenas de PEG de 10 kDa por subunidad.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente descripción proporciona mejores conjugados de polímeros solubles en agua, preferiblemente polietilenglicoles u óxidos de polietileno, con uricasas. Asimismo, la descripción ofrece composiciones farmacéuticas de conjugados mejorados. Estos conjugados son sobre todo no inmunogénicos y retienen el 75 % como mínimo, preferentemente el 85 %, e idealmente el 95 % o más de la actividad uricolítica de la enzima no modificada. Las uricasas aconsejables para la conjugación con polímeros solubles en agua incluyen oxidasas de urato de origen natural aisladas de bacterias, hongos y tejidos de plantas o animales, tanto vertebrados como invertebrados, así como formas recombinantes de uricasa, incluyendo las variantes mutadas, híbridas y/o truncadas enzimáticamente activas. Entre los polímeros solubles en agua aconsejables para su uso en la presente descripción se encuentran los polietilenglicoles u óxidos de polietileno, mejor conocidos como PEG. Ejemplos de PEG ramificados son los sujetos a la patente estadounidense 5,643,575. Un ejemplo preferido de PEG lineales es el monometoxiPEG, de estructura general CH30-(CH2CH20)nH, en donde n varia aproximadamente desde 100 a 2.300.
Una uricasa de origen mamífero preferida es la uricasa recombinante PBC, compuesta por porciones de secuencias de hígado de cerdo e hígado de babuino, Wu, et al., (1989), fueron los primeros en determinarlos. Un ejemplo de dicha uricasa quimérica contiene los primeros 225 aminoácidos derivados de la secuencia de uricasa porcina (SEQ ID NO:1) y los últimos 79 aminoácidos derivados de la secuencia de uricasa de babuino (SEQ ID NO:2) (uricasa de cerdo-babuino o uricasa PBC; véase la figura 6). Otro ejemplo de esto es que una uricasa contiene residuos 7-225 de secuencia porcina (SEQ ID NO. 1) y residuos 226-301 de la secuencia de babuino (SEQ ID NO. 2); lo que es equivalente a la uricasa PBC que se trunca en terminales de amino y carboxilo (PBC-NT-CT; véase figura 6). Otro ejemplo de esto es que la uricasa quimérica contiene los primeros 288 aminoácidos derivados de la secuencia porcina (SEQ ID NO. 1) y los últimos 16 aminoácidos derivados de la secuencia de babuino (SEQ ID NO.2). Debido a que la última secuencia difiere de la secuencia porcina en sólo dos posiciones, con una lisina (K) en lugar de arginina en el residuo 291 y una serina (S) en lugar de treonina en el residuo 301, se hace referencia a esta mutación como una uricasa porcina-K-S o PKS. Cada una de las uricasas PKS, PBC y PBC-NT-CT tienen un residuo de lisina más y, por ende, un sitio más potencial de PEGilación que la secuencia porcina o de babuino.
Se subclonaron las cADN para varias uricasas de mamíferos, incluyendo uricasa PBC, uricasa PKS y uricasa recombinante similar al babuino, y se determinaron las condiciones óptimas para expresión en E. coli, utilizando los métodos estándar. Véase Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA
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Ejemplo 1
La purificación de la forma tetramérica de uricasa
La forma tetramérica de uricasa (peso molecular ca. 140 kDa) se purificó de una disolución de uricasa de hígado porcino mediante una cromatografía preparativa de exclusión por tamaño o intercambio de iones, seguida por una cromatografía analítica de exclusión por tamaño. La uricasa de hígado porcino se obtuvo del Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo n.º U2350 o U3377; o Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.
Las cromatografías preparativa y analítica de exclusión por tamaño se realizaron con un pH de 10-10,5, preferiblemente 10,2, en un tampón de carbonato de sodio de 10 mM que contiene NaCl 0.1 M, en columnas Superdex 200 que fueron previamente calibradas con proteínas de peso molecular conocido. Se obtuvo Superdex de Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Puede utilizarse cualquier tampón que tenga la capacidad de mantener el pH deseado y que sea compatible con la química que va utilizarse para la copulación PEG. Tales tampones son muy conocidos en el ámbito. La absorbancia ultravioleta del eluato derivado de la columna de preparación se supervisó a 280 nm, en tanto que las porciones con eluato de uricasa que corresponden al peso molecular de la forma tetramérica deseada, pero libre de especies de peso molecular elevado, se recolectaron para utilizarse en la PEGuricasa no inmunogénica como se describe en el ejemplo 2. Opcionalmente, las formas tetraméricas de uricasa pueden aislarse utilizando otro medio de exclusión por tamaño como Superose 12 (Amersham Pharmacia) o cualquier otro medio que sea compatible con soluciones ligeramente alcalinas y que tenga un intervalo adecuado de fraccionación por tamaño. Dichos medios se consiguen sin problemas, además son muy conocidos en el ámbito.
