ES2654589T3 - Un microorganismo para la producción de metionina con importación de glucosa mejorada - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo recombinante para la producción de metionina mejorada que comprende: a) modificaciones para producir metionina a partir de glucosa como fuente principal de carbono por fermentación, b) modificaciones para mejorar la importación de glucosa por sobreexpresión del gen ptsG que codifica la enzima del PTS IICBGlc y eliminación del gen dgsA, y c) en donde se atenúa la expresión de al menos uno de los siguientes genes: metJ, pykA, pykF, purU, yncA o udhA.
Description
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DESCRIPCIÓN
Un microorganismo para la producción de metionina con importación de glucosa mejorada.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un microorganismo mejorado para la producción de metionina y al procedimiento para la preparación de metionina. En particular, la presente invención se refiere a un microorganismo para la producción de metionina con importación de glucosa mejorada que comprende la sobreexpresión del gen ptsG y eliminación del gen dgsA, en donde la expresión de al menos uno de los siguientes genes está atenuada: metJ, pykA, pykF, purU, yncA o udhA.
Técnica anterior
Los compuestos que contienen azufre tales como la cisteína, homocisteína, metionina o S-adenosilmetionina son críticos para el metabolismo celular y se pueden producir industrialmente para usar como aditivos de alimentos o piensos y productos farmacéuticos. En particular la metionina, un aminoácido esencial, que no puede ser sintetizado por animales, tiene una función importante en muchas funciones del cuerpo. Además de su función en la biosíntesis de proteínas, la metionina está implicada en la transmetilación y en la biodisponibilidad del selenio y el cinc. La metionina también se usa directamente como tratamiento para trastornos tales como alergia y fiebre reumática. No obstante, la mayoría de la metionina que se produce se añade al pienso.
Con el menor uso de proteínas derivadas de animales como resultado de la BSE y la gripe aviar, ha aumentado la demanda de metionina pura. Normalmente, la D,L-metionina se produce químicamente a partir de acroleína, metilmercaptano y cianuro de hidrógeno. Sin embargo, las mezclas racémicas no funcionan tan bien como la L-metionina pura (Saunderson, C.L., 1985). Además, aunque la L-metionina pura se puede producir a partir de metionina racémica, por ejemplo, por el tratamiento con acilasa de la N-acetil-D,L-metionina, esto aumenta notablemente los costes de producción. Por consiguiente, la demanda creciente de L-metionina pura junto con la preocupación ambiental hacen de la producción microbiana de la metionina una posibilidad atractiva.
La optimización de la producción de un producto químico a partir de un microorganismo típicamente implica la sobreexpresión de proteínas implicadas en la ruta de biosíntesis, atenuación de proteínas implicadas en la represión de la ruta de biosíntesis o atenuación de proteínas implicadas en la producción de subproductos no deseados. Todos estos procedimientos para la optimización de la producción de L-metionina en microorganismos se han descrito previamente (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 7.790.424, patente de Estados Unidos nº 7.611.873, solicitudes de patente WO 2002/10209, WO 2006/008097 y WO 2005/059093); sin embargo, la producción industrial de L-metionina a partir de microorganismos requiere mejoras adicionales.
Típicamente, la L-metionina se ha producido mediante microorganismos desarrollados en glucosa como fuente principal de carbono en un procedimiento fermentativo. En bacterias, la glucosa externa es transportada a la célula y fosforilada por el sistema fosfotransferasa de azúcar del fosfoenolpiruvato (PTS) (Meadow et al. 1990; Rohwer et al. 1996; Tchieu et al. 2001). El PTS consiste en dos proteínas citoplasmáticas comunes, la enzima I y HPr, y una serie de complejos de enzima II específicos de azúcar (EIIs). El PTS enzima IICBGlc, codificado por ptsG en E.coli transporta y simultáneamente fosforila glucosa a glucosa-6-fosfato (G6P). Aunque la G6P es un producto intermedio esencial en el metabolismo de la glucosa, su acumulación intracelular produce el fenómeno de la toxicidad de azúcar-fosfato, llamada también “estrés por fosfoazúcares”. De hecho, se ha descrito que la acumulación de glucosa es muy tóxica para las bacterias, dando lugar a la glicación, mutagénesis de ADN e inhibición del crecimiento (Lee y Cerami, 1987; Kadner et al. 1992).
Estudios recientes han demostrado que en E. coli el gen ptsG que codifica IICBGlc es altamente regulado de forma bastante intrigante tanto a nivel transcripcional como postranscripcional, dependiendo de las condiciones fisiológicas (Plumbridge, 1998; Kimata et al. 1998; Plumbridge et al. 2002; Morita y Aïba, 2007; Görke y Vogel, 2008). Específicamente, se han identificado varios niveles de regulación:
-regulación de la expresión del gen ptsG por muchos reguladores diferentes (ArcA, Fis, Crp) y en particular la represión por DgsA, un regulador transcripcional llamado primer Mlc (Making larger colonies);
-desestabilización del ARNm de ptsG por el ARN pequeño sgrS (Sugar transport-related sRNA) por un mecanismo antisentido;
-control de la actividad de PtsG por el polipéptido pequeño SgrT por un mecanismo todavía desconocido; y
-regulación de la expresión de sgrS/sgrT por el regulador transcripcional SgrR.
Debido a la toxicidad de G6P y la naturaleza altamente regulada y compleja del sistema, la manipulación de sistema de transporte de glucosa en microorganismos es muy difícil. Hasta la fecha ha habido varios intentos de mejorar la producción de aminoácidos y en particular la producción de treonina aumentando la importación de glucosa manipulando los genes ptsG o dgsA (documentos WO0300475 y WO03004670 de Degussa; US2004229320 de
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usar un promotor más fuerte, eliminar elementos reguladores o usar un alelo con mayor actividad, o posiblemente combinar estas medidas. Además, la expresión de un gen se puede aumentar por medios cromosómicos o extracromosómicos. Por ejemplo, se pueden introducir varias copias del gen en el genoma del microorganismo por métodos de recombinación. Alternativamente, los genes los pueden llevar diferentes tipos de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación y por lo tanto su número de copias en la célula. Los genes pueden estar presentes en 1-5 copias, aproximadamente 20 o hasta 500 copias, que corresponde a plásmidos con número de copias bajo con replicación ajustada (pSC101, RK2), plásmidos de bajo número de copias (pACYC, pRSF1010) o plásmidos de alto número de copias (pSK bluescript II). Los elementos reguladores son importantes para controlar la expresión de genes. Por ejemplo, los genes se pueden expresar usando promotores de diferentes resistencias, que además pueden ser inducibles. Estos promotores pueden ser homólogos o heterólogos. Depende de la capacidad del experto en la técnica el seleccionar promotores adecuados; sin embargo, por ejemplo, los promotores Ptrc, Ptac, Plac o el promotor lambda cI se usan ampliamente. En una realización, se potencia la expresión del gen ptsG poniendo el gen bajo el control de un promotor inducible o constitutivo.
En otra realización la expresión del gen ptsG se potencia eliminando la secuencia que codifica el sitio de unión del ARN pequeño sgrS.
La expresión "eliminación de la secuencia que codifica el sitio de unión del ARN pequeño sgrS" significa que el sitio de unión del ARN pequeño sgrS (SEQ ID NO: 19) se elimina total o parcialmente para así prevenir la unión del ARN pequeño sgrS en el gen ptsG.
