RS64329B1 - Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovo pripremanje - Google Patents

Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovo pripremanje

Info

Publication number
RS64329B1
RS64329B1 RS20230519A RSP20230519A RS64329B1 RS 64329 B1 RS64329 B1 RS 64329B1 RS 20230519 A RS20230519 A RS 20230519A RS P20230519 A RSP20230519 A RS P20230519A RS 64329 B1 RS64329 B1 RS 64329B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
group
hetero
conjugate
glcnac
Prior art date
Application number
RS20230519A
Other languages
English (en)
Inventor
Delft Floris Louis Van
Geel Remon Van
Maria Antonia Wijdeven
Original Assignee
Synaffix Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50544942&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS64329(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Synaffix Bv filed Critical Synaffix Bv
Publication of RS64329B1 publication Critical patent/RS64329B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike kojoj pronalazak pripada
[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na modifikovana antitela, posebno na antitela modifikovana jednom ili više azidnih grupa konjugovanih sa molekulom od interesa, da se formira konjugat antitela. Pomenuti molekul od interesa je aktivna supstanca. Pronalazak se, dakle, odnosi i na konjugate antitela i leka (antibody-drug conjugates, ADC).
Osnov pronalaska
[0002] Konjugati antitela, tj. antitela konjugovana sa molekulom od interesa preko linkera, poznati su u struci. Postoji veliko interesovanje za konjugate antitela u kojima je molekul od interesa lek, na primer citotoksično hemijsko sredstvo. Konjugati antitela i leka poznati su u struci i sastoje se od rekombinantnog antitela kovalentno povezanog sa citotoksičnim hemijskim sredstvom preko sintetskog linkera (S.C. Alley et al, Curr. Opin. Chem. Biol.2010, 14, 529-537). Glavni cilj konjugata antitela i leka (ADC), nazvanog još i imunotoksin, je da kombinuje visoku specifičnost monoklonskog antitela za tumor-asocirani antigen sa farmakološkom snagom "malog" citotoksičnog leka (tipično 300 do 1000 Da). Primeri ADC uključuju gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg; anti-CD33 mAb konjugovano sa kaliheamicinom, Pfizer/ Wyeth); brentuksimab vedotin (SGN-35, Adcetris, CD30-ciljajući ADC koji se sastoji od brentuksimaba, kovalentno vezanog sa MMAE (monometilauristatin), Seattle Genetics); trastuzumab-DM1 konjugat (T-DM1). Jedan napredak u ovoj oblasti uključuje pojavu izrazito jakih toksina, posebno taksana, kalihemicina, majtanzina, pirolobenzodiazepina, duokarmicina i auristatina. Toksičnost ovih supstanci u nanomolarnim do pikomolarnim koncentracijama glavno je poboljšanje u odnosu na ranije primenjivane toksine. Drugi važan tehnološki napredak uključuje upotrebu optimizovanih linkera hidrolizabilnih u citoplazmi, rezistentnih ili podložnih proteazama, ili rezistentnih na eflukspumpe koje daju otpornost na veliki broj lekova i koje su povezane sa lekovima visoke citotoksičnosti.
[0003] ADC poznati u stanju tehnike uobičajeno se pripremaju konjugacijom linker-toksina sa bočnim lancem amino-kiseline lizin ili cistein antitela, acilacijom, odnosno alkilacijom. Za lizine, konjugacija se odigrava preferencijalno na bočnom lancu lizina sa najvišom steričkom pristupačnošću, najnižom pKa, ili njihovom kombinacijom. Nedostatak ovog postupka je taj što je kontrola mesta konjugacije niska.
[0004] Bolja kontrola specifičnosti mesta dobija se alkilacijom cisteina, na osnovu činjenice da tipično nema slobodnih cisteina u antitelu, čime se pruža mogućnost alkilisanja samo onih cisteina koji su selektivno oslobođeni u koraku redukcije ili specifično inženjerisani u antitelo kao slobodni cisteini (kao u takozvanim Thiomab antitelima). Selektivno oslobađanje cisteina redukcijom tipično se izvodi tretmanom celog antitela redukujućim sredstvom (npr. TCEP ili DTT), što dovodi do konverzije disulfidne veze u dva slobodna tiola (uglavnom u regionu šarke antitela). Oslobođeni tioli se zatim alkiluju elektrofilnim reagensom, tipično na bazi maleimida, prikačenim za linker-toksin, što se obično dešava brzo i sa visokom selektivnošću. U vezi sa inženjerisanjem dodatnog (slobodnog) cisteina u antitelo, pojačana kontrola mesta postiže se u odnosu na lokaciju jednog ili više dodatih cisteina i nije potreban korak redukcije, čime se idealno izbegava sečenje većeg broja disulfidnih veza i veći broj alkilacija. I u ovoj strategiji, alkilacija slobodnih cisteina sprovodi se maleimidnom hemijom, ali se ne postiže puna homogenost.
[0005] U isto vreme, nedostatak ADC dobijenih alkilacijom maleimidima je taj što su dobijeni konjugati nestabilni zbog reverzije alkilacije, tj. retro-Michael-ove reakcije, što dovodi do oslobađanja linker-toksina iz antitela. Jasno je da konjugacija bazirana na cistein-maleimidalkilaciji nije idealna tehnologija za razvoj ADC koji, poželjno, ne bi trebalo da pokazuju prevremeno oslobađanje toksina.
[0006] U struci je poznato da azidi (N3grupe, označene i kao azido grupe) mogu podleći selektivnoj cikloadiciji sa terminalnim alkinima (uz katalizu bakrom) ili sa cikličnim alkinima (na osnovu naprezanja prstena). Triazoli koji su rezultat reakcije sa alkinima nisu podložni hidrolizi ili drugim putevima degradacije. U struci je takođe poznato da ketoni mogu podleći selektivnoj konjugaciji sa hidroksilaminima ili hidrazinima, što rezultuje oksimima, odnosno hidrazonima. Oksimi i hidrazoni su takođe relativno inertni pri neutralnim uslovima, ali mogu podleći hidrolizi na nižem pH.
[0007] Pregled nekoliko postupaka za uvođenje azida u protein dali su nedavno van Delft et al., ChemBioChem. 2011, 12, 1309: (a) hemoselektivna diazo transfer reakcija, (b) enzimska konverzija, (c) ekspresiija u auksotrofnim bakterijama i (d) genetičko kodiranje. Hemoselektivne diazo transfer reakcije (a) imaju ograničenu primenljivost kod antitela jer se odvijaju tipično na N-terminusu proteina, dok se u antitelu N-terminusi i teškog i lakog lanca nalaze u vezujućem regionu antitela. Ekspresija u auksotrofnim bakterijama (c) i genetičko kodiranje (d) su, iako moćne, veoma kompleksne strategije za laboratorije koje nisu specijalizovane, a pored toga, ne mogu se koristiti za direktnu postmodifikaciju postojećih rekombinantnih antitela i zato nisu opšteprimenljive.
[0008] U pogledu enzimske konverzije proteina (b), tokom godina saopšteno je da nekoliko enzima može postići takvu transformaciju sa neprirodnim, azid-sadržavajućim supstratima, npr., transglutaminaza, ligaza lipoinske kiseline, sortaza, FGE i drugi (pregled dat u Bertozzi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974). Bez izuzetka, međutim, ovi enzimi zahtevaju specifične prepoznavajuće sekvence u proteinu, koje treba da budu specifično inženjerisane, i konjugacija može biti ograničena na krajeve proteina.
[0009] Potencijalno široko primenljiva strategija koja se, uopšteno, može primeniti na sva monoklonska antitela uključuje specifičnu enzimsku konjugaciju sa Fc-prikačenim glikanom koji je prirodno prisutan u svim antitelima eksprimiranim u kulturama ćelija sisara (i kvasaca). U struci je poznato nekoliko strategija baziranih na ovom konceptu, kao što je oksidacija terminalne galaktoze ili prenos (neprirodne) sijalinske kiseline na istu komponentu galaktoze. Međutim, za ADC takva strategija je suboptimalna jer se glikani uvek formiraju kao kompleksna smeša izoformi koje mogu sadržati različite nivoe galaktozilacije (G0, G1, G2) i stoga bi dali ADC sa slabom kontrolom odnosa lek-antitelo (drug-antibody ratio, DAR, vidi u nastavku teksta).
[0010] Slika 1 prikazuje antitelo koje sadrži glikan na svakom teškom lancu. Ovi glikani prisutni su u različitim izoformama u pogledu galaktozilacije (G0, G1 i G2) i fukozilacije (G0F, G1F i G2F).
[0011] U WO 2007/133855 (Biotehnološki institut Univerziteta Merilend), objavljen je hemoenzimski postupak za pripremanje homogenog glikoproteina ili glikopeptida, koji uključuje strategiju u dva stupnja, koja uključuje najpre orezivanje skoro čitavog glikanskog stabla (pod dejstvom endo A ili endo H) posle čega ostaje samo sržna N-acetilglukozaminska (N-acetylglucosamine, GlcNAc) komponenta (takozvani GlcNAc-protein), posle čega sledi reglikozilacioni događaj u kojem se, u prisustvu katalizatora koji uključuje endoglikozidazu (endoglycosidase, ENGaza), oligosaharidna komponenta prenosi na GlcNAc-protein dajući homogeni glikoprotein ili glikopeptid. Objavljena je strategija za azidom funkcionalizovane glikoproteine, u kojoj GlcNAc-protein reaguje u prisustvu ENGaze sa tetrasaharid oksazolinom koji sadrži dve 6-azidomanozne komponente, uvodeći time istovremeno dva azida u glikan. Glikoprotein funkcionalizovan azidom može zatim katalitički reagovati u "klik"-hemijskoj reakciji cikloadicije, u prisustvu katalizatora (npr. Cu(I) katalizator) sa terminalnim alkinom koji nosi funkcionalnu komponentu X od interesa. Konkretni primeri pomenute "klik"-hemije nisu objavljeni.
[0012] U J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13790, Wang et al. objavljuju efikasno dvostruko prikačinjanje terminalnog alkin-modifikovanog trisaharida za bis-azidom modifikovanu ribonukleazu B "klik"-hemijom katalizovanom bakrom.
[0013] U J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030, Davis et al. objavljuju transfer oligosaharid oksazolina na sržni fukozilovani kao i nefukozilovani sržni GlcNAc-Fc domen intaktnih antitela, u prisustvu glikosintaze EndoS.
[0014] U J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308, Wang et al. objavljuju transfer tetrasaharid oksazolina koji sadrži dve 6-azidomanozne komponente na sržni fukozilovani kao i nefukozilovani sržni GlcNAc-Fc domen intaktnih antitela (rituksimab) u prisustvu glikosintaznih mutanata EndoS-D233A i EndoS-D233Q. Ovaj postupak prikazan je šematski na Slici 2, i rezultuje antitelom koje sadrži četiri azido grupe. Konjugacija azidomodifikovanog IgG "klