ES2657986T3 - Método y kit para la medición de muy alta sensibilidad de proteína y ácido nucleico y un novedoso sustrato enzimático - Google Patents

Método y kit para la medición de muy alta sensibilidad de proteína y ácido nucleico y un novedoso sustrato enzimático Download PDF

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Abstract

Un metodo de ensayo de la actividad enzimatica que usa un complejo anticuerpo-enzima, en el que se usan glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa como una enzima del complejo anticuerpo-enzima y un derivado de androsterona representado por la siguiente formula (1) se usa como un sustrato de la enzima,**Fórmula** en la que X representa un resto de azucar, el resto de azucar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrogeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando el derivado de androsterona representado por la formula (1) se usa como un sustrato de glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa y una cuantificacion de un producto de la reaccion enzimatica se realiza produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reaccion de ciclacion enzimatica usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producidos, o midiendo el cambio del color del tio-NADH y/o tio-NADPH producidos.

Description

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DESCRIPCION
Método y kit para la medición de muy alta sensibilidad de proteína y ácido nucleico y un novedoso sustrato enzimático
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a un ensayo de alta sensibilidad de proteína y ácido nucleico y a un kit que usa un inmunoensayo enzimático y un ensayo de sonda de ácido nucleico. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método que permite un ensayo de sensibilidad de proteínas o ácidos nucleicos ultra alta a la vez que evita la interferencia causada en el método de ciclación con tio-NAD usado en este ensayo de actividad enzimática empleando un sustrato enzimático específico para una enzima marcada por un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico. La presente invención se refiere además a novedosos sustratos enzimáticos que se pueden usar en el ensayo de alta sensibilidad anterior de proteína y ácido nucleico y un kit.
[Tecnología antecedente]
Aunque el método de radioinmunoensayo (RIE) se establece técnicamente como una medición de alta sensibilidad de proteína o ácido nucleico, en las circunstancias actuales, es imposible cambiar el método anteriormente mencionado por uno que tenga una sensibilidad alta más allá de un grado de 10-16moles además de la mejora de la sensibilidad de un equipo de detección. y mediante el método RIE, el lugar de medición no se limita solo a una instalación experimental de isótopos, sino que la fecha de caducidad de los reactivos será extremadamente corta y la sensibilidad de los reactivos disminuirá rápidamente, debido al uso del nucleido de un corto período de tiempo. También tiene el problema del problema de los desechos radiactivos en el método de medición de la radiación. Especialmente, el problema del abandono en el caso de usar un nucleido de larga duración es grave. Por lo tanto, la investigación y el desarrollo de la medición de alta sensibilidad de proteína o ácido nucleico se han desarrollado considerando «no radioactivo» como una palabra clave recientemente. Por tanto, la mayor parte de la investigación y el desarrollo y la mejora técnica sobre el método RIE no se realiza en las condiciones reales.
Se reemplazó una medición de alta sensibilidad por el método RIE, que es un inmunoensayo enzimático (método ELISA) en la medición de proteínas ( Figura 1 ), y el método de RCP en la medición de ácido nucléico. El inmunoensayo enzimático puede transcurrir a una alta sensibilidad (10-15 moles) mediante el método de fluorescencia y el método de emisión de luz desde una sensibilidad de 10-13 moles mediante el ensayo colorimétrico en el desarrollo inicial, y el desarrollo y la mejora del dispositivo de medición exclusivo también están avanzando. Sin embargo, la sensibilidad se ha llegado a limitar, solo la operación de medición es simple.
Además, en el método RCP de la medición de alta sensibilidad del ácido nucleico, se considera que el problema de la detección de la señal específica para la molécula diana, la eficiencia de la amplificación y el estado del producto de la RCP llegan a unos niveles estables, la cuantificación del ácido nucleico es difícil estrictamente.
El inmunoensayo enzimático que usa el complejo anticuerpo-enzima y el ensayo de la sonda de ácido nucleico que usa un complejo de ácido nucleico-enzima usando el ensayo de ciclación con tio-NAD ya es conocido. (Consulte el documento WO2008/117816 (documento de patente 1))
[Divulgación de la invención]
[Problemas a resolver por la invención]
De acuerdo con el método del documento de patente 1, el inmunoensayo enzimático se combinó con el método de ciclación enzimática que usa como sustrato el que produce la enzima marcadora que usa el inmunoensayo enzimático, y el tio-NAD(P)H como sustancia señal se amplifica de un modo geométrico-progresivo y mediante un método de ensayo colorimétrico, da como resultado la cuantificación de proteína o ácido nucleico y la detección de ácido nucleico. Sin embargo, reveló que no necesariamente una alta reactividad de la enzima y el sustrato marcados, y el sustrato de la enzima de ciclación marcada inhibe parcialmente la reacción enzimática en la reacción de ciclación enzimática.
El objetivo de la presente invención es en el inmunoensayo enzimático, el método de combinarse con el método de ciclación que usa como sustrato el que produce la enzima marcada usada en el inmunoensayo enzimático, que resuelve el problema anteriormente mencionado del sustrato de la enzima marcada, y el uso de un método de ensayo colorimétrico, el método de detección de alta sensibilidad de proteína o ácido nucleico mediante el ensayo colorimétrico del método más fácil, y que proporciona el ensayo de aumento de la sensibilidad al grado geométrico- progresivo. En particular, se proporciona el método de ensayo que aumentó la sensibilidad más de 10'18 moles.
