ES2659270T3 - Anticuerpo modificado, conjugado de anticuerpo y proceso de preparación de los mismos - Google Patents

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Abstract

Proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar un anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo y una o más moléculas de interés, donde dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x, donde GlcNAc es una N-acetilglucosamina, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A es un grupo azida y x es 1, 2, 3 o 4, donde dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se enlaza al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc- S(A)x, y donde dicha GlcNAc es opcionalmente fucosilada.

Description

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Anticuerpo modificado, conjugado de anticuerpo y proceso de preparación de los mismos Campo técnico de la invención
[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos modificados, en particular a anticuerpos modificados con uno o más grupos funcionales azida, alquino y/o cetona. Los anticuerpos modificados según la invención se pueden conjugar a una molécula de interés, para formar un conjugado de anticuerpo. Dicha molécula de interés puede ser, por ejemplo, una sustancia activa. La invención, por lo tanto, también se refiere a conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). La invención se refiere además a un método para la preparación de los anticuerpos modificados según la invención y a un método para la preparación de un conjugado de anticuerpo según la invención.
Antecedentes de la invención
[0002] Los conjugados de anticuerpos, es decir anticuerpos conjugados a una molécula de interés vía un conector, se conocen en la técnica. Hay gran interés por conjugados de anticuerpo donde la molécula de interés es un fármaco, por ejemplo, una sustancia química citotóxica. Los conjugados anticuerpo-fármaco se conocen en la técnica y consisten en un anticuerpo recombinante enlazado de manera covalente a una sustancia química citotóxica vía un conector sintético (S.C. Aley et al, Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 529-537). El objetivo principal de un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), también llamado inmunotoxina, es combinar la elevada especificidad de un anticuerpo monoclonal para un antígeno asociado a un tumor con la potencia farmacológica de un "pequeño" fármaco citotóxico (típicamente de 300 a 1,000 Da). Ejemplos de ADC incluyen gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg; anti-CD33 mAb conjugado a calicheamicina, Pfizer/Wyeth); brentuxmab vedotina (SGN-35, Adcetris, un ADC que actúa sobre CD30 que consiste en brentuximab, enlazado de manera covalente a MMAE (monometilauristatina), Seattle Genetics); conjugado trastuzumab-DM1 (T-DM1).
[0003] Un avance en el campo incluye la emergencia de toxinas extremadamente potentes, en particular taxanos, calicheamicinas, maitansinas, pirrolobenzodiazepinas, duocarmicinas y auristatinas. La baja toxicidad de nanomolar a picomolar de estas sustancias es una mejora del conductor principal sobre las toxinas aplicadas anteriores. Otro avance tecnológico importante implica el uso de conectores optimizados que son hidrolizables en el citoplasma, resistentes o susceptibles a las proteasas, o resistentes a las bombas de flujo de resistencia a multifármaco que se asocian con fármacos altamente citotóxicos.
[0004] Los ADC conocidos de la técnica anterior se preparan comúnmente por conjugación de la toxina del conector a la cadena lateral del aminoácido lisina o cisteína del anticuerpo, por acilación o alquilación, respectivamente.
[0005] Para las lisinas, la conjugación tiene lugar preferentemente en cadenas laterales de lisina con la máxima accesibilidad estérica, la mínima pKa, o una combinación de las mismas. La desventaja de este método es que el control del sitio de la conjugación es bajo.
[0006] Mejor control de la especificidad del sitio se obtiene mediante la alquilación de cisteínas, basado en el hecho de que típicamente no hay cisteínas libres presentes en un anticuerpo, ofreciendo así la opción de alquilar solo aquellas cisteínas que se liberan selectivamente mediante un paso reductivo o diseñadas específicamente en el anticuerpo como cisteínas libres (como en los así denominados Thiomab). La liberación de cisteína selectiva mediante reducción se realiza típicamente mediante tratamiento del anticuerpo entero con un agente reductor (por ejemplo, TCEP o DTT), lo que conduce a la conversión de un enlace de disulfuro en dos tioles libres (en su mayoría en la región de bisagra del anticuerpo). Los tioles liberados se alquilan luego con un reactivo electrofílico, típicamente basados en una maleimida fijada a una toxina del conector, lo que trasncurre generalmente rápido y con alta selectividad. Respecto a la ingeniería de una cisteína (libre) adicional en un anticuerpo, el control del sitio mejorado se logra con respecto a la ubicación de la(s) cisteína(s) adicionada(s) y no se requiere ningún paso reductivo, evitando así idealmente múltiples escisiones de enlaces de disulfuro y alquilación múltiple. También en esta estrategia, la alquilación de cisteínas libres se efectúa con química de maleimida, pero no se logra una homogeneidad completa.
[0007] A mismo tiempo, una desventaja de los ADC obtenidos vía alquilación con maleimidas es que en general los conjugados resultantes son inestables debido a la reversión de la alquilación, es decir una reacción de retro-Michael, que conduce así a la liberación de la toxina del conector del anticuerpo. La conjugación basada en alquilación de cisteína-maleimida claramente no es una tecnología ideal para desarrollos de ADC que preferiblemente no deberían mostrar liberación prematura de toxina.
[0008] Se conoce en la técnica que las azidas (grupos N3, también referidos como grupos azida) pueden sufrir cicloadición selectiva con alquinos terminales (catalizados con cobre) o con alquinos cíclicos (en virtud de la tensión anular). Los triazoles resultantes de la reacción con alquinos no son susceptibles a hidrólisis u otras vías de degradación. También se conoce en la técnica que las cetonas pueden sufrir conjugación selectiva con
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hidroxilaminas o hidracinas, dando como resultado respectivamente oximas o hidrazonas. Las oximas e hidrazonas son también relativamente inertes en condiciones neutrales, pero pueden sufrir hidrólisis a bajo pH.
[0009] Diferentes métodos para la introducción de una azida en una proteína se han revisado recientemente por van Delft et al., ChemBioChem. 2011, 12, 1309: (a) reacción de transferencia de diazo quimioslectivo, (b) conversión enzimática, (c) expresión en bacterias auxotróficas y (d) codificación genética. Las reacciones de transferencia de diazo quimioselectivo (a) tienen aplicabilidad limitada para los anticuerpos, ya que típicamente ocurren en un N- terminal de la proteína, mientras que en un anticuerpo los N-terminales de la cadena tanto ligera como pesada están en la región de unión del anticuerpo. La expresión en bacterias auxotróficas (c) y la codificación genética (d) son, aunque potentes, estrategias muy complejas para laboratorios no especializados y además no se pueden usar para la postmodificación directa de anticuerpos recombinantes existentes y no son, por lo tanto, generalmente aplicables.
[0010] Respecto a la conversión enzimática de proteínas (b), se han proporcionado diversas enzimas durante estos últimos años capaces de alcanzar tal transformación con sustratos antinaturales que contienen azida, por ejemplo, transglutaminasa, ligasa de ácido lipoico, sortasa, FGE y otros (revisado en Bertozzi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974). Sin excepción, sin embargo, estas enzimas requieren secuencias de reconocimiento específicas en la proteína, que necesitan ser diseñadas específicamente, y la conjugación se puede restringir a los terminales de la proteína.
[0011] Una estrategia potencialmente versátil que puede ser aplicable generalmente a todos los anticuerpos monoclonales implica la conjugación enzimática específica al glicano fijado a Fc, que está presente naturalmente en todos los anticuerpos expresados en cultivos celulares de mamíferos (o levadura). Diferentes estrategias basadas en este concepto se conocen en la técnica, tal como vía oxidación de la galactosa terminal o vía transferencia de ácido siálico (antinatural) a la misma fracción de galactosa. Sin embargo, para el fin de los ADC, tal estrategia es subóptima, porque los glicanos se forman siempre como una mezcla compleja de isoformas, que pueden contener niveles diferentes de galactos ilación (G0, G1, G2) y, por lo tanto, proporcionaría ADC con pobre control de la proporción fármaco-anticuerpo (DAR, véase a continuación).
[0012] La figura 1 muestra un anticuerpo que comprende un glicano en cada cadena pesada. Estos glicanos están presentes en isoformas diferentes respecto a la galactosilación (G0, G1 y G2) y la fucosilación (G0F, G1F y G2F).
[0013] En WO 2007/133855 (University of Maryland Biotechnology Institute), se describe un método quimioenzimático para la preparación de una glicoproteína o glicopéptido homogéneo, que implica una estrategia de dos etapas que causa primero el recorte del árbol de glicano casi completo (bajo la acción de endo A o endo H) que deja solo la fracción de N-acetilglucosamina central (GlcNAc) (la así denominada proteína GlcNAc), seguido de un evento de reglicosilación donde, en presencia de un catalizador que comprende endoglicosidasa (ENGasa), una fracción de oligosacárido se transfiere a la proteína de GlcNAc para producir una glicoproteína o glicopéptido homogéneo. Se describe una estrategia para glicoproteínas funcionalizadas con azida, donde una proteína GlcNAc se reacciona en presencia de ENGasa con una oxazolina tetrasacárida que contiene dos fracciones de 6- azidomanosa, introduciendo así dos azidas simultáneamente en el glicano. La glicoproteína funcionalizada con azida puede luego reaccionarse catalíticamente en una reacción de cicloadición de "química click", en presencia de un catalizador (por ejemplo, un catalizador Cu(I)) con un alquino terminal que soporta una fracción funcional X de interés. No se divulgan ejemplos reales de dicha química click.
[0014] En J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13790, Wang et al. divulgan una fijación doble eficaz de un trisacárido modificado con alquino terminal a ribonucleasa B modificada con bis-azida por química click catalizada con cobre.
[0015] En J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030, Davis et al. revelan la transferencia de oxazolinas de oligosacárido en un dominio de GlcNAc-Fc central fucosilada al igual que no fucosilada de anticuerpos intactos, en presencia de glicosintasa EndoS.
[0016] En J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308, Wang et al. revelan la transferencia de una oxazolina tetrasacárida que contiene dos fracciones de 6-azidomanosa en el dominio de GlcNAc-Fc fucosilada al igual que no fucosilada de anticuerpos intactos (Rituximab) en presencia de mutantes de glicosintasa EndoS-D233A y EndoS-D233Q. Este proceso se muestra esquemáticamente en la figura 2 y produce un anticuerpo que comprende cuatro grupos azida. La conjugación posterior del IgG modificado con azida con química click se menciona, pero no se describe.
[0017] Sin embargo, una desventaja de las estrategias de glicosintasa descritas en WO 2007/133855, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030 y J. Am. Chem. Soc. 2012, 134,12308 es la síntesis larga y compleja de las oxazolinas de oligosacárido que contienen azida requeridas. Además, las oxazolinas de oligosacárido que contienen azida comprenden dos grupos azida. Hasta la fecha, no se ha mostrado si este proceso puede ser adecuado para la introducción de solo un grupo azida en el glicano de un anticuerpo.
[0018] Qasba et al. revelar en J. Biol. Chem. 2002, 277, 20833, que las galactos iltrans fe rasas mutantes GaIT(Y289L), GalT(Y289I) y GaIT(Y289N) pueden unir enzimáticamente GalNAc a un azúcar GlcNAc no reductor (p- bencil-GlcNAc).
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[0019] WO 2004/063344 (National Institutes of Health) divulga galactosiltransferasas mutantes GaIT(Y289L), GalT(Y289I) y GaIT(Y289N). Se describe un proceso donde glicanos complejos tales como los de los anticuerpos mono clon al es (Rituxan, Remicade, Herceptin) se convierten primero en glicanos G0 en anticuerpos mediante tratamiento con galactosidasa para eliminar toda la galactosa terminal de la cadena. Estos anticuerpos G0 se someten posteriormente a GaINAc-UDP en presencia de GalT(Y289L), lo que conduce a anticuerpos con estructuras de glicano significativamente más homogéneas.
[0020] Qasba et al. revelan en Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1228 que el proceso descrito en WO 2004/063344 también procede para variantes antinaturales de GaINAc-UDP sustituidas en el grupo N-acetil. Anticuerpos monoclonales tratados con ^-Galactosidasa con una glicoforma G0 se galactosilan completamente a la glicoforma G2 después de la transferencia de una fracción de galactosa que comprende una fracción de azidoacetamida sustituida en C2 (GalNAz) a los residuos GlcNAc terminales del glicano, lo que lleva a anticuerpos sustituidos con tetraazido, es decir, dos fracciones GalNAz por cadena pesada. Este proceso se muestra esquemáticamente en la figura 3. La conjugación de dichos anticuerpos sustituidos con tetraazido a una molécula de interés no se describió. La transferencia de una fracción de galactosa que comprende un grupo ceto sustituido en C2 (C2-ceto-Gal) a los residuos GlcNAc terminales de un glicano de glicoforma G0, al igual que también se describe el enlace de C2-ceto- Gal a aminooxi biotina. En cualquier caso, se usa mutante GalT(Y289L) para la transferencia de GaINAc-UDP (o GalNAz-UDP) a los anticuerpos, pero no se describe el uso de mutantes GalT(Y289N) o GalT(Y289I).
[0021] Una desventaja del método descrito en WO 2004/063344 y Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1228 es que la conjugación de los anticuerpos sustituidos con tetraazido a una molécula de interés llevaría a un conjugado de anticuerpo con típicamente dos moléculas de interés por glicano (siempre que dicha conjugación procediera con conversión completa). En algunos casos, por ejemplo, cuando la molécula de interés es una toxina lipofílica, no se desea la presencia de demasiadas moléculas de interés por anticuerpo, ya que esto puede llevar a la formación de agregado (BioProcess International 2006, 4, 42-43).
[0022] WO 2007/095506 y WO 2008/029281 (Invitrogen Corporation) revelan un método de formación de un conjugado de glicoproteína donde la glicoproteína está en contacto con UDP-GalNAz en presencia de mutante GalT(Y289L), lo que conduce a la incorporación de GalNAz en una GlcNAc no reductora terminal de un carbohidrato de un anticuerpo. La posterior química click catalizada con cobre con un alquino terminal o ligadura de Staudinger puede después usarse para conjugar una molécula indicadora, soporte sólido o molécula portadora a la fracción de azida unida. WO 2007/095506 y WO 2008/029281 revelan además que, si ningún azúcar GlcNAc terminal está presente en el anticuerpo, se pueden usar enzimas Endo H, Endo A o Endo M para generar una cadena truncada que termina con un residuo de N-acetilglucosamina.
[0023] Los conjugados de anticuerpo conocidos en la técnica generalmente tienen varias desventajas. Para conjugados anticuerpo-fármaco, una medida para la carga del anticuerpo con una toxina se da mediante la proporción de fármaco-anticuerpo (DAR), que da el número medio de moléculas de sustancia activas por anticuerpo. Sin embargo, la DAR no da ninguna indicación con respecto a la homogeneidad de tal ADC.
[0024] Los procesos de preparación de un conjugado de anticuerpo conocidos de la técnica anterior dan lugar generalmente a un producto con una DAR de entre 1,5 y 4, pero, de hecho, tal producto comprende una mezcla de conjugados de anticuerpo con un número de moléculas de interés que varía de 0 a 8 o más alto. En otras palabras, los conjugados de anticuerpo conocidos de la técnica anterior se forman generalmente con una DAR con alta desviación típica.
[0025] Por ejemplo, la gemtuzumab ozogamicina es una mezcla heterogénea de 50 % de conjugados (de 0 a 8 fracciones de calicheamicina por moléculas de IgG con un promedio de 2 o 3, enlazadas de forma aleatoria a residuos de lisilo expuestos solventes del anticuerpo) y 50 % de anticuerpo no conjugado (Bross et al., Clin. Cancer Res. 2001, 7, 1490; Labrijn et al., Nat. Biotechnol. 2009 27, 767). Sin embargo, también para la brentuximab vedotina, T-DM1, y otros ADC en la clínica, sigue sin poder controlarse exactamente cuántos fármacos se unen a cualquier anticuerpo en concreto (proporción de fármaco-anticuerpo, DAR) y el ADC se obtiene como una distribución estadística de conjugados. Si el número óptimo de fármacos por anticuerpo es por ejemplo dos, cuatro o más, unirlos en un número previsible y en ubicaciones específicas de sitio a través de conjugación específica del sitio con una pequeña desviación típica sigue siendo problemático.
Resumen de la invención
[0026] La presente divulgación se refiere a un proceso de preparación de un anticuerpo modificado, que comprende poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho sustituyente N- acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP),
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difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP), y donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x. Opcionalmente, la GlcNAc de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x es fucosilada.
[0027] La divulgación también se refiere a un anticuerpo modificado que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x, donde GlcNAc es una N-acetilglucosamina, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se enlaza al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicha N-acetilglucosamina es opcionalmente fucosilada.
[0028] La divulgación también se refiere a un proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar el anticuerpo modificado según la invención con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de conector comprende un grupo funcional B y una o más moléculas de interés, donde dicho grupo funcional B es un grupo funcional que es capaz de reaccionar con un grupo funcional A de un sustituyente GlcNAc- S(A)x en dicho anticuerpo modificado.
[0029] La invención se refiere a un proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar el anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x, donde GlcNAc es una N-acetilglucosamina, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A es un grupo azida y x es 1, 2, 3 o 4, donde dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se conecta al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicha GlcNAc es opcionalmente fucosilada y donde dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo terminal y una o más moléculas de interés.
[0030] La invención se refiere además a un conjugado de anticuerpo obtenible mediante el proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo según la invención.
[0031] El anticuerpo modificado descrito en este documento, y el conjugado de anticuerpo y los procesos de preparación de los mismos según la invención tienen diferentes ventajas sobre los procesos, los anticuerpos modificados y los conjugados de anticuerpo conocidos en la técnica.
[0032] Como se describió anteriormente, los procesos conocidos para la conjugación de unas entidades de toxina del conector a anticuerpos todavía necesitan mejorarse, en cuanto al control tanto de especificidad del sitio como de estequiometría. A pesar de la capacidad de los ADC para alojarse en sus objetivos, la cantidad de fármaco estimada que se introduce en las células de los tumores es típicamente < 2 % de una dosis administrada. Este problema se amplifica por los resultados de conjugación imprevisibles de los ADC conocidos en la técnica. Resulta importante evitar anticuerpos infraconjugados, que reducen la potencia, al igual que especies altamente conjugadas, que pueden tener vidas medias de circulación fuertemente disminuidas, unión deficiente a la proteína objetivo y toxicidad aumentada.
[0033] Para conjugados fármaco-anticuerpo, una medida para la carga de moléculas de interés (por ejemplo, fármacos, sustancias activas) en el anticuerpo es la así llamada proporción de fármaco-anticuerpo (DAR), que da el número medio de moléculas de sustancia activas por anticuerpo, calculado a partir de una distribución estadística. El valor máximo teórico de la DAR para un tipo determinado de ADC es igual al número de sitios de anclaje. Como se describió anteriormente, los procesos de preparación de ADC conocidos de la técnica anterior suponen generalmente un producto que comprende una mezcla de conjugados de anticuerpo con un número variable de moléculas de interés presentes en cada conjugado de anticuerpo, y una DAR con una desviación típica alta.
[0034] Una de las ventajas de los anticuerpos modificados y los conjugados de anticuerpo según la invención es que estos anticuerpos y conjugados de anticuerpo son homogéneos, tanto en especificidad de sitio como en estequiometría. Dichos anticuerpos modificados y conjugados de anticuerpo se obtienen con una DAR muy cercana al valor teórico, y con una desviación típica muy baja. Esto también significa que los conjugados de anticuerpo según la invención suponen un producto más consistente para el análisis preclínico.
[0035] En una forma de realización preferida, el anticuerpo modificado y el conjugado de anticuerpo según la invención son homogéneos, tanto en especificidad del sitio como en estequiometría. Aquí, un anticuerpo o un conjugado de anticuerpo se considera homogéneo cuando la conjugación se efectúa solo en un sitio predeterminado y con una proporción de fármaco-anticuerpo predeterminada. Un conjugado de anticuerpo es heterogéneo cuando la conjugación del anticuerpo tiene lugar en sitios diferentes en el anticuerpo, lo que conduce a una mezcla de productos con proporción de fármaco-anticuerpo imprevisible. En este último caso, la proporción de fármaco- anticuerpo será un promedio del grupo entero de conjugados fármaco-anticuerpo.
[0036] En otra forma de realización preferida, el conjugado de anticuerpo según la invención tiene una DAR que está dentro del 10 % de su valor teórico.
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[0037] Otra ventaja de los procesos y los anticuerpos según la invención implica la reducción de residuos en la fabricación, mejorando así el coste de los productos de las empresas.
[0038] Además, cuando un anticuerpo modificado con azida según la invención se acopla a un conjugado de conector que incluye un grupo alquinilo, o cuando un anticuerpo modificado con alquino según la invención se acopla a un conjugado de conector que incluye una fracción de azida, vía una reacción de cicloadición, los triazoles resultantes no son susceptibles a hidrólisis u otras vías de degradación. Cuando un anticuerpo modificado con cetona según la invención se acopla a un conjugado de conector que comprende una hidroxilamina o una hidracina, las oximas o hidrazonas resultantes son también relativamente inertes en condiciones neutrales.
[0039] Ventajas adicionales son, por tanto, la estabilidad de los conjugados de anticuerpo según la invención, al igual que el proceso directo y generalmente aplicable para la introducción de un grupo azida, un grupo ceto o un grupo alquinilo en un anticuerpo.
[0040] Como se describió anteriormente, la conjugación enzimática de un azúcar antinatural a la GlcNAc terminal de un glicano oligomérico fijado a un anticuerpo, en presencia de galactosiltransfereasa Y289L mutante, como se mostró en la figura 3, se conoce en la técnica.
[0041] Hasta la fecha, sin embargo, la idoneidad de las galactosiltransferasas mutantes conocidas en la técnica para la transferencia de nucleótidos de azúcar o nucleótidos de derivado de azúcar a un sustituyente GlcNAc central en un anticuerpo, y la idoneidad de tal estrategia para la generación de conjugados de anticuerpo, no se han demostrado todavía. En los procesos conocidos en la técnica anterior, un nucleótido de azúcar o nucleótido de derivado de azúcar se transfiere a una GlcNAc terminal de un glicano de oligo o polisacárido enlazado a un anticuerpo.
[0042] Además, hasta la fecha, la idoneidad de las galactosiltransferasas mutantes conocidas en la técnica para la transferencia de nucleótidos de azúcar o nucleótidos de derivado de azúcar a azúcares internos y derivados de azúcar no se ha demostrado. Con los procesos según la invención, es ahora posible transferir un derivado de azúcar que comprende grupos funcionales tal como uno o más grupos azida, ceto y/o alquino, a un sustituyente GlcNAc central presente en un anticuerpo, con independencia de si dicha GlcNAc es fucosilada o no. Ventajosamente, la eliminación de la fucosa antes del proceso según la invención no es, por lo tanto, necesaria, ya que se puede utilizar una mezcla de anticuerpos que comprende tanto los sustituyentes GlcNAc central como GlcNAc(Fuc) central en el proceso.
Descripción de las figuras
[0043]
La figura 1 muestra glicoformas diferentes de glicanos de anticuerpo G2F, G1F, G0F, G2, G1 y G0.
La figura 2 muestra un proceso para la transferencia de un tetrasacárido que comprende dos grupos azida a un sustituyente GlcNAc central en presencia de EndoS-D233A mutante, que resulta en un anticuerpo modificado que comprende cuatro grupos azida, como se describe en J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308.
La figura 3 muestra un proceso para la transferencia de GalNAz a los residuos de GlcNAc terminales de un glicano de anticuerpo, que conduce a un anticuerpo modificado que comprende cuatro grupos azida, como se describe en Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1228.
La figura 4 muestra una forma de realización preferida del proceso de preparación de un anticuerpo modificado con azida, donde un anticuerpo opcionalmente sustituido que comprende un sustituyente GlcNAc central se reacciona con GalNAz-UDP en presencia de GalT Y289L como un catalizador.
La figura 5 muestra la desglicosilación de una mezcla de glicoformas en presencia de EndoS como un catalizador.
La figura 6 muestra una forma de realización preferida del proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, donde un anticuerpo modificado con azida se conjuga a un conjugado de conector que comprende una o más moléculas de interés.
La figura 7 muestra el esquema de reacción de la síntesis de conjugados BCN-doxorrubicina de conector no escindible 28a y 28b.
La figura 8 muestra el esquema de reacción para la síntesis de conjugado DIBAC-biotina 30. La figura 9 muestra el esquema de reacción de la síntesis de conjugado BCN-vc-PABA-doxorrubicina de conector escindible 33 empezando a partir de Fmoc-citrulina 310.
La figura 10a muestra el esquema de reacción para la síntesis de conjugados de BCN escindible a vc-PABA- MMAE (37a), vc-PABA-MMAF (37b), conjugado BCN-MMAF no escindible (38), conjugado BCN-vc-PABA- maitansinoide escindible (38) y conjugado maleimida-vc-PABA-maitansinoide (40).
La figura 10b muestra la estructura del conjugado BCN-MMAF no escindible 57.
La figura 11 muestra el esquema de reacción para la síntesis de DIBAC-vc-PABA-MMAF escindible 41.
La figura 12 muestra el esquema de reacción para la síntesis de tres conjugados ciclooctino-doxorrubicina 42-44.
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La figura 13 muestra las estructuras de tres reactivos biotinilados funcionalizados 45-47. La figura 14 muestra el esquema de reacción para la síntesis de derivados de UDP-GalNAc modificados en 2 52-54 y las estructuras de UDP-Gal (55) y UDP-GalNAc (56) modificadas con 6-azida.
La figura 15 muestra el perfil MS de (A) trastuzumab, (B) trastuzumab después del recorte con endo S, (C) después de galactosiltransferasa con UDP-GalNAz 52 y (D) después de conjugación con BCN-MMAF 37b.
La figura 16 muestra el perfil MS de IgG de plasma agrupado (A), después del recorte con endo S (B) y después de galactosiltransferasa con UDP-GalNAz 52 (C).
La figura 17 muestra el perfil MS de trastuzumab recortado con endo S, luego galactosiltransferasa con UDP- GalNAz 52 y finalmente mediante conjugación catalizada con cobre con alquino-biotina 45. La figura 18 muestra el perfil MS de trastuzumab recortado con endo S, (A) después de galactosiltransferasa con UDP-GalNAc-ina 53 y (B) después de conjugación catalizada con cobre con azida-biotina 46, que conduce a 50 % de conversión.
La figura 19 muestra el perfil MS perfil de trastuzumab recortado con endo S, (A) después de galactosiltransferasa con UDP-GalNLev 55 y (B) después de conjugación de oxima con hidroxilamina-biotina 47. La figura 20 muestra el SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (vía 1-4) o condiciones no reductoras (vía 5-8) de trastuzumab (vía 1 y 5), trastuzumab después del recorte y galactosiltransferasa con UDP-GalNAz 52 (vía 2 y 6), conjugado de trastuzumab obtenido por tratamiento de trast(GalNAz)2 con BCN-biotina 25 (vía 3 y 7) y conjugado de trastuzumab obtenido por tratamiento de trast(GalNAz)2 con alquino-biotina 45 tras reacción de click catalizada con Cu(I) (vía 4 y 8). Diferentes bandas en la vía 4 y 8 indican la formación de fragmentos covalentes y/o reducidos formados, al igual que agregación, como resultado de la conjugación de click catalizada con cobre, que están todos ausentes de la conjugación promovida por tensión en la vía 3 y 7.
La figura 21 muestra el cromatograma de exclusión de tamaño del conjugado de trastuzumab(MMAF)2 derivado de trastuzumab(GalNAz)2 y BCN-MMAF 37b.
La figura 22 muestra el perfil MS dependiente del tiempo de trastuzumab(doxorrubicina)2 derivada de 28a, en plasma humano mermado de IgG.
La figura 23 muestra el nivel de agregación de diferentes mAb o ADC no tratados o tras 5 ciclos de congelación- des congelación.
La figura 24 muestra la citotoxicidad in vitro de un rango de ADC en la línea celular SK-BR-3. La figura 25 muestra la citotoxicidad in vitro de un rango de ADC en la línea celular SK-OV-3. La figura 26 muestra la citotoxicidad in vitro de un rango de ADC en la línea celular (control) MDA-MB-231.