La importación de glucosa también mejora de acuerdo con la invención por la eliminación del gen dgsA.
En una realización, se atenúa la expresión del gen sgrS y/o el gen sgrT en el microorganismo recombinante de la invención. El gen sgrS codifica el ARN pequeño ARNp relacionado con el transporte de azúcar en E.coli. La secuencia de nucleótidos del gen sgrS se muestra en la SEQ ID NO: 20. El gen sgrT codifica el polipéptido pequeño SgrT en E. coli. La secuencia de nucleótidos del gen sgrT se muestra en la SEQ ID NO: 21. El dgsA codifica un regulador global que actúa como un represor transcripcional para varios genes, en especial el gen ptsG y el operón ptsHIcrr de E. coli. La secuencia de nucleótidos del gen dgsA se muestra en la SEQ ID NO: 22.
El término "atenuado", como se usa en la presente memoria, se refiere a la supresión parcial o completa de la expresión de un gen. Esta supresión de la expresión puede ser bien una inhibición de la expresión del gen, una eliminación de toda o parte de la región promotora necesaria para la expresión del gen, una eliminación en la región que codifica el gen y/o el intercambio del promotor de tipo natural por un promotor natural o sintético más débil. Preferiblemente, la atenuación de un gen es esencialmente la eliminación completa de ese gen, que se puede sustituir por un gen marcador de selección que facilita la identificación, aislamiento y purificación de cepas de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la supresión de la expresión del gen se puede lograr por la técnica de la recombinación homóloga (Datsenko y Wanner, 2000). En una realización, la importación de glucosa mejora por eliminación del gen sgrS. En otra realización, la importación de glucosa mejora por eliminación del gen SgrT.
En una realización de adicional, la importación de glucosa mejora por una combinación de las modificaciones descritas antes. Por ejemplo, en el microorganismo de la invención la importación de glucosa se puede mejorar por:
-potenciación de la expresión del gen ptsG y eliminación del gen dgsA y atenuación de la expresión del gen sgrS;
-potenciación de la expresión del gen ptsG y eliminación del gen dgsA y atenuación de la expresión del gen sgrT;
-potenciación de la expresión del gen ptsG y eliminación del gen dgsA y atenuación de la expresión del gen sgrS y el gen sgrT.
En una realización preferida de la invención, la importación de glucosa mejora por la sobreexpresión del gen ptsG y eliminación del gen dgsA y los genes sgrT y sgrS.
Las modificaciones para mejorar el transporte de glucosa con el fin de mejorar la producción de metionina no se hacen de forma aislada, sino en combinación con modificaciones que promueven la producción fermentativa de la metionina por un microorganismo a partir de glucosa como una fuente principal de carbono. En el microorganismo recombinante de la invención, se atenúa la expresión de al menos uno de los siguientes genes: metJ, pykA, pykF, purU, yncA, o udhA. Otras modificaciones que promueven la producción de metionina en un microorganismo son bien conocidas para el experto en la técnica. En una realización, se potencia la expresión de al menos uno de los siguientes genes: pyc, pntAB, cysP, cysU, cysW, cysA, cysM, cysJ, cysI, cysH, gcvT, gcvH, gcvP, lpd, serA, serB, serC, cysE, metF, metH, thrA, un alelo de metA que codifica una enzima con menor sensibilidad por retroalimentación a la S-adenosilmetionina y/o metionina (MetA*), o un alelo de thrA que codifica una enzima con menor inhibición por retroalimentación de treonina (thrA*). En una realización particular de la invención al menos uno de estos genes puede estar bajo el control de un promotor inducible. En una realización preferida de la invención el gen thrA* es expresado bajo un promotor inducible.
Los expertos en la técnica conocen bien los métodos de modificación de la expresión de genes en un microorganismo y se describen más arriba y a continuación.
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(●): cepa 2 en condiciones 20/80 de concentración de IPTG.
Ejemplos
Protocolos Se han usado varios protocolos para construir cepas que producen metionina descritos en los siguientes ejemplos. Protocolo 1: Modificaciones cromosómicas por recombinación homóloga y selección de recombinantes (Datsenko y
Wanner, (2000)). La sustitución alélica o alteración génica en un locus de cromosoma específico se llevó a cabo por recombinación homóloga como describen Datsenko y Wanner, (2000). El gen cat de resistencia a cloranfenicol (Cm) o kan de resistencia a la kanamicina (Km), flanqueado por sitios de reconocimiento Flp, se amplificaron por PCR usando los plásmidos pKD3 o pKD4 como molde respectivamente. Los productos de la PCR resultantes se usaron para transformar la cepa de E. coli receptora que alberga el plásmido pKD46 que expresa la recombinasa Red (γ, β,
exo). Después se seleccionaron los transformantes resistentes a antibiótico y se verificó la estructura cromosómica del locus mutado por análisis por PCR con los cebadores adecuados listados en la tabla 1 más adelante. El gen de resistencia cat se puede intercambiar por el gen de resistencia kan usando el plásmido pCP20 que lleva el
gen que codifica la recombinasa Flp como describen Datsenko y Wanner, (2000) y el plásmido pKD4 que lleva el gen kan. Los plásmidos pCP20 y pKD4 se introdujeron en la cepa adecuada y los transformantes se extendieron en LB complementado con kanamicina a 37ºC con el objetivo de expresar el gen flp y después los clones que crecían se verificaron por PCR usando los oligonucleótidos citados en la tabla 1.
Los genes de resistencia se separaron usando el plásmido pCP20 como describen Datsenko y Wanner, (2000). Brevemente, los clones que albergaban el plásmido pCP20 se cultivaron a 37ºC en LB y después se ensayó la pérdida de resistencia a antibiótico a 30ºC. Después se verificaron los clones sensibles a antibiótico por PCR usando los cebadores citados en la tabla 1.
Protocolo 2: Transducción del fago P1 Se transfirieron las modificaciones cromosómicas a una cepa receptora de E. coli dada por transducción de P1. El
protocolo está compuesto de 2 etapas: (i) preparación de lisado de fago en una cepa donadora que contiene la modificación cromosómica asociada a la resistencia, y (ii) infección de la cepa receptora por este lisado de fago. Preparación del lisado de fago -Inocular 100 µl de un cultivo de una noche de la cepa MG1655 con la modificación cromosómica de interés en 10
ml de LB + Cm 30 µg/ml o Km 50 µg/ml + glucosa al 0,2% + CaCl2 5 mM. -Incubar 30 min a 37°C con agitación. -Añadir 100 µl de lisado de fago P1 preparado en la cepa donadora MG1655 (aprox. 1 x 109 fagos/ml). -Agitar a 37ºC durante 3 horas hasta la lisis completa de las células. -Añadir 200 µl de cloroformo y mezclar en mezcladora vorticial. -Centrifugar 10 min a 4500 g para eliminar los residuos celulares. -Transferir el líquido sobrenadante a un tubo estéril. -Almacenar el lisado a 4ºC. Transducción -Centrifugar 10 min a 1500 g 5 ml de un cultivo de una noche de la cepa receptora de E. coli cultivada en medio LB. -Suspender el sedimento celular en 2,5 ml de MgSO4 10 mM, CaCl2 5 mM. -Infectar 100 µl de células con fago 00 µl P1 de la cepa MG1655 con la modificación en el cromosoma (tubo de
ensayo) y como tubos de control 100 µl de células sin fago P1 y 100 µl de fago P1 sin célula. -Incubar 30 min a 30ºC sin agitación. -Añadir 100 µl de citrato sódico 1 M en cada tubo y mezclar con mezcla vorticial. -Añadir 1 ml de LB -Incubar 1 hora a 37ºC con agitación.