El presente inventor ha logrado obtener un compuesto como sustrato de la enzima marcada que resuelve el problema mencionado anteriormente o que proporciona el nuevo compuesto y, por lo tanto, al usar estos sustratos, ha logrado resolver el problema anteriormente mencionado, por tanto, la presente invención se ha completado.
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[Medios de resolución de los problemas]
La presente invención es la siguiente:
[1] Un método de ensayo de la actividad enzimática que usa un complejo anticuerpo-enzima, en el que la glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa se usa como una enzima del complejo anticuerpo- enzima, y
un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1) se usa como un sustrato de la enzima,
imagen1
en la que
X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa, e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2
representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) se usa como un sustrato de la glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa, y se realiza una cuantificación de un producto de la reacción enzimática produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color del tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
[2] Un método de ensayo de una sonda de ácido nucleico que usa una sonda de ácido nucleico marcada con enzima, en el que
la glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa se usa como una enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima, y
un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1) se usa como un sustrato de la enzima,
imagen2
en la que
X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) se usa como un sustrato de la glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa, y
se realiza una cuantificación de un producto de reacción de la reacción enzimática produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP, e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color del tio-NADH y/o tio-NADPH producido.
[3] Un kit de inmunoensayo enzimático que comprende los reactivos (1) a (5) descritos a continuación:
1) glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa que está marcada con un anticuerpo específico
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para un antígeno de proteína diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
imagen3
(en la que X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6),
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED)
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
[5] Un kit de ensayo de una sonda de ácido nucleico que comprende los reactivos (1) a (5) siguientes:
(1) glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa marcada con una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
imagen4
(en la que X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6),
(3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP.
[6] Un derivado de androsterona representado por la fórmula (1) a continuación:
imagen5
en la que, las definiciones de X, Y1 e Y2 son las siguientes:
X representa uno de un resto de azúcar seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa
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y mañosa, Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
[Efectos de la invención]
De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar un inmunoensayo enzimático que potencia la
sensibilidad del ensayo a 10-18 moles o más, y medir una proteína diana o un ácido nucleico diana con alta
sensibilidad.
[Breve descripción de los dibujos]
La Figura 1 es el principio del ensayo del inmunoensayo enzimático (método ELISA);
la Figura 2 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo comparativo 1;
la Figura 3 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo comparativo 2;
la Figura 4 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo comparativo 3;
la Figura 5 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo comparativo 4;
la Figura 6 son compuestos de ejemplo de algunos 3a-hidroxiandrostano.
la Figura 7 es la curva de calibración de la fosfatasa alcalina obtenida en el Ejemplo 1;
la Figura 8 es la curva de calibración de la fosfatasa alcalina obtenida en el Ejemplo 2;
la Figura 9 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 3;
la Figura 10 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 4;
la Figura 11 es la curva de calibración de la p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 5;
la Figura 12 es la curva de calibración de la p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 6;
la Figura 13 es la curva de calibración de la p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 7;
la Figura 14 es la curva de calibración de la p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 8;
la Figura 15 es la curva de calibración de la p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo 9;
la Figura 16 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 10;
la Figura 17 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 11;
la Figura 18 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 12;
la Figura 19 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 13;
la Figura 20 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo de referencia 7;
la Figura 21 es la curva de calibración de la p-galactosidasa obtenida en el Ejemplo de referencia 8;
la Figura 22 es la curva de calibración de la peroxidasa de rábano rusticano obtenida en el Ejemplo 14 y
la Figura 23 es la curva de calibración de Pumilio obtenida en el Ejemplo 15.
[Mejor modo de llevar a cabo la invención]
[Sustrato novedoso]
La presente invención se refiere a un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1).
imagen6
en la que, las definiciones de X, Y1 e Y2 se describen a continuación.
X representa un tipo de un resto de azúcar seleccionado de un grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa, Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
El grupo alcoxi C1-6 como un ejemplo de Y2
puede ser, por ejemplo, un grupo metoxi, un grupo etoxi, un grupo propoxi y similares, y el grupo alquilo C1-6 puede ser, por ejemplo, un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo iso- propilo, un grupo n-propilo, un grupo terc-butilo, un grupo n-butilo, un grupo n-pentilo, un grupo n-hexilo y similares.
El azúcar del resto de azúcar puede estar compuesto por glucosa, galactosa, fructosa o manosa, y se puede seleccionar adecuadamente dependiendo de la enzima marcadora que se usa.
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Ejemplos específicos del compuesto de la presente invención se enumeran en la Tabla 1 que se describirá a continuación. Sin embargo, la Tabla 1 incluye compuestos que pueden usarse en el método y el kit de la presente invención además de los ejemplos específicos del compuesto de la presente invención.
Estos compuestos de la presente invención se pueden sintetizar basándose en o en referencia a los métodos descritos en los ejemplos.
[Ensayo de ciclación enzimático]
La presente invención se refiere a un ensayo enzimático que usa un complejo anticuerpo-enzima, en el que se realiza una cuantificación de un producto de reacción por la enzima del complejo anticuerpo-enzima produciendo tio- NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NAdH y/o NADpH, tio-NAD y/o tio-NADP y deshidrogenasa (DH), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color del tio NADH y/o tio-NADP producido.
El complejo anticuerpo-enzima consiste en un anticuerpo específico para un antígeno de proteína diana y una enzima marcada con este anticuerpo, y se usa en el ensayo de la proteína diana anteriormente mencionada.
Además, la presente invención se refiere a un método de ensayo de una sonda de ácido nucleico que usa una sonda de ácido nucleico marcada con enzima, en el que se realiza una cuantificación de un producto de reacción por la enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP y deshidrogenasa (DH), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color del tio NaDH y/o tio-NADP producido.
La sonda de ácido nucleico marcada con enzima consiste en una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana y una enzima marcada con esta sonda de ácido nucleico, y se usa en el ensayo del ácido nucleico diana anteriormente mencionado.
En el método de la presente invención, la enzima (enzima marcadora) del complejo anticuerpo-enzima o la sonda de ácido nucleico marcada con enzima usada es galactosidasa, la glucosidasa, fructosidasa, o manosidasa. Como sustrato de la enzima anterior, se usa el derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1).
imagen7
en la que el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) se usa como sustrato de la galactosidasa, la glucosidasa, fructosidasa o manosidasa, X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa un tipo seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6. Un compuesto en el que X representa glucosa cuando Y2 representa un grupo hidroxilo, se describe en Phytochemistry, 1974, vol. 13, n.° 10, págs 2135-2142.
El ensayo de sensibilidad ultra alta de la presente invención se puede llevar a cabo de forma análoga por un inmunoensayo enzimático o por un ensayo de sonda de ácido nucleico habitual. Por ejemplo, se puede usar un portador de fase sólida, que se usa en un ensayo habitual, por ejemplo, un portador de fase sólida tal como una microplaca o un tubo de plástico, una perla magnética y similares en el que un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un sujeto se inmoviliza en la superficie.
El anticuerpo y el complejo de sonda de ácido nucleico-enzima se pueden preparar mediante un método habitual.
El anticuerpo que constituye el complejo anticuerpo-enzima puede seleccionarse de forma adecuada de los anticuerpos que se unen específicamente a un sujeto a medir mediante el inmunoensayo enzimático de la presente invención. Por ejemplo, el inmunoensayo enzimático de la presente invención se usa en un ensayo de una proteína, y en el presente documento el anticuerpo que consiste en el complejo anticuerpo-enzima es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína que es el sujeto. Además, en este caso, se usa una placa basal en la que un anticuerpo que se une específicamente a la proteína sujeto se inmoviliza en la superficie. Además, el anticuerpo que
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constituye el complejo anticuerpo-enzima y el anticuerpo inmovilizado en la placa basal puede ser un fragmento del anticuerpo. En la presente invención del inmunoensayo enzimático, el sujeto no está limitado a una proteína, y puede ser cualquier sustancia que sea un sujeto de medición de un inmunoensayo enzimático habitual además de una proteína.
En el complejo enzimático de la sonda de ácido nucleico, la sonda se puede seleccionar adecuadamente de forma análoga de las sondas complementarias a una sonda de ácido nucleico que es complementaria a un sujeto de medición.
En el método de la presente invención, la cuantificación de un producto de reacción por la enzima del complejo anticuerpo-enzima o la enzima de la sonda de ácido nucleico marcada con enzima se realiza produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP y deshidrogenasa (DH), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o midiendo el cambio del color del tio NADH y/o tio-NADP producido.
En el método de la presente invención, la concentración de cada componente puede estar en el intervalo que se describirá a continuación.
(1) Intervalo de concentración del complejo anticuerpo-enzima o la sonda de ácido nucleico marcada con enzima: 0,01 |jg/ml a 1 mg/ml
(2) Intervalo de concentración del sustrato de la enzima marcadora: 1 jM a 500 mM
(3) Intervalo de concentración del NADH y/o NADPH: 0,01 mM a 50 mM
(4) Intervalo de concentración del tio-NAD y/o tio-NADP: 0,01 mM a 100 mM
(5) Intervalo de concentración de la deshidrogenasa (DH): 0,01 U/ml a 5000 U/ml
Las condiciones de reacción pueden determinarse adecuadamente considerando el intervalo óptimo de temperatura de la enzima marcadora y la deshidrogenasa (DH). Por ejemplo, en cuanto a la temperatura de reacción, la reacción se lleva a cabo preferentemente a temperatura ambiente desde un punto de manipulación simple. Sin embargo, la reacción se puede llevar a cabo a una temperatura más alta o a una temperatura más baja que la temperatura ambiente considerando el intervalo óptimo de temperatura de la enzima marcadora y la deshidrogenasa (DH).
El tiempo de reacción puede ser un tiempo suficiente de acumulación de tio-NADH y/o tio-NADPH, para permitir el ensayo de la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producido, o la medición del cambio del color del tio-NADH y/o tio-NADPH producido. Sin embargo, la cantidad de acumulación de tio-NADH y/o tio-NADPH necesaria para el ensayo o medición varía dependiendo de las condiciones del ensayo o la medición, y puede determinarse adecuadamente dependiendo de las condiciones.
El sistema de ciclación que usa tio-NAD(P) en el sistema de ciclación enzimático es un sistema de ciclación particular que apareció hace relativamente poco. Con este sistema, se realiza la ciclación, es decir, tio-NAD(P)/tio- NAD(P)H que usa deshidrogenasa (DH) con NAD(P)/NAD(P)H como coenzima en condiciones de coexistencia de NAD(P)/NAD(P)H y su análogo, y la amplificación y la cuantificación se realizan con tio-NAD(P)H (longitud de onda de absorción máxima: 400 nm, coeficiente de absorción molar = 11.900) como sustrato de la deshidrogenasa. El principio de medición del sistema de ciclación con tio-NAD(P) es el que se describe a continuación.
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tio-NAD (P) tio-NAD(P)H (400 nm)
Sustrato (reducido)
Sustrato (oxidado)
NAD(P)H
NAD(P)
Deshidrogenasa
Mientras que el NADH muestra la absorción máxima a 340 nm (coeficiente de absorción molar = 6.200), tio- NAD(P)H muestra absorción en el intervalo visible (longitud de onda de absorción máxima: 400 nm, coeficiente de absorción molar = 11.900) y por tanto el método de ciclación con tio-NAD(P) tiene la ventaja de permitir la medición usando un popular espectrofotómetro de absorción o un lector de microplacas para la medición colorimétrica.
El uso de las ventajas de la medición en el sistema de ciclación que usa tio-NAD(P) puede realizarse usando un popular espectrofotómetro de absorción o un lector de microplacas para medición colorimétrica, algunos métodos
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convencionales basados en el aumento de la absorción de NADH, tales como un ensayo de la actividad y la cuantificación de la deshidrogenasa de un sustrato de la misma, se han mejorado por un método que usa tio-NAD. Sin embargo, todavía no se ha indicado el uso de este sistema de ciclación en la mejora de la sensibilidad como un sistema de detección tal como un inmunoensayo enzimático.
En la presente invención, la combinación de una enzima marcadora y el sistema de ciclación permite que la reacción de amplificación sea una reacción exponencial por primera vez, lo que da como resultado una mejora de la sensibilidad suficiente.
De acuerdo con el ensayo de la presente invención, como se ejemplifica en el inmunoensayo enzimático, los productos producidos con el complejo enzimático y un sustrato en combinación se usan como sustrato de la siguiente reacción de ciclación enzimática, y la absorción del tio-NAD( P)H producido por la reacción de ciclación enzimática se cuantifica colorimétricamente. La ciclación enzimática se realiza con una deshidrogenasa en esta reacción, y por tanto se puede usar un sustrato reducido o un sustrato oxidado como sustrato de la reacción de ciclación enzimática.
En la presente invención, la enzima marcadora usada como complejo enzimático, su sustrato y la deshidrogenasa usada posteriormente en la reacción de ciclación tienen las propiedades que se describen a continuación.
(1) El producto de la enzima marcadora es androsterona o un derivado de la misma;
(2) Se pueden usar enzimas de marcado disponibles en el mercado y ampliamente usadas;
(3) El número de renovación de la ciclación enzimática es excelente y
(4) la deshidrogenasa usada en esta reacción de ciclación no tiene contaminación de la enzima marcadora o actividad similar a la de la enzima marcadora.
Ejemplos de la deshidrogenasa (DH) pueden incluir, por ejemplo, 3a-hidroxiesteroide deshidrogena.
Ejemplos de una combinación representativa de la enzima marcadora, el sustrato y la deshidrogenasa para la ciclación enzimática que se pueden usar en la presente invención se describirán a continuación. Sin embargo, por supuesto, la combinación no se limita a estas combinaciones.
Tabla 1
Enzima marcada
Sustrato Deshidrogenasa
a -glucosidasa
5a-androsterona 3a-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
a -glucosidasa
5p-androsterona 3a-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
a -glucosidasa
3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3-a-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
a -glucosidasa
3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3-a-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
5a-androsterona 3-p-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
5p-androsterona 3-p-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3-p-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-glucosidasa
3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3-p-glucósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
5a-androsterona 3-p-galactósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
5p-androsterona 3-p-galactósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
3a-hidroxi-17p-metoxi-5a-androstano 3-p-galactósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
p-galactosidasa
3a-hidroxi-17p-metoxi-5p-androstano 3-p-galactósido 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa
Por ejemplo, cuando se usa 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa como la enzima de ciclación entre las combinaciones descritas anteriormente, los ejemplos de un candidato para el sustrato que se puede usar incluyen androsterona, 11p-hidroxiandrosterona, 11-oxoandrosterona y 11a-hidroxiandrosterona.
El sustrato de la ciclación es preferentemente aquel que tiene una velocidad de reacción enzimática rápida (que tienen alta actividad para el sustrato) y que reacciona incluso a una baja concentración (que tienen un valor bajo de Km). Además, una propiedad deseable en cuanto a la deshidrogenasa es la velocidad de reacción cuando se usa tio-NAD(P) como coenzima. En la reacción de deshidrogenación de la androsterona por otras muchas deshidrogenasas, la velocidad de reacción cuando se usa tio-NAD como coenzima se encuentra dentro de varios % de la velocidad de reacción cuando se usa NAD, mientras que con la 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, la velocidad de reacción con tio-NAD es aproximadamente el 59 % de la velocidad de reacción con NAD. Por tanto, la
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3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa tiene una propiedad deseable como la enzima de ciclación de la presente invención.
Además, de forma análoga, la glucosidasa, que se usa ampliamente como enzima marcadora, y el glucósido de un derivado de la androsterona, y la galactosidasa y el galactósido de un derivado de la androsterona son una combinación preferente en un punto de fácil síntesis.
A continuación se describirá un ejemplo de reacción que usa 3-p-D galactósido de androsterona.
imagen9
Un inmunoensayo enzimático que usa fosfatasa alcalina (FA) como la enzima del complejo anticuerpo-enzima se explicará a continuación como ejemplo, pero dicho ejemplo no representa la presente invención. La fosfatasa alcalina (FA) es una enzima ampliamente usada como enzima marcadora, y cuando el derivado de la androsterona, el nuevo compuesto se usa como sustrato de FA en un inmunoensayo enzimático que usa esta FA, se produce androsterona como un producto de reacción. A continuación, la 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3a-HED), cuya deshidrogenasa usa el producto de reacción de FA como sustrato, se usa en la reacción de ciclación enzimática.
La ciclación con tio-NAD permite la amplificación y la cuantificación del sustrato de la deshidrogenasa en una eficiencia de cientos de ciclos por minuto si se selecciona una reacción de deshidrogenasa adecuada. Por consiguiente, la actividad de la enzima que presenta dicho sustrato como producto de reacción puede determinarse mediante la ciclación con tio-NAD con sensibilidad ultra alta.
[Kit de ciclación enzimática]
La presente invención abarca un kit para el método de ciclación enzimática que incluye una enzima marcada con un portador reactivo, un sustrato del mismo, una enzima para la reacción de ciclación y tio-NAD y NADH como una coenzima de la misma tal como se define en las reivindicaciones. El portador reactivo representa un anticuerpo, una sonda de ácido nucleico, que tiene una actividad de unión a un sujeto de medición.
Más específicamente, la presente invención se refiere además a un kit para el método de ciclación enzimática que incluye una enzima marcadora, un sustrato de la misma, una enzima para la reacción de ciclación y tio-NAD y NADH como una coenzima de la misma.
El kit de la presente invención es un kit de inmunoensayo enzimático que incluye los reactivos (1) a (5) siguientes.
(1) glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa, cuyas enzimas están marcadas con un anticuerpo específico para un antígeno de proteína diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima,
(3) deshidrogenasa (DH),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP
Además, la presente invención es un kit de medición de una sonda de ácido nucleico, que incluye los reactivos (1) a
(5) siguientes.
(1) glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa, cuyas enzimas están marcadas con una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana,
(2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima,
(3) deshidrogenasa (DH),
(4) NADH y/o NADPH, y
(5) tio-NAD y/o tio-NADP
Para la enzima marcadora, la deshidrogenasa (DH) y el derivado de androsterona representado por la fórmula (1),
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que se pueden usar son los descritos anteriormente en el método de la presente invención tal como están.
El kit de la presente invención puede ser un anticuerpo comercial marcado con enzima y similares en combinación con los reactivos que constituyen este kit. Este kit puede usarse en un inmunoensayo enzimático que usa el método de ciclación enzimática.
[Ejemplos]
En lo sucesivo en el presente documento, se describirá la presente invención basándose en los ejemplos. Sin embargo, dichos ejemplos se pueden modificar de diversas maneras en el nivel técnico de este campo.
En lo sucesivo en el presente documento, la presente invención se describirá más específicamente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos siguientes que se refieren a la fosfatasa alcalina o peroxidasa no están de acuerdo con la presente invención, pero se muestran de prueba del principio. Solo los ejemplos que se refieren a la deshidrogenasa y a los derivados de azúcar de la androsterona se considerarán acordes con la presente invención
Ensayo de la fosfatasa alcalina y el Pumilio usando la ciclación con tio-NAD de un sistema de fosfatasa alcalina (FA) y androsterona 3-fosfato (A3P) como sistema de detección.
Ejemplo de referencia 1
Fabricación del anticuerpo marcado con FA
Un anticuerpo monoclonal derivado de ratón que tiene reactividad específica de antígeno se diasilizó tres veces con una solución tampón de ácido cítrico 0,1 M (pH 3,5) durante 30 minutos. La solución de anticuerpo se añadió con pepsina a 0,5 % con respecto a la cantidad del anticuerpo, se dejó a 37 °C durante 1 hora, y después se ajustó a pH neutro con solución tampón Tris 1,5 M (pH 8,8). Esta solución de reacción mezclada se filtró en gel usando una columna llena de Superdex 200 (Amersham Biosciences, Inc.), para producir F(ab')2.
FA se marcó mediante el kit de marcado de FA (DOJINDO LABORATORIES) usando 100 g de este F(ab')2.
Ejemplo de referencia 2
Preparación de un portador insoluble inmovilizado con el anticuerpo 1
Una solución de un anticuerpo policlonal procedente de cobayas que tiene reactividad específica de antígeno disuelto en una solución tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) en una concentración de 100 pg/ml, se añadió a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) de 50 pl cada uno, y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se recogió la solución de anticuerpo. Se añadió 300 pl de TBS que contenía albúmina de suero bovino (ASB) al 2 % y se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas para realizar el tratamiento de bloqueo, para producir una microplaca inmovilizada con anticuerpo.
Ejemplo de referencia 3
Preparación de un portador insoluble inmovilizado con el anticuerpo 2
Una solución de un anticuerpo policlonal procedente de cobayas que tiene reactividad específica de antígeno disuelto en una solución tampón de carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6) en una concentración de 10 pg/ml se añadió a cada pocillo de una microplaca de fondo plano (Nunc A/S) de 50 pl cada uno, y se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se eliminó por succión, se añadió 300 pl de TBS que contenía albúmina de suero bovino (ASB) al 0,1 % y se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas para realizar el tratamiento de bloqueo, y se lavó con TBS que contenía 0,05 % de Tween 20, para producir una microplaca inmovilizada con anticuerpo.
<Ejemplo comparativo 1> Ensayo de Pumilio mediante un método de una etapa usando 5a-androsterona 3-fosfato
Solución de ensayo de reacción
Solución tampón de glicina 0,2 M (pH 8,8) tio-NAD 1,5 mM NaDH 1 mM
5a-androsterona 3-fosfato 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide dehidrogenasa
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Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50, 100 y 200 ng/ml de Pumilio Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado con el método del Ejemplo de referencia 2, se añadió 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenía una solución de ASB al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia convencional) en un intervalo de 0 a 200 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20. La microplaca se añadió con 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenía la solución de ASB al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con FA preparado con el método del Ejemplo de referencia 1 en una concentración de 2,5 jg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20, y se lavó adicionalmente con TBS. A continuación, se añadió 100 jl de la solución de ensayo de reacción a cada pocillo, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de la absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia convencional. La línea recta obtenida que depende de la concentración se muestra en la Figura 2.
En el presente documento, la mala reactividad de la enzima (fosfatasa alcalina) con el sustrato (androsterona 3- fosfato), y la inhibición del sustrato en la reacción de ciclación dio problemas, y por tanto el método de dos etapas en el que la reacción de la enzima y la reacción de ciclación están divididas, fue probado. Además, se descubrió que la 3a-hidroxiesteroide deshidrogenasa, una enzima en la reacción de ciclación, tenía actividad fosfatasa, y era una causa del blanco, y por tanto se determinó usar una solución tampón que contenía ácido fosfórico en el momento de la reacción de ciclación del método de dos etapas.
<Ejemplo comparativo 2>
Ensayo de Pumilio mediante el método de dos etapas usando 5a-androsterona 3-fosfatato Solución de ensayo de reacción A
Una solución tampón Tris 0,1 M (pH 8.3)
MgCl2 1 mM
5a-androsterona 3-fosfato 0,1 mM Solución de ensayo de reacción B
Una solución tampón de glicina 0,2 M (pH 9,6) que contiene
hidrógeno fosfato de disodio 0,2 M
tio-NAD 3 mM
NaDH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide dehidrogenasa Muestra de ensayo
0,5, 0,75, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 20, 50, 75 y 100 ng/ml de Pumilio Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de referencia 3, se añadió 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenía una solución de ASB al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia convencional) en un intervalo de 0 a 100 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20. La microplaca se añadió con 50 jl de TBS (pH 7,5) que contenía la solución de ABS al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con FA preparado en el método del Ejemplo de referencia 1 en una concentración de 2,5 jg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20, y se lavó adicionalmente con TBS. A continuación, se añadió 50 jl de la solución de ensayo de reacción A a cada pocillo, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió 50 jl de la solución de ensayo de reacción B al pocillo, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de la absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia convencional. La línea recta obtenida que
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depende de la concentración se muestra en la Figura 3.
Aunque se probó el método de dos etapas, la sensibilidad no aumentó tanto como se esperaba, y por tanto, se determinó usar 5p-androsterona 3-fosfato, que tiene una estructura diferente de la de 5a-androsterona 3-fosfato usada hasta ahora, con el fin de mejorar la reactividad con fosfatasa alcalina.
<Ejemplo comparativo 3> Ensayo de Pumilio mediante el método de una etapa usando 5p-androsterona 3-fosfato
Solución de ensayo de reacción
Una solución tampón Tris 0,1 M (pH 8,6)
MaCl2 0,5 mM tio-NAD 1,5 mM NaDH 0,5 mM
5p-androsterona 3-fosfato 0,5 mM
20 U/ml de 3a-hidroxiesteroide dehidrogenasa
Muestra de ensayo
0,1, 0,5, 1, 2, 5, 8, 10, 20 y 50 ng/ml de Pumilio. Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de referencia 3, se añadió 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenía una solución de ASB al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia convencional) en un intervalo de 0 a 50 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20. Se añadió 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenía la solución de ASB al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con FA preparado en el método del Ejemplo de referencia 1 en una concentración de 2,5 pg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20, y se lavó adicionalmente con TBS. A continuación, a cada pocillo, se añadió 50 pl de la solución de ensayo de reacción, respectivamente, y la absorbancia se midió durante 30 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de la absorbancia durante 30 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia convencional. La línea recta obtenida que depende de la concentración se muestra en la Figura 4.