La figura 27 muestra el espacio libre sanguíneo de trastuzumab(MMAF)2 marcado con 111In derivado de 37b, trastuzumab(maitansinoide)2 derivado de 39, trastuzumab desglicosilado (obtenido mediante recorte de endo S de trastuzumab) y trastuzumab nativo.
La figura 28 muestra la biodistribución de trastuzumab(MMAF)2 marcado con 111In derivado de 37b, trastuzumab(maitansinoide)2 derivado de 39, trastuzumab desglicosilado (obtenido mediante recorte de endo S de trastuzumab) y trastuzumab nativo. Se inyectó a ratones 25 pg y se disecaron 21 d después de la inyección. La absorción del tejido se expresa como % Dl/g.
La figura 29 muestra la eficacia in vivo de un modelo de xenoinjerto de ratón. Los ADC que se evaluaron fueron trastuzumab conugado con N297 a vc-maitansinoide (3 mg/kg y 9 mg/kg) y se compararon con T-DM1 (9 mg/kg). Un modelo (PDX) de xenoinjerto derivado de paciente con cáncer se eligió mediante implantación subcutánea de código de tumor (HBx-13B) en ratones SHO hembra. Los tumores se midieron en el día 0, 4, 7, 11 y 14.
La figura 30 muestra la eficacia in vivo de un modelo de xenoinjerto de ratón. Los ADC que se evaluaron fueron trastuzumab conjugado con N297 a vc-maitansinoide (3 mg/kg y 9 mg/kg), trastuzumab conjugado con N297 a vc-MMAF (3 mg/kg y 9 mg/kg) y se compararon con T-DM1 (9 mg/kg). Un modelo (PDX) de xenoinjerto derivado de paciente con cáncer se eligió mediante implantación subcutánea de código de tumor (HBx-13B) en ratones SHO hembra. Los tumores se midieron en el día 0, 4, 7, 11, 14, 18 y 21 para ADC de vc-maitansinoide, T-DM1 y vehículo y en el día 0, 3, 7 y 10.
La figura 31 muestra el análisis de espectros de masas detallado de especies de proteína intacta (nanoLC-MS) que usa nanoLC acoplado a resolución ultra elevada QTOF MS (maXis 4G) de la cadena ligera (LC) de (A) trastuzumab nativo, (B) trast(GalNAz)2, (C) trast(GalNAz)2 después de conjugación con BCN-biotina 25 y (D) trast(GalNAz)2 después de conjugación catalizada con cobre con alquino-biotina 45. Mientras que el valor máximo de base es idéntico para (A)-(C), el conjugado de trastuzumab formado bajo catálisis con cobre (D) muestra un hombro claro a 23441,5 y otro a 23459,5, lo que indica la formación de cantidades significativas (> 20 %) de productos secundarios oxidados y/o desamidados.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
[0044] El verbo "comprender" usado en esta descripción y en las reivindicaciones y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitativo para significar que los artículos después de la palabra se incluyen, pero los artículos no mencionados específicamente no se excluyen.
[0045] Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que más de una unidad del elemento estén presentes, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" o "una", por lo tanto, significa normalmente "al menos uno".
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[0046] Los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden comprender uno o más centros asimétricos, y pueden existir diferentes diastereómeros y/o enantiómeros de los compuestos. La descripción de cualquier compuesto en esta descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye todos los diastereómeros, y derivados de los mismos, a menos que se indique lo contrario. Además, la descripción de cualquier compuesto en esta descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye los enantiómeros individuales, al igual que cualquier mezcla, racémica o de otro modo, de los enantiómeros, a menos que se indique lo contrario. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un enantiómero específico, debe entenderse que la invención de la presente aplicación no está limitada a ese enantiómero específico.
[0047] Los compuestos pueden ocurrir en formas tautoméricas diferentes. Los compuestos según la invención se entiende que incluyen todas las formas tautoméricas, a menos que se indique lo contrario. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un tautómero específico, debe entenderse que la invención de la presente aplicación no está limitada a ese tautómero específico.
[0048] Los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden existir además como exo y endo diastereoisómeros. A menos que se indique lo contrario, la descripción de cualquier compuesto en la descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye tanto los exo diastereoisómeros individuales como los endo diastereoisómeros individuales de un compuesto, al igual que mezclas de los mismos. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un endo o exo diastereómero específico, debe entenderse que la invención de la presente aplicación no está limitada a ese endo o exo diastereómero específico.
[0049] Además, los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden existir como isómeros cis y trans. A menos que se indique lo contrario, la descripción de cualquier compuesto en la descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye tanto el isómero cis individual como el isómero trans individual de un compuesto, al igual que mezclas de los mismos. Como ejemplo, cuando la estructura de un compuesto se representa como un isómero cis, debe entenderse que el correspondiente isómero trans o las mezclas del isómero cis y trans no se excluyen de la invención de la presente solicitud. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un isómero cis o trans específico, debe entenderse que la invención de la presente solicitud no está limitada a ese isómero cis o trans específico.
[0050] Los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden exstir además como regioisómeros. A menos que se indique lo contrario, la descripción de cualquier compuesto en la descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye los regioisómeros de un compuesto, al igual que las mezclas de los mismos. Cuando la estructura de un compuesto se representa como un regioisómero específico, debe entenderse que la invención de la presente aplicación no está limitada a ese regioisómero específico.
[0051] Los grupos alquilo no sustituidos tienen la fórmula general CnH2n+1 y pueden ser lineales o ramificados. Los grupos alquilo no sustituidos también pueden contener una fracción cíclica, y tienen así la fórmula general concomitante CnH2n-1. Opcionalmente, los grupos alquilo se sustituyen por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento. Ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, 2-propilo, t-butilo, 1- hexilo, 1-dodecilo, etc.
[0052] Un grupo arilo comprende de seis a doce átomos de carbono y puede incluir estructuras monocíclicas y bicíclicas. Opcionalmente, el grupo arilo se puede sustituir por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento. Ejemplos de grupos arilo son fenilo y naftilo.
[0053] Un grupo heteroarilo comprende de cinco a doce átomos de carbono donde de uno a cuatro átomos de carbono se sustituyen por heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. Un grupo heteroarilo puede tener una estructura monocíclica o bicíclica. Opcionalmente, el grupo heteroarilo se puede sustituir por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento. Ejemplos de grupos heteroarilo adecuados incluyen piridinilo, quinoleínilo, pirimidinilo, pirazinilo, pirazolilo, pirrolilo, furanilo, benzofuranilo, indolilo, purinilo, benzoxazolilo, tienilo, fosfolilo y oxazolilo.
[0054] Los grupos arilalquilo y grupos alquilarilo comprenden al menos siete átomos de carbono y pueden incluir estructuras monocíclicas y bicíclicas. Opcionalmente, los grupos arilalquilo y alquilarilo se pueden sustituir por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento. Un grupo arilalquilo es por ejemplo bencilo. Un grupo alquilarilo es por ejemplo 4-t-butilfenilo.
[0055] Un grupo alquinilo comprende uno o más enlaces triples de carbono-carbono. Un grupo alquinilo no sustituido que comprende un enlace triple tiene la fórmula general CnH2n-3. Un alquinilo terminal es un grupo alquinilo donde el enlace triple se localiza en una posición terminal del grupo alquinilo. Opcionalmente, el grupo alquinilo se sustituye por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento, y/o se interrumpe con heteroátomos seleccionados del grupo de oxígeno, nitrógeno y azufre. Ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo, propinilo, butinilo, octinilo, etc.
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[0056] Un grupo cicloalquinilo es un grupo alquinilo cíclico. Un grupo cicloalquinilo no sustituido que comprende un enlace triple tiene la fórmula general CnH2n-5. Opcionalmente, un grupo cicloalquinilo se sustituye por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento. Un ejemplo de un grupo cicloalquinilo es ciclooctinilo.
[0057] Un grupo heterocicloalquinilo es un grupo cicloalquinilo interrumpido por heteroátomos seleccionados del grupo de oxígeno, nitrógeno y azufre. Opcionalmente, un grupo heterocicloalquinilo se sustituye por uno o más sustituyentes especificados con más detalle en este documento. Un ejemplo de un grupo heterocicloalquinilo es azaciclooctinilo.
[0058] Un grupo (hetero)arilo comprende un grupo arilo y un grupo heteroarilo. Un grupo alquil(hetero)arilo comprende un grupo alquilarilo y un grupo alquilheteroarilo. Un grupo (hetero)arilalquilo comprende un grupo arilalquilo y un grupo h ete roa ri la l qu i lo. Un grupo (hetero)alquinilo comprende un grupo alquinilo y un grupo heteroalquinilo. Un grupo (hetero)cicloalquinilo comprende un grupo cicloalquinilo y un grupo heterocicloalquinilo.
[0059] Un compuesto (hetero)cicloalquino se define aquí como un compuesto que comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo.
[0060] Varios de los compuestos descritos en esta descripción y en las reivindicaciones pueden describirse como compuestos (hetero)cicloalquinos fusionados, es decir, compuestos (hetero)cicloalquinos donde una segunda estructura anular se fusiona, es decir se anilla, al grupo (hetero)cicloalquinilo. Por ejemplo, en un compuesto (hetero)ciclooctino fusionado, un cicloalquilo (por ejemplo, un ciclopropilo) o un areno (por ejemplo, benceno) se puede anillar al grupo (hetero)ciclooctinilo. El enlace triple del grupo (hetero)ciclooctinilo en un compuesto (hetero)ciclooctino fusionado se puede situar en cualquiera de las tres ubicaciones posibles, es decir en la posición 2, 3 o 4 de la fracción de ciclooctino (numeración según "IUPAC Nomenclature of Organic Chemistry", norma A31.2). La descripción de cualquier compuesto (hetero)ciclooctino fusionado en esta descripción y en las reivindicaciones se entiende que incluye los tres regioisómeros individuales de la fracción de ciclooctino.
[0061] Cuando un grupo alquilo, un grupo (hetero)arilo, un grupo alquil(hetero)arilo, un grupo (hetero)arilalquilo, un grupo (hetero)cicloalquinilo se sustituye opcionalmente, dichos grupos se sustituyen de manera independiente opcionalmente con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcoxi C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquinilox C2 - C12, grupos cicloalquiloxi C3 - C12, halógenos, grupos amino, grupos oxo y grupos sililo, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alqueniloxi, grupos alquiniloxi y grupos cicloalquiloxi se sustituyen opcionalmente, donde los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi se interrumpen opcionalmente por uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos sililo se representan con la fórmula (R6)3Si-, donde R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo C1 - C12, grupos alquenilo C2 - C12, grupos alquinilo C2 - C12, grupos cicloalquilo C3 - C12, grupos alcox C1 - C12, grupos alqueniloxi C2 - C12, grupos alquiniloxi C2 - C12 y grupos cicloalquiloxi C3 - C12, donde los grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos alcoxi, grupos alquenilox, grupos alquinilox y grupos cicloalquiloxi se sustituyen opcionalmente, donde los grupos alquilo, los grupos alcoxi, los grupos cicloalquilo y los grupos cicloalcoxi se interrumpen opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S.
[0062] Un anticuerpo es una proteína generada por el sistema inmunológico que es capaz de reconocer y unirse a un antígeno específico. El término anticuerpo se usa aquí en su sentido más amplio e incluye en concreto anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos y anticuerpos de cadena doble y simple. El término "anticuerpo" en este documento también se entiende que incluye anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos de unión específica a antígeno de cáncer. El término "anticuerpo" se entiende que incluye anticuerpos enteros, pero también fragmentos de un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab de anticuerpo, F(ab')2, fragmento Fv o fragmento Fc de un anticuerpo escindido, un fragmento scFv-Fc, un minicuerpo, un diacuerpo o un scFv. Además, el término incluye los derivados modificados genéticamente de un anticuerpo. Anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y anticuerpos modificados genéticamente se pueden obtener por métodos que se conocen en la técnica. Los anticuerpos comercializados adecuados incluyen, entre otros, abciximab, rituximab, basiliximab, palivizumab, infliximab, trastuzumab, alemtuzumab, adalimumab, tositumomab-I131, cetuximab, ibrituximab tiuxetan, omalizumab, bevacizumab, natalizumab, ranibizumab, panitumumab, eculizumab, certolizumab pegol, golimumab, canakinumab, catumaxomab, ustekinumab, tocilizumab, ofatumumab, denosumab, belimumab, ipilimumab y brentuximab.
[0063] El término general "azúcar" se usa aquí para indicar un monosacárido, por ejemplo, glucosa (Glc), galactosa (Gal), manosa (Man) y fucosa (Fuc). El término "derivado de azúcar" se usa aquí para indicar un derivado de un azúcar monosacárido, es decir, un azúcar monosacárido que comprende sustituyentes y/o grupos funcionales. Ejemplos de un derivado de azúcar incluyen aminoazúcares y ácidos de azúcar, por ejemplo, glucosamina (GlcN), galactosamina (GalN) N-acetilglucosamina (GlcNAc), N-acetilgalactosamina (GalNAc), ácido N-acetilneuramínico
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(NeuNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc), ácido glucurónico (GlcA) y ácido idurónico (IdoA). Ejemplos de un derivado de azúcar también incluyen compuestos aquí denominados S(A)x, donde S es un azúcar o un derivado de azúcar, y donde S comprende x grupos funcionales A
[0064] Un sustituyente N-acetilglucosamina central (sustituyente GlcNAc central) se define aquí como una GlcNAc que se conecta vía el C1 a un anticuerpo, preferiblemente vía un enlace N-glicosídico al átomo de nitrógeno amídico en la cadena lateral de un aminoácido asparagina del anticuerpo. El sustituyente GlcNAc central puede estar presente en un sitio de glicosilación nativo de un anticuerpo, pero también se puede introducir en un sitio diferente en el anticuerpo. Aquí, un sustituyente N-acetilglucosamina central es un sustituyente monosacárido, o si dicho sustituyente GlcNAc central es fucosilado, un sustituyente (Fuca1-6)GlcNAc central disacárido, referido además como GlcNAc(Fuc). Aquí, un "sustituyente GlcNAc central" no se debe confundir con una "GlcNAc central". Una GlcNAc central se define aquí como la GlcNAc interna que es parte de un poli o un oligosacárido que comprende más de dos sacáridos, es decir la GlcNAc vía la cual el poli u oligosacárido se enlaza a un anticuerpo.
[0065] Un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central tal y como se define aquí es así un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc central monosacárido tal como se ha definido anteriormente, o si dicho sustituyente GlcNAc central es fucosilado, un sustituyente GIcNAc(Fuc) central disacárido.
[0066] Si un sustituyente GlcNAc central o la GlcNAc en un sustituyente GlcNAc-S(A)x es fucosilado, la fucosa más frecuentemente se enlaza en a-1,6 al C6 del sustituyente GlcNAc central. Un sustituyente GlcNAc central fucosilado se denomina GlcNAc(Fuc) central, un sustituyente GlcNAc-S(A)x fucosilado se denomina GlcNAc(Fuc)-S(A)x.
[0067] Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a la prevención completa o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a una curación parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento" como se usa aquí, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un humano, e incluye prevenir que ocurra la enfermedad en un sujeto que puede tener predisposición a la enfermedad, pero que aún no ha sido diagnosticado que la tiene; inhibiendo la enfermedad, es decir, deteniendo su desarrollo; aliviando la enfermedad, es decir, causando la regresión de la enfermedad.
Proceso de preparación de un anticuerpo modificado
[0068] La presente divulgación se refiere a un proceso de preparación de un anticuerpo modificado, que comprende poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (un sustituyente GlcNAc central) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho sustituyente GlcNAc central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP), y donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x.
[0069] En una forma de realización preferida, el anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (sustituyente GlcNAc central) es un anticuerpo monoclonal (mAb). Preferiblemente, dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos IgA IgD, IgE, IgG e IgM. Más preferiblemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG, y de la forma más preferible dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG1. Cuando dicho anticuerpo es un anticuerpo entero, el anticuerpo preferiblemente comprende uno o más, más preferiblemente uno, sustituyentes GlcNAc central en cada cadena pesada, donde dicho sustituyente GlcNAc central es opcionalmente fucosilado. Dicho anticuerpo entero comprende así preferiblemente dos o más, preferiblemente dos, sustituyentes GlcNAc central opcionalmente fucosilados. Cuando dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple o un fragmento de un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab, el anticuerpo preferiblemente comprende uno o más sustituyentes GlcNAc central, que es opcionalmente fucosilado.
[0070] En el anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc central (es decir, la materia de inicio del proceso), dicho sustituyente GlcNAc central se puede situar en cualquier sitio en el anticuerpo, siempre que dicho sustituyente no obstaculice el sitio de unión del antígeno del anticuerpo. En una forma de realización, dicho sustituyente GlcNAc central se sitúa en el fragmento Fc del anticuerpo, más preferiblemente en el dominio Ch2. En otra forma de realización, dicho sustituyente GlcNAc central se sitúa en el fragmento Fab del anticuerpo.
[0071] En una forma de realización, el anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc central, donde dicho sustituyente GlcNAc central es opcionalmente fucosilado, tiene la fórmula (1), donde AB representa un anticuerpo, GlcNAc es N-acetilglucosamina, Fuc es fucosa, b es 0 o 1 e y es de 1 a 20.
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[0072] En una forma de realización preferida, y es de 1 a 10, más preferiblemente y es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, aún más preferiblemente y es 1,2, 3 o 4 y de la forma más preferible y es 1 o 2.
[0073] Una forma de realización del proceso según la invención donde la materia de inicio del proceso es un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc central opcionalmente fucosilado (1a, y es 1) y una forma de realización donde dicha materia de inicio es un anticuerpo que comprende dos sustituyentes GlcNAc central opcionalmente fucosilados (1b, y es 2) se muestra en el esquema 1, donde AB representa un anticuerpo y donde b es 0 o 1. S(A)x y P son tal como se ha definido anteriormente.
[0074] La modificación del anticuerpo (1a) lleva a un anticuerpo modificado que comprende un sustituyente GlcNAc- S(A)x (2) y la modificación de un anticuerpo (1b) lleva a un anticuerpo modificado que comprende dos sustituyentes GlcNAc-S(A)x (3).
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[0075] Diferentes catalizadores adecuados para el proceso según la invención se conocen en la técnica. Un catalizador adecuado para un proceso específico es un catalizador por el que el nucleótido de derivado de azúcar específico S(A)x-P en ese proceso específico es un sustrato. Preferiblemente, el catalizador se selecciona del grupo de galactosiltransferasas, más preferiblemente del grupo de (6(1,4)-galactosiltransferasas o cr(1,3)-N- galactosiltransferasas, aún más preferiblemente del grupo de ^(1,4)-galactosiltransferasas o cr(1,3)-N- galactosiltransferasas que comprende un dominio catalítico mutante.
[0076] Un catalizador adecuado es, por ejemplo, un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante a partir de una (6(1,4)-galactosiltransferasa I. Un dominio catalítico se refiere aquí a un segmento de aminoácido que se incorpora a un dominio que es capaz de catalizar el enlazado del nucleótido de derivado de azúcar específico S(A)x- P al sustituyente GlcNAc central en un proceso específico según la invención. Un dominio catalítico puede tener una secuencia de aminoácidos como se encuentra en una enzima de tipo salvaje, o tener una secuencia de aminoácidos que es diferente de una secuencia de tipo salvaje. Aquí se hace referencia a un dominio catalítico con una secuencia de aminoácidos que es diferente de una secuencia de tipo salvaje como un dominio catalítico mutante. La mutación puede por ejemplo comprender un cambio de aminoácidos único (una mutación puntual), pero también un cambio de aminoácidos múltiple (por ejemplo, de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1,2, 3 o 4, aún más preferiblemente de 1 o 2 aminoácidos), o una deleción o inserción de uno o más (por ejemplo, de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1,2, 3 o 4, aún más preferiblemente de 1 o 2) aminoácidos. Dicho dominio catalítico mutante puede estar presente en una enzima en toda su longitud, por ejemplo, una enzima j6(1,4)- galactosiltransferasa I, pero también en, por ejemplo, un fragmento de polipéptido o un polipéptido recombinante que comprende dicho dominio catalítico mutante, enlazado opcionalmente a aminoácidos adicionales.
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[0077] Aquí también se hace referencia a ^(1,4)-galactosiltransferasa I aquí como GalT. Tales dominios catalíticos de GalT mutante se describen, por ejemplo, en WO 2004/063344 (National Institutes of Health). WO 2004/063344 divulga mutantes Tyr-289 de GalT, que son referidos como Y289L, Y289N e Y289I. El método de preparación de dichos dominios catalíticos mutantes Y289L, Y289N e Y289I se describe en detalle en WO 2004/063344, p. 34,1.6 - p. 36, 1. 2.
[0078] Los dominios de GalT mutante que catalizan la formación de un enlace de glucosa-6(1,4)-N- acetilglucosamina se describen en WO 2004/063344 en p. 10, 1,25 - p. 12, 1.4. Los dominios de GalT mutante que catalizan la formación de un enlace de N-acetilgalactosamina-(6(1,4)-N-acetilglucosamina se describen en WO 2004/063344 en p. 12, 1, 6 - p. 13, 1. 2. Los dominios de GalT mutante que catalizan la formación de un enlace de N-acetilglucosamina16(1,4)-N-acetilglucosamina y un enlace de manosa-(6(1,4)-N-acetilglucosamina se describen en WO 2004/063344 en p. 12, 1, 19 - p. 14, 1. 6. Los dominios de GalT mutante descritos se pueden incluir en las enzimas de GalT de longitud total, o en moléculas recombinantes que contienen los dominios catalíticos, como se describe en WO 2004/063344 en p. 14, 1,31-p. 16. 1,28.
[0079] Otro dominio de GalT mutante es por ejemplo Y284L, descrito por Bojarová et al., Glycobiology 2009, 19, 509. La mutación en la posición 284 concierne a un residuo de tirosina.
[0080] Otro dominio de GalT mutante es por ejemplo R228K, descrito por Qasba et al, Glycobiology 2002, 12, 691, donde Arg228 se sustituye por lisina.
[0081] En una forma de realización preferida del proceso de preparación de un anticuerpo modificado según la invención, dicho catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante de una j6(1,4)- galactosiltransferasa, preferiblemente una (6(1,4)-galactosiltransferasa bovina. En otra forma de realización preferida, dicho catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante de GalT seleccionado del grupo que consiste en Y289L, Y289N, Y289I, Y284L y R228K, preferiblemente Y289L. En una forma de realización específica, el catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante de una j6(1,4)- galactosiltransferasa, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en GalT Y289L, GalT Y289N y GalT Y289I, más preferiblemente GalT Y289L o GalT Y289N, y de la forma más preferible GalT Y289L.
[0082] En otra forma de realización, el catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante a partir de una (6(1,4)-galactosiltransferasa bovina, seleccionada del grupo que consiste en GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I y GalT Y289A, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en GalT Y289F y GalT Y289M. GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I y GalT Y289A pueden ser previstas vía procesos de mutagénesis dirigidos al sitio, de una manera similar a como se describe en WO 2004/063344, en Qasba et al., Prot. Expr. Pur. 2003, 30, 219 y en Qasba et al, J. Biol. Chem. 2002, 277, 20833 para Y289L, Y289N e Y289I. En GalT Y289F el aminoácido tirosina (Y) en la posición 289 se sustituye por un aminoácido fenilalanina (F), en GalT Y289M dicha tirosina se sustituye por un aminoácido metionina (M), en GalT Y289V por un aminoácido valina (V), en GalT Y289G por un aminoácido glicina (G), en GalT Y289I por un aminoácido isoleucina (I) y en Y289A por un aminoácido analina (A).
[0083] Otro tipo de catalizador adecuado es un catalizador basado en a(1,3)-N-galactosiltransferasa (también referido como a3Gal-T), preferiblemente a(1,3)-N-acetilgalactosaminiltransferasa (también referido como a3GalNAc- T), como se describe en WO 2009/025646. La mutación de a3Gal-T puede ampliar la especificidad donante de la enzima, y hacerla una a3GalNAc-T. La mutación de a3GalNAc-T puede ampliar la especificidad donante de la enzima. Fragmentos de polipéptido y dominios catalíticos de a(1,3)-N-acetilgalactosaminiltransferasas se describen en WO 2009/025646 en p. 26, l. 18 - p. 47, l. 15 y p. 77, 1.21 - p. 82, 1. 4.
[0084] En una forma de realización, el catalizador es una galactosiltransferasa de tipo salvaje, más preferiblemente una (6(1,4)-galactosiltransferasa de tipo salvaje o una (6(1,3)-N-galactosiltransferasa de tipo salvaje, e incluso más preferiblemente una (6(1,4)-galactosiltransferasa I de tipo salvaje. Aquí también se hace referencia a j6(1,4)- Galactosiltransferasa como GalT. Aún más preferiblemente, la p(1,4)-Galactosiltransferasa se selecciona del grupo que consiste en una j6(1,4)-Gal-T1 bovina, una j6(1,4)-Gal-T1 humana, una j6(1,4)-Gal-T2 humana, una j6(1,4)-Gal-T3 humana y una j6(1,4)-Gal-T4 humana. Aún más preferiblemente, la (6(1,4)-galactosiltransferasa es una j6(1,4)-Gal-T1. Cuando el catalizador es una (6(1,3)-N-galactosiltransferasa de tipo salvaje, se prefiere una j6(1,3)-Gal-T5 humana.
[0085] Esta forma de realización donde el catalizador es una galactosiltransferasa de tipo salvaje es particularmente preferida cuando un grupo funcional A en el derivado de azúcar S(A)x está presente en el C2 o C6, preferiblemente el C6, de dicho derivado de azúcar. En esta forma de realización, se prefiere además que Su(A)x comprenda un grupo funcional A es decir, x es preferiblemente 1. P, Su(A)x y Su(A)x-P se describen con más detalle a continuación.
[0086] Por consiguiente, la divulgación por lo tanto también se refiere a un proceso de preparación de una glicoproteína modificada, donde el proceso comprende poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina (GlcNAc) central con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho catalizador es una galactosiltransferasa de tipo salvaje, donde S(A)x es un
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derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y donde x es 1, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP), y donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x.
[0087] El proceso de preparación de un anticuerpo modificado se realiza preferiblemente en una solución tamponada adecuada, tal como, por ejemplo, fosfato, solución salina tamponada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, solución salina tamponada con tris), citrato, HEPES, tris y glicina. Los tampones adecuados se conocen en la técnica. Preferiblemente, la solución tamponada es solución salina tamponada con fosfato (PBS) o tampón tris.
[0088] El proceso se realiza preferiblemente en el rango de temperatura de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 °C, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 °C, aún más preferiblemente en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 °C, y de la forma más preferible en el rango de aproximadamente 30 a aproximadamente 37 °C.
[0089] El proceso se realiza preferiblemente en el rango de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, preferiblemente en el rango de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. De la forma más preferible, el proceso se realiza en el rango de pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.
[0090] En el proceso, se puede utilizar una mezcla de anticuerpos como el anticuerpo de inicio, donde dicha mezcla comprende anticuerpos que comprenden uno o más sustituyentes GlcNAc central y/o uno o más sustituyentes GlcNAc(Fuc) central. Por ejemplo, cuando la mezcla de anticuerpos de inicio comprende un anticuerpo entero con un sustituyente GlcNAc central opcionalmente fucosilado en cada cadena pesada, el anticuerpo entero puede comprender dos sustituyentes GlcNAc central, o dos sustituyentes GlcNAc(Fuc) central, o un sustituyente GlcNAc central y un sustituyente GlcNAc(Fuc) central.
[0091] La GlcNAc en el sustituyente GlcNAc central monosacárido está en la posición terminal, mientras que la GlcNAc en el sustituyente GlcNAc(Fuc) central disacárido está en una posición interna, enlazado al anticuerpo vía el C1 y a la Fuc vía el C6. Ya que, como se describió anteriormente, dichos catalizadores enzimáticos mutantes de galactosiltransferasas son también capaces de reconocer azúcares internos y derivados de azúcar como un aceptor, el derivado de azúcar S(A)x se enlaza al sustituyente GlcNAc central en el proceso según la invención, con independencia de si dicha GlcNAc es fucosilada o no. Ventajosamente, la eliminación de la fucosa antes del proceso según la invención no es, por lo tanto, necesaria, ya que se puede usar en el proceso una mezcla de anticuerpos que comprende sustituyentes tanto de GlcNAc central como de GlcNAc(Fuc) central. Sin embargo, si se desea, la fucosa se puede quitar de cualquier sustituyente GlcNAc(Fuc) central antes del proceso según la invención, por ejemplo, por desfucosilación en presencia de ducosidasa como se conoce en la técnica.