La cromatografía de intercambio de iones se llevó a cabo con un pH de 10-10,5, preferiblemente 10,2, en las columnas Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) que se equilibró con tampón de carbonato de sodio de 0,1 M. Es posible utilizar cualquier tampón que sea compatible con la química de acoplamiento de PEG y cuente con la capacidad de mantener el pH deseado, en la concentración de iones suficientemente baja para permitir la absorción de uricasa a la columna. Tales tampones son muy conocidos en el ámbito. La absorbencia ultravioleta del eluato se controló en 280 nm durante la elución de la uricasa derivada de la resina de intercambio de iones al aumentar la concentración de iones de la disolución tampón aplicada, por ejemplo por un gradiente lineal de 0 a 0,5 M NaCl en el tampón de carbonato de sodio. Luego, se utilizo la HPLC de exclusión por tamaño a fin de identificar las fracciones del eluato que contenga la forma tetramérica deseada de uricasa, sin los agregados detectables, para la síntesis de PEG-uricasa sustancialmente no inmunogénica. De manera opcional, la forma tetramérica de uricasa puede aislarse utilizando otro medio de intercambio de iones, como Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) o cualquier otro medio que sea compatible con soluciones ligeramente alcalinas. Dichos medios se consiguen sin problemas, además son muy conocidos en el ámbito.
La actividad de uricasa se ensayó utilizando una modificación de los métodos estándar. Véase, por ejemplo, Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). Las soluciones de ácido úrico se prepararon todos los días en un tampón de borato de sodio de 50 mM, pH 9,2, para dar concentraciones finales en el ensayo de 6-150 µM. Las preparaciones de uricasa se diluyeron en este tampón de burato que contenía albúmina de suero bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo n.º A-7030), de modo que la concentración final de albúmina en el ensayo fue de 0.1 mgr/mL. Después de mezclar varias diluciones de la enzima con el sustrato en una placa de microtitulación para un lector de microplacas, la tasa de eliminación de ácido úrico en 25 °C se supervisó en 292 nm cada cuatro segundos durante 3 minutos. De las muestras en las que entre el 10 % y el 40 % del sustrato se consumió en un periodo de tres minutos, por lo menos 20 puntos de datos se utilizaron para calcular la tasa máxima de reducción en la absorción por minuto. Una unidad internacional (IU, international unit) de actividad de uricasa se definió respecto a la cantidad de enzima que consume un micromol de ácido úrico por minuto; las actividades específicas se expresan como proteína IU/mg. Algunos de los datos en relación con las actividades de uricasa relativas de las figuras 1A-5B se obtuvieron utilizando ácido úrico de 100 µM en el ensayo. Otros resultados en relación con la velocidad en el ácido úrico de 100 µM (V100) se calcularon a partir de los valores de la constante de Michaelis (KM) y la velocidad máxima (Vmáx) para las respectivas preparaciones de enzima, utilizando la fórmula:
V100 = 100 x Vmáx/(KM + 100)
Donde KM se expresa en micromol.
Ejemplo 2
Copulación de PEG para uricasa tetramérica porcina
Para una disolución de uricasa tetramérica en un tampón de carbonato de sodio de 0,1 M, pH 10,2, 10-200 moles de un derivado activado de monometoxiPEG, por ejemplo, el carbonato de 4-nitrofenil (NPC-PEG), de varios tamaños (5 kDa a 30 kDa) se agregaron por cada mol de subunidad de uricasa (peso molecular 35 kDa). Estos y otros PEG activados recomendados se pueden obtener en Shearwater Polymers. Las instrucciones para acoplar estos PEG con las proteínas se incluyen en el catálogo de Shearwater Polymer que puede encontrarse en su sitio de Internet, www.swpolymers.com, y en JM Harris, et al., (Eds.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society. La reacción de acoplamiento se permitió a fin de proceder en 0-8 °C hasta que el acomplamiento de PEG no cambiase de manera
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de 2 cadenas de PEG de 19 kDa por subunidad, utilizando un derivado de carbonato de 4-nitrofenilo de PEG (NPC-PEG). Sherman, et al., (1997). El conjugado menos inmunorreactivo () se preparó mediante el acoplamiento de un promedio de 6 cadenas de NPC-PEG de 10 kDa por subunidad para un preparado de uricasa PBC que contenía 5 % de agregados de uricasa.
La figura 8 muestra la relación inversa entre las concentraciones de ácido úrico en el suero y orina, así como la actividad de PEG-uricasa inyectada en el suero de un ratón carente de uricasa (uox-/-). Las inyecciones en tiempo cero y después de 72 horas contenían 0,43 IU de uricasa PBC conjugada con un promedio de 6 cadenas de PEG de 10 kDa por subunidad de enzima.