<Ejemplo comparativo 4> Ensayo de Pumilio mediante el método de dos etapas usando 5p-androsterona 3-fosfato
Solución de ensayo de reacción A
Una solución tampón Tris 0,1 M (pH 8,3)
MaCl2 1 mM
5p-androsterona 3-fosfato 0,1 mM Solución de ensayo de reacción B
Una solución tampón de glicina 0,2 M (pH 9,6) que contiene hidrógeno fosfato de disodio 0,2 M tio-NAD 3 mM NaDH 1 mM
40 U/ml de 3a-hidroxiesteroide dehidrogenasa Muestra de ensayo
0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2,5, 5, 10, 25 y 50 ng/ml de Pumilio Método de ensayo
A una microplaca inmovilizada con el anticuerpo policlonal de cobaya anti-Pumilio preparado en el método del Ejemplo de referencia 3, se añadió 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenía una solución de ASB al 0,1 % que contenía Pumilio purificado (sustancia convencional) en un intervalo de 0 a 50 ng/ml, y la microplaca se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, la solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20. La microplaca se añadió con 50 pl de TBS (pH 7,5) que contenía la solución de ABS al 0,1 % que contenía el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Pumilio marcado con FA preparado en el método del Ejemplo de referencia 1 en una concentración de 2,5 pg/ml, y la microplaca se agitó durante 1 hora. La solución en el pocillo se eliminó por succión y, después la microplaca se lavó con TBS (pH 7,5) que contenía 0,05 % de Tween 20, y se lavó adicionalmente con TBS. A continuación, se añadió 50 pl de la solución
de ensayo de reacción A a cada pocilio, respectivamente, y la microplaca se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Posteriormente, se añadió 50 |jl de la solución de ensayo de reacción B al pocilio, y la absorbancia se midió durante 10 minutos usando un filtro de 405 nm con un lector de microplaca (MTP-500 fabricado por CORONA CORPORATION) mientras se calentaba la microplaca a 37 °C. La cantidad del cambio de la absorbancia durante 10 5 minutos se representó con respecto a las concentraciones de la sustancia convencional. La línea recta obtenida que depende de la concentración se muestra en la Figura 5.
Se descubrió que la androsterona 3-fosfato era un sustrato de la reacción de ciclación hasta el momento, y el aumento del blanco por este resultado se convirtió en un problema. Se determinó que la causa era cetona en la 10 posición 17, y por tanto se determinó usar un sustrato en el que se elimina o sustituye la cetona en la posición 17. Las 3a-hidroxiandrostanosas sintetizadas se muestran en la Figura 6. Además, los números de rotación de las reacciones de ciclación que los usan como sustrato se muestran en la Tabla 2. Entre ellos, el número de rotación de la 5a-androsterona era el máximo, y un sustrato que estaba cerca de esta era la 3a-hidroxi-17p-metoxi-5p- androstano y la 5a-dihidrotestosterona. Por tanto, un éster de fosfato de la primera, es decir, 3a-hidroxi-17p-metoxi- 15 5p-androstano 3-fosfato se sintetizó y se aplicó a la ciclación con tio-NAD.
Tabla 2: Números de rotación de las reacciones de ciclación con 3a-hidroxiandrostanosas
Ciclo/min Valor relativo (%)
5a-androsterona
623 100
5p-androsterona
384 62
5a-17-CHa
200 32
5a-17-deoxo
241 39
5a-17-CH2
308 49
5p-17-CHa
114 18
5p-17p-OCH3
458 74
5a-DHT
535 86
Glicoquenodeoxicolato (Ejemplo de referencia)
129 21

Claims (19)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
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    REIVINDICACIONES
    1. Un método de ensayo de la actividad enzimática que usa un complejo anticuerpo-enzima, en el que
    se usan glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa como una enzima del complejo anticuerpo-enzima y
    un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1) se usa como un sustrato de la enzima,
    imagen1
    en la que
    X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) se usa como un sustrato de glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa y
    una cuantificación de un producto de la reacción enzimática se realiza produciendo tio-NADH y/o tio-NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producidos, o midiendo el cambio del color del tio-NADH y/o tio-NADPH producidos.
  2. 2. Un método de ensayo de una sonda de ácido nucleico que usa una sonda de ácido nucleico marcada con enzima, en el que
    se usan glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa como una enzima de la sonda de ácido nucleico marcado con enzima y
    un derivado de androsterona representado por la siguiente fórmula (1) se usa como un sustrato de la enzima,
    imagen2
    en la que
    X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6 cuando el derivado de androsterona representado por la fórmula (1) se usa como un sustrato de glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa, y una cuantificación de un producto de reacción de la reacción enzimática se realiza produciendo tio-NADH y/o tio- NADPH por reacción de ciclación enzimática usando NADH y/o NADPH, tio-NAD y/o tio-NADP e hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED), y determinando la cantidad del tio-NADH y/o tio-NADPH producidos, o midiendo el cambio del color del tio-NADH y/o tio-NADPH producidos.
  3. 3. Un kit de inmunoensayo enzimático que comprende los reactivos (1) a (5) siguientes:
    (1) glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa que están marcadas con un anticuerpo específico para un antígeno de proteína diana,
    (2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    imagen3
    en la que X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6,
    (3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED)
    (4) NADH y/o NADPH, y
    (5) tio-NAD y/o tio-NADP.