[0092] S(A)x se define como un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo, y donde x es 1,2, 3 o 4.
[0093] Un grupo azida es un grupo funcional de azida -N3. Un grupo ceto es un grupo -[C(R7)2]oC(O)R6, donde R6 es un grupo metilo o un grupo alquilo C2 - C24 opcionalmente sustituido, R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno y R6, y o es 0 - 24, preferiblemente 0 - 10, y más preferiblemente 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6. Preferiblemente, R7 es hidrógeno. Un grupo alquinilo es preferiblemente un grupo alquinilo terminal o un grupo (hetero)cicloalquinilo tal como se ha definido anteriormente. En una forma de realización, el grupo alquinilo es un grupo -[C(R7)2]0CeC-R7, donde R7 y o son tal como se ha definido anteriormente; R7 es preferiblemente hidrógeno.
[0094] El derivado de azúcar S(A)x puede comprender uno o más grupos funcionales A Cuando S(A)x comprende dos o más grupos funcionales A, cada grupo funcional A se selecciona independientemente, es decir un S(A)x puede comprender grupos funcionales A diferentes, por ejemplo, un grupo azida y un grupo ceto, etc. En una forma de realización preferida, x es 1 o 2, más preferiblemente x es 1. En otra forma de realización preferida, el grupo funcional A es un grupo azida o un grupo ceto, más preferiblemente un grupo azida.
[0095] El derivado de azúcar S(A)x se deriva de un azúcar o un derivado de azúcar S, por ejemplo, un aminoazúcar o un azúcar derivado de otro modo. Ejemplos de azúcares y derivados de azúcar incluyen galactosa (Gal), manosa (Man), glucosa (Glc), ácido glucurónico (Gcu) y fucosa (Fuc). Un aminoazúcar es un azúcar donde un grupo hidroxilo (OH) se sustituye por un grupo amino y los ejemplos incluyen N-acetilglucosamina (GlcNAc) y N-acetilgalactosamina (GalNAc). Ejemplos de un azúcar derivado de otro modo incluyen ácido glucurónico (Gcu) y ácido N- acetilneuramínico (ácido siálico).
[0096] El derivado de azúcar S(A)x se deriva preferiblemente de galactosa (Gal), manosa (Man), N-acetilglucosamina (GlcNAc), glucosa (Glc), N-acetilgalactosamina (GalNAc), ácido glucurónico (Gcu), fucosa (Fuc) y ácido N-
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acetilneuramínico (ácido siálico), preferiblemente del grupo que consiste en GIcNAc, Glc, Gal y GalNAc. Más preferiblemente S(A)x se deriva de Gal o GalNAc, y de la forma más preferible S(A)x se deriva de GalNAc.
[0097] El uno o más grupos funcionales A en S(A)x se pueden enlazar al azúcar o derivado de azúcar S de diferentes maneras. El uno o más grupos funcionales A se puede enlazar al C2, C3, C4 y/o C6 del azúcar o derivado de azúcar, en vez de un grupo hidroxilo (OH). Debe observarse que, ya que la fucosa carece de un grupo OH en C6, si A se enlaza al C6 de Fuc, entonces A toma la posición de un átomo de H.
[0098] Cuando A es un grupo azida, se prefiere que A se conecte al C2, C4 o C6. Como se describió anteriormente, el uno o más sustituyentes de azida en S(A)x se pueden enlazar al C2, C3, C4 o C6 del azúcar o derivado de azúcar S, en vez de un grupo hidroxilo (OH) o, en caso de 6-azidofucosa (6-AzFuc), en vez de un átomo de hidrógeno. Alternativamente o adicionalmente, el sustituyente N-acetilo de un derivado de aminoazúcar se puede sustituir por un sustituyente azidoacetilo. En una forma de realización preferida S(A)x se selecciona del grupo que consiste en 2-azidoacetamidogalactosa (GalNAz), 6-azido-6-desoxigalactosa (6-AzGal), 6-azido-6-desoxi-2- a ce tam i do gal actos a (6-AzGalNAc), 4-azido-4-desoxi-2-acetamidogalactosa (4-AzGalNAc), 6-azido-6-desoxi-2- azidoacetamidogalactosa (6-AzGalNAz), 2-azidoacetamidoglucosa (GlcNAz), 6-azido-6-desoxiglucosa (6-AzGlc), 6- azido-6-desoxi-2-acetamidoglucosa (6-AzGlcNAc), 4-azido-4-desoxi-2-acetamidoglucosa (4-AzGlcNAc) y 6-azido-6- desoxi-2-azidoacetamidoglucosa (6-AzGlcNAz), más preferiblemente del grupo que consiste en GalNAz, 4- AzGalNAc, GlcNAz y 6-AzGlcNAc. Ejemplos de S(A)x-P donde A es un grupo azida se muestran a continuación.
[0099] Cuando A es un grupo ceto, se prefiere que A se enlace al C2 en vez del grupo OH de S. Alternativamente A se puede conectar al átomo de N de un derivado de aminoazúcar, preferiblemente un derivado de 2-aminoazúcar. El derivado de azúcar entonces comprende un sustituyente -NC(O)R6. R6 es preferiblemente un grupo alquilo C2 - C24, opcionalmente sustituido. Más preferiblemente, R6 es un grupo etilo. En una forma de realización preferida, S( A)x se selecciona del grupo que consiste en 2-desoxi-(2-oxopropil)galactosa (2-cetoGal), 2-N-propionilgalactosamina (2-N- propionilGalNAc), 2-N-(4-oxopentanoil)galactosamina (2-N-LevGal) y 2-N-butirilgalactosamina (2-N-butirilGalNAc), más preferiblemente 2-cetoGalNAc y 2-N-propionilGalNAc. Ejemplos de S(A)x-P donde A es un grupo ceto se muestran a continuación.
[0100] Cuando A es un grupo alquinilo, preferiblemente un grupo alquinilo terminal o un grupo (hetero)cicloalquinilo, se prefiere que dicho grupo alquinilo esté presente en un derivado de 2-aminoázucar. Un ejemplo de S(A)x donde A es un grupo alquinilo es 2-(amidoácido but-3-iónico)-2-desoxi-galactosa. Un ejemplo de S(A)x-P donde A es un grupo alquinilo se muestra a continuación.
[0101] Los compuestos de fórmula S(A)x-P, donde un monofosfato de nucleósido o un difosfato de nucleósido P se enlaza a un derivado de azúcar S(A)x, se conocen en la técnica. Por ejemplo, Wang et al., Chem. Eur. J. 2010, 16, 13343-13345, Piller et al., ACS Chem. Biol. 2012, 7, 753, Piller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5459-5462 y WO 2009/102820, revelan una serie de compuestos S(A)x-P y su síntesis.
[0102] En una forma de realización preferida, el mono o difosfato de nucleósido P en S(A)x-P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP), difosfato de timidina (TDP), difosfato de citidina (CDP) y monofosfato de citidina (CMP), preferiblemente UDP.
[0103] Diferentes ejemplos (5 - 10) de difosfatos de uridina enlazados a azúcares y derivados de azúcar, S(A)x-UDP, sustituidos con azida, cetona y alquinilo, se muestran a continuación.
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AzGalNAc-UDP (7), 4-AzGalNAz-UDP, 6-AzGalNAz-UDP, 6-AzGlc-UDP, 6-AzGlcNAz-UDP, 2-cetoGal-UDP (8), 2-N- propionilGalNAc-UDP (9, donde R6 es etilo) y 2-(amidoácido but-3-iónico)-2-desoxi-galactosa-UDP (10).
[0105] De la forma más preferible, S(A)x-P es GalNAz-UDP (5) o 4-AzGalNAc-UDP (7). La síntesis de GalNAz-UDP (5) y 6-AzGalNAc-UDP (7) se describe en Piller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5459-5462 y Wang et al., Chem. Eur. J. 201 0, 16, 133 43-13345.
[0106] La síntesis de 2-cetoGal-UDP (8) se describe en Qasba et al, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 16162, en particular en la información de apoyo.
[0107] La síntesis de 2-(amidoácido but-3-inoico)-2-desoxi-galactosa-UDP se describe en WO 2009/102820.
[0108] Como se describió anteriormente, en el proceso para la modificación de un anticuerpo según la invención, S(A)x-P puede ser cualquier nucleótido de derivado de azúcar que es un sustrato para un catalizador de galactosiltransferasa adecuado.
[0109] Una forma de realización preferida del proceso según la invención se muestra en la figura 4. La figura 4 muestra un anticuerpo monoclonal (mAb) que incluye un sustituyente GlcNAc central, opcionalmente fucosilado (b = 0 o 1), en cada cadena pesada del anticuerpo. Estos sustituyentes GlcNAc central (b = 0) y GlcNAc(Fuc) central (b = 1) se convierten en sustituyentes GlcNAc-GalNAz y GlcN Ac(Fuc)-GalNAz, respectivamente. Dicha conversión se ejecuta vía reacción con GalNAz-UDP (5) en presencia de una enzima GalT Y289L mutante como un catalizador.
[0110] La presente divulgación generalmente se refiere a un proceso de preparación de un anticuerpo modificado, donde el proceso comprende:
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(a) proporcionar un anticuerpo que incluye un sustituyente N-acetilglucosamina central (sustituyente GIcNAc central), opcionalmente fucosilado, seguido de
(b) poner en contacto dicho anticuerpo con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P ss selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP), y donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo v'a el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x.
[0111] El anticuerpo que incluye un sustituyente GlcNAc central opcionalmente fucosilado puede ser proporcionado de varias maneras. Dichos anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos modificados genéticamente, etc. pueden ser proporcionados por métodos que son conocidos para el experto en la técnica. Por ejemplo, fragmentos Fab o Fc se pueden preparar por digestión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intacta con papaína, o por expresión recombinante de las partes deseadas de una cadena pesada y ligera de inmunoglobulina.
[0112] En una forma de realización, el proceso según la invención comprende además la desglicosilación de un glicano de un anticuerpo que tiene una N-acetilglucosamina central, en presencia de una endoglicosidasa, para obtener un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central, donde dicha N-acetilglucosamina central y dicho sustituyente N-acetilglucosamina central son opcionalmente fucosilados. Dependiendo de la naturaleza del glicano, se puede seleccionar una endoglicosidasa adecuada. La endoglicosidasa se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enzimas Endo S, Endo A, Endo F, Endo M, Endo D y Endo H y/o una combinación de las mismas, la selección de la cual depende de la naturaleza del glicano. En otra forma de realización preferida, la endoglicosidasa es Endo S, Endo S49, Endo F o una combinación de las mismas. En otra forma de realización preferida, la endoglicosidasa es Endo S, Endo F o una combinación de las mismas. En otra forma de realización preferida, la endoglicosidasa es Endo S. En otra forma de realización preferida la endoglicosidasa es Endo S49.
[0113] Un glicano de un anticuerpo que tiene una N-acetilglucosamina central se define aquí como un anticuerpo que comprende un glicano que se conecta al anticuerpo v'a el C1 de una GlcNAc (la GlcNAc central) opcionalmente fucosilada. Además de dicha GlcNAc central y la Fuc opcional, dicho glicano comprende al menos un azúcar o derivado de azúcar más.
[0114] Una forma de realización preferida de dicho paso de desglicosilación del proceso se muestra en la figura 5, donde una mezcla de glicoformas de anticuerpo G2F, G1F, G0F, G2, G1 y G0, y posiblemente más glicoformas tales como glicanos triantenarios, se convierte en anticuerpos que incluyen un sustituyente N-acetilglucosamina central opcionalmente fucosilado (b es 0 o 1). Las glicoformas G2F, G1F, g0f, G2, G1 y G0 se muestran en la figura 1.
[0115] La presente divulgación, por lo tanto, también se refiere a un proceso de preparación de un anticuerpo modificado, donde el proceso comprende:
(a) desglicosilar un glicano de un anticuerpo con una N-acetilglucosamina central, en presencia de una endoglicosidasa, para obtener un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central, donde dicho sustituyente N-acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, seguido de
(b) poner en contacto dicho anticuerpo con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP), y donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo v'a el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x.
[0116] La presente invención también se refiere a un proceso de preparación de un anticuerpo modificado, donde el proceso comprende:
(a) desglicosilación de un glicano de un anticuerpo con una N-acetilglucosamina central, en presencia de una endoglicosidasa, para obtener un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central, donde dicho sustituyente N-acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho sustituyente N- acetilglucosamina central se enlaza vía un enlace N-glicosídico al átomo de nitrógeno amídico en la cadena lateral de un aminoácido asparagina del anticuerpo, y donde dicha endoglicosidasa es Endo S, Endo S49, Endo F, o una combinación de las mismas; seguido de
(b) poner en contacto dicho anticuerpo con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una
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galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP), y difosfato de citidina (CDP),
donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo v'a el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x.
[0117] En una forma de realización preferida, dicha endoglicosidasa se selecciona del grupo que consiste en Endo S, Endo F, o una combinación de las mismas. En otra forma de realización preferida, la endoglicosidasa es Endo S, Endo F o una combinación de las mismas. En una forma de realización más preferida, dicha endoglicosidasa es Endo S. En otra forma de realización preferida, dicha endoglicosidasa es Endo S49. En otra forma de realización preferida, dicha endoglicosidasa se selecciona del grupo que consiste en Endo S, Endo S49, Endo F y/o una combinación de las mismas. Más preferiblemente, dicha endoglicosidasa es Endo S o Endo S49. De la forma más preferible, dicha endoglicosidasa es Endo S o Endo F.
[0118] Endo S, Endo A Endo F, Endo M, Endo D y Endo H son conocidas para el experto en la técnica. Endo S49 se describe en WO 2013/037824 (Genovis AB). Endo S49 se aísla de Streptococcus pyogenes NZ131 y es un homólogo de Endo S. Endo S49 tiene una actividad de endoglicosidasa específica en IgG nativo y escinde una variedad mayor de glicanos Fc que Endo S.
[0119] En una forma de realización preferida, dicha N-acetilglucosamina central está presente en un sitio de N- glicosilación nativo del anticuerpo. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo es IgG y dicha N- acetilglucosamina central está presente en un sitio de N-glicosil ación nativo del IgG. En otra forma de realización preferida, el anticuerpo es IgG, dicha N-acetilglucosamina central está presente en un sitio de N-glicosilación nativo del IgG, y el sitio nativo es el sitio de N-glicosilación N297 del IgG. El sitio de N-glicosilación N297 está presente en la región Fc de la cadena pesada de un anticuerpo IgG.
[0120] Cuando dicha N-acetilglucosamina central está presente en un sitio de N-glicosilación nativo de un anticuerpo IgG, se prefiere que la endoglicosidasa se seleccione del grupo que consiste en Endo S, Endo S49 y Endo F, y una combinación de las mismas. Más preferiblemente, la endoglicosidasa es Endo S, Endo S49 o Endo F, aún más preferiblemente Endo S o Endo F, y de la forma más preferible Endo S. Como se conoce en la técnica, Endo H, Endo M, Endo F1 son menos adecuadas para la desglicosilación de un glicano que está presente en el sitio nativo de un anticuerpo IgG. En particular, son menos adecuadas para la desglicosilación de un glicano que está presente en N297.
Anticuerpo modificado
[0121] La divulgación también se refiere a un anticuerpo obtenible mediante el proceso de preparación de un anticuerpo modificado según la invención. Dicho proceso de preparación de un anticuerpo modificado, al igual que las formas de realización preferidas de los mismas, se ha descrito en detalle anteriormente.
[0122] La divulgación se refiere además a un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x, donde GlcNAc es una N-acetilglucosamina, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se enlaza al anticuerpo vía el C1 de la N- acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicha N-acetilglucosamina es opcionalmente fucosilada. A tal anticuerpo se hace referencia aquí como un anticuerpo modificado.
[0123] En una forma de realización, el anticuerpo modificado tiene la fórmula (4), donde AB representa un anticuerpo, GlcNAc es N-acetilglucosamina, Fuc es fucosa, b es 0 o 1 e y es 1 a 20, y donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1,2, 3 o 4. En una forma de realización preferida, y es de 1 a 10, más preferiblemente y es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, aún más preferiblemente y es 1,2, 3 o 4 y de la forma más preferible y es 1 o 2.
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[0124] El derivado de azúcar S(A)x en el sustituyente GlcNAc-S(A)x del anticuerpo modificado puede por ejemplo conectarse al C4 del GlcNAc vía un enlace j6(1,4)-glicosídico o al C3 de dicha GlcNAc vía un enlace cr(1,3)- glicosídico. La N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se enlaza vía el C1 al anticuerpo, preferiblemente vía un enlace N-glicosídico al átomo de nitrógeno amÍdico en la cadena lateral de un aminoácido asparagina del anticuerpo (GlcNAcp1-Asn). La GlcNAc en dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x es opcionalmente fucosilada. Si el derivado de azúcar S(A)x en el sustituyente GlcNAc-S(A)x del anticuerpo modificado se enlaza al C4 de la GlcNAc vía un enlace ^(1,4)-glicosídico o al C3 de dicha GlcNAc vía un enlace or(1,3)-glicosídico depende del catalizador que se usó en el proceso de preparación del anticuerpo modificado. Cuando el proceso se realiza en presencia de un catalizador de (6(1,4)-galactosiltransferasa, entonces ocurre la unión vía el C1 del S(A)x y el C4 de la GlcNAc vía un enlace j6(1,4)-glicosídico. Cuando el proceso se realiza en la presencia de un catalizador de cr(1,3)- galactosiltransferasa, entonces la unión ocurre vía el C1 del S(A)x y el C3 de la GlcNAc vía un enlace or(1,3)- glicosídico.
[0125] Cuando A es un grupo funcional azida, se hace referencia al anticuerpo modificado como un anticuerpo modificado con azida. Cuando A es un grupo funcional ceto, se hace referencia al anticuerpo modificado como un anticuerpo modificado con cetona. Cuando A es un grupo funcional alquinilo, se hace referencia al anticuerpo modificado como un anticuerpo modificado con alquino. Preferiblemente, el anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida o con cetona, más preferiblemente un anticuerpo modificado con azida.
[0126] En una forma de realización preferida, dicho S(A)x se deriva de un azúcar o derivado de azúcar seleccionado del grupo que consiste en galactosa (Gal), manosa (Man), N-acetilglucosamina (GlcNAc), glucosa (Glc), N- acetilgalactosamina (GalNAc), ácido glucurónico (Gcu), fucosa (Fuc) y ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico), preferiblemente Gal, GlcNAc, glucosa y GalNAc.
[0127] En otra forma de realización preferida S(A)x se selecciona del grupo que consiste en GalNAz, 6-AzGal, 6- AzGalNAc, 4-AzGalNAz, 6-AzGalNAz, 6-AzGlc, 6-AzGlcNAz, 2-cetoGal, 2-N-propionilGalNAc y 2-(amidoácido but-3- iónico)-2-desoxi-galactosa. De la forma más preferible, S(A)x es GalNAz o 4-AzGalNAc.
[0128] En otra forma de realización preferida, el anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, es decir, un grupo funcional A en S(A)x es un grupo azida. Un anticuerpo modificado con azida puede tener la estructura que se muestra a continuación, donde S(A)x, donde A es azida, y se representa como S[(Q)p-N3]x:
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b es 0 o 1; x es 1,2, 3 o 4;
S es un derivado de azúcar; p es 0 o 1;
Q es -N(H)C(O)CH2- o -CH2-; y es 1 - 20;
y donde AB es un anticuerpo, S es un azúcar o un derivado de azúcar, GlcNAc es N-acetilglucosamina. GlcNAc es opcionalmente fucosilada (b es 0 o 1).
[0129] El anticuerpo modificado con azida puede comprender de 1 a 20 sustituyentes opcionalmente fucosilados GlcNAc-S(A)x (y es de 1 a 20). Preferiblemente, y es de 1 a 10, más preferiblemente y es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, aún más preferiblemente y es 1,2, 3 o 4 y de la forma más preferible y es 1 o 2.
[0130] El valor de p y la naturaleza de Q dependen del derivado de azúcar sustituido con azida S(A)x que está presente en el anticuerpo modificado con azida. Si un grupo azida en S(A)x está presente en la posición C2, C3, o C4 del azúcar o el derivado de azúcar, es decir en vez del grupo OH del azúcar, entonces p es 0. Si un grupo azida en S(A)x es un grupo 2-azidoacetamido, es decir, S(A)x es por ejemplo GalNAz o GlcNAz, entonces p es 1 y Q es - N(H)C(O)CH2-. Si un grupo azida en S(A)x está presente en la posición C6 del azúcar o el derivado de azúcar, es decir, en vez de un grupo OH del azúcar o en caso de 6-AzFuc en vez de un átomo de H, entonces p es 1 y Q es - CH2-.
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[0131] Preferiblemente el anticuerpo modificado es un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Aún más preferiblemente dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG, y de la forma más preferible dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG1. Cuando el anticuerpo modificado es un anticuerpo entero, el anticuerpo preferiblemente comprende dos o más, más preferiblemente dos, sustituyentes GlcNAc-S(A)x, donde dichos sustituyentes GlcNAc-S(A)x son opcionalmente fucosilados. Sin embargo, si el anticuerpo modificado es un fragmento de un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab o Fc, el anticuerpo puede tener solo un sustituyente GlcNAc-S(A)x, que es opcionalmente fucosilado.
[0132] En el anticuerpo modificado, el sustituyente GlcNAc-S(A)x se puede situar en cualquier sitio en el anticuerpo, siempre que dicho sustituyente no obstaculice la unión de un antígeno al sitio de unión del antígeno del anticuerpo. En una forma de realización, dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se sitúa en el dominio Fc del anticuerpo, más preferiblemente en el dominio Ch2. En otra forma de realización, dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se sitúa en el dominio Fab del anticuerpo. En otra forma de realización, dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se sitúa en un fragmento Fab o Fc del anticuerpo.
[0133] Como se describió, el proceso de preparación del anticuerpo modificado puede proporcionar anticuerpos modificados que comprenden más de un sustituyente GlcNAc-S(A)x. El número de sustituyentes en los anticuerpos depende no solo de la naturaleza del anticuerpo que se va a modificar (por ejemplo, anticuerpo entero, cadena simple, fragmento, etc.), sino también del número de sustituyentes GlcNAc central que están presentes en el anticuerpo que se va a modificar.
Proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo
[0134] La presente invención también se refiere al uso del anticuerpo modificado según la invención en la preparación de un conjugado de anticuerpo (AC). Un conjugado de anticuerpo (AC) se define aquí como un anticuerpo que se conjuga a una molécula de interés (D) vía un conector (L). El conjugado de anticuerpo según la invención se puede conjugar a una o a más de una molécula de interés (D) vía dicho conector (L).
[0135] Una molécula de interés puede por ejemplo ser una molécula indicadora, una sustancia activa, una enzima, una proteína (no catalítica), un péptido, un oligonucleótido, un glicano, una azida o una fracción de (hetero)cicloalquinilo, preferiblemente una fracción de (hetero)cicloalquinilo bivalente o bifuncional. Otros ejemplos de una molécula de interés incluyen un compuesto de diagnóstico, un aminoácido (incluido un aminoácido antinatural), un polipéptido, una diamina de (poli)etilenglicol (por ejemplo 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano o equivalentes que comprenden cadenas más largas de etilenglicol), una cadena de polietilenglicol, una cadena de óxido de polietileno, una cadena de polipropilenglicol, una cadena de óxido de polipropileno y 1,x-diaminoalcano (donde x es el número de átomos de carbono en el alcano). En una forma de realización preferida, la molécula de interés se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido (en particular lisina), una sustancia activa, una molécula indicadora, una azida y una fracción de (hetero)cicloalquinilo. En otra forma de realización preferida, la molécula de interés se selecciona del grupo que consiste en una sustancia activa, una molécula indicadora, una azida y una fracción de (hetero)cicloalquinilo.
[0136] Una sustancia activa es una sustancia farmacológica y/o biológica, es decir una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa, por ejemplo, un fármaco o un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, ARN o ADN. Ejemplos de etiquetas de péptido adecuadas incluyen péptidos que penetran en la célula como lactoferrina o poliarginina humana. Un ejemplo de un glicano adecuado es oligomanosa.
[0137] En una forma de realización preferida, la sustancia activa se selecciona del grupo que consiste en fármacos y profármacos. Más preferiblemente, la sustancia activa se selecciona del grupo que consiste en compuestos activos farmacéuticamente, en particular compuestos de bajo a medio peso molecular (por ejemplo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1500 Da, preferiblemente de aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 Da), tales como por ejemplo citotoxinas, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, péptidos y oligonucleótidos. Ejemplos de citotoxinas incluyen camptotecinas, staurosporina, doxorrubicina, daunorrubicina, colchicina, metotrexato, taxanos, calicheamicinas, duocarmicinas, maitansinas y maitansinoides (es decir, derivados de maitansina), auristatinas, tubulisina M, criptoficina o pirrolobenzodiazepinas (PBD). Ejemplos de auristatinas incluyen dolastatina 10, auristatina F, monometil auristatina F (MMAF), auristatina E, monometil auristatina E (MMAE), auristatina PE, auristatina TP y auristatina AQ. Ejemplos de maitansinas y maitansinoides incluyen mertansina y ansamitocina.
[0138] Una molécula indicadora es una molécula cuya presencia se detecta fácilmente, por ejemplo, un agente de diagnóstico, un tinte, un fluoroforo, una etiqueta de isótopo radioactivo, un agente de contraste, un agente de formación de imágenes por resonancia magnética o una etiqueta de masa. Ejemplos de un fluoroforo incluyen todo tipo de Alexa Fluor (por ejemplo, Alexa Fluor 555), tintes de cianina (por ejemplo, Cy3 o Cy5), derivados de cumarina, fluoresceína, rodamina, aloficocianina y cromomicina.
[0139] Ejemplos de etiqueta de isótopo radioactivo incluyen "mTc, 111In, 18F, 14C, 64Cu, 131I o 123I, que pueden o no conectarse vía una fracción quelante tal como DTPA DOTA, NOTA o HiNICo.
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[0140] En el conjugado de anticuerpo (AC) según la invención, la molécula de interés se conjuga al anticuerpo vía un conector (L). Los conectores o unidades de conexón se conocen bien en la técnica, y se describen con más detalle a continuación.
[0141] La divulgación también se refiere a un proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar el anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de conector comprende un grupo funcional B y una o más moléculas de interés, donde dicho grupo funcional B es un grupo funcional que es capaz de reaccionar con un grupo funcional A de un sustituyente GlcNAc-S(A)x en dicho anticuerpo modificado. Dicho conjugado de conector es preferiblemente de la fórmula B-L(D)r, donde B, L y D son tal como se ha definido anteriormente, y r es 1 - 20, preferiblemente r es 1 - 10, más preferiblemente r es 1 - 8, aún más preferiblemente r es 1,2, 3, 4, 5 o 6, aún más preferiblemente r es 1,2, 3 o 4 y de la forma más preferible r es 1 o 2.
[0142] Los grupos funcionales complementarios B para el grupo funcional A en el anticuerpo modificado (A es un grupo azida, un grupo ceto o un grupo alquinilo) se conocen en la técnica.
[0143] Cuando A es un grupo azida, el enlace del anticuerpo modificado con azida y el conjugado de conector tiene lugar preferiblemente vía una reacción de cicloadición. El grupo funcional B se selecciona entonces preferiblemente del grupo que consiste en grupos alquinilo, preferiblemente grupos alquinilo terminales, y grupos (hetero)cicloalquinilo.
