ES2650224T3

ES2650224T3 - Proteínas de unión al antígeno C-FMS humano

Info

Publication number: ES2650224T3
Application number: ES08798203.9T
Authority: ES
Inventors: Kenneth Allan Brasel; Stephen Foster; Douglas Pat Cerretti; Jilin Sun; James F. Smothers; Christopher Mehlin
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-08-21
Filing date: 2008-08-19
Publication date: 2018-01-17
Anticipated expiration: 2028-08-19
Also published as: NO2188313T3; SI2188313T1; JP2018007683A; NZ583282A; EP2188313A1; US9303084B2; KR20100056492A; MX2010001918A; US20140105916A1; EP2188313B1; TWI595005B; PL2188313T3; TW200911829A; US20120230987A1; JP2010536378A; EA201591355A1; US20090155164A1; AU2008288974B2; HRP20171741T1; JP2015107118A

Abstract

Un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3, donde dichas CDR comprenden las secuencias de aminoácidos como se expone a continuación: (a) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 147, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 163, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 186, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 193, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 214, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 228, (b) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 137, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 150, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 166, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 198, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 216, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 233, (d) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 147, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 163, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 186, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 195, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 214, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 228, (e) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 137, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 152, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 170, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 198, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 216, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 233, (f) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 147, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 163, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 186, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 194, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 214, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 228, (g) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 141, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 156, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 172, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 209, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 223, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 245, (i) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 140, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 155, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 169, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 202, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 218, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 236, (j) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 140, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 155, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 169, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 201, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 218, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 236, (k) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 143, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 158, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 190, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 199, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 219, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 237, (l) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 137, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 151, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 167, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 199, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 217, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 233, (m) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 137, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 150, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 173, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 198, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 216, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 233, (n) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 142, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 157, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 187, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 206, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 221, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 242, (o) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 143, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 158, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 177, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 200, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 216, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 235, o (p) CDRH1 comprende SEQ ID NO: 142, CDRH2 comprende SEQ ID NO: 157, CDRH3 comprende SEQ ID NO: 176, CDRL1 comprende SEQ ID NO: 207, CDRL2 comprende SEQ ID NO: 224, y CDRL3 comprende SEQ ID NO: 243; y en el que dicho anticuerpo se une a c-fms humanas con una KD de menos de 10-8M, medida como se describe en este documento.

Description

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Descripción detallada

Los encabezados de sección usados en este documento son solo para fines de organización y no deben interpretarse como limitativos del tema descrito.

A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente solicitud tendrán los significados que comúnmente comprenden los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en este documento son las bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente solicitud se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de el presente documento descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3er ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. La terminología utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en la presente son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.

La invención se define mediante las reivindicaciones, y se ilustra mediante metodología, protocolos y reactivos relacionados, etc., descritos en este documento. La terminología utilizada en el presente documento solo tiene el propósito de describir realizaciones particulares.

Aparte de lo presentado en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usados en este documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" cuando se usa en relación con porcentajes puede significar ±1%.

Definiciones

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye tanto polímeros de nucleótidos monocatenarios como bicatenarios. Los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos

: o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2',3'-didesoxirribosa y modificaciones de enlaces internucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.

El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases. En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios

: o bicatenarios, por ejemplo, para usar en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta, que incluye un radiomarcador, un marcador fluorescente, un hapteno o un marcador antigénico, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.

Una "molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o enlazado a un polinucleótido al que no está enlazado en la naturaleza. Para los fines de esta descripción, debe entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificadoras para hasta diez o incluso hasta otras veinte proteínas o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras operativamente ligadas que controlan la expresión del región codificante de las secuencias de ácido nucleico enumeradas, y/o puede incluir secuencias de vector.

A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de cualquier secuencia polinucleotídica monocatenaria discutida en este documento es el extremo 5'; la dirección de la izquierda de las secuencias polinucleotídicas bicatenarias se denomina dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de transcritos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que la transcripción de ARN que están en el extremo 5' al 5' del transcrito de ARN se denominan "secuencias corriente arriba"; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que la transcripción de ARN

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los mismos, ejemplos de los cuales se describen a continuación.

El término "cadena liviana" incluye una cadena liviana de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena liviana de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. El dominio de la región variable de la cadena liviana está en el extremo amino del polipéptido. Las cadenas livianas incluyen cadenas kappa y cadenas lambda.

El término "cadena pesada" incluye una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma que tienen una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad de unión. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, CH1, CH2 y CH3. El dominio VH está en el extremo amino del polipéptido, y los dominios CH están en el extremo carboxilo, siendo el CH3 el más cercano al extremo carboxi del polipéptido. Las cadenas pesadas pueden ser de cualquier isotipo, incluidas las IgG (incluidos los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluidos los subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE.

El término "fragmento inmunológicamente funcional" (o simplemente "fragmento") de un anticuerpo o cadena de inmunoglobulina (cadena pesada o liviana), como se usa en el presente documento, es una proteína de unión a antígeno que comprende una porción (independientemente de cómo se obtenga o sintetice esa porción) de un anticuerpo que carece al menos de algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa pero que es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos porque se unen específicamente al antígeno diana y pueden competir con otras proteínas de unión a antígeno, que incluyen anticuerpos intactos, para la unión específica a un epítopo dado. En un aspecto, dicho fragmento retendrá al menos una CDR presente en la cadena liviana o pesada de longitud completa, y en algunas realizaciones comprenderá una sola cadena pesada y/o cadena liviana o parte de la misma. Estos fragmentos biológicamente activos se pueden producir por técnicas de ADN recombinante, o se pueden producir por escisión enzimática o química de proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos monocatenarios, y pueden derivarse de cualquier fuente de mamífero, que incluye pero no se limita a humanos, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla además que una porción funcional de las proteínas de unión a antígenos descritas aquí, por ejemplo, una o más CDR, podría unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido a un objetivo particular en el cuerpo, que posee propiedades terapéuticas bifuncionales, o que tiene una vida media en suero prolongada.

Un "fragmento Fab" está compuesto por una cadena liviana y las regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.

Una región "Fc" contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios CH1 y CH2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen unidos por dos o más enlaces disulfuro y por interacciones hidrófobas de los dominios CH3.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena liviana y una porción de una cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1 y CH2, de manera que un enlace disulfuro intercadena se puede formar entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula F(ab')2.

Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas livianas y dos cadenas pesadas que contienen una porción de la región constante entre los dominios CH1 y CH2, de manera que se forma un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Por lo tanto, un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.

La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas pesada y liviana, pero carece de las regiones constantes.

Los "anticuerpos monocatenarios" son moléculas Fv en las que las regiones variables de cadena pesada y liviana se han conectado mediante un enlazador flexible para formar una única cadena polipeptídica, que forma una región de unión a antígeno. Los anticuerpos monocatenarios se discuten en detalle en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 88/01649 y en las Patentes de los Estados Unidos No. 4,946,778 y No. 5,260,203.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena liviana. En algunos casos, dos o más regiones VH se unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones VH de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse a antígenos iguales o diferentes.

Una "proteína de unión a antígeno bivalente" o "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades de antígeno. Las proteínas de unión al antígeno bivalente y los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos, véase más adelante.

Una proteína de unión a “antígeno multiespecífica" o "anticuerpo multiespecífico" es una que se dirige a más de un antígeno o epítopo.

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En aspectos en los que la proteína de unión a antígeno se usa para aplicaciones terapéuticas, una proteína de unión a antígeno puede inhibir, interferir o modular una o más actividades biológicas de c-fms. En este caso, una proteína de unión a antígeno se une específicamente y/o inhibe sustancialmente la unión de c-fms humanas a CSF-1 cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de c-fms humanos unidos a CSF-1, o viceversa, mediante al menos aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o más (por ejemplo midiendo la unión en una competencia in vitro ensayo de unión). C-fms tiene muchos efectos biológicos distintos, que se pueden medir en muchos ensayos diferentes en diferentes tipos de células; ejemplos de tales ensayos se proporcionan en este documento.

Estructura del anticuerpo de origen natural

Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se proporcionan tienen la estructura típicamente asociada con anticuerpos naturales. Las unidades estructurales de estos anticuerpos comprenden típicamente uno o más tetrámeros, cada uno compuesto por dos pareados idénticos de cadenas polipeptídicas, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tienen solo una única cadena pesada. En un anticuerpo típico, cada par

o dupla incluye una cadena "liviana" de longitud completa (en ciertas realizaciones, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas realizaciones, aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual está compuesta de varios "dominios de inmunoglobulina", cada uno de los cuales consta de aproximadamente 90 a 110 aminoácidos y expresa un patrón de plegamiento característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que se componen los polipéptidos de anticuerpos. La porción amino terminal de cada cadena incluye típicamente un dominio variable que es responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal está más conservada evolutivamente que el otro extremo de la cadena y se denomina "región constante" o "región C". Las cadenas livianas humanas generalmente se clasifican como cadenas livianas kappa y lambda, y cada una de ellas contiene un dominio variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como cadenas mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y éstas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varios subtipos, que incluyen, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los subtipos de IgM incluyen IgM e IgM2. Los subtipos de IgA incluyen IgA1 e IgA2. En humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas livianas; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas livianas. La región C de la cadena pesada típicamente comprende uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de la región constante de la cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen cada una tres dominios de la región C conocidos como CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos que se proporcionan pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos. En ciertas realizaciones, el anticuerpo c-fms es del subtipo IgG1, IgG2 o IgG4.

