ES2651143T3

ES2651143T3 - Antígenos de F de prefusión del VRS

Info

Publication number: ES2651143T3
Application number: ES12722057.2T
Authority: ES
Inventors: Kurt Swanson; Andrea Carfi
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-05-14
Publication date: 2018-01-24
Anticipated expiration: 2032-05-14
Also published as: US20220332767A1; EP3275892B1; SI2707385T1; MX2013013133A; RS56748B1; JP2014519819A; SG194755A1; CY1122826T1; AU2012255971A1; HRP20171703T1; DK2707385T3; DK3275892T3; US20230287056A1; CA2835644C; PL3275892T3; NO2707385T3; LT2707385T; EP3275892A3; US20140248314A1; WO2012158613A1

Abstract

Un polipéptido F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS), en el que la región HRA, restos 137-239 de la SEQ ID NO:1 de la proteína F del VRS de referencia, contiene un resto de cisteína introducido y la región DIII, restos 51-98 y 206-308 de la SEQ ID NO:1 de la proteína F del VRS de referencia, contiene un resto de cisteína introducido, y se forma un puente disulfuro entre el resto de cisteína introducido en le región HRA y el resto de cisteína introducido en la región DIII que estabiliza el polipéptido F de prefusión del VRS.

Description

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DESCRIPCION

Antígenos de F de prefusión del VRS Antecedentes de la invención

El virus respiratorio sincitial (VRS) es un virus de ARN no codificante no segmentado y con envoltura de la familia Paramyxoviridae, género Pneumovirus. Es la causa más común de bronquiolitis y neumonía entre los niños en su primer año de vida. El VRS también provoca infecciones repetidas incluyendo la enfermedad grave del tracto respiratorio inferior, que puede tener lugar a cualquier edad, especialmente entre los ancianos o aquellos con sistemas cardíaco, pulmonar o inmunitario comprometidos.

Para infectar a una célula hospedadora, los paramixovirus tales como VRS, como otros virus con envoltura tales como el virus de la gripe y el VIH, requieren la fusión de la membrana del virus con la membrana de un hospedador. Para el VRS, la proteína de fusión conservada (F de VRS) fusiona las membranas vírica y celular acoplando el replegamiento irreversible de la proteína con la yuxtaposición de las membranas. En los modelos actuales, basados en estudios en paramixovirus, la proteína F del VRS se pliega inicialmente en una conformación de "prefusión". Durante la penetración en la célula, la conformación de prefusión se somete a un replegamiento y a cambios conformacionales hacia su conformación "postfusión".

La proteína F del VRS se traduce a partir del ARNm en una proteína de aproximadamente 574 aminoácidos denominada F0. El procesamiento postraduccional de F0 incluye la retirada de un péptido señal en el extremo N- terminal mediante una peptidasa señal en el retículo endoplasmático. F0 también se escinde en dos lugares (109/110 y 136/137) mediante proteasas celulares (en particular, furina) en el trans del Golgi. Esta escisión da como resultado la retirada de una secuencia corta intermedia y genera dos subunidades denominadas F1 (de aproximadamente 50 kDa; en C-terminal; aproximadamente los restos 137-574) y F2 (de aproximadamente 20 kDa; en N-terminal; aproximadamente los restos 1-109) que permanecen asociadas entre sí. F1 contiene un péptido de fusión hidrofóbico en su extremo N-terminal y también dos regiones heptadas repetidas anfipáticas (HRA y HRB). HRA está cerca del péptido de fusión y HRB está cerca del dominio transmembrana. Tres heterodímeros F1-F2 se ensamblan como homotrímeros de F1-F2 en la superficie del virión.

Actualmente no ha disponible una vacuna frente a la infección por VRS, pero se desea. Los candidatos de vacuna basados en el antígeno principal de neutralización del VRS, la glucoproteína F, han fracasado debido a problemas con la estabilidad, la pureza, la reproducibilidad y la potencia. Las estructuras cristalinas de las glucoproteínas F de parainfluenza relacionadas han revelado un gran cambio conformacional entre los estados de prefusión y postfusión. La magnitud del reordenamiento sugirió que los antígenos F postfusión no promoverían la formación de anticuerpos neutralizantes de manera eficaz, que presumiblemente se deben unir a epítopos expuestos en la conformación de prefusión. Por consiguiente, los esfuerzos para producir una vacuna frente al VRS se han centrado en desarrollar vacunas de subunidad que contienen las formas de prefusión de la F del VRS (véase, por ejemplo, los documentos WO 2010/149745, WO 2010/149743, y WO 2009/079796). Este enfoque en las formas de prefusión de la F del VSR se ha corroborado mediante modelos disponibles de la F del VRS.

La F de prefusión es una estructura "metaestable" que se reordena fácilmente en el estado postfusión de menor energía, que después se agrega debido a la exposición de un péptido de fusión hidrofóbico (Begona Ruiz-Arguello, M. y col. Virology 298, 317-326 (2002) (142)). Las grandes diferencias estructurales entre el trímero de F de prefusión con forma de piruleta y el trímero de F de postfusión con forma de muleta son evidentes incluso a la resolución de microscopía electrónica de muestras teñidas negativamente, sugiriendo que la F de prefusión y de postfusión pueden ser antigénicamente diferentes (Calder, L. J. y col. Virology 271, 122-131 (2000) (143)). Para evitar la entrada del virus, los anticuerpos neutralizantes específicos de F supuestamente deben unirse a la conformación de prefusión de F en el virión, antes de que la envoltura vírica se fusione con una membrana celular. Sin embargo, los esfuerzos para generar un antígeno de la subunidad F de prefusión estabilizado soluble aún no han proporcionado candidatos adecuados para el ensayo en seres humanos. Además, el análisis del complejo motavizumab-péptido y el modelo de homología sugirieron que el epítopo neutralizante dominante reconocido por palivizumab y motavizumab podría estar incluido en la F trimérica, requiriendo al menos una disociación local para la exposición en superficie para permitir la unión de anticuerpos (McLellan, J. S. y col. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010)). Existe una necesidad de composiciones mejoradas de proteína F del VRS y procedimientos para preparar composiciones de proteína F del VRS.

Sumario de la invención

La invención proporciona un polipéptido F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS), en el que la región HRA, restos 137-239 de la SEQ ID NO:1 de la proteína F del VRS de referencia, contiene un resto de cisteína introducido y la región DIII, restos 51-98 y 206-308 de la SEQ ID NO:1 de la proteína F del VRS de referencia, contiene un resto de cisteína introducido, y se forma un puente disulfuro entre el resto de cisteína introducido en le región HRA y el resto de cisteína introducido en la región DIII que estabiliza el polipéptido F de prefusión del VRS.

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La invención se refiere a polipéptidos F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS).

En algunos aspectos, el polipéptido F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS) comprende adicionalmente al menos dos restos de cisteína introducidos que están en estrecha proximidad entre sí, y forman un puente disulfuro que estabiliza el polipéptido F de prefusión del VRS. En realizaciones particulares, la región HRB contiene un resto de cisteína introducido y la región DI y/o DII contienen un resto de cisteína introducido, y se forma un puente disulfuro entre el resto de cisteína introducido en la región HRB y el resto de cisteína introducido en la región DI o DII. En otras realizaciones, la región HRA contiene al menos 2 restos de cisteína introducidos, y se forma un puente disulfuro entre los restos de cisteína introducidos en la región HRA.

En otros aspectos, el polipéptido F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS) comprende adicionalmente una modificación postfusión seleccionada del grupo que consiste en la deleción de la hélice HRA, la deleción de la hélice HRB, la introducción de mutaciones puntuales, la adición de sitios de glicosilación y combinaciones de las mismas, en las que dicha modificación postfusión desestabiliza la conformación de postfusión. En algunas realizaciones, la modificación desestabilizante de postfusión es la deleción de la hélice HRB, en su totalidad o en parte. Si se desea, la modificación desestabilizante de postfusión puede comprender adicionalmente la deleción del péptido de fusión, en su totalidad o en parte. En otras realizaciones, la modificación desestabilizante de postfusión incluye la adición de un sitio de glicosilación, tal como la glicosilación en un resto seleccionado del grupo que consiste en la posición 173, la posición 175 y la posición 184.

En otro aspecto, una proteína F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS) comprende tres monómeros F del VRS, en los que al menos dos de los monómeros contienen un resto de cisteína introducido, los restos de cisteína introducidos están en estrecha proximidad entre sí y forman un puente disulfuro que estabiliza la proteína F de prefusión del VRS.

En otro aspecto, la divulgación es una proteína F de prefusión quimérica que comprende una proteína F estabilizada de un virus que no sea VRS, tal como el polipéptido F del virus parainfluenza o un polipéptido F del virus metapneumovirus, que contiene uno o más epítopos neutralizantes de la F del VRS. Los epítopos neutralizantes adecuados se pueden seleccionar del grupo que consiste en los epítopos que se reconocen por motavizumab, palivizumab, mAb 11, mAb 151, mAb 1129, mAb 1153, mAb 1200, mAb 1214, mAb 1237, mAb 47F, mAb 7C2, mAb B4, Fab 19, mAb AK13A2, mAb 7,936, mAb 9,936, mAb 19, mAb 20, mAb 101F y combinaciones de los mismos.

la divulgación se refiere a procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria frente al virus respiratorio sincitial (VRS) en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que comprende una proteína F de prefusión del VRS o una proteína F quimérica de prefusión. Preferentemente, la respuesta inmunitaria inducida se caracteriza por anticuerpos neutralizantes para el VRS y/o inmunidad protectora frente al VRS.

En aspectos particulares, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir o generar anticuerpos neutralizantes anti-proteína F del virus respiratorio sincitial (VRS) en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que comprende una proteína F de prefusión del VRS o una proteína F quimérica de prefusión.

En aspectos particulares, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir o generar inmunidad protectora frente al virus respiratorios sincitial (VRS) en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que comprende una proteína F de prefusión del vRs o una proteína F quimérica de prefusión.

En aspectos particulares, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden una proteína F del virus respiratorio sincitial (VRS) o una proteína F quimérica de prefusión.

La proteína F de prefusión del VRS que se usa en la invención puede ser de longitud completa o truncada, tal como un ectodominio soluble que carece de los dominios citoplasmático y transmembrana. La proteína F de prefusión del VRS, por ejemplo, de longitud completa o el ectodominio soluble, puede comprender sitios de escisión de furina funcionales en las posiciones 109/110 y 136/137. En algunas realizaciones preferentes, esa proteína F de prefusión del VRS (por ejemplo, de longitud completa o el ectodominio soluble) contiene la secuencia de aminoácidos de la porción correspondiente (por ejemplo, ectodominio) de una proteína F del VRS de origen natural. En cualquiera de los aspectos de la invención, la proteína F de prefusión del VRS se puede administrar con o sin un adyuvante según se desee, y la composición inmunogénica puede comprender un adyuvante si se desea.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra un alineamiento de secuencias basado en la estructura de cuatro proteínas F, la asignación secundaria y las características clave. El alineamiento de las F del VRS (SEQ ID NO:33), del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) (SEQ ID NO:34), del VPI3 (SEQ ID NO:36) y del VPI5 (SEQ ID NO:35) se generó con ClustalW2 (
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/), se ajustó de forma manual basándose en la superposición estructural usando Lsqkab del conjunto de programas CCP4 y se visualizó usando ESPript versión 2.2 (
http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/). Las características de la F del VRS se indican por encima de las

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secuencias; las características de la F del VPI3 se indican por debajo de las secuencias. *CHO indica los sitios de glicosilación de la F del VRS. Los elementos de estructura secundaria se indican, con flechas paralelas a las secuencias que designan las láminas p, cilindros que designan las a-hélices, "TT" que designa los giros y espirales que designan 310 hélices. Se indican los símbolos de la localización del dominio de estructura secundaria (DI, DII, DIII), excepto para las hélices a5 y a6 del VRS, que se marcan para indicar que forman el sitio de unión de Motavizumab y p20 y p21, que se marcan para indicar que forman el sitio de unión 101F. Los números redondeados (VRS) o los números en triángulos (VPI3) designan restos que forman puentes disulfuro, con el mismo número para cada compañero en un par enlazado por puente disulfuro. Los sitios de escisión de furina para la F del VRS y la F del VPI3 se indican con flechas verticales marcadas Fr. La región p27 de la F del VRS liberada a partir de la proteína tras la escisión de furina se indica mediante una barra negra. Los péptidos de fusión de la F del VRS y de la F del VPI3 están marcados. La flecha en el péptido de fusión indica el primer resto del fragmento F1 en la construcción de deleción de péptido de fusión usada en el presente estudio. Los restos que son idénticos en todas las cuatro proteínas se indican mediante recuadros sombreados. Los péptidos usados para investigar los sitios de unión de neutralizantes están en cajas abiertas y las mutaciones de resistencia se indican mediante asteriscos.

La FIG. 2 muestra la microscopía electrónica y el análisis de dicroísmo circular del trímero de F de postfusión del VRS. En la FIG. 2A una micrografía electrónica de la proteína F del VRS muestra un campo de fenotipos de muleta uniformes consistentes con la estructura de las proteínas F de postfusión. La FIG. 2B muestra una curva de DC de la fusión del trímero F de postfusión del VRS observada a 210 nm, el mínimo del espectro observado de la proteína F plegada del VRS. La absorción del DC, eje Y, se representa frente a la temperatura, eje X. La FIG. 2C muestra un espectro de DC del trímero F de postfusión del VRS a 20° y 95 °C. El espectro se registró desde 320 hasta 190 nm y mostró a ambas temperaturas un mínimo helicoidal característico para una proteína plegada.

La FIG. 3 muestra densidades electrónicas representativas de la proteína F del VRS cristalizada. La FIG. 3A es una vista lateral del modelo original de solución de reemplazo molecular, que contiene la cabeza de postfusión del VPI3 en marco con el paquete de 6 hélices de la F del VRS, mostrado en el mapa de densidad electrónica (1a) calculado tras el promedio de tres veces la NCS del espacio real iterativo, emparejamiento de histograma y aplanamiento de solvente con extensión de fase de 7.0 a 3.2 A y sin recombinación de fase. La región de la cabeza se ajusta mal en la densidad electrónica. FIG. 3B Vista lateral. El modelo final de la F del VRS mostrado en el mapa de densidad electrónica promedio tal como se describe en la FIG. 4A. La FIG. 3C muestra una vista superior de la estructura de la proteína F del VRS mostrada en la FIG. 4A. La FIG. 3D muestra una vista superior de B. Modelo y densidad electrónica representados como en la FIG. 4B. La FIG. 3E es un primer plano de una densidad electrónica promedio representativa (gris) con el modelo final en representación con barras. La FIG. 3F muestra la misma vista que en la FIG. 4E, pero con un mapa final de densidad electrónica de 2mFo-dFc contorneado a 1,5a.

La FIG. 4 muestra la estructura del ectodominio de F del VRS. 4A es un diagrama lineal. Los números de los restos enumerados se corresponden con el extremo N-terminal de cada segmento, los sitios de escisión de furina (puntas de las flechas), y el extremo C-terminal. DI-III, dominios I-III; p27, péptido extraído; PF, péptido de fusión; HRA, B y C, repeticiones heptadas A, B y C. 4B muestra una representación de cintas de una subunidad del trímero del ectodominio de la F del VRS. Los dominios están marcados y sombreados como en 4A, los glucanos se muestran en negro. 4c muestra una representación de la superficie del trímero del ectodominio de la F del VRS. Los dominios de una subunidad están marcados y sombreados como en 4A, las otras dos subunidades están en blanco y en gris.

La FIG. 5 muestra la superposición de los dominios I y II de la F del VRS y la F del VPI3. La FIG, 5A muestra un diagrama de cintas del dominio I del VRS y el VPI3 superpuestos mediante coincidencia de las láminas p comunes. La FIG 5B muestra un diagrama de cintas del dominio II de la F del VRS y la F del VPI3 superpuestos basándose en las cadenas p comunes. Los elementos de estructura secundaria de la F del VRS están marcados. La FIG. 6 ilustra una comparación entre el VRS y el VPI3. La FIG. 6A es un diagrama de cintas del dominio III de la F del VRS. La FIG. 6B muestra un diagrama de cintas del dominio III del VPI3 orientado para que coincida con la orientación mostrada en la FIG. 6A. La FIG. 6C muestra el detalle de los paquetes de las hélices del dominio III del VRS y VPI3 (que están sombreados de manera diferente) superpuestos basándose en las láminas p del dominio III. FIG. 6D muestra los trímeros del ectodominio F del VRS y del VPI3 (sombreados como en A y en B) superpuestos basándose en sus paquetes de seis hélices. La imagen de la izquierda muestra un diagrama de cintas visto en perpendicular al triple eje; la imagen de la derecha es una representación de la superficie vista a lo largo del triple eje, desde la parte superior de la cabeza.

La FIG. 7 ilustra el epítopo de Motavizumab. La FIG. 7A es una superposición de las hélices de unión de Motavizumab, a5 y a6, desde el trímero de F de postfusión del VRS y el complejo péptido-Motavizumab (código de PDB 3IXT). La estructura de trímero de postfusión y la estructura del complejo péptido-motavizumab se han sombreado de manera diferente. Los restos del VRS unidos mediante Motavizumab se muestran en representación de barras. Los asteriscos denotan las mutaciones de escape. La FIG. 7B muestra una representación de cintas que modeliza un complejo Motavizumab-trímero de F de postfusión del VRS. Los dominios Vh y Vl de la Fab están marcados; las hélices a5 y a6 de la estructura de la F del VRS y la estructura péptido-Motavizumab están sombreados de manera diferente; un glucano en la F del VRS está en negro; y el resto de la F del VRS está en blanco.

La FIG. 8 ilustra los cambios de conformación de la F del VRS, la estructura antigénica y la unión de Palivizumab. La FIG. 8A es una representación de la superficie de la estructura de postfusión. Los sitios

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antigénicos A y C están delineados y marcados. Los asteriscos indican restos seleccionados en variantes de escape de neutralización o que forman contactos con un anticuerpo en las estructuras determinadas de los complejos anticuerpo neutralizante-péptido. Las superficies de HRA y HRB están sombreadas. La FIG. 8B es una representación de la superficie de un modelo de prefusión, rotulada como en A. La FIG. 8C es un gráfico que muestra la inhibición de la unión de Palivizumab a la F de postfusión del VRS mediante sueros agrupados de ratones no inmunizados o de ratones inmunizados con el antígeno de F del VRS. La unión de Palivizumab (porcentaje de señal de ELISA sin sueros competentes) se representa como una función de la dilución de los sueros competentes agrupados.

La FIG. 9 muestra la exposición del epítopo de Motavizumab en la estructura de F de postfusión del VRS (A) y el modelo de F de prefusión del VRS (B). La Fig. 9A muestra el Dominio III de una subunidad de la estructura de postfusión sombreado en negro y gris mientras que las partes restantes de la F del VRS están en blanco. Los elementos estructurales que no cambian significativamente entre la prefusión y la postfusión están en negro, mientras que la HRA (marcada con flecha), que se repliega en la transición desde la conformación de prefusión a la de postfusión, está en gris claro. Los epítopos de Motavizumab sobre las dos subunidades también están marcados. Un tercer epítopo de Motavizumab está presente en la superficie del trímero, pero no es fácilmente visible en esta orientación. Las hélices a5 y a6 del epítopo de Motavizumab están marcadas en un ejemplo. La Fig. 9B muestra el Dominio III del modelo de prefusión sombreado como en A. La región del péptido de fusión está sombreada y con el PF marcado. La región HRA está dividida en los elementos estructurales al, a2, a3, p1 y p2; marcada y sombreada en gris para una subunidad. Tanto en las estructuras de prefusión y de postfusión, las hélices a5 y a6 del epítopo de Motavizumab están expuestas en superficie. Sin embargo, en el modelo de prefusión, el bucle HRC puede necesitar desplazarse para acomodar la unión del anticuerpo (tal como se indica por la flecha).

La FIG. 10 muestra un modelo de anticuerpo neutralizante 101F unido al trímero de F de postfusión del VRS. La FIG. 10A muestra el péptido (restos 431-435) (SEQ ID NO:37) de la estructura del complejo Fab 101F-péptido (código de PDB 3041 21) superpuesta en restos equivalentes de la estructura de la cadena p 20 a la cadena p 21 de la F del VRS. La FIG. 10B es una representación de cintas de un modelo de la Fab 101F unido al trímero de F de postfusión del VRS. Los dominios VH y Vl de la Fab 101F están marcados; la cadena p 20 y la cadena p 21 de la F del VRS y marcados como en A. Las partes restantes de la F del VRS están en blanco. La FIG. 10B desvela "NKTF" como la SEQ ID NO: 37.

Las FIGS. 11A-C muestran que los restos en las distancias apropiadas para formar puentes disulfuro se pueden identificar, basándose en el modelo actual de F de prefusión del vRs, se pueden identificar. La FIG. 11A (Centro), el modelo de F de prefusión del VRS está sombreado/coloreado para mostrar características estructurales que están marcadas (HRB, HRA, DIII). La FIG. 11B (Izquierda) es una vista de acercamiento del paquete de HRA en el dominio III en el modelo de prefusión. Los números emparejados indican restos en estrecha proximidad que, si se mutan a cisteínas podrían formar un puente disulfuro. La FIG. 11C (derecha) es una vista de acercamiento del paquete del pedúnculo de HRB en los dominios I y III (blanco). Los números emparejados indican restos que, si se mutan a cisteínas podrían formar un puente disulfuro. Los restos de aminoácidos 165 y 296, y 56 y 164 no son distancias ideales entre sí, en el modelo de prefusión, para formar puentes disulfuro, pero están en la orientación correcta y pueden formar puentes disulfuro si el modelo está sesgado por la estructura del VPI5, sobre la que se ha construido el modelo.

La FIG. 12 muestra una micrografía electrónica de tinción negativa de la construcción de la F del VRS con HRB delecionado (F del VRS delHRB HIS, SEQ ID NO:28). La microscopía electrónica de la construcción de la F del VRS con HRB delecionado demostró que la proteína F del VRS formaba rosetas, probablemente a través del péptido de fusión. La formación de rosetas a través del péptido de fusión es una característica de la F de postfusión del VRS en lugar de un comportamiento predicho de las proteínas F de prefusión (Ruiz-Arguello y col. 2004 (142) y Connolly y col., 2006 (144)). Este resultado muestra que la construcción de la F del VRS con HRB delecionada no estabiliza de manera apreciable la proteína en la conformación de prefusión deseada.

La FIG. 13 muestra la estructura de la proteína F del VRS en la que se introducen determinadas mutaciones para inhibir la formación del paquete de 6 hélices. Se muestra la estructura de la F de postfusión del VRS en la que la hélice HRB se ha eliminado y reemplazado con una hipotética espiral aleatoria (representada mediante las líneas). La hélice alargada HRA de la F de postfusión del VRS está marcada. Los números representan posibles sitios para los sitios de glicosilación introducidos u otras mutaciones que interfieren con la formación del paquete de 6 hélices característico de la estructura de postfusión. Una mutación en la hélice HRA que interfiere con la interacción con HRB desestabilizaría la conformación de postfusión, que a su vez provocaría que la proteína permaneciese en la conformación de prefusión favorecida.

Las FIGs. 14A y B son análisis por transferencia de western de lisados celulares (14A muestra la expresión total) o medios (14B muestra la proteína secretada) en condiciones de ebullición y reductoras usando un anticuerpo anti-marcador His. Los análisis por transferencia de western muestran la expresión de las proteínas F del VRS, y que las proteínas con restos de cisteína diseñados genéticamente se expresaron y estuvieron contenidos en los puentes disulfuro intracatenarios. La escisión de la proteína F del VRS desde F0 hasta F1/F2 y la secreción a partir de la célula es una evidencia de plegamiento proteico apropiado de las proteínas F del VRS. Las migraciones para la F0 no escindida y la F1 escindida se indican. La leyenda para el marcado de los carriles del gel se muestra por encima de los análisis por transferencia de western. (A) Análisis por transferencia de Western de un lisado celular que indica la expresión de proteína total. Cada construcción de proteína se expresó bien por la célula. (B) Análisis por transferencia de Western de la F del VRS secretada al medio. La proteína secretada se escindió de manera predominante (F1) y la cantidad de secreción varió entre las proteínas. Los resultados de

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este análisis indican que las construcciones de la proteína T58C y V164C, K168C y V296C, y M396C y F483C fueron las construcciones de proteína mejor expresadas/secretadas. R049: F de fus del VRS R429S I432T K433T S436F trunc (SEQ ID NO:39); R050: puente disulfuro 2 de HRA de F del VRS I57C S190C trunc (SEQ ID NO:40); R051: puente disulfuro 3 de HRA de F del VRS T58C V164C trunc (SEQ ID NO:6); R052: puente disulfuro 5 de HRA de F del VRS K168C V296C trunc (SEQ ID NO:8); R053: F de fus del VRS del N262Y N2681K272M R429S I432T K433T S436F trunc (SEQ ID NO:41); R054 puente disulfuro 1 de HRA de F del VRS V56C V164C trunc (SEQ ID NO:4); R055 puente disulfuro 4 de HRA de F del VRS N165C V296C trunc (SEQ ID NO: 7); R056 puente disulfuro de HRB de F del VRS M396C F483C trunc (SEQ ID NO:9).

Las FIGs. 15 A-C muestran el análisis de SEC de los puentes disulfuro intracatenarios de la F del VRS. Las rosetas de F de postfusión y los trímeros de F del VRS con el péptido de fusión delecionado se usaron para desarrollar un ensayo de HPLC-SEC para diferenciar entre las rosetas y los trímeros. (FIG. 15 A) Las rosetas dela F del VRS con el péptido de fusión estabilizado migraron con el volumen vacío por la SEC (tiempo de retención de 5 minutos en la columna de SEC Bio-Sil 250). El análisis por transferencia de western anti-marcador HIS confirmó que la proteína estaba en el pico del volumen de vacío. (FIG. 15 B) Los trímeros de la F del VRS con el péptido de fusión delecionado migraron con un tiempo de retención de la SEC de aproximadamente 6,5 minutos. El análisis por transferencia de western de anti-marcador HIS confirmó de manera similar que la proteína estaba en el pico del volumen del trímero. Aunque el pico de vacío es mayor que el pico de volumen incluido, el análisis por transferencia de western de anti-marcador HIS presenta que las cantidades aproximadamente iguales de la F del VRS están en los dos picos. (FIG. 15 C). Estos datos muestran que la construcción F del VRS T58C V164C tuvo una población de F del VRS escindida que estaba en la forma de trímeros monodispersados en lugar de rosetas, sugiriendo que la población de la construcción de la proteína estaba en la forma de prefusión.