[0144] Cuando A es un grupo ceto, el enlace del anticuerpo modificado con cetona con el conjugado de conector tiene lugar preferiblemente vía conjugación selectiva con derivados de hidroxilamina o hidracinas, lo que da como resultado respectivamente oximas o hidrazonas. El grupo funcional B es entonces preferiblemente un grupo amino primario, por ejemplo, un grupo -NH2, un grupo aminooxi, por ejemplo -O-NH2, o un grupo hidrazinilo, por ejemplo - N(H)NH2. El conjugado de conector es entonces preferiblemente H2N-L(D)r, H2N-O-L(D)r o H2N-N(H)-L(D)r respectivamente, donde L, D y r son tal como se ha definido anteriormente.
[0145] Cuando A es un grupo alquinilo, el enlace del anticuerpo modificado con alquino con el conjugado de conector tiene lugar preferiblemente vía una reacción de cicloadición, preferiblemente una cicoadición 1,3-dipolar. El grupo funcional B es entonces preferiblemente un 1,3-dipolo, tal como una azida, una nitrona o un óxido de nitrilo. El conjugado de conector es entonces preferiblemente N3-L(D)r, donde L, D y r son tal como se ha definido anteriormente.
[0146] La divulgación así pues también se refiere a un proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar el anticuerpo modificado según la invención con un conjugado de conector, donde:
a. cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo, y una o más moléculas de interés; o
b. cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con cetona, dicho conjugado de conector comprende un grupo amino primario, un grupo aminooxi o un grupo hidrazinilo, y una o más moléculas de interés; o
c. cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con alquino, dicho conjugado de conector comprende un grupo azida, y una o más moléculas de interés.
[0147] La presente invención también se refiere a un proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar un anticuerpo modificado con azida con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo terminal, y una o más moléculas de interés.
[0148] En dicho proceso, una azida en el anticuerpo modificado con azida según la invención reacciona con un grupo alquinilo, preferiblemente un grupo alquinilo terminal, o un grupo (hetero)cicloalquinilo del conjugado de conector vía una reacción de cicloadición. Esta reacción de cicloadición de una molécula que incluye una azida con una molécula que comprende un grupo alquinilo terminal o un grupo (hetero)cicloalquinilo es una de las reacciones que se conoce en la técnica como "química click". En el caso de un conjugado de conector que comprende un grupo alquinilo terminal, dicha reacción de cicloadición necesita ser realizada en presencia de un catalizador adecuado, preferiblemente un catalizador Cu(I). Sin embargo, en una forma de realización preferida, el conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo, más preferiblemente un grupo (hetero)cicloalquinilo tensionado. Cuando el (hetero)cicloalquinilo es un grupo (hetero)cicloalquinilo tensionado, la presencia de un catalizador no es necesaria, y dicha reacción puede incluso ocurrir de forma espontánea mediante una reacción llamada cicloadición de azida- alquino promovida por tensión (SPAAC). Esta es una de las reacciones conocidas en la técnica como "química click libre de metales". Grupos (hetero)cicloalquinilo tensionados se conocen en la técnica y se describen con más detalle a continuación.
[0149] Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo comprende hacer reaccionar un anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de
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conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo y una o más moléculas de interés, donde dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x, donde GlcNAc es una N- acetilglucosamina, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A es un grupo azida y x es 1, 2, 3 o 4, donde dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se enlaza al anticuerpo vía el C1 de la N- acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicha GlcNAc es opcionalmente fucosilada. En otra forma de realización preferida, dicho grupo (hetero)cicloalquinilo es un grupo (hetero)cicloalquinilo tensionado.
[0150] En otra forma de realización preferida, dicho proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo comprende los pasos de:
(i) poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho sustituyente N- acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A es un grupo azida y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP), para obtener un anticuerpo modificado, donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x conectado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicho anticuerpo modificado está según la fórmula (4):
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donde:
S(A)x y x son tal como se ha definido anteriormente; AB representa un anticuerpo; GlcNAc es N- acetilglucosamina; Fuc es fucosa; b es 0 o 1; e y es de 1 a 20; y
(ii) hacer reaccionar dicho anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de
conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo y una o más moléculas de interés.
[0151] Una ventaja de esta forma de realización del proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo según la invención es que la presencia de un catalizador de cobre no es necesaria. Dicho proceso sucede así en ausencia de un catalizador de cobre. La presencia de un catalizador de cobre en dicho proceso tiene diferentes desventajas, sin embargo. Generalmente, el procedimiento más conveniente para la conjugación de azida a alquinos terminales requiere la presencia de Cu(I). Cobre(I) se genera típicamente in situ a partir de Cu(II), que requiere la adición de un agente reductor apropiado, por ejemplo DTT, ascorbato sódico o hidracina y la adición de un ligando adecuado para mantener el cobre en el estado de oxidación Cu(I). Sin embargo, se puede requerir optimización extensa y ajuste de condiciones para encontrar los parámetros óptimos para la conversión eficaz. No obstante, incluso bajo tales condiciones, la formación concomitante de especies reactivas de oxígeno no puede evitarse siempre completamente, lo que a su vez puede inducir daño oxidativo a la proteína, por ejemplo, oxidación de enlaces de metionina, histidina, cisteína o disulfuro. Otros protocolos han empleado fuentes de cobre(I) tales como CuBr para células fijadas de etiquetado y glicoproteínas de sintetización. En estos casos, la inestabilidad del CuI en el aire impone un requisito para grandes excesos de Cu (mayores que 4 mm) y ligando para reacciones eficaces, lo que también suscita preocupación por el daño o precipitación de proteínas, más la presencia de metal residual después de la purificación. Se ha observado que la conjugación de anticuerpos que contienen azida a alquinos terminales en presencia de cobre lleva a la formación de producto secundario extenso por la oxidación de aminoácidos no deseada. Por ejemplo, el análisis de espectros de masas de alta resolución de la cadena ligera (LC) de trastuzumab después de la conjugación catalizada con cobre indica la formación de > 20 % de especies con pesos moleculares + 16/+18 (véase la figura 31). El análisis detallado de fragmentos de péptido de la cadena pesada (HC) de trastuzumab después de la digestión tríptica indica la oxidación de al menos una histidina particular de hasta el 69 %, como se ejemplifica en el ejemplo 39. El análisis detallado de fragmentos de péptido de cadena ligera (LC) de trastuzumab después de la digestión tríptica indica la oxidación de al menos una metionina particular, también ejemplificado en el ejemplo 39.
[0152] Las moléculas de interés se han descrito con más detalle anteriormente. En una forma de realización preferida, la molécula de interés se selecciona del grupo que consiste en una sustancia activa, una molécula indicadora, una azida y un grupo (hetero)cicloalquinilo, más preferiblemente una sustancia activa, una molécula
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indicadora y una azida. Cuando la molécula de interés es un grupo (hetero)cidoalquinilo, se prefiere que dicha fracción sea una fracción de (hetero)ciclooctino. Las estructuras preferidas de grupos (hetero)ciclooctino se describen con más detalle a continuación.
[0153] El proceso de preparación de un anticuerpo modificado según la invención se realiza preferiblemente a una temperatura en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 °C, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 °C, aún más preferiblemente en el rango de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 °C, y de la forma más preferible en el rango de aproximadamente 32 a aproximadamente 37 °C.
[0154] El proceso se realiza preferiblemente con un pH en el rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, preferiblemente en el rango de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 8,5, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. De la forma más preferible, el proceso se realiza con un pH en el rango de aproximadamente 7 a aproximadamente 8.
[0155] El proceso se realiza preferiblemente en agua. Más preferiblemente, dicha agua es agua purificada, aún más preferiblemente agua ultrapura o agua de tipo I tal y como se define según ISO 3696. Agua adecuada es por ejemplo agua de milliQ®. Dicha agua es preferiblemente tamponada, por ejemplo, con solución salina tamponada con fosfato o tris. Los tampones adecuados son conocidos para un experto en la técnica. En una forma de realización preferida, el proceso se realiza en agua de milliQ que se tampona con solución salina tamponada con fosfato o tris.
[0156] Preferiblemente, el conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo. En una forma de realización preferida dicho conjugado de conector tiene la fórmula (11):
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donde:
L es un conector;
D es una molécula de interés; r es 1 - 20;
R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OR5, -NO2, -CN, - S(O)2R5, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo y donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen opcionalmente, donde dos sustituyentes R1 se pueden enlazar juntos para formar un cicloalquilo anillado o un sustituyente (hetero)areno anillado, y donde R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo;
X es C(R1)2, O, S o NR2, donde R2 es R1 o L(D)r, y donde L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente; q es 0 o 1, con la condición de que si q es 0 entonces X es N-L(D)r; y a es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8.
[0157] En otra forma de realización preferida dicho conjugado de conector tiene la fórmula (11b):
{L(D)r}q
X
S'í,
1 Ib
donde:
L es un conector;
D es una molécula de interés; r es 1 - 20;
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R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OR5, -NO2, -CN, - S(O)2R5, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24 y donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen opcionalmente, donde dos sustituyentes R1 se pueden enlazar juntos para formar un cicloalquilo anillado o un sustituyente (hetero)areno anillado, y donde R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
X es C(R1)2, O, S o NR2, donde R2 es R1 o L(D)r, y donde L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente; q es 0 o 1, con la condición de que si q es 0 entonces X es N-L(D)r; a es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; a' es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; y a + a' < 10.
En otra forma de realización preferida, a + a' es 4, 5, 6 o 7, más preferiblemente a + a' es 4, 5 o 6 y de la forma más preferible a + a' es 5.
[0158] En una forma de realización preferida, si q es 1 entonces X es C(R1)2, O, S o NR1.
[0159] En otra forma de realización preferida, a es 5, es decir, dicho grupo (hetero)cicloalquinilo es preferiblemente un grupo (hetero)ciclooctino. En otra forma de realización preferida, X es C(R2)2 o NR2. Cuando X es C(R2)2 se prefiere que R2 sea hidrógeno. Cuando X es NR2, se prefiere que R2 sea L(D)r. En otra forma de realización preferida, r es de 1 a 10, más preferiblemente, r es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, más preferiblemente r es 1,2, 3, 4, 5 o 6, de la forma más preferible r es 1,2, 3 o 4.
[0160] El sustituyente L(D)r puede estar presente en un átomo de C en dicho grupo (hetero)cicloalquinilo, o, en caso de un grupo heterocicloalquinilo, en el heteroátomo de dicho grupo heterocicloalquinilo. Cuando el grupo (hetero)cicloalquinilo comprende sustituyentes, por ejemplo, un cicloalquilo anillado, el sustituyente L(D)r también puede estar presente en dichos sustituyentes.
[0161] Los métodos para conectar un conector L a un grupo (hetero)cicloalquinilo en el un extremo y a una molécula de interés en el otro extremo, para obtener un conjugado de conector, dependen de la naturaleza exacta del conector, el grupo (hetero)cicloalquinilo y la molécula de interés. Métodos adecuados se conocen en la técnica.
[0162] Preferiblemente, el conjugado de conector comprende un grupo (hetero)ciclooctino, más preferiblemente un grupo (hetero)ciclooctino tensionado. Las fracciones de (hetero)cicloalquinilo adecuado se conocen en la técnica. Por ejemplo, DiFO, DIFO2 y DIFO 3 se describen en uS 2009/0068738. DIBO se describe en WO 2009/067663. DIBO puede opcionalmente ser sulfatado (S-DIBO) como se describe en J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 5381. BARAC se describe en J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688 - 3690 y US 2011/0207147.
[0163] Ejemplos preferidos de conjugados de conector que comprenden un grupo (hetero)ciclooctino se muestran a continuación.
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[0164] Otras fracciones de ciclooctino que se conocen en la técnica son DIBAC (también conocidas como ADIBO o DBCO) y BCN. DIBAC se describe en Chem. Commun. 2010, 46, 97 - 99. BCN se describe en WO 2011/136645.
[0165] En una forma de realización preferida, dicho conjugado de conector tiene la fórmula (12), (13), (14), (15) o (16).
[0166] En otra forma de realización preferida, dicho conjugado de conector tiene la fórmula (17):
imagen9
R1, L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente;
Y es O, S o NR2, donde R2 es tal y como se ha definido anteriormente;
R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, donde los grupos alquilo se interrumpen opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen de manera independiente opcionalmente; y n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
[0167] En otra forma de realización preferida, R1 es hidrógeno. En otra forma de realización preferida, R3 es hidrógeno. En otra forma de realización preferida, n es 1 o 2. En otra forma de realización preferida, R4 es hidrógeno, Y-L(D)r o -(CH2)n-Y-L(D)r. En otra forma de realización preferida, R2 es hidrógeno o L(D)r. En otra forma de realización preferida, el conjugado de conector tiene la fórmula 18:
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[0169] En otra forma de realización preferida, dicho conjugado de conector tiene la fórmula (15):
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[0170] La reacción de cicloadición de un anticuerpo modificado con azida con un conjugado de conector que 15 comprende un tipo preferido del grupo ciclooctino BCN-L(D)r (17) se muestra en el esquema 2.
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[0171] El valor de p y la naturaleza de Q dependen del azúcar o derivado de azúcar S(A)x sustituido con azida que está presente en el anticuerpo modificado con azida según la invención que se enlaza a un conjugado de conector. Si una azida en S(A)x está presente en la posición C2, C3 o C4 del azúcar o el derivado de azúcar (en vez de un grupo OH de azúcar), entonces p es 0. Si S(A)x es un derivado de azúcar azidoacetamido, S(A)x es por ejemplo GalNAz o GlcNAz, entonces p es 1 y Q es -N(H)C(O)CH2-. Si la azida en S(A)x está presente en la posición C6 del azúcar o el derivado de azúcar, entonces p es 1 y Q es -CH2-.
[0172] Los conectores (L), también referidos como unidades de conexión, son bien conocidos en la técnica. En un conjugado de conector como se describe en este caso, L se enlaza a una molécula de interés, así como a un grupo funcional B, como se describió anteriormente.
[0173] En una forma de realización preferida, el anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida. Un conjugado de conector adecuado para la preparación de un anticuerpo modificado con azida es un conjugado de conector que comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo y una molécula de interés. Se conocen en la técnica numerosos métodos para enlazar dicho grupo (hetero)cicloalquinilo y dicha molécula de interés a L. Como estará claro para un experto en la técnica, la elección de un método adecuado para enlazar un grupo (hetero)cicloalquinilo a un extremo de un conector y una molécula de interés al otro extremo depende de la naturaleza exacta del grupo (hetero)cicloalquinilo, el conector y la molécula de interés.
[0174] Un conector puede tener la estructura general F1-L(F2)r, donde F1 representa un grupo funcional que es capaz de reaccionar con un grupo funcional F en el grupo funcional B como se ha descrito anteriormente, por ejemplo un grupo (hetero)cicloalquinilo, un grupo alquinilo terminal, una amina primaria, un grupo aminooxi, un grupo hidrazilo o un grupo azida. F2 representa un grupo funcional que es capaz de reaccionar con un grupo funcional F en la molécula de interés.
[0175] Ya que se pueden enlazar más de una molécula de interés a un conector, más de un grupo funcional F2 pueden estar presentes en L. Como se describió anteriormente, r es de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 8, aún más preferiblemente 1,2, 3, 4, 5 o 6, aún más preferiblemente 1,2, 3 o 4 y de la forma más preferible, r es 1 o 2.
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[0176] L puede por ejemplo seleccionarse del grupo que consiste en grupos alquileno C1-C200 lineales o ramificados, grupos alquenileno C2-C200, grupos alquileno C2-C200, grupos cicloalquileno C3-C200, grupos cicloalquenileno C5-C200, grupos cicloalquileno C8-C200, grupos alquilarileno C7-C200, grupos arilalquileno C7-C200, grupos arilalquenileno C8- C200, grupos arilalquinileno C9-C200. Opcionalmente los grupos alquileno, grupos alquenileno, grupos alquileno, grupos cicloalquileno, grupos cicloalquenileno, grupos cicloalquileno, grupos alquilarileno, grupos arilalquileno, grupos arilalquenileno y grupos arilalquinileno se pueden sustituir, y opcionalmente dichos grupos se pueden interrumpir con uno o más heteroátomos, preferiblemente de 1 a 100 heteroátomos, donde dichos heteroátomos se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en O, S y NR5, donde R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24. De la forma más preferible, el heteroátomo es O.
[0177] F, F1 y F2 se pueden por ejemplo seleccionar independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, R5, grupos (hetero)cicloalquino C4 - C10, -CH=C(R5)2, -C=CR5, -[C(R5)2C(R5)2O]q-R5, donde q está en el rango de 1 a 200, -CN, -N3, -NCX, -XCN, -XR5, -N(R5)2, -+N(R5)3, -C(X)N(R5)2, -C(R5)2XR5, -C(X)R5, -C(X)XR5, - S(O)R5, -S(O)2R5, -S(O)OR5, -S(O)2OR5, -S(O)N(R5)2, -S(O)2N(R5)2, -OS(O)R5, -OS(O)2R5, -OS(O)OR5, -OS(O)2OR5; -P(O)(R5)(OR5), -P(O)(OR5)2, -OP(O)(OR5)2, -Si(R5)3, -XC(X)R5, -XC(X)XR5, -XC(X)N(R5)2, -N(R5)C(X)R5, - N(R5)C(X)XR5 y -N(R5)C(X)N(R5)2, donde X es oxígeno o azufre y donde R5 es tal como se ha definido anteriormente.
[0178] Ejemplos de unidades de conexión adecuados incluyen (poli)etilenglicol diamina (por ejemplo 1,8-diamino- 3,6-dioxaoctano o equivalentes que comprenden cadenas de etilenglicol más largas), polietilenglicol o cadenas de óxido de polietileno, polipropilenglicol o cadenas de óxido de polipropileno y 1 ,x-diaminoalcanos donde x es el número de átomos de carbono en el alcano.
[0179] Otra clase de conectores adecuados comprende conectores escindióles. Los conectores escindióles se conocen en la técnica. Por ejemplo, Shabat et al., Soft Matter 2012, 6, 1073, divulga conectores escindibles que comprenden fracciones autoinmolativas que se liberan tras sobre un detonante biológico, por ejemplo una escisión enzimática o un evento de oxidación. Algunos ejemplos de enlaces escindibles adecuados son conectores de péptido que se escinden tras el reconocimiento específico por una proteasa, por ejemplo, catepsina, plasmina o metal oproteasas, o conectores basados en glicósido que se escinden tras el reconocimiento específico por una glicosidasa, por ejemplo glucoronidasa, o nitroaromáticos que tienen pocas áreas hipóxicas pobres en oxígeno.
Conjugado de anticuerpo
[0180] La invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo obtenible por el proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo según la invención. Dicho proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo y los ejemplos de realización preferidos de dicho proceso se han descritos en detalle anteriormente.
[0181] La invención, por lo tanto, también se refiere a un conjugado de anticuerpo obtenible por un proceso que incluye las etapas de:
(i) poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho sustituyente N- acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1,2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP),
para obtener un anticuerpo modificado, donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicho anticuerpo modificado es según la fórmula (4):
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donde:
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S(A)x y x son tal como se ha definido anteriormente; AB representa un anticuerpo; GIcNAc es N- acetilglucosamina; Fuc es fucosa; b es 0 o 1; e y es de 1 a 20; y
(ii) hacer reaccionar dicho anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde:
(a) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo, y una o más moléculas de interés; o
(b) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con cetona, dicho conjugado de conector comprende un grupo amino primario, un grupo aminooxi o un grupo hidrazinilo, y una o más moléculas de interés; o
(c) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con alquino, dicho conjugado de conector comprende un grupo azida, y una o más moléculas de interés;
donde una molécula de interés (D) se conjuga al anticuerpo v'a un conector (L), y donde dicha molécula de interés es una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa.
[0182] La invención se refiere además a un conjugado de anticuerpo según la fórmula (20):
imagen15
donde AB es un anticuerpo, S es un azúcar o un derivado de azúcar, GlcNAc es N-acetilglucosamina, donde y es 1 - 20, y donde L, D, X, R1, Q, a, b, p, r, x, e y q son tal como se ha definido anteriormente, así como sus formas de realización preferidas.
[0183] La invención se refiere además a un conjugado de anticuerpo según la fórmula (20b):
imagen16
donde AB es un anticuerpo, S es un azúcar o un derivado de azúcar, GlcNAc es N-acetilglucosamina, donde y es 1 - 20, y donde L, D, X, R1, Q, a, a', b, p, r, x, e y q son tal como se ha definido anteriormente, así como sus formas de realización preferidas.
[0184] En el anticuerpo conjugado de la fórmula (20) y (20b), GlcNAc es opcionalmente fucosilada (b es 0 o 1). El anticuerpo puede comprender hasta 20 sustituyentes conjugados (y es 1 - 20). Preferiblemente y es 1 - 10, más preferiblemente y es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, aún más preferiblemente y es 1,2, 3 o 4 y de la forma más preferible y es 1 o 2.
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[0185] Las estructuras preferidas del derivado de azúcar (S), el conector (L), el sustituyente R1 y los valores preferidos para r y a se han descrito en detalle anteriormente.
[0186] Como se describió anteriormente, el valor de p y la naturaleza de Q dependen del azúcar o derivado de azúcar sustituido con azida S(A)x que está presente en el anticuerpo modificado con azida según la invención que se enlaza a un conjugado de conector. Si la azida en S(A)x está presente en la posición C2, C3 o C4 del derivado de azúcar, entonces p es 0. Si S(A) es un derivado de azúcar de azidoacetamida, S(A)x es por ejemplo GalNAz o GlcNAz, entonces p es 1 y Q es -N(H)C(O)CH2-. Si la azida en S(A)x está presente en la posición C6 posición del azúcar o el derivado de azúcar, entonces p es 1 y Q es -CH2-.
[0187] Las moléculas de interés (D) también se han descrito con más detalle anteriormente. El conjugado de anticuerpo puede comprender más de una molécula de interés. Un conjugado de anticuerpo comprende más de una molécula de interés por ejemplo cuando se enlaza a más de un conjugado de conector, cuando un conjugado de conector comprende más de una molécula de interés, o ambos casos.
[0188] Preferiblemente la molécula de interés se selecciona de los grupos consistentes en una sustancia activa, una molécula indicadora, una azida y un grupo (hetero)cicloalquino. Cuando la molécula de interés es una sustancia activa, también se puede hacer referencia al conjugado de anticuerpo como conjugado anticuerpo-fármaco (ADC).
[0189] En una forma de realización preferida, el conjugado de anticuerpo según la invención tiene la fórmula (21):
imagen17
dicha N-acetilglucosamina es opcionalmente fucosilada (b es 0 o 1).
[0190] En otra forma de realización preferida, R1, R3 y R4 son hidrógeno y n es 1 o 2, y en una forma de realización aún más preferida x es 1.
[0191] En otra forma de realización preferida, el conjugado de anticuerpo tiene la fórmula (22):
imagen18
acetilglucosamina es opcionalmente fucosilada (b es 0 o 1).
5 [0192] El conjugado de anticuerpo 22 es un ejemplo de un compuesto que puede existir en diferentes regioisómeros.
Otro regioisómero se muestra a continuación.
imagen19
10 acetilglucosamina es opcionalmente fucosilada.
[0193] En otra forma de realización preferida, el conjugado de anticuerpo tiene la fórmula (15b):
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acetilglucosamina es opcionalmente fucosilada.
[0194] En la figura 6, se muestra otra forma de realización preferida del conjugado de anticuerpo según la invención. Un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras comprende una GlcNAc central opcionalmente fucosilada en cada cadena pesada. Un conjugado de conector según la fórmula (17) se enlaza al anticuerpo vía una reacción de cicloadición del grupo ciclooctinilo de dicho conjugado de conector con una azida en el anticuerpo modificado con azida según la invención con un sustituyente -GlcNAc-GalNAz.
[0195] La invención se refiere además al conjugado de anticuerpo según la invención, para usar como un medicamento. Ejemplos de realización preferidos de dicho conjugado de anticuerpo se han descrito con más detalle anteriormente.
Conjugado anticuerpo-fármaco
[0196] Cuando la molécula de interés en un conjugado de anticuerpo según la invención es una sustancia activa, también se puede hacer referencia al conjugado de anticuerpo como conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). La presente invención se refiere así también a un conjugado anticuerpo-fármaco, donde una molécula de interés (D) se conjuga al anticuerpo vía un conector (L); donde dicha molécula de interés (D) es una sustancia activa; y donde una sustancia activa se define como una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa.
[0197] La invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo obtenible mediante el proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo según la invención, donde una molécula de interés (D) se conjuga al anticuerpo vía un conector (L); donde dicha molécula de interés (D) es una sustancia activa; y donde una sustancia activa se define como una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa. Dicho proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo y los ejemplos de realización preferidos de dicho proceso se han descrito en detalle anteriormente.
[0198] En una forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo, obtenible mediante un proceso que incluye las etapas de:
(i) poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho sustituyente N- acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1,2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP),
para obtener un anticuerpo modificado, donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicho anticuerpo modificado es según la fórmula (4):
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donde:
S(A)x y x son tal como se ha definido anteriormente; AB representa un anticuerpo; GIcNAc es N- acetilglucosamina; Fuc es fucosa; b es 0 o 1; e y es de 1 a 20; y
(ii) hacer reaccionar dicho anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde:
(a) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo, y una o más moléculas de interés; o
(b) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con cetona, dicho conjugado de conector comprende un grupo amino primario, un grupo aminooxi o un grupo hidrazinilo, y una o más moléculas de interés; o
(c) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con alquino, dicho conjugado de conector comprende un grupo azida, y una o más moléculas de interés;
donde una molécula de interés (D) se conjuga al anticuerpo vía un conector (L); donde dicha molécula de interés (D) es una sustancia activa; y donde una sustancia activa se define como una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa.
[0199] Las moléculas de interés (D) y los conectores (L) se han descrito con más detalle anteriormente y a continuación.
[0200] La etapa (i) y etapa (ii) del proceso mediante el cual el conjugado anticuerpo-fármaco es obtenible, al igual que formas de realización preferidas del mismo, se han descrito en detalle anteriormente.
[0201] El conjugado anticuepro-fármaco se obtiene preferiblemente mediante el proceso según la invención, donde x es 1 o 2, y más preferiblemente, x es 1. En consecuencia, en el anticuerpo modificado según la fórmula (4) al igual que en el conjugado anticuepro-fármaco, cada fracción de azúcar S se enlaza preferiblemente a 1 o 2, más preferiblemente 1, conjugados de conector L(D)r.
[0202] El conjugado anticuepro-fármaco se obtiene preferiblemente mediante el proceso según la invención, donde y es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, más preferiblemente y es 1, 2, 3 o 4 e incluso más preferiblemente, y es 1 o 2. Se prefiere además que r sea 1,2, 3 o 4, más preferiblemente que r sea 1 o 2 y de la forma más preferible que r sea 1.
[0203] Se prefiere además que, en el conjugado anticuepro-fármaco según la invención, el anticuerpo sea un anticuerpo entero, donde y sea 2. En esta forma de realización, el conjugado anticuepro-fármaco se puede enlazar así a 2, 4 o 8 moléculas de interés, más preferiblemente el anticuerpo se enlaza a 2 o 4 moléculas de interés y de la forma más preferible el anticuerpo se enlaza a 2 moléculas de interés.
[0204] En otra forma de realización preferida, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos IgA IgD, IgE, IgG e IgM, más preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo IgG, preferiblemente un anticuerpo IgG1.
[0205] En otra forma de realización del conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo. En esta forma de realización, se prefiere que y sea 1.
[0206] En otra forma de realización preferida, x es 1 e y es 1. En otra forma de realización preferida, x es 2 e y es 2. Se prefiere además que r sea 1. En otra forma de realización preferida, x es 1, y es 1 y r es 1. En otra forma de realización preferida adicional, x es 1, y es 2 y r es 1. En otra forma de realización preferida adicional, x es 2, y es 2 y r es 1.
[0207] En una forma de realización preferida el conjugado anticuerpo-fármaco es obtenible mediante el proceso según la invención, donde en la etapa (ii) dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, y donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (11) o (11b):
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D y L son tal y como se ha definido anteriormente; r es 1 - 20;
R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OR5, -NO2, -CN, - S(O)2R5, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24 y donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen opcionalmente, donde dos sustituyentes R1 se pueden enlazar juntos para formar un cicloalquilo anillado o un sustituyente (hetero)areno anillado, y donde R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
X es C(R1)2, O, S o NR2, donde R2 es R1 o L(D)r donde L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente; q es 0 o 1, con la condición de que si q es 0, entonces X es N-L(D)r; a es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; a' es 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; y a + a' < 10.