  4. 4. Un kit de ensayo de una sonda de ácido nucleico que comprende los reactivos (1) a (5) siguientes:
    (1) glucosidasa, galactosidasa, fructosidasa o manosidasa marcadas con una sonda de ácido nucleico que se une específicamente a un ácido nucleico diana,
    (2) un derivado de androsterona representado por la fórmula (1), que es un sustrato de la enzima descrita anteriormente
    imagen4
    en la que X representa un resto de azúcar, el resto de azúcar representa uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa e Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6,
    (3) hidroxiesteroide deshidrogenasa (HED),
    (4) NADH y/o NADPH, y
    (5) tio-NAD y/o tio-NADP.
  5. 5. Un derivado de androsterona representado por la fórmula (1) siguiente:
    imagen5
    en la que, las definiciones de X, Y1 e Y2 son:
    X representa uno de un resto de azúcar seleccionado del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa y manosa, Y1 e Y2 representan juntos un grupo metileno o Y1 representa hidrógeno, e Y2 representa un grupo alcoxi C1-6 o un grupo alquilo C1-6.
    Reacción enzimática
    Fig. 1
    imagen6
    imagen7
    Enzima
    Antígeno de proteina
    marcada/ Anticuerpo marcado con enzima
    TTY
    Anticuerpo
    Placa de fase sólida
    V
    imagen8
    Amplificación y cuantificación por ciclación con tio-NAD(P)
    imagen9
    (Abs)
    0,08
    y = Q,QQ04x + 0,0055
    Rr = 0,999
    0,04
    100
    150
    200
    250
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen10
    (Abs)
    y = 0,00 34x - 0,0031
    Ff = 0,9919
  6. 0.02
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen11
    (Abs)
    y = 0,002tx- 0,0036
    R2 = 0,9997
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen12
    Abs
    0,08
    y = 0,O564x ~ 0,0006
    R2 = 0,9991
    0,04
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen13
    CONHCH^COONa
    3a-hidroxi-17B-melil-5a
    5(3-androsterona
    5a-androsterona
    androstano(5a-17-CH3)
    3a-hidroxi-17-metileno-5a- 3a-hidroxi-17B-melil-5B -
    3a-hidroxi -5a-
    androstano(5a-17-CH2) androstano(5p -17-CH3)
    androstano(5a-17-dexo)
    3a-hidroxi-17p-metoxi-5p -
    Glicoquenodeoxicolato
    5a-dihidrotestosterona
    androstano(5p -I7-OCH3)
    de sodio
    5a-DHT)
    imagen14
    de
    absorbancia
    (Abs)
    Ifi
    14
    6477x
    01
    16
    fr
    9977
  7. 0.04
    02
    Fosfatasa alcalina (pg/ml)
    imagen15
    (Abs)
    0,08
    y = 0,01 Oox + 0,0014
    Fe = 0.9978
    Fosfatasa alcalina (pg/ml)
    imagen16
    Abs
  8. 0.18
    y = 0,0722x +• 0,0172
    R2 = 0.9961
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen17
    Abs
    Y = 0,6 704x + 0,0066
    R2 = 0,9997
  9. 0.05
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen18
    (Abs)
    v = 0.0014x +.0,0008
  10. 0.06
    n = 0.9998
    100
    120
    Concentración de p-galactosidasa (pg/ml)
    imagen19
    Abs
    y - 0,004/x - u,002¿
    Fe = 0.9994
    Concentración de B-galactosidasa (pg/ml)
    imagen20
    (Abs)
    y = 0,0047x - 0,0021
    R2 = 0,9997
    Concentración de p-galactosidasa (pg/ml)
    imagen21
    Abs
    y = 0,00 37x - 0,0035
    R2 = 0,997
    Concentración de S-galactosidasa (pg/ml)
    imagen22
    (Abs)
    0,06
    y = 0,0024x - 0,0002
    Ff = 0,9993
    Concentración de 6-galactosidasa (pg/ml)
    imagen23
    (Abs)
    0,07
  11. 0.06
    0,05
  12. 0.04
    y = 0,0234x + 5E~G6
    UJJo
    R = 0.9984
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen24
    absorbancia
    (Abs)
  13. 0.0549x - 0.0045
  14. 0.06
    R2
    9919
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen25
    absorbancia
    Abs
    14
    12
  15. 0.08
  16. 0.u253x + 0.0003
    Fr
    aos
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen26
    (Abs)
    y = 0,0488x + 0,005
    = 0,9991
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen27
    (Abs)
  17. 0.035
  18. 0.025
  19. 0.015
    y = 0,0013x - 0,0004
    R2 = 0.999
    0,005
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
    imagen28
    (Abs)
    0,04
    y = 0,0058x + 0,0024
    Fe = 0,9992
    Concentración de (3-galactosidasa (pg/ml)
    imagen29
    Fig. 22
    (Abs)
    0p046x + 0,007
    Fe = 0,9978
    120
    140
    Concentración de PRR (pg/ml)
    Fig. 23
    Cambio
    de la absorbancia
    Abs
    qp728x + Op13
    R3 = 05995
    Concentración de Pumilio (ng/ml)
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