En las cadenas livianas y pesadas de longitud completa, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente doce o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente diez aminoácidos más. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nueva York: Raven Press. Las regiones variables de cada par de cadena liviana/pesada típicamente forman el sitio de unión al antígeno.

Un ejemplo de un dominio constante pesado de IgG2 de un anticuerpo monoclonal c-fms de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos:

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Un ejemplo de un dominio constante ligera kappa de un anticuerpo monoclonal c-fms de ejemplo tiene la secuencia de aminoácidos:

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Las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulina generalmente muestran la misma estructura general, que comprende regiones marco conservadas (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, más a menudo llamadas "regiones determinantes de complementariedad" o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par de cadena pesada/cadena liviana mencionadas anteriormente típicamente están alineadas por las regiones marco 5 para formar una estructura que se une específicamente con un epítopo específico en la proteína diana (por ejemplo, c-fms). Desde N-terminal hasta C-terminal, las regiones variables de cadena liviana y pesada de origen natural se ajustan típicamente con el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Se ha diseñado un sistema de numeración para asignar números a los aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Este sistema de numeración se define en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest 10 (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), o Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature

342: 878-883.

Las diversas regiones variables de cadena pesada y liviana proporcionadas en este documento se representan en la Tabla 2. Cada una de estas regiones variables puede unirse a las regiones constantes de cadena pesada y liviana anteriores para formar una cadena pesada y liviana de anticuerpo completa, respectivamente. Además, cada una de

15 las secuencias de cadena pesada y liviana así generadas se puede combinar para formar una estructura de anticuerpo completa. Debe entenderse que las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena liviana proporcionadas en el presente documento también se pueden unir a otros dominios constantes que tienen secuencias diferentes de las secuencias ilustrativas enumeradas anteriormente.

Ejemplos específicos de algunas de las cadenas livianas y pesadas de longitud completa de los anticuerpos que se 20 proporcionan y sus secuencias de aminoácidos correspondientes se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Cadenas pesadas y livianas de ejemplo

Referencia: Designación SEQ Secuencia de aminoácidos

ID

imagen14: imagen15 NO. imagen16

H1 109 1N1G1: H1 4 imagen17

H1 13 1N1G1: H2 5 imagen18

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 131 1N1G1: H3 6 imagen19

H1 134 1N1G1: H4 7 imagen20

H1 143 1N1G1: H5 8 imagen21

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 144 1N1G1: H6 9 imagen22

H1 16 1N1G1: H7 10 imagen23

H1 21N1G1: H8 11 imagen24

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 26 1N1G1: H9 12 imagen25

H1 27 1N1G1: H10 13 imagen26

H1 30 1N1G1: H11 14 imagen27

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 33-1 1N1G1: H12 15 imagen28

H1 33 1N1G1: H13 16 imagen29

H1 34 1N1G1: H14 17 imagen30

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 39 1N1G1: H15 18 imagen31

H142 1N1G1: H16 19 imagen32

H164 1N1G1: H17 20 imagen33

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 66 1N1G1: H18 21 imagen34

H1 72 1N1G1: H19 22 imagen35

H2 103 1N1G2: H20 23 imagen36

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 90 1N1G1: H21 24 imagen37

H2131 1N1G2: H22 25 imagen38

H2 291 1N1G2: H23 26 imagen39

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 360 1N1G2: H24 27 imagen40

H2 360 1N1G2 SM: H25 28 imagen41

H2 369 1N1G2: H26 29 imagen42

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 380 1N1G2: H27 30 imagen43

H2475 1N1G2: H28 31 imagen44

H2 508 1N1G2: H29 32 imagen45

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 534 1N1G2: H30 33 imagen46

H2 550 1N1G2: H31 34 imagen47

H2 65 1N1G2: H32 35 imagen48

H1 109 1N1K: L1 36 imagen49

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 109 1N1K SM: L2 37 imagen50

H1 131 1N1K: L3 38 imagen51

H1 134 1N1K: L4 39 imagen52

H1 143 1N1K: L5 40 imagen53

H1 144 1N1K: L6 41 imagen54

H1 161N1K: L7 42 imagen55

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 21N1K: L8 43 imagen56

H1 21N1K 3M: L9 44 imagen57

H1 271N1K: L10 45 imagen58

H1 301N1K: L11 46 imagen59

H133-1 1N1K: L12 47 imagen60

H1341N1K: L13 48 imagen61

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 391N1K: L14 49 imagen62

H1 42 1N1K: L15 50 imagen63

H1 64 1N1K: L16 51 imagen64

H1 66 1N1K: L17 52 imagen65

H1 72 1N1K: L18 53 imagen66

H1 90 1N1K: L19 54 imagen67

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2103 1N1K: L20 55 imagen68

H2131 1N1K: L21 56 imagen69

H2 360 1N1K: L22 57 imagen70

H2 360 1N1K SM: L23 58 imagen71

H2 369 1N1K: L24 59 imagen72

H2 380 1N1K: L25 60 imagen73

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 475 1N1K: L26 61 imagen74

H2 508 1N1K: L27 62 imagen75

H2 534 1N1K: L28 63 imagen76

H2 550 1N1K: L29 64 imagen77

H2 65 1N1K: L30 65 imagen78

H1 131N1K: L31 66 imagen79

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 261N1K: L32 67 imagen80

H1 13H1 13 1NVK2KK: L33 68 imagen81

H1 26H1 26 1NVK2KK: L34 69 imagen82

De nuevo, cada una de las cadenas pesadas ilustrativas (H1, H2, H3, etc.) enumeradas en la Tabla 1 se puede combinar con cualquiera de las cadenas livianas ilustrativas que se muestran en la Tabla 1 para formar un anticuerpo. Los ejemplos de tales combinaciones incluyen H1 combinado con cualquiera de L1 a L34; H2 combinado con 5 cualquiera de L1 a L34; H3 combinado con cualquiera de L1 a L34, y así sucesivamente. En algunos casos, los anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena liviana de las enumeradas en la Tabla 1. En algunos casos, los anticuerpos comprenden dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas livianas diferentes enumeradas en la Tabla 1. En otros casos, los anticuerpos contienen dos cadenas livianas idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Como ejemplo, un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional puede incluir dos cadenas pesadas

10 H1 y dos cadenas livianas L1, o dos cadenas pesadas H2 y dos cadenas livianas L2, o dos cadenas pesadas H3 y dos cadenas livianas L3 y otras combinaciones similares de pares de cadenas livianas y pares de cadenas pesadas como se detalla en la Tabla 1.

Otras proteínas de unión a antígeno que se proporcionan son variantes de anticuerpos formados por combinación de las cadenas pesada y liviana mostradas en la TABLA 1 y comprenden cadenas livianas y/o pesadas que tienen al

15 menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 99% de identidad con las secuencias de aminoácidos de estas cadenas. En algunos casos, tales anticuerpos incluyen al menos una cadena pesada y una cadena liviana, mientras que en otros casos las formas variantes contienen dos cadenas livianas idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.

Dominios Variables de Anticuerpos

También se proporcionan proteínas de unión a antígeno que contienen una región variable de cadena pesada de

20 anticuerpo seleccionada del grupo que consiste en VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, y VH32, y/o una región variable de cadena liviana de anticuerpo seleccionada de la grupo compuesto por VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, y VL34, como se muestra en la Tabla 2 a

25 continuación, y fragmentos, derivados, muteínas y variantes inmunológicamente funcionales de estas regiones variables de cadena liviana y cadena pesada.

Se proporcionan alineaciones de secuencia de las diversas regiones variables de cadena pesada y liviana, respectivamente, en las Figuras 1A y 1B.

Las proteínas de unión a antígeno de este tipo generalmente se pueden designar con la fórmula "VHx/VLy", donde "x" corresponde al número de regiones variables de cadena pesada e "y" corresponde al número de regiones variables de cadena liviana (en general, x e y son cada uno 1 o 2) como se detalla en la Tabla 2:

Tabla 2: Cadenas VH y VL de ejemplo

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 109 1N1G1: VH1 70 imagen83

H113 1N1G1: VH2 71 imagen84

H1 131 1N1G1: VH3 72 imagen85

H1 134 1N1G1: VH4 73 imagen86

H1 143 1N1G1: VH5 74 imagen87

H1 144 1N1G1: VH6 75 imagen88

H1 16 1N1G1: VH7 76 imagen89

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 2 1N1G1: VH8 77 imagen90

H1 26 1N1G1: VH9 78 imagen91

H127 1N1G1: VH10 79 imagen92

H1 30 1N1G1: VH11 80 imagen93

H1 33-1 1N1G1: VH12 81 imagen94

H1 33 1N1G1: VH13 82 imagen95

H134 1N1G1: VH14 83 imagen96

H1 39 1N1G1: VH15 84 imagen97

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H142 1N1G1: VH16 85 imagen98

H164 1N1G1: VH17 86 imagen99

H166 1N1G1: VH18 87 imagen100

H1 72 1N1G1: VH19 88 imagen101

H2103 1N1G2: VH20 89 imagen102

H1 90 1N1G1: VH21 90 imagen103

H2131 1N1G2: VH22 91 imagen104

H2 291 1N1G2: VH23 92 imagen105

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 360 1N1G2: VH24 93 imagen106