Preferiblemente, a + a' es 4, 5, 6 o 7, más preferiblemente a + a' es 4, 5 o 6 y de la forma más preferible a + a' es 5.
[0208] En otra forma de realización preferida, el conjugado anticuerpo-fármaco según la invención es obtenible mediante el proceso según la invención, donde en la etapa (ii) dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida y donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (12), (13), (14), (15) o (16).
[0209] En otra forma de realización preferida adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco según la invención es obtenible mediante el proceso según la invención, donde en la etapa (ii) dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida y donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (17):
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R1, L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente;
Y es O, S o NR2, donde R2 es tal y como se ha definido anteriormente;
R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, donde los grupos alquilo se interrumpen opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos alquilo, (grupos hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen de manera independiente opcionalmente; y n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
[0210] En otra forma de realización preferida adicional, R1 es hidrógeno. En otra forma de realización preferida R3 es hidrógeno. En otra forma de realización preferida, n es 1 o 2. En otra forma de realización preferida, R4 es
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[0211] En otra forma de realización preferida adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco según la invención es obtenible mediante el proceso según la invención, donde en la etapa (ii) dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida y donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (19):
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donde L, D y r son tal como se ha definido antenormente.
[0212] En otra forma de realización preferida adicional, el conjugado anticuerpo-fármaco según la invención es obtenible mediante el proceso según la invención, donde en la etapa (ii) dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida y donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (15):
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[0213] Los experimentos de eficacia in vivo muestran que el conjugado anticuerpo-fármaco según la invención tiene un efecto en el volumen del tumor.
[0214] La invención se refiere además a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, donde la molécula de interés es una sustancia activa, para usar como un medicamento.
[0215] La invención también se refiere al uso de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, donde la molécula de interés es una sustancia activa, para usar en el tratamiento contra el cáncer.
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[0216] La invención se refiere además a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, donde la molécula de interés es una sustancia activa, para usar en el tratamiento de cáncer de mama, más preferiblemente para usar en el tratamiento de cáncer de mama HER2 positivo.
[0217] La invención también se refiere a un método para tratar el cáncer mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención.
[0218] La invención también se refiere a un método para tratar el cáncer de mama mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención.
[0219] La invención también se refiere a un método para tratar el cáncer de mama HER2 positivo mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención.
[0220] En una forma de realización preferida, el anticuerpo en dicho conjugado anticuerpo-fármaco es trastuzumab. En otra forma de realización preferida, la molécula de interés es una citotoxina, preferiblemente maitansinoide, auristatina E, auristatina F, duocarmicina o pirrolobenzodiazepina.
[0221] En el conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, la molécula de interés es una sustancia activa. Como se describió anteriormente, una sustancia activa es una sustancia farmacológica y/o biológica, es decir una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa, por ejemplo un fármaco o un profármaco, un agente de diagnóstico, una proteína, un péptido, un aminoácido, un glicano, un lípido, una vitamina, un esteroide, un polietilenoglicol, un nucleótido, un nucleósido, un polinucleótido, ARN o ADN. Ejemplos de etiquetas de péptido adecuadas incluyen péptidos que penetran en la célula como lactoferrina o poliarginina humana. Un ejemplo de un glicano adecuado es oligomanosa.
[0222] En una forma de realización preferida, la sustancia activa se selecciona del grupo que consiste en fármacos y profármacos. Más preferiblemente, la sustancia activa se selecciona del grupo que consiste en compuestos farmacéuticamente activos, en particular compuestos de bajo a medio peso molecular (por ejemplo, de aproximadamente 200 a aproximadamente 1500 Da, preferiblemente de aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 Da), tal como por ejemplo citotoxnas, agentes antivíricos, agentes antibacterianos, péptidos y oligonucleótidos. Ejemplos de citotoxinas incluyen camptotecinas, staurosporina, doxorrubicina, daunorrubicina, colchicina, metotrexato, taxanos, calicheamicinas, duocarmicinas, maitansinas y maitansinoides (es decir derivados de maitansina), auristatinas, tubulisina M, criptoficina o pirrolobenzodiazepinas (PBD). Ejemplos de auristatinas incluyen dolastatina 10, auristatina F, monometil auristatina F (MMAF), auristatina E, monometil auristatina E (MMAe), auristatina PE, auristatina TP y auristatina AQ. Ejemplos de maitansinas y maitansinoides incluyen mertansina y ansamitocina.
[0223] En una forma de realización preferida, el anticuerpo en dicho conjugado de anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de cáncer. Ejemplos de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de cáncer incluyen trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, rituximab, bevacizumab, girentuximab, gemtuzumab, inotuzumab, alemtuzumab, tositumumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, elotuzumab, zanolimumab, obinutuzumab, necitumumab, farletuzumab, vedolizumab, tabalumab, itolizumab, ocrelizumab, epratuzumab, mepolizumab, reslizumab, sarilumab y ramicurumab.
[0224] Por lo tanto, la invención se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a antígeno de cáncer y donde la molécula de interés es una citotoxina, para usar como un medicamento. La invención también se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a antígeno de cáncer y donde la molécula de interés es una citotoxina, para usar en el tratamiento contra el cáncer. También, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a antígeno de cáncer y donde la molécula de interés es una citotoxina, para usar en el tratamiento del cáncer de mama, y más preferiblemente para usar en el tratamiento del cáncer de mama HER2 positivo.
[0225] En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la
invención, donde el conjugado de anticuerpo es trastuzumab-(MMAF)2, trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2, trastuzumab(maitansinoide)2 o trastuzumab-(vc-PABA-maitansinoide)2, para usar en el tratamiento contra el cáncer. En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el conjugado de anticuerpo es trastuzumab-(MMAF)2, trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2,
trastuzumab(maitansinoide)2 o trastuzumab-(vc-PABA-maitans¡no¡de)2, para usar en el tratamiento del cáncer de mama, más preferiblemente para usar en el tratamiento del cáncer de mama HER2 positivo.
[0226] Además, la invención se refiere a un método para tratar el cáncer mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención. La invención también se refiere a un método para tratar el cáncer de mama mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención. La invención se refiere además a un método para tratar el cáncer de mama HER2 positivo mediante la administración de un conjugado anticuerpo-
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fármaco según la invención. Ejemplos de realización preferidos del anticuerpo y la molécula de interés se han descrito con anterioridad.
Proceso de preparación de un conjugado fármaco-anticuerpo
[0227] La invención también se refiere a un proceso de preparación de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención, que incluye las etapas de:
(i) poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador adecuado, donde dicho sustituyente N- acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1,2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP),
para obtener un anticuerpo modificado, donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicho anticuerpo modificado es según la fórmula (4):
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donde:
S(A)x y x son tal como se ha definido anteriormente; AB representa un anticuerpo; GlcNAc es N- acetilglucosamina; Fuc es fucosa; b es 0 o 1; E y es 1 a 20; y
(ii) hacer reaccionar dicho anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde:
(a) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo, y una o más moléculas de interés; o
(b) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con cetona, dicho conjugado de conector comprende un grupo amino primario, un grupo aminooxi o un grupo hidrazinilo, y una o más moléculas de interés; o
(c) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con alquino, dicho conjugado de conector comprende un grupo azida, y una o más moléculas de interés,
donde una molécula de interés (D) se conjuga al anticuerpo vía un conector (L); donde dicha molécula de interés es una sustancia activa; y donde una sustancia activa se define como una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa.
[0228] En una forma de realización preferida, dicho catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante a partir de unap(1,4) -galactosiltransferasa, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en GalT Y289L, GalT Y289N y GalT Y289I. En otra forma de realización preferida, dicho catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante a partir de una (3(1,4) -galactosiltransferasa, seleccionada del grupo que consiste en GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I y GalT Y289A preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en GalT Y289F y GalT Y289M.
[0229] En otra forma de realización preferida, x es 1,2, 3 o 4, preferiblemente x es 1 o 2, más preferiblemente x es 1. En otra forma de realización preferida, y es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8, preferiblemente y es 1, 2, 3 o 4 y más preferiblemente y es 1 o 2.
[0230] En una forma de realización preferida específica, el anticuerpo es un anticuerpo entero e y es 2, y en otra forma de realización preferida, el anticuerpo es un fragmento de un anticuerpo e y es 1.
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[0231] En una forma de realización preferida del proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo según la invención, dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, y dicho conjugado de conector tiene la fórmula (11) o (11b):
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donde:
D y L son tal y como se ha definido anteriormente; r es 1 - 20;
R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OR5, -NO2, -CN, - S(O)2R5, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos
(hetero)arilalquilo C7 - C24 y donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen opcionalmente, donde dos sustituyentes R1 se pueden enlazar juntos para formar un cicloalquilo anillado o un sustituyente (hetero)areno anillado, y donde R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
X es C(R1)2, O, S o NR2, donde R2 es R1 o L(D)r donde L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente; q es 0 o 1, con la condición de que si q es 0, entonces X es N-L(D)r; y a es 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; y a' es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; y a + a' < 10.
Preferiblemente, a + a' es 4, 5, 6 o 7, más preferiblemente a + a' es 4, 5 o 6 y de la forma más preferible a + a' es 5.
[0232] En otra forma de realización preferida del proceso según la invención, dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, y dicho conjugado de conector tiene la fórmula (12), (13), (14), (15) o (16).
[0233] En otra forma de realización preferida adicional del proceso según la invención, dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, y dicho conjugado de conector tiene la fórmula (17):
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R1, L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente;
Y es O, S o NR2, donde R2 es tal y como se ha definido anteriormente;
R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
R4 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, donde los grupos alquilo se interrumpen opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen de manera independiente opcionalmente; y n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
[0234] En otra forma de realización preferida del proceso según la invención, R1 es hidrógeno. En otra forma de realización preferida, R3 es hidrógeno. En otra forma de realización preferida, n es 1 o 2. En otra forma de
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[0235] En otra forma de realización preferida adicional del proceso según la invención, dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, y dicho conjugado de conector tiene la fórmula (19):
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[0236] En otra forma de realización preferida del proceso según la invención, dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, y dicho conjugado de conector tiene la fórmula (15):
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Anticuerpo modificado, conjugado de anticuerpo y conjugado de anticuerpo-fármaco según la invención
[0237] El anticuerpo modificado, el conjugado de anticuerpo, el conjugado anticuerpo-fármaco y los procesos de preparación de los mismos según la invención tienen diferentes ventajas sobre los anticuerpos modificados, conjugados de anticuerpo y procesos de preparación de los mismos conocidos en la técnica.
[0238] Como se describió anteriormente, los procesos conocidos para la conjugación de una toxina de conector a anticuerpos todavía necesitan ser mejorados, no solo en cuanto a control tanto de la especificidad del sitio como de estequiometría, sino también en cuanto a la eficiencia del proceso de conjugación. A pesar de la capacidad de los ADC para alojarse en uno de sus objetivos, la cantidad de fármaco que se estima que entra en las células de los tumores internos es típicamente < 2 0/o de una dosis administrada. Este problema se amplifica por los resultados de conjugación imprevisibles de los ADC conocidos en la técnica. Resulta importante evitar anticuerpos
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infraconjugados, que reducen la potencia, al igual que especies altamente conjugadas, que pueden tener vidas medias circulantes marcadamente disminuidas, unión dificultada a la proteína objetivo y toxicidad aumentada.
[0239] Para conjugados anticuerpo-fármaco, una medida para la carga de moléculas de interés (por ejemplo fármacos, sustancias activas) sobre el anticuerpo es la así llamada proporción de fármaco por anticuerpo (DAR), que da el número medio de moléculas de sustancia activa por anticuerpo, calculado a partir de una distribución estadística. El valor de máximo teórico de la DAR para un tipo determinado de ADC es igual al número de sitios de anclaje. Como se describió anteriormente, los procesos de preparación de ADC conocidos de la técnica anterior dan como resultado generalmente un producto que comprende una mezcla de conjugados de anticuerpo con un número variable de moléculas de interés presentes en cada conjugado de anticuerpo, y una DAR con una desviación típica alta.
[0240] Una de las ventajas de los anticuerpos modificados y los conjugados de anticuerpo según la invención es que estos anticuerpos y conjugados de anticuerpo son homogéneos, tanto en especificidad del sitio como en estequiometría. La invención, por lo tanto, también se refiere a un conjugado anticuerpo-fármaco, donde el conjugado anticuerpo-fármaco es homogéneo. Se prefiere además que el conjugado anticuerpo-fármaco sea homogéneo en especificidad del sitio y estequiometría. También se prefiere que el conjugado anticuerpo-fármaco se obtenga con una proporción de fármaco por anticuerpo (DAR) cercana al valor teórico, y con una desviación típica baja.
[0241] En una forma de realización preferida, el anticuerpo modificado y el conjugado de anticuerpo según la invención son homogéneos, tanto en especificidad del sitio como en estequiometría. Aquí, un anticuerpo o un conjugado de anticuerpo se considera homogéneo cuando la conjugación se efectúa solo en un sitio predeterminado y con proporción de fármaco-anticuerpo predeterminada. Un conjugado de anticuerpo es heterogéneo cuando la conjugación del anticuerpo tiene lugar en sitios diferentes en el anticuerpo, lo que conduce a una mezcla de productos con proporción de fármaco-anticuerpo imprevisible. En este último caso, la proporción de fármaco- anticuerpo será un promedio del grupo entero de conjugados anticuerpo-fármaco.
[0242] En otra forma de realización preferida, el conjugado de anticuerpo según la invención tiene una DAR que está dentro del 10 % de su valor teórico.
[0243] Dichos anticuerpos modificados y conjugados de anticuerpo se obtienen con una DAR muy cercana al valor teórico, y con una desviación típica muy baja. Esto también significa que los conjugados de anticuerpo según la invención suponen un producto más consistente para el análisis preclínico.
[0244] Otra ventaja de los procesos y anticuerpos según la invención implica la reducción de residuos en la fabricación, lo que mejora así el coste de los productos de las empresas.
[0245] Además, el proceso de preparación de un anticuerpo modificado y de preparación de un anticuerpo conjugado según la invención transcurre muy eficazmente. Las cinéticas de reacción son muy favorables, lo que da como resultado una conversión casi completa en un periodo de tiempo relativamente corto, particularmente en comparación con procesos conocidos en la técnica, y no se forman productos secundarios o no se forma casi ninguno.
[0246] Además, cuando un anticuerpo modificado con azida según la invención se acopla a un conjugado de conector que incluye un grupo alquinilo, o cuando un anticuerpo modificado con alquino según la invención se acopla a un conjugado de conector que incluye una fracción de azida, vía una reacción de cicloadición, los triazoles resultantes no son susceptibles a hidrólisis u otras vías de degradación. Cuando un anticuerpo modificado con cetona según la invención se acopla a un conjugado de conector que comprende una hidroxilamina o una hidracina, las oximas o hidrazonas resultantes son también relativamente inertes a condiciones neutrales.
[0247] Ventajas adicionales son así la estabilidad de los conjugados de anticuerpo según la invención, al igual que el proceso directo y generalmente aplicable para la introducción de un grupo azida, un grupo ceto y/o un grupo alquinilo en un anticuerpo.
[0248] Como se ha descrito anteriormente, los conjugados de anticuerpo según la invención tienen diferentes ventajas sobre los conjugados de anticuerpo conocidos en la técnica anterior. Una de las ventajas de los anticuerpos modificados, los conjugados de anticuerpo y el proceso de preparación de los mismos según la invención es que estos anticuerpos y conjugados de anticuerpo son homogéneos, tanto en especificidad del sitio como en estequiometría. Los anticuerpos modificados y conjugados de anticuerpo según la invención se obtienen con una DAR muy cercana al valor teórico, y con una desviación típica muy baja. Esto también significa que los conjugados de anticuerpo según la invención suponen un producto más consistente para el análisis preclínico.
[0249] Las propiedades de un conjugado de anticuerpo según la invención se modulan mediante el diseño, la expresión y el procesado en los conjugados anticuerpo-fármaco de anticuerpos monoclonales con perfiles de glicosilación diferentes. Las propiedades que se pueden modular son, por ejemplo, actividad antitumoral, dosis
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máxima tolerada, farmacocinéticas tales como espacio libre de plasma, índice terapéutico, tanto en cuanto a eficacia como toxicidad, atenuación del fármaco, estabilidad de la fijación del fármaco y liberación del fármaco después de alcanzar el objetivo. En particular, hay una correlación entre la ubicación del fármaco y la eficacia in vivo del ADC.
[0250] Los experimentos in vivo e in vitro muestran que el conjugado de anticuerpo según la invención tiene un efecto citotóxico en células con expresión de HER2. Los experimentos in vitro demuestran que los conjugados anticuerpo-fármaco según la invención son capaces de matar selectivamente la línea celular con expresión de HER2 con respecto a la línea celular con HER2 negativo, como se resume en las figuras 24 - 26. El experimento in vivo demuestra que una dosis individual de varios de los conjugados de anticuerpo según la invención es capaz de eliminar un tumor con expresión de HER2 a partir de un xenoinjerto de ratón, como se clarifica en las figuras 29 y 30. Además, se demuestra que los conjugados de anticuerpo según la invención tienen un perfil farmacocinético idéntico al del anticuerpo nativo trastuzumab, como se resume en la figura 27.
[0251] La invención por lo tanto se refiere además a un conjugado de anticuerpo según la invención, para usar como un medicamento. La invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, para usar en el tratamiento contra el cáncer. La invención se refiere además a un conjugado de anticuerpo según la invención, para usar en el tratamiento de cáncer de mama, más preferiblemente para usar en el tratamiento de cáncer de mama HER2 positivo.
[0252] En una forma de realización preferida, la molécula de interés en dicho conjugado de anticuerpo es una sustancia activa, es decir una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa. Preferiblemente, la sustancia activa es una citotoxina. Ejemplos de citotoxinas incluyen camptotecinas, doxorrubicina, daunorrubicina, taxanos, calicheamicinas, duocarmicinas, maitansinas y maitansinoides (es decir, derivados de maitansina), auristatinas o pirrolobenzodiazepinas (ejemplos de PBD de citotoxinas incluyen camptotecinas, staurosporina, doxorrubicina, daunorrubicina, colchicina, metotrexato, taxanos, calicheamicinas, duocarmicinas, maitansinas y maitansinoides (es decir, derivados de maitansina), auristatinas, tubulisina M, criptoficina o pirrolobenzodiazepinas (PBD). Ejemplos de auristatinas incluyen dolastatina 10, auristatina F, monometil auristatina F (MMAF), auristatina E, monometil auristatina E (MMAE), auristatina PE, auristatina TP y auristatina AQ. Ejemplos de maitansinas y maitansinoides incluyen mertansina y ansamitocina.
[0253] En una forma de realización preferida, el anticuerpo en dicho conjugado de anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al antígeno de cáncer. Ejemplos de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de cáncer incluyen trastuzumab, pertuzumab, cetuximab, rituximab, bevacizumab, girentuximab, gemtuzumab, inotuzumab, alemtuzumab, tositumumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, elotuzumab, zanolimumab, obinutuzumab, necitumumab, farletuzumab, vedolizumab, tabalumab, itolizumab, ocrelizumab, epratuzumab, mepolizumab, reslizumab, sarilumab y ramicurumab.
[0254] Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a antígeno de cáncer y donde la molécula de interés es una citotoxina, para usar como un medicamento. En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a antígeno de cáncer y donde la molécula de interés es una citotoxina, para usar en el tratamiento contra el cáncer. En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a antígeno de cáncer y donde la molécula de interés es una citotoxina, para usar en el tratamiento del cáncer de mama, y más preferiblemente para usar en el tratamiento del cáncer de mama HER2 positivo.
[0255] En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el conjugado de anticuerpo es trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2 o trastuzumab-(vc-PABA- maitansinoide)2, para usar en el tratamiento contra el cáncer. En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a un conjugado de anticuerpo según la invención, donde el conjugado de anticuerpo es trastuzumab-(vc- PABA-MMAF)2 o trastuzumab-(vc-PABA-maitansinoide)2, para usar en el tratamiento del cáncer de mama, más preferiblemente para usar en el tratamiento del cáncer de mama HER2 positivo.
[0256] Además, la invención se refiere a un método para tratar el cáncer mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención. La invención también se refiere a un método para tratar el cáncer de mama mediante la administración de un conjugado anticuerpo-fármaco según la invención. La invención se refiere además a un método para tratar el cáncer de mama HER2 positivo mediante la administración de un conjugado anticuerpo- fármaco según la invención. Ejemplos de realización preferidos del anticuerpo y la molécula de interés se han descrito anteriormente.
Conjunto de partes
[0257] La divulgación también se refiere a un conjunto de partes, que comprende un anticuerpo modificado según la invención y un conjugado de conector. Dicho anticuerpo modificado y conjugado de conector, y las formas de realización preferidas de los mismos, se han descrito con más detalle anteriormente.
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[0258] La divulgación se refiere además a un conjunto de partes, que incluye un anticuerpo modificado con azida según la invención y un conjugado de conector según la fórmula 11:
R1
—X
yh {L(D)rí q
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donde R1, X, L, D, a, r y q son tal como se ha definido anteriormente.
[0259] Las formas de realización preferidas del anticuerpo modificado con azida y del conjugado de conector 11 se han descrito con más detalle anteriormente.
Ejemplos
Síntesis
Ejemplos 1 - 4: Síntesis de BCN-doxonubicina 28a y 28b
[0260] El esquema de reacción de la síntesis de conjugado de conector BCN-doxorrubicina 28a empezando a partir de BCN-OSu 23, como se realiza en los ejemplos 1 - 4, se muestra en la figura 7.
Ejemplo 1. Síntesis de BCN-amina 24
[0261] A una solución de 2,2'-(etilenodioxi)bis(etilamina) (11,78 mL, 80,5 mmol) en DCM (200 mL) se añadió BCN- OSu 23 (7,82 g, 26,8 mmol) en DCM (100 mL) gota a gota durante 3 h. Después de la adición completa, se agitó la mezcla durante 10 min seguido de lavado con NHUCl acuoso saturado (3 x 200 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-93:7 + 1 % Et3N) dio producto 24 (5,95 g, 54,7 mmol, 68 %). 1H-RMN (300 MHz, CDCla) ó 5,38 (s, 1H), 4,13 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,59 (s, 4H), 3,56-3,50 (m, 4H), 3,35 (q, J = 5,1 Hz, 2H), 2,88 (t J = 5,1 Hz, 2H), 2,32 (br s, 2H), 2,27-2,15 (m, 6H), 1,62-1,42 (m, 2H), 1,33 (qn, J = 8,7 Hz, 1H), 0,97-0,85 (m, 2H). ^C-NMR (CDCla, 75 MHz) ó 156,4, 98,3, 68,7 (2C), 62,2, 45,5,
40.3, 40,2, 28,6, 20,9, 19,6, 17,3. HRMS (ESI+) calculado para C1yH2aN2NaO4 (M+Na+) 347,1947, hallado 347,1952.
Ejemplo 2. Síntesis de BCN-biotina 25
[0262] A una solución de derivado de BCN 24 (0,80 g, 2,47 mmol) en DCM (25 mL) se añadieron biotina-OSu (0,93 g, 2,71 mmol) y EfeN (0,86 mL, 6,16 mmol). La mezcla reactiva se agitó durante 5 h y se añadió después NaHCO3 (20 mL) acuoso saturado. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 (2 x 20 mL) acuoso saturado, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. La cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-92:8) biotina BCN suministró 25 (1,14 g, 2,1 mmol, 84 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCla): ó 6,57 (s, 1H), 6,44 (s, 1H), 5,48 (s, 1H), 5,37 (s, 1H), 4,52-4,48 (m, 1H), 4,33-4,30 (m, 1H), 4,16 (d, J = 8 Hz, 2H), 3,62 (s, 4H), 3,57 (t, J = 5,2 Hz, 4H), 3,45 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 3,40-3,36 (m, 2H), 3,17-3,12 (m, 1H), 2,92 (dd, J = 8, 4,8 Hz, 1H), 2,72 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 2,33-2,18 (m, 8H), 1,88 (br s, 1H), 1,80-1,57 (m, 6H), 1,49-1,33 (m, 3H), 0,95 (t, J = 9,6 Hz, 2H). 13C-NMR (CDCl3, 75 MHz) ó 172,9, 163,6, 156,4, 98,3, 69,6, 61,3, 59,7, 55,2, 40,3, 40,0, 38,7, 35,5, 28,6, 27,8, 27,6, 25,1, 21,0, 19,7,
17.3. HRMS (ESI+) calculado para C27H43N4O6S (M+H+) 551,2903, hallado 551,2911.
Ejemplo 3. Síntesis de ésten activado 26
[0263] BCN-amina 24 (3,6 g, 11,1 mmol) se disolvió en DCM (150 mL) y se añadieron anhídrido glutárico (1,39 g, 12,2 mmol) y Et3N (4,61 mL, 33,3 mmol). La mezcla reactiva se agitó durante 2 h seguido de adición de DSC (4,3 g, 16,7 mmol). Después de 2 h, la reacción se apagó con H2O (100 mL) y la capa orgánica se lavó con agua (2 x 150 mL), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna flash (EtOAc:MeOH 99:1-94:6) suministró éster activado 26 (4,63 g, 8,6 mmol, 78 %).
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): ó 4,14 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,59 (s, 4H), 3,57-3,52 (m, 4H), 3,44 (q, J = 5,1 Hz, 2H), 3,35 (q, J = 4,8 Hz, 2H). 2,83 (br s, 4H), 2,67 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,33-2,16 (m, 7H), 2,08 (qn, J = 6,9 Hz, 2H), 1,65-1,49 (m, 2H), 1,33 (t, J = 9,0 Hz, 1H), 0,97-0,87 (m, 2H).
LRMS (ESI+) calculado para C26H37N3O9 (M+H+) 536,26, hallado 536,0.
Ejemplo 4. Síntesis de conjugado BCN-doxonnubicina 28a
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[0264] A una solución de éster activado 26 (5 mg, 0,0093 mmol) y doxorrubicina-HCl (27,10 mg, 0,017 mmol) en DMF (0,5 mL) se añadió Et3N (5 |jL, 0,036 mmol) y la mezcla se agitó durante toda la noche. El solvente se extrajo bajo presión reducida y el producto bruto se purificó con cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-80:20) para suministrar BCN-doxorrubicina 28a (6 mg, 0,0062 mmol, 66 %). LRMS (ESI+) calculado para C49H61N3O17 (M+H+) 964,4, hallado 963,9.
Ejemplo 4-2. Síntesis de conjugado BCN-doxorrubicina 28b
[0265] A una solución de H2N-PEG8-COOH (822 mg, 1,86 mmol) en THF:H2O 1:1 (20 mL) se añadieron BCN-OSu (23) (651 mg, 2,23 mmol) y Et3N (774 jL, 5,59 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h y se acidificó a pH 1 seguido de extracción con EtOAc (3 x 35 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el solvente se extrajo bajo presión reducida. El producto bruto se disolvió entonces en DCM seco (20 mL) y posteriormente se añadieron DCC (461 mg, 2,23 mmol) y NHS (257 mg, 2,23 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 1 h, la reacción se filtró y el filtrado se concentró in vacuo. La cromatografía en columna flash (MeCN, MeCN:H2O 30:1) suministró BCN-PEG8-COOSu.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3): ó 5,44 (br s, 1H), 4,14) d, J = 8,1 Hz, 2H), 3,84 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,68-3,63 (m; 30H), 3,56 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,34 (q, J = 5,4 Hz, 2H), 2,90 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 2,85 (s, 4H), 2,36-2,14 (m, 6H). 1,72-1,49 (m, 2H), 1,36 (qn, J = 8,7 Hz, 1H), 1,02-0,88 (m, 2H).
LRMS (ESI+) calculado para C34H54N2O14 (M+Na+) 737,35, hallado 737,3.
[0266] A una solución de doxorrubicina-HCl (27,500 mg, 0,862 mmol) en DMF anhidro (10 mL) se añadieron trietilamina (361 jL, 262 mg, 2,59 mmol) y una solución de BCN-PEGs-COOSu (678 mg, 0,948 mmol) en DMF (10 mL). La mezcla resultante se agitó durante 22 h y se concentró con 3 g de gel de sílice. Después de la purificación vía cromatografía en columna, el producto se obtuvo como un material amorfo rojo (757 mg, 0,66 mmol, 77 %).
LRMS (HPLC, ESI-) calculado para C57H77N2O22 (M-H+) 1141,5, hallado 1142,2.
Ejemplo 5. Síntesis de DIBAC-biotina 30 (representada esquemáticamente en la figura 8)
[0267] A una solución de amina 29, disponible comercialmente de ClickChemistryTools (50 mg, 0,18 mmol) en DMF (2 mL) se añadió biotina-OSu (62 mg, 0,18 mmol) y Et3N (50 jL, 0,36 mmol). La mezcla reactiva se agitó durante 3 h seguido de concentración bajo presión reducida. La cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-90:10) suministró DIBAC-biotina 30 (44 mg, 0,09 mmol, 49 %). 1H-RMN (300 MHz, CDCb): ó 7,66-7,62 (m, 1H), 7,40-7,24 (m, 7H), 6,67-6,60 (m, 1H), 6,53-6,49 (m, 1H), 5,75 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,13 (dd, J = 2,9,14,0 Hz, 1H), 4,47-4,43 (m, 1H), 4,29-4,28 (m; 1H), 3,68 (d, J = 13,9 Hz, 1H), 3,34-3,30 (m, 1H), 3,17-3,08 (m, 2H), 2,92-2,67 (m, 3H), 2,50-2,42 (m, 1H), 2,10-1,95 (m, 2H), 1,73-1,24 (m, 6H). LRMS (ESI+) calculado para C28H30N4O3S (M+H+) 503,2, hallado 503,1.
Ejemplos 6 - 9: Síntesis de conjugado BCN-doxorrubicina 35
[0268] El esquema de reacción para la síntesis del conjugado de BCN-doxorrubicina 35 empezando a partir de Fmoc-citrulina 31, como se realiza en los ejemplos 7 - 10, se muestra en la figura 9.
Ejemplo 6. Síntesis de derivado de citrulina 32
[0269] Se añadieron isobutilcloroformato (99 jL, 0,76 mmol) y N-metilmorfolina (83 jL, 0,76 mmol) a una solución de Fmoc-citrulina 31 (300 mg, 0,76 mmol) en THF a -40 °C. La solución se agitó durante 2 h seguido de la adición de p- aminobenzilalcohol (112 mg, 0,91 mmol) y N-metilmorfolina (100 jL, 0,91 mmol). Después de agitar 1 h la solución se calentó a temperatura ambiente y después de 2 h la mezcla reactiva se concentró bajo presión reducida. La purificación vía cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-80:20) suministró derivado de citrulina 32 (346 mg, 0,69 mmol, 90 %).L RMS (ESI+) calculado para C28H30N4O5 (M+H+) 503,2, hallado 503,1.
Ejemplo 7. Síntesis de dipéptido 33
[0270] El derivado de citrulina 32 (100 mg, 0,20 mmol) se disolvió en DMF (1,6 mL) y se añadió piperidina (333 jL). Después de 2 h, la reacción se concentró bajo presión reducida y el producto bruto se disolvió en DMF (2 mL). Se añadieron Alloc-Val-OSu (60 mg, 0,20 mmol) y Et3N (58 jL, 0,40 mmol), la mezcla se agitó durante toda la noche y posteriormente se concentró in vacuo. La purificación vía cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-90:10) suministró dipéptido 33 (65 mg, 0,14 mmol, 70 %). LRMS (ESI+) calculado para C22H33N5O6 (M+H+) 464,2, hallado 464,0.
Ejemplo 8. Síntesis de dipéptido-doxorrubicina 34
[0271] A una solución de dipéptido 33 (40 mg, 0,086 mmol) en DMF (0,5 mL) se añadieron Et3N (36 jL, 0,26 mmol) y DSC (66 mg, 0,26 mmol). La mezcla reactiva se agitó durante toda la noche seguido de concentración bajo presión reducida. La purificación vía cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-90:10) suministró el producto (30 mg,
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Ejemplo 9. Síntesis de conjugado BCN-doxorrubicina 35
[0272] Dipéptido-doxorrubicina 34 (8 mg, 0,008 mmol) se disolvió en DMF (0,5 mL) y se adicionaron trifenilsilano (7 jL, 0,054 mmol) y Pd(PPh3)4 (0,6 mg, 0,0005 mmol). Después de agitar durante toda la noche, la reacción se concentró bajo presión reducida y se suspendió en DCM (2 mL). Después de la filtración, el producto bruto se obtuvo como un sólido rojo que fue disuelto en DMF (0,5 mL). Se añadieron derivado de BCN 26 (3 mg, 0,006 mmol) y EfeN (2 jL, 0,014 mmol) y la reacción se agitó durante toda la noche. Los solventes se extrajeron bajo presión reducida y la purificación vía cromatografía en columna flash (DCM:MeOH 99:1-60:40) suministró conjugado BCN-doxorrubicina 35 (3 mg, 0,002 mmol, 27 %). LRMS (ESI+) calculado para C68H88N8O22 (M+H+) 1369,8, hallado 1369,3.
Ejemplo 9-2. Síntesis de BCN-vc-PABA-MMAE (37a)
[0273] A una solución de Val-Cit-PAB-MMAE.TFA (8,0 mg, 6,5 jmol) y trietilamina (3,5 jL) en DMF anhidro (1 mL) se añadió BCN-PEG2-OSu (2,7 mg, 6,5 jmolz) (36) como una solución en DMF (0.78 mL). El producto (6 mg, 4 jmol, 62 %) se obtuvo después de la purificación vía HPLC de fase inversa (C18, gradiente H2O/MeCN). LRMs (ESI+) calculado para C74Hn5NnNaO17 (M+Na+) 1452,84, hallado 1452,7.
Ejemplo 9-3. Síntesis de BCN-vc-PABA-MMAF (37b)
[0274] A una solución de Val-Cit-PAB-MMAF.TFA (17,9 mg, 14,3 jmol) en DMF (2 mL) se añadió BCN-PEG2-OSu (17,9 mg, 14,3 jmol) (36) como una solución en DMF (0,78 mL) y trietilamina (6,0 jL). El producto (7 mg, 5 jmol, 35 %) se obtuvo después de la purificación vía HPLC de fase inversa (C18, gradiente H2O/MeCN 1 % AcOH). LRMS (HPLC, ESI+) calculado para C74H114N11O18 (M+H+) 1444,83, hallado 1445,44.
Ejemplo 9-4. Síntesis de BCN-MMAF (38)
[0275] A una solución de Val-Cit-PABA-MMAF (7,6 mg, 0,0074 mmol) en DMF (0,2 mL) se añadió éster de BCN-OSu 26 (8 mg, 0,015 mmol) y EfeN (3 jL, 2,2 mg, 0,022 mmol). Después de reaccionar durante toda la noche, la mezcla se concentró. La purificación vía cromatografía en columna (MeOH/DCM 1/3) produjo el producto deseado (3,4 mg, 0,0022 mmol, 29 %). LRMS (HPLC, ESI+) calculado para C80H125N12O19 (M+H+) 1557,92, hallado 1558,16.
Ejemplo 9-5. Síntesis de BCN-vc-PABA-maitansinoide (39)
[0276] A una suspensión de Val-Cit-PABA-p-alaninoil-maitansinoide (disponible comercialmente de Concortis) (27 mg, 0,022 mmol) en MeCN (2 mL) se añadió trietilamina (9,2 jL, 6,7 mg, 0,066 mmol) y una solución de carbonato BCN-PEG2 OSu (9,2 mg, 0,022 mmol) en MeCN (1 mL). Después de 23 h, la mezcla se vertió fuera en una mezcla de EtOAc (20 mL) y agua (20 mL). Después de la separación, la fase orgánica se secó (Na2SO4) y se concentró. Después de la purificación vía cromatografía en columna (EtOAc^- MeOH/EtOAc 1/4) 22 mg (0,015 mmol, 70 %) del producto deseado se obtuvo. LRMS (ESI+) calculado para C70H97CN10O20 (M+H+) 1432,66, hallado 1434,64.
Ejemplo 9-6. Síntesis de maleimida-vc-PABA-maitansinoide (40)
[0277] A una solución de Val-Cit-PABA-p-alaninoil-maitansinoide (13,9 mg, 0,011 mmol) (disponible comercialmente de Concortis, San Diego, EE.UU.) en DMF anhidro (1 mL) se añadió trietilamina (4,5 jL, 3,3 mg, 0,033 mmol) y N- succinimidilo 6-maleimidocaproato (3,9 mg, 0,013 mmol). Después de la agitación durante un tiempo apropiado, la mezcla se dividió sobre EtOAc (20 mL) y NaHCO3 saturado acuoso (10 mL). Después de la separación, la capa acuosa se extrajo con EtOAc (20 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2SO4) y se concentraron. Después de la purificación vía HPLC de fase inversa (C18, gradiente H2O/MeCN), se obtuvo 10 mg (0,0077 mmol) del producto deseado. LRMS (HPLC, ESI+) calculado para C64H88CIN1üO18 (M+H+) 1390,60, hallado 1390,52.
[0278] Los ejemplos anteriores de 9-3 a 9-6 se representan esquemáticamente en el esquema 10a.
Ejemplo 9-7. Síntesis de DIBAC-vc-PABA-MMAF41 (representado esquemáticamente en el esquema 11)
[0279] DIBAC-amina 29, disponible comercialmente de ClickChemistryTools (430 mg, 1,50 mmol) se disolvió en DCM (15 mL) y se trató con anhídrido de ácido glutárico (213 mg, 1,87 mmol) y Et3N (647 jL, 4,67 mmol) a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 2 h, seguido de la adición de DSC (478 mg, 1,87 mmol). Después de otras 2 h de agitación a temperatura ambiente, se añadió DCM (30 mL) y la reacción se lavó con H2O (3
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[0280] A continuación, a una solución del éster de DIBAC-OSu (1 mg, 0,003 mmol) en DMF (0,2 mL) se añadió vc- PABA-MMAF (2 mg, 0,002 mmol) y trietilamina (1 pL, 0,007 mmol). La solución se agitó durante toda la noche seguido de concentración. La purificación con HPLC (fase invertida, MeCN:H2O + 0,1 % TFA) dio 41 (0,9 mg, 0,0006 mmol, 33 %). El análisis LCMS dio un valor máximo con masa 1510,40 (previsto para C81H113N12O16 = 1510,83).
Ejemplos 9-8 - 9-11. Protocolo general para síntesis de otros doxorrubicina-ciclooctinos
[0281] A una solución de 0,1 M del ciclooctino activado (1-2 equiv) en DCM/DMF (1:1) se añadió doxorrubicina HCl (27,1 equiv) y trietilamina (1,5 equiv). La solución roja se agitó durante toda la noche seguido de concentración in vacuo. La mezcla en bruto se preempaquetó en sílice usando DMF como solvente seguido de cromatografía en columna (DCM^DCM:MeOH 8:2) para producir el producto deseado.
Ejemplo 9-9. Síntesis de doxorrubicina-MFCO 42.
[0282] El éster de MFCO-OSu (disponible comercialmente de Berry and Associates, Dexter, Michigan, EE.UU.) (3,4 mg, 0,009 mmol) se reaccionó con Doxorrubicina HCl (27,5 mg, 0,009 mmol) según el procedimiento general para producir doxorrubicina MCFO 42 (5 mg, 0,006 mmol, 69 %). El análisis LCMS dio un valor máximo con masa 831,88 (previsto para C42H4gFN2NaO13 = 831,31).
Ejemplo 9-10. Síntesis de doxorrubicina-ciclooctino 43.
[0283] Ciclooct-4-in-1-ol (Chem. Ber. 1986, 119, 297-312.) se convirtió en su derivado de carbonato de p-nitrofenilo (5 mg, 0,017 mmol), que se reaccionó con doxorrubicina-HCl (27,5 mg, 0,009 mmol) según el procedimiento general para suministrar doxorrubicina-ciclooctino 43 (6 mg, 0,008 mmol, 94 %).
Ejemplo 9-11. Síntesis de doxorrubidna-DIBO 44
[0284] Según el procedimiento general, carbonato DIBO OSu (disponible comercialmente de LifeTechnologies, 5 mg, 0,013 mmol) se reaccionó con doxorrubicina (27,5 mg, 0,009 mmol) para suministrar DIBO-doxorrubicina 44 (7 mg, 0,008 mmol, 90 %).
[0285] Los ejemplos anteriores de 9-8 a 9-11 se representan esquemáticamente en el esquema 12.
Ejemplo 9-12. Síntesis de alquino-biotina 45
[0286] A una solución de biotina-PEG3-NH2 en diclorometano (6 mL) se añadió trietilamina (54 pL, 39 mg, 0,39 mmol) y éster succinimidílico de ácido pent-4-inoico (25 mg, 0,13 mmol). Después de 19 h, la mezcla reactiva se concentró y el residuo se purificó vía cromatografía en columna (5 ^20 % MeOH en DCM).El producto purificado se disolvió en DCM, se filtró y se concentró, lo que produjo el producto deseado como un sólido blanco (52 mg, 0,11 mmol, 85 %).
Ejemplo 9-13. Síntesis de biotina de hidroxlamina de O-alquilo 47
[0287] A una solución de dietilenglicol (0,89 mL, 1g, 9,42 mmol) en 80 mL de THF seco se añadió PPh3 (5,43 g, 20,7 mmol) y N-hidroxiftalimida. Tras el enfriamiento a 0 °C, un 40 % de solución DEAD en tolueno se añadió (9,44 mL, 20,7 mmol). La mezcla se agitó durante 21 h. El producto se filtró y se lavó con EtOAc. El producto se obtuvo como un sólido blanco (1,73 g, 4,37 g). 1H NMR (300 MHz, CDCla) ó (ppm) 7,85 - 7,66 (m, 8H), 4,31 - 4,20 (m, 4H), 3,92 - 3,78 (m, 4H). A continuación, 1,5 g (3,78 mmol) del producto obtenido en la etapa precedente se disolvieron en 7 N NH3 en MeOH, calentado a 40 °C y agitado durante 20 h. Se enfrió entonces a temperatura ambiente mientras se burbujeaba argón a través de la mezcla reactiva. La mezcla reactiva se concentró y el residuo se disolvió en DCM (50 mL), se filtró y se concentró. El residuo se purificó vía cromatografía en columna (^5 % MeOH en DCM). Rendimiento: 0,46 g (3,38 mmol, 89 %). 1H NMR (300 MHz, CDCla) ó 5,51 (s, 4H), 3,88-3,82 (m, 4H), 3,71-3,64 (m, 4H).
[0288] Los ejemplos anteriores 9-12 y 9-13 se representan esquemáticamente en el esquema 13.
Ejemplos 9-14 - 9.17: Síntesis de derivados de UDP-GalNAc 52-55
[0289] El esquema de reacción de la síntesis de derivados de UDP-GalNAc 52-54, empezando a partir de 51, se muestra en la figura 14. Los compuestos 55 y 56 se compraron en Glycohub, Inc. (EE.UU.).
Ejemplo 9-14. Síntesis de UDP-GalNH2 51
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[0290] El compuesto 48 se preparó a partir de D-galactosamina según el procedimiento descrito para D-glucosamina en Linhardt et al, J. Org. Chem. 2012, 77, 1449-1456. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD): ó 5,69 (dd, J = 6,84, 6,84 Hz, 1H), 5,43-5,41 (m, 1H), 5,35 (dd, J = 10,9, 3,4 Hz, 1H), 4,54 (t, J = 6,48 Hz, 1H), 4,23-4,12 (m, 1H), 4,04 (dd, J = 10,9, 6,1 Hz, 1H), 3,82 (dt, J = 11,1,2,7 Hz, 1H), 2,12 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,99 (s, 3H). LRMS (ESI-) calculado para C12H18N3O11 (M-H+) 410,06, hallado 410,1.
[0291] A continuación, se acopló el compuesto 48 a UMP según Baisch et al. Bioorg. Med. Chem., 1997, 5, 383391).
[0292] Así, una solución de D-uridina-5'-monofosfato sal disósica (1,49 g, 4,05 mmol) en H2O (15 mL) se trató con DOWEx 50Wx8 (forma H+) durante 30 minutos y se filtró. El filtrado se agitó enérgicamente a temperatura ambiente mientras se añadía tributilamina (0,966 mL, 4,05 mmol) gota a gota. Después de 30 minutos de agitación adicional, la mezcla reactiva se liofilizó y se secó adicionalmente sobre P2O5 bajo vacío durante 5 h.
[0293] El uridina-5'-monofosfato de tributilamonio resultante se disolvió en DMF seco (25 mL) en una atmósfera de argón. Se añadió carbonildiimidazol (1,38 g, 8,51 mmol) y la mezcla reactiva se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, se añadió MeOH seco (180 pL) y se agitó durante 15 min para eliminar el exceso de CDI. El MeOH sobrante se extrajo bajo alto vacío durante 15 min. Posteriormente, el compuesto 48 (2,0 g, 4,86 mmol) se disolvió en DMF seco (25 mL) y se adicionó gota a gota a la mezcla reactiva. Se permitió la agitación de la reacción a temperatura ambiente durante 2 d antes de la concentración in vacuo. El consumo del intermedio de imidazol-UMP se controló con MS. La cromatografía en columna flash (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) suministró producto 49 (1,08 g, 1,51 mmol, 37 %).
1H-RMN (300 MHz, D2O): ó 7,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 5,98-5,94 (m, 2H), 5,81-5,79 (m, 1H), 5,70 (dd, J = 7,1, 3,3 Hz, 1H), 5,49 (dd, J = 15,2, 2,6 Hz, 1H), 5,30 (ddd, J = 18,5, 11,0, 3,2 Hz, 2H), 4,57 (q, J = 6,0 Hz, 2H), 4,35-4,16 (m, 9H), 4,07-3,95 (m, 2H), 2,17 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H).
LRMS (ESI-) calculado para C21H29N5O19P2 (M-H+) 716,09, hallado 716,3.
[0294] El compuesto 49 se desacetiló según Kiso et al, Glycoconj. J., 2006, 23, 565-573).
[0295] Así, el compuesto 49 (222 mg, 0,309 mmol) se disolvió en H2O (2,5 mL) y trietilamina (2,5 mL) y MeOH (6 mL) se añadieron. La mezcla reactiva se agitó durante 3 h y luego se concentró in vacuo para suministrar UDP-2-azido-2- deoxi-D-galactosa en bruto (50). 1H-RMN (300 MHz, D2O): ó 7,99 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,02-5,98 (m, 2H), 5,73 (dd, J = 7,4, 3,4 Hz, 1H), 4,42-4,37 (m, 2H), 4,30-4,18 (m, 4H), 4,14-4,04 (m, 2H), 3,80-3,70 (m, 2H), 3,65-3,58 (m, 1H). LRMS (ESI-) calculado para C15H23N5O16P2 (M-H+) 590,05, hallado 590,2.
[0296] Finalmente, a una solución de compuesto 50 en H2O:MeOH 1:1 (4mL) se añadió catalizador Lindlar (50 mg). La reacción se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno durante 5 h y se filtró sobre celita. El filtro se enjuagó con H2O (10 ml) y el filtrado se concentró in vacuo para suministrar la UDP-D-galactosamina (UDP-GalNH2, 51) (169 mg, 0,286 mmol, 92 % rendimiento después de dos pasos). 1H-RMN (300 MHz, D2O): ó 7,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,995,90 (m, 2H), 5,76-5,69 (m, 1H), 4,39-4,34 (m, 2H), 4,31-4,17 (m, 5H), 4,05-4,01 (m, 1H), 3,94-3,86 (m, 1H), 3,823,70 (m, 3H), 3,30-3,16 (m, 1H). LRMS (ESI-) calculado para C15H25N3O16P2 (M-H+) 564,06, hallado 564,1.
Ejemplo 9-15. Síntesis de UDP-GalNAz 52
[0297] El éster succinimidílico de ácido azidoacético se preparó según el procedimiento descrito en Hamilton et al, Chem. Eur. J., 2012, 18, 2361-2365.
[0298] La UDP-D-galactosamina (51) (82 mg, 0,145 mmol) se disolvió en 0,1 M de NaHCO3 (2 mL) y éster succinimidílico de ácido azidoacético (86 mg, 0,435 mmol) y DMF (2 mL) se añadieron. La reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y se concentró posteriormente in vacuo. La cromatografía en columna flash (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) suministró UDP-GalNAz (52) (34 mg, 0,052 mmol, 36 %).
"h-RMN (300 MHz, D2O): ó 8,73 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 5,90-5,82 (m, 2H), 5,49 (dd, J = 6,9, 3,3 Hz, 1H), 4,29-4,05 (m, 7H), 4,03-3,85 (m, 4H), 3,72-3,61 (m, 2H). LRMS (ESI-) calculado para C17H23N6O17P2 (M-H+) 647,08, hallado 647,1.
Ejemplo 9-16. Síntesis de UDP-GalNAc-ina 53
[0299] El éster succinimidílico de ácido pent-4-inoico se preparó según el procedimiento descrito en Rademann et al, Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51,9441-9447.
[0300] UDP-D-galactosamina (51) (53 mg, 0,094 mmol) se disolvió en 0,1 M de NaHCO3 (2 mL) y éster succinimidílico de ácido pent-4-inoico (37 mg, 0,188 mmol) y DMF (2 mL) se añadieron. La reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y se concentró in vacuo. La cromatografía en columna flash (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) suministró UDP-GalNAc-ina (53) (42 mg, 0,065 mmol, 69 %).
1H-RMN (300 MHz, D2O): ó 7,78 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 5,84-5,76 (m, 2H), 5,39 (dd, J = 6,8, 3,2 Hz, 1H), 4,22-4,16 (m, 2H), 4,14-3,97 (m, 5H), 3,88-3,85 (m, 1H), 3,81-3,75 (m, 1H), 3,63-3,55 (m, 2H), 2,45-2,28 (m, 5H), 2,19 (t, J = 2,4 Hz, 1H). LRMS (ESI-) calculado para C20H29N3O17P2 (M-H+) 644,09, hallado 644,1.
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[0301] El éster sucdnimidílico de ácido levulínico se preparó según el procedimiento para éster succinimidílico de ácido pent-4-inoico descrito en Rademann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51,9441-9447.
1H-RMN (300 MHz, CDCla): ó 2.81 (s, 4H), 2,77 (s, 4H), 2,14 (s, 3H).
[0302] UDP-D-galactosamina (51) (53 mg, 0,094 mmol) se disolvió en 0,1 M de NaHCO3 (2 mL) y éster succinimidílico de ácido levulínico (40 mg, 0,188 mmol) y DMF (2 mL) se añadieron. La reacción se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente y el solvente se extrajo bajo presión reducida. La cromatografía en columna flash (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) suministró UDP-GalNLev (54) (10 mg, 0,015 mmol, 16 %).
1H-RMN (300 MHz, D2O): ó 7,78 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 5,82-5,77 (m, 2H), 5,36 (dd, J = 6,8, 3,2 Hz, 1H), 4,22-4,15 (m, 2H), 4,13-3,95 (m, 5H), 3,88-3,84 (m, 1H), 3,82-3,75 (m, 1H), 3,64-3,52 (m, 3H), 2,74-2,61 (m, 2H), 2,47-2,37 (m, 2H), 2,05 (s, 3H). LRMS (ESI-) calculado para C20H31N3O18P2 (M-H+) 662,10, hallado 662,1.
Ejemplo 9-18. Síntesis de BCN-MMAF (56)
[0303] A una solucón de MMAF.TFA (8,1 mg, 0,0096 mmol) en DMF (0,3 mL) se añadió Et3N (5 pL, 3,6 mg, 0,036 mmol) y BCN-PEG2-OSu (36) (19 mg, 0,045 mmol). Después de reaccionar durante toda la noche, la mezcla se concentró. La purificación vía cromatografía en columna (DCM^- MeOH/DCM 1/3) produjo el producto deseado. LRMS (HPLC; ESI+) calculado para C55H87N6O13 (M+H+) 1039,63, hallado 1039,72.
Protocolo general para modificación de IgG
Recorte de glicanos IgG con endo S
[0304] El recorte de glicanos IgG se realizó utilizando endo S de Streptococcus pyogenes (disponible comercialmente de Genovis, Lund, Suecia). El IgG (10 mg/mL) se incubó con endo S (40 U/mL) en 25 mM Tris pH 8,0 durante aproximadamente 16 horas a 37 °C. El IgG desglicosilado se concentró y se lavó con 10 mM de MnCh y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 utilizando una membrana Amicon Ultra-0,5, Ultracel-10 (Millipore).
Análisis de espectros de masas
[0305] Una solución de 50 pg de IgG (modificado), 1 M de Tris-HCl con pH 8,0, 1 mM de EDTA y 30 mM de DTT con un volumen total de aproximadamente 70 pL se incubó durante 20 minutos a 37 °C para reducr los puentes disulfuro que permiten analizar las cadenas tanto ligeras como pesadas. Si están presentes, las funcionalidades de azida se reducen a aminas bajo estas condiciones. Muestras reducidas se lavaron tres veces con milliQ utilizando membrana Amicon Ultra-0,5, Ultracel-10 (Millipore) y se concentraron a 10 pM de IgG (modificado). El IgG reducido se analizó por tiempo de vuelo con ionización por electrospray (ESI-TOF) en un JEOL AccuTOF. Los espectros desconvolucionados se obtuvieron utilizando software Magtran.
Ejemplo 10. Recorte de trastuzumab (figura 15a + 15b)
[0306] Se sometió trastuzumab al protocolo de recorte anterior. Después de la desconvolución de los valores máximos, el espectro de masas mostró un valor máximo de la cadena ligera y dos valores máximos de la cadena pesada. Los dos valores máximos de la cadena pesada pertenecían a un producto principal (49496 Da, 90 % de cadena pesada total), resultante de trastuzumab sustituido con GlNAc(Fuc) central, y un producto menor (49351 Da, ± 10 % de cadena pesada total), resultante de trastuzumab sustituido con GlcNac central.
Ejemplo 11. Recorte de bevacizumab
[0307] El tratamiento de bevacizumab similar al del trastuzumab llevó a la formación de un producto de cadena pesada principal (50062 Da, ± 90 %) junto con unos pocos productos de cadena pesada menor (± 10 %).
Ejemplo 12. Recorte de cetuximab
[0308] El cetuximab difiere del trastuzumab en el hecho de que contiene un segundo sitio de N-glicosil ación en N88. El glicano en N88 se localiza en la región Fab y tiene una constitución diferente del glicano en N297. El tratamiento del cetuximab similar al trastuzumab llevó a la formación de un rango de productos de cadena pesada con masas de 51600 Da-52300 Da (valores máximos en 51663 Da y 51808 Da), lo que indica que solo se recortó un glicano por Endo S, supuestamente en N297.
Ejemplo 12-1. Recorte de rituximab
[0309] El tratamiento del rituximab similar al trastuzumab llevó a la formación de un producto de cadena pesada principal (49408 Da).
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[0310] El trastuzumab se incubó con endoglicosidasa H (EndoH) de Streptomyces picatus (disponible comercialmente de New England BioLabs). Se añadieron concentraciones en aumento de endo H < 115 u/pl) a trastuzumab (10 mg/mL) en 50 mM de citrato sódico con pH 5,5 y se incubaron durante 16 h a 37 °C. Los espectros de masas solo mostraron los principales valores máximos correspondientes a la cadena pesada glicosilada nativa (50589 y 50752 Da que corresponden a las isoformas G0F y G1F, respectivamente), lo que indica que el trastuzumab no se puede recortar usando endo H.