La figura 9 muestra que el tratamiento de ratones carentes de uricasa con uricasa modificada-PEG PBC disminuyó la gravedad de un defecto concentrante en la orina. El promedio y la desviación estándar de los datos en relación con la osmolalidad de orina se muestran en dos ratones que tenían una copia del gen normal de uricasa murino (uox +/-), seis ratones no tratados homocigotos carentes de uricasa (uox -/-) y seis ratones homocigotos carentes de uricasa que recibieron 10 inyecciones entre el tercer y 72º día de vida con 95 o 190 mIU de PEG-uricasa. Los ratones de cada uno de los grupos genéticos recibieron agua ad libitum (barras sólidas) o se les privó de agua por un periodo de 12 horas (barras urdidas) antes de la recolección de su orina.
La figura 10 muestra que el tratamiento de los ratones carentes de uricasa con uricasa modificada-PEG PBC redujo la gravedad de diabetes insípida nefrogénica, que se caracteriza por un consumo inusualmente elevado de agua y salida de orina inusualmente elevada. Los antecedentes genéticos de los ratones y el protocolo del tratamiento fueron los mismos que en la figura 9. Se muestran el promedio y la desviación estándar del consumo de agua diario (barras sólidas) y la salida de orina (barras urdidas) para tres grupos de seis ratones.
La figura 11 muestra que el tratamiento de ratones carentes de uricasa con uricasa modificada-PEG PBC disminuyó la gravedad de la nefropatía inducida por el ácido úrico, como se apreció a través del microscopio de resonancia magnética. Los antecedentes genéticos de los tres grupos de ratones y el protocolo de tratamiento fueron los mismos que se utilizaron en las figuras 9 y 10. El estudio con microscopio de resonancia magnética se realizó en el Center for in vivo Microscopy, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina.
Además de los resultados resumidos en la figuras 8-11, se demostró que los niveles de ácido úrico en la orina de todos los ratones carentes de uricasa disminuyeron de forma dramática después del tratamiento con uricasa modificada-PEG PBC. Por último, la figura 12 muestra que, a diferencia de la forma tetramérica modificada-PEG de uricasa PBC, la forma octamérica (peso molecular = 280 kDa), aún si es ampliamente PEGilada, es inmunogénica en los ratones. Esta propiedad se refleja en la eliminación acelerada del octámero modificado-PEG durante un periodo de 5 días tras una sola inyección intraperitoneal. Los mismos ratones recibieron otra inyección con la misma dosis de las mismas preparaciones de PEG-uricasa en los días 8 y 15. Veinte cuatro horas después de la segunda y tercera inyección, la actividad uricolítica no fue detectable en los sueros de ratones inyectados con el octámero PEGilado, pero fue más fácil de detectar en los sueros de los ratones inyectados con el tetrámero PEGilado. Estos hallazgos, en combinación con la eliminación acelerada del octámero PEGilado que se observó después de la primera inyección (figura 12), apoyan la utilidad de eliminar todas las formas de uricasa mayores del tetrámero antes de la PEGilación de la enzima.
Ejemplo 4
Conjugación PEG de la uricasa derivada de Candida utilis
La uricasa derivada de Candida utilis se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; catálogo n.º U1878) o Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; catálogo n.º URYW). Procediendo según lo descrito en los ejemplos 1 y 2, la forma tetramérica se aisló y los conjugados PEG se sintetizaron con PEG 5 kDa, 10 kDa o 30 kDa (figuras 1A-1B). La figura 1A muestra la retención de actividad gracias a la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis como una función del número de cadenas de PEG acopladas por subunidad. Los datos de los autores de la presente invención(▲, ●, □) se compararon con los de Nishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda, et al., (1990) y Fujita, et al., (1991). Los datos illustrados por los círculos grandes denotan conjugados que Nishimura, et al., (1979 o 1981) informaron como no antigénicos o que Chen, et al., (1981) reportó como no inmunoreactivos.
La figura 1B muestra la retención de la actividad mediante la uricasa PEGilada derivada de Candida utilis como una función de la masa total de PEG acoplada por subunidad. Los datos de los autores de la presente invención (▲, ●,
□) se comparan con los que aparecen en los informes de la figura 1A. Los datos ilustrados por los círculos grandes tienen el mismo significado que en la figura 1A.
Como aparece en la figura 1A y 1B, los conjugados con un promedio de hasta 6 cadenas de PEG de 5 kDa o 30 kDa, o 9 cadenas de PEG de 10 kDa por subunidad retuvieron por lo menos el 75 % de la actividad de la enzima no modificada. El aparente aumento en la actividad específica cuando se incorpora un número creciente de cadenas de PEG de 30 kDa se incorpora (hasta 5 o 6 cadenas por subunidad) puede reflejar la relativa insolubilidad o inestabilidad de la enzima no modificada en comparación con los conjugados.
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