H2 360 1N1G2 SM: VH25 94 imagen107

H2 369 1N1G2: VH26 95 imagen108

H2 380 1N1G2: VH27 96 imagen109

H2475 1N1G2: VH28 97 imagen110

H2 508 1N1G2: VH29 98 imagen111

H2 534 1N1G2: VH30 99 imagen112

H2 550 1N1G2: VH31 100 imagen113

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 65 1N1G2: VH32 101 imagen114

H1 109 1N1K: VL1 102 imagen115

H1 109 1N1K SM: VL2 103 imagen116

H1 131 1N1K: VL3 104 imagen117

H1 134 1N1K: VL4 105 imagen118

H1 143 1N1K: VL5 106 imagen119

H1 144 1N1K: VL6 107 imagen120

H1 16 1N1K: VL7 108 imagen121

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 21N1K: VL8 109 imagen122

H121N1K SM: VL9 110 imagen123

H1 27 1N1K: VL10 111 imagen124

H1 30 1N1K: VL11 112 imagen125

H1 33-1 1N1K: VL12 113 imagen126

H1341N1K: VL13 114 imagen127

H1 391N1K: VL14 115 imagen128

H1 42 1N1K: VL15 116 imagen129

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1641N1K: VL16 117 imagen130

H1 66 1N1K: VL17 118 imagen131

H1 72 1N1K: VL18 119 imagen132

H1 90 1N1K: VL19 120 imagen133

H2103 1N1K: VL20 121 imagen134

H2131 1N1K: VL21 122 imagen135

H2 360 1N1K: VL22 123 imagen136

H2 360 1N1K SM: VL23 124 imagen137

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H2 369 1N1K: VL24 125 imagen138

H2 380 1N1K: VL25 126 imagen139

H2 475 1N1K: VL26 127 imagen140

H2 508 1N1K: VL27 128 imagen141

H2 534 1N1K: VL28 129 imagen142

H2 550 1N1K: VL29 130 imagen143

H2 65 1N1K: VL30 131 imagen144

H1 131N1K: VL31 132 imagen145

5

10

15

20

25

30

35

Referencia: Designación SEQ ID NO. Secuencia de aminoácidos

H1 261N1K: VL32 133 imagen146

H1 13H1 13 1NVK2KK: VL33 134 imagen147

H1 26H1 26 1NVK2KK: VL34 135 imagen148

Cada una de las regiones variables de cadena pesada listadas en la Tabla 2 puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena liviana mostradas en la Tabla 2 para formar una proteína de unión a antígeno. Ejemplos de tales combinaciones incluyen VH1 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, o VL34; VH2 combinado con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, o VL30, o VH3 combinados con cualquiera de VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, o VL34, y así sucesivamente.

En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena liviana de las enumeradas en la Tabla 2. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos dos variables de cadena pesada diferentes regiones variables y/o de cadena liviana de las enumeradas en la Tabla 2. Un ejemplo de dicha proteína de unión a antígeno comprende (a) un VH1, y (b) uno de VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, o VH32. Otro ejemplo comprende (a) un VH2 y (b) uno de VH1, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, o VH32. De nuevo otro ejemplo comprende (a) un VH3, y (b) uno de VH1, VH2, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15, VH16, VH17, VH18, VH19, VH20, VH21, VH22, VH23, VH24, VH25, VH26, VH27, VH28, VH29, VH30, VH31, o VH32 etc.

De nuevo, otro ejemplo de dicha proteína de unión a antígeno comprende (a) un VL1 y (b) uno de VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, o VL34. De nuevo, otro ejemplo de dicha proteína de unión a antígeno comprende (a) un VL2 y (b) uno de VL1, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, y VL34. De nuevo, otro ejemplo de dicha proteína de unión a antígeno comprende (a) un VL3 y (b) uno de VL1, VL2, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, VL16, VL17, VL18, VL19, VL20, VL21, VL22, VL23, VL24, VL25, VL26, VL27, VL28, VL29, VL30, VL31, VL32, VL33, o VL34, etc.

Las diversas combinaciones de regiones variables de cadena pesada se pueden combinar con cualquiera de las diversas combinaciones de regiones variables de cadena liviana.

En otros casos, la proteína de unión a antígeno contiene dos regiones variables de cadena liviana idénticas y/o dos regiones variables de cadena pesada idénticas. Como ejemplo, la proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional que incluye dos regiones variables de cadena liviana y dos regiones variables de cadena pesada en combinaciones de pares de regiones variables de cadena liviana y pares de regiones variables de cadena pesada enumeradas en la Tabla 2.

imagen149

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H1 4 1N1G1: CDRH 1-6 SYDMH [SEQ ID NO:141]

H2 369 1N1G2; H2 508 1N1G2; H2 360 1N1G2: CDRH 1-7 ELSMH [SEQ ID NO:142]

H2 475 1N1G2; H1 66 1N1G1; H1 90 1N1G1; H1 134 1N1G1; H2 291 1N1G2: CDRH 1-8 SYGMH [SEQ ID NO:143]

H2 380 1n1g2: CDRH 1-9 SYYWS [SEQ ID NO:144]

H2 131 1N1G2: CDRH 1-10 NYYWS [SEQ ID NO:145]

H1 131 1N1G1: CDRH 1-11 GYYIH [SEQ ID NO:146]

H2 550 1N1G2; H1 21N1G1; H1 30 1N1G1; H1 42 1N1G1: CDRH 1-12 SYGIS [SEQ ID NO:147]

H1 13 1N1G1: CDRH 2-1 YIYYSGSTNYNPSLKS [SEQ ID NO:148]

H2 534 1N1G2: CDRH 2-2 YISYSGDTYYNPSLKS [SEQ ID NO:149]

H1 26 1N1G1; H1 144 1N1G1; H2 103 1N1G2; H1 72 1N1G1; H1 34 1N1G1; H1 27 1N1G1: CDRH 2-3 RIKSKTDGGTTDYAAPVKG [SEQ ID NO:150]

H1 143 1N1G1: CDRH 2-4 RIKSKTDGGTTDNAAPVKG [SEQ ID NO:151]

H1 39 1N1G1: CDRH 2-5 RIKSKTDGGTADYAAPVKG [SEQ ID NO:152]

H2 65 1N1G2: CDRH 2-6 RIKTKTDGGTTDYAAPVKG [SEQ ID NO:153]

H1 16 1N1G1: CDRH 2-7 RIKSKTDGWTTDYAAPVKG [SEQ ID NO:154]

H1 33 1N1G1; H1 33 1 1N1G1; H1 109 1N1G1; H1 131 1N1G1: CDRH 2-8 WINPNSGGTNYAQKFQG [SEQ ID NO:155]

H1 4 1N1G1: CDRH 2-9 GIGTAGDTYYPGSVKG [SEQ ID NO:156]

H2 369 1N1G2; H2 508 1N1G2; H2 360 1N1G2: CDRH 2-10 GFDPEDGETIYAQKFQG [SEQ ID NO:157]

H2 475 1N1G2; H1 90 1N1G1; H1 134 1N1G1: CDRH 2-11 VIWYDGSNKYYADSVKG [SEQ ID NO:158]

H2 380 1N1G2: CDRH 2-12 YIYYSGNTNYNPSLKS [SEQ ID NO:159]

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H1 66 1N1G1: CDRH 2-13 VIWYDGSNEYYADSVKG [SEQ ID NO:160]

H2 131 1N1G2: CDRH 2-14 RIYTSGSTHYNPSLKS [SEQ ID NO:161]

H2 291 1N1G2: CDRH 2-15 VIWYDGSYKYYADSVKG [SEQ ID NO:162]

H1 2 1N1G1; H1 30 1N1G1; H1 42 1N1G1: CDRH 2-16 WISAYNGNTNYAQKLQG [SEQ ID NO:163]

H2 550 1N1G2: CDRH 2-17 WISAYNGNPNYAQKFQG [SEQ ID NO:164]

H1 13 1N1G1: CDRH 3-1 GIAATGTLFDC [SEQ ID NO:165]

H1 26 1N1G1; H1 144 1N1G1: CDRH 3-2 EYYGSGGVWYYGMDV [SEQ ID NO:166]

H1 143 1N1G1: CDRH 3-3 GGSLLWTGPNYYYYGMDV [SEQ ID NO:167]

H1 33 1N1G1; H1 331 1N1G1: CDRH 3-4 DSNWYHNWFDP [SEQ ID NO:168]

H1 10 91N1G1: CDRH 3-5 GGYSGYDLGYYYGMDV [SEQ ID NO:169]

H1 39 1N1G1: CDRH 3-6 EGPYSDYGYYYYGMDV [SEQ ID NO:170]

H1 534 1N1G1: CDRH 3-7 LDLYGDYFDY [SEQ ID NO:171]

H1 4 1N1G1: CDRH 3-8 EGSWYGFDY [SEQ ID NO:172]

H1 103 1N1G1: CDRH 3-9 EYYHILTGSFYYSYYGMDV [SEQ ID NO:173]

H2 65 1N1G2: CDRH 3-10 EYYGIVTGSFYYYYYGMDV [SEQ ID NO:174]

H2 369 1N1G2: CDRH 3-11 RAGTTLAYYYYAMDV [SEQ ID NO:175]

H2 508 1N1G2: CDRH 3-12 AGLEIRWFDP [SEQ ID NO:176]

