ES2657713T3

ES2657713T3 - Ensayo de competición

Info

Publication number: ES2657713T3
Application number: ES11738269.7T
Authority: ES
Inventors: Hugh Carr Smith; Graham Mead; Arthur Randall Bradwell
Original assignee: Binding Site Group Ltd
Current assignee: Binding Site Group Ltd
Priority date: 2010-07-19
Filing date: 2011-07-19
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2031-07-19
Also published as: EP2596367A1; EP2596367B1; WO2012010881A1; US10845362B2; GB201012049D0; US20130217149A1

Abstract

Un método para detectar cadenas ligeras libres (CLL) o inmunoglobulinas intactas en una muestra que comprende incubar la muestra con el anticuerpo anti CLL, o anticuerpos específicos de clase de cadena pesada-tipo de cadena ligera, o fragmentos de dichos anticuerpos, y una cantidad conocida de CLL o inmunoglobulina intacta y detectar la unión del anticuerpo con la cantidad conocida de CLL o inmunoglobulina, caracterizado por que el método comprende las etapas de: (i) mezclar la muestra de suero con anticuerpo anti CLL, o anticuerpos específicos de clase de cadena pesada10 tipo de cadena ligera, o un fragmento de los mismos; (ii) incubar la muestra de suero con el anticuerpo anti CLL o anticuerpos específicos de clase de cadena pesadatipo de cadena ligera, o fragmentos de los mismos para formar una mezcla incubada; (iii) medir la absorbancia óptica o dispersión de una fuente de luz, de la mezcla incubada para producir una lectura de control; (iv) mezclar una cantidad predeterminada de partículas recubiertas con una cantidad conocida de CLL o inmunoglobulina intacta, con la mezcla incubada; (v) medir la formación de complejos de las partículas recubiertas con el anticuerpo anti CLL o anticuerpos específicos de clase de cadena pesada-tipo de cadena ligera, o fragmentos de los mismos; y (vi) comparar la formación de los complejos con una curva de calibración predeterminada de formación de complejo con concentraciones conocidas de CLL o inmunoglobulina intacta.

Description

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a diversas relaciones de proteína:biotina) se usa después para recubrir las perlas y cualquier sitio de estreptavidina no unido restante se inactiva con la adicción de biotina libre. Las perlas se lavan después en GBS 0,1 M y se diluyen con agua para proporcionar un reactivo de trabajo con contenido de sólidos de perlas de látex típicos de 0,133 % (g/100 g). Los resultados descritos a continuación usan reactivo preparado por este proceso.

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Principio de ensayo y secuencia de reacción

El reactivo R1 entra en una cubeta de reacción y se mezcla con la muestra. Hay un periodo de incubación antes de la adición del reactivo R2 y este se ha denominado “prerreacción”. Durante esta prerreacción, cualquier antígeno 10 presente en la muestra es capaz de reaccionar con el anticuerpo F(ab)2 y formar complejos inmunitarios. Debido a la escasez del antígeno, se forman complejos inmunitarios pequeños que no se detectan por instrumentación convencional que usa una longitud de onda incapaz de detectar complejos de este tamaño. La adición del reactivo R2 significa que cualquier anticuerpo restante se usa para reticular con la perla de poliestireno y formar complejos suficientemente grandes para detectar a la longitud de onda utilizada. Por lo tanto, cuando más antígeno esté

15 presente en la muestra, menos señal se generará, lo que significa que el cambio de la señal es inversamente proporcional a la presencia de antígeno. Este concepto está representado esquemáticamente en los siguientes diagramas:

Figura 1. No hay ningún antígeno presente en la muestra y todo el anticuerpo se usa para reticular con el antígeno 20 unido a látex, dando como resultado una cantidad de señal alta.

Figura 2. La adición de cantidades pequeñas de antígeno en la muestra significa que el anticuerpo está “cubierto” en la primera reacción y es incapaz de reticular con la perla, reduciendo la cantidad de señal generada.

25 Figura 3. La adición de grandes cantidades de antígeno en la muestra provoca que todo el anticuerpo se cubra en la primera reacción. No queda ningún anticuerpo que sea capaz de provocar reticulación de la perla, y no se produce ningún cambio en la señal.

La Figura 4 muestra una curva de calibración para CLL kappa usando CLL kappa unida a partículas. Los datos de 30 precisión a continuación muestran la reproducibilidad del ensayo a intervalo alto y bajo.

Nivel bajo: Nivel alto

1: 0,743 9,211

2: 0,728 9,401

3: 1,051 10,042

4: 1,212 10,059

5: 0,617 9,939

6: 0,836 10,048

7: 0,680 10,321

8: 0,740 9,726

9: 0,877 9,496

10: 0,597 9,822

DT: 0,19 0,35

Media (mg/l): 0,81 9,81

CV: 24,07 % 3,54 %

La Figura 5 muestra una curva de calibración para CLL lambda usando CLL lambda unida a partículas lambda. Los datos de precisión para el ensayo se muestran a continuación.

Nivel bajo: Nivel alto

1: 0,58 7,30

2: 0,57 6,99

3: 0,76 7,63

4: 0,71 7,02

5: 0,54 6,99

6: 0,53 7,01

7: 0,57 7,54

8: 0,68 7,08

9: 0,54 7,04

DT: 0,08 0,25

Media (mg/l): 0,61 7,18

CV: 13,95 % 3,49 %

Las Figuras 6 y 8 muestran curvas de calibración que se han usado para determinar los valores de CLL kappa y

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lambda respectivamente, para las mismas muestras de suero, para mostrar correlación con ensayos de la técnica anterior. Aunque los calibradores no se han asignado completamente, los valores corresponden muy bien con valores determinados usando ensayos de la técnica anterior (R2 de kappa = 0,66, R2 de lambda = 0,78). Figuras 7 y

9. Los valores de R2 altos muestran que se está analizando el mismo parámetro y al considerar las correlaciones de CLL tanto kappa como lambda juntas indica tanto una buena sensibilidad como una buena especificidad para el método de ensayo.

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Claims

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