Las FIGs. 16 A-C muestran la purificación y el análisis de las construcciones de la proteína F del VRS que contienen cisteínas diseñadas genéticamente. La FIG 16A muestra la purificación de la construcción F del VRS N165C/V296C. Las columnas están marcadas para el flujo a través (FT), el lavado (W), la elución (E) y la resina (F) de una purificación por quelación. A diferencia de otras construcciones de proteína que contenían mutaciones de puentes disulfuros introducidos y se expresaron en células de insecto, N165C/V296C se secretó como una especie escindida, similar a su perfil cuando se expresó en las células de mamífero. La FIG. 16 B muestra un análisis del desplazamiento en gel de las construcciones de proteína F del VRS K168C/V296C y M396C/F483C. A la izquierda de los patrones están las dos construcciones que se dejaron correr con agente de ebullición y de reducción presentes. A la derecha de los patrones, las dos construcciones se dejan correr tras la ebullición sin agente reductor (b/nr) o sin ebullición ni agente reductor (nb/nr). El análisis de transferencia de western muestra que la proteína está ampliamente sin escindir, pero que de manera inesperada no se formaron puentes disulfuro intercatenarios. K168C/V296C sin ebullición se desplazó hacia la banda del trímero, mientras que M396C/F483C sin ebullición se dejó correr como una banda de monómero. La FIG. 16 C muestra un gel con tinción de coomasie de las construcciones de proteína F del VRS K168C/V296C y M396C/F483C con reducción y ebullición. Aproximadamente el 50 % del material se escindió.

La FIG. 17(A) muestra el análisis de microscopía electrónica de la F (de prefusión) del NDV con las cabezas esféricas esperadas para la F de prefusión, con unos pocos agregados de tipo roseta. La FIG. 17(B) muestra las formas cristalinas de tipo barra de F de prefusión del NDV. Se analizó una barra aislada y se registró un conjunto de datos con aproximadamente el 95 % de terminación a aproximadamente 3,7 angstroms. La FIG. 17 (C) muestra las formas cristalinas bipiramidales de F de prefusión del NFV (tamaño de 50x50x50 pm).

Las FIGs. 18 A-E muestran el análisis de varias construcciones de proteína F del VRS. La FIG 18A muestra el análisis de ME de la F del VRS con Del-HRB que muestra que el 100 % formó rosetas. La proteína eluyó desde la columna de SEC en el pico de retención de vacío/roseta. La FIG. 18(B) muestra el análisis/purificación de la construcción de F del VRS con Del-HRB Del-PF. Se halló la proteína tanto en el pico de retención de vacío como en el del trímero. La FIG. 18C muestra el análisis en gel, que sugiere que había F del VRS con Del-HRB Del-PF parcialmente escindida presente tanto en el pico de vacío como en el del trímero. La FIG. 18D muestra la ME de la F (de prefusión) del NDV, que presenta las cabezas esféricas esperadas para la F de prefusión con unos pocos agregados de tipo roseta. La FIG. 18E muestra que la F del vRs con Del-HRB del pico del trímero de la SEC contiene una mezcla heterogénea de estructuras de tipo roseta, muletas de postfusión y las especies esféricas de tipo cabeza de prefusión.

La FIG. 19 muestra el análisis SDS-PAGE de las construcciones quiméricas de F del RSV/NDV y F del VRS/F del VPI5. El sobrenadante de las células transfectadas con una de las seis construcciones (1: VRS-F NDV HRB del fus trunc; 2: VRS-F NDV HRB trunc; 3: VRS-F NDV HRB2 del fus trunc; 4: VRS-F NDV HRB2 trunc; 5: VRS-F NDV5HRB del fus trunc; 6: VRS-F VPI5 HRB trunc) se analizó mediante SDS-PAGE. Las construcciones se diseñaron genéticamente con o sin (del fus) péptido de fusión. Las proteínas tenían bien una HRB del NDV, una HRB del NDV con un resto de glicina adicional como un enlazador (HRB2) o HRB del VPI5 tal como se indica. Para cada construcción, se observó una proteína F1 escindida consistente con una proteína F procesada. Se realizaron expresiones de un litro de cada proteína.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, las proteínas F de "prefusión" del VRS son proteínas F del VRS que

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comparten una arquitectura estructural general más similar a la estructura de prefusión del VPI5 que la estructura de F de postfusión del VRS. Las proteínas F de prefusión del VRS incluyen las siguientes características: la región HRA se empaqueta contra el dominio III en la región delantera de la F del VRS y/o la región HRB forma un pedúnculo de superhélice en la proximidad de los dominios I y II en lugar de asociarse con la región HRA en los alrededores del paquete de 6 hélices.

Tal como se usa en el presente documento, la "conformación postfusión" de la proteína F del VRS son proteínas F del VRS que comparten una arquitectura estructural más general con la estructura de F de postfusión del VRS en lugar de la estructura de prefusión de VPI5. Las proteínas F de postfusión del VRS incluyen un paquete de 6 hélices de HRA-HRB.

Tal como se usa en el presente documento, la región HRA en la F de prefusión del VSR es aproximadamente los restos 137-239 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2) y comprende el péptido de fusión, la hélice al, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1 y la cadena p2. Véase, la FIG. 9B.

Tal como se usa en el presente documento, la hélice HRA en la F de postfusión del VSR está formada aproximadamente por los restos 155-226 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, el péptido de fusión se define mediante los restos 137-154 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la hélice a1 de la región HRA de la F de prefusión del VRS está formada por aproximadamente los restos 145-157 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la hélice a2 de la región HRA de la F de prefusión del VRS está formada por aproximadamente los restos 158-167 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la hélice a3 de la región HRA de la F de prefusión del VRS está formada por aproximadamente los restos 168-176 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la hélice a4 de la región HRA de la F de prefusión del VRS está formada por aproximadamente los restos 194-212 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la cadena p1 de la región HRA de la F de prefusión del VRS está formada por aproximadamente los restos 177-184 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la cadena p2 de la región HRA de la F de prefusión del VRS está formada por aproximadamente los restos 185-193 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, la región HRB en la F de del VSR es aproximadamente los restos 461515 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2) e incluye la hélice de HRB y el enlazador de HRB.

Tal como se usa en el presente documento, la hélice HRB en la F del VRS está formada aproximadamente por los restos 485-515 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, el enlazador de HRB en la F del VRS está formado aproximadamente por los restos 461-484 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, el dominio I (DI) está formado aproximadamente por los restos 26-50 y 309-401 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, el dominio II (DII) está formado aproximadamente por los restos 400-460 y de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, el dominio III (DIII) está formado aproximadamente por los restos 51-98 y 206-308 o los restos 51-308 de la proteína F del VRS (SEQ ID NOS: 1 y 2).

Tal como se usa en el presente documento, una proteína o polipéptido "purificado" es una proteína o polipéptido que se produce de manera recombinante o de manera sintética, o se produce por su hospedador natura, y se ha aislado de otros componentes del sistema de producción recombinante o sintético u hospedador natural de manera que la cantidad de la proteína relacionada con otros componentes macromoleculares presente en una composición es sustancialmente mayor que la presente en una preparación sin elaborar. En general, una proteína purificada será al menos aproximadamente homogénea al 50 % y más preferentemente al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o sustancialmente homogénea.

Tal como se usa en el presente documento, "sustancialmente libre de lípidos y lipoproteínas" se refiere a composiciones, proteínas y polipéptidos que son al menos aproximadamente el 95 % libres de lípidos y lipoproteínas en una base masiva cuando se observa la pureza de la proteína y/o el polipéptido (por ejemplo, polipéptido F de

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VRS) en un gel SDS PAGE y se mide el contenido total de proteína usando bien la absorción a UV280 o el análisis BCA, y se determina el contenido en lípidos y lipoproteínas usando el ensayo de fosfolipasa C (Wako, código n.° 433-36201).

Tal como se usa en el presente documento, "estrecha proximidad" se refiere a una distancia de no más de

aproximadamente 10 Á, no más de aproximadamente 8 Á, no más de aproximadamente 6 Á, no más de

aproximadamente 4 Á, o no más de aproximadamente 2 Á. Cuando dos o más restos de aminoácidos están en estrecha proximidad, la distancia entre los carbonos alfa de los restos de aminoácido es no más de

aproximadamente 4 Á, o no más de aproximadamente 2 Á.

Las características de la proteína F del VRS adecuadas para su uso en la presente invención se describen en el presente documento con referencia a aminoácidos particulares que se identifican mediante la posición del aminoácido en la secuencia de la proteína F del VRS a partir de la cepa A2 (SEQ ID NO: 1). Las proteínas F del VRS pueden tener la secuencia de aminoácidos de la proteína F de la cepa A2 o cualquier otra cepa deseada. Cuando se usa la proteína F de una cepa que no es la cepa A2, los aminoácidos de la proteína F se numeran con referencia a la numeración de la proteína F de la cepa A2, con la inserción de huecos según se necesite. Esto se puede lograr alineando la secuencia de cualquier proteína F del VRS deseada con la proteína F de la cepa A2. Los alineamientos de secuencia se producen preferentemente usando el algoritmo desvelado por Corpet, Nucleic Acids Research, 1998, 16(22): 10881-10890, usando parámetros por defecto (Tabla de comparación de símbolos Blossum 62, penalización abierta: 12, penalización de extensión en hueco: 2).

Tal como se describe y se ejemplifica en el presente documento, se ha determinado la estructura cristalina en rayos x de 3,2 A de una forma de proteína F de postfusión. Se hizo un modelo de la proteína F de la forma de prefusión del VRS comparando la estructura cristalina en rayos x de la F de postfusión del VRS con las estructuras conocidas de las proteínas F de prefusión y de postfusión del virus parainfluenza. Este modelo de la forma F de prefusión del VRS revela características estructurales que difieren de las de los modelos anteriores de la F de prefusión del VRS y permite un diseño lógico basado en la estructura de las formas de prefusión de la F del VRS.

Por consiguiente, la invención se refiere a polipéptidos y/o proteínas F de prefusión del virus respiratorio sincitial (F del VRS), y a composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos y/o proteínas F de prefusión del VRS. La invención también se refiere al uso de polipéptidos y/o proteínas F de prefusión del VRS para inducir una respuesta inmunitaria, o para la inmunidad protectora frente al VRS. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos y/o proteínas F de prefusión del VRS.

En general, las composiciones inmunogénicas comprenden polipéptidos y/o proteínas F de prefusión del VRS que generan anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a los mismos epítopos que palivizumab, motavizumab y 101F.

Las estructuras de F de prefusión y postfusión del VPI revelan en conjunto cambios de dominios y grandes reordenamientos de HRA y HRB. En el dominio III de la estructura de prefusión del VPI5, HRA se pliega en tres a- hélices y dos cadenas p en vez de la larga hélice de HRA de postfusión (Yin y col., 2006). Sin embargo, cuando se comparan las conformaciones de prefusión y postfusión de los dominios de la F del VPI, las partes no reordenadas se superponen bien. La superposición de los dominios de F de postfusión del VRS sobre sus homólogos de F de prefusión del VPI5 no dio como resultado importantes discordancias y posicionó todos los pares de cisteínas que forman los puentes disulfuro de interdominio en proximidad entre sí. El modelo de F de prefusión del VRS obtenido mediante la combinación de la información de la estructura cristalina en rayos x con la F de postfusión del VRS y la estructura de F del VPI5 de prefusión reveló una característica no evidente de los modelos de homología anteriores de la F de prefusión del VRS basada únicamente en la estructura de prefusión del VPI5 (McLellan y col. NSMB 2010 (141)). Las hélices del epítopo de palivizumab/motivizumab se exponen en la superficie del modelo de trímero de F de prefusión del VRS, tal como están en la estructura cristalina en rayos x del trímero de F de postfusión del VRS (Figura 9). En el modelo de F de prefusión del VRS de los inventores, el bucle que conecta p4 y HRC (parte del dominio III) podría dificultar el acceso de palivizumab o motavizumab a su epítopo. Sin embargo, es probable que el bucle tenga la suficiente flexibilidad como para adoptar una conformación alternativa que permita la unión de anticuerpos (Figura 9B).

El modelo de prefusión desvelado en el presente documento, que se basa en la estructura cristalina en rayos x de la F de postfusión del VRS y la estructura de prefusión del VPI5 (Yin y col., 2006 (145)), demuestra que la hélice de HRA alargada de la F de postfusión del VRS (restos 137-212) se pliega en bandas y hélices similares a la estructura cristalina de prefusión del VPI5. El péptido de fusión de la F del VRS, restos 137-154, forma una espiral y hélice que se empaqueta en la cabeza de la F de prefusión del VRS. Se forman cuatro hélices; la hélice al es de aproximadamente los restos 145-157, la hélice a2 es de aproximadamente los restos 158-167, la hélice a3 es de aproximadamente los restos 168-176 y la hélice a4 es de aproximadamente los restos 194-212. Se forman dos cadenas; la cadena b1 es de aproximadamente los restos 177-184, la cadena b2 es de aproximadamente los restos 185-193 (Figura 9).

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Conformación de prefusión

La invención incluye los polipéptidos y proteínas F de prefusión del VRS y composiciones inmunogénicas que contienen polipéptidos y proteínas F de prefusión del VRS. Los polipéptidos y proteínas F del VRS pueden contener 1 o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos que estabilizan la conformación de prefusión o desestabilizan la conformación de postfusión, por ejemplo, una F de prefusión del VRS estabilizada con enlaces disulfuro, o una F de prefusión del VRS formada mediante desestabilización de la conformación de postfusión.

Estabilización a través de puentes disulfuro

El modelo de F de prefusión del VRS se puede usar como una guía para seleccionar restos de aminoácido que están en estrecha proximidad entre sí en la conformación de prefusión y que ya no están en estrecha proximidad en la conformación de postfusión. Tales aminoácidos se pueden muta a restos de cisteína para permitir la formación de puentes disulfuro que estabiliza la conformación de prefusión, por ejemplo, evitando la asociación de la hélice de HRB con la hélice de HRA, evitando de este modo el replegamiento hacia la conformación de postfusión.

Una proteína F de prefusión del VRS de la invención puede comprender un puente disulfuro entre dos elementos estructurales cualquiera, o entre un elemento estructural y el resto de la proteína F del VRS, o entre un elemento estructural de una subunidad de un trímero y un elemento estructural de otra subunidad del mismo trímero. En general, un primer aminoácido en un elemento estructural y un segundo aminoácido que está en un elemento estructural diferente, o el mismo elemento estructural en un monómero separado, y que también está en estrecha proximidad con el primer aminoácido en el modelo de prefusión se seleccionan para la sustitución con cisteína. La distancia entre los restos (por ejemplo, los carbonos alfa) puede ser menor de aproximadamente 10 Á, menor de aproximadamente 8 Á, menor de aproximadamente 6 Á, menor de aproximadamente 5 Á, menor de aproximadamente 4 Á, o menor de aproximadamente 3 Á. Las sustituciones de cisteína del primer aminoácido y del segundo aminoácido y un puente disulfuro entre ellos se pueden modelar. La longitud del puente disulfuro modelado, en algunas realizaciones, no coincide exactamente con la longitud de aproximadamente 2 Á considerada que es óptima para los puentes disulfuro. Preferentemente, la longitud del puente disulfuro modelado (distancia entre los núcleos de azufre) es de aproximadamente 0,5 Á-3,5 Á, aproximadamente 1,0 Á-3,0 Á o aproximadamente 1,5 Á-2,5 Á, que, debido a la flexibilidad estructural, pretende formar puentes disulfuro en la proteína.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS se puede estabilizar en la conformación de prefusión mediante la introducción de al menos una mutación de cisteína en un primer elemento estructural en estrecha proximidad con al menos otra cisteína (natural o introducida) en un segundo elemento estructural o la región restante de cabeza de la F del VRS. Los puentes disulfuro se forman entre la cisteína introducida que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión. Por ejemplo, la proteína F de prefusión del VRS se puede estabilizar en la conformación de prefusión mediante la introducción de al menos una mutación de cisteína en la región de la hélice de HRA, en la región de la hélice de HRB, en el péptido de fusión, en la hélice a1, en la hélice a2, en la hélice a3, en la hélice a4, en la cadena p1, en la cadena p2, en el DI, en el DII o en el DIII en estrecha proximidad con al menos una otra cisteína (natural o introducida) en una región estructural diferente (por ejemplo, seleccionada de la región de la hélice de HRA, la región de la hélice de HRB, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2, el DI, el DII o el DIII), formando de este modo uno o más puentes disulfuro que podrían evitar la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

Las cisteínas se pueden introducir en la HRB o en el enlazador de HRB para crear puentes disulfuro entre las cisteínas. En una realización, se pueden introducir una o más cisteínas en el enlazador de HRB y la región de la hélice (aproximadamente los restos 452 a 515) para formar puentes disulfuros con partes de la región de cabeza de la F del VRS. En otra realización, se puede usar un puente disulfuro entre el enlazador de HRB o la hélice y el resto de la proteína F del VRS para estabilizar la proteína en la conformación de prefusión. En una realización preferida, se forma un puente disulfuro entre el pedúnculo de la HRB de prefusión y la región de DI o DII en la "parte alta" de la cabeza (por ejemplo, M396C + F483C).

En una realización preferida, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, M396C y F483C, comprendiendo de este modo un puente disulfuro entre el pedúnculo de la HRB de prefusión y la región del DI.

En otras realizaciones preferidas, se forma un puente disulfuro entre la región HRA y la región DIII. Por ejemplo, la proteína F del VRS puede contener sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en V56C + V164C, I57C + S190C, T58C + V164C, N165C + V296C, K168C + V296C, y combinaciones de los mismos.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la región de HRA, y una segunda cisteína (natural o introducida) en el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2 de la región HRA de prefusión o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la región de la hélice de HRB, y una segunda cisteína (natural o introducida) en el DI o el DII. En esta realización, la proteína

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comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en el péptido de fusión, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, la hélice al, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2 o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación de la hélice alargada de HRA de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la hélice a1, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, el péptido de fusión, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2 o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la hélice a2, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2 o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la hélice a3, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2 o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la hélice a4, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a3, la cadena p1, la cadena p2 o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la cadena p1, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p2 o DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la cadena p2, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de HRA, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, el DI, el DII o el DIII. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA- HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la región del DI, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de la hélice de HRB. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la región del DII, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de la hélice de HRB. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera mutación de cisteína en la región del DIII, y una segunda cisteína (natural o introducida) en la región de la hélice de HRA. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En otra realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende una primera cisteína introducida en la región de la hélice de HRA, la región de la hélice de HRB, el péptido de fusión, la hélice a1, la hélice a2, la hélice a3, la hélice a4, la cadena p1, la cadena p2, la región DI, DII o DIII y una segunda cisteína (natural o introducida) cualquier otra región de la proteína F del VRS que está en estrecha proximidad con la cisteína introducida. En esta realización, la proteína comprende un puente disulfuro entre la primera y la segunda cisteína que evita la formación del paquete de seis hélices de HRA-HRB de postfusión.

En una realización específica, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína seleccionadas del grupo que consiste en V56C + Vl64C, I57C + S190C, T58C+V164C, N165C+V296C, y K168C + V296C, y combinaciones de los mismos, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRA y la región del DIII.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, V56C y V164C, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRA y la región del DIII.

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En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, I57C y S190C, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRA y la región del DIII.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, T58C y V164C, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRA y la región del DIII.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, N165C y T296C, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRA y la región del DIII.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, K168C y T296C, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRA y la región del DIII.

En una realización, la proteína F de prefusión del VRS comprende dos mutaciones de cisteína, M396C + F483C, comprendiendo por lo tanto un puente disulfuro entre la región de HRB y la región del DII.

La proteína F de prefusión del VRS de la presente invención se estabiliza en la conformación de prefusión mediante mutaciones que estabilizan la subunidad de prefusión, que forma trímeros.

En algunas realizaciones, la proteína F de prefusión del VRS de la presente invención es un trímero de monómeros F del VRS, y la conformación de prefusión se estabiliza mediante uno o más puentes disulfuro entre restos de cisteína que se introducen en monómeros diferentes.

Las secuencias de aminoácidos de monómeros de F del VRS ejemplares que contienen restos de cisteína introducidos que estabilizan la conformación de prefusión se presentan a continuación (SEQ ID NOS: 4-9). Las secuencias presentadas contienen un péptido señal y un marcador HIS (GGSAGSGHHHHHH; SEQ ID NO:3). La proteína F de prefusión del VRS de la invención puede contener cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas a continuación, con o sin el péptido señal y/o el marcador HIS.

>puente disulfuro I de HRA de la F del VRS (V56C + V164C) (SEQ ID NO: 4)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSCITIELSNIKEN KCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRK RRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGECNKIKSALLS TNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITN DQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLT RTDRGWY CDNAGSV S FFP Q AE TCKVQ SNRVFCD TMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV SSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV KGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHH H

>puente disulfuro 2 de HRA de la F del VRS (I57C + S190C) (SEQ ID NO: 5)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVCTIELSNIKEN KCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELFRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRK RRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLS TNKAWS LSNGVSVLTCKVLDLKNYIDK QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITN DQKKLMSNNVQIVRQQS YS IMS 11KEEVL AYWQ LP LYGVIDTPCWKLHT SPLC TTNTKEGSNICLT RTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV SSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV KGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHH H

>puente disulfuro 3 de HRA de la F del VRS (T58C + V164C) (SEQ ID NO: 6)

MELLILKANAITTILTAVTFOFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVICIELSNIKEN KCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTP ATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRK RRFLGF LLGVGS AI ASGVAV S KVLHLEGE CNKIKSALLS TNKAWS LSNGVS VL T SKVLDLKNYIDK QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITN DQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLT RTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNS LT LP S EVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV S S SVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV KGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHH H

>puente disulfuro 4 de HRA de la F del VRS (N165C + V296C) (SEQ ID NO: 7)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEN KCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRK RRF LGFLLGVGSAI AS GVAVSKVLHLEGEVCKIK S ALL S TNKAWS L SNGVSVLT S KVLD LKNYI DK QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITN DQKKLMSNNVQIVRQQSYS IMS 11KEECLAYWQLPL Y GVI DTP CNKLH T SP LC TTNTKEGSNICLT RTDRGWYCDNAGSVS FFP QAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV SSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV KGEPIINFYDPLVFP SDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHH H

>puente disulfuro 5 de HRA de la F del VRS (K168C + V296C) (SEQ ID NO: 8)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEN

KCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRK RRFLGFLLGVGSAI AS GVAVS KVLHLEGE VNKIC SALLS TNKAWS L SNGVSVLT SKVLDLKNY IDK QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITN DQKKLMSNNVQIVRQQSYS IMSIIKEECLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLT RTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDV SSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV KGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHH

>puente disulfuro de HRB de la F del VRS (M396C + F483C) (SEQ ID NO: 9)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEN KCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRK RRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK QLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITN DQKKLMSNNVQIVRQQSYS IMS IIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLT RTDRGHYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNS LTLP SEVNLCNVDIFNPKYDCKICTSKTDV S S SVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYV KGEPIINFYDPLVCPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNGGSAGSGHHHHH H

Desestabilización de la F de postfusión del VRS

Una característica principal de la estructura de F de postfusión del VRS es el paquete de 6 hélices en la región del 10 pedúnculo. En la conformación de postfusión, las tres hélices de HRA y las tres hélices de HRB forman un paquete de 6 hélices muy estable. Una estrategia alternativa para producir una proteína F de prefusión del VRS de la invención, es mediante desestabilización del paquete de 6 hélices de postfusión y/o evitando la formación del paquete de 6 hélices (por ejemplo, mediante la deleción de la hélice de HRB, la introducción de mutaciones puntuales, la adición de sitios de glicosilación u otros sitios de modificación).

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La formación del paquete de 6 hélices se puede evitar mediante deleción de la hélice de HRA o de la hélice de HRB.

Preferentemente, la región helicoidal de HRB se deleciona o se muta para evitar la formación de la conformación de postfusión. La región HRB forma el pedúnculo en la conformación de prefusión de la F del VRS, está en estrecha proximidad a la membrana del virus y probablemente no contiene importantes epítopos neutralizantes. La deleción de la hélice de HRB (restos 484 y C-terminal) puede evitar el replegamiento de la proteína F del VRS desde el estado de prefusión hasta el estado de postfusión.

Una proteína F de prefusión del VRS de la invención puede comprender la secuencia del ectodominio del VRS con la región HRB delecionada o mutada, y preferentemente comprende además una mutación o deleción adicional para la secuencia del ectodominio restante. Por ejemplo, el ectodominio del VRS puede comprender una o más cisteínas introducidas para crear puentes disulfuro que estabilizan la estructura de prefusión tal como se describe en el presente documento, los sitios de escisión de furina mutados o delecionados, la secuencia del péptido de fusión mutada o delecionada u otras mutaciones anteriormente descritas en el documento WO 2011/008974. El ectodominio de VRS puede ser el ectodominio de una proteína F del VRS de origen natural o puede contener mutaciones además de las deleciones y/o mutaciones de la región HRA o HRB.

En una realización, la proteína F estabilizada de prefusión del virus VRS comprende un ectodominio de una proteína F del VRS de origen natural en la que la región HRB se deleciona y una o más mutaciones que evitan la escisión en uno o ambos sitios de escisión de furina (es decir, los aminoácidos 109 y 136 de las SEQ ID NOS: 1 y 2) están presentes.

En una realización, la proteína F estabilizada de prefusión del virus VRS comprende un ectodominio de una proteína F del VRS de origen natural en la que la región HRB se deleciona y el péptido de fusión se muta (aminoácidos 137 y 153 de las SEQ ID NOS: 1 o 2). Por ejemplo, esta región se puede delecionar por completo o en parte.