Ejemplo 12-3. Intento de recorte de trastuzumab con endo M
[0311] El trastuzumab (10 mg/mL) se incubó con concentraciones en aumento de endo-p-N-acetilglucosaminidasa (endo M, < 231 mU/mL) de Mucor hiemalis (disponible comercialmente de TCI Europe N.V.) en 50 mM de citrato sódico con pH 6,0 y se incubó durante 16 h a 37 °C. Los espectros de masas mostraron los principales valores máximos correspondientes a la cadena pesada glicosilada nativa (50589 y 50752 Da que corresponden a las isoformas G0F y G1F, respectivamente). Además, se observó un producto menor (49347 Da, ± 5 % de la cadena pesada total), resultante de la cadena pesada sustituida con GlcNac central. Estos resultados muestran que solo las glicoformas de trastuzumab que carecen de la fucosa central pueden recortarse con endo M.
Glicosiltransferencia de derivado de galactosa (por ejemplo, azidoazúcar) con Gal-T1(Y289L)
[0312] La introducción enzimática de derivado de galactosa (por ejemplo azúcar que contiene azida) en IgG se
efectuó con un mutante pp,4) -galactosiltransferasa [p(1,4)-Gal-T1(Y289L)] bovina. El IgG desglicosilado
(preparado como se ha descrito anteriormente, 10 mg/mL) se incubó con un derivado de UDP-galactosa modificado (por ejemplo, un derivado UDP de azúcar modificado con azida) (0,4 mM)p(/l,4) -Gal-T1(Y289L) (1 mg/mL) en
10 mM de MnCl2 y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C.
[0313] El IgG funcionalizado (por ejemplo, IgG funcionalizado con azida) se incubó con proteína A agarosa (40 pL por mg de IgG) durante 2 horas a 4 °C. La proteína A agarosa se lavó tres veces con PBS y el IgG se eluyó con 100 mM de glicina-HCl con pH 2,7. El IgG eluido se neutralizó con 1 M de Tris-HCl con pH 8,0 y se concentró y se lavó con PBS utilizando una membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) hasta una concentración de 15-20 mg/mL.
Ejemplo 13. Trastuzumab(GalNAz)2 (figura 15c)
[0314] El trastuzumab se sometió al protocolo de glicosiltransferencia con UDP-N-azidoacetilgalactosamina 52 (UDP-GalNAz). Después de la purificación de afinidad de la proteína A el análisis de espectros de masas indicó la formación de un producto principal de (49713 Da, 90 % de la cadena pesada total), resultante de la transferencia de GalNAz al trastuzumab sustituido con GlcNAc(Fuc) central, y un producto menor (49566 Da, ± 10 % de la cadena pesada total), resultante de la transferencia de GalNAz al trastuzumab sustituido con GlcNAc central.
Ejemplo 14. Bevacizumab(GalNAz)2
[0315] El bevacizumab (7,5 mg, 10 mg/mL) se recortó con Endo S según el protocolo general. El bevacizumab recortado (10 mg/mL) se incubó con UDP-GalNAz 52 (65 pL, 10 mM) y |(1,4)-GalT1(Y289L) (75 pL, 2 mg/mL) en 10 mM de MnCh y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C. La purificación con ProtA dio el bevacizumab modificado (3,2 mg). El análisis AccuTOF mostró la formación de un producto de cadena pesada principal (50282 Da, ± 95 %).
Ejemplo 15. Cetuximab(GalNAz)2
[0316] Cetuximab (7,5 mg, 10mg/mL) se recortó con endo S según el protocolo general. El cetuximab recortado (10 mg/mL) se incubó con UDP-GalNAz 52 (65 pL, 10 mM) y |(1,4)-GalT1(Y289L) (75 pL, 2 mg/mL) en 10 mM de MnCl2 y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C. La purificación con ProtA dio el cetuximab modificado (3,2 mg). El análisis AccuTOF mostró la formación de dos productos de cadena pesada principales (51884 Da y 52029 Da), según el recorte del glicano N297, pero no del glicano Fab.
Ejemplo 15-1. Rituximab(GalNAz)2
[0317] El rituximab (7,5 mg, 10mg/mL) se recortó con Endo S según el protocolo general. El rituximab recortado (10 mg/mL) se incubó con UDP-GalNAz 52 (65 pL, 10 mM) y |(1,4)-GalT1(Y289L) (75 pL, 2 mg/mL) en 10 mM de MnCl2 y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C. La purificación con ProtA dio el Rituximab modificado (3,2 mg). El análisis AccuTOF mostró la conversión completa al producto deseado (masa 49625, masa prevista 49627).
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[0318] El girentuximab se recortó utilizando endo S según el protocolo general anteriormente descrito, lo que condujo a la formación de un producto de cadena pesada principal (49427 Da). El girentuximab recortado se incubó posteriormente con UDP-GalNAz y p(1,4)-Gal-T1(Y289L) como se ha descrito anteriormente, lo que llevó a la formación de un producto de cadena pesada principal (49643 Da).
Ejemplo 15-3. Trastuzumab(GalNAc-ina)2
[0319] El trastuzumab recortado (100 pL, 10 mg/mL, 6,6 nmol), obtenido mediante el tratamiento con endo S del trastuzumab según el protocolo general, se incubó con UDP-GalNAc-ina (53) (5 pL, 10 mM) y p(1,4)-Gal-T1(Y289L) (5 pL, 2 mg/mL) en 10 mM de MnCh y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C. La mezcla en bruto se purificó con ProtA para suministrar trast-(GalNAc-ina)2 (0,43 mg). El análisis AccuTOF mostró 90 % de conversión al producto deseado (masa 49735, masa prevista 49736), se observó 10 % de subproducto (masa 50379).
Ejemplo 15-4. Trastuzumab (GalNLev)2
[0320] El trastuzumab recortado (100 pL, 10 mg/mL, 6,6 nmol), obtenido mediante el tratamiento con endo S del trastuzumab según el protocolo general, se incubó con UDP-GalNLev (54) (10 pL, 10 mM) y p(1,4)-Gal-T1(Y289L) (7,5 pL, 2 mg/mL) en 10 mM de MnCh y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C. La mezcla en bruto se purificó con ProtA para dar trast-(GalNLev)2 (0,53 mg). El análisis AccuTOF mostró 95 % de conversión al producto deseado (masa 49753, masa prevista 49754), se observó 5 % de subproducto (masa 504 1 7).
Recorte de transferencia de + GalNAz a IgG de plasma agrupado.
Ejemplo 15-5. Análisis espectrométrico de masa de IgG de plasma
[0321] A la mezcla reactiva que contiene 0,5 mg de IgG de plasma agrupado (Lee Biosolutions, Inc) se añadió PBS (220 pL) y tampón de digestión (250 pL, 0,1 mg/mL de papaína, 0,02 M de cisteína, 0,02 M de EDTA en PBS) seguido de incubación durante 1 h a 37 °C. Posteriormente, se añadió lechada de proteína A (100 pL) y se rotó la mezcla sucesivamente durante 1 h. La proteína A se lavó con PBS (3 * 1 mL) seguido de elución con tampón de Glicina-HCl (pH 2,7, 0,1 M, 300 pL). El tampón de elución se neutralizó con Tris-HCl (pH 8, 0,1 M, 80 pL) y posteriormente se tomó una muestra para el análisis de masa según el protocolo estándar (figura 14a).
Ejemplo 15-6. Recorte de IgG de plasma agrupado
[0322] El plasma agrupado IgG (170 pL, 14 mg/mL) se recortó con endo S (16 pL, 20 u/pl) en 98 pL de Tris-HCl (25 mM, pH 8,0) durante 16 horas a 37 °C. El análisis se realizó según el protocolo de análisis. Las mediciones del AccuTOF mostraron conversión completa.
[0323] Los ejemplos anteriores 15-5 y 15-6 se representan esquemáticamente en el esquema 16.
Ejemplo 15-7. Transferencia de GalNAz a IgG de plasma.
[0324] El IgG de plasma recortado (46 pL, 10,8 mg/mL, 3,3 nmol) se incubó con UDP-GalNAz 52 (3,3 pL, 10 mM) y p1,4-Gal-T1(Y289L) (2,5 pL, 2 mg/mL) en 10 mM de MnCh y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C. El análisis se realizó según el protocolo de análisis de IgG del plasma y las mediciones del AccuTOF mostraron conversión completa.
Conjugación de IgG modificado con azida mediante cicloadición con una sonda de ciclooctino
[0325] Una molécula enlazada de manera covalente con BCN o funcionalizada con DIBAC (en DMSO) se diluyó en PBS. El IgG purificado que contiene azidas (100 pL de 10 mg/mL) se añadió y la mezcla reactiva se rotó sucesivamente durante de 12 a 72 horas a 4 °C. El conjugado de IgG resultante se concentró y se lavó con PBS utilizando a membrana Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 (Millipore) hasta una concentración final de 10 mg/mL.
Reacciones de conjugación del IgG modificado con azida mediante cicloadición promovida por tensión con una sonda de ciclooctino
[0326] Después de la purificación de la proteína A, el IgG que contiene azida (100 pM o 15 mg/mL) se añadió a 0,01 de volumen de 40 mM de una solución madre de una molécula funcionalizada con ciclooctino enlazada de manera covalente (4 equivalentes) en DMSO o DMF, se mezcló inmediatamente y se rotó sucesivamente durante de 12 a 24 horas a temperatura ambiente. Si era necesario, este procedimiento se repitió para obtener la conversión completa.
[0327] El conjugado de IgG resultante se concentró y se lavó con PBS utilizando una membrana Amicon Ultra-0,5, Ultracel-10 (Millipore) hasta una concentración final de 10 mg/mL.
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[0328] En el caso del ADC, este paso se sustituyó mediante purificación vía cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex200.
Ejemplo 16. Conjugación de BCN-biotina a trastuzumab(GalNAz)2
[0329] El conjugado de BCN-biotina 25 (2 pL 100 mM en DMSO) se diluyó en PBS (98 pL) y 5 pL de esta solución se sometieron a trastuzumab(GalNAz)2 (5 pL 10 mg/ml en PBS). El lavado y la concentración, seguidos de análisis de espectros de masas indicaron la presencia de un producto principal (50294 Da, 90 % de la cadena pesada total) y un producto menor (50148 Da, ± 10 % de la cadena pesada total).
Ejemplo 17. Conjugación de DIBAC-biotina a trastuzumab(GalNAz)2
[0330] El conjugado DIBAC-biotina 30 (2 pL 100 mM en DMSO) se diluyó en PBS (98 pL) y 5 pL de esta solución se sometieron a trastuzumab(GalNAz)2 (5 pL 10 mg/ml en PBS). El lavado y la concentración, seguidos de análisis de espectros de masas, indicaron la presencia de un producto principal (50247 Da, 90 % de la cadena pesada total) y un producto menor (50101 Da, ± 10 % de la cadena pesada total).
Ejemplo 17-1. Conjugación de DIBAC-vc-PABA-MMAF41 a trastuzumab(GalNAz)2
[0331] Después de 1 día, según análisis AccuTOF, conversión completa. Masa observada 51248, masa prevista 51248.
Ejemplo 18. Conjugación de BCN-doxorrubicina 28a a trastuzumab(GalNAz)2
[0332] La BCN-doxorrubicina 28a (4 pL de 50 mM de solución en DMSO) se diluyó en PBS (896 pL) y se sometió a trastuzumab(GalNAz)2 como se describe en el procedimiento general. El lavado y la concentración, seguidos de análisis de espectros de masas indicaron la presencia de un producto principal (50708 Da, 90 % de la cadena pesada total) y un producto menor (50294 Da, ± 10 % de la cadena pesada total).
Ejemplo 19. Conjugación de BCN-doxorrubicina 35 a trastuzumab(GalNAz)2
[0333] La BCN-doxorrubicina 35 (4 pL 50 mM en DMSO) se diluyó en PBS (896 pL) y se sometió a trastuzumab(GalNAz)2 como se describe en el procedimiento general. El lavado y la concentración, seguidos de análisis de espectros de masas indicaron la presencia del conjugado de trastuzumab(GalNAz)2 y BCN-doxorrubicina 35 (51114 Da).
Ejemplo 20. Conjugación de BCN-PEG8-doxorrubicina 28b a trastuzumab(GalNAz)2
[0334] La incubación de BCN-PEGs-doxorrubicina (400 pM, 4 eq) con trastuzumab(GalNAz)2 (100 pM) en PBS durante 16 h llevó a una conversión completa en trastuzumab(PEGs-doxorrubicina)2 (productos de cadena pesada entre 50467 y 51134 Da con valor máximo mayor de 50881 Da que corresponde a la cadena pesada con GalNAzGlcNac(Fuc) central conjugada a BCN-PEGs-doxorrubicina).
Ejemplo 21. Conjugación de BCN-vc-PABA-doxorrubicina 33 a trastuzumab(GalNAz)2
[0335] La BCN-doxorrubicina 33 (4 pL de 50 mM solución en DMSO) se diluyó en PBS (896 pL) y se sometió a trastuzumab(GalNAz)2 como se describe en el procedimiento general. El lavado y la concentración, seguidos de análisis de espectros de masas indicaron la presencia del conjugado de trastuzumab(GalNAz)2 y BCN-vc-PABA- doxorrubicina 33 (51114 Da).
Ejemplo 22. Conjugación de BCN-vc-PABA-MMAE 37a a trastuzumab(GalNAz)2
[0336] La incubación de BCN-vc-PABA-MMAE 37a (125 pM, 5 eq) con trastuzumab(GalNAz)2 (25 pM) en PBS durante 16 h llevó a una conversión completa en trastuzumab(vc-PABA-MMAE)2 (productos de cadena pesada entre 51137 y 51600 Da con valor máximo principal de 51283 Da que corresponde a cadena pesada con GalNAzGlcNac(Fuc) central conjugada a BCN-vc-MMAE, ± 95 % de cadena pesada total, y un valor máximo menor de 50520 Da debido a la fragmentación del conector de PABA durante la espectrometría de masas, ± 5 % de cadena pesada total).
Ejemplo 23. Conjugación de BCN-vc-PABA-MMAF37b a trastuzumab(GalNAz)2
[0337] La incubación de BCN-vc-PABA-MMAF 37b (600 pM, 4 + 2 eq) con trastuzumab(GalNAz)2 (100 pM) en PBS durante aproximadamente 16 h llevó a una conversión completa en trastuzumab(vc-PABA-MMAF)2 (productos de cadena pesada entre 51032 y 51500 Da con valor máximo principal de 51181 Da que corresponde a la cadena pesada con GalNazGlcNac(Fuc) central conjugada a BCN-vc-PABA-MMAF, ± 95 % de la cadena pesada total, y un
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valor máximo menor a 50407 Da debido a la fragmentación del conector de PABA durante la espectrometría de masas, ± 5 % de la cadena pesada total).
Ejemplo 24. Conjugación de BCN-MMAF 38 a trastuzumab(GalNAz)2
[0338] TrastuzumabíMMAF)?: incubación de BCN-MMAF 38 con trastuzumab(GalNAz)2 (100 pM) en PBS durante aproximadamente 16 h llevó a una conversión completa en trastuzumab(MMAF)? (productos de cadena pesada entre 50 636 y 51100 Da con valor máximo principal de 50783 Da que corresponde con la cadena pesada con GalNazGlcNac(Fuc) central conjugada a BCN-MMAF).
Ejemplo 24-2. Conjugación de BCN-MMAF 57 a trastuzumab(GalNAz)2
[0339] Trastuzumab(MMAF)?: la incubación de BCN-MMAF (57, figura 10b) con trastuzumab(GalNAz)? (100 pM) en PBS durante aproximadamente 16 h llevó a una conversión completa en trastuzumab(MMAF)? (productos de cadena pesada entre 50636 y 51100 Da con valor máximo mayor de 50783 Da que corresponde con la cadena pesada con GalNAzGlcNAc(Fuc) central conjugada a BCN-MMAF 57).
Ejemplo 25. Conjugación de BCN-vc-PABA-maitansinoide 39 a trastuzumab(GalNAz)2
[0340] La incubación de BCN-vc-PABA-maitansinoide (39) (800 pM, ? x 4 eq) con trastuzumab(GalNAz)? (100 pM) en PBS durante aproximadamente 40 h llevó a una conversión completa en trastuzumab(vc-PABA-maitansinoide)? (productos de cadena pesada entre 50781 y 51600 Da con valor máximo principal de 5117? Da que corresponde a la cadena pesada con GalNAzGlcNac(Fuc) central conjugada a BCN-vc-PABA-maitansinoide, ± 95 % de cadena pesada total).
Conjugación de conjugados cidooctino-doxorrubicina 42-44 a trastuzumab(GalNAz)2 mediante cicloadición promovida por tensión
[0341] A una solución de trastuzumab-(GalNAz)? (7,5 pL, ?0 mg/ml, 1 nmol) en PBS se añadió una solución de ciclooctino (?,5 pL, ?,4 mM 5 % DMF en MiliQ, 6 nmol). La reacción se rotó sucesivamente seguido de análisis AccuTOF.
Ejemplo 26: Conjugación de MCFO-doxorrubicina 42 a trast(GalNAz)2
[034?] Después de 5 días, según el análisis AccuTOF, conversión del 80 %. Masa observada 50548, masa prevista 50550.
Ejemplo 27: Conjugación de DIBO-doxorrubicina 43 a trast(GalNAz)2
[0343] Después de 5 días, según el análisis AccuTOF, conversión del 30 %. Masa observada 50530, masa prevista 50544.
Ejemplo 28: Conjugación de ciclooctino-doxorrubicina 44 a trast(GalNAz)2
[0344] Después de 5 días, según el análisis AccuTOF, conversión del 50 %. Masa observada 50434, masa prevista 50449.
Ejemplo 29: CuAAC de trastuzumab-(N3)2 con alquino-biotina 45
[0345] A una solución de trast-(GalNAz)? (10 pL, 9,6 mg/ml, 0,64 nmol) (derivado de 5?) en PBS se añadió una solución de alquino-biotina (45,1 pL, 10 mM, 10 nmol) y una premezcla de materia prima (1 pL, 10 mM de CuSO4, 10 mM de ascorbato sódico, 10 mM de tris((1-((O-etil)carboximetil)-(1,?,3-triazol-4-il))metilamina en ?0 % de MeCN en miliQ). La reacción se rotó sucesivamente durante toda la noche, tiempo después del cual el análisis AccuTOF mostró la formación completa del producto deseado (masa observada 50195), como se indica en la figura 17.
Ejemplo 30: CuAAC de trastuzumab-ina2 con azida-biotina 46
[0346] A una solución de trast-(GalNAc-ina)? derivada de 53 (10 pL, 9,6 mg/ml, 0,64 nmol) en PBS se añadió una solución de biotina-N3 46 (1 pL, 10 mM, 10 nmol) y una premezcla de materia prima (1 pL, 10 mM de CuSO4, 10 mM de ascorbato sódico, 10 mM de tris((1-((O-etil)carboximetil)-(1,?,3-triazol-4-il))metilamina en ?0 % de MeCN en miliQ). La reacción se rotó sucesivamente durante toda la noche y posteriormente el análisis AccuTOF mostró conversión del 50 % (masa 50353, masa prevista 50351), como se indica en la figura 18.
Ejemplo 31: Conjugación de maleimida-vc-PABA-maitansinoide 40 a trastuzumab (N297C)
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[0347] El trastuzumab(N297C) (4 mg, 10 mg/mL) se incubó con DTT (10 eq) en PBS con pH 7,4 durante 2 horas a 22 °C. El exceso de DTT se extrajo mediante purificación con filtro de centrifugado y el IgG reducido (10 mg/mL) se incubó con ácido deshidroascórbico (20 eq) durante 3 horas a 22 °C. Maleimida-vc-PABA-maitansinoide 40 (3 eq) se añadió y la mezcla reactiva se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, después de lo cual el exceso de maleimida-vc-PABA-maitansinoide 40 se extrajo mediante purificación con filtro de centrifugado. El análisis AccuTOF mostró la formación de tres productos de cadena pesada, que corresponden a la cadena pesada no modificada (49133 Da, ± 10 % de la cadena pesada total), la cadena pesada conjugada a 1 maitansinoide (50454 Da, ± 85 % de la cadena pesada total) y la cadena pesada conjugada a 2 maitansinoides (50774 Da, ± 5 % de la cadena pesada total). No se detectó conjugación a la cadena ligera.
Ejemplo 32: Ensayo de estabilidad de plasma in vitro
[0348] El plasma humano (preparado utilizando heparina) se centrifugó a 200 g durante 10 minutos a 4 °C y el sobrenadante se incubó con proteína A agarosa (Kem-En-Tec) durante 1 hora a 4 °C para agotar el IgG. El plasma agotado se filtró esterilizado utilizando un filtro de 0,22 pm (Whatman). El conjugado de trastuzumab-doxorrubicina derivado de 28a se añadió al plasma humano estéril a una concentración final de 100 pg/ml y se incubó a 37 °C en una incubadora de CO2 para mantener los niveles del pH del plasma cerca del pH fisiológico de 7,2. Las muestras se tomaron a 0, 24, 48 y 144 horas y se almacenaron a -80 °C. El conjugado de trastuzumab se purificó con proteína A agarosa seguido de análisis MS. Las muestras de plasma humano se incubaron con proteína A agarosa durante 1 hora a 4 °C, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y el conjugado de trastuzumab se eluyó con 100 mM de glicina-HCl con pH 2,7 seguido de neutralización con 1 M de Tris-HCl con pH 8,0. El análisis MS mostró que el valor máximo que corresponde al conjugado de trastuzumab-doxorrubicina (50708 Da) no se redujo con el tiempo. Además, no se pudo detectar ningún valor máximo correspondiente a productos de degradación, lo que demuestra que el conjugado es estable durante al menos 144 horas en el plasma humano.
Ejemplo 33: Eficacia in vitro
[0349] Células SK-Br-3 (Her2+), SK-OV-3 (Her2+) y MDA-MB-231 (Her2-) se colocaron en placas con placas de 96 pocillos (5000 células/pocillo) en RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) complementadas con 10 % de suero fetal de ternera (FCS) (Invitrogen, 200 pl/pocillo) y se incubaron durante toda la noche a 37 °C y 5 % de CO2. Una serie de diluciones triples (que varían de ± 0,002 a 100 nM) de los compuestos filtrados de forma estéril se prepararon en RPMI 1640 GlutaMAX complementadas con 10 % de FCS. Después de la eliminación del medio de cultivo, la serie de concentraciones se añadieron in quadruplo y se incubaron durante tres días a 37 °C y 5 % de CO2. El medio de cultivo se sustituyó por 0,01 mg/mL de resazurina (Sigma Aldrich) en RPMI 1640 GlutaMAX complementado con 10 % de FCS. Después de 4 a 6 horas a 37 °C y 5 % de CO2, se detectó fluorescencia con un lector de placa de fluorescencia (Tecan Infinnite 200) a 540 nm de excitación y 590 nm de emisión. Las unidades fluorescentes relativas (RFU) se normalizaron al porcentaje de viabilidad celular mediante el ajuste de los pocillos sin células a 0 % de viabilidad y los pocillos con la dosis más baja de compuesto a 100 % de viabilidad. Para cada condición se muestra el porcentaje de viabilidad celular media ± eem.
[0350] La citotoxicidad in vitro de trastuzumab-(vc-PABA-MMAE)2 (derivado de 37a), trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2 (derivado de 37b), trastuzumab-(vc-PABA-maitansinoide)2 (derivado de 39), trastuzumab-(maitansinoide)2 y trastuzumab(N297C)-(vc-PABA-maitansinoide)2 (derivado de 40) se compararon con T-DM1 como un control positivo y trastuzumab y rituximab-(vc-PABA-maitansinoide)2 como controles negativos. Todos los ADC basados en trastuzumab afectan la viabilidad de las líneas celulares Her2 positivas SK-Br-3 y SK-OV-3, pero no de la línea celular Her2 negativa MDA-MB-231, lo que muestra que estos ADC actúan sobre las células Her2 positivas. En la línea celular Her2 negativa MDA-MB-231, solo T-DM1 muestra una reducción ligera en la viabilidad celular en la concentración más elevada (100 nM).
Ejemplo 34: Conjugación, radiom arcado y determinación de IRF de D TPA
[0351] Trastuzumab(MMAF)2 (derivado de conjugación de trast(GalNAz)2 y 37b) y trastuzumab(maitansinoide)2 (derivado de conjugación de trast(GalNAz)2 y 39), trastuzumab desglicosilado (obtenido de tratamiento de trastuzumab y endo S) y trastuzumab nativo se conjugaron con isotiocianato-DTPA (Macrocyclics, Houston, TX) y se marcaron con 111In (Covidien, Petten). Para los experimentos con animales, todos los constructos se marcaron en actividad específica entre 2,7 y 3,4 MBq/pg.
Ejemplo 35: Estudios PK/biodistribución
[0352] Ratones sin pelo BALB/c (n=15) se inocularon subcutáneamente con células 5 x 106 SK-OV-3 (volumen de inyección: 200 pl) en el flanco adecuado. 14 días después de la inducción tumoral, grupos de cinco ratones se inyectaron i.v. con 15-20 MBq de anticuerpo marcado con 111In, marcados en una dosis de proteína de 25 pg. Para valorar la estabilidad in vivo y las farmacocinéticas de los conjugados, muestras de sangre de 50 pl se tomaron vía sangrado submandibular a 0,5, 1,30 min, 1, 2 y 4 horas, y 1, 2, 5, 7, 9, 13, 16 y 21 días después de la inyección de las preparaciones de anticuerpo radiomarcadas.
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[0353] Una semana después de la inyección (3 d p.i.) se sometió a los ratones a eutanasia y diseccionaron para determinar la biodistribución del radiomarcado en tejidos pertinentes. La distribución de tejido de trastuzumab(MMAF)2 (derivado de 37b), trastuzumab(maitansinoide)2 (derivado de 39) y trastuzumab desglicosilado es comparable con la del trastuzumab nativo.
Ejemplo 37: Eficacia in vivo
[0354] Ratones SHO hembra (Crl:SHO-Prkdcscid Hrhr, de 6 a 9 semanas de edad al principio de la fase experimental, obtenidos de Challes River Laboiatoriess, L'Arbresles, Francia) se anestesiaron con cetamina/xilazina, la piel se aseptizó con una solución de clorhexdina, se hizo una incisión en el nivel de la región interescapular, se colocó un fragmento tumoral de 20 mm3 (modelo de xenoinjerto derivado de paciente con cáncer de mama HBCx- 13B) en el tejido subcutáneo y la piel se cerró con clips. Cuando el volumen tumoral estuvo en el rango de 60 a 200 mm3, grupos de cuatro ratones se inyectaron i.v. con cualquier vehículo trastuzumab-(vc-PABA-maitansinoide)2 (derivado de 39, a 3 mg/kg y 9 mg/kg), trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2 (derivado de 37b, a 3 mg/kg y 9 mg/kg), y T- DM1 (9 mg/kg).
Análisis espectrométrico de masas detallado de trastuzumab y derivados
[0355] El trastuzumab nativo, trastuzumab(GalNAz)2, y conjugados de biotina preparados a partir de trastuzumab(GalNAz)2 por química click catalizada con cobre (conjugación con 46 según el protocolo descrito en el ejemplo 29) o por química click promovida por tensión (conjugación con 25 como se describe en el ejemplo 16) se sometieron a análisis de análisis de espectros de masas detallados de especies de proteína intactas (nanoLC-MS) usando nanoLC acoplado a resolución ultraelevada QTOF MS (maXis 4G).
Ejemplo 38: Análisis de proteína intacta
Preparación de las muestras
[0356] La reducción de proteína se realizó durante 30 minutos en 10 mM de DTT a 56 °C. Las muestras se diluyeron 1:1 en 2 % de ácido fórmico antes del análisis.