H2 475 1N1G2: CDRH 3-13 SSGDYYGMDV [SEQ ID NO:177]

H2 380 1N1 G2: CDRH 3-14 IATRPFDY [SEQ ID NO:178]

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H2 131 1N1G2: CDRH 3-15 DRVFYGMDV [SEQ ID NO:179]

H2 291 1N1G2: CDRH 3-16 EGDYSDYYGMDV [SEQ ID NO:180]

H1 131 1N1G1: CDRH 3-17 DRGQLWLWYYYYYGMDV [SEQ ID NO:181]

H1 66 1N1G1: CDRH 3-18 SSGNYYDMDV [SEQ ID NO:182]

H1 90 1N1G1: CDRH 3-19 SSSNFYDMDV [SEQ ID NO:183]

H1 16 1N1G1: CDRH 3-20 DLRITGTTYYYYYYGMDV [SEQ ID NO:184]

H2 550 1N1G2: CDRH 3-21 DQGLLGFGELEGLFDY [SEQ ID NO:185]

H1 2 1N1G1; H1 30 1N1G1; H1 42 1N1G1: CDRH 3-22 ESWFGEVFFDY [SEQ ID NO:186]

H2 360 1N1G2: CDRH 3-23 GVMITFGGVIVGHSYYGMDV [SEQ ID NO:187]

H1 72 1N1G1: CDRH 3-24 EGPYSNYGYYYYGVDV [SEQ ID NO:188]

H1 34 1N1G1; H1 27 1N1G1: CDRH 3-25 DGATVVTPGYYYYGTDV [SEQ ID NO:189]

H1 1341N1G1: CDRH 3-26 SSWSYYGMDV [SEQ ID NO:190]

TABLA 3B: Secuencias de CDRL de ejemplo

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H1 26H1 26 1VK2KK; H1 13H1 13 1NVK2KK: CDRL1-1 RSSQSLVYSDGNTYLN [SEQ ID NO:191]

H1 331 1N1K: CDRL1-2 RASQSISDYLN [SEQ ID NO:192]

H1 2 1N1K: CDRL1-3 KSSQSVLDSSDNKNYLA [SEQ ID NO:193]

H1 42 1N1K: CDRL1-0 KSSQSVLDSSNNKNFLA [SEQ ID NO:194]

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H1 30 1N1K: CDRL1-5 KSSQGVLDSSNNKNFLA [SEQ ID NO:195]

H2 369 1N1K: CDRL1-6 RASQSISRYLN [SEQ ID NO:196]

H1 131 1N1K: CDRL1-7 KSSQSLLSDGKTYLY [SEQ ID NO:197]

H1 16 1N1K; H1 90 1N1K; H1 34 1N1K; H1 72 1N1K; H2 103 1N1K; H1 271N1K; H1 144 1N1K; H1 39 1N1K; H1 131N1K; H1 26 1N1K: CDRL1-8 QASQDISNYLN [SEQ ID NO:198]

H1 143 1N1K; H2651N1K; H1 134 1N1K: CDRL1-9 QASQDINNYLN [SEQ ID NO:199]

H2 475 1N1K: CDRL1-10 QASHDISNYLN [SEQ ID NO:200]

H1 109 1N1K: CDRL1-11 QASQNISNFLD [SEQ ID NO:201]

H1 109 1N1K SM: CDRL1-12 QASQDISNFLD [SEQ ID NO:202]

H1 661N1K: CDRL1-13 QASQDISNFLN [SEQ ID NO:203]

H2 550 1N1K: CDRL1-14 KSSQSVLYSSNNKNYLA [SEQ ID NO:204]

H2131 1N1K: CDRL1-15 RASQGFSNYLA [SEQ ID NO:205]

H2 360 1N1K: CDRL1-16 RASQGINNYLA [SEQ ID NO:206]

H2 508 1N1K: CDRL1-17 RSSQSLLHSNGYNYLD [SEQ ID NO:207]

H2 534 1N1K: CDRL1-18 RASQYIGSSLH [SEQ ID NO:208]

H1 64 1N1K: CDRL1-19 RASQSVSSGYLAYLA [SEQ ID NO:209]

H2 380 1N1K: CDRL1-20 RASQGIRNDLD [SEQ ID NO:210]

H1 26H1 26 1NVK2KK; H1 13H1 13 1NVK2KK: CDRL2-1 KVSNWDS [SEQ ID NO:211]

H1 331 1N1K; H2 369 1N1K; H2 380 1N1K: CDRL2-2 AASSLQS [SEQ ID NO:212]

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H2 550 1N1K: CDRL2-3 WASTRES [SEQ ID NO:213]

H1 2 1N1K; H1 42 1N1K; H1 30 1N1K: CDRL2-4 WASNRES [SEQ ID NO:214]

H1 131 1N1K: CDRL2-5 EASNRFS [SEQ ID NO:215]

H1 16 1N1K; H1 90 1N1K; H1 34 1N1K; H2 65 1N1K; H1 72 1N1K; H2 475 1N1K; H2103 1N1K; H1 27 1N1K; H1 144 1N1K; H1 39 1N1K; H1 131N1K; H1 26 1N1K; H1 661N1K: CDRL2-6 DASNLET [SEQ ID NO:216]

H1 143 1N1K: CDRL2-7 DTSNLEP [SEQ ID NO:217]

H1 109 1N1K: CDRL2-8 DASDLDP [SEQ ID NO:218]

H1 134 1N1K: CDRL2-9 DASNLEI [SEQ ID NO:219]

H2 131 1N1K: CDRL2-10 AASTLQS [SEQ ID NO:220]

H2 360 1N1K: CDRL2-11 VASTLQS [SEQ ID NO:221]

H2 534 1N1K: CDRL2-12 YVSQSFS [SEQ ID NO:222]

H1 64 1N1K: CDRL2-13 GASSTAT [SEQ ID NO:223]

h2 508 1NIK: CDRL2-14 LGSIRAS [SEQ ID NO:224]

H1 26H1 26 1NVK2KK: CDRL3-1 MQGTHWPIT [SEQ ID NO:225]

H1 13H1 13 1NVK2KK: CDRL3-2 MQGTHWPRGLFT [SEQ ID NO:226]

H1 331 1N1K: CDRL3-3 QQTYSDPFT [SEQ ID NO:227]

H1 21N1K; H1 42 1N1K; H1 30 1N1K: CDRL3-4 QQYYSDPFT [SEQ ID NO:228]

H2 369 1N1K: CDRL3-5 QQSYITPPS [SEQ ID NO:229]

H1 131 1N1K: CDRL3-6 MQSIOLPLT [SEQ ID NO:230]

H1 16 1N1K: CDRL3-7 QQYDNLIT [SEQ ID NO:231]

H1 90 1N1K: CDRL3-8 QRYDDLPIT [SEQ ID NO:232]

H1 143 1N1K; H1 34 1N1K; H1 72 1N1K; H2 103 1N1K; H1 27 1N1K; H1 144 1N1K; H1 39 1N1K; H1 26 1N1K: CDRL3-9 QQYDNLLT [SEQ ID NO:233]

H2 65 1N1K: CDRL3-10 QQYDDLLT [(SEQ ID NO:234]

H2 475 1N1K: CDRL3-11 QQYDNLPLT [SEQ ID NO:235]

Contenido en referencia: Designación Secuencia de aminoácidos/SEQ ID NO.

H2 109 1N1K: CDRL3-12 QQYVSLPLT [SEQ ID NO:236]

H1 134 1N1K: CDRL3-13 QQYDNFPFT [SEQ ID NO:237]

H1 13 1N1K: CDRL3-14 QQFDNLPPT [SEQ ID NO:238]

H2 550 1N1K: CDRL3-15 QQYYTTPPT [SEQ ID NO:239]

H1 66 1N1K: CDRL3-16 QQYDNLPFT [SEQ ID NO:240]

H2 131 1N1K: CDRL3-17 QKYNSAPLT [SEQ ID NO:241]

H2 360 1N1K: CDRL3-18 QKYNSGPFT [SEQ ID NO:242]

H2 508 1N1K: CDRL3-19 MQALQTPRT [SEQ ID NO:243]

H2 534 1N1K: CDRL3-20 HQSSSLPFT [SEQ ID NO:244]

H1 64 1N1K: CDRL3-21 QQYGSSPIT [SEQ ID NO:245]

H2 380 1N1K: CDRL3-22 LQYNSYPIT [SEQ ID NO:246]

La estructura y propiedades de las CDR dentro de un anticuerpo natural se han descrito, supra. Brevemente, en un anticuerpo tradicional, las CDR están incluidas dentro de un marco en la región variable de la cadena pesada y liviana donde constituyen las regiones responsables de la unión y el reconocimiento del antígeno. Una región variable 5 comprende al menos tres CDR de cadena pesada o liviana, véase, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; véase también Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de una región marco (designadas regiones marco 1-4, FR1, FR2, FR3 y FR4, por Kabat et al., 1991, supra; véase también Chothia and Lesk, 1987, supra). Sin embargo, las CDR proporcionadas en el presente documento pueden usarse no solo para definir el dominio de unión

10 a antígeno de una estructura de anticuerpo tradicional, sino que pueden estar incluidas en una variedad de otras estructuras polipeptídicas, como se describe en este documento.

En un aspecto, las CDR proporcionadas son (a) una CDRH seleccionada del grupo que consiste en (i) una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 136-147; (ii) una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 148-164; (iii) una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 165-190; y (iv) una CDRH 15 de (i), (ii) y (iii) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos de no más de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido; (B) una CDRL seleccionado del grupo que consiste en (i) una CDRL1 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 191-210; (ii) una CDRL2 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 211-224; (iii) una CDRL3 seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 225-246; y (iv) una CDRL de (i), (ii) y

(iii) que contiene una o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos de no más de cinco, cuatro, 20 tres, dos o un aminoácidos.

En otro aspecto, una proteína de unión a antígeno incluye formas variantes 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR enumeradas en las Tablas 3A y 3B, cada una con al menos 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia a una secuencia de CDR enumerada en las Tablas 3A y 3B. Algunas proteínas de unión a antígenos incluyen 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR enumeradas en las Tablas 3A y 3B, cada una de las cuales difiere en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de las

25 CDR enumeradas en estas tablas.

En otro aspecto más, las CDR descritas en este documento incluyen secuencias consenso derivadas de grupos de anticuerpos monoclonales relacionados. Como se describe en el presente documento, una "secuencia consenso" se refiere a secuencias de aminoácidos que tienen aminoácidos conservados comunes entre varias secuencias y aminoácidos variables que varían dentro de una secuencia de aminoácidos dada. Las secuencias consenso de CDR 30 proporcionadas incluyen CDR correspondientes a cada uno de CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

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5

10

15

20

25

30

35

rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbenoamarillo lucifer, Azul Cascade J, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Rojo 705, verde Oregon, los colorantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633 , Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascade , Amarillo Cascade y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina y Rojo Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Los colorantes ópticos adecuados, incluidos los fluoróforos, se describen en MOLECULAR PROBES HANDBOOK by Richard P. Haugland.

Marcadores fluorescentes proteináceos adecuados también incluyen, pero no se limitan a, proteína fluorescente verde, que incluye una especie Renilla, Ptilosarcus o Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263: 802-805), EGFP (Clontech Labs., Inc., número de acceso Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarilla potenciada (EYFP, Clontech Labs., Inc.), luciferasa (Ichiki et a., 1993, J. Immunol., 150: 5408-5417), β-galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2603-2607) and Renilla (documentos WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes de los Estados Unidos No. 5292658, No. 5418155, No. 5683888, No. 5741668, No. 5777079, No. 5804387, No. 5874304, No. 5876995, No. 5925558).

Ácidos nucleicos que codifican proteínas de unión al antígeno C-fms

También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de unión a antígeno descritas aquí, o porciones de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos que codifican una o ambas cadenas de un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo, polinucleótidos que codifican regiones variables de cadena pesada

o solo CDR, polinucleótidos suficientes para uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido y secuencias complementarias de los anteriores. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o más nucleótidos de longitud, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o ser parte de un ácido nucleico mayor, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). La Tabla 6 muestra secuencias de ácidos nucleicos de ejemplo que codifican una región constante de cadena pesada de IgG2 y una región constante de cadena liviana kappa de IgG2. Cualquier región variable proporcionada aquí puede unirse a estas regiones constantes para formar secuencias completas de cadena pesada y liviana. Sin embargo, debe entenderse que estas secuencias de regiones constantes se proporcionan solo como ejemplos específicos. En algunas realizaciones, las secuencias de región variable se unen a otras secuencias de región constante que son conocidas en la técnica. Ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas y livianas se proporcionan en la Tabla 7.

Tabla 6: Secuencias de ejemplo de ácidos nucleicos que codifican regiones constantes de cadenas pesadas y livianas La Tabla 7 muestra ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican regiones variables de cadena pesada y cadena liviana, en las que están incrustadas las diversas secuencias CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

Tipo: Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

Cadena pesada IgG2: imagen172

Tipo: Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

Cadena liviana kappa IgG2: imagen173

Tabla 7: Secuencias de ejemplo de ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadenas pesadas y livianas

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 109 1N1G1: VH1 imagen174

H1 13 1N1G1: VH2 imagen175

H1 131 1N1G1: VH3 imagen176

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 134 1N1G1: VH4 imagen177

H1 143 1N1G1: VH5 imagen178

H1 144 1N1G1: VH6 imagen179

H1 16 1N1G1: VH7 imagen180

H1 2 1N1G1: VH8 imagen181

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 26 1N1G1: VH9 imagen182

H1 27 1N1G1: VH10 imagen183

H1 30 1N1G1: VH11 imagen184

H1 33 11N1G1: VH12 imagen185

H1 33 1N1G1: VH13 imagen186

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 34 1N1G1: VH14 imagen187

H1 39 1N1G1: VH15 imagen188

H1 42 1N1G1: VH16 imagen189

H1 64 1N1G1: VH17 imagen190

H1 66 1N1G1: VH18 imagen191

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

VH19
VH19: imagen192

H1 90 1N1G1: VH20 imagen193

H2 103 1N1G2: VH21 imagen194

H2 131 1N1G2: VH22 imagen195

H2 291 1N1G2: VH23 imagen196

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H2 360 1N1G2: VH24 imagen197

H2 369 1N1G2: VH26 imagen198

H2 380 1N1G2: VH27 imagen199

H2 475 1N1G2: VH28 imagen200

H2 508 1N1G2: VH29 imagen201

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H2 534 1N1G2: VH30 imagen202

H2 550 1N1G2: VH31 imagen203

H2 65 1N1G2: VH32 imagen204

H1 109 1N1K: VL1 imagen205

H1 131 1N1K: VL3 imagen206

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 134 1N1K: VL4 imagen207

H1 143 1N1K: VL5 imagen208

H1 144 1N1K: VL6 imagen209

H1 16 1N1K: VL7 imagen210

H1 2 1N1K: VL8 imagen211

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 271N1K: VL10 imagen212

H1 30 1N1K: VL11 imagen213

H1 33-1 1N1K: VL12 imagen214

H1 34 1N1K: VL13 imagen215

H1 39 1N1K: VL14 imagen216

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H1 42 1N1K: VL15 imagen217

H1 64 1N1K: VL16 imagen218

H1 66 1N1K: VL17 imagen219

H1 72 1N1K: VL18 imagen220

H1 90 1N1K: VL19 imagen221

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H2 103 1N1K: VL20 imagen222

H2 131 1N1K: VL21 imagen223

H2 360 1N1K: VL22 imagen224

H2 369 1N1K: VL24 imagen225

H2 380 1N1K: VL25 imagen226

Referenci a: Designació n Secuencia de ácidos nucleicos/SEQ ID NO.

H2 475 1N1K: VL26 imagen227

H2 508 1N1K VL27
H2 508 1N1K VL27: imagen228

H2 534 1N1K VL28
H2 534 1N1K VL28: imagen229

H2 550 1N1K VL29
H2 550 1N1K VL29: imagen230

H2 65 1N1K VL30
H2 65 1N1K VL30: imagen231

Los ácidos nucleicos que codifican ciertas proteínas de unión a antígeno, o porciones de los mismos (por ejemplo, anticuerpo de longitud completa, cadena pesada o liviana, dominio variable, o CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 o CDRL3) pueden aislarse a partir de células B de ratones que han sido inmunizados con c-fms o un fragmento inmunogénico de los mismos. El ácido nucleico se puede aislar mediante procedimientos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presentación en fagos es otro ejemplo de una técnica conocida mediante la cual se pueden preparar derivados de anticuerpos y otras proteínas de unión a antígenos. En una metodología, los polipéptidos que son componentes de una proteína de unión a antígeno de interés se expresan en

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Clon de mAb
Clon de mAb: ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)

1.2.1: imagen250 8.17E+05 1.13E-03 1.4

1.42.3: 6 6.60E+05 1.07E-03 1.6

1.64.1: 7 2.55E+05 6.40E-04 2.5

1.30.2: 8 4.06E+05 1.40E-03 3.4

1.134.1: 9 1.53E+05 7.03E-04 4.6

2.475.2: imagen251 3.00E+05 1.40E-03 4.7

2.103.1: 11 7.51E+04 3.64E-04 4.8

1.39.3: 12 1.13E+05 6.08E-04 5.4

1.72.2: 13 1.03E+05 5.68E-04 5.5

2.360.3: 14 6.05E+04 3.38E-04 5.6

1.13.2: imagen252 1.20E+05 7.73E-04 6.4

2.65.2: 16 1.68E+05 1.60E-03 9.5

1.143.2: 17 5.50E+04 5.59E-04 10

1.90.2: 18 1.93E+05 2.00E-03 10

1.144.1: 19 2.30E+05 2.50E-03 11

1.26.1: imagen253 2.39E+05 2.63E-03 11

2.369.3: 21 1.00E+05 1.38E-03 14

1.16.2: 22 1.29E+05 2.96E-03 23

1.66.1: 23 2.39E+05 5.50E-03 23

2.550.1: 24 3.00E+05 7.24E-03 24

2.291.2: imagen254 2.86E+05 9.30E-03 33

1.27.3: 26 2.99E+05 1.00E-02 33

1.34.3: 27 3.65E+05 1.31E-02 36

1.131.1: 28 5.31E+04 2.15E-03 41

2.534.1: 29 3.45E+05 1.50E-02 43

En base a los ensayos de inhibición de la unión y de inhibición de la proliferación, se seleccionaron 16 de los 29 sobrenadantes (once isotipos IgG1 y cinco isotipos IgG2) para su posterior caracterización. La reactividad cruzada con c-fms de ratón y cynomolgus se probó mediante la inhibición de la proliferación de DRM de células de ratón de 5 células primarias de médula ósea de cynomolgus (una línea celular monocítica inmortalizada ras y myc derivada de cultivo de células de médula de ratón Dexter), respectivamente, inducidas por CSF-1.. Con respecto a la proliferación celular, ninguno de los sobrenadantes inhibió la proliferación de las células DRM de ratón (datos no mostrados) mientras que 13 de 16 sobrenadantes inhibieron la proliferación de las células de la médula ósea de Cynomolgus. Los sobrenadantes también se ensayaron para la inhibición de la proliferación inducida por CSF-1 de monocitos CD14+

10 derivados de sangre periférica humana y se volvieron a analizar en el bioensayo de AML-5 humano (ver la sección ensayo anterior), cuyos resultados se muestran en las Tablas 9 y 10. El anticuerpo 2-4A5 (Biosource), que es un anticuerpo anti-c-fms humano de rata, se usó como control positivo.

Cuatro anticuerpos IgG1 de isotipo tenían una potencia <10 pM en el bioensayo de AML-5 y tres de los anticuerpos, los ID de Clon Nos. 1.2.1, 1.109.3 y 1.134.1, inhibieron la proliferación de las células de la médula ósea de cynomolgus. 15 De los tres anticuerpos, los clones 1.2.1 y 1.109.3 tuvieron la mayor afinidad por c-fms en el ensayo de unión de Biacore. Dos anticuerpos isotipo IgG2, 2.103.3 y 2.360.2, mostraron alta potencia en los bioensayos de AML-5 y de médula ósea de cynomolgus y afinidades similares por c-fms en el ensayo Biacore. Los cinco anticuerpos que mostraron alta potencia en los bioensayos de la médula ósea AML-5 y cynomolgus también mostraron diversidad en la secuencia. En función de estos factores de potencia, afinidad y diversidad, se eligieron los clones 1.2.1, 1.109.3 y

20 2.360.2 para un desarrollo y caracterización adicionales.

TABLA 9: Resumen de resultados de bioensayos para los sobrenadantes de hibridoma anti-C-fms

Clon ID: Bioensayo de médula ósea de Cynomolgus (media, n=2) IC50 (pM) Bioensayo de monocitos humanos CD14+ (n=1) IC50 (pM) Bioensayo de AML-5 (media, n=3 o 4) IC50 (pM)

1.2.1: 40 <7 6

1.26.1: 33 13 27

1.27.2: 933 200 73

1.30.3: 267 67 40

1.39.2: 67 67 27

1.42.3: 200 67 20

1.64.2: NA* 13 4

1.66.2: 47 67 27

1.109.3: 73 20 5

1.134.1: 40 <7 7

1.143.1: 360 ND** 100

2.103.3: 27 133 53

2.360.2: 53 67 27

2.475.2: 167 67 40

2.508.2: NA* 133 20

2.534.2: NA* 47 20

2-4A5: 8333 667 187

c-fms-Fc: 617 556 210

Anti-CSF-1: 3333 667 20

*NA=Sin Actividad, No cruzado-Reactivo; **ND = No hecho

TABLA 10: Sinopsis de los resultados de bioensayos para sobrenadantes de hibridoma anti-c-fms

Clon: Concentración de media-máx. (IC50, ng/ml)

Bioensayo de médula ósea de Cynomolgus (media, n=2): Bioensayo de monocitos humanos CD14+ (n=1) Bioensayo de AML-5 (media, n=3 o 4) AML-5 x diferencia

1.2: 6 <1 0.9 4

1.26.1: 5 2 4 24

1.27.2: 140 30 11 44

1.30.3: 10 10 6 24

1.39.2: 30 10 4 24

1.42.3: imagen255 10 3 9

1.64.2: NA* 2 0.6 8

1.66.2: 7 10 4 12

1.109.3: 11 3 0.7 1.4

1.134.1: 6 <1 1 3

1.143.1: 54 ND** 15 119

2.103.1: 4 20 8 19

2.360.2: 8 10 4 11

2.475.2: 25 10 6 18

2.508.2: NA* 20 5 20

imagen256

imagen257

Anticuerpo: Bioensayo AML-5 IC50 (pM) Bioensayo de médula ósea de Cynomolgus IC50 (pM) Inhibición (KI) de unión de 125I-CSF-1 a AML-5 (pM) Afinidad de unión (KD) a c-fms monoméricas por Biacore (pM)

1.2: 27 78 8.5 516

1.2 SM*: 12 81 11.5 548

1.109: 27 16 13.5 51

1.109 SM*: imagen258 23 9.7 102

2.360: 60 67 ∼160 535

2.360 SM*: imagen259 imagen260 ∼900 1200

*SM = mutación somática curada

La actividad del anticuerpo 1.2 SM se investigó adicionalmente en ensayos de proliferación usando células monocíticas de médula ósea de Cynomolgus o humanas. Para el ensayo humano, las células humanas se incubaron con 11.1 ng/ml de CSF-1 humana recombinante en presencia de concentraciones decrecientes de anticuerpo 1.2 SM. Para el

5 ensayo en cynomolgus, las células de cynomolgus se incubaron con 29.63 ng/ml de CSF-1 humana recombinante en presencia de concentraciones decrecientes de anticuerpo 1.2 SM. El anticuerpo IgG2 humano se usó en experimentos de control. Después de 7 días, se midió la proliferación celular usando CellTiter-Glo (Promega, Madison WI) para determinar los niveles de ATP. El ajuste de la curva de regresión no lineal se realizó para determinar la IC50 del anticuerpo. La Tabla 13 muestra los resultados de tres conjuntos de experimentos.

10 Tabla 13: Actividad del anticuerpo clonado 1.2 SM en ensayos de proliferación celular

Célula monocítica de médula ósea: IC50 de 1.2 SM en presencia de hCSF-1 (pM)

imagen261: Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Promedio S. D.

Humana: 15.5 20.1 10.9 15.5 4.6

Cynomolgus: 42.55 26.01 22.90 32.73 13.89

Ejemplo 6: Inhibición de la fosforilación de tirosina C-fms

Para mostrar que los mAb IgG2 anti-c-fms, 1.109, 1.2 y 2.360, son capaces de una inhibición completa o casi completa de la respuesta de fosfotirosina (pTyr), se trataron células 293T/c-fms con estos mAbs durante 1 hora en diversas 15 concentraciones a 37°C antes de la estimulación de CSF-1.

Diversas concentraciones de los mAbs de IgG2 usando diluciones de titulación fueron de 1.0, 0.1, 0.01, 0.001 y 0.0001 μg/ml. Como controles, se usaron un anticuerpo monoclonal anti-c-fms no bloqueante, mAb 3-4A4 (BioSource, Int.) y un anticuerpo no relevante, hCD39 M105, cada uno a 1.0 μg/ml. Se trataron células 293T/c-fms carentes de suero con cada uno de los mAb IgG2 (PT) usando las diversas concentraciones mencionadas anteriormente, y cada 20 concentración variando en una dilución de diez veces antes de una estimulación de CSF-1 de cinco minutos a 50 ng/ml durante 5 minutos. Tras la estimulación, se recogieron lisados de células completas, se inmunoprecipitaron a 4ºC durante la noche con un anticuerpo policlonal C20 anti-c-fms (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y se examinaron mediante transferencia Western en la que se inmunosondeó la transferencia con un anticuerpo anti-pTyr genérico, 4G10 (Upstate Biotechnology), y un anticuerpo anti-C-fms C20 para los niveles de fosforilación de tirosina de c-fms y

25 c-fms, respectivamente.

Para hacer crecer las células 293T/c-fms en placas de 24x10 cm, a 37°C en 5% de CO2, se recogieron once matraces T175 (~50-60% confluentes) a través de 4 ml de tripsina/matraz (Gibco-Invitrogen) y se transfirieron a 70 ml de DMEM (Gibco)/10% de FBS (JRH Biosciences). A cada placa de 10 cm se le aplicaron luego 10 ml de medio y se inocularon con 2 ml de las células recolectadas. Se preparó medio DMEM/-FBS durante 1 hora a 37°C. Se retiró el medio de cultivo de placas de 10 cm mediante aspiración cuidadosa, eliminando tanto medio que contenga FBS como fue posible. Se añadieron diez ml de DMEM/-FBS y la mezcla se incubó durante 1 hora a 37ºC.

Después de la privación de suero durante 1 hora a 37°C, se eliminó el medio. Los tratamientos con anticuerpos y los controles con menos-Ab se establecieron con 4.0 ml de las muestras que contenían Ab diluidas en serie o con DMEM/-FBS solo, y se incubaron durante otra hora más a 37°C para proporcionar un total de 2 horas de suero inanición. El pretratamiento del anticuerpo y la estimulación del ligando se ilustran en la Tabla 14.

Tabla 14

Placa: Pretratamiento Ab Estimulación del ligando

#1: DMEM/-FBS (menos Ab) medio solo

#2: DMEM/-FBS (menos Ab) CSF-1

#3: CLON 1.109 @ 1.0 µg/ml medio solo

#4: CLON 1.2 @ 1.0 µg/ml medio solo

#5: CLON 2.360 @1.0 µg/ml medio solo

#6: 3-4A4 @ 1.0 µg/ml medio solo

#7: M105 @ 1.0 µg/ml medio solo

#8: CLON 1.109 @ 1.0 µg/ml CSF-1

#9: CLON 1.109 @ 0.1 µg/ml CSF-1

#10: CLON 1.109 @ 0.01 µg/ml CSF-1

#11: CLON 1.109 @ 0.001 µg/ml CSF-1

#12: CLON 1.109 @ 0.001 µg/ml CSF-1

#13: CLON 1.2 @ 1.0 µg/ml CSF-1

#14: CLON 1.2 @ 0.1 µg/ml CSF-1

#15: CLON 1.2 @ 0.01 µg/ml CSF-1

#16: CLON 1.2 @ 0.001 µg/ml CSF-1

#17: CLON 1.2 @ 0.0001 µg/ml CSF-1

#18: CLON 2.360 @ 1.0 µg/ml CSF-1

#19: CLON 2.360 @ 0.1 µg/ml CSF-1

#20: CLON 2.360 @ 0.01 µg/ml CSF-1

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temperatura ambiente. Tabla 15: Valoración de anticuerpos monoclonales IgG2 C-fms

mAb (µg/µL): Volumen utilizado DMEM/-FBS

Clon 1.109 PT (0.41): 14.6 µL 6.0 ml

Clon 1.109 SM (G) (0.34): 17.6 µL 6.0 ml

Clon 1.109 SM (F/G) (0.58): 10.3 µL 6.0 ml

Clon 1.2 PT (1.57): 3.8 µL 6.0 ml

Clon 1.2 SM (0.35): 17.1 µL 6.0 ml

Clon 2.360 PT (0.41): 14.6 µL 6.0 ml

Clon 2.360 SM (0.55): 10.9 µL 6.0 ml

3-4A4 (0.2): 15 µL 3.0 ml

Se analizó una serie de diluciones de anticuerpos en serie (300 μL + 2.7 ml de DMEM/-FBS) dentro del intervalo de

1.0 μg/ml a 0.1 μg/ml para cada mAb. Después de 1 hora de privación de suero a 37ºC, se eliminó el medio y se prepararon pretratamientos de anticuerpos y controles menos-Ab de manera similar a como se describe en la Tabla

13. Los pretratamientos de anticuerpos y la estimulación del ligando se describen en la Tabla 16 a continuación:

Tabla 16 Se realizó pTyr inducido por ligando mediante mAbs anti-c-fms (formas SM) como se describe en el Ejemplo 6 para las formas de PT.

Placa No.: Ab-pretratamiento Estimulación del ligando

1: DMEM/-FBS (menos Ab) medio solo

2: DMEM/-FBS (menos Ab) CSF-1

3: 3-4A4 @ 1.0 µg/ml CSF-1

4: Clon 1.109 @ 1.0 µg/ml medio solo

5: Clon 1.109 @ 1.0 µg/ml CSF-1

6: Clon 1.109 @ 0.1 µg/ml CSF-1

7: Clon 1.109 SM-G @ 1.0 µg/ml medio solo

8: Clon 1.109 SM-G @ 1.0 µg/ml CSF-1

9: Clon 1.109 SM-G @ 0.1 µg/ml CSF-1

10: Clon 1.109 SM-F/G @ 1.0 µg/ml medio solo

Placa No.: Ab-pretratamiento Estimulación del ligando

11: Clon 1.109 SM-F/G @ 1.0 µg/ml CSF-1

12: Clon 1.109 SM-F/G @ 0.1 µg/ml CSF-1

13: Clon 1.2 @ 1.0 µg/ml medio solo

14: Clon 12 @ 1.0 µg/ml CSF-1

15: Clon 1.2 @ 0.1 µg/ml CSF-1

16: Clon 1.2 SM @ 1.0 µg/ml medio solo

17: Clon 1.2 SM @ 1.0 µg/ml CSF-1

18: Clon 1.2 SM @ 0.1 µg/ml CSF-1

19: Clon 2.360 @ 1.0 µg/ml medio solo

20: Clon 2.360 @ 1.0 µg/ml CSF-1

21: Clon 2.360 @ 0.1 µg/ml CSF-1

22: Clon 2.360 SM @ 1.0 µg/ml medio solo

23: Clon 2.360 SM @ 1.0 µg/ml CSF-1

24: Clon 2.360 SM @ 0.1 µg/ml CSF-1

Los experimentos que usan las células 293T/c-fms para comparar los efectos de las formas PT frente a SM de los tres

5 mAb IgG2 a 1.0 y 0.1 μg/ml no revelaron diferencias en la capacidad de inhibir las pTyr/C-fms inducidas por ligando (ver la Figura 6). Los clones 1.109 y 1.2 (ambas formas PT y SM) mostraron inhibición a concentraciones más bajas que con las formas 2.360 (formas PT y SM).

Los clones 1.109 y 1.2 (PT o SM) pudieron prevenir pTyr/c-fms inducidos por ligando in vitro cuando se trataron células 293T/c-fms con 0.1 μg/ml (8.3 nM) o mAb mayor durante 1 hora a 37°C antes de la adición de CSF-1 a 50 ng/ml (1.0

10 nM). La capacidad de estos anticuerpos monoclonales para bloquear la formación de pTyr/c-fms conduciría a la inhibición de la señalización de CSF-1, la migración de monocitos y, posteriormente, la acumulación de TAM. No pareció asociarse actividad agonista con estos mAbs, para evitar la activación del receptor de una manera que no depende de CSF-1. Los mAbs no mostraron actividad agonista cuando se usaron a una concentración de 1.0 μg/ml y tan alta como 10 μg/ml (datos no mostrados).

15 Por consiguiente, los mAb fueron capaces de prevenir pTyr/c-fms inducidos por ligando in vitro.

Ejemplo 8: Inmunoprecipitación de C-fms por mAb anti-c-fms

La capacidad de los mAb IgG2 anti-c-fms para unirse e inmunoprecipitar c-fms se logró utilizando las células 293T/cfms transfectadas establemente tal como se describió anteriormente. Los lisados de células enteras de células no estimuladas se inmunoprecipitaron durante la noche con cada mAb (PT y SM) y anticuerpo C20 anti-c-fms y se 20 examinaron por inmunoprecipitación Western sobre C20 Ab (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) como la sonda para detección de c-fms. C-fms fue inmunoprecipitado por anticuerpos monoclonales. Se prepararon lisados de 293T/c-fms

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transfectados establemente crecidos a 37ºC/5% de CO2 a aproximadamente 75% de confluencia y se combinaron con los anticuerpos monoclonales, como se muestra en la Tabla 17.

Tabla 17

Tubo No.: Ab (µg/µL) Ab (µL)

1: Clon 1.109 (0.41) 6.1

2: Clon 1.109 SM F/G (0.58) 4.3

3: Clon 1.2 (1.57) 1.6

4: Clon 1.2 SM (0.35) 7.1

5: Clon 2.360 (0.41) 6.1

6: Clon 2.360 SM (0.52) 4.8

7: C20 (0.2) 12.5

8: C19 (0.2) 12.5

Los experimentos de inmunoprecipitación usando lisados de células enteras no tratadas de 293T/c-fms estable demostraron una capacidad comparable de los diversos mAbs (excepto 2.360 SM) para unir y precipitar c-fms, en comparación con el control policlonal anti-c-fms C20; el clon 2.360-SM, sin embargo, exhibió una capacidad reducida en este ensayo (véase la Figura 7).

Ejemplo 9: Inmunoprecipitación de variantes de SNP por mAbs de IgG2

Los polimorfismos de un solo nucleótido o SNP son variaciones de la secuencia de ADN que se producen cuando se ha cambiado un único nucleótido (A, G, T o C) en la secuencia genómica. Los SNP pueden ocurrir tanto en las regiones codificadoras como no codificadoras del genoma humano. Muchos SNP no tienen ningún impacto en la función celular, pero los científicos consideran que otros SNP pueden predisponer a las personas a la enfermedad o tener un efecto en su respuesta a fármacos. Las variaciones en la secuencia de ADN pueden tener una gran influencia en la forma en que una persona responde a una enfermedad, agresiones ambientales (por ejemplo, bacterias, virus, toxinas y productos químicos), fármacos y otras terapias. Por esta razón, los SNP son de gran valor para la investigación biomédica, el desarrollo de productos farmacéuticos y el diagnóstico médico. Además, los mapas de SNP le permitirán al científico identificar múltiples genes que están asociados con enfermedades complejas como cáncer, diabetes y enfermedades vasculares.

La región extracelular de c-fms humanas se puede dividir en cinco dominios repetidos similares a inmunoglobulina (Ig) (designados de A a E). Véase, por ejemplo, Hampe, A. et al. (1989) Oncogene Res. 4: 9-17 para una discusión sobre los dominios humanos. Véase, por ejemplo, Wang, et al. (1993) Molecular and Cell Biology 13: 5348-5359 para los dominios correspondientes en la proteína de ratón. Se ha demostrado que los dominios A-C comprenden la región de unión a CSF-1, mientras que se ha demostrado que el dominio D ayuda a regular la dimerización del receptor tras la unión del ligando. Se prepararon tres variantes de SNP de origen natural de c-fms humanas, a saber, A245S, V279M en el dominio de Ig C y H362R en el dominio de Ig D (véase la Figura 8 para la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de c-fms). Estos SNP se encuentran en o cerca de la región de unión a CSF-1 y el examen por inmunoprecipitaciones Western sondeados con anti-c-fms H-300 (un anticuerpo policlonal de conejo generado contra los aminoácidos 11-310 que mapean cerca del N-terminal de c-fms humano/CSF-1R; Santa Cruz Biotech., Inc., Cat. No. sc-13949).