En otra realización, la proteína F estabilizada de prefusión del VRS comprende un ectodominio del VRS de tipo silvestre en el que la región HRB y el péptido de fusión se delecionan, en su totalidad o en parte.

En otra realización, la proteína F estabilizada de prefusión del VRS comprende un ectodominio del VRS de tipo silvestre en el que la región HRB se deleciona y se ha añadido una secuencia de oligomerización. Cuando está presente una secuencia de oligomerización, preferentemente es una secuencia de trimerización. Las secuencias de oligomerización adecuadas son bien conocidas en la materia e incluyen, por ejemplo, la proteína GCN4 de cremallera de leucina de levadura, la secuencia de trimerización ("foldon") de la fibritina del bacteriófago T4, y el dominio trímero HA de la gripe.

En otra realización, la proteína F estabilizada de prefusión del virus VRS comprende un ectodominio del VRS de tipo silvestre en el que la región HRB se deleciona y la región p27 se muta (aminoácidos 110-136 de las SEQ ID NOS: 1 o 2), incluyendo la deleción de la región p27 por completo o en parte. Por ejemplo, los restos de lisina y/o arginina en la región p27 (aproximadamente los aminoácidos 110-136 de las SEQ ID NOS: 1 o 2) se pueden sustituir o delecionar.

En otra realización, la proteína F estabilizada de prefusión del VRS comprende un ectodominio del VRS de tipo silvestre en el que la región HRB se deleciona y se añade una secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de escisión de proteasa. En general, la secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de escisión de proteasa se localizará en aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos o sustancialmente adyacente al extremo amino terminal del dominio transmembrana (aminoácido 525 de la SEQ ID NO: 1 o 2).

Una secuencia de aminoácidos ejemplar de un monómero F del VRS en la que el péptido de fusión y HRB se delecionan para estabilizar la conformación de prefusión se presenta a continuación (sEq ID NO: 10). La secuencia presentada contiene un péptido señal y un marcador HIS (GGSAGSGHHHHHH; sEq ID NO:3). La proteína F de prefusión del VRS de la invención puede contener las secuencias de aminoácidos presentadas a continuación, con o sin el péptido señal y/o el marcador HIS.

>péptido de fusión de F del VRS delHRB HIS (SEQ ID NO: 10)

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MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELS NIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKK TNVT LSKKRKRRSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL STNKAWS LSNGVSVLTSKVLDL KNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSEL LSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSY SIMS IIKEEVLAYWQLP LYGVIDTPCWKLHT S PLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNL CNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVS NKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSGGSAGSGHHHHHH

La proteína F de prefusión del VRS estabilizada de la invención también puede estar formada mediante el bloqueo de la formación del paquete de 6 hélices en las regiones HRA o HRB (aproximadamente los restos 154-212 y 484 a 513, respectivamente) mediante mutaciones puntuales de ingeniería genética o introducción de sitios de glicosilación (por ejemplo, AsnXaaSer/Thr; SEQ ID NO:11) u otros sitios de modificación (por ejemplo, lipidación, fosforilación). Los sitios de glicosilación u otros sitios de modificación postraduccional o mutaciones puntuales que interfieren con la formación del paquete de 6 hélices mediante impedimento electrostático o estérico, se pueden introducir a través de las regiones helicoidales HRA o HRB. La glicosilación puede interferir con la formación del paquete de 6 hélices y evitar el volteo de la construcción de la F del VRS a la conformación de postfusión.

Una proteína F de prefusión del VRS estabilizada de la invención puede comprender una o más mutaciones que forman uno o más sitios de glicosilación en las regiones helicoidales HRA o HRB. La proteína F del VRS puede contener mutaciones o deleciones, además de las que introducen los sitios de glicosilación en las regiones helicoidales HRA o HRB.

En una realización, la proteína F del VRS comprende las mutaciones S173N y N175T y la proteína F de prefusión del VRS tiene un sitio de glicosilación en el resto actual de serina 173.

En otra realización, la proteína F del VRS comprende una mutación A177T, de manera que la proteína F de prefusión del VRS tiene un sitio de glicosilación en el resto actual N175.

En otra realización, la proteína F del VRS comprende las mutaciones G184N y S186T y la proteína F de prefusión del VRS tiene un sitio de glicosilación en el resto actual G184.

Estructuras quiméricas de F de prefusión con epítopos relevantes de F del VRS

La divulgación también se refiere a proteínas F de prefusión quiméricas que contienen epítopos neutralizantes de la proteína F del VRS. En general, las proteínas F de prefusión quiméricas comprenden una proteína F estabilizada de un virus diferente, tal como el virus parainfluenza (VPI1, VPI2, VPI3, VPI4, VPI5), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus Sendai (SeV), virus Hendra, virus Nipah (NiV), metapneumovirus humano o metapneumovirus aviar, en los que las porciones que se exponen en la superficie de la proteína se sustituyen con las porciones correspondientes de F del VRS. Preferentemente, las porciones contienen epítopos neutralizantes de la F del VRS.

Por ejemplo, cualquier proteína F no del VRS (por ejemplo, del virus parainfluenza o del metapneumovirus) que está estabilizada en la conformación de prefusión (por ejemplo, en virtud de un dominio trímero GCN fusionado en el extremo C-terminal a la región HRB), se puede usar como un molde para la proteína (es decir, una proteína de fusión de F del NDV sin escindir - GCN). Por ejemplo, la SV5 de la proteína F de prefusión del VPI5, descrita por Yin y col., 2006 (145) o la F de prefusión del NDV descrita por Swanson y col., 2010 (146) se puede usar en la construcción de proteína F quimérica. El molde se puede mutar después para introducir epítopos neutralizantes o supuestos neutralizantes de la F del VRS. Por lo tanto, la proteína puede tener una estructura de la F de prefusión que presenta los epítopos neutralizantes, pero no los epítopos no neutralizantes, de la F del VRS. Un claro beneficio para esta construcción es que no generaría anticuerpos no neutralizantes de la F del VRS.

Una proteína quimérica de prefusión de la divulgación puede comprender una proteína F del virus parainfluenza, estabilizada en la conformación de prefusión que se muta para introducir epítopos neutralizantes de la F del VRS. La proteína F del virus puede ser cualquier proteína F del virus parainfluenza, preferentemente la SV5 de la proteína F de prefusión del VPI5, descrita por Yin y col., 2006 (147) o la F de prefusión del NDV descrita por Swanson y col., 2010 (146). Los epítopos neutralizantes ejemplares que se pueden introducir por mutación incluyen los epítopos desvelados en la Tabla 1. Por ejemplo, los aminoácidos que forman los epítopos reconocidos por los anticuerpos enumerados en la Tabla 1 se pueden introducir en las correspondientes posiciones (por ejemplo, identificados mediante comparación estructural, tal como el alineamiento basado en la estructura) de una proteína F no del VRS (por ejemplo, la proteína F del virus parainfluenza o la proteína F del metapneumovirus) que se estabiliza en la conformación de prefusión. Por ejemplo, la proteína F quimérica puede contener el epítopo del sitio A o el epítopo del sitio C de la F del VRS. En un ejemplo particular, la proteína F quimérica contiene uno o más restos de la F del VRS seleccionados de los restos de aminoácidos en las posiciones 262-276 de la F del VRS. En otro ejemplo particular, la proteína F quimérica contiene uno o más restos de la F del VRS seleccionados de los restos de

aminoácidos en las posiciones 429-447 de la F del VRS.

Tabla 1. Epítopos neutralizantes de la F del VRSa

Sitiob: mAb Restos Procedimiento Referencia

A: 11 N2681 Escape0 (149)

A: 151 K272N Escape (150)

A: 1129 S275F Escape (150)

A: 1153 N262S Escape (150)

A: 1200 K272N Escape (150)

A: 1214 N276Y Escape (150)

A: 1237 N276Y Escape (150)

A: 47F N262Y, N268I Escape (151)

A: 7C2 K272E, K272T Escape (149)

A: B4 K272T Escape (149)

A: Fab 19d I266M Escape (149)

A: AK13A2 N262Y Escape (149)

A: PVZe K272M, K272Q , N2681 Escape (152)

A: PVZe K272M, K272T, S275F Diseñado genéticamentef (153)

A: PVZg N262, N268, D269, K272, S275 Estructurah (141)

C: 7,936 1— co co "31— CM CO < -vi > Escape (154)

C: 9,432 S436F Escape (154)

C: 19d R429S Escape (149)

C: 19d R429K, R429S, G430A Diseñado genéticamente (153)

C: 20 R429S Escape (149)

C: 101F K433T Escape (155)

C: 101F K433D, K433L, K433N, K433Q, K433R Diseñado genéticamente (153)

C: 101F R429, I431, I432, K433, S436, N437 T434, F435, Estructura (148)

a Los resultados de los estudios que usan la unión de péptidos o la inhibición de péptidos no se incluyen en esta tabla.

b Los sitios se basan en los análisis de competencia y neutralización cruzada de Beeler y col., 1989 (156). c Se incluye una mutación de escape si es la única mutación en una cepa resistente a anticuerpos. d Fab 19 y 19 son anticuerpos no relacionados. Los nombres similares son una coincidencia. e Palivizumab

f Se incluyen mutaciones diseñadas genéticamente en F del VRS recombinante intacta que permitió el procesamiento intacto, la completa actividad de fusión y la unión reducida a anticuerpos monoclonales de menos del 15 % de tipo silvestre. g Motavizumab

h Los restos de los péptidos en las estructuras del complejo péptido-Fab se incluyen si sus átomos de la cadena lateral o de la cadena principal entran en contacto de forma significativa con el anticuerpo. El significado biológico de las interacciones péptido-anticuerpo observadas en estos estudios estructurales se ha confirmado mediante otras técnicas.

En una realización, la proteína F quimérica de la divulgación comprende la región HRA de la F del VRS (restos 137212) en lugar de los restos equivalentes de HRA de la F de prefusión de NDV-GCN. Por lo tanto, la proteína F de

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prefusión (NDV-GCN) se expresa con posibles sitios de epítopos neutralizantes (región HRA de la F del VRS) en la parte superior de la cabeza de la F de prefusión, permitiendo la generación de anticuerpos neutralizantes de la F del VRS. Se pueden añadir epítopos neutralizantes si se desea, por ejemplo, el epítopo motavizumab o el epítopo 101F.

Una secuencia de aminoácidos ejemplar de una proteína quimérica que contiene la F de prefusión del NDV mutada para incluir las secuencias de aminoácidos se presenta a continuación (SEQ ID NO: 13). Las secuencias presentadas contienen un péptido señal, un dominio de trimerización de GCN y un marcador HIS. La proteína F de prefusión quimérica de la divulgación puede contener la secuencia de aminoácidos presentada a continuación, con o sin el péptido señal y/o el dominio de trimerización de GCN y/o el marcador HIS.

la HRA de prefusión del VRS NDV (la parte subrayada es la HRA del VRS, la parte en cursiva es el dominio trimérico GCN de C-terminal y el marcador de purificación por afinidad HIS6 (SEQ ID NO:12) (SEQ ID NO: 13).

MGSRSS'J’RlPVPLML'rVUVMLALSC'VCFI’SAl .DGRPLAAAGlVV'l’GDKAVNIYTSSQTGSlll KLLPNMPKDKHACAKAPLPAYNRlIG'l’LLTPlXiDSlRRIQHSVTrSGGCiKQGRLlCrAiiGiMi l'LLGVGSAlASGVAVSKVLHLI'Gl'VNKIKSAl.LSt’NKAVVSLSNGVSVIG’SKVLDLKNYinK OIJ JJI VNKOSClKITOOVGVliLNLYi.TRLTTVrGPOITSPALTOl.TIOAPYNRAGGNMGYLI-T KLGVGNNQI.SSLISSGUrGNPILYJYSQTQPPGIQVn.PSVGNl.NNMRATYLHTLSVSi'I’KG]-’ ASAI.VPKVVTQVGSVIIÍHI jyrSYCIPTDI.DLYCTRIVTrPMSPGlYSCPSGNTSACMYSKTHG AIGTPYMTl.KGSVIANCKM'ITCRCADPPGNSQNYGHAVSLlDRQSOMLSLDGm.RLSGHm ATYQKNESiQDSQVI VTGNI.DISTPI GNVNNSISNAII)KI.PPSNNKI.I)K V7./.)K77.,G//,SX7}'A/GV ElARIKKLIGEAGGPLVPRGSHHHHHH

La glucoproteína F del VRS

La glucoproteína F del VRS dirige la penetración del virus mediante la fusión entre la envoltura del virión y la membrana plasmática de la célula hospedadora. Es una proteína integral de membrana de paso único de tipo I que tiene cuatro dominios generales: Secuencia de señal (SS) de traslocación en RE en N-terminal, ectodominio (ED), dominio transmembrana (TM) y una cola citoplasmática (CC). La CC contiene un único resto de cisteína palmitoilado. La secuencia de la proteína F está altamente conservada entre los aislados del VRS, pero está permanentemente envuelta (7). A diferencia de la mayoría de los paramixovirus, la proteína F en el vRs puede regular la entrada y la formación del sincitio independientemente de las otras proteínas víricas (HN es normalmente necesaria además de F en otros paramixovirus).

El ARNm de la F del VRSh se traduce en una proteína precursora de 574 aminoácidos denominada F0, que contiene una secuencia de péptido señal en el extremo N-terminal que se elimina mediante una peptidasa señal en el retículo endoplasmático. F0 se escinde en dos sitios (aminoácidos 109/110 y 136/137) mediante proteasas celulares (en particular, furina) en el trans del Golgi, eliminando una corta secuencia de intervención glicosilada y generando dos subunidades denominadas F1 (de aproximadamente 50 kDa; en el extremo C-terminal; restos 137-574) y F2 (de aproximadamente 20 kDa; en el extremo N-terminal; restos 1-109) (Véase, por ejemplo, la FIG. 4A). F1 contiene un péptido de fusión hidrofóbico en su extremo N-terminal y también dos regiones heptadas repetidas hidrofóbicas (HRA y HRB). HRA está cerca del péptido fusión y HRB está cerca del dominio y transmembrana (véase, por ejemplo, la FIG. 4A). Los heterodímeros F1-F2 se ensamblan como homotrímeros en el virión.

El VRS existe como un único serotipo pero tiene dos subgrupos antigénicos: A y B. Las glucoproteínas F de los dos grupos son idénticas al 90 %. El subgrupo A, el subgrupo B o una combinación o híbrido de ambos se puede usar en la invención. Una secuencia de ejemplo para el subgrupo A es la SEQ ID NO: 1 (cepa A2; GenBank GI: 138251; Swiss Prot P03420), y para el subgrupo B es la SEQ iD NO: 2 (cepa 18537; GI: 138250; Swiss Prot P13843). La SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:2 son ambas secuencias de 574 aminoácidos. El péptido señal en la cepa A2 son los aminoácidos 1-21, pero en la cepa 18537 son los aminoácidos 1-22. En ambas secuencias, el dominio TM es de aproximadamente los aminoácidos 530-550, pero se ha documentado como alternativa los aminoácidos 525-548.

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SEQ ID NO: 1

1 MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE SO 61 LGNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQGTPPTHNRARRELPRFMHYTLH 120 121 HAK K TNVT L G K KRKRRF LG F L LGVG GAIA o G VA V 5 K V LH L E GE VN KIKG AL L G THKAWG 180 181 LGNGVGVLTGKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ5CGI5MIETVIEFQQKHHRLLEITREFGVH 240 241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQ3YSIMGIIKEEVLAYV 300 301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTGPLCTTMTKEG3NICLTRTDRGWYC DNAGSV3 F FPQAE TCKV 3 SO 361 QGNRVFCDTMNSLTLFGEINLCNVDIFNPKYDCKIMTGKTDV553VIT3LGAIV5CYGKT 420 421 KCTAGHKNRGIIKTF SNGCDYVSNKGMDTVSVGHT L Y YVHKQEGKG L YY'KGEP I1HF YDP 4 80 481 LVFPGDEFDASIGQVNEKINQGLAF IRKGDE L LHNVHAGKGTTMIMITT111V11VILLG 5 40 541 LIAVGLLLYCKAR3TPVTLGKDQLSGINMIAFSM 574

GEQ ID NO: 2

1 MELLIHRSGAIFLTLAVHALYLTSGQNITEEFYQSTCGAVGRGYFGALRTGWYTGVITIE 60 61 L G HIKE T KC NGT D TKVK LIKQE L DKYKNAVT E LQL LMQNTPAANNRARREAPQ YMMY TIM 120 121 TTKNLHVSI3KKRKRRFLGFLLGVG3AIA3GIAVSKVLHLEGEVNKIKNALL3THKAWG 180 181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVHQQGCRIGHIETVIEFQQMHGRLLEITREFGVH 240 241 AGVTTPLGTYMLTHGELLGLINDMPITHDQKKLMGGMVQIVRQQ3YGIMG IIKEEVLAYV 3 00 301 VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTHIKEGGNICLTRTDRGWYCDNAGSVGFFPQADTCKV 360 361 QGNRVFCDTMHGLTLPGEVGLCNTDIFNGKYDCKIMTGKTDIGGGVITGLGAIVGCYGKT 420 421 KCTAGHKNRGIIKTF5NGCDYV5NKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDP 480 481 LVFPGDEFDAG IGQVHEKIHQGLAF IRRGDELLHHVMTGKGTTHIMITT11IVIIWLLG 540 541 LIAIGLLLYCKAKMTPVTLGKDQLGGIHMIAFGK 574

La invención puede usar cualquier secuencia deseada de aminoácidos de la F del VRS, tal como la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o 2, o una secuencia que tiene una identidad con la SEQ ID NO: 1 o 2.

Típicamente tendrá al menos el 75 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o 2 por ejemplo, al menos el 80 %, al menos

el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % de identidad con la SEQ ID NO:1 o 2. La secuencia se puede hallar de forma natural en el VRS.

Cuando la invención usa un ectodominio de la proteína F, en su totalidad o en parte, puede comprender:

(i) un polipéptido que comprende aproximadamente los aminoácidos 22-525 de la SEQ ID NO: 1.

(ii) un polipéptido que comprende aproximadamente los aminoácidos 23-525 de la SEQ ID NO: 2.

(iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad (por ejemplo, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % de identidad) con (i) o (ii).

(iv) un polipéptido que comprende un fragmento de (i), (ii) o (iii), en el que el fragmento comprende al menos un epítopo de la proteína F. El fragmento será normalmente al menos aproximadamente de 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos aproximadamente de 150, al menos aproximadamente de 200, al menos aproximadamente de 250, al menos aproximadamente de 300, al menos aproximadamente de 350, al menos aproximadamente de 400, al menos aproximadamente de 450 aminoácidos de longitud.

El ectodominio puede ser una forma de F0 con o sin el péptido señal, o puede comprender dos cadenas peptídicas separadas (por ejemplo, una subunidad F1 y una subunidad F2) que se asocian entre sí, por ejemplo, las subunidades se pueden enlazar mediante un puente disulfuro. Por consiguiente, toda o una porción de aproximadamente 101 a aproximadamente 161 aminoácidos, tal como los aminoácidos 110-136, puede estar ausente del ectodominio. Por lo tanto, el ectodominio, en su totalidad o en parte, puede comprender:

(v) una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica que se asocia con la primera cadena de polipéptidos, en la que la primera cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad (por ejemplo, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad) con aproximadamente el aminoácido 22 hasta aproximadamente el aminoácido 101 de la SEQ ID NO: 1 o con aproximadamente el aminoácido 23 hasta aproximadamente el aminoácido 101 de la SEQ ID NO: 2, y la segunda cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 75 % de identidad (por ejemplo, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99 % o incluso el 100 % de identidad) con aproximadamente el aminoácido 162 hasta aproximadamente el 525 de la SEQ ID NO: 1 o con aproximadamente el aminoácido 162 hasta aproximadamente el 525 de la SEQ ID NO: 2.

(vi) una primera cadena peptídica y una segunda cadena peptídica que se asocia con la primera cadena de polipéptidos, en la que la primera cadena peptídica comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un fragmento desde aproximadamente el aminoácido 22 hasta aproximadamente el aminoácido 101 de la SEQ ID NO: 1 o desde aproximadamente el aminoácido 23 hasta aproximadamente el aminoácido 109 de la SEQ ID NO: 2, y la segunda cadena peptídica comprende un fragmento desde aproximadamente el aminoácido 162 hasta aproximadamente el aminoácido 525 de la SEQ ID NO: 1 o desde aproximadamente el aminoácido 161

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hasta aproximadamente el aminoácido 525 de la SEQ ID NO: 2. Uno o ambos fragmentos comprenderán al menos un epítopo de la proteína F. El fragmento en la primera cadena peptídica normalmente será de al menos 20 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80 aminoácidos de longitud. El fragmento en la segunda cadena peptídica normalmente será de al menos 100 aminoácidos de longitud, por ejemplo, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450 aminoácidos de longitud.

(vii) una molécula que se obtiene mediante la digestión con furina de (i), (ii), (iii) o (iv).

Por lo tanto, una secuencia de aminoácidos usada con la invención se puede hallar de manera natural en la proteína F del VRS (por ejemplo, una proteína F soluble del VRS que carece de TM y CC, aproximadamente los aminoácidos 522-574 de las SEQ ID NOS: 1 o 2) y/o puede tener una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) mutaciones únicas de aminoácidos (inserciones, deleciones o sustituciones) en relación con una secuencia del VRS natural. Por ejemplo, es conocido el mutar proteínas F para eliminar sus secuencias de escisión de furina, evitando de este modo el procesamiento intracelular. En ciertas realizaciones, la proteína F del VRS carece de TM y CC (aproximadamente los aminoácidos 522-574 de las SEQ ID NOS: 1 o 2) y contiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) mutaciones únicas de aminoácidos (inserciones, deleciones o sustituciones) en relación con una secuencia del VRS natural.

Mutaciones de escisión de furina, de escisión de tripsina y del péptido de fusión

Si se desea, los polipéptidos o proteínas F de postfusión del VRS pueden contener una o más mutaciones, por ejemplo, mutaciones que evitan la escisión en uno o ambos sitios de escisión de furina (es decir, los aminoácidos 109 y 136 de las SEQ ID NOS: 1 y 2), que evita la escisión de o introduce sitios de escisión de tripsina, mutaciones en la región p27 y/o mutación en el péptido de fusión. Tales mutaciones pueden evitar la agregación de los polipéptidos o proteínas solubles y facilitar de este modo las purificaciones, pueden evitar la fusión entre dos células si la proteína F del VRS se expresa en la superficie de una célula, tal como mediante la expresión de un replicón vírico (por ejemplo, partículas de replicón de alfavirus) o si la proteína F del VRS es un componente de una partícula de tipo vírica.

Los ejemplos de mutaciones del sitio de escisión de furina adecuadas incluyen la sustitución de los restos de aminoácidos 106 - 109 de la SEQ ID NO: 1 o 2 con RARK (SEQ ID NO:14), RARQ (SEQ ID NO:15), QAQN (SEQ ID NO:16), o IEGR (SEQ ID NO:17). Como alternativa o adicionalmente, los restos de aminoácidos 133 - 136 de la SEQ ID NO: 1 o 2 se pueden sustituir con RKKK (SEQ ID NO: 18), AAAR, QNQN (SEQ ID NO:19), QQQR (SEQ ID NO:20) o IEGR (SEQ ID NO: 17). (A indica que se ha delecionado el resto de aminoácido). Estas mutaciones del sitio de escisión de furina se pueden combinar, si se desea, con otras mutaciones descritas en el presente documento, tales como mutaciones en el sitio de escisión de tripsina y mutaciones del péptido de fusión.

Los ejemplos de mutaciones adecuadas en el sitio de escisión de la tripsina incluyen la deleción de cualquier resto de lisina o arginina entre aproximadamente la posición 101 y la posición 161 de la SEQ ID NO:1 o 2, o la sustitución de cualquiera de tales restos de lisina o arginina con otro aminoácido que no sea lisina o arginina. Por ejemplo, los restos de lisina y/o arginina en la región p27 (aproximadamente los aminoácidos 110-136 de las SEQ ID NOS: 1 o 2) se pueden sustituir o delecionar, incluyendo la deleción de la región p27 por completo o en parte.

Las mutaciones descritas en el presente documento se pueden combinar, si se desea, en cualquier combinación. Por ejemplo, las mutaciones de furina se pueden combinar con la deleción parcial o por completo de la región del péptido de fusión y/o la deleción de la región helicoidal de HRA o HRB.

Además de las mutaciones descritas anteriormente, por ejemplo, las mutaciones del sitio de escisión de furina y del péptido de fusión o, como alternativa, polipéptidos o proteínas F solubles del VRS, tales como las que carecen de la región transmembrana y la cola citoplasmática, o deleciones de HRA y HRB, o mutaciones de cisteína, pueden contener una o más secuencias de oligomerización. Cuando está presente una secuencia de oligomerización, preferentemente es una secuencia de trimerización. Las secuencias de oligomerización adecuadas son bien conocidas en la materia e incluyen, por ejemplo, la proteína GCN4 de cremallera de leucina de levadura, la secuencia de trimerización ("foldon") de la fibritina del bacteriófago T4, y el dominio trímero HA de la gripe. Estas y otras secuencias de oligomerización adecuadas se describen en mayor detalle en el presente documento.

En realizaciones particulares, la secuencia del extremo carboxilo terminal del polipéptido o proteína F del VRS, comenzando desde la posición 480, es

(GCN) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE (SEQ ID NO:21)

(HA) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK (SEQ ID NO:22)

(hélice idealizada) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK (SEQ ID NO:23)

(secuencia corta foldon)

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PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID

NO:24); o

(secuencia larga foldon)

PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

(SEQ ID NO:25)

Si se desea, los polipéptidos o proteínas F del VRS que contienen una región transmembrana pueden contener una secuencia de aminoácidos añadida que proporciona un sitio de escisión de proteasa. Este tipo de polipéptido o proteína F del VRS se puede producir mediante la expresión en superficie de una célula, y recuperar en forma soluble tras la escisión desde la superficie celular usando una proteasa apropiada. En general, la secuencia de aminoácidos que proporciona un sitio de escisión de proteasa se localizará en aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos o sustancialmente adyacente al extremo amino terminal del dominio transmembrana (aminoácido 525 de la SEQ ID NO: 1 o 2). En la técnica se conocen bien muchas secuencias de aminoácido adecuadas que se escinden mediante proteasas comercialmente disponibles. Por ejemplo, la trombina escinde la secuencia LVPR (SEQ ID NO:26), el factor Xa escinde la secuencia IEGr (SEQ ID NO: 17) y la enterocinasa escinde la secuencia DDDDK (SEQ ID NO:27). Estas secuencias de aminoácidos se pueden introducir en un polipéptido F del VRS.

Los polipéptidos inmunogénicos usados de acuerdo con la invención normalmente se aislarán o purificarán. Por lo tanto, no estarán asociados con moléculas con las que normalmente, si es aplicable, se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína F usada con la invención no estará en la forma de un virión del VRS (aunque puede estar en la forma de un virión artificial, tal como un virosoma o VLP (partículas de tipo virus).

Los polipéptidos normalmente se prepararán mediante la expresión en un sistema de hospedador recombinante. En general, ellos (por ejemplo, los ectodominios del VRS) se producen mediante la expresión de construcciones recombinantes que codifican los ectodominios en células hospedadoras recombinantes adecuadas, aunque se puede usar cualquier procedimiento adecuado. Las células hospedadoras recombinantes adecuadas incluyen, por ejemplo, células de insecto (por ejemplo, Aedesaegypti, Autographa californica, Bombyxmori, Drosophilamelanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni), células de mamífero (por ejemplo, humano, primate no humano, caballo, vaca, oveja, perro, gato y roedor (por ejemplo, hámster), células de aves (por ejemplo, pollo, pato y ganso), bacterias (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, y Streptococcus spp.), células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenualpolymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica), células de Tetrahymena (por ejemplo Tetrahymena thermophila) o combinaciones de las mismas. En la técnica son bien conocidas muchas células de insecto y de mamífero adecuadas. Las células de insecto adecuadas incluyen, por ejemplo, células Sf9, células Sf21, células Tn5, células Schneider S2 y células High Five ((BTI-TN-5B1- 4) son un aislado clonal derivado de la línea celular parental Trichoplusia ni. (Invitrigen)). Las células de mamífero adecuadas incluyen, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células renales de embrión humano (células HEK293, típicamente transformadas por ADN esquilado de adenovirus de tipo 5), células NIH-3T3, células 293-T, células Vero, células HeLa, células PERC.6 (número de depósito de ECACC 96022940), células Hep G2, MRC-5 (ATCC CCL-171), WI-38 (ATCC CCL-75), células pulmonares de feto de macaco de la India (ATCC CL-160), células de riñón bovino Madin-Darby ("MDBK"), células de riñón canino Madin-Darby ("MDCK") (por ejemplo, MDCK (NBL2), ATCC CCL34; o MDCK 33016, DSM ACC 2219), células de riñón de cría de hámster (BHK), tales como BHK21-F, células HKCC, y similares. Las células de aves adecuadas incluyen, por ejemplo, células madre de embrión de pollo (por ejemplo, células EBx®), fibroblastos de embrión de pollo, células germinales de embrión de pollo, células de pato (por ejemplo, las líneas celulares AGE1.CR y AGE1.CR.pIX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y en el documento WO2005/042728), células EB66 y similares.

Los sistemas de expresión en células de insecto adecuados, tales como sistemas de baculovirus, son conocidos por los expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin N.° 1555 (1987). Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión baculovirus/célula de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit por, entre otros, Invitrogen, San Diego CA. Los sistemas de expresión en células de aves también son conocidos por los expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos n.° 5.340.740; 5.656.479; 5.830.510; 6.114.168; y 6.500.668; la Patente Europea N.° EP 0787180B; la Solicitud de Patente Europea N.° EP03291813.8; el documento WO 03/043415; y el documento WO 03/076601. De manera análoga, los sistemas de expresión en células de mamífero y en bacterias también son conocidos en la materia y se describen en, por ejemplo, Yeast Genetic Engineering (Barr y col., eds., 1989) Butterworths, Londres.

Las construcciones recombinantes que codifican la proteína F de prefusión del VRS se pueden preparar en vectores adecuados usando procedimientos convencionales. Una serie de vectores adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en células de insecto o de mamífero son bien conocidos y convencionales en la materia. Los vectores adecuados pueden contener una serie de componentes, incluyendo, pero sin limitarse a uno o más de los siguientes: un origen de replicación; un gen marcador seleccionable; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control transcripcional (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un finalizador), y/o una o

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más señales de traducción; y una secuencia señal o secuencia líder para el direccionamiento a la vía secretora en una célula hospedadora seleccionada (por ejemplo, de origen de mamífero o de una especie heteróloga de mamífero o no mamífero). Por ejemplo, para la expresión en células de insecto, un vector de expresión de baculovirus, tal como pFastBac (Invitrogen), se usa para producir partículas recombinantes de baculovirus. Las partículas de baculovirus se amplifican y se usan para infectar células de insecto para expresar proteína recombinante. Para la expresión en células de mamífero, se usa un vector que dirigirá la expresión de la construcción en la célula hospedadora de mamífero deseada (por ejemplo, células de ovario de hámster chino).

Los polipéptidos de proteína F de prefusión del VRS se pueden purificar usando cualquiera de los procedimientos adecuados. Por ejemplo, los procedimientos para purificar polipéptidos de F de prefusión del VRS mediante cromatografía de inmunoafinidad son bien conocidos en la materia. Ruiz-Arguello y col., J. Gen. Virol., 85:3677-3687 (2004). Los procedimientos adecuados para purificar proteínas deseadas que incluyen la precipitación y diversos tipos de cromatografía, tales como interacción hidrofóbica, intercambio iónico, afinidad, quelación y exclusión por tamaño son bien conocidos en la materia. Los esquemas de purificación adecuados se pueden crear usando dos o más de estos u otros procedimientos adecuados. Si se desea, los polipéptidos de proteína F de prefusión del VRS pueden incluir un "marcador" que facilita la purificación, tal como un marcador de epítopo o un marcador HIS. Tales polipéptidos marcados se pueden purificar de manera conveniente, por ejemplo, a partir de medios condicionados, mediante cromatografía de quelación o cromatografía de afinidad.

Los polipéptidos de F de prefusión del VRS también se pueden producir in situ mediante la expresión de ácidos nucleicos que los codifican en las células de un sujeto. Por ejemplo, mediante la expresión de un ARN autorreplicante descrito en el presente documento.

Los polipéptidos pueden incluir secuencias adicionales además de las secuencias de prefusión del VRS. Por ejemplo, un polipéptido puede incluir una secuencia para facilitar la purificación (por ejemplo, una secuencia de poli- His). De manera análoga, con fines de expresión, el péptido líder natural de la proteína F se puede sustituir por uno diferente. Por ejemplo, la referencia 6 usó un péptido líder de melitina de abeja en lugar del natural.

ARN autorreplicante

Los polipéptidos de F de prefusión del VRS descritos en el presente documento se pueden producir mediante la expresión de ácidos nucleicos recombinantes que codifican los polipéptidos en las células de un sujeto. Los ácidos nucleicos preferidos que se pueden administrar a un sujeto para provocar la producción de polipéptidos de F de prefusión del VRS son moléculas de ARN autorreplicante. Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se basan en el ARN genómico de los virus de ARN, pero carecen de los genes que codifican una o más proteínas estructurales. Las moléculas de ARN autorreplicante son capaces de traducirse para producir proteínas no estructurales del virus de ARN y proteínas heterólogas codificadas por el ARN autorreplicante.

El ARN autorreplicante generalmente contiene al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en replicasa vírica, proteasas víricas, helicasas víricas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación activas en cis en los extremos 5' y 3' y, si se desea, una secuencia heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos deseada (por ejemplo, una proteína, un antígeno). Se puede incluir en el ARN autorreplicante un promotor subgenómico que dirige la expresión de la secuencia heteróloga. Si se desea, la secuencia heteróloga se puede fusionar en marco con otras regiones codificantes en el ARN autorreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, del inglés internal ribosome entry site).

Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se pueden diseñar de manera que la molécula de ARN autorreplicante no induzca la producción de partículas víricas infecciosas. Esto se puede lograr, por ejemplo, por omisión de uno o más genes víricos que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN autorreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autorreplicante se basa en un alfavirus, tal como el virus Sinebis (SIN), el virus del bosque Semliki y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), se puede omitir uno o más genes que codifican proteínas estructurales víricas, tales como glucoproteínas de la cápside y/o de la envoltura. Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se pueden diseñar para inducir la producción de partículas víricas infecciosas que están atenuadas o son virulentas, o para producir partículas víricas que son capaces de producir una sola ronda de infección posterior.

Una molécula de ARN autorreplicante puede, cuando se administra a una célula de vertebrado incluso sin ninguna proteína, llevar a la producción de múltiples ARN hijos mediante la transcripción de sí misma (o de una copia de sí misma no codificante). El ARN autorreplicante se puede traducir directamente tras la administración a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que entonces produce tránscritos del ARN administrado. Por lo tanto, el ARN administrado lleva a la producción de múltiples ARN hijos. Estos tránscritos son no codificantes en relación con el ARN administrado y se pueden traducir a sí mismos para proporcionar la expresión in situ de un producto génico, o se pueden transcribir para proporcionar tránscritos adicionales con el mismo sentido que el ARN administrado que se traducen para proporcionar la expresión in situ del polipéptido de F codificado del VRS.

Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación es usar un replicón de ARN basado en alfavirus. Estos

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replicones codificantes se traducen tras la administración a una célula para dar una replicasa (o replicasa- transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para producir un complejo de replicación que crea copias genómicas de la hebra no codificante de la hebra codificante del ARN administrado. Los tránscritos de la hebra no codificante se pueden autotranscribir para dar copias adicionales de la hebra codificante del ARN parental y también para dar un tránscrito subgenómico que codifica el polipéptido de la F del VRS. La traducción del tránscrito subgenómico lleva por lo tanto a la expresión in situ del polipéptido de F del VRS por la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus sindbis, de un virus del bosque de semliki, de un virus de encefalitis equina del este, de un virus de encefalitis equina venezolana, etc.

Una molécula preferida de ARN autorreplicante por lo tanto codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN autorreplicante y (ii) un polipéptido de F del VRS. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus por ejemplo, que comprende la proteína de alfavirus nsP4.

Mientras que los genomas naturales de alfavirus codifican proteínas estructurales de virión además de la poliproteína no estructural replicasa, se prefiere que una molécula de ARN autorreplicante basada en alfavirus de la invención no codifique proteínas estructurales de alfavirus. Por lo tanto, el ARN autorreplicante puede llevar a la producción de copias de ARN genómico de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones de alfavirus que contienen aRn. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN autorreplicante no puede perpetuar por sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo silvestre están ausentes de los ARN autorreplicantes de la invención y en su lugar están genes que codifican el producto génico deseado, de manera que el tránscrito subgenómico codifica el producto génico deseado en lugar de las proteínas estructurales de virión de alfavirus.

Por lo tanto, una molécula de ARN autorreplicante útil para la invención puede tener dos marcos de lectura abierta. El primer marco de lectura abierta (5') codifica una replicasa; el segundo marco de lectura abierta (3') codifica un polipéptido de F del VRS. En algunas realizaciones, el ARN puede tener marcos de lectura abierta adicionales (aguas abajo), por ejemplo, que codifican adicionalmente productos génicos deseados. Una molécula de ARN autorreplicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.

En un aspecto, la molécula de ARN autorreplicante proviene de o se basa en un alfavirus. En otros aspectos, la molécula de ARN autorreplicante proviene de o se basa en otro virus que no sea un alfavirus, preferentemente, virus de ARN codificante, y más preferentemente un picornavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus o coronavirus. Las secuencias adecuadas de alfavirus de tipo silvestre son bien conocidas y están disponibles a partir de depósitos de secuencias, tales como la American Type Culture Collection, Rockville, Md. Los ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATcC VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, AtCc VR- 1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus chikungunya (AtCC VR-64, AtCC VR-1241), virus de la encefalomielitis equina del este (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus del río Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR- 1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis equina del oeste (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926), y Y-62-33 (ATCC VR-375).

El ARN autorreplicante se puede asociar con un sistema de administración. El ARN autorreplicante se puede administrar con o sin un adyuvante.

SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN DE ARN

El ARN autorreplicante de la invención es adecuado para la administración en una variedad de modalidades, tales como la administración de ARN desnudo o en combinación con lípidos, polímeros u otros compuestos que faciliten la penetración en las células. Las moléculas de ARN autorreplicante de la presente invención se pueden introducir en células diana o sujetos usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, mediante inyección directa, microinyección, electroporación, lipofección, biolística y similares. La molécula de aRn autorreplicante también se puede introducir en células mediante endocitosis mediada por receptor. Véase, por ejemplo, patente de EE.UU. N° 6.090.619; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621 (1988); y Curiel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 88:8850 (1991). Por ejemplo, La Patente de Estados Unidos n.° 6.083.741 desvela la introducción de un ácido nucleico exógeno en células de mamífero mediante la asociación de ácido a un resto de policatión (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene 3-100 restos de lisina), que a su vez se acopla a un resto de unión a receptor de integrina (por ejemplo, un péptido cíclico que tiene la secuencia Arg-Gly-Asp).

La molécula de ARN autorreplicante de la presente invención se puede administrar en células mediante moléculas anfifílicas. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.071.890. Típicamente, una molécula de ácido nucleico puede formar un complejo con la molécula anfifílica catiónica. Las células de mamífero en contacto con el complejo se pueden obtener fácilmente.

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El ARN autorreplicante se puede administrar como ARN desnudo (simplemente como una solución acuosa de ARN) pero, para mejorar la penetración en las células y también los posteriores efectos intercelulares, el ARN autorreplicante se administra preferentemente en combinación con un sistema de administración, tal como una partícula o sistema de administración por emulsión. Un gran número de sistemas de administración son bien conocidos por los expertos en la materia. Tales sistemas de administración incluyen, por ejemplo, administraciones basadas en liposomas (Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose Patente de EE.UU. n.° 5.279.833; Brigham (1991) WO 91/06309; y Feigner y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 84: 7413-7414), así como el uso de vectores víricos (por ejemplo, de adenovirus (véase, por ejemplo, Berns y col. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 95-104; Ali y col. (1994) Gene Ther. 1: 367-384; y Haddada y col. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199 (Pt 3): 297-306 para revisión), de papilomavirus, de retrovirus (véase, por ejemplo, Buchscher y col. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann y col. (1992) J. Virol. 66 (5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt y col., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson y col. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller y col., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal y col., PCT/US94/05700, y Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, Tercera Edición Paul (ed) Raven Press, Ltd., Nueva York y las referencias en ese documento, y Yu y col., Gene Therapy (1994) citados anteriormente), y vectores víricos adenoasociados (véase West y col. (1987) Virology 160:38-47; Carter y col. (1989) Patente de EE.UU. n.° 4.797.368; Carter y col. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351 y Samulski (citado anteriormente) para una visión global de los vectores víricos adenoasociados (AAV); véase también, Lebkowski, patente de EE.UU. N° 5.173.414; Tratschin y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin, y col. (1984) Mol. Cell. Biol., 4:2072- 2081; Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 81:6466-6470; McLaughlin y col. (1988) y Samulski y col. (1989) J. Virol., 63:03822-3828), y similares.

Tres sistemas de administración particularmente útiles son (i) liposomas (ii) micropartículas poliméricas no tóxicas y biodegradables (iii) emulsiones catiónicas submicrométricas de aceite en agua.

Liposomas

Diversos lípidos anfifílicos pueden formar bicapas en un ambiente acuoso para encapsular un núcleo acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo aniónico, catiónico o zwitteriónico en la cabeza hidrofílica. La formación de liposomas a partir de fosfolípidos aniónicos se remonta a la década de 1960 y los lípidos catiónicos que forman liposomas se han estudiado desde la década de 1990. Algunos fosfolípidos son aniónicos, mientras que otros son zwitteriónicos. Las clases adecuadas de fosfolípidos incluyen, pero sin limitación, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se enumeran en la Tabla 2. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero sin limitación, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DsDmA), 1,2-dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero sin limitación, lípidos zwitteriónicos de acilo y lípidos zwitteriónicos de éter. Los ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden ser saturados o insaturados.

Los liposomas pueden formarse a partir de un único lípido o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwitteriónicos (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwitteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwitteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwitteriónicos. De manera análoga, una mezcla puede comprender tanto lípidos saturados como lípidos insaturados. Por ejemplo, una mezcla puede comprender DSPC (zwitteriónico, saturado), DlinDMA (catiónico, insaturado), y/o DMPG (aniónico, saturado). Cuando se usa una mezcla de lípidos, no se necesita que todos los componentes lipídicos de la mezcla sean anfifílicos, por ejemplo, uno o más lípidos anfifílicos se pueden mezclar con colesterol.

La porción hidrofílica de un lípido puede ser PEGilada (es decir, modificada mediante enlace covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y evitar la adsorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos se pueden conjugar con PEG usando técnicas tales como las desveladas en Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-287.

Una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMPG y colesterol se usa en los ejemplos. Un aspecto separado de la divulgación es un liposoma que comprende DPSC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma preferentemente encapsula ARN, tal como un ARN autorreplicante por ejemplo que codifica un inmunógeno.

Los liposomas se dividen normalmente en tres grupos: vesículas multilamelares (MLV, del inglés multilamellar vesicles); vesículas unilamelares pequeñas (SUV, del inglés small unilamellar vesicles); y vesículas unilamelares grandes (LUV, del inglés large unilamellar vesicles). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y las LUV tienen una única bicapa que encapsula un núcleo acuoso; Las SUV típicamente tienen un diámetro < 50 nm y las LUV tienen un diámetro > 50 nm. Los liposomas útiles para la divulgación son, de manera ideal, las LUV con un diámetro en el intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos el 80 % en número debería tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población

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está, de manera ideal, en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) los diámetros deberían tener un índice de polidispersidad < 0,2.

Las técnicas para preparar liposomas adecuados son bien conocidas en la materia, por ejemplo, véase Liposomes: Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols, (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X; Liposome Technology, volúmenes I, II y III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006; y Functional Polymer Colloids and Microparticles volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes), (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002. Un procedimiento útil implica mezclar (i) una solución etanólica de los lípidos (ii) una solución acuosa del ácido nucleico y (iii) tampón, seguido del mezclado, el equilibrio, la dilución y la purificación (Heyes y col. (2005) J Controller Release 107:276-87).

El ARN preferentemente se encapsula en los liposomas, y de este modo el liposoma forma una capa externa alrededor de un núcleo acuoso que contiene ARN. Se ha descubierto que esta encapsulación protege el ARN de la digestión con RNasa. Los liposomas pueden incluir algunos ARN externos (por ejemplo, en la superficie de los liposomas), pero al menos la mitad del ARN (y de manera ideal, su totalidad) está encapsulado.

Micropartículas poliméricas

Diversos polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN. El uso de un polímero sustancialmente no tóxico significa que un receptor puede recibir de manera segura las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas se pueden metabolizar tras la administración para evitar la persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles también se pueden esterilizar, para ayudar a preparar formulaciones de tipo farmacéutico.

Los polímeros adecuados no tóxicos y biodegradables incluyen, pero sin limitación, poli(a-hidroxi ácidos), ácidos polihidroxibutíricos, polilactonas (incluyendo policaprolactonas), polidioxanonas, polivalerolactona, poliortoésteres, polianhídridos, policianoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina, polivinil-pirrolidinonas o poliesteramidas y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, las micropartículas están formadas de poli(a-hidroxi ácidos), tales como poli(lactidas) ("PLA"), copolímeros de lactida y glicolida tales como una poli(D,L-lactida-co-glicolida) ("PLG") y copolímeros de D,L- lactida y caprolactona. Los polímeros de PLG útiles incluyen aquellos que tienen una proporción molar lactida/glicolida que oscila, por ejemplo, desde 20:80 hasta 80:20, por ejemplo, 25:75, 40:60, 45:55, 55:45, 60:40, 75:25. Los polímeros de PLG incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5.000-200.000 Da por ejemplo, entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 40.000-50.000 Da.

Las micropartículas tienen de manera ideal un diámetro en el intervalo de 0,02 pm a 8 pm. Para una composición que comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros al menos el 80 % en número debería tener diámetros en el intervalo de 0,03-7 pm.

Las técnicas para preparar micropartículas adecuadas son bien conocidas en la materia, por ejemplo, véase Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady y Guyot). Citus Books, 2002; Polymers in Drug Delivery. (eds. Uchegbu y Schatzlein). CRC Press, 2006. (en particular, el capítulo 7) y Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohen y Bernstein). CRC Press, 1996. Para facilitar la adsorción de ARN, una micropartícula puede incluir un tensioactivo y/o lípido catiónico, por ejemplo, tal como se desvela en O'Hagan y col. (2001) J Virology75:9037-9043; y Singh y col. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-251. Una forma alternativa de hacer partículas poliméricas es mediante moldeado y maduración, por ejemplo, tal como se desvela en el documento WO2009/132206.

Las micropartículas de la invención pueden tener un potencial electrocinético de entre 40-100 mV.

El ARN se puede adsorber a las micropartículas, y la adsorción se facilita incluyendo materiales catiónicos (por ejemplo, lípidos catiónicos) en la micropartícula.

Emulsiones catiónicas de aceite en agua

Las emulsiones de aceite en agua son conocidas como adyuvante en vacunas de la gripe, por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto FLUAD™, y el adyuvante AS03 en el producto PREPANDRIX™. La administración de acuerdo con la presente invención puede utilizar una emulsión de aceite en agua, siempre que la emulsión incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, se puede incluir un lípido catiónico en la emulsión para proporcionar una superficie de gota a la que puede atacar el ARN no codificante.

La emulsión comprende uno o más aceites. El(los) aceite(s) adecuado(s) incluye(n) aquellos de, por ejemplo, una fuente animal (tal como un animal marino) o vegetal. El aceite es, de manera ideal, biodegradable (que se puede metabolizar) y biocompatible. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de algodón o aceite de oliva, el más comúnmente disponible, ejemplifican los aceites de frutos secos. El aceite de jojoba se puede usar, por ejemplo, obtenido a partir de la jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de sésamo y

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similares. En el grupo de los cereales, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros cereales tales como el trigo, la avena, el centeno, el arroz, el teff, el triticale y similares también se pueden usar. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se dan de manera natural en aceites de semilla, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados comenzando a partir de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamífero se pueden metabolizar y, por tanto, se pueden usar. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales son bien conocidos en la materia.

La mayoría de animales marinos contienen aceites que se pueden metabolizar que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón, y los aceites de ballena tales como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de animales marinos que se pueden usar en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan de manera bioquímica en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan de manera general terpenoides. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también se puede usar. Los aceites de animales marinos, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la materia.

Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con el escualeno. Cuando la fase de aceite de una emulsión incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 6, £ o ^, pero se prefieren los a-tocoferoles. Se puede usar tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Se puede usar una combinación de aceite que comprende escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).

Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide ramificado e insaturado (C30H50; [(CH3)2C[=CHCH2CH2C(CH3)b=CHCH2-b; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-

tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9).

El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno, y al menos un aceite adicional.

El componente acuoso de la emulsión puede ser agua corriente (por ejemplo, a.p.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales de citrato o de fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina; o un tampón citrato. Se prefiere una fase acuosa tamponada, y los tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM.

La emulsión también incluye un lípido catiónico. Preferentemente este lípido es un tensioactivo, de manera que pueda facilitar la formación y la estabilización de la emulsión. Los lípidos catiónicos útiles generalmente contienen un átomo de nitrógeno que está cargado positivamente en condiciones fisiológicas, por ejemplo, como una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrógeno puede estar en el grupo de la cabeza hidrofílica de un tensioactivo anfipático. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero sin limitación: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3'-[N- (N',N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]Colesterol (DC Colesterol), dimetildioctadecil-amonio (DDA por ejemplo el bromuro), 1,2-Dimiristoil-3-Trimetil-AmonioPropano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amonio propano (DPTAP), distearoiltrimetilamonio propano (DSTAP). Otros lípidos catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de bencetonio, cetramida (que contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dedeciltrilmetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetil amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de cetil trimetilamonio (CTAC), N,N',N'-polioxietileno (10)-N-sebo-1,3 -diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de alquiltrimetilamonio mezclado, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecilamonio, metóxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB), cloruro de metilbencetonio, cloruro de decametonio, cloruro de trialquil amonio mezclado con metilo, cloruro de metil trioctilamonio), cloruro de N,N-dimetil- N-[2 (2-metil-4-(1,1,3,3tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)etil]-bencenometanaminio (DEBDA), sales de dialquilmetilamonio, cloruro de [1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N,trimetilamonio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio) propano (grupo acilo = dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1,2-diacil-3 (dimetilamonio)propano (grupo acilo = dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), 1,2-dioleoil-3-(4'-trimetilamonio)butanoil-sn-glicerol, éster de 1,2-dioleoil 3-succinil- sn-glicerol colina, butanoato de colesteril (4'-trimetilamonio), sales de N-alquil piridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos bolaform dicatiónicos (C12Me6; C12BU6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a dioleoilfosfatidiletanolamina, éster de colesterol hemisuccinato colina, lipopoliaminas, que incluyen, pero sin limitación, dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanol-amidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli (L (o D)-lisina conjugada con N- glutarilfosfatidiletanolamina, éster de didodecil glutamato con grupo amino colgante (CAGluPhCnN), éster de ditetradecil glutamato con grupo amino colgante (C14GluCnN+), derivados catiónicos del colesterol, incluyendo pero sin limitación, sal de colesteril-3 p-oxisuccinamidoetilenotrimetilamonio, colesteril-3 p-oxisuccinamidoetileno- dimetilamina, sal de colesteril-3 p-carboxiamidoetilenotrimetilamonio, y colesteril-3 p- carboxiamidoetilenodimetilamina. Otros lípidos catiónicos útiles se describen en los documentos US 2008/0085870 y US 2008/0057080.

El lípido catiónico es preferentemente biodegradable (que se puede metabolizar) y biocompatible.

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Además del aceite y el lípido catiónico, una emulsión puede incluir un tensioactivo no iónico y/o un tensioactivo zwitteriónico. Tales tensioactivos incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitán (comúnmente denominados los Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO, del inglés ethylene oxide), óxido de propileno (PO, del inglés propylene oxide), y/o óxido de butileno (BO, del inglés butylene oxide), vendido bajo el nombre comercial de DOWFAx™, tales como copolímeros de bloque EO / PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de repeticiones de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) siendo de interés particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno que provienen de alcoholes de laurilo, cetilo, esterarilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como el trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); polioxietilen-9-lauril éter; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los Spans), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos preferidos para incluirlos en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de polioxietileno sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Las mezclas de estos tensioactivos se pueden incluir en las emulsiones, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Triton-X100. Una combinación de un éster de polioxietilen sorbitán tal como monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Triton X-100) es también adecuada. Otra combinación útil comprende laureth 9 y más un éster de polioxietilen sorbitán y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un tensioactivo con un valor HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80, con un HLB de 15,0) y un tensioactivo con un valor de HLB en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán, con un HLB de 1,8).

Las cantidades preferidas de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre el 2-20 %, por ejemplo, 5-15 %, 6-14 %, 7-13 %, 8-12 %. Un contenido en escualeno de aproximadamente el 4-6 % o aproximadamente el 9-11 % es particularmente útil.

Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) en la emulsión final está entre el 0,001 % y el 8 %. Por ejemplo: ésteres de polioxietilen sorbitán (tales como polisorbato 80) 0,2 a 4 %, en particular, entre el 0,4-0,6 %, entre el 0,45-0,55 %, aproximadamente el 0,5 % o entre el 1,5-2 %, entre el 1,8-2,2 %, entre el 1,9-2,1 %, aproximadamente el 2 %, o el 0,85-0,95 %, o aproximadamente el 1 %; ésteres de sorbitán (tales como trioleato de sorbitán) del 0,02 al 2 %, en particular, aproximadamente el 0,5 % o aproximadamente el 1 %; octil- o nonilfenoxietanoles (tales como Triton X-100) del 0,001 al 0,1 %, en particular, del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) del 0,1 al 8 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular, del 0,1 al 1 % o aproximadamente el 0,5 %.

Las cantidades absolutas de aceite y tensioactivo y su proporción, pueden variar dentro de los amplios límites siempre que se forme una emulsión. Un experto en la materia puede variar fácilmente las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada, pero una proporción de peso de entre 4:1 y 5:1 para el aceite y el tensioactivo es típica (exceso de aceite).

Un parámetro importante para asegurar la actividad inmunoestimuladora de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de la gota de aceite (diámetro). Las emulsiones más eficaces tienen un tamaño de la gota en el intervalo de las submicras. De manera adecuada, los tamaños de las gotas estarán en el intervalo de 50-750 nm. Lo más útil es que el tamaño promedio de la gota sea menor de 250 nm, por ejemplo, menor de 200 nm, menor de 150 nm. El tamaño promedio de la gota está de manera útil en el intervalo de 80-180 nm. Idealmente, al menos el 80 % (en número) de las gotas de aceite de la emulsión son menores de 250 nm en diámetro, y preferentemente al menos el 90 %. Los aparatos para determinar el tamaño promedio de la gota en una emulsión y la distribución en tamaños, están comercialmente disponibles. Estos utilizan típicamente las técnicas de dispersión de luz dinámica y / o detección óptica de partículas individuales, por ejemplo la serie de instrumentos Accusizer™ y Nicomp™ disponible de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EEUU), o los instrumentos Zetasizer™ de Malvern Instruments (Reino Unido), o el analizador por distribución de tamaño de partícula de Horiba (Kyoto, Japón).

Idealmente, la distribución de los tamaños de las gotas (en número) tiene solo un máximo, es decir, hay una única población de gotas distribuida alrededor de un promedio (moda), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersidad de <0,4, por ejemplo, 0,3, 0,2 o menos.

Las emulsiones adecuadas con gotas submicrométricas y una estrecha distribución de tamaños se pueden obtener mediante el uso de microfluidización. Esta técnica reduce el tamaño promedio de la gota de aceite al propulsar corrientes de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijos a alta presión y alta velocidad. Estas corrientes ponen en contacto las paredes del canal, las paredes de la cámara y entre sí. Los resultados de fuerzas de cizalla, impacto y cavitación causan una reducción en el tamaño de gota. Se pueden realizar etapas repetidas de microfluidización hasta que se logre una emulsión con un tamaño promedio de gota y una distribución de tamaño deseados.

Como alternativa a la microfluidización, se pueden usar procedimientos térmicos para provocar una inversión de fase. Estos procedimientos también pueden proporcionar una emulsión submicrométrica con una estrecha distribución de tamaño de partícula.

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Las emulsiones preferidas se pueden esterilizar por filtración, es decir, sus gotas pueden pasar a través de un filtro de 220 nm. Además de proporcionar una esterilización, este procedimiento también elimina cualquier gota grande en la emulsión.

En ciertas realizaciones, el lípido catiónico en la emulsión es DOTAP. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTAP desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde

aproximadamente 0,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta

aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,9 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde

aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,1 mg/ml hasta

aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,2 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde

aproximadamente 1,3 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,4 mg/ml hasta

aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,5 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde

aproximadamente 1,6 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta

aproximadamente 25 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 24 mg/ml, desde

aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 22 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta

aproximadamente 20 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 18 mg/ml, desde

aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 15 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta

aproximadamente 12 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, desde

aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta

aproximadamente 2 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,9 mg/ml, desde

aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,8 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta

aproximadamente 1,7 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, desde

aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, desde aproximadamente 0,7 mg/ml hasta

aproximadamente 1,6 mg/ml, desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tales como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.

En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DC colesterol. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DC colesterol desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml de DC colesterol. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DC colesterol aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 0,62 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2,46 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 3,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,92 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2,46 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 2,46 mg/ml, aproximadamente 4,92 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende desde aproximadamente 0,62 mg/ml hasta aproximadamente 4,92 mg/ml de DC colesterol, tal como 2,46 mg/ml.

En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DDA. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml de DDA. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DDA desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 3 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,5 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta

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aproximadamente 1,45 mg/ml, desde aproximadamente 0,2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,4 mg/ml hasta

aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,73 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 0,8 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 0,9 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta

aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 1,2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 1,45 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 2,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 3 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 3,5 mg/ml hasta

aproximadamente 5 mg/ml, desde aproximadamente 4 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, desde

aproximadamente 4,5 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,45 mg/ml, etc. Como alternativa, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DDA hasta aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. En una realización a modo de ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende desde aproximadamente 0,73 mg/ml hasta aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml.

Los catéteres o dispositivos similares se pueden usar para administrar las moléculas de ARN autorreplicante de la invención, como ARN desnudo o en combinación con un sistema de administración, en un órgano o tejido diana. Los catéteres adecuados se desvelan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 4.186.745; 5.397.307; 5.547.472; 5.674.192; y 6.129.705.

La presente invención incluye el uso de sistemas de administración, tales como liposomas, micropartículas poliméricas o micropartículas de emulsión submicrométricas con ARN autorreplicante encapsulado o adsorbido, para administrar una molécula de ARN autorreplicante que codifica un polipéptido de F del VRS, por ejemplo, para generar una respuesta inmunitaria solo o en combinación con otra macromolécula. La invención incluye liposomas, micropartículas y emulsiones submicrométricas con moléculas de ARN autorreplicante adsorbidas y/o encapsuladas, y combinaciones de los mismos.

Tal como se demostró adicionalmente en los Ejemplos, las moléculas de ARN autorreplicante asociadas con liposomas y micropartículas submicrométricas de emulsión se pueden administrar de manera eficaz a la célula hospedadora y pueden inducir una respuesta inmunitaria para la proteína codificada por el ARN autorreplicante.

Composiciones inmunogénicas

La invención proporciona composiciones inmunogénicas. Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un único agente inmunogénico activo o varios agentes inmunogénicos. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede comprender polipéptidos de F de prefusión del VRS o una composición de polipéptidos quiméricos de F de prefusión del VRS. La composición inmunogénica puede comprender un ARN autorreplicante que codifica un polipéptido de F de prefusión del VRS, y preferentemente también comprende un sistema de administración adecuado, tal como liposomas, micropartículas poliméricas, una emulsión de aceite en agua y combinaciones de los mismos.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes, por ejemplo dos, tres, cuatro o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, más tratados a continuación.

En otra realización, una composición inmunogénica de la invención comprende un polipéptido que presenta un epítopo presente e una conformación de prefusión de una glucoproteína F del VRS.

En otra realización, una composición inmunogénica de la invención comprende uno o más proteínas quiméricas de prefusión basadas en dos diferentes proteínas de prefusión que no son del VRS (proteínas F (por ejemplo, metaneumovirus, parainfluenza, tales como VPI5, NDV), en las que ambas tienen los mismos epítopos neutralizantes de la F del VRS mutados en la superficie de la proteína.

Las composiciones de la invención son preferentemente adecuadas para la administración a un sujeto mamífero, tal como un ser humano e incluye uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo los adyuvantes. Una discusión completa de dichos componentes está disponible en la referencia 29. Las composiciones generalmente estarán en forma acuosa. Cuando la composición es una composición inmunogénica, generará una respuesta inmunitaria cuando se administre a un mamífero, tal como un ser humano. La composición inmunogénica se puede usar para preparar una formulación de vacuna para inmunizar a un mamífero.

Las composiciones inmunogénicas pueden incluir un único agente inmunogénico activo o varios agentes inmunogénicos. Por ejemplo, la proteína F de prefusión del VRS puede ser de longitud completa o un polipéptido del ectodominio y puede estar en forma única (por ejemplo, monómero no escindido, monómero escindido, trímero no escindido, trímero escindido) o en dos o más formas (por ejemplo, una mezcla de monómero no escindido y trímero no escindido o un equilibrio dinámico entre el monómero no escindido y el trímero escindido). Además, las composiciones pueden contener una proteína F de prefusión del VRS y una u otras proteínas más del VRS (por

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ejemplo, una proteína G y/o una proteína M) y/o se puede combinar con inmunógenos de otros patógenos.

La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacuna debería estar sustancialmente libre de (es decir, menos de 5 |jg/ml) material de mercurio, por ejemplo, sin tiomersal. Las composiciones inmunogénicas que no contienen mercurio son más preferidas. Las composiciones inmunogénicas sin conservantes son particularmente preferidas.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro sódico (NaCl), que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato potásico, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio y similares.

Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg y estará más preferentemente en el intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina (en particular con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Se incluirán normalmente tampones en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición generalmente estará entre 5,0 y 8,1 y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8. Un proceso de la invención puede, por tanto, incluir una etapa de ajustar el pH de la vacuna a granel antes del envasado.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica, por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida normalizada) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composición es preferentemente sin gluten. Las vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5ml, aunque se puede administrar media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a los niños.

Adyuvantes

Las composiciones de la invención, que contienen polipéptidos de F del VRS, o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de F del VRS, también pueden incluir uno o más adyuvantes, por ejemplo dos, tres, cuatro o más adyuvantes, que pueden funcionar para potenciar las respuestas inmunitarias (humorales y/o celulares) generadas en un paciente que recibe la composición. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante de TH1 y/o un adyuvante de TH2. Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:

• Composiciones que contienen minerales. Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de calcio y sales de aluminio (o mezclas de los mismos). La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc., o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos adoptando cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.) y con la adsorción siendo preferente. Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" desveladas en la ref. 38). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos y similares. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal de metal (39). Los adyuvantes de sal de aluminio se describen en más detalle a continuación.

• Composiciones de emulsión de aceite (véase en más detalle a continuación). Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador).

• Agentes de inducción de citocina (véase en más detalle a continuación). Los agentes de inducción de citocina adecuados para su uso en la invención incluyen agonistas del receptor 7 de tipo toll (TLR7) (por ejemplo, los compuestos de benzonaftiridina desvelados en el documento WO 2009/111337.

• Saponinas (capítulo 22 de la ref. 74) que son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, en las hojas, en los tallos, en las raíces e incluso en las flores de un rango amplio de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvantes. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOMs. QS21 se comercializa como STIMULON (TM). Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones específicas purificadas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la ref. 40. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol (41). Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (capítulo 23 de la ref. 74). Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o

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fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida se puede usar en los ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las refs. 41-43. Opcionalmente, los ISCOM se pueden estar desprovistos de detergente adicional (44). Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponinas se puede encontrar en las refs. 45 y 46.

• Adyuvantes grasos (véase con más detalle a continuación), incluyendo emulsiones de aceite en agua, lípido As natural modificado que proviene de lipopolisacáridos enterobacterianos, compuestos de fosfolípidos (tales como el dímero de fosfolípido sintético, E6020) y similares.

• Toxinas bacterianas ADP-ribosilantes (por ejemplo, la enterotoxina "LT" de E. coli lábil al calor, toxina "CT" del cólera, o toxina "PT" de pertussis) y derivados detoxificados de las mismas, tales como las toxinas mutantes conocidas como LT-K63 y LT-R72 (47). El uso de las toxinas ADP-ribosilantes detoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 48 y como adyuvantes parenterales en la referencia. 49.

• Bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como las microsferas de ácido hialurónico esterificadas (50) o quitosano y sus derivados (51).

• Micropartículas (es decir, una partícula de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 pm de diámetro, más preferentemente de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 pm de diámetro, o -500 nm hasta -10 pm de diámetro) formada a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos(por ejemplo, un poli(a- hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona y similares), con poli(láctido-co-glicólido) siendo preferido, tratado de manera opcional para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como cTaB).

• Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la ref. 74). Los ejemplos de las formulaciones de liposoma adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las refs. 52-54.

• Éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno (55). Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de éster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol (56) así como polioxietileno alquil éteres o tensioactivos de éster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (57). Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril éter (laureth 9), polioxietilen-9 esteroil éter, polioxietilen-8-esteroil éter, polioxietilen-4-lauril éter, polioxietilen-35- lauril éter, y polioxietilen-23-lauril éter.

• Péptidos de muramilo, tales como N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina ("thr-MDP"), N-acetil-normuramil-L- alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida ("DTP-DPP", o "Theramide™), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamina ("MTP-PE").

• Una preparación de proteína proteosoma de membrana externa preparada a partir de una primera bacteria Gram negativa en combinación con una preparación de liposacárido que proviene de una segunda bacteria Gram negativa, en la que las preparaciones de proteína proteosoma y liposacárido forman un complejo de adyuvante estable no covalente. Tales complejos incluyen "IVX-908", un complejo comprendido por la membrana externa de Neisseria meningitidis y lipopolisacáridos.

• Un polímero de polioxidonio (58, 59) u otros derivados N-oxidados de polietileno-piperazina.

• Metil inosina 5'-monofosfato ("MIMP") (60).

• Un compuesto polihidroxilado de pirrolizidina (61), tal como uno que tiene la fórmula:

en la que R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, los grupos acilo, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y arilo lineales o ramificados, no sustituidos o sustituidos, saturados o insaturados, o una sal o derivado de los mismos farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-epi-casuarina, 7-epi-casuarina, 3,7-diepi- casuarina, y similares.

• Un ligando de CD1, tal como una a-glucosilceramida (62-69) (por ejemplo, a-galactosilceramida), a- glucosilceramidas que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-2-(N- hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanetriol], CRONY-101,3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

• Una gamma inulina (70) o derivado de la misma, tal como algammulina.

• Virosomas y partículas de tipo virus (VLP, del inglés virus-like particles). Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. De manera general, no son patogénicos, no replicantes y generalmente no contienen ninguno del genoma vírico natural. Las proteínas víricas se pueden producir de manera recombinante o aislar de los virus completos. Estas proteínas víricas adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas que provienen del virus de la gripe (tales

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como HA o NA), del virus de la hepatitis B (tales como las proteínas del núcleo o de la cápside), del virus de la hepatitis E, del virus del sarampión, del virus Sindbis, del rotavirus, del virus de la enfermedad de fiebre aftosa, de retrovirus, del virus Norwalk, del virus del papiloma humano, del VIH, de los fagos de ARN, del fago Qp (tales como proteínas de recubrimiento), del fago GA, del fago fr, del fago AP205 y de Ty (tales como la proteína p1 del retrotransposón Ty).

Estas y otras sustancias activas adyuvantes se tratan con más detalle en las referencias 74 y 75.

Las composiciones pueden incluir dos, tres, cuatro o más adyuvantes. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden incluir ventajosamente tanto una emulsión de aceite en agua como un agente de inducción de citocinas, o tanto una composición que contiene minerales como un agente de inducción de citocinas, o dos adyuvantes de emulsión de aceite en agua, o dos compuestos de benzonaftiridina, etc.

Los antígenos y adyuvantes en una composición típicamente estarán en mezcla.

Adyuvantes de emulsión de aceite

Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 %, y Span 85 al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). El adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) también se pueden usar.

Se conocen diversas emulsiones de aceite en agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, con el(los) aceite(s) y tensioactivo(s) siendo biodegradable (que se puede metabolizar) y biocompatible. Las gotas de aceite en la emulsión son generalmente menores de 5 pm de diámetro, y pueden incluso tener un diámetro submicrométrico, alcanzando estos tamaños pequeños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Las gotas con un tamaño menor de 220 nm son preferidas dado que se pueden someter a esterilización por filtrado.

La invención se puede usar con aceites tales como los de una fuente animal (tales como animales marinos) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de algodón o aceite de oliva, el más comúnmente disponible, ejemplifican los aceites de frutos secos. Se puede usar aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido a partir de la jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de sésamo y similares. En el grupo de los cereales, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros cereales tales como el trigo, la avena, el centeno, arroz, el teff, el triticale y similares también se pueden usar. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se dan de manera natural en aceites de semilla, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados comenzando a partir de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamífero se pueden metabolizar y, por tanto, se pueden usar en la práctica de la presente invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales son bien conocidos en la materia. La mayoría de animales marinos contienen aceites que se pueden metabolizar que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón, y los aceites de ballena tales como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de animales marinos que se pueden usar en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan de manera bioquímica en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan de manera general terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, insaturado conocido como escualeno, 2, 6, 10, 15, 19, 23-hexametil-2, 6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferido en el presente documento. El escualano, el análogo saturado del escualeno, es también un aceite preferido. Los aceites de animales marinos, incluyendo escualeno y escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la materia. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase a continuación). Se pueden usar mezclas de aceites.

Los tensioactivos se pueden clasificar mediante su "HLB" (equilibrio hidrófilo-lipofílico). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La invención se puede usar con tensioactivos que incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitán (comúnmente denominados los Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO, del inglés ethylene oxide), óxido de propileno (PO, del inglés propylene oxide), y/o óxido de butileno (BO, del inglés butylene oxide), vendido bajo el nombre comercial de DOWFAX (TM), tales como copolímeros de bloque EO / PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de repeticiones de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol) siendo de interés particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilados de nonilfenol, tales como la serie NP de TERGITOL (TM); éteres grasos de polioxietileno que provienen de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como el trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los SPAN), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferidos para incluirlos en la emulsión son TWEEN 80 (TM) (monooleato de polioxietileno sorbitán), Span 85 (trioleato de

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sorbitán), lecitina y Tritón X-100.

Se pueden usar mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de TWEEN 80 (TM)/Span 85. Una combinación de un éster de polioxietilen sorbitán tal como monooleato de polioxietilen sorbitán (TWEEN 80 (TM)) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) es también adecuada. Otra combinación útil comprende laureth 9 y más un éster de polioxietilen sorbitán y/o un octoxinol.

Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de polioxietilen sorbitán (tales como TWEEN 80 (TM)) de 0,01 al 1 %, en particular, aproximadamente el 0,1 %; octil- o nonilfenoxietanoles (tales como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton) del 0,001 al 0,1 %, en particular, del 0,005 al 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) del 0,1 al 20 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular, del 0,1 al 1 % o aproximadamente el 0,5 %.

Los adyuvantes específicos de emulsión de aceite en agua útiles para la invención incluyen, pero sin limitación:

• Una emulsión submicrométrica de escualeno, TWEEN 80 (TM) y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente el 5 % de escualeno, aproximadamente el 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente el 0,5 % de Span 85. En términos de peso, estas proporciones llegan a ser del 4,3 % de escualeno, el 0,5 % de polisorbato 80 y el 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59' (71-73), tal como se describe en más detalle en el Capítulo 10 de la ref. 74 y en el capítulo 12 de la ref. 75. La emulsión MF59 ventajosamente incluye iones citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol, y TWEEN 80 (TM). La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir Span 85 (por ejemplo, al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener desde el 2 hasta el 10 % de escualeno, desde el 2 hasta el 10 % de tocoferol y desde el 0,3 hasta el 3 % de TWEEN 80 (TM), y la proporción de peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1 dado que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y TWEEN 80 (TM) pueden presentar una proporción de volumen de aproximadamente 5:2. Una emulsión así se puede preparar disolviendo TWEEN 80 (TM) en PBS para dar una solución del 2 %, después mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de 5 g de DL-a- tocoferol y 5 ml de escualeno, después microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante pude tener gotas submicrométricas de aceite, por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente sobre 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en un radio en una proporción de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Triton X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deberían de incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de los antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("PLURONIC (TM) L121"). La emulsión se puede formular en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para dipéptidos de muramilo, y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" (76) (0,05-1 % de Thr- MDP, el 5 % de escualano, el 2,5 % de Pluronic L121 y el 0,2 % de polisorbato 80). También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" (77) (5 % de escualano, el 1,25% de Pluronic L121 y el 0,2 % de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrofílico de polioxietileno alquiléter (por ejemplo, polioxietileno (12) cetoesteariléter) y un tensioactivo no iónico hidrofóbico (por ejemplo, un éster de sorbitán o un éster de manida, tal como monoleato de sorbitán o 'Span 80'). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos el 90 % de las gotas de aceite (en volumen) con un tamaño menor de 200 nm. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecil maltósido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglucósido. Tales emulsiones se pueden liofilizar.

• Una emulsión que tiene desde el 0,5-50 % de un aceite, el 0,1-10 % de un fosfolípido y el 0,05-5 % de un tensioactivo no iónico. Tal como se describe en la referencia 78, los componentes de fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños de gota submicrométricos son ventajosos.

• Una emulsión de aceite en agua de un aceite que no se puede metabolizar (tal como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, TWEEN 80 (TM) o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tales como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 79, producido mediante la adición de una amina alifática la desacilsaponina mediante el grupo carboxilo del ácido

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glucurónico), bromuro de dimetiidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso no iónico, lipofílico y etoxilado y un tensioactivo no iónico hidrofílico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloques de polioxietileno- polioxipropileno).

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso no iónico, hidrofílico y etoxilado y un tensioactivo no iónico lipofílico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno).

• Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales (80).

Las emulsiones se pueden mezclar con antígeno de manera extemporánea, en el momento de la administración. Por lo tanto, el adyuvante y el antígeno se pueden mantener de manera separada en una vacuna envasada o distribuida, lista para la formulación final en el momento de su uso. El antígeno estará de manera general en una forma acuosa, de manera que la vacuna se prepare finalmente mezclando dos líquidos. La proporción en volumen de los dos líquidos para la mezcla puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero generalmente es de aproximadamente 1:1.

Agentes de inducción de citocinas

Los agentes de inducción de citocinas para la inclusión en composiciones de la invención son capaces, cuando se administran a un paciente, de promover que el sistema inmunitario libere citocinas, incluyendo interferones e interleucinas. Los agentes preferidos pueden promover la liberación de uno o más de: interferón-Y; interleucina-1; interleucina-2; interleucina-12; TNF-a; TNF-p; y GM-CSF. Los agentes preferidos promueven la liberación de citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de tipo Th1, por ejemplo, interferón-Y, TNF-a, Interleucina-2. Se prefiere la estimulación tanto de interferón-Y como de interleucina-2.

Como resultado de recibir una composición de la invención, por lo tanto, un paciente tendrá linfocitos T que, cuando se estimulen con una proteína F del VRS, liberarán la(s) citocina(s) deseada(s) de una manera específica de antígeno. Por ejemplo, los linfocitos T purificados a partir de su sangre liberarán Y-interferón cuando se expongan in vitro a la proteína F. Los procedimientos para medir tales respuestas en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés peripheral blood mononuclear cells) son conocidos en la materia, e incluyen ELISA, ELISPOT, citometría de flujo y pCr a tiempo real. Por ejemplo, la referencia 81 documenta un estudio en el que las respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T específicos de antígeno frente a toxoide tetánico, especialmente las respuestas de Y-interferón, se controlaron, y se descubrió que ELISPOT fue el procedimiento más sensible para discriminar las respuestas inducidas por linfocitos T específicos de antígeno de las respuestas espontáneas, pero que la detección de citocina intracitoplásmica mediante citometría de flujo fue el procedimiento más eficaz para detectar los efectos reestimulantes.

Los agentes adecuados de inducción de citocinas incluyen, pero sin limitación:

• Un oligonucleótido inmunoestimulador, tal como un que contiene un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada unida mediante una unión de fosfato a una guanosina), o un ARN de doble cadena, o un oligonucleótido que contiene una secuencia palindrómica, o un oligonucleótido que contiene una secuencia poli(dG).

• Lípido A monofosforil 3-O-deacilado ('3dMPL', también conocido como 'MPL (TM)') (82-85).

• Un compuesto de imidazoquinolina, tal como IMIQUIMOD (TM) ("R-837") (86, 87), RESIQUIMOD (TM) ("R-848") (88), y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de hidrocloruro). Los detalles adicionales sobre las imidazoquinolinas inmunoestimuladoras se pueden encontrar en las referencias 89 a 93.

• Un compuesto de benzonaftiridina, tal como: (a) un compuesto que tiene la fórmula: en el que:

R4 se selecciona de H, halógeno, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)N(R11R12), -N(R11R12), -N(R9)2, -NHN(R9)2, -SR7, - (CH2)nOR7, -(CH2)nR7, -LR8, -LR10, -OLR8, -OLR10, C-i-Caalquilo, C-i-Caheteroalquilo, C-i-Cahaloalquilo, C2- Caalqueno, C2-Csalquino, C-i-Caalcoxi, C-i-Cahaloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-Cscicloalquilo, y C3-Csheterocicloalquilo, en el que los grupos C-i-Caalquilo, C-i-Caheteroalquilo, C-i-Cahaloalquilo, C2- C8alqueno, C2-C8alquino, C-i-Caalcoxi, C-i-Cahaloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo de R4 se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de manera independiente de halógeno, -CN, -NO2, -R7,-OR8, -C(O)R8, -OC(O)R 8, -C(O)OR8, - N(R9)2, -P(O)(OR8)2,-OP(O)(OR8)2, -P(O)(OR10)2,

-OP(O)(OR10)2, -C(O)N(R9)2, -S(O)2R8, -S(O)R8, -S(O)2N(R9)2, y -NR9S(O)2R8;

cada L se selecciona de manera independiente a partir de una unión, -(O(CH2)m)t-, C-i-Caalquilo, C2- Caalquenileno y

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C2-C6alquinileno, en el que los grupos Ci-C6alquilo, C2-C6alquenileno y C2-C6alquinileno de L se sustituyen opcionalmente cada uno con 1 a 4 sustituyentes seleccionados de manera independiente de halógeno,

-R8 -OR8,-N(R9)2, -P(O)(OR8)2,

-OP(O)(OR8)2,

-P(O)(OR10)2, y -OP(O)(OR10)2;

R7 se selecciona de H, C1-C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1-C6alcoxi, C1-C6haloalcoxi, y C3-C8heterocicloalquilo, en el que los grupos C1- C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2- C8alquino, CrCaalcoxi, C1-C6haloalcoxi y C3-C8heterocicloalquilo de R7 se sustituye cada uno de manera opcional con 1 a 3 grupos R13;

cada R8 se selecciona independientemente de H, -CH(R10)2, C1-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1- Cahaloalquilo, C1-C6alcoxi, C1-C6heteroalquilo, C3-C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo, C1-C6hidroxialquilo y C1-C6haloalcoxi, en el que los grupos C1-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1-C6heteroalquilo, C1- Cahaloalquilo, C1-C6alcoxi, C3-C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo, C1-C6hidroxialquilo y CrCahaloalcoxi de R8 se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de manera independiente de -CN, R11, -OR11, -SR11, -C(O)R11, -OC(O)R11,

-C(O)N(R9)2, -C(O)OR11, -NR9C(O)R11, -NR9R10, -NR11R12, -N(R9)2,-OR9, -OR10, -C(O)NR11R12, -C(O)NR11OH, -S(O)2R11, -S(O)R11, -S(O)2NR11R12, -NR11S(O)2R11, -P(O)(OR11)2, y -OP(O)(OR11)2;

cada R9 se selecciona independientemente de H, -C(O)R8, -C(O)OR8, -C(O)R10, -C(O)OR10, -S(O)2R10, -C1-C6 alquilo, C1-C6 heteroalquilo y C3-C6 cicloalquilo, o cada R9 es independientemente un C1-C6alquilo que junto con N se unen para formar un C3-C8heterocicloalquilo, en el que el anillo de C3-C8heterocicloalquilo opcionalmente contiene un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, y en el que los grupos C1- C6alquilo, C1-C6 heteroalquilo, C3-C6 cicloalquilo, o

C3-C8heterocicloalquilo de R9 se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de manera independiente de

-CN, R11, -OR11, -SR11, -C(O)R11, -OC(O)R11, -C(O)OR11, -NR11R12, -C(O)NR11R12, -C(O)NR11OH,

-S(O)2R11, -S(O)R11, -S(O)2NR11R12, -NR11S(O)2R11, -P(O)(OR11)2, y -OP(O)(OR11)2;

cada R10 se selecciona independientemente de arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo, en la que los grupos arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, -R8,-OR8, -LR9, -LOR9, -N(R9)2, - NR9C(O)R8,

-NR9CO2R8, -CO2R8, -C(O)R8 y -C(O)N(R9)2;

R11 y R12 se seleccionan independientemente de H, C1-C6alquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo, en el que los grupos C1-C6alquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo R11 y R12 se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de manera independiente de halógeno, -CN, R8, -OR8, -C(O)R8,

-OC(O)R8, -C(O)OR8, -N(R9)2, -NR8C(O)R8, -NR8C(O)OR8, -C(O)N(R9)2, C3-C8heterocicloalquilo, -S(O)2R8, - S(O)2N(R9)2, -NR9S(O)2R8, C1-C6haloalquilo y C1-C6haloalcoxi;

o R11 y R12 son cada uno de manera independiente C1-C6alquilo y junto con el átomo de N al que se unen forman un anillo de C3-C8heterocicloalquilo opcionalmente sustituido que opcionalmente contiene un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S;

cada R13 se selecciona independientemente de halógeno, -CN, -LR9, -LOR9, -OLR9, -LR10, -LOR10, -OLR10, - LR8, -LOR8, -OLR8, -LSR8, -LSR10, -LC(O)R8, -OLC(O)R8, -LC(O)OR8, -LC(O)R10, -LOC(O)OR8, - LC(O)NR9R11, -LC(O)NR9R8, -LN(R9)2, -LNR9R8, -LNR9R10, -LC(O)N(R9)2, -LS(O)2R8, -LS(O)R8, -

LC(O)NR8OH, -LNR9C(O)R8, -LNR9C(O)OR8, -LS(O)2N(R9)2,-OLS(O)2N(R9)2, -LNR9S(O)2R8,-

LC(O)NR9LN(R9)2, -LP(O)(OR8)2, -LOP(O)(OR8)2, -LP(O)(OR10)2 y -OLP(O)(OR10)2; cada RA se selecciona independientemente de -R8, -R7, -OR7, -OR8, -R10, -OR10, -SR8, -NO2, -CN, -N(R9)2, -NR9C(O)R8, -NR9C(S)R8, -NR9C(O)N(R9)2, -NR9C(S)N(R9)2, -NR9CO2R8, -NR9NR9C(O)R8,-NR9NR9C(O)N(R9)2, -NR9NR9CO2R8, - C(O)C(O)R8, -C(O)CH2C(O)R8, -CO2R8, -(CH2)nCO2R8, -C(O)R8, -C(S)R8, -C(O)N(R9)2, -C(S)N(R9)2, - OC(O)N(R9)2, -OC(O)R8, -C(O)N(OR8)R8, -C(NOR8)R8, -S(O)2R8, -S(O)3R8, -SO2N(R9)2, -S(O)R8, - NR9SO2N(R9)2, -NR9SO2R8, -P(O)(OR8)2,-OP(O)(OR8)2, -P(O)(OR10)2, -OP(O)(OR10)2, -N(OR8)R8, - CH=CHCO2R8, -C(=NH)-N(R9)2, y -(CH2)nNHC(O)R8; o dos sustituyentes de RA adyacentes en el anillo A forman un anillo de 5-6 miembros que contiene hasta dos heteroátomos como miembros del anillo; n es, de forma independiente en cada caso, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; cada m se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y t es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; (b) un compuesto que tiene la fórmula:

en el que:

R4 se selecciona de H, halógeno, -C(O)OR7, -C(O)R7, -C(O)N(R11R12), -N(R11R12), -N(R9)2, -NHN(R9)2, -SR7, - (CH2)nOR7, -(CH2)nR7, -LR8, -LR10, -OLR8, -OLR10, C1-C6alquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, C2- C8alqueno, C2-C8alquino, C1-C6alcoxi, C1-C6haloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3- C8heterocicloalquilo, en el que los grupos C1-C6alquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1-C6alcoxi, C1-C6haloalcoxi, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, y C3-C8heterocicloalquilo de

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R4 y se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de manera independiente de halógeno, -CN, -NO2, -R7,-OR8, -C(O)R8, -OC(O)R8, -C(O)OR8, -N(R9)2, -P(O)(OR8)2,- OP(O)(OR8)2, -P(O)(OR10)2, -OP(O)(OR10)2, -C(O)N(R9)2, -S(O)2R8, -S(O)R8, -S(O)2N(R9)2, y -NR9S(O)2R8 cada L se selecciona de manera independiente a partir de una unión, -(O(CH2)m)t-, C1-C6alquilo, C2- C6alquenileno y C2-C6alquinileno, en el que los grupos CrC6alquilo, C2-C6alquenileno y C2-C6alquinileno de L se sustituyen opcionalmente cada uno con 1 a 4 sustituyentes seleccionados de manera independiente de halógeno, -R8 -OR8,-N(R9)2, -P(O)(OR8)2, -OP(O)(OR8)2,

-P(O)(OR10)2, y -OP(O)(OR10)2;

R7 se selecciona de H, C1-C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1-C6alcoxi, C1-C6haloalcoxi, y C3-C8heterocicloalquilo, en el que los grupos C1- C6alquilo, arilo, heteroarilo, C3-C8cicloalquilo, C1-C6heteroalquilo, C1-C6haloalquilo, C2-C8alqueno, C2- C8alquino, C1-C6alcoxi, C1-C6haloalcoxi y C3-C8heterocicloalquilo de R7 se sustituye cada uno de manera opcional con 1 a 3 grupos R13;

cada R8 se selecciona independientemente de H, -CH(R10)2, C1-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1- C6haloalquilo, C1-C6alcoxi, C1-C6heteroalquilo, C3-C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo, C1-C6hidroxialquilo y C1-C6haloalcoxi, en el que los grupos C1-C8alquilo, C2-C8alqueno, C2-C8alquino, C1-C6heteroalquilo, C1- C6haloalquilo, C1-C6alcoxi, C3-C8cicloalquilo, C2-C8heterocicloalquilo,

C1-C6hidroxialquilo y C1-C6haloalcoxi de R8 se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de manera independiente de -CN, R11, -OR11, -SR11, -C(O)R11, -OC(O)R11, - C(O)N(R9)2, -C(O)OR11, -NR9C(O)R11, -NR9R10, -NR11R12, -N(R9)2, -OR9, -OR10, -C(O)NR11R12, -C(O)NR11OH, -S(O)2R11,-S(O)R11, -S(O)2NR11R12, -NR11S(O)2R11, -P(O)(OR11)2, y -OP(O)(OR11)2;

cada R9 se selecciona independientemente de H, -C(O)R8, -C(O)OR8, -C(O)R10,-C(O)OR10, -S(O)2R10, -C1-C6 alquilo, C1-C6 heteroalquilo y C3-C6 cicloalquilo, o cada R9 es independientemente un C1-C6alquilo que junto con N se unen para formar un C3-C8heterocicloalquilo, en el que el anillo de C3-C8heterocicloalquilo opcionalmente contiene un heteroátomo adicional seleccionado de N, O y S, y en el que los grupos C1- C6alquilo, C1-C6 heteroalquilo, C3-C6 cicloalquilo, o

-CN, R11, -OR11, -SR11, -C(O)R11, -OC(O)R11, -C(O)OR11, -NR11R12, -C(O)NR11R12, -C(O)NR11OH, -S(O)2R11, -

S(O)R11, -S(O)2NR11R12, -NR11S(O)2R11, -P(O)(OR11)2, y

-OP(O)(OR11)2;

cada R10 se selecciona independientemente de arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo, en la que el arilo, C3-C8cicloalquilo, C3-C8heterocicloalquilo y heteroarilo se sustituyen cada uno de manera opcional con 1 a 3 sustituyentes seleccionados de halógeno, -R8,-OR8, -LR9, -LOR9, -N(R9)2, -NR9C(O)R8, -NR9CO2R8, -CO2R8, -C(O)R8 y -C(O)N(R9)2;

-OC(O)R8, -C(O)OR8, -N(R9)2, -NR8C(O)R8, -NR8C(O)OR8, -C(O)N(R9)2, C3-C8heterocicloalquilo, -S(O)2R8, - S(O)2N(R9)2, -NR9S(O)2R8, C1-C6haloalquilo y C^haloalcoxi;

LC(O)NR8OH, -LNR9C(O)R8 -LNR9C(O)OR8, LS(O)2N(R9)2, -OLS(O)2N(R9)2, -LNR9S(O)2R8, -

LC(O)NR9LN(R9)2, -LP(O)(OR8)2, -LOP(O)(OR8)2, -LP(O)(OR10)2 y -OLP(O)(OR10)2;

cada RA se selecciona independientemente de -R8, -R7, -OR7, -OR8, -R10, -OR10, -SR8 -NO2, -CN, -N(R9)2, -

NR9C(O)R8 -NR9C(S)R8, -NR9C(O)N(R9)2, -NR9C(S)N(R9)2, -NR9CO2R8, -NR9NR9C(O)R8, -

NR9NR9C(O)N(R9)2, -NR9NR9CO2R8, -C(O)C(O)R8, -C(O)CH2C(O)R8, -CO2R8, -(CH2)nCO2R8, -C(O)R8, - C(S)R8, -C(O)N(R9)2, -C(S)N(R9)2, -OC(O)N(R9)29 -OC(O)R8, -C(O)N(OR8)R8, -C(NOR8)R8, -S(O)2R8, - S(O)3R8, -SO2N(R9)2, -S(O)R8, -NR9SO2N(R9)2, -NR9SO2R8, -P(O)(OR8)2,-OP(O)(OR8)2, -P(O)(OR10)2, - OP(O)(OR10)2, -N(OR8)R8, -CH=CHCO2R8, -C(=NH)-N(R9)2, y -(CH2)nNHC(O)R8; n es, de forma independiente en cada caso, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; cada m se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6, y

t es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; o (c) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) o (b).

Otros compuestos de benzonaftiridina, y procedimientos para preparar compuestos de benzonaftiridina, se describen en el documento WO 2009/111337. Un compuesto de benzonaftiridina, o una sal del mismo, se puede usar por sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, se puede usar un compuesto de benzonaftiridina en combinación con una emulsión de aceite en agua o una composición que contiene minerales. En una realización particular, se usa un compuesto de benzonaftiridina en combinación con una emulsión de aceite en

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agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno en agua, tal como MF59) o una composición que contiene minerales (por ejemplo, una sal mineral tal como una sal de aluminio o una sal de calcio).

• Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como los desvelados en la referencia 94. Los procedimientos para formular, fabricar y seleccionar compuestos activos también se describen en la referencia 94. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

• Un compuesto de triptantrina, tal como los desvelados en la referencia 95. Los procedimientos para formular, fabricar y seleccionar compuestos activos también se describen en la referencia 95. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

• Un análogo de nucleósido, tal como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos desvelados en las referencias 96 a 98; (f) un compuesto que tiene la fórmula:

en el que:

Ri y R2 son cada uno independientemente H, halo, -NRaRb, -OH, C1-6 alcoxi, C1-6 alcoxi sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido, C6-10 arilo, C6-10 arilo sustituido, C1-6 alquilo, o C1-6 alquilo sustituido; R3 está ausente, H, alquilo C1-6, C1-6 alquilo sustituido, C6-10 arilo, C6-10 arilo sustituido, heterociclilo, o heterociclilo sustituido;

R4 y R5 son cada uno independientemente H, halo, heterociclilo, heterociclilo sustituido, -C(O)-Rd, C1-6 alquilo, C1-6 alquilo sustituido, o unidos juntos para formar un anillo de 5 miembros como en R4-5:

R4-5

logrando la unión en los enlaces indicados mediante un X1 y X2 son cada uno independientemente N, C, O, o S;

Re es H, halo, -OH, C1-6 alquilo, C2-6 alquenilo, C2-6 alquinilo, -OH, -NRaRb,-(CH2)n-O-Rc, -O-(C1-6 alquilo), - S(O)pRe, o -C(O)-Rd

Rg es H, C1-6 alquilo, C1-6 alquilo sustituido, heterociclilo, heterociclilo sustituido o Rga, en la que Rga es:

R9a

logrando la unión en los enlaces indicados mediante un

R10 y R11 son cada uno independientemente H, halo, C1.6 alcoxi, C1-6 alcoxi sustituido, -NRaRb, o -OH; cada Ra y Rb es independientemente H, C1.6 alquilo, C1-6 alquilo sustituido, -C(O)Rd, C6-10 arilo; cada Rc es independientemente H, fosfato, difosfato, trifosfato, C1-6 alquilo, o C1.6 alquilo sustituido; cada Rd es independientemente H, halo, C1-6 alquilo, C1.6 alquilo sustituido, C1.6 alcoxi, C1.6 alcoxi sustituido, -NH2, - NH(alquilo C1.6), -NH(C1-6 alquilo sustituido), -N(C1-6 alquilo)2, -N(C1-6 alquilo sustituido)2, C6-10 arilo, o heterociclilo;

cada Re es independientemente H, C1-6 alquilo, C1.6 alquilo sustituido, C6-10 arilo, C6-10 arilo sustituido, heterociclilo, o heterociclilo sustituido;

cada Rf es independientemente H, C1-6 alquilo, C1.6 alquilo sustituido, -C(O)Rd, fosfato, difosfato o trifosfato;

cada n es independientemente 0, 1, 2 o 3; cada p es independientemente 0, 1 o 2; o

o (g) una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de (a) a (f), un tautómero de cualquiera de (a) a (f) o una sal farmacéuticamente aceptable del tautómero.

• Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (99).

• Los compuestos desvelados en la referencia 100, incluyendo: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) (101, 102), compuestos de hidraptalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol (103), compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina, y compuestos de benzazol (104).

• Los compuestos desvelados en la referencia 105.

• Un derivado de aminoalquil glucosaminida fosfato, tal como RC-529 (106, 107).

• Un fosfaceno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno] ("PCPP") tal como se describe, por ejemplo, en las referencias 108 y 109.

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• Inmunopotenciadores molécula pequeña (SMIP, del inglés small molecule immunopotentiators) tales como:

N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo [4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo [4,5- c]quinolina-2,4-diamina N2-etil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2- metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

1-(2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo [4,5- c]quinolina-2,4-diamina N2-butil-N2-metil-1-(2-metil propil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2- metilpropil)-N2-pentil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina N2-metil-1-(2-metilpropil)-N2-prop-2-enil-1H-imidazo [4, 5-c] quinolina-2, 4-diamina

1-(2-metilpropil)-2-[(fenilmetil)tio]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina 1-(2-metilpropil)-2-(propiltio)-1H-imidazo[4,5-

c]quinolin-4-amina 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etanol

acetato de 2-[[4-amino-1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-il](metil)amino]etilo

4-amino-1-(2-metilpropil)-1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona

N2-butil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

N2-butil-N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

N2-metil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

N2,N2-dimetil-1-(2-metilpropil)-N4,N4-bis(fenilmetil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina

1-[4-amino-2-[metil(propil)amino]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol

1-[4-amino-2-(propilamino)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol

N4,N4-dibencil-1-(2-metoxi-2-metilpropil)-N2-propil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-2,4-diamina.

Los agentes de inducción de citocinas para su uso en la presente invención pueden ser moduladores y/o agonistas de receptores de tipo Toll (TLR). Por ejemplo, Por ejemplo, pueden ser agonistas de uno o más de las proteínas humanas TLR1, tLr2, TlR3, TLR4, TLR7, TLR8 y/o TLR9. Los agentes preferidos son agonistas de TLR4 (por ejemplo, lípido As natural modificado que proviene de lipopolisacáridos enterobacterianos, compuestos de fosfolípidos, tales como el dímero de fosfolípido sintético, E6020), TLR7 (por ejemplo, benzonaftiridinas, imidazoquinolinas) y/o TLR9 (por ejemplo, oligonucleótidos CpG). Estos agentes son útiles para activar las vías de inmunidad innata.

El agente de inducción de citocinas se puede añadir a la composición en diversas etapas durante su producción. Por ejemplo, puede estar en una composición de antígeno, y esta mezcla se puede añadir a una emulsión de aceite en agua. Como una alternativa, puede estar en una emulsión de aceite en agua, en cuyo caso, el agente se puede añadir a los componentes de la emulsión bien antes de la emulsificación o bien se puede añadir a la emulsión tras la emulsificación. De manera análoga, el agente puede estar coacervado con las gotas de la emulsión. La localización y distribución del agente de inducción de citocinas en la composición final dependerá de sus propiedades hidrofílicas/lipofílicas, por ejemplo, el agente se puede localizar en la fase acuosa, en la fase oleosa y/o en la interfase aceite-agua.

El agente de inducción de citocinas se puede conjugar con un agente separado, tal como un antígeno (por ejemplo, CRM197). Una revisión general de las técnicas de conjugación para pequeñas moléculas se proporciona en la ref. 110. Como una alternativa, los adyuvantes pueden estar asociados de manera no covalente con agentes adicionales, tal como mediante interacciones hidrofóbicas o iónicas.

Los agentes de inducción de citocinas preferidos son (a) compuestos de benzonaftiridina; (b) oligonucleótidos inmunoestimuladores y (c) 3dMPL.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble cadena o (salvo para el ARN) de cadena sencilla. Las referencias 111, 112 y 113 desvelan posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, sustitución de guanosina con 2'-desoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se trata adicionalmente en las refs. 114 a 119. Se puede dirigir una secuencia CpG a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT (120). La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN (oligodesoxinucleótido) CpG-A o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CdG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se tratan en las refs. 121-123. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A. Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véanse, por ejemplo, las referencias 120 y 124-126. Un adyuvante útil de CpG es CpG7909, también conocido como pRomUnE (TM) (Coley Pharmaceutical Group, Inc.).

Como alternativa o adicionalmente, para usar secuencias CpG, se pueden usar las secuencias TpG (127). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados.

El oligonucleótido inmunoestimulador puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, tal como se desvela en la ref. 127), y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % en timidina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, tal como se desvela en la ref. 127), y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % en citosina (por ejemplo, > 35 %, > 40

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%, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores comprenderán típicamente al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

El 3dMPL (también conocido como monofosforil-lípido A 3-de-O-acilado o 3-O-desacil-4'-monofosforil lípido A) es un adyuvante en el que la posición 3 de la glucosamina del extremo reductor en el monofosforil lípido A se ha deacetilado. EL 3dMPL se ha preparado a partir de un mutante sin heptosa de Salmonella minnesota, y es químicamente similar al lípido A pero carece de un grupo fosforilo lábil al ácido y un grupo acilo lábil a la base. Activa las células del linaje de los monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-a y GM-CSF (véase también la ref. 128). La preparación de 3dMPL se describió de manera original en la referencia 129.

3dMPL puede tomar la forma de una mezcla de moléculas relacionadas, variando por su acilación (por ejemplo, teniendo 3, 4, 5 o 6 cadenas de acilo, que pueden ser de longitudes diferentes). Los dos monosacáridos de glucosaminas (también conocidos como 2-desoxi-2-amino-glucosa) están N-acilados en sus carbonos de 2 posiciones (es decir, en las posiciones 2 y 2') y también hay O-acilación en la posición 3'. El grupo unido al carbono 2 tiene la fórmula -NH-CO-CH2-CR1R1'. El grupo unido al carbono 2' tiene la fórmula -NH-CO-CH2-CR2R2'. El grupo unido al carbono 3' tiene la fórmula -O-CO-CH2-CR3R3'. Una estructura representativa es:

Los grupos R1, R2 y R3 son cada uno independientemente -(CH2)n-CH3. El valor de n está preferentemente entre 8 y 16, más preferentemente entre 9 y 12, y es lo más preferentemente 10.

Los grupos R1, R2' y R3' pueden ser cada uno de manera independiente: (a) -H; (b) -OH; o (c)-O-CO-R4, en el que R4 es bien -H o -(CH2)m-CH3, en el que el valor de m está preferentemente entre 8 y 16, y es más preferentemente 10, 12 o 14. En la posición 2, m es preferentemente 14. En la posición 2', m es preferentemente 10. En la posición 3', m es preferentemente 12. Los grupos R1', R2' y R3' son por tanto grupos -O-acil de ácido dodecanoico, ácido tetradecanoico o ácido hexadecanoico.

Cuando todos los R1, R2' y R3' son -H, entonces el 3dMPL tiene solo 3 cadenas acilo (una en cada una de las posiciones 2, 2' y 3'). Cuando solo dos de R1', R2' y R3' son -H entonces el 3dMPL puede tener 4 cadenas de acilo. Cuando solo uno de R1', R2' y R3' son -H entonces el 3dMPL puede tener 5 cadenas de acilo. Cuando ninguno de R1, R2' y R3' es -H, entonces el 3dMPL puede tener 6 cadenas de acilo. El adyuvante de 3dMPL usado de acuerdo con la invención puede ser una mezcla de estas formas, con de 3 a 6 cadenas de acilo, pero se prefiere incluir 3dMPL con cadenas de 6 acilos en la mezcla, y en particular, asegurar que la forma de la cadena de hexaacilo constituye al menos el 10 % en peso del 3dMPL total, por ejemplo, > 20 %, > 30 %, > 40 %, > 50 % o más. Se ha descubierto que el 3dMPL con las 6 cadenas de acilo es la forma de adyuvante más activa.

Por lo tanto, la forma más preferida de 3dMPL para su inclusión en composiciones de la invención tiene la fórmula (IV), mostrado más adelante.

Cuando se usa 3dMPL en la forma de una mezcla, entonces las referencias a las cantidades o concentraciones de 3dMPL en las composiciones de la invención se refieren a las especies de 3dMPL combinadas en la mezcla.

En condiciones acuosas, el 3dMPL puede formar agregados micelares o partículas con diferentes tamaños, por ejemplo, con un diámetro < 150 nm o > 500 nm. Cualquiera o ambos de estos se pueden usar en la invención, y se pueden seleccionar las mejores partículas mediante ensayo habitual. Las partículas más pequeñas (por ejemplo, lo suficientemente pequeñas como para dar una suspensión acuosa clara de 3dMPL) se prefieren para su uso de acuerdo con la invención debido a su actividad superior (130). Las partículas preferidas tienen un diámetro medio menor de 220 nm, más preferentemente menor de 200 nm o menor de 150 nm o menor de 120 nm, y pueden incluso tener un diámetro medio menor de 100 nm. En la mayoría de los casos, sin embargo, el diámetro medio no será menor de 50 nm. Estas partículas son lo suficientemente pequeñas como para ser adecuadas para la esterilización por filtro. El diámetro de las partículas se puede evaluar mediante la técnica habitual de dispersión de luz dinámica, que revela un diámetro medio de partícula. Cuando se dice que una partícula tiene un diámetro de x nm, será generalmente una distribución de partículas sobre esta media, pero al menos el 50 % en número (por ejemplo, > 60 %, > 70 %, > 80 %, > 90 % o más) de las partículas tendrá un diámetro en el intervalo de x + 25 %.

Se puede usar ventajosamente 3dMPL en combinación con una emulsión de aceite en agua. Sustancialmente, todos los 3dMPL se pueden localizar en la fase acuosa de la emulsión.

El 3dMPL se puede usar por sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, es conocido usar 3dMPL en combinación con la saponina QS21 (131) (que se incluye en una emulsión de aceite en agua (132)), con un oligonucleótido inmunoestimulador, con QS21 y un oligonucleótido inmunoestimulador, con un fosfato de aluminio (133), con hidróxido de aluminio (134), o con fosfato de aluminio e hidróxido de aluminio.

Fórmula (IV)

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Adyuvantes grasos

Los adyuvantes grasos que se pueden usar con la invención incluyen las emulsiones de aceite en agua descritas anteriormente, y también incluyen, por ejemplo:

• Un compuesto de fosfolípido de fórmula I, II o III, o una sal del mismo:

I II III

tal como se describe en la referencia 135, tal como 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 o 'ER 804057' por ejemplo:

ER804057

ER-803022.

ER804057 también se denomina E6020. Un compuesto de fosfolípido de fórmula, II o III, o una sal del mismo, se puede usar por sí mismo, o en combinación con uno o más compuestos adicionales. Por ejemplo, un compuesto de fórmula I, II o III, se puede usar en combinación con una emulsión de aceite en agua o una composición que contiene minerales. En una realización particular, E6020 se usa en combinación con una emulsión de aceite en agua (por ejemplo, una emulsión de escualeno en agua, tal como MF59) o una composición que contiene minerales (por ejemplo, una sal mineral tal como una sal de aluminio o una sal de calcio).

• Derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174 (descrito en las refs. 136 y 137).

• Una formulación de un lípido catiónico y un colípido (normalmente neutro), tal como aminopropil-dimetil- miristoleiloxi-propanaminio bromuro-difitanoilfosfatidil-etanolamina ("VAXFECTIN (TM)") o aminopropil-dimetil-bis- dodeciloxi-propanaminio bromuro-dioleoilfosfatidil-etanolamina ("GAP-DLRIE:DOPE"). Se prefieren formulaciones que contienen sales de (+)-N-(3-aminopropil)-N,N-dimetil-2,3-bis(sin-9-tetradecenoiloxi)-1-propanaminio (138).

• Lípido A monofosforil 3-O-deacilado (véase anteriormente).

• Compuestos que contienen lípidos enlazados a una estructura principal acíclica que contiene fosfato, tal como el antagonista de TLR4 E5564 (139, 140):

• Lipopéptidos (es decir, compuestos que comprenden uno o más restos de ácidos grasos y dos o más restos de aminoácidos), tales como lipopéptidos basados en glicerilcisteína. Los ejemplos específicos de tales péptidos incluyen los compuestos de la siguiente fórmula

en la que cada uno de los R1 y R2 representa un radical de hidrocarburo saturado o insaturado, alifático o mezcla de alifático y cicloalifático que tiene de 8 a 30, preferentemente de 11 a 21, átomos de carbono que opcionalmente también se sustituye por las funciones de oxígeno, R3 representa el hidrógeno o el radical R1-CO-O-CH2- en el que R1 tiene el mismo significado que anteriormente, y X representa un aminoácido unido mediante un enlace peptídico y tiene un grupo carboxilo libre, esterificado o amidado, o una secuencia de aminoácidos de 2 a 10 aminoácidos de la que el grupo carboxilo terminal está en forma libre, esterificada o amidada. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos comprende un D-aminoácido, por ejemplo, ácido D-glutámico (D-Glu) o ácido D-gamma-carboxi- glutámico (D-Gla).

Los lipopolipéptidos bacterianos generalmente reconocen la TLR2, sin requerir la participación de TLR6. (Las TLR operan de manera cooperativa para proporcionar un reconocimiento específico de diversas moléculas desencadenantes, y TLR2 junto con TLR6 reconocen los peptidoglucanos, mientras que TLR2 reconoce los lipopéptidos sin TLR6). Estos se clasifican a veces como lipopéptidos naturales y lipopéptidos sintéticos. Los lipopéptidos sintéticos tienden a comportarse de manera similar, y se reconocen fundamentalmente mediante TLR2.

Los lipopéptidos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen compuestos que tienen la fórmula:

en la que el centro quiral marcado con * y el marcado con *** están ambos en la configuración R; el centro quiral marcado ** está bien en la configuración R o S;

cada R1a y R1b es independientemente un grupo de hidrocarburos alifáticos o cicloalifático-alifático que tiene 7-21 átomos de carbono, sustituido de manera opcional por las funciones de oxígeno, o uno de R1a y R1b, pero no ambos, es H;

R2 es un grupo de hidrocarburo alifático o cicloalifático que tiene 1-21 átomos de carbono y opcionalmente sustituido por funciones de oxígeno; n es 0 o 1;

As representa bien -O-Kw-CO- o -NH-Kw-CO-, en el que Kw es un grupo de hidrocarburos alifáticos que tiene 112 átomos de carbono;

As1 es un D- o L-alfa-aminoácido;

Z1 y Z2 representa cada uno de manera independiente -OH o el radical N-terminal de un D- o L-alfa aminoácido de un ácido amino-(alcano más bajo)-sulfónico o un péptido que tiene hasta 6 aminoácidos seleccionados a partir de los ácidos D- y L-alfa aminocarboxílicos y ácidos amino-alquilo más bajo-sulfónicos; y

Z3 es H o -CO-Z4, en el que Z4 es -OH o el radical N-terminal de un D- o L-alfa aminoácido de un ácido amino-

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(alcano más bajo)-sulfónico o de un péptido que tiene hasta 6 aminoácidos seleccionados de los ácidos D y L- alfa aminocarboxílicos y ácidos amino-alquilo más bajo-sulfónicos; o un éster o una amida formada a partir del ácido carboxílico de tales compuestos. Las amidas adecuadas incluyen -NH2 y NH(alquilo más bajo), y los ésteres adecuados incluyen los ésteres de alquilo de C1-C4. (el aquilo más bajo o el alcano más bajo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a alquilos de cadena lineal o de cadena ramificada de C1-C6).

Tales compuestos se describen con más detalle en el documento US 4.666.886. En una realización particular, el lipopéptido tiene la fórmula:

Otro ejemplo de una especie de lipopéptido se denomina LP40, y es un agonista de TLR2. Akdis, y col., Eur. J. Immunology, 33: 2717-26 (2003).

Estos se relacionan con una clase de lipopéptidos conocida de E. coli, denominada lipoproteínas de mureína. Determinados productos de degradación parcial de estas proteínas denominados lipopéptidos de mureína se describen en Hantke, y col., Eur. J. Biochem., 34: 284-296 (1973). Estos comprenden un péptido enlazado al ácido N-acetil murámico y están, por tanto, relacionados con los péptidos de muramilo, que se describen en Baschang, y col., Tetrahedron, 45(20): 6331-6360 (1989).

Adyuvantes de sales de aluminio

Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" y "fosfato de aluminio" se pueden usar. Estos nombres son convencionales, pero se usan solo por conveniencia, ya que ninguna de las dos es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase el capítulo 9 de la referencia 74). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes.

Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que normalmente son al menos parcialmente cristalinas. El oxihidróxido de aluminio, que puede representarse por la fórmula AlO(OH), puede distinguirse de otros compuestos de aluminio, tales como hidróxido de aluminio Al(OH)3, mediante espectroscopía infrarroja (IR), en particular, por la presencia de una banda de absorción a 1070cm'1 y un hombro intenso a 3090-3100cirr1 (capítulo 9 de la ref. 74). El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se refleja por el ancho de la banda de difracción a media altura (WHH), mostrando las partículas poco cristalinas un mayor ensanchamiento de la línea debido a los tamaños cristalinos menores. El área superficial aumenta a medida que aumenta WHH, y se ha observado que los adyuvantes con mayores valores de WHH tienen mayor capacidad de adsorción de antígeno. Una morfología fibrosa (por ejemplo, tal como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente aproximadamente 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga positiva de la superficie a pH fisiológico. Se han comunicado capacidades de adsorción de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente sales de hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo contienen también una pequeña cantidad de sulfato (es decir, hidroxifosfato sulfato de aluminio). Se pueden obtener mediante precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influencian el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una relación molar PO4/Al entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos pueden distinguirse de AlPO4 estrictos por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda de espectro de IR a 3164 cirr1 (por ejemplo, cuando se calienta a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales (cap. 9 de la ref. 74).

La relación molar de PO4/Al3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio será generalmente entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente 0,95+0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluida a 0,6 mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio estará generalmente particulado (por ejemplo, morfología de tipo placa tal como se ve en las micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 pm) tras cualquier adsorción de antígeno. Las capacidades adsortivas de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 se han comunicado para los adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC, del inglés point of zero charge) del fosfato de aluminio se relaciona inversamente con el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de la reacción y de la concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera cambiando la concentración de iones fosfato libres en solución (más fosfato = más PZC ácido) o añadiendo un tampón, tal como un tampón de histidina (hace que el PZC sea más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invención tendrán un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero esto no es siempre necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y sin pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuosos libres, por ejemplo, presentes a una concentración de entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más

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preferentemente aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro sódico.

La invención puede usar una mezcla de un hidróxido de aluminio y un fosfato de aluminio. En este caso, puede ser más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una proporción de peso de al menos 2:1, por ejemplo, > 5:1, > 6:1, > 7:1, > 8:1, > 9:1, etc.

La concentración de AI+++ en una composición para su administración a un paciente es preferentemente menor de 10 mg/ml, por ejemplo, < 5 mg/ml, < 4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido es entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

Además de incluir uno o más adyuvantes de sal de aluminio, el componente adyuvante puede incluir uno o más adyuvantes adicionales o agentes inmunoestimuladores. Tales componentes adicionales incluyen, pero sin limitación: un compuesto de benzonaftiridina, un adyuvante de lípido A monofosforil 3-O-deacilado ('3d-MPL'); y/o una emulsión de aceite en agua. El 3dMPL también se ha denominado como monofosforil-lípido A 3-de-O-acilado o como 3-O-desacil-4'-monofosforil lípido A. El nombre indica que la posición 3 de la glucosamina del extremo reductor en el monofosforil lípido A se ha deacetilado. Se ha preparado a partir de un mutante sin heptosa de S.minnesota, y es químicamente similar al lípido A pero carece de un grupo fosforilo lábil al ácido y un grupo acilo lábil a la base. Activa las células del linaje de los monocitos/macrófagos y estimula la liberación de varias citocinas, incluyendo IL-1, IL-12, TNF-a y GM-CSF. La preparación de 3d-MPL se describió originariamente en la referencia 129, y el producto se ha fabricado y vendido por Corixa Corporation con el nombre MPL (TM). Los detalles adicionales se pueden encontrar en las referencias 82 a 85.

El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio es útil, particularmente en niños, y los antígenos se adsorben de manera general a estas sales. Las emulsiones de escualeno en agua también son preferidas, particularmente en la vejez. Las combinaciones de adyuvantes útiles incluyen combinaciones de adyuvantes de Th1 y Th2 tales como CpG y alumbre, o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL. Otras combinaciones que se pueden usar incluyen: alumbre y un compuesto de benzonaftiridina o una SMIP, una emulsión de escualeno en agua (tal como MF59) y un compuesto de benzonaftiridina o una SMIP y E6020 y una emulsión de escualeno en agua, tal como MF59) o alumbre.

Las composiciones de la invención pueden generar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral.

En general, se considera que dos tipos de linfocitos T, los CD4 y los CD8 son necesarios para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor de CD8 y se denominan comúnmente linfocitos T citotóxicos (LTC). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en las moléculas de MHC de Clase I.

Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor de CD4 y se denominan comúnmente linfocitos T colaboradores. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a las moléculas de MHC de clase II. Tras la interacción con una molécula de MHC de clase II, los linfocitos CD4 pueden secretar factores tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar los linfocitos B, los linfocitos T citotóxicos, los macrófagos, y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T colaboradores o los linfocitos T CD4+ se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: el fenotipo TH1 y el fenotipo TH2 que difieren en su citocina y su función efectora.

Los linfocitos TH1 activados mejoran la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de LTC específicos de antígeno) y por tanto son de valor particular en la respuesta a las infecciones intracelulares. Los linfocitosTH1 activos pueden secretar una o más de IL-2, IFN-y, y TNF-p. Una respuesta inmunitaria de TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, células NK (linfocitos citolíticos naturales) y linfocitos T CD8 citotóxicos (LTC). Una respuesta inmunitaria de TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria mediante la estimulación del crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar IgG2a.

Los linfocitos TH2 activados mejoran la producción de anticuerpos y son, por tanto, de valor en la respuesta a infecciones extracelulares. Los linfocitos TH2 activados pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10. Una respuesta inmune de TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para una futura protección.

Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta inmunitaria de TH2.

Una respuesta inmunitaria de TH1 puede incluir uno o más de un aumento en LTC, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH1 (tal como IL-2, IFN-y, y TNF-p), un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad de las NK, o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH1 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

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La respuesta inmunitaria de TH1 se puede promover usando un adyuvante de TH1. Un adyuvante de TH1 generalmente promoverá niveles elevados de producción de IgG2a relacionados con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para su uso en la invención pueden incluir por ejemplo formulaciones de saponina, virosomas y partículas de tipo virus, derivados no tóxicos de lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS), oligonucleótidos inmunoestimuladores. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, tales como los oligonucleótidos que contiene un motivo de CpG, son adyuvantes TH1 preferidos para su uso en la invención.

Una respuesta inmunitaria de TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10), o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH2 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

La respuesta inmunitaria de TH2 se puede promover usando un adyuvante de TH2. Un adyuvante de TH2 generalmente promoverá niveles elevados de producción de IgG1 relacionados con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite, y toxinas ADP-ribosilantes y derivados detoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la invención.

Una composición puede incluir una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, tal composición promueve una respuesta mejorada de tH1 y TH2, es decir, un aumento en la producción tanto de IgG1 como de la producción de IgG2 en relación con la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y TH2 promueve una respuesta inmunitaria elevada de TH1 y tH2 en relación con un único adyuvante (es decir, en relación con la inmunización con un adyuvante solo de TH1 o la inmunización con un adyuvante solo de TH2).

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta de TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta mejorada de TH1 y una respuesta mejorada de TH2.

La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica o de la mucosa. Preferentemente, la respuesta inmune proporciona uno o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una respuesta inmunitaria de la mucosa mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de la mucosa es una respuesta inmunitaria de TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de la mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Procedimiento de tratamiento y administración

Las composiciones de la invención son adecuadas para su administración a mamíferos, y la invención proporciona un procedimiento de inducción de una repuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una composición (por ejemplo, una composición inmunogénica) de la invención al mamífero. Las composiciones (por ejemplo, una composición inmunogénica) se pueden usar para producir una formulación de vacuna para inmunizar a un mamífero. El mamífero es típicamente un ser humano, y la proteína F del VRS es típicamente una proteína F del VRS humano. Sin embargo, el mamífero puede ser cualquier otro mamífero que sea susceptible de infección con el VRS, tal como una vaca que se puede infectar con el vRs bovino. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria se puede generar tras la administración de una proteína F purificada del vRs, una partícula de alfavirus, o ARN autorreplicante.

La invención también proporciona el uso de dos o más proteínas quiméricas de prefusión, basadas en dos o más proteínas F de prefusión que no son del VRS (por ejemplo, el virus parainfluenza o el metapneumovirus) (es decir, VPI5 y NDV) que cada una tiene los mismos epítopos neutralizantes mutados de F del VRS en la superficie de la proteína. Por lo tanto, la inoculación con una F de prefusión quimérica y una segunda inoculación con la segunda F de prefusión puede cebar varios anticuerpos, algunos para el VRS y algunos para la estructura principal de la proteína del molde. La segunda inoculación puede influir en el refuerzo de solo los epítopos neutralizantes compartidos de la F del VRS.

La invención también proporciona una composición de la invención para su uso como un medicamento, por ejemplo, para su uso en la inmunización de un paciente frente a infección por VRS.

La invención también proporciona el uso de un polipéptido tal como se describe anteriormente en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un paciente.

La respuesta inmunitaria generada mediante estos procedimientos y usos generalmente incluirá una respuesta de anticuerpos, preferentemente una respuesta de anticuerpos protectora. Los procedimientos para evaluar las respuestas de anticuerpos tras la vacuna del VRS son bien conocidos en la materia.

Las composiciones de la invención se pueden administrar de una serie de formas adecuadas, tales como inyección

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intramuscular (por ejemplo, en el brazo o en la pierna), inyección subcutánea, administración intranasal, administración oral, administración intradérmica, administración transcutánea, administración transdérmica, y similares. La vía de administración apropiada dependerá de la edad, de la salud y de otras características del mamífero. Un médico clínico será capaz de determinar una vía de administración apropiada basada en estos y otros factores.

Las composiciones inmunogénicas y las formulaciones de vacuna, se pueden usar para tratar tanto niños como adultos, incluyendo mujeres embarazadas. Por lo tanto, un sujeto puede ser de menos de 1 año de edad, de 1-5 años de edad, de 5-15 años de edad, de 15-55 años de edad, o al menos de 55 años de edad. Los sujetos preferidos para recibir las vacunas son los de la vejez (por ejemplo, > 50 años de edad, > 60 años de edad y, preferentemente, > 65 años), los jóvenes (por ejemplo, < 6 años de edad, tales como de 4 - 6 años de edad, < 5 años de edad,) y las mujeres embarazadas. Las vacunas no solo son adecuadas para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar de manera más general en una población.

El tratamiento puede ser por una única pauta de dosificación o una pauta de dosificación múltiple. Se pueden usar múltiples dosis en una pauta de inmunización principal y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta de dosificación múltiple, las diversas dosis se pueden dar por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo, una principal por vía parenteral y un refuerzo por vía mucosal, una principal por vía mucosal y un refuerzo por vía parenteral, etc. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útiles en pacientes que no se han tratado anteriormente de manera inmunológica. Las múltiples dosis se administrarán típicamente con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas y similares).

Las formulaciones de vacuna producidas usando una composición de la invención se pueden administrar a los pacientes a sustancialmente el mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional de la salud o a un centro de vacunación) otras vacunas.

General

La expresión "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste" y "que consiste esencialmente en" por ejemplo, una composición "que comprende" X podrá consistir exclusivamente en X o podrá incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo, una composición que es "sustancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10%.

A no ser que se indique específicamente, un proceso que comprende una etapa de mezclado de dos o más componentes no requiere cualquier orden de mezclado específico. Por lo tanto, los componentes pueden mezclarse en cualquier orden. Cuando existen tres componentes entonces se pueden combinar dos componentes entre sí, y a continuación la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.

En los casos donde se usan materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse de fuentes que existen exentas de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE), y en particular, exentas de encefalopatía espongiforme bovina (BSE). En general, se prefiere cultivar las células en total ausencia de materiales procedentes de animales.

En los casos donde se administre un compuesto al organismo como parte de una composición, entonces ese compuesto puede como alternativa reemplazarse por un profármaco adecuado.

Cuando un sustrato celular se usa para procedimientos de reasignación o de genética inversa, se prefiere el que se ha aprobado para su uso en la producción de vacunas humanas, por ejemplo, como en Ph Eur general capítulo 5.2.3.

La identidad entre secuencias de polipéptidos se determina preferentemente mediante el algoritmo de búsqueda de homología que se implementó en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una búsqueda de espacio afín con parámetros de penalización abierta = 12 y penalización de extensión de hueco = 1.

Tabla 2. Fosfolípidos

DDPC 1,2-Didecanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DEPA 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-Fosfato

DEPC 1,2-Erucoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

DEPE 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

DEPG 1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

DLOPC DLPA DLPC DLPE DLPG DLPS DMG DMPA DMPC DMPE DMPG DMPS DOPA DOPC DOPE DOPG DOPS DPPA DPPC DPPE DPPG DPPS DPyPE DSPA DSPC DSPE DSPG DSPS EPC HEPC HSPC HSPC

LISOFOSFATIDILCOLINA (LYSOPC MYRISTIC) LISOFOSFATIDILCOLINA (LYSOPC PALMITIC) LISOFOSFATIDILCOLINA (LYSOPC STEARIC) Esfingomielina de leche MPPC MSPC PMPC POPC POPE POPG PSPC SMPC SOPC SPPC

(continuación)

1.2- Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1.2- DNauroil-sn-GNcero-3-Fosfato

1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

1.2- DNauroN-sn-GNcero-3[FosfatidN-rac-(1-gliceroL.)

1.2- Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

1.2- Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfato

1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

1.2- Miristoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-( 1-glicerol...)

1.2- Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato

1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

1.2- Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

1.2- DipalmitoN-sn-Glicero-3-Fosfato

1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

1.2- Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina

1.2- difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina

1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfato

1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1.2- Diostearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

1.2- Distearoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)

1.2- Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina fosfatidil colina de huevo (Egg-PC)

Egg PC hidrogenada

Fosfatidil colina de soja (Soy PC) hidrogenada de alta pureza Soy PC hidrogenada

MIRÍSTICA 1 -Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

PALMÍTICA 1-Palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

ESTEÁRICA 1-Estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Miristoil,2-palmitoil-sn-Glicero 3-fosfatidilcolina

1-Miristoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Palmitoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Palmitoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina

1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol)...]

1-Palmitoil,2-estearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Estearoil,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Estearoil,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

1-Estearoil,2-palmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina

EJEMPLIFICARON

1. Estructura de postfusión y modelo de prefusión Estructura de F de prefusión del VRS

5 Se preparó un antígeno de subunidad de la F del VRS estable, no agregante, soluble, mediante la deleción del péptido de fusión, la región de transmembrana y el dominio citoplasmático (FIG. 1). Esta F diseñado genéticamente se expresó de mana eficaz y se purificó fácilmente. La microscopía electrónica de las muestras teñidas negativamente demostró que se forman moléculas no agregadas, homogéneas, con forma de muleta, consistentes con los trímeros F de postfusión (FIG. 2A). Este trímero de F diseñado genéticamente fue estable, y la 10 espectroscopía de dicroísmo circular no reveló una fusión significativa a temperaturas de hasta 95 °C (FIGS. 2b y 2C).

Esta proteína F del VRS se cristalizó y se determinó su estructura mediante sustitución molecular y el promedio de tres veces de simetría no cristalográfica (NCS) (Tabla 3 y FIG. 3). La estructura no incluye el fragmento de p27 (el péptido entre los dos sitios de furina que se pierde tras la escisión), el péptido de fusión, la región de transmembrana

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o el dominio citoplasmático (FIG. 4).

Tabla 3. Datos cristalográficos

Estadísticas de la colección de datos

Grupo espacial: P 21 21 21

Dimensiones de la célula (A): a = 87,930

: b = 113,160

: c = 311,370

: a= p= y= 90,00°

Límite de resolución (A): 50-3,2

Reflexiones únicas: 51,911

Reflexiones únicas1': 40.398

Redundancia: 3,9 (3,7)¥

Totalidad general (%): 99,4 (99,4)

Totalidad general (%) 1: 77,0 (26,7)

<I/a >: 12,2 (2,2)

Rsim(%): 7,7(71,0)

Estadísticas de refinamiento11

Cadenas de polipéptidos: 3

Átomos de proteína: 10.398

Restos en las regiones permitidas del gráfico de Ramachandran (%): 98,5

Restos en las regiones más favorables del gráfico de Ramachandran: (%)83,5

Desviación cuadrática media de las longitudes de enlace (A): 0,021

Estadísticas de refinamiento11 Desviación cuadrática media de los ángulos de enlace (grados) Valores B medios (A2) Intervalo de resolución (A) Rtrabajo (%) Rlibre (%): 2,053 15,71 30-3,2 23,1 (34,9) 26,6 (40,2)

¥ Los valores entre paréntesis se refieren a los datos en la estructura de mayor resolución 1 Estadísticas para los datos tras la corrección anisótropa.

1 Valores de refinamiento para los datos tras la corrección anisótropa.________________

La estructura general de la F de postfusión del VRS se comparte con otras proteínas de fusión de postfusión de parainfluenza. La proteína está compuesta por tres subunidades estrechamente entrelazadas, que forman una cabeza globular y un pedúnculo alargado. Cada subunidad contiene tres dominios, denominados I, II y III (FIGS. 4A- C). Los dominios I y II están en la parte superior de la cabeza trimérica y forman una corona triangular. El dominio III forma la base de la cabeza. Una larga hélice, HRA, se extiende desde el dominio III y forma la superhélice en el centro del pedúnculo. La hélice HRB se conecta con el dominio II y alcanza el extremo distal de la parte superior del pedúnculo, donde forma las hélices externas de un paquete de seis hélices con la superhélice interior HRA. En la F de longitud completa, el péptido de fusión hidrofóbica (N-terminal a HRA) y la región transmembrana (C-terminal a HRB), podrían estar yuxtapuestos en la parte inferior del pedúnculo e insertados n la membrana de la célula diana.

Los dominios I y II de las proteínas F del VRS, del virus parainfluenza 3 (VPI3) y del virus parainfluenza 5 (VPI5) se conservan de manera estructural (FIGs. 5A y 5B). La única diferencia significativa está en la orientación de la única hélice del dominio I (r|3 de la F del VRS y a6 de las F del VPI3 y VPI5) en relación con sus láminas p comunes. Por el contrario, el dominio III de la F del VRS tiene características que no se predijeron a partir del modelo basado en parainfluenza (FIG. 6). Cuando las láminas p de cuatro bandas del dominio III de la F del VRS y del dominio III de la F del VPI3 se superponen, las diferencias clave en las regiones helicoidales de los dominios son evidentes. La hélice HRA se enrolla en una posición más en N-terminal en la F del VRS que en la F del VPI3, provocando una diferencia de aproximadamente 60° en la rotación de las cabezas en relación con los pedúnculos (FIGS. 6A, 6B, 6D). Las hemaglutininas de la gripe también varían en las orientaciones de sus cabezas en relación con sus pedúnculos, con diferencias de 30°-50° en la rotación entre los subtipos. (Ha, Y. y col., Embo Journal 21, 865-875 (2002)).

La región del paquete helicoidal del dominio III de la F del VRS contiene una hélice adicional (a6) que cambia la orientación de las hélices empaquetadas en relación con las de las F de parainfluenza (FIGS. 6A-C y FIG. 1). Las hélices a5 y a6 de la F del VRS son casi paralelas y se exponen en la superficie del trímero; el equivalente a la hélice a6 de la F del VRS en el paquete helicoidal del VPI3 (a5, FIG. 6C) está inmerso en la interfase interior- subunidad del trímero. Las hélices a5 y a6 de la F del VRS forman la unión del epítopo mediante los anticuerpos neutralizantes relacionados Palivizumab y Motavizumab. La estructura de un complejo entre la Fab de Motavizumab y un péptido de 24 restos de la F del VRS que incluye a5 y a6 se ha documentado (McLellan, J. S. y col. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010)). La comparación entre esta estructura y la estructura de la F de postfusión del VRS reveló una estrecha coincidencia entre las hélices a5-a6 (desviación cuadrática media = 0.52 A; FIG. 7A). La superposición de las dos estructuras basadas en estas hélices modela un complejo entre Motavizumab y la F de postfusión del VRS (FIG 7B). Este modelo no revela impedimento estérico que pudiera evitar la unión de

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Motavizumab (o, presumiblemente, Palivizumab) a la F de postfusión del VRS. Se confirmó la unión de Palivizumab al ectodominio de F de postfusión en solución usando la resonancia de plasmón superficial (Kd de 4,2 x 10'10M).

Las estructuras de F de prefusión y postfusión de parainfluencia revelan en conjunto cambios de dominios y grandes reordenamientos de HRA y HRB. En el dominio III de la estructura de F de prefusión del VPI5 (la única estructura de F de prefusión de parainfluenza documentada), HRA se pliega en tres a-hélices y dos cadenas p en vez de la larga hélice de HRA de postfusión (Yin, H. S., y col. Nature 439, 38-44 (2006)). Sin embargo, cuando se comparan las conformaciones de prefusión y postfusión de los dominios de la proteína F de parainfluenza, las partes no reordenadas se superponen bien. La superposición de los dominios de F de postfusión del VRS sobre sus homólogos de F de prefusión del VPI5 no dio como resultado importantes discordancias y posicionó todos los pares de cisteínas que forman los puentes disulfuro de interdominio en proximidad (FIG. 8B).

El modelo de F de prefusión del VRS revela una característica no evidente a partir de la modelización de los dominios de F de prefusión del VRS basada en las estructuras de los dominios de prefusión del VPI5 (McLellan, J. S. y col. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010)). Las hélices del epítopo de Motavizumab se exponen en la superficie del trímero de F de prefusión del VRS, tal como están en el trímero de F de postfusión del VRS (FIG. 9). En el modelo actual de F de prefusión del VRS, el bucle que conecta p4 y HRC (parte del dominio III) dificultaría el acceso de palivizumab o motavizumab al epítopo. Sin embargo, el bucle puede tener la suficiente flexibilidad como para adoptar una conformación alternativa que permita la unión de anticuerpos (FIG. 9B).

La estructura antigénica de la F del VRS se ha cartografiado mediante una variedad de técnicas (FIG. 1). Los grupos de epítopos mejor documentados se denominan A y C (Beeler, J. A. y van Wyke Coelingh, K. J Virol 63, 2941-2950 (1989)), y otros se han propuesto. La estructura de Motavizumab-péptido corroboró la localización del sitio A, aunque puso en duda la exposición del sitio sobre la superficie del trímero F del VRS (McLellan, J. S. y col. Structural basis of respiratory syncytial virus neutralization by motavizumab. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010)); una estructura cristalina de un péptido F del VRS (restos 422-436) unido al anticuerpo neutralizante 101F corroboró la localización del sitio C (McLellan, J. S. y col. J Virol 84, 12236-12244 (2010)). El modelo de la estructura de postfusión de la F del VRS y de la F de prefusión del VRS indica que los sitios A y C permanecen expuestos y son estructuralmente similares en ambas conformaciones (FIGS. 8A y 8B). La superposición del complejo 101F-péptido sobre el modelo de prefusión de la F del VRS y la estructura de postfusión confirmó que 101F no chocaría con F en ninguna conformación (FIG. 10).

En el Apéndice se proporciona el archivo PDB del modelo de prefusión de la F del VRS basado en la estructura de postfusión de la F del VRS y los alineamientos secuencia/dominio con la estructura de prefusión del VPI5. El archivo PDB contiene las coordenadas atómicas para el modelo de prefusión, y se pueden usar con el programa informático adecuado para la visualización molecular y el análisis (por ejemplo, Roger Sayle y E. James Milner-White. "RasMol: Biomolecular graphics for all", Trends in Biochemical Sciences (TIBS), Septiembre de 1995, vol. 20, N.° 9, p. 374.) para mostrar el modelo. En el modelo se incluyen tres cadenas de subunidades con el péptido de fusión y la región de HRA plegada como en el VPI5, creando contactos significativos con el DIII. Las regiones de HRB de las tres subunidades trimerizan en el pedúnculo de prefusión y se asocian con D1 y DII.

2. Desestabilización del paquete de 6 hélices de postfusión mediante la deleción de la hélice HRB

Se diseñó una construcción de la deleción de HRB para evitar la formación de la conformación de postfusión. Se han diseñado dos construcciones para dirigir esta estrategia. La primera es un ectodominio de tipo silvestre que carece de la región HRB (restos 1-483 de la F del VRS) denominado Del HRB:

La secuencia presentada a continuación contiene un péptido señal y un marcador HIS (GGSAGSGHHHHHH; SEQ ID NO:3). La proteína F de prefusión del VRS de la invención puede contener las secuencias de aminoácidos presentadas a continuación, con o sin el péptido señal y/o el marcador HIS.

>F del VRS delHRB HIS (SEQ ID NO: 28)

MELLILKANAITTILTA VTFC ’F A S (1Q NITEEF Y QS T (1SAVSKC IYLS ALRTGW YTS VITIE ESNIKGNKCNGTDAKVK1JKQGEDKYKNAVTGEQEEMQSTPATNNRARRFEPR] MN YTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLIILEGEVNKIKSALLS TNKAVVSESNGVSVETSKVEDEKNYIDKQEEPIVNKQSCSISNIHTVIE1 QQKNNREEH ITRE1 SVNAGV r l'PVS I YMT TNS1 ■> .1 .SI 1NDMPI l'NDQKKT MSNNVQIVRQQSYS1MS1 IK1 :i :V1 ,AYVVQ] ,PI YGVIDTPCWKI HISPI .CITNTKl XiSNlCI TRTDRGWYCDNAGS VS1 1 PQA1 ■ rCKVQSNRVI CDTMNSI I I ,PSI • VNI ,CNVOII NPKYDCKIMTSKTDVSSSV ITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKf .VDTVSVC .NTLYYVNKOE GKSFYVKGHPIINI YDPFVITSGGSAGSGHHHHHH

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La secuencia anterior tiene ambos sitios de escisión de furina sin alterar, y se esperaba que fuese procesada por la célula. Además, la secuencia anterior tiene la secuencia de péptido de fusión de tipo silvestre. En experimentos anteriores, cuando las proteínas basadas en el ectodominio F del VRS se escindieron por la célula y contuvieron péptidos de fusión, formaron agregados solubles con restos celulares en la forma de rosetas de la F del VRS. Si esta construcción permaneció en la conformación de prefusión (debido a la ausencia de la hélice HRB que se cree que es necesaria para la conformación de postfusión) entonces el péptido de fusión debería estar incluido en el dominio de la cabeza de la F del VRS y no debería formar agregados de rosetas. Esta construcción se expresó, se purificó mediante purificación por afinidad y se evaluó mediante análisis de ME (FIG. 12).

Está claro tanto mediante su migración en una columna de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) en el volumen vacío, así como a partir de la micrografía de ME que la construcción formó rosetas similares a las rosetas formadas mediante las proteínas F de postfusión del VRS. Este resultado fue una sorpresa ya que se hipotetizó que se necesitaba HRB para estabilizar la HRA en su formación de hélice alargada (tal como se observa que los péptidos de HRA no forman trímeros). Por lo tanto, los inventores han hipotetizado que los péptidos de fusión, la unión entre si o con restos celulares, está estabilizando las hélices HRA en su formación de postfusión alargada.

Los inventores han hipotetizado que el fenotipo de tipo postfusión de la construcción DeIHRB se debió a la estabilización de HRA en hélices alargadas mediante la unión de los péptidos de fusión entre sí o a restos celulares. Para probar esta hipótesis, los inventores generaron la siguiente construcción (DeIHRB deleción de péptido de fusión:abajo) que es similar a la DeIHRB pero tiene la deleción del péptido de fusión consistente con el trímero de postfusión de los inventores. Los inventores probarán mediante microscopía ME el fenotipo de la construcción para ver si forma estructuras de tipo muleta similares a las del fenotipo de tipo postfusión observado en las rosetas de DeIHRB de si la construcción forma formas de cabeza en prefusión, que son similares a la forma esférica del fenotipo de piruleta publicado en las referencias.

>péptido de fusión de F del VRS delHRB HIS (SEQ ID NO: 10)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYT

SVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRA

RRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIK

SALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEF

QQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSN

NVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGS

NICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLC

NVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFS

NGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSGGS

AGSGHHHHHH

3. Estabilización de prefusión con la formación de puentes disulfuro intracatenarios

El modelo de F del VRS, basado en la estructura de postfusión de la F del VRS y en la estructura de prefusión del VPI5, se usó para diseñar genéticamente mutaciones en cisteína que pretendían formar puentes disulfuro que estabilizasen la F del VRS en la conformación de prefusión (Figura 11). Las construcciones de puentes disulfuro intracatenarios se expresaron y se secretaron a partir de la célula al medio y después se escindieron desde F0 hasta F1/F2 a diversos grados (Figura 14). Se descubrió que T58C/V164C de la F del VRS (expresado en células de mamífero) se expresó como una especie escindida que se secreta en el medio. El material se purificó mediante purificación por quelación y se evaluó mediante el ensayo HPLC-SEC de roseta/trímero usando la columna de SEC Bio-Sil 250 con PBS 2x como fase móvil (Figura 15). Como esto es una F escindida que contiene un péptido de fusión, se esperaba que estuviese en la forma de postfusión y formase rosetas y migrase al volumen vacío, de manera similar a las rosetas de la F de postfusión del VRS (Figura 15A). Si la proteína F escindida que presenta un péptido de fusión se plegó en la forma de prefusión, se podría esperar que el péptido de fusión estuviese incluido en la región de la cabeza de prefusión evitando la formación de roseta. Los trímeros de prefusión migrarían en el volumen incluido con un tiempo de retención similar al trímero de postfusión de F del VRS que carece del péptido de fusión (Figura 15B). El puente disulfuro T58C V164C de la HRA de la F del VRS se dejó correr en HPLC-SEC y la mayoría del material migró al volumen vacío de la columna, indicando que el material se estaba agregando o

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formando rosetas de F de postfusión. Una porción más pequeña de la proteína migró en el volumen incluido con un tiempo de retención consistente con un trímero de F, sugiriendo que algún material formó la F de prefusión estabilizada deseada.

Las construcciones de puentes disulfuro se clonaron posteriormente en vectores de expresión en baculovirus y se expresaron tres construcciones (puentes disulfuro de HRA N165C/V296C y K168C/V296C, y el M396C/F483C de HRB). K168C/V296C y M396C/F483C, que se escindieron cuando se expresaron en células de mamífero, se secretaron por células de insecto predominantemente como una especie sin escindir (tal como se muestra mediante el análisis por transferencia de western de anti-HIS). Ambas construcciones migraron a la porción de vacío, lo que fue inconsistente con las observaciones previas de que las especies no escindidas corren como monómeros. Las proteínas pueden haberse agregado en virtud de una formación incorrecta de puente disulfuro. El análisis de desplazamiento en gel usando anti-HIS en análisis por transferencia de western (Figura 16) sugirió que los puentes disulfuro intracatenarios no se habían formado. El material puro tomado de la fracción de vacío de la SEC se analizó con SDS-PAGE y tinción de coomassie, y se descubrió que cada proteína estaba escindida al 50 % (Figura 16). Se expresó una tercera construcción de puente disulfuro y N165C/V296C se secretó de manera predominante como el producto escindido deseado a juzgar por el análisis por transferencia de western (Figura 16A).

4. Estructura de prefusión de la F del NDV para desarrollo adicional de la subunidad quimérica VRS-NDV

Se desarrolló una estrategia para recuperar los epítopos de prefusión de HRA del VRS para generar una construcción de F de prefusión del NDV y mutar restos seleccionados de la HRA a los de la F del VRS. Los intentos iniciales por sustituir la HRA del NDV con la HRA del VRS generaron una construcción que no se expresaba/secretaba a partir de la célula. Esto indicó que la proteína mal plegada. Se requirió el refinamiento adicional de los restos de la F del NDV disponible para la mutagénesis (es decir, aquellos localizados en la superficie de la proteína). Una nueva construcción, F del NDV estabilizada con un dominio de trimerización de gCn (no escindido) migró como un trímero mediante análisis por SEC. Esto fue lo esperado ya que esta construcción demostró ser un trímero de prefusión mediante microscopía electrónica (Swason y col, 2010).

5. Análisis en ME de la F del VRS con HRB y deleción del péptido de fusión en relación con la construcción de prefusión del NDV

Se generó la F del VRS con HRB delecionada que lleva el péptido de fusión, y se purificó la proteína. La construcción migró en el volumen vacío de la columna de SEC consistente con las rosetas de F del VRS. La construcción se evaluó mediante ME y demostró que forma rosetas similares a las de F de postfusión del VRS (Figura 18A). Una proteína F del VRS con la HRB y el péptido de fusión delecionados ((Del-HRB Del-PF) se generó, se expresó y se purificó. La F del VRS con la HRB y el péptido de fusión delecionado corrió de manera parcial como un trímero en la SEC (Figura 18B). El análisis en gel demostró que la F del RSV con del-HRB y Del-PF migraron tanto en el pico de agregación/roseta como en el pico del trímero (Figura 18C). Para la comparación, la construcción de prefusión del NDV no escindida tuvo muy poco material en la fracción de vacío (Figura 18C). La F del VRS con Del-RB Del-PF se recuperó del volumen del trímero y se evaluó mediante ME.

Las micrografías electrónicas de la construcción de prefusión del NDV demostraron de manera predominante la s cabezas esféricas esperadas para la F de prefusión (Figura 18D). Una porción del material pareció estar asociada con los agregados de tipo roseta, que no debería permitirse dado que la construcción está sin escindir y es de prefusión. Esta cantidad de asociación podría deberse a la agregación mediante el marcador HIS y podría explicar por qué la Del-HRB Del-PF del VRS contenía algunos agregados/rosetas incluso cuando el péptido de fusión no estuvo presente. El análisis de ME de la F del VRS con Del-HRV Del-PF demostró que el material era heterogéneo (Figura 18E). La F del VRS con Del-HRB Del-PF formó estructuras de tipo roseta similares a las de F del NDV, así como "muletas" de tipo postfusión y "esferas" de tipo prefusión.

R057 delHRB delFP trunc 6H (péptido de fusión delecionado)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRT

GWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQ

STPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRSAIASGVAV

SKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ

LLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLErrREFSVNAGVTTPVSTYML

TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVV

QLPLY G VIDTPC WKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGW Y CDNAGS V

SFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMT SKTDVSSSVrrSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKG VDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSGGSAGSGHH HHHH** (SEQ ID NO: 10)

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R105 delHRB delFP+enlazador trunk 6H (péptido de fusión y enlazador delecionados)

MELLILKANArrriLTAVTFCIASCiQNITEEFYQSTCSAVSKGYI.SAI.RT GWYTSVITIELSNIKENKCNCiI DAKVKI.IKQEI DKYKNAVTELQLI.MQ STPATNNRARREIPRFMNYTI NNAKKTNV TI SKKRKRRS AI ASGVAV S K V] .HLEGEVNKIKSAIA ÜTNKAWSI ,S NGVSVI T3 KVLDLKN YIDKQ LLFIVNKQSCSISNIET VIEFQQKNNRLLEITREFS VN AG VTTP VSTYML TNSELI ÜLINDMPITNDQ KKLM SNN V QIVRQQS Y SIMSIIKEEVLA YV V QLP1 ,Y( i VI DTK: WKLI1TSP1X ’TTNTKJ:(iSN IC1 TRTDRC i W YCDN A( iS V SFFPQ AFTCKVQSNR VFC ’DTMNSI TI .PSFVNI.('NVDIFNPKYDC ’KIMT S KTD VS SSVITSLG AI VSC YG KTKCT AS N KNRGIIKTFSNGCD YVSN KG VDTVSVGNTL,YYVNKQEGGGSAGSGHHHHHH** (SEQ ID NO:38)

6. Diseño de construcciones no naturales de HRB de la F del VRS

Se generó una F de prefusión estable del VRS mediante sustitución de la región HRB bien por la región HRB del NDV (con o sin un enlazador de glicina adicional: HRB2) o VPI5. La expresión en mamíferos de las construcciones no naturales de HRB demostró que cada una de las construcciones se expresó y secretó bien (Figura 19). Adicionalmente, la banda observada migró de manera consistente con las especies F1 escindidas, lo que sugiere que las proteínas se procesaron adecuadamente. Las construcciones existieron con o sin péptido de fusión (tal como se indica en la Figura 19).

REFERENCIAS ADICIONALES

Las siguientes referencias se incorporan en el presente documento como referencia por todo lo que enseñan.

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5

10

15

20

25

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35

6677349, 6683088, 6703402, 6743920, 6800624, 6809203, 6888000, and 6924293.

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5

10

15

20

25

30

35

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efficient adjuvants for CD4+ T cells'.

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APÉNDICE

5 (El APÉNDICE desvela las SEQ ID NOS 29-32, 29-32 y 29-32, respectivamente, en orden de aparición)

HEADER: — XX-XXX-9- xxxx

COMPND: ___

SSBOND: 1 CYS G 69 CYS G 212

SSBOND: 2CYSG313 CYS G 343

SSBOND: 3 CYS G 322 CYS G 333

SSBOND: 4 CYS G 358 CYS G 367

SSBOND: 5 CYS G 382 CYS G 393

SSBOND: 6 CYS G 416 CYS G 422

LINKR: C.l NAGJ1535 ND2ASNG 70 NAG-ASN

LINKR: C.l NAGJ1545 ND2 ASN G 500 NAG-ASN

LINKR: C1 NAG .11525 ND2ASNG 27 NAG-ASN

SSBOND: 7 CYS H 69 CYS H 212

SSBOND: 8 CYS H 313 CYS H 343

SSBOND: 9 CYS H 322 CYS H 333

SSBOND: 10 CYS H 358 CYS H 367

SSBOND: 11 CYS H 382 CYS H 393

SSBOND: 12 CYS H 416 CYS H 422

LINKR: C.l NAGK1535 ND2 ASN H 70 NAG-ASN

LINKR: OD1 ASNH500 C.7 NAG K1545 ASN-NAG

LINKR: C.l NAG K1545 ND2 ASN H 500 NAG-ASN

LINKR: OD1 ASNH 27 07 NAGK1525 ASN-NAG 1

LINKR: C.l NAG K1525 ND2 ASN H 27 NAG-ASN

SSBOND: 13 CYS I 69 C.YS 1212

SSBOND: 14 CYS 1313 CYS I 343

SSBOND: 15 CYS I 322 CYS I 333

SSBOND: 16 CYS I 358 CYS I 367

SSBOND: 17 CYS I 382 CYS I 393

SSBOND: 18 CYS 1416 CYS 1422

LINKR: C.l NAGL1535 ND2ASNI 70 NAG-ASN

LINKR: C.l NAG L1545 ND2 ASN I 500 NAG-ASN

LINKR: C.l NAGL1525 ND2ASNI 27 NAG-ASN

LINKR: GLNG 98 PHE G 137 gap

LINKR: ASN G 325 SER G 330 gap

LINKR: LYS G 465 GLUG472 gap

LINKR: NAG J1535 NAG J1536 BETA 1-4

LINKR: NAG J1545 NAG J1546 BETA 1-4

LINKR: NAGJ1525 NAG J1526 BETA 1-4

LINKR: PRO G 304 TYR G 306 gap

LINKR: THRG 50 ILEG309 gap

LINKR: GLNH 98 PHE H 137 gap

LINKR: ASN H 325 SER H 330 gap

LINKR: LYS H 465 GLUH472 gap

LINKR: PRO H 304 TYR H 306 gap

LINKR: THRH 50 TI L H 309 gap

LINKR: GLN I 98 PHE I 137 gap

LINKR: ASN I 325 SER I 330 gap

LINKR: LYS 1465 GLU 1472 gap

LINKR: PRO I 304 TYR I 306 gap

LINKR: THR I 50 IIP, I 309 gap

LINKR: NAG K1535 NAGK1536 BETA 1-4

LINKR: NAG L1535 NAG L1536 BETA 1-4

LINKR: NAG K1545 NAG K1546 BETA 1-4

LINKR: NAG L1545 NAG L1546 BETA1-4

Claims

5

10

15

20

25

1. Un polipéptido F de prefusión del virus respiratorio sincitial (VRS), en el que la región HRA, restos 137-239 de la SEQ ID NO:1 de la proteína F del VRS de referencia, contiene un resto de cisteína introducido y la región DIII, restos 51-98 y 206-308 de la SEQ ID NO:1 de la proteína F del VRS de referencia, contiene un resto de cisteína introducido, y se forma un puente disulfuro entre el resto de cisteína introducido en le región HRA y el resto de cisteína introducido en la región DIII que estabiliza el polipéptido F de prefusión del VRS.
2. El polipéptido F de prefusión del VRS de la reivindicación 1, en el que dichas mutaciones de cisteína no están a más de aproximadamente 10 A de distancia entre sí.
3. El polipéptido F de prefusión del VRS de una cualquiera de la reivindicación 1 o 2, en el que el polipéptido F de prefusión del VRS es un ectodominio soluble de F del VRS.
4. El polipéptido F de prefusión del VRS de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente un dominio heterólogo de oligomerización, un epítopo, o un péptido señal.
5. El polipéptido F de prefusión del VRS de la reivindicación 4, en el que dicho dominio heterólogo de oligomerización es un dominio de trimerización.
6. El polipéptido F de prefusión del VRS de la reivindicación 5, en el que el dominio de trimerización es de hemaglutinina del virus de la gripe, proteína espicular del SARS, gp41 del VIH, NadA, GCN4 modificada, GCN4 o ATCasa.
7. Una composición inmunogénica que comprende el polipéptido F de prefusión del VRS de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y opcionalmente, un adyuvante.
8. La composición inmunogénica de la reivindicación 7, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: una sal de aluminio, una emulsión de escualeno en agua, un compuesto de benzonaftiridina, un compuesto de fosfolípido, un inmunopotenciador de molécula pequeña y combinaciones de cualquiera de los anteriores.
9. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido F de prefusión del VRS de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 9, que es una molécula de ARN autorreplicante.
11. Una composición inmunogénica que comprende la molécula de ARN autorreplicante de la reivindicación 10 y, opcionalmente, un sistema de administración de ARN.
12. La composición inmunogénica de la reivindicación 7, 8 u 11 para su uso como un medicamento.

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FIG. 2

imagen2

imagen3

FIG. 3

297

imagen4

26 50 109 136 155 309 400 460 524

----- F2-----a a--------------------------------F1----------------------------------------

Sitios de escisión de furina

imagen5

FIG.4

imagen6

'¡r Pedúnculo

298

imagen7

Dominio I de la F del VRS Dominio I de la F del VPI3

FIG.

imagen8

Dominio II de la F del VRS Dominio II de la F del VPI3

5

299

imagen9

imagen10

FIG.6

300

De la estructura de postfusión

imagen11

Del complejo péptido-Motavizumab

FIG. 7

301

Estructura de postfusión de la F del VRS

imagen12

imagen13

Sitio antigénico C

I C

Sitio

antigénico A

imagen14

n

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Diluciones de suero

0,1

Suero tras la inmunización Suero de origen

Modelo de prefusión de la F del VRS

FIG.8

A

Estructura de postfusión

B

Modelo de prefusión

imagen15

Figura 9

303

imagen16

FIG. 10

imagen17

DIN sin cambios

165-296 y 56-164 propuestos para dar cuenta del posible sesgo del modelo

FIG. 11

imagen18

imagen19

R049 F de fus del VRS R429S I432T K433T S436F trunc

R050 puente disulfura 2 de FIRA de F del VRS I57C S190C trunc

R051 puente disulfuro 3 de FIRA de F del VRS T58C V164C trunc

R052 puente disulfuro 5 de HRA de F del VRS K168C V296C trunc

R053 F de fus del VRS del N262Y N268I K272M R429S I432T K433T S436F trunc

R054 puente disulfuro 1 de HRA de F del VRS V56C V164C trunc

R055 puente disulfuro 4 de HRA de F del VRS N165C V296C trunc

R056 puente disulfura de HRB de F del VRS M396C F483C trunc

CO

o

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imagen20

+reducción

+ebullición

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O T— CM cO O" LO CO

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191

97

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F0-

51

F1-

39

28

19

imagen21

Usado celular (expresión total)

Medios (proteína secretada)

FIG. 14

R056

308

imagen22

^ Análisis SEC-HPLC del puente disulfuro de HRA T85CV164C de intento de prefusión

Tiempo de retención del puente disulfuro de la F del VRS ~5 min (roseta) y 6,3 (trímero)

imagen23

FIG. 15

309

imagen24

FIG. 16

310

B

A

imagen25

Barras de la F del NDV 10%PEG 3350.2% Tascimato, Tris a pH 7,5

m

imagen26

ME: NDV F Prefusión

c

Barras de la F del NDV

15% PEG 1000.6% Tascimato, Tris a pH 8,5

imagen27

FIG. 17

311

imagen28

B

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$EC: FdeVRS Del-PF Del-HRB

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F de NDV Prefusión

F de VRS

Del-PF Del-HRB

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ME: F de NDV Prefusión

ME: F de VRS Del-PF Del-HRB

FIG. 18

312

imagen30

FIG. 19