Cromatografía en fase líquida - espectrometría de masas
[0357] Las separaciones de proteínas se realizaron utilizando una cromatografía en fase líquida de nanoflujo UHPLC (Bruker Daltonics nano advance) acoplada en línea a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo tetrapolar de resolución ultraelevada (Bruker Daltonics maXis 4G ETD) vía una fuente de electrospray asistida con vacío de desolvatación axial (pulverizador interno de Bruker Daltonics). Las proteínas se cargaron en la columna de trampa (Dionex PepSwift, 0,2 x 5 mm) en 3 minutos con un caudal de flujo de 5000 nL/min utilizando 0,1 % de ácido fórmico. Las proteínas se separaron en una columna de partículas monolíticas 0,2 x 150 mm (Michrom 8pm 4000Á PLRP-S) a 50 °C utilizando un gradiente lineal de 20 a 50 % de acetonitrilo y de 0,1 % de ácido fórmico con un caudal de flujo de 1000 nl/min. La desolvatación e ionización de péptidos que eluyen a partir de la columna se realizó utilizando 6 L/min de gas nitrógeno a 180 °C y 1600 V de voltaje capilar. El espectrómetro de masas se calibró externamente utilizando mezcla de ajuste de Agilent (G1969-85000) y se usó calibración de estándar de referencia a 1221,9906 m/Z (Agilent G1982-85001). El espectrómetro de masas se programó para los espectros adquiridos en el rango de 500-4200 m/z a 1 Hz con los ajustes siguientes: 400 Vpp embudo rF, 10 eV isClD, 400 Vpp multipolar RF, 8 eV energía iónica tetrapolar, 510 mZ masa baja, 10 eV energía de célula de colisión, 3500 Vpp colisión RF, 110 ps tiempo de transferencia, 450 Vpp refrigerador de iones RF y 18 ps almacenamiento prepulso.
Procesamiento de datos
[0358] Todos los datos se procesaron en el software de análisis de datos. Después de la calibración del estándar de calibración de masa, los espectros MS de las cadenas ligeras y pesadas se promediaron sobre cada valor máximo cromatográfico, respectivamente. Los espectros promediados se descircunvolucionaron utilizando el algoritmo de entropía máxima en combinación con el algoritmo de selección de valor máximo SNAP para el espectro de la cadena ligera o selección del valor máximo de suma para el espectro de la cadena pesada.
Ejemplo 39 Análisis de péptido proteolítico
Preparación de la muestra
[0359] De cada muestra, cinco microgramos de proteína se sometieron a digestión tríptica en la solución. Brevemente, la reducción se realizó en 10 mM de DTT durante 30 minutos a 56 °C. La alquilación de las cisteínas reducidas (carbamidometilación) se realizó utilizando 50 mM de cloroacetamida. La digestión de proteína se realizó primero mediante adición de 0,5 pg de LysC peptidasa e incubación durante 3 horas a 37 °C. A continuación, 800 ng
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Cromatografía en fase líquida - espectrometría de masas en tándem
[0360] Las separaciones de péptidos se realizaron utilizando un cromatógrafo de líquido de nanoflujo UHPLC (Bruker Daltonics nano advance) acoplado en línea a una trampa de iones de alta capacidad (Bruker Daltonics amaZon speed ETD) v'a una fuente de electrospray asistida con vacío de desolvatación axial (pulverizador interno Bruker Daltonics). Los péptidos se cargaron en la columna de la trampa (Dionex PepSwift, 0,2 x 5 mm) en 3 minutos con un caudal de flujo de 5000 nL/min utilizando 0,1 % de ácido fórmico. Los péptidos se separaron en una columna monolítica 0,1 x 250 mm (Dionex PepSwift) a 60 °C utilizando un gradiente lineal de 5 a 25 % de acetonitrilo y 0,1 % de ácido fórmico con un caudal de flujo de 800 nL/min. La desolvatación e ionización de los péptidos que eluyen de la columna se realizaron utilizando 3 L/min de gas nitrógeno a 150 °C y 1300 V de voltaje capilar. El espectrómetro de masas se programó para adquirir un espectro de encuesta única (MS) con análisis de fragmentación dependiente de datos posterior (MS/MS) del top 6 de los iones más abundantes. Los espectros de la encuesta se adquirieron en modo de resolución mejorada y usaron los siguientes ajustes del instrumento: tiempo de acumulación máxima 50 ms, ICC objetivo 500,000, sintonización a 1000 m/z, promedios de espectros 5. Los espectros de fragmentación se adquirieron en el modo de exploración de extremos con modo de autoselección de fragmentación habilitado que cambia entre disociación inducida por colisión (CID) y métodos de fragmentación de disociación de transferencia electrónica (ETD) basados en la proporción masa-carga y el estado de carga del ion precursor. Los siguientes ajustes del instrumento se usaron para escaneos de fragmentación: ICC objetivo 500,000, tiempo de acumulación máxima 200 ms, SPS habilitado, energía CID 70 % y exclusión dinámica 0,2 min.
Búsquedas de base de datos
[0361] Los datos de espectrometría de masas en bruto adquiridos se procesaron mediante software de análisis de datos (Bruker Daltonics, v4.1) para generar ficheros de entrada compatibles con Mascot (formato GMF). Los ficheros GMF se cargaron en el software ProteinScape (Bruker Daltonics, V3.1) y se buscan en una base de datos de secuencias utilizando el software de búsqueda de bases de datos de Mascot. La base de datos de secuencias FASTA contenía las secuencias de proteínas de cadena ligera y pesada de trastuzumab con secuencias proteínicas contaminantes adicionadas (por ejemplo, LysC, Tripsina y queratinas). Se realizaron búsquedas utilizando los ajustes siguientes: tolerancia de masa precursora 0,35 Da, tolerancia de masa de ion de fragmento 0,35 Da, especificidad tríptica con un máximo de 2 escisiones omitidas, carbamidometilación (C) como modificación fija. Las modificaciones variables siguientes se especificaron: oxidación (MHW), desamidación (NQ), carbamilación (K + N- terminal) y acetilación (proteína N-terminal). Los péptidos con puntuaciones de ion de Mascot sobre el umbral de puntuación de identidad se aceptaron como identificaciones válidas (tasa de descubrimientos falsos de péptido < 1 %).
Cuantificación relativa
[0362] Para la proteína de cadena pesada de trastuzumab, un péptido único con oxidación de histidina (secuencia K.FNWYVDGVEVH*NAK.T, con H11 oxidado) se identificó exclusivamente en el conjugado de trastuzumab obtenido por conjugación catalizada con cobre de 46, pero no se detectó ninguno en las otras muestras. Los cromatogramas corrientes de ion extraído (EIC) para el péptido con y sin histidina oxidada (EIC: 847,46 ± 0,5 m/z y EIC: 839,97 ± 0,5 m/z, respectivamente) se generaron en software DataAnalysis. Además, cromatogramas EIC para los siguientes dos péptidos se usaron con fines de normalización: -.EvQlVESGGGLVQPGGSLR.L (EIC: 941,6 ± 0,5 m/z) y K.GPSVFPLAPSSK.S (EIC: 593,95 ± 0,5 m/z). Las áreas de valor máximo integradas de las tres mediciones replicadas se promediaron y se expresaron con respecto a trastuzumab nativo, lo que indica que el fragmento anterior con histidina oxidada equivale al 69 % del total de ese fragmento particular (31 % de fragmento sin modificar).
[0363] Para la proteína de cadena ligera de trastuzumab, un péptido único con oxidación de metionina (secuencia - .DIQM*TQSPSSLSASVGDR.V, con M4 oxidado) se identificó exclusivamente en el conjugado de trastuzumab obtenido por conjugación catalizada con cobre de 46, pero no se detectó ninguno en las otras muestras.
Ejemplo 40: Clonación y expresión de mutantes de GalT Y289N, Y289F, Y289M, Y289V, Y289A e Y289G e Y289I.
[0364] Los genes mutantes de GalT se amplificaron a partir de un constructo con la secuencia que codifica el dominio catalítico de GalT que consiste en residuos 130-402 aa, mediante el método PCR de extensión de superposición. La enzima de tipo salvaje se representa mediante la SEQ ID N°: 17. Para el mutante Y289N (representado con la SEQ ID N°: 18), el primer fragmento de ADN se amplificó con un par de cebadores: Oligo38_GalT_External_Fw (CAG CGACAT ATG TCG CTG ACC GCA TGC CCT GAG GAG TCC representado por la SEQ ID N°: 1) y Oligo19_GalT_Y289N_Rw (GAC ACC TCC AAA GTT CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA representado por la SEQ ID N°: 2). El sitio de restricción NdeI está subrayado, mientras que el sitio de mutación está destacado en negrita. El segundo fragmento se amplificó con un par de cebadores: Oligo29_GalT_External_Rw (CTG ATG GAT GGA TCC CTA GCT CGG CGT CCC GAT GTC CAC representado por la SEQ ID N°: 3) y
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Oligo18_GalT_Y289N_Fw (CCT TAC GTG CAG AAC TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTArepresentado por la SEQ ID N°: 4). El sitio de restricción BamHI está subrayado, mientras que el sitio de mutación está destacado en negrita. Los dos fragmentos generados en el primer ciclo de PCR se fusionaron en el segundo ciclo usando cebadores Oligo38_GalT_External_Fw y Oligo29_GalT_External_Rw. Después de la digestión con Ndel y BamHI, este fragmento se ligó al vector pET16b escindido con las mismas enzimas de restricción. El vector de expresión recientemente construido contenía el gen que codifica mutante Y289N y la secuencia que codifica la etiqueta His del vector pET16b, lo que fue confirmado por los resultados de secuenciación del ADN. Para la construcción de los mutantes Y289F (representado por la SEQ ID N°: 19), Y289M (representado por la SEQ ID N°: 20), Y289I (representado por la SEQ ID N°: 21), Y289V (representado por la sEq ID N°: 22), Y289A (representado por la SEQ ID N°: 23) e Y289G (representado por la SEQ ID N°: 24) se usó el mismo procedimiento, con los sitios de mutación cambiados a tripletes TTT, ATG, ATT, GTG, GCG o GGC que codifican fenilalanina, metionina, isoleucina, valina, alanina o glicina, respectivamente. Más específicamente, para la construcción de Y289F el primer fragmento de ADN se amplificó con un par de cebadores definidos aquí como la SEQ ID N°: 1 y la SEQ ID N°: 5 y el segundo fragmento se amplificó con un par de cebadores definidos aquí como la SEQ ID N°: 3 y la SEQ ID N°: 6 (refiérase a la tabla 1 para las secuencias relativas). Además, para la construcción de Y289M el primer fragmento de ADN se amplificó con un par de cebadores definidos aquí como la SEQ ID N°: 1 y SEQ ID N°: 7 y el segundo fragmento se amplificó con un par de cebadores definidos aquí como la SEQ ID N°: 3 y la SEQ ID N°: 8 (refiérase a la tabla 1 para las secuencias relativas).
[0365] Mutantes de GalT se expresaron, aislaron y replegaron a partir de cuerpos de inclusión según el procedimiento proporcionado por Qasba et al. (Prot. Expr. Pur. 2003, 30, 219-229). Después del repliegue, el precipitado se extrajo y la proteína soluble y plegada se aisló utilizando una columna de Ni-NTA (columna 1 mL excel HisTrap, GE Healthcare). Después de la elución con 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0, 300 mM de NaCl y 200 mM de imidazol, la proteína se dializó contra 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 y se concentró a 2 mg/mL utilizando un filtro de centrifugado (unidad de filtrado centrífugo Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-10, Merck Millipore).
Tabla 1 Identificación de secuencias de los cebadores usados
SEQ ID N°
Secuencia de nucleótidos
SEQ ID N°
1 CAG CGA CAT ATG TCG CTG ACC GCA TGC CCT GAG GAG TCC
SEQ ID N°
2 GAC ACC TCC AAA GTT CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
3 CTG ATG GAT GGA TCC CTA GCT CGG CGT CCC GAT GTC CAC
SEQ ID N°
4 CCT TAC GTG CAG AAC TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
SEQ ID N°
5 GAC ACC TCC AAA AAA CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
6 CCT TAC GTG CAG TTT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
SEQ ID N°
7 GAC ACC TCC AAA CAT CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
8 CCT TAC GTG CAG ATG TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
SEQ ID N°
9 GAC ACC TCC AAA AAT CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
10 CCT TAC GTG CAG ATT TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
SEQ ID N°
11 GAC ACC TCC AAA CAC CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
12 CCT TAC GTG CAG GTG TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
SEQ ID N°
13 GAC ACC TCC AAA CGC CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
14 CCT TAC GTG CAG GCG TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
SEQ ID N°
15 GAC ACC TCC AAA GCC CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA
SEQ ID N°
16 CCT TAC GTG CAG GGC TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA
Ejemplo 41: Transferencia de UDP-GalNAz con mutantes de GalT Y289N, Y289Fe Y289M.
[0366] La introducción enzimática de derivado de galactosa en trastuzumab se efectuó con uno de los mutantes de p(1,4)-Gal-T1 Y289N, Y289F o Y289M. Así, el trastuzumab desglicosilado (preparado como se ha descrito anteriormente, 10 mg/mL) se incubó con UDP-N azidoacetilgalactosamina 52 (UDP-GalNAz) (1 mM) y el respectivo mutante p(1,4)-Gal-T1 (0,1 mg/mL) en 10 mM de MnCh y 25 mM de Tris-HCl con pH 8,0 durante 16 horas a 30 °C.
[0367] Para los tres mutantes Y289N, Y289F o Y289M, el análisis de espectros de masas de la mezcla en bruto indicó la conversión limpia de trastuzumab sustituido con GlcNAc(Fuc) central en trastuzumab(GalNAz)2 (49713 Da, 90 % de la cadena pesada total).
Listado de secuencias
[0368]
<110> SynAffix B.V.
<120> Anticuerpo modificado, conjugado de anticuerpo y proceso de preparación de los mismos <130> P6042904PCT
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<150> EP12189604.7 <151> 2012-10-23
<150> US61/717,187 <151> 2012-10-23
<150> EP13188607.9 <151> 2013-10-14
<160>24
<170> Versión de PatentIn 3.3
<210> 1 <211>39 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 1
cagcgacata tgtcgctgac cgcatgccct gaggagtcc
<210>2 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 2
gacacctcca aagttctgca cgtaaggtag gctaaa
<210>3 <211>39 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 3
ctgatggatg gatccctagc tcggcgtccc gatgtccac
<210>4 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 4
ccttacgtgc agaactttgg aggtgtctct gctcta 36
<210>5 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
39
36
39
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210>6 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 6
ccttacgtgc agttttttgg aggtgtctct gctcta 36
<210>7 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 7
gacacctcca aacatctgca cgtaaggtag gctaaa
<210>8 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 8
ccttacgtgc agatgtttgg aggtgtctct gctcta 36
<210>9 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 9
gacacctcca aaaatctgca cgtaaggtag gctaaa
<210> 10 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 10
ccttacgtgc agatttttgg aggtgtctct gctcta 36
<210> 11 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador
36
36
36
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 12 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 12
ccttacgtgc aggtgtttgg aggtgtctct gctcta 36
<210> 13 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 13
gacacctcca aacgcctgca cgtaaggtag gctaaa
<210> 14 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 14
ccttacgtgc aggcgtttgg aggtgtctct gctcta 36
<210> 15 <211>36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 15
gacacctcca aagccctgca cgtaaggtag gctaaa
<210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> artificial
<220>
<223> secuencia de cebador <400> 16
ccttacgtgc agggctttgg aggtgtctct gctcta 36
<210> 17 <211>402 <212> PRT <213> Bos taurus
<400> 17
36
36
36

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Proceso de preparación de un conjugado de anticuerpo, que comprende hacer reaccionar un anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo y una o más moléculas de interés, donde dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x, donde GlcNAc es una N-acetilglucosamina, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A es un grupo azida y x es 1, 2, 3 o 4, donde dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x se enlaza al anticuerpo v'a el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc- S(A)x, y donde dicha GlcNAc es opcionalmente fucosilada.
  2. 2. Proceso según la reivindicación 1, que incluye las etapas de:
    (i) poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador, donde dicho sustituyente N-acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A es un grupo azida y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP),
    para obtener un anticuerpo modificado, donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicho anticuerpo modificado es según la fórmula (4):
    imagen1
    donde:
    S(A)X y x son tal como se ha definido anteriormente; AB representa un anticuerpo; GlcNAc es N- acetilglucosamina; Fuc es fucosa; b es 0 o 1; e y es de 1 a 20; y
    (ii) hacer reaccionar dicho anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo y una o más moléculas de interés.
  3. 3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, donde el catalizador es un catalizador que comprende un dominio catalítico mutante a partir de una (6(1,4)-galactosiltransferasa, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en GalT Y289L, GalT Y289N, GalT Y289I, GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I y GalT Y289A.
  4. 4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (11) o (11b):
    R1
    r~hx
    T^-{L(D)r}q ' ' a
    11
    donde:
    L es un conector;
    D es una molécula de interés; r es 1 - 20;
    R1 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OR5, -NO2, -CN, - S(O)2R5, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24 y donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    (hetero)arilalquilo se sustituyen opcionalmente, donde dos sustituyentes R1 se pueden enlazar juntos para formar un cicloalquilo anillado o un sustituyente (hetero)areno anillado, y donde R5 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
    X es C(R1)2, O, S o NR2, donde R2 es R1 o L(D)r, y donde L, D y r son tal y como se ha definido anteriormente;
    q es 0 o 1, con la condición de que si q es 0, entonces X es N-L(D)r;
    a es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; a es 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8; y a + a' < 10.
  5. 5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (17):
    imagen2
    R1, L, D y r son tal y como se define en la reivndicación 4;
    Y es O, S o NR2, donde R2 es tal y como se define en la reivindicación 4;
    R3 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, grupos alquilo C1- C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24;
    R4 se selecciona del grupo que consisten en hidrógeno, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halógeno, grupos alquilo C1 - C24, grupos (hetero)arilo C6 - C24, grupos alquil(hetero)arilo C7 - C24 y grupos (hetero)arilalquilo C7 - C24, donde los grupos alquilo se interrumpen opcionalmente con uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S, donde los grupos alquilo, grupos (hetero)arilo, grupos alquil(hetero)arilo y grupos (hetero)arilalquilo se sustituyen de manera independiente opcionalmente; y n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10,
    o donde dicho conjugado de conector tiene la fórmula (15) o la fórmula (19):
    imagen3
  6. 6. Conjugado de anticuerpo según la fórmula (20) o (20b):
    imagen4
    L, D, X, R1, a, a', r y q son tal y como se define en la reivindicación 5;
    5 b es 0 o 1;
    p es 0 o 1;
    Q es -N(H)C(O)CH2- o -CH2-; x es 1,2, 3 o 4; y es 1 - 20;
    10 y donde AB es un anticuerpo, S es un azúcar o un derivado de azúcar, GlcNAc es N-acetilglucosamina y
    Fuc es fucosa.
  7. 7. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 8, donde el conjugado de anticuerpo tiene la fórmula (21):
    imagen5
    5
    10
    15
    20
    25
    imagen6
    donde AB, L, D, S, x, y, b, p, Q y GIcNAc son tal y como se define en la reivindicación 6.
  8. 8. Conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 6 - 7, donde dicha molécula de interés (D) se selecciona del grupo que consiste en una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa, una molécula indicadora, una azida y un grupo (hetero)cicloalquinilo.
  9. 9. Conjugado de anticuerpo obtenible mediante el proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5.
  10. 10. Conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 6 - 9 para usar como un medicamento.
  11. 11. Conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 6 - 9 para usar en el tratamiento contra el cáncer, preferiblemente cáncer de mama, más preferiblemente cáncer de mama HER2 positivo.
  12. 12. Proceso de preparación de un conjugado anticuerpo-fármaco, que incluye las etapas de:
    (i) poner en contacto un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central (GlcNAc) con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador, donde dicho sustituyente N-acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP),
    para obtener un anticuerpo modificado, donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x enlazado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x, y donde dicho anticuerpo modificado es según la fórmula (4):
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    imagen7
    donde:
    S(A)x y x son tal como se ha definido anteriormente; AB representa un anticuerpo; GIcNAc es N- acetilglucosamina; Fuc es fucosa; b es 0 o 1; e y es de 1 a 20; y
    (ii) hacer reaccionar dicho anticuerpo modificado con un conjugado de conector, donde:
    (a) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con azida, dicho conjugado de conector comprende un grupo (hetero)cicloalquinilo o un grupo alquinilo, y una o más moléculas de interés; o
    (b) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con cetona, dicho conjugado de conector comprende un grupo amino primario, un grupo aminooxi o un grupo hidrazinilo, y una o más moléculas de interés; o
    (c) cuando dicho anticuerpo modificado es un anticuerpo modificado con alquino, dicho conjugado de conector comprende un grupo azida, y una o más moléculas de interés,
    donde una molécula de interés (D) se conjuga al anticuerpo vía un conector (L); donde dicha molécula de interés es una sustancia que es biológicamente y/o farmacéuticamente activa.
  13. 13. Conjugado anticuerpo-fármaco obtenible mediante el proceso según la reivindicación 12.
  14. 14. Proceso de preparación de un anticuerpo modificado, donde el proceso comprende:
    (a) desglicosilación de un glicano de un anticuerpo con una N-acetilglucosamina central, en presencia de una endoglicosidasa, para obtener un anticuerpo que comprende un sustituyente N-acetilglucosamina central, donde dicho sustituyente N-acetilglucosamina central es opcionalmente fucosilado, donde dicho sustituyente N-acetilglucosamina central se enlaza vía un enlace N-glicosídico al átomo de nitrógeno amídico en la cadena lateral de un aminoácido asparagina del anticuerpo, y donde dicha endoglicosidasa es Endo S, Endo S49, Endo F, o una combinación de la mismas; seguido de
    (b) puesta en contacto de dicho anticuerpo con un compuesto de fórmula S(A)x-P en presencia de un catalizador, donde dicho catalizador comprende un dominio catalítico mutante a partir de una galactosiltransferasa, donde S(A)x es un derivado de azúcar que comprende x grupos funcionales A donde A se selecciona independientemente del grupo que consiste en un grupo azida, un grupo ceto y un grupo alquinilo y x es 1, 2, 3 o 4, donde P se selecciona del grupo que consiste en difosfato de uridina (UDP), difosfato de guanosina (GDP) y difosfato de citidina (CDP),
    donde un anticuerpo modificado se define como un anticuerpo que comprende un sustituyente GlcNAc-S(A)x conectado al anticuerpo vía el C1 de la N-acetilglucosamina de dicho sustituyente GlcNAc-S(A)x.
    Fig. 1
    imagen8
    imagen9
    • Man U GLCNAc O Gal □ GalNAc > Fue
    imagen10
    imagen11
    imagen12
    imagen13
    G1
    Fig. 2
    imagen14
    Rituximab
    imagen15
    Fig. 3
    mezcla de
    G2F, GIF,__________________
    3' galactosidasa
    imagen16
    mezcla de GOF y GO
    imagen17
    N3-a-UDP GaIT Y289L
    imagen18
    mezcla de G2F y G2 con GalNaz en lugar de Gal
    imagen19
    Fig.4
    Wh N3~°- UDP
    GaIT Y289L
    mezc a de mAb con
    GIcNAc y GlcNac(Fuc),
    Fig. 5
    mezcla de G2F,G1F,
    GOF, G2, G1, GO
    EndoS
    mezcla de mAb con
    GIcNac y GlcNac(Fuc),
    Fig. 6
    imagen20
    Fig. 8
    imagen21
    00
    NJ
    imagen22
    imagen23
    00
    co
    H 2N O
    HN
    imagen24
    RABA, IBCF,
    FmocHN" sC02H 31
    h2n^o
    hX
    FrnocHN
    h2n,.^o
    1) piperidina
    imagen25
    O
    imagen26
    2) Alloc-Val-OSu AilocHN OH
    imagen27
    32
    O OH O
    33
    imagen28
    23
    00
    4^
    h y Mo o
    H
    36
    imagen29
    38
    imagen30
    Fig. 10a
    imagen31
    39 R =
    40 R =
    imagen32
    h2íto
    rY
    o
    OyNH, ,NH
    imagen33
    O
    H o
    A
    "N
    37a R = MMAE 37b R = MMAF
    Fig. 10b
    00
    en
    Fig. 11
    hf \
    biotina-OSu
    k Ñy^NH2 O á 29
    Et3N
    49%
    *
    imagen34
    y~r
    O
    O
    HN' NH
    '.,w
    imagen35
    O
    30
    imagen36
    H
    N
    T
    O
    h2n^0
    imagen37
    o
    41
    Fig. 12
    00
    O)
  15. 27. HC!
    imagen38
    imagen39
    imagen40
    imagen41
    Fig. 14
    00
    00
    AcO X)Ac 'O
    AcO'
    imagen42
    NgO^OH
    'A
    O OH
    48
    imagen43
    imagen44
    OHOH
    52 R = j v„ ,N3
    53 R = A
    54 R =
    O
    imagen45
    imagen46
    Fig. 15a
    A50591
    oo
    CD
    B50753
    imagen47
    49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000
    Masa
    Fig. 15b
    A49495
    imagen48
    v v' v v*-*j '/■'/'■•'í-'y
    49000 49200 49400 49600 49800
    co o
    Fig. 15c
    A49714
    B49567 } \
    49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200
    50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000
    Masa
    Fig. 15d
    A51182
    49000 49200 49400
    49600
    B50407
    |
    ■■
    C51036
    JS
    í í
    I
    rS,
    49800 50000 50200
    50400 50600 Masa
    50800
    ................ T'"**»'* . ...
    51000 51200 51400 51600 51800
    52000
    imagen49
    26800 27000 27200 27400
    Fig. 16a
    26701
    27025
    26378
    Masa
    Fig. 16b
    25315
    25607
    25930
    25000 25200
    25400
    25600
    25800
    26000
    26200
    Masa
    Fig. 16c
    25533
    25825
    26151
    25000 25200
    25400 25600 25800 26000 26200 26400
    Masa
    Fig. 7
    50195
    I
    47000
    48000
    49000 50000
    Masa
    51000
    52000
    Fig.
    A49735
    Fig. 18b
    | 650579
    48000
    B49736
    5ÓÓ00 52000
    Masa
    A50353
    imagen50
    54000
    üj 50581
    \ Á,
    a^Ljiy...... r...
    imagen51
    Masa
    Fig. 19b
    A50098
    48500
    49000
    C49755
    !\
    ■J v\
    49500
    Masa
    50000
    50500
    imagen52
    imagen53
    Agregación (%)
    7,00
    Fig. 23
    imagen54
    Concentración (nM)
    Viabilidad celular (%)
    o
    o
    O
    -pi
    o
    er*
    o
    oo
    o
    M
    o
    imagen55
    QA
    X
    «
    S3
    7
    Uí
    i******
    X
    m
    35
    N»
    +
    Fig. 24
    Viabilidad celular (%)
    Fig. 25
    mcms (BÉH2+)
    80 t
    40
    imagen56
    0
    0,001 0,01
    0,1
    10
    'Rituxímab“{vc-Mai}2 Trast-(vc-MMAE)2 Trast-(vc-MMÁF)2 -ár Trast-{vc-Mai)2 “^“TrastMai
    TrastG0-{vc-Mai}4 Ira St (N297G}- {vc-M a i }2 - * *T-DfV11
    Concentración (nM)
    Viabilidad celular (%)
    Fig. 26
    MDA-MB-231 (HER2-)
    imagen57
    -slr-Trast
    “■“Rítuxima'b-(vc-Mai)2 Trast-{vc>MMAE}2 Tras£-(voMMAF}2 -A- Trast»(vc-Mai)2 -^-Trast- Mai
    .....TrastGO-(vc-Mai )4
    — Trast(M297C)-(vc-Mai)2 ~ • ’T-DMl
    0,001 0,01 0,1 1 10
    Concentración (nM)
    100
    imagen58
    imagen59
    Biodistribución T = 21 d
    m trastuzumab o trastuzumab desglicosilado
    ■i trastuzyrnab^vc - Mai)s Ü1 trastuzumab(vc-MMAF)2
    volumen de tumor
    (D
    3
    TJ
    O
    (D
    01
    (0
    r-o
    o
    05
    O
    f--.
    O
    OI
    o
    imagen60
    Fig.29 eco T
    Volumen de tumor medio
    Volumen de tumor
    Volumen de tumor medio
    Fig. 30
    ™* -vehículo
    T-DM1 9 mg/kg *”* *trast{vc-Mai }2 3 mg/kg trast(vc-Mai)2 9 mg/kg “ trast{vc-M MAF)2 3 mg/kg “*~trsst{vc:-MMAF)2 9 mg/kg
    /
    /
    imagen61
    ■/
    y
    m 4 i *m *
    m* *
    0
    .¿i k m.m%m m. mm.mM fe.
    10 15
    tiempo en días
    5
    104
    Fig. 31
    imagen62
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