Para estudiar cómo las variantes humanas de c-fms SNP interactúan con los diversos anticuerpos c-fms proporcionados en el presente documento, se usaron células 293T transfectadas transitoriamente que expresan los tres tipos de variantes SNP c-fms, como se discutió anteriormente, y (WT) c-fms tipo silvestre (así como un control irrelevante, compatible con el vector) para evaluar la capacidad de cada mAb anti-c-fms para unirse a variantes de SNP mediante inmunoprecipitación.

Se transfectaron células 293T en placas duplicadas de 10 cm con c-fms A245S, V279M, H362R, WT c-fms y una construcción de control irrelevante en el vector de expresión de mamíferos pCIneo y se cultivaron durante 48 horas a 37°C/5% CO2. Los lisados celulares se prepararon como se describió anteriormente. Se añadieron mAbs anti-c-fms y anti-c-fms policlonales C20 o anti-c-kit C19 a 2.5 μg/ml en alícuotas de 1.0 ml a cada lisado como se ilustra en la Tabla

5 18.

Tabla 18 Las células se incubaron durante la noche a 4°C en un balanceador como se describe en el Ejemplo 6.

Tubo: Transfectante IP Ab (µg/µL) IP Ab (µL)

1: c-fms Clon 1.2 (1.57) 1.6

2: c-fms Clon 1.2 SM (0.5) 5.0

3: c-fms Clon 1.109 (0.41) 6.1

4: c-fms Clon 1.109 SM (0.5) 5.0

5: c-fms Clon 2.360 (0.41) 6.1

6: c-fms Clon 2.360 SM (0.5) 5.0

7: c-fms C20 (0.2) 12.5

8: c-fms C19 (0.2) 12.5

9: A245S Clon 1.2 (1.57) 1.6

10: A245S Clon 1.2 SM (0.5) 5.0

11: A245S Clon 1.109 (0.41) 6.1

12: A245S Clon 1.109 SM (0.5) 5.0

13: A245S Clon 2.360 (0.41) 6.0

14: A245S Clon 2.360 SM (0.5) 5.0

15: A245S C20 (0.2) 12.5

16: V279M Clon 1.2 (1.57) 1.6

17: V279M Clon 1.2 SM (0.5) 5.0

18: V279M Clon 1.109 (0.41) 6.1

19: V279M Clon 1.109 SM (0.5) 5.0

20: V279M Clon 2.360 (0.41) 6.1

21: V279M Clon 2.360 SM (0.5) 5.0

Tubo: Transfectante IP Ab (µg/µL) IP Ab (µL)

22: V279M C20 (0.2) 12.5

23: H362R Clon 1.2 (1.57) 1.6

24: H362R Clon 1.2 SM (0.5) 5.0

25: H362R Clon 1.109 (0.41) 6.1

26: H362R Clon 1.109 SM (0.5) 5.0

27: H362R Clon 2.360 (0.41) 6.1

28: H362R Clon 2.360 SM (0.5) 5.0

29: H362R C20 (0.2) 12.5

30: Menos-control Clon 1.2 (1.57) 1.6

31: Menos-control Clon 1.2 SM (0.5) 5.0

32: Menos-control Clon 1.109 (0.41) 6.1

33: Menos-control Clon 1.109 SM (0.5) 5.0

34: Menos-control Clon 2.360 (0.41) 6.1

35: Menos-control Clon 2.360 SM (0.5) 5.0

36: Menos-control C20 (0.2) 12.5

37: Menos-control C19 (0.2) 12.5

Los anticuerpos no revelaron pérdida de capacidad para unirse a las formas de SNP en comparación con el control de WT (Figura 9). Los mAb parecen tener la capacidad de unirse al rango de variantes de c-fms naturales.

5 La inmunoprecipitación a partir de lisados de células enteras no tratadas de 293T/c-fms estable demostró la misma capacidad de todos los diversos mAb (excepto 2.360 SM) para unir y precipitar c-fms en comparación con el control policlonal anti-c-fms; el clon 2.360 SM exhibió una capacidad claramente reducida en este ensayo. El examen de la capacidad de los diversos mAbs para inmunoprecipitar c-fms y variantes de SNP de células 293T/c-fms transfectadas transitoriamente no reveló pérdida de capacidad para unirse a las formas de SNP. La capacidad de los diversos mAb

10 para unir los SNP de c-fms indicó que reconocen las proteínas c-fms en todo el espectro de variantes conocidas que existen para los humanos.

Ejemplo 10: Inhibición de la unión de 125I-hCSF-1 por mAb anti-c-fms

La afinidad de los mAbs anti-c-fms por las c-fms humanas expresadas en la superficie celular se determinó midiendo la inhibición de la unión de 125I-hCSF-1 a células AML-5.

15 Se yodó hCSF-1 recombinante (Amgen) usando 125I (Amersham) e IODO-GEN® (Pierce). Se añadieron setenta y cinco μl de PBS, 10 μg de hCSF-1 y 1 mCi de 125I a un tubo de yodación prerrecubierto IODO-GEN® y se dejaron en hielo durante 15 minutos. La mezcla se transfirió a una columna P6 equilibrada de 2 ml en la que 125I-hCSF-1 se separó del 125I libre por filtración en gel. Las fracciones que contenían hCSF-1 yodado se agruparon, luego se diluyeron hasta

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Anticuerpo monoclonal: Proliferación de AML-5 IC50 (pM)* Proliferación de la médula ósea de Cynomolgus IC50 (pM) Inhibición (KI) de unión de 115I-CSF-1 a células AML-5 (pM) Afinidad de unión (KD) a c-fms por Biacore (pM) IP de células 293T que expresan Wt c-fms y SNP Inhibición sobre la inducción del ligando de pTyr de c-fms

1.2 SM**: 12 81 11.5 548 +++ +++

1.109: 27 16 13.5 51 +++ +++

1.109 SM**: imagen265 23 9.7 102 +++ +++

2.360: 60 67 ∼160 535 +++ ++

2.360 SM**: imagen266 imagen267 ∼900 1200 ++ ++

* Ensayo de células primarias en diana humana; ** SM = mutaciones somáticas eliminadas.

Ejemplo 12. Mapeo de epítopos de anticuerpos anti C-fms clones IgG2 1.109, 1.2 y 2.36

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Preparación de constructos de fusión C-fms-avidina

Los constructos de expresión de fusión c-fms avidina se muestran en la Figura 10. Para expresar cada proteína de fusión, la secuencia codificante para el dominio extracelular c-fms humano se amplificó por PCR y se clonó en pCEP4-Avidina (N), de manera que la secuencia c-fms se unió al extremo C de la secuencia de avidina de pollo usando la enzima de restricción XhoI. La secuencia de señal de c-fms no se incluyó, ya que la secuencia de señal para avidina de pollo se dejó intacta en el vector pCEP4-avidina (N).

Como se indicó anteriormente, el dominio extracelular contiene cinco regiones diferentes similares a Ig. Los diferentes dominios en c-fms humanos se discuten, por ejemplo, en Hampe et al., 1989, Oncogene Res. 4: 9-17. Para una discusión de los dominios correspondientes en c-fms de ratón, véase, por ejemplo, Wang et al., 1993, Molecular and Cell Biology 13: 5348-5359. Se prepararon las siguientes constructos de avidina diferentes para que se correspondan con el dominio similar a Ig indicado (véase la Figura 8 para la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular, SEQ ID No 1).

Señal: aminoácidos 1-19

Dominio similar a Ig 1: aminoácidos 20-126

Dominio 1-similara Ig 2: aminoácidos 20-223

Dominio similar a Ig 1-3: aminoácidos 20-320

Dominio similar a Ig 1-4: aminoácidos 20-418

Dominio similar a Ig 1-5: aminoácidos 20-512

dominio 2 solo similar a Ig 2: aminoácidos 85-223.

Por lo tanto, para crear regiones específicas de c-fms humanas (truncamientos) para el mapeo de epítopos, se realizó la amplificación por PCR para dirigirse a los siguientes aminoácidos: bucle similar a Ig1 (IPVI-ALLP), bucles similares a Ig 1 y 2 (IPVI-AQIV ), bucles similares a Ig 1-3 (IPVI-EGLN), bucles similares a Ig 1-4 (IPVI-GTLL), y bucles similares a Ig 1-5 (IPVI-PPDE), así como bucle similar a Ig 2 solo (TEPG-AQIV). Las secuencias identificadas entre paréntesis indican la secuencia de inicio y finalización respectivamente para cada uno de los dominios (véase la Figura 8). Las regiones particulares indicadas se seleccionaron para mantener los residuos de cisteína implicados en la formación del enlace disulfuro, ya que estos enlaces son importantes para mantener la estructura tridimensional nativa de los dominios. Además, la construcción para el bucle similar a Ig 2 solo incluye alguna secuencia del bucle similar a Ig 1 por la misma razón. En consecuencia, los aminoácidos iniciales y finales de los dominios que se enumeran difieren un tanto de las regiones de dominio especificadas en los artículos de Hampe y Wang enumerados anteriormente.

Expresión de proteínas de fusión de avidina

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Claims

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