-Centrifugar 3 min a 7000 rpm. -Cultivar en LB + Cm 30 µg/ml o Km 50 µg/ml. -Incubar a 37ºC durante la noche. Tabla 1: Oligonucleótidos usados en los siguientes ejemplos.
- Nombre del oligonucleótido
- SEQ ID N° Secuencia 5' → 3'
- Ome2070-EcoRI-PlacIq-F
- 1 CCGGAATTCCATTTACGTTGACACCATCGAATGG
- Ome2071-NheI-TT02-lacIq-R
- 2
- Ome2072-GfpTurboOpt-RBS01*2-AvrII-OP01-Ptrc01-NheI-TT02-F
- 3
- Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R
- 4
- Ome2115-AvrII-RBS01*2-ptsG-F
- 5
- Ome2116-BstZ17I-ptsG-R
- 6 GACGTATACTTAGTGGTTACGGATGTACTCATC
- Ome2127-RHamont-pCC1BAC-Gt-F
- 7
- Ome2128-RHaval-pCC1BAC-Gt-R
-
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- Ome2371-DsgrS-F1
- 9 GGACGCAAAAAGAAACGCCAGTG
- Ome2372-DsgrS-R1
- 10
- Ome2373-DsgrS-F2
- 11
- Ome2374-DsgrS-R2
- 12
- Ome2375-DsgrS-F3
- 13
- Ome2376-DsgrS-R3
- 14
- Ome2378-DsgrS-Fseq
- 15 GATGGGATGGCTGGCAAAGT
- Ome2377-DsgrS-Rseq
- 16 CGAGTTTTGCTGACATCTTCTACG
- melBup-F
- 23 cgtaggcgccggtaccgacctcaatatcgacccagctacgc
- Nombre del oligonucleótido
- SEQ ID N° Secuencia 5' → 3'
- melBup-R
- 24
- melBdown-F
- 25
- melBdown-R
- 26 cgtaggcgccggtacccgaactgcactaagtaacctcttcgg
- Km-F
- 27 tcccccggggtataccatatgaatatcctccttag
- Km-R
- 28 gcccaagctttgtaggctggagctgcttcg
- Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-F
- 29
- pycre-TT07-R
- 30
- melB-pycre-F
- 31 gccgattttgtcgtggtggc
- melB-pycre-R
- 32 gccggttatccatcaggttcac
- purUup-F
- 33 ctgaggcctatgcatggaatgcaatcgtagccacatcgc
- purUup-R
- 34
- purUdown-F
- 35
- purUdown-R
- 36 ctgaggcctatgcatgcggattcgttgggaagttcaggg
- PL1*1/RBS01*2-pycre-F
- 37
- pycre-TT07-R2
- 38
- purU-pycre-F
- 39 gcccaccagcgaaccaattg
- purU-pycre-R
- 40 gtaaacgtggtgccatcggg
- dgsA-F
- 41 cctggcaaataacccgaatg
- dgsA-R
- 42 cccattcagagagtggacgc
Ejemplo 1: Construcción de la cepa 2.
1. Cepa productora de metionina 1 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)
5 thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serAserC (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) se ha descrito en la solicitud de patente PCT/FR2010/052937.
2. Construcción de la cepa 2
10 Para aumentar la importación de glucosa en la célula, PtsG (IICGlc), la PTS permeasa específica de glucosa del sistema de fosfotransferasa de glucosa se superprodujo a partir de un cromosoma artificial bacteriano y el uso de un promotor trc inducible artificial.
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El plásmido pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 deriva de los plásmidos pCC1BACPlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 (descrito más adelante) y por lo tanto del cromosoma artificial bacteriano pCC1BAC (Epicentre).
Para la construcción del plásmido pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07, el fragmento PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01lOP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 se obtuvo por PCR de solapamiento. Primero se amplificó la región PlacIq-lacI-TT02 por PCR a partir del plásmido pTRC99A (Stratagene) usando los siguientes oligonucleótidos, Ome2070-EcoRI-PlacIq-F y Ome2071-NheI-TT02-lacIq-R, y la región Ptrc01/OP01/RBS01*2GfpTurboOpt-TT07 se amplificó por PCR a partir del plásmido pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)RBS01-GfpTurboOpt-TT07 (sintetizado por Geneart y descrito más adelante) usando los siguientes oligonucleótidos, Ome2072-GfpTurboOpt-RBS01*2-AvrII-OP01-Ptrc01-NheI-TT02-F y Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R. Después, se llevó a cabo la PCR de solapamiento usando los productos de la PCR PlacIq-lacI-TT02 y Ptrc01/OP01/RBS01*2GfpTurboOpt-TT07 que tienen una región que se solapa como matriz, y los oligonucleótidos Ome2070-EcoRI-PlacIq-F y Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R. El producto final de la PCR PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2GfpTurboOpt-TT07 se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y SfiI y se clonó en los sitios EcoRI / SfiI del vector pCC1BAC. El plásmido recombinante se verificó por secuenciación del ADN, dando el plásmido pCC1BACPlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07.
Ome2070-EcoRI-PlacIq-F (SEQ ID NO 1)
ccggaattcCATTTACGTTGACACCATCGAATGG
con
-secuencia en minúsculas para el sitio de restricción de EcoRI y bases extra,
-secuencia en mayúsculas homóloga a la versión modificada PlacIq del promotor del gen lacI, que lleva el vector pTRC99A (2967-2991, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22744.1)
Ome2071-NheI-TT02-lacIq-R (SEQ ID NO 2)
con -secuencia en mayúsculas negrilla homóloga al promotor de trc artificial, Ptrc01 (Meynial-Salles et al. 2005) -secuencia en minúsculas para el sitio de restricción de NheI y bases extra, -secuencia en mayúsculas itálica para el terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli (Orosz et al. 1991),
secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/), denominada TT02 -secuencia en mayúsculas homóloga al gen lacI (4118-4137, secuencia de referencia en el sitio web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M22744.1, o 365652-365671, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/) -secuencia subrayada que muestra la región de solapamiento para la etapa de PCR de solapamiento Ome2072-GfpTurboOpt-RBS01*2-AvrII-OP01-Ptrc01-NheI-TT02-F (SEQ ID NO 3)
con
-secuencia en mayúsculas itálica para el terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli (Orosz et al. 1991), secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/), denominado TT02 -secuencia en minúsculas para el sitio de restricción NheI o AvrII y bases extra, -secuencia en mayúsculas negrilla homologa al promotor de trc artificial, Ptrc01 y operador, OP01 (Meynial-Salles et
al. 2005) -secuencia en minúsculas negrilla itálica para la secuencia del sitio de unión al ribosoma, denominado RBS01*2 -secuencia en mayúsculas homóloga a una forma modificada del gen gfp, que significa optimizado para uso de
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codones de E. coli, denominada GfpTurboOpt -secuencia subrayada que muestra la región de solapamiento para la etapa de PCR de solapamiento Ome2073-EcoRI-SfiI-PacI-TT07-R (SEQ ID NO 4) ccagaattcggcccgggcggccttaattaaGCAGAAAGGCCCACCCGAAG con -secuencia en minúsculas para los sitios de restricción EcoRI, SfiI, PacI y bases extra -secuencia en mayúsculas itálica para la secuencia terminadora de la transcripción T7Te (Harrington et al. 2001),
denominada TT07 GfpTurboOpt-TT07 región presente en el plásmido pCR4BluntTOPO-TTadc-CI857*-PlambdaR*(-35)-RBS01GfpTurboOpt-TT07, sintetizado por Geneart Company (SEQ ID NO 17):
con
-secuencia en minúsculas negrilla itálica para el sitio de unión al ribosoma, denominada RBS01*2
-secuencia en minúsculas homóloga al gen GfpTurbo (Evrogene) optimizada para E. coli, denominada GfpTurboOpt
-secuencia en mayúsculas para el sitio de restricción BstZ17I
-secuencia subrayada para la secuencia terminadora de la transcripción T7Te (Harrington et al. 2001), denominada TT07.
Para intercambiar el gen GfpTurboOpt por el gen ptsG gen en el vector pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 para obtener el plásmido pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07, primero se digirió parcialmente pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07 con las enzimas de restricción AvrII y BstZ17I. Después, se amplificó la región ptsG por PCR a partir de ADN genómico de la cepa de E. coli MG1655 usando los siguientes oligonucleótidos, Ome2115-AvrII-RBS01*2-ptsG-F y Ome2116-BstZ17I-ptsG-R y el producto resultante de la PCR se digirió con las enzimas de restricción AvrII y BstZ17I y se clonó en los sitios AvrII / BstZ17I del vector pCC1BACPlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-GfpTurboOpt-TT07. El plásmido recombinante se verificó por secuenciación del ADN, dando el plásmido pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07.
Ome2115-AvrII-RBS01*2-ptsG-F (SEQ ID NO 5)
con -secuencia en minúsculas para los sitios de restricción NotI, AvrII y bases extra -secuencia en mayúsculas negrilla para la secuencia del sitio de unión al ribosoma, denominada RBS01*2 -secuencia en mayúsculas homóloga al gen ptsG (1157092-1157116, secuencia de referencia en el sitio web
http://ecogene.org/) Ome2116-BstZ17I-ptsG-R (SEQ ID NO 6)
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gacgtatacTTAGTGGTTACGGATGTACTCATC
con
-secuencia en minúsculas para el sitio de restricción BstZ17I y bases extra
-secuencia en mayúsculas homóloga al gen ptsG (1158502-1158525, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Finalmente, el plásmido resultante pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 se introdujo en la cepa 1 dando lugar a la cepa 2 de MG1655, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07).
En esta construcción pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07, el promotor natural, así como el sitio de unión al ARN pequeño sgrS se sustituyen por un promotor artificial fuerte. Por consiguiente, ptsG es sobreexpresado y su ARNm ya no está regulado y es activado para la degradación por sgrS.
La sobreexpresión de ptsG en la cepa cultivada en condiciones inducibles (+IPTG en el cultivo) se comprobó por qPCR.
Ejemplo 2: Construcción de la cepa 4
- 1.
- Cepa productora de metionina 3 MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::Cm ΔudhA (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) se ha descrito en la solicitud de patente WO2012/055798.
- 2.
- Construcción de la cepa 4
Con el fin de sobreproducir PtsG en una cepa productora de metionina modificada en su ruta de producción de NADPH (transhidrogenasas UdhA y PntAB), se tuvo que modificar el casete de resistencia a antibiótico del plásmido pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 (descrito en el ejemplo 1). Se intercambió el gen de resistencia al cloranfenicol de pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 por un gen de resistencia a gentamicina, dando el plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07.
Para proceder a este intercambio de genes de resistencia a antibióticos se usó un procedimiento basado en el sistema Red portado por el vector pKD46 (Genebridges). Para este fin se usaron 2 oligonucleótidos:
Ome2127-RHamont-pCC1BAC-Gt-F (SEQ ID NO 7)
con
-secuencia en mayúsculas subrayada homóloga a la región del vector pCC1BAC en 3' del gen de resistencia al cloranfenicol -secuencia en mayúsculas homóloga al gen de resistencia a la gentamicina que lleva el vector p34S-Gm (Dennis y
Zyltra, 1998) (735-805, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF062079.1) y Ome2128-RHaval-pCC1BAC-Gt-R (SEQ ID NO 8)
con
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
-secuencia en mayúsculas subrayada homóloga a la región del vector pCC1BAC en 5' del gen de resistencia al cloranfenicol
-mayúsculas homóloga al gen de resistencia a la gentamicina que lleva el vector p34S-Gm (Dennis y Zyltra, 1998) (272-344, secuencia de referencia en el sitio web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF062079.1)
Los oligonucleótidos Ome2127-RHamont-pCC1BAC-Gt-F y Ome2128-RHaval-pCC1BAC-Gt-R se usaron para amplificar el casete de resistencia a la gentamicina a partir del plásmido p34S-Gm (Dennis y Zyltra, 1998). El producto de la PCR obtenido después se introdujo por electroporación en la cepa DH5alfa (pCC1BAC-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07) (pKD46) en la que la enzima recombinasa Red permite la recombinación homóloga. Después, se seleccionaron los transformantes resistentes a la gentamicina y resistentes al cloranfenicol y la inserción del casete de resistencia se verificó por análisis de perfil de restricción.
Finalmente, el plásmido recombinante pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 se verificó por secuenciación del ADN y se introdujo en la cepa 3 dando la cepa de MG1655 4, MG1655 metA*11 PtrcmetH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA ::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP46::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*1 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::Cm ΔudhA (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07).
En esta construcción pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07, el promotor natural así como el sitio de unión al ARN pequeño sgrS se sustituyen por un promotor artificial fuerte. Por consiguiente, ptsG es sobreexpresado y su ARNm ya no está regulado y es activado para la degradación por sgrS.
La sobreexpresión de ptsG en la cepa cultivada en condiciones inducibles (+IPTG en el cultivo) se comprobó por qPCR.
Ejemplo 3: Construcción de la cepa 5
Para evitar cualquier regulación en el transcrito de ptsG y en la proteína PtsG, se eliminó el gen sgrT, que codifica un péptido pequeño que regula la actividad de PtsG y la parte del gen sgrS que codifica el ARN pequeño de sgrS que interfiere con el ARNm de ptsG.
Los genes sgrS/T son los primeros genes del operón sgrS/T-setA. Con el fin de eliminar los genes sgrS/T sin suprimir la expresión del gen en la dirección 3’ setA, se eliminó sgrS/T y al mismo tiempo se movió el gen setA en la dirección 3’ del promotor del operón. Para este fin, se usó la estrategia de recombinación homóloga descrita en el protocolo 1. La cepa de Escherichia coli BW25113 ΔsetA::Km (pKD46) de la colección de mutantes Keio (Baba et al., 2006) se usó para insertar un casete de resistente al cloranfenicol mientras se eliminaban los genes sgrS/T y se restablecía el gen setA en la dirección 3’ del promotor del operón.
Específicamente, el fragmento "sgrR-PsgrR-PsgrS-RBSsetA-setA-FRT-Cm-FRT-leuD" (fragmento 4), necesario para eliminar los genes sgrS/T se amplificó por PCR de solapamiento. Los primeros fragmentos 1, 2 y 3 que servían como matriz para la PCR de solapamiento final se amplificaron; cada uno de estos fragmentos tiene al menos una región homóloga de 48 nucleótidos de largo entre los extremos 3’ y 5’ que permite la etapa de la PCR de solapamiento. El fragmento 1, "sgrR-PsgrR-PsgrS-RBSsetA-setA", se amplificó a partir del ADN genómico de Escherichia coli MG1655 usando los oligonucleótidos Ome2371-DsgrS-F1 y Ome2372-DsgrS-R1; el fragmento 2, "PsgrR-PsgrS-RBSsetA-setA", se amplificó a partir del ADN genómico de Escherichia coli MG1655 usando los oligonucleótidos Ome2373-DsgrS-F2 y Ome2374-DsgrS-R2; el fragmento 3, "FRT-Cm-FRT-leuD", se amplificó por PCR a partir del plásmido pKD3, usando los oligonucleótidos Ome2375-DsgrS-F3 y Ome2376-DsgrS-R3. Finalmente, el fragmento 4 se amplificó por PCR a partir de una mezcla de fragmentos 1, 2 y 3 usados como matriz y usando los oligonucleótidos Ome2371-DsgrS-F1 y Ome2376-DsgrS-R3.
Ome2371-DsgrS-F1 (SEQ ID NO 9)
GGACGCAAAAAGAAACGCCAGTG
homólogo al gen sgrR (76743-76765, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome2372-DsgrS-R1 (SEQ ID NO 10)
GTCATTATCCAGATCATACGTTCCCTTTTTAAACTGACGCATGGGGCACCC
Con
-secuencia en mayúsculas homóloga a la región promotora de sgrR y sgrS (77379-77398, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Puesto que el marco de lectura abierto de sgrT solapa con la secuencia de sgrS que codifica el ARN pequeño, la eliminación de sgrS da como resultado la eliminación de sgrT. Así pues, la eliminación de sgrS/T se denominó ΔsgrS.
Ome2378-DsgrS-Fseq (SEQ ID NO 15)
GATGGGATGGCTGGCAAAGT
homóloga al gen sgrR (76502-76521, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
Ome2377-DsgrS-Rseq (SEQ ID NO 16)
CGAGTTTTGCTGACATCTTCTACG
homóloga al gen leuD (79143-79120, secuencia de referencia en el sitio web http://ecogene.org/)
La eliminación de sgrS/T se transfirió por transducción de fago P1 de la cepa BW25113 ΔsgrS::Cm a la cepa 1. Después, se seleccionaron los transformantes resistentes al cloranfenicol y la inserción del casete de resistencia se verificó por análisis de PCR con los oligonucleótidos Ome2378-DsgrS-Fseq y Ome2377-DsgrS-Rseq. La cepa resultante se denominó cepa 5, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔsgrS::Cm (pCL1920-PgapA-pycre-TT07).
Ejemplo 4: Construcción de la cepa 6
Con el fin de superar las regulaciones de PtsG en una cepa de metionina modificada en su ruta de producción de NADPH (transhidrogenasas UdhA y PntAB), se eliminaron los genes sgrS/T en la cepa 3.
Para este fin, primero se intercambió el casete de resistencia al cloranfenicol de ΔsgrS::Cm por un casete de resistencia a la kanamicina. Para esto, se introdujeron los plásmidos pCP20 y pKD4 en la cepa de BW25113 ΔsgrS::Cm y después de extender los transformantes en LB complementado con kanamicina a 37ºC, los clones que crecían se verificaron por PCR usando los oligonucleótidos Ome2378-DsgrS-Fseq y Ome2377-DsgrS-Rseq. Después, la eliminación ΔsgrS::Km se transfirió por transducción del fago P1 de la cepa de BW25113 ΔsgrS::Km a la cepa 3. Después, se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina y el casete de resistencia se verificó por un análisis de PCR con los oligonucleótidos Ome2378-DsgrS-Fseq y Ome2377-DsgrS-Rseq. La cepa resultante se denominó cepa 6, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC Ptrc30-pntAB::Cm ΔudhA ΔsgrS::Km (pCL1920-PgapA-pycre-TT07).
Ejemplo 5: Construcción de la cepa 7
Con el fin de aumentar drásticamente la importación de glucosa en la cepa 2 que ya sobreexpresa ptsG a partir de pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07, se eliminaron los genes sgrS/T en esta cepa.
Para este fin, la eliminación ΔsgrS se transfirió por transducción de fago P1 desde la cepa de BW25113 ΔsgrS::Km a la cepa 2. Después, se seleccionaron los transformantes resistentes a cloranfenicol y la inserción del casete de resistencia se verificó por un análisis de PCR con los oligonucleótidos Ome2378-DsgrS-Fseq y Ome2377-DsgrS-Rseq. La cepa resultante se denominó cepa 7, MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC ΔsgrS::Cm (pCL1920-PgapA-pycre-TT07) (pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07).
La sobreexpresión de ptsG de la cepa cultivada en condiciones inducibles (+IPTG en el cultivo) se comprobó por qPCR.
Ejemplo 6: Construcción de la cepa 15
1. Cepa 8
La cepa productora de metionina 8 se ha descrito en la solicitud de patente WO2012/055798. El genotipo de la cepa
5
10
15
20
25
30
35
40
ctgaggcctatgcatGCGGATTCGTTGGGAAGTTCAGGG
con
-una región (minúsculas) para los sitios de restricción StuI y NsiI y bases extra,
-una región (mayúsculas) homóloga a la secuencia (1286429-1286452) de la región purU (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/).
Primero, se amplificaron por PCR los fragmentos "upPurU" y "downPurU" a partir del ADN genómico de MG1655 usando los oligonucleótidos purUup-F/purUup-R y purUdown-F/purUdown-R, respectivamente. En segundo lugar, se amplificó el fragmento "upPurU-downPurU" a partir de los fragmentos de la PCR "upPurU" y "downPurU" (que tienen una región que solapa compuesta de una parte del terminador de la transcripción T1 del gen rrnB de E. coli y parte del sitio de clonación múltiple) usando los oligonucleótidos purUup-F/purUdown-R. El fragmento de la PCR "upPurUdownPurU" se cortó con la enzima de restricción StuI y se clonó en los sitios EcoRI/HindIII de extremos romos del vector pUC18, dando el plásmido pUC18-ΔpurU::TT02-SMC.
Después, se amplificó por PCR el casete de resistencia a la kanamicina a partir del vector pKD4 usando los oligonucleótidos Km-F y Km-R (descritos antes). El fragmento de la PCR se cortó con las enzimas de restricción BstZ17I y HindIII y se clonó en los sitios BstZ17I / HindIII del plásmido pUC18-ΔpurU::TT02-SMC, dando el plásmido pUC18-ΔpurU::TT02-SMC::Km.
Finalmente, el fragmento PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km se amplificó por PCR con los cebadores PL1*1/RBS01*2pycre-F y pycre-TT07-R2 a partir del plásmido pCL1920-PgapA-pycre-TT07, descrito en la solicitud de patente WO2012/055798. El fragmento de la PCR se cortó con las enzimas de restricción SpeI y SmaI y se clonó en los sitios AvrII/SmaI del plásmido pUC18-ΔpurU::TT02-SMC::Km, dando el plásmido pUC18-ΔpurU::TT02PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km. Los plásmidos recombinantes se verificaron por secuenciación de ADN.
PL1*1/RBS01*2-pycre-F (SEQ ID NO 37)
con -una región (minúsculas) para los sitios de restricción SpeI, SalI, HpaI y MluI y bases extra, -una región (mayúsculas negrilla) homóloga a la forma corta del promotor PL del bacteriófago lambda (PL1 Giladi et
al. 1995) y que alberga una mutación en la caja -10 box (G12T, subrayada negrilla) descrita en Kincade y deHaseth (1991). Este promotor se denomina PL1*1, -una región (mayúsculas itálica) homóloga a un sitio de unión del ribosoma optimizado, -una región (mayúsculas) homóloga al inicio 5' del gen pyc de Rhizobium etli (1-32). pycre-TT07-R2 (SEQ ID NO 38)
con
-una región (minúsculas) para los sitios de restricción SmaI, PacI, ScaI, SnaBI y bases extra,
-una región (mayúsculas negrilla) para la secuencia del terminador transcripcional T7te (Harrington et al. 2001),
-una región (mayúsculas) homóloga al extremo 5' del gen pyc de Rhizobium etli (3445-3465).
En segundo lugar, se obtuvo el fragmento ΔpurU::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km cortando el plásmido pUC18-ΔpurU::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km con la enzima de restricción NsiI y después se introdujo por electroporación, de acuerdo con el protocolo 1, en la cepa MG1655 metA*11 pKD46. Después, se seleccionaron los transformantes resistentes a la kanamicina, y la inserción del fragmento ΔpurU::TT02-PL1*1/RBS01*2-pycreTT07::Km se verificó por un análisis de PCR con los oligonucleótidos purU-pycre-F y purU-pycre-R. La cepa verificada y seleccionada se denominó MG1655 metA*11 pKD46 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km.
purU-pycre-F (SEQ ID NO 39)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
GCCCACCAGCGAACCAATTG
homóloga a la secuencia (1288589-1288608) de la región purU (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/)
purU-pycre-R (SEQ ID NO 40)
GTAAACGTGGTGCCATCGGG
homóloga a la secuencia (1285868-1285887) de la región purU (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/).
En tercer lugar, se transdujo la modificación cromosómica ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km en la cepa 10, con un lisado de fago P1 desde la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km descrita antes, de acuerdo con el protocolo 2. Los transductantes resistentes a la kanamicina se seleccionaron y la presencia de la modificación cromosómica ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07::Km se verificó por PCR con los cebadores purU-pycre-F y purU-pycre-R. La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcFcysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadcCI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycreTT07::Km se denominó cepa 11.
Después se eliminó el casete de resistencia a la kanamicina. El plásmido pCP20, que llevaba la recombinasa FLP que actúa en los sitios FRT del casete de resistencia a la kanamicina, se introdujo en la cepa 11. Después de una serie de cultivos a 37ºC, la pérdida del casete de resistencia a la kanamicina se verificó por análisis de PCR con los mismos oligonucleótidos usados previamente, purU-pycre-F / purU-pycre-R. La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP46::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*1 1 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 se denominó cepa 12.
3. Construcción de las cepas 13 y 14
Para aumentar el conjunto de metileno-tetrahidrofolato en la célula, se llevó a cabo la sobreproducción del complejo de escisión de glicina codificado por el operón gcvTHP por adición de una copia de este operón en el cromosoma en el locus yjbI. Esta copia adicional de gcvTHP se expresó usando el promotor trc inducible artificial, y un sitio de unión al cromosoma optimizado, dando la integración del cromosoma ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km, descrito en la solicitud de patente PCT/FR2012 /051361.
La modificación cromosómica ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km se transdujo en la cepa 12, con un lisado de fago P1 a partir de la cepa MG1655 metA*11 pKD46 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km, descrita en la solicitud de patente PCT/FR2012 /051361, de acuerdo con el protocolo 2. Los transductores resistentes a la kanamicina se seleccionaron y la presencia de la modificación cromosómica ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHPTT07::Km se verificó por PCR con los cebadores yjbI-gcvTHP-F y yjbI-gcvTHP-R, descritos en la solicitud de patente PCT/FR2012/051361. La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1cysE-PgapA-metA* 1 1 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07::Km se denominó cepa 13.
Después, se eliminó el casete de resistencia a la kanamicina. Se introdujo el plásmido pCP20, que llevaba la recombinasa FLP que actúa en los sitios FRT del casete de resistencia a la kanamicina, en la cepa 13. Después de una serie de cultivos a 37ºC, la pérdida del casete de resistencia a la kanamicina se verificó por análisis de PCR con los mismos oligonucleótidos usados previamente, yjbI-gcvTHP-F y yjbI-gcvTHP-R. La cepa resultante MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadcPlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysEPgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 se denominó cepa 14.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
4. Construcción de la cepa 15
Para aumentar el flujo en la ruta de serina, se introdujo el plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca, descrito en la solicitud de patente PCT/FR2012 /051361, en la cepa 14, dando la siguiente cepa MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 (pCC1BAC-TT02-Ptc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca), denominada cepa 15.
Ejemplo 7: Construcción de las cepas 16 y 17
1. Construcción de la cepa 16
Para aumentar la importación de glucosa en la célula, se eliminó el gen dgsA (o mlc), que codifica un regulador doble transcripcional que controla la expresión de una serie de genes que codifican enzimas del sistema de fosfotransferasa de azúcar dependiente de PEP (PTS) de Escherichia coli.
Para eliminar el gen dgsA, se usó la cepa de Escherichia coli BW25113 ΔdgsA::Km de la colección de mutantes Keio (Baba et al., 2006). La eliminación de ΔdgsA::Km se transfirió por la transducción del fago P1 (de acuerdo con el protocolo 2) de la cepa BW25113 ΔdgsA::Km a la cepa 14. Se seleccionaron los transductantes resistentes a la kanamicina y la presencia de la eliminación cromosómica ΔdgsA::Km se verificó por PCR con los cebadores dgsA-F y dgsA-R definidos más adelante.
La cepa retenida MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔuxaCA::TT07-TTadc-PlambdaR*(35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔCP4-6::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11 ΔwcaM::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1-cysE-PgapA-metA*11ΔtreBC::TT02-serA-serC ΔmelB::RN/Ptrc01/ARN01/RBS01*2-pycre-TT07 ΔpurU::RN/PL1*1/RBS01*2-pycre-TT07 ΔyjbI::RN/Ptrc01/RBS01-gcvTHP-TT07 ΔdgsA::Km se denominó cepa 16.
dgsA-F (SEQ ID NO 41)
CCTGGCAAATAACCCGAATG
homóloga a la secuencia (1667067-1667086) de la región dgsA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/)
dgsA-R (SEQ ID NO 42)
CCCATTCAGAGAGTGGACGC homóloga a la secuencia (1664853-1664872) de la región dgsA (secuencia de referencia en el sitio web http://www.ecogene.org/).
2. Construcción de la cepa 17
Otra forma de aumentar la importación de glucosa en la célula consiste en la sobreproducción de PtsG (IICGlc), la pareja transmembrana del sistema de fosfotransferencia de glucosa. Con el fin de sobreexpresar ptsG en el contexto de la cepa 15, se construyó el siguiente plásmido, pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsGTT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca.
El plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca se obtiene del plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 (descrito antes en el ejemplo 1, construcción de la cepa 2) y del plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca, descrito en la solicitud de patente PCT/FR2012/051361. El fragmento Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca se cortó con las enzimas de restricción SnaBI y AvrII a partir del plásmido pCC1BAC-TT02-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca y se clonó en el sitio PacI de extremo romo del plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07, dando plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serC-TT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca.
Después, el plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07-Ptrc30/RBS01-serCTT07*2-Ptrc30/RBS01-serA-TTadcca se introdujo en la cepa 16, dando la siguiente MG1655 metA*11 Ptrc-metH PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP Ptrc36-ARNmst17-metF Ptrc07-serB ΔmetJ ΔpykF ΔpykA ΔpurU ΔyncA ΔmalS::TTadc-CI857-PlambdaR*(-35)-thrA*1-cysE ΔpgaABCD::TT02-TTadc-PlambdaR*(-35)-RBS01-thrA*1
- CoCl2.6H2O
- 0,0080
- H3BO3
- 0,0010
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0004
- MgSO4.7H2O
- 1,00
- Ácido cítrico
- 6,00
- CaCl2.2H2O
- 0,04
- K2HPO4
- 8,00
- Na2HPO4
- 2,00
- (NH4)2HPO4
- 8,00
- NH4Cl
- 0,13
- NaOH 4 M
- Ajustado a pH 6,8
- FeSO4.7H2O
- 0,04
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 15,00
- Tiosulfato amónico
- 5,60
- Vitamina B12
- 0,01
- MOPS
- 15,00
Efecto de la sobreexpresión de ptsG en la producción de metionina en diferentes cepas
Tabla 3: Rendimientos de metionina, cetometilvalerato y homolantionina (YMet, YKMV, YHLA) en % de g de producto/g de glucosa, producido en cultivo discontinuo por la cepa 2. Para la definición precisa de rendimiento de metionina/glucosa véase antes. Para cada una de las condiciones se hicieron dos repeticiones. Las concentraciones de HLA y KMV se midieron solo para un matraz. El IPTG (abreviatura de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) induce la transcripción del promotor lac del plásmido pCC1BACVB01-PlacIq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 que lleva la cepa 2 (véase el genotipo en el ejemplo 1).
- Concentración de IPTG (µM)
- YMet YKMV YHLA
- 0
- 9,86 ± 0,67 0,87 3,78
- 10
- 11,90 ± 0,17 0,35 3,55
- 20
- 13,32 ± 0,14 0,18 3,48
- 200
- 12,80 ± 0,37 0,13 3,66
10 Como se puede ver en la tabla 3, el rendimiento de la producción de metionina aumenta significativamente tras la expresión de ptsG. La mejor inducción de ptsG se obtiene con IPTG 20 µM (comprobado por qPCR, no se muestran los datos) y la mejor producción de metionina también se obtiene en dichas condiciones. Además, la sobreproducción de ptsG permite disminuir la acumulación de cetometilvalerato en el cultivo.
Como información, la cepa de control 1 cultivada en matraces da un rendimiento de la producción de metionina 15 equivalente al rendimiento obtenido con la cepa 2 sin IPTG.
Tabla 4: Rendimientos de metionina, cetometilvalerato y homolantionina (YMet, YKMV, YHLA) en % de g de producto/g de glucosa, producido en cultivo discontinuo por las cepas 3 y 4. Para la definición precisa de rendimientos véase antes. El número de repeticiones se indica entre paréntesis. La cepa 4 se cultivó con IPTG 20 µM para inducir la expresión de ptsG.
20
5
10
15
20
25
30
35
- Cepa
- YMet YKMV YHLA
- Cepa 3 (N = 27)
- 9,95 ± 1,40 1,22 ± 0,32 2,87 ± 1,21
- Cepa 4 (N = 3)
- 9,86 ± 0,10 0,17 1,99
La sobreexpresión de ptsG en la cepa 4, que tiene la expresión de transhidrogenasa modificada (sobreexpresión de pntAB y eliminación de udhA) permite la reducción de la producción de homolantionina y cetometilvalerato. En dicho contexto, la sobreexpresión de ptsG no potencia el rendimiento de producción de metionina, pero mejora claramente la pureza del producto final.
Esto muestra que no era fácil predecir el efecto de una mayor importación de glucosa en cepas productoras de metionina.
Efecto de la eliminación de sgrS y sgrT en la producción de metionina
Tabla 5: Rendimientos de metionina, cetometilvalerato y homolantionina (Ymet, YKMV, YHLA) en % de g de producto/g de glucosa, producido en cultivo discontinuo por las cepas 1 y 5. Para la definición precisa de rendimientos véase antes. El número de repeticiones se indica entre paréntesis.
- Cepa
- Ymet YKMV YHLA
- Cepa 1 (N = 283)
- 10,42 ± 1,87 1,22 ± 0,42 3,25 ± 0,91
- Cepa 5 (N = 3)
- 14,03 ± 0,26 1,92 3,01
Como puede verse en la tabla 5 anterior, el rendimiento de metionina aumenta significativamente tras la eliminación de los genes sgrS y sgrT.
SgrS inhibe la traducción del ARNm de ptsG tanto directa como indirectamente. El extremo 5' de SgrS contiene un marco de lectura abierto de 43 aminoácidos, sgrT, que regula la actividad de PtsG.
En la cepa 5 se eliminan tanto los genes sgrS como sgrT y el efecto en la producción de metionina es positivo y similar al efecto obtenido con una sobreproducción de ptsG (véase la tabla 3).
Ejemplo 10: Producción de L-metionina por fermentación en biorreactores con las cepas 1 y 2
Las cepas que produjeron en matraces cantidades sustanciales de metabolitos de interés, posteriormente se ensayaron en condiciones de producción de fermentadores de 2,5 litros (Pierre Guerin) usando un procedimiento semicontinuo.
Se usó un cultivo de 24 horas cultivado en 10 ml de medio LB con glucosa 2,5 g.l-1 para inocular un precultivo de 24 horas en medio mínimo (B1a). Estas incubaciones se llevaron a cabo en matraces con deflectores de 500 ml que contenían 50 ml de medio mínimo (B1a) en un agitador rotatorio (200 rpm). El primer precultivo se cultivó a una temperatura de 30ºC, el segundo a una temperatura de 34ºC.
Se llevó a cabo una tercera etapa de precultivo en biorreactores (Sixfors) cargados con 200 ml de medio mínimo (B1b) inoculado con una concentración de biomasa de 1,2 g.l-1 con 5 ml de precultivo concentrado. La temperatura del precultivo se mantuvo constante a 34ºC y el pH se ajustó automáticamente a un valor de 6,8 usando una solución de NH4OH al 10%. La concentración de oxígeno disuelto se ajustó continuamente a un valor de 30% de la saturación de la presión parcial del aire con suministro de aire y/o agitación. Tras agotarse la glucosa del medio discontinuo, se inició la fase semicontinua con un caudal inicial de 0,7 ml.h-1 y se aumentó exponencialmente durante 24 horas con una velocidad de crecimiento de 0,13 h-1 con el fin de obtener una concentración celular final de aproximadamente 20 g.l-1 .
Tabla 6: Composición del medio mineral de precultivo discontinuo (B1a y B1b).
- Compuesto
- Concentración de B1a (g.l-1) Concentración de B1b (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2.2H2O
- 0,0130 0,0130
- CuCl2.2H2O
- 0,0015 0,0015
- MnCl2.4H2O
- 0,0150 0,0150
- CoCl2.6H2O
- 0,0025 0,0025
- H3BO3
- 0,0030 0,0030
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0025 0,0025
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,1064 0,1064
- EDTA
- 0,0084 0,0084
- MgSO4.7H2O
- 1,00 1,00
- CaCl2.2H2O
- 0,08 0,08
- Ácido cítrico
- 1,70 1,70
- KH2PO4
- 4,57 4,57
- K2HPO4.3H2O
- 2,50 2,50
- (NH4)2HPO4
- 1,10 1,10
- (NH4)2SO4
- 4,90 4,90
- (NH4)2S2O3
- 1,00 1,00
- Tiamina
- 0,01 0,01
- Vitamina B12
- 0,01 0,01
- Glucosa
- 30,00 5,00
- MOPS
- 30,00 0,00
- NH4OH 28%
- Ajustado a pH 6,8 Ajustado a pH 6,8
Tabla 7: Composición de medio mineral de precultivo semicontinuo (F1)
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2.H2O
- 0,0104
- CuCl2.2H2O
- 0,0012
- MnCl2.4H2O
- 0,0120
- CoCl2.6H2O
- 0,0020
- H3BO3
- 0,0024
- Na2MoO4.2H2O
- 0,0020
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,0424
- EDTA
- 0,0067
- MgSO4
- 5,00
- (NH4)2SO4
- 8,30
- Na2SO4
- 8,90
- (NH4)2S2O3
- 24,80
- Tiamina
- 0,01
- Glucosa
- 500,00
- Vitamina B12
- 0,01
- NH4OH 28%
- Ajustado a pH 6,8
Tabla 8: Composición de medio mineral de cultivo discontinuo (B2)
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2,2H2O
- 0,0130
- CuCl2,2H2O
- 0,0015
- MnCl2,4H2O
- 0,0150
- CoCl2,6H2O
- 0,0025
- H3BO3
- 0,0030
- Na2MoO4,2H2O
- 0,0025
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,1064
- EDTA
- 0,0084
- MgSO4,7H2O
- 1,00
- CaCl2,2H2O
- 0,08
- Ácido cítrico
- 1,70
- KH2PO4
- 2,97
- K2HPO4,3H2O
- 1,65
- (NH4)2HPO4
- 0,72
- (NH4)2S2O3
- 3,74
- Tiamina
- 0,01
- Vitamina B12
- 0,01
- Biotina
- 0,10
- Glucosa
- 10
- NH4OH 28%
- Ajustado a pH 6,8
Tabla 9: Composición de medio de cultivo semicontinuo (F2) 5
- Compuesto
- Concentración (g.l-1)
- Zn(CH3COO)2,2H2O
- 0,0104
- CuCl2,2H2O
- 0,0012
- MnCl2,4H2O
- 0,0120
- CoCl2,6H2O
- 0,0020
- H3BO3
- 0,0024
- Na2MoO4,2H2O
- 0,0020
- Citrato de Fe(III) H2O
- 0,0524
- EDTA
- 0,0067
- MgSO4
- 5,00
10
15
20
25
30
35
- (NH4)2S2O3
- 55,50
- Tiamina
- 0,01
- Vitamina B12
- 0,01
- Biotina
- 0,10
- Glucosa
- 500
Posteriormente, los fermentadores de 2,5 litros (Pierre Guerin) se cargaron con 600 ml de medio mínimo (B2) y se inocularon a una concentración de biomasa de 2,1 g.l-1 con un volumen de precultivo en el intervalo entre 55 y 70 ml.
La temperatura del cultivo se mantuvo constante a 37ºC y el pH se mantuvo al valor de trabajo (6,8) por adición automática de disoluciones de NH4OH (NH4OH al 10% durante 9 horas y 28% hasta el final del cultivo). La velocidad de agitación inicial se ajustó a 200 rpm durante la fase discontinua y se aumentó hasta 1000 rpm durante la fase semicontinua. El caudal de aire inicial se ajustó a 40 Nl.h-1 durante la fase discontinua y se aumentó a 100 Nl.h-1 al comienzo de la fase semicontinua. La concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en valores entre 20 y 40%, preferiblemente 30% de saturación, aumentando la agitación.
Cuando la masa celular alcanzó una concentración cercana a 5 g.l-1, se inició la fase semicontinua con un caudal inicial de 5 ml.h-1. La disolución de alimentación se inyectó durante 14 horas con un perfil sigmoideo con un caudal creciente que alcanzó 27 ml.h-1 después de 26 horas. Las condiciones de alimentación precisas se calcularon mediante la siguiente ecuación:
donde Q(t) es el caudal de alimentación en ml.h-1 para un volumen de lote de 600 ml.
Para 14 hora, los parámetros eran: p1 = 1,80, p2 = 22,40, p3 = 0,27, p4 = 6,50 y después desde las 14 h a las 26 horas, los parámetros eran p1 = 2,00, p2 = 25,00, p3 = 0,40, p4 = 9,00.
Después de 26 horas de fase semicontinua, se detuvo el bombeo de la disolución de alimentación y el cultivo se detuvo tras agotarse la glucosa.
Los aminoácidos extracelulares se cuantificaron por HPLC después de derivatización con OPA/Fmoc y otros metabolitos relevantes se analizaron usando HPLC con detección refractométrica (ácidos orgánicos y glucosa) y GC-MS después de sililación.
Tabla 10: Rendimientos de metionina (YMet) en % de g de metionina por g de glucosa, producida en cultivo semicontinuo por la cepa 2 y cepa 1. La cepa 2 se cultivó usando diferentes concentraciones de IPTG. Para la definición del rendimiento de metionina/glucosa véase más adelante. DE indica la desviación estándar para los rendimientos que se calcularon basándose en varias repeticiones (N = número de repeticiones)
- Cepa
- Condiciones YMet
- Cepa 1
- No IPTG (N = 34) 22,06 ± 1,02
- Cepa 2
- IPTG 20 µM en medio discontinuo -IPTG 20 µM en medio semicontinuo (N = 2) 24,13 ± 2,31
- Cepa 2
- IPTG 20 µM en medio discontinuo -IPTG 80 µM en medio semicontinuo (N = 1) 23,11
Como puede verse en la tabla 10, independientemente de la concentración de IPTG aplicada durante el cultivo de la cepa 2, la sobreexpresión de ptsG mejora significativamente la producción de metionina. Una sobreexpresión constitutiva del gen ptsG en la cepa 2 (condiciones de inducción: IPTG 20 µM en medio discontinuo -IPTG 20 µM en medio semicontinuo) son las mejores condiciones para potenciar el rendimiento de la metionina.
La inducción de la expresión de ptsG se comprobó por qPCR. Los niveles de ARNm de ptsG eran mucho mayores en las cepas 2 y 3 con IPTG que en la cepa de control 1. Véanse los resultados en la figura 1.
Tras la sobreexpresión de ptsG, la cepa 2 no acumula glucosa durante el cultivo ni al final del mismo. Al contrario, la cepa 1 que tenía una importación de glucosa de tipo natural, muestra una fuerte acumulación de glucosa después de 25 h de cultivo. La concentración de glucosa residual alcanza más de 10 g/l para la cepa 1 y menos de 3 g/l con la cepa 2.
La mejora de la importación de glucosa no solo mejora la producción de metionina, sino que también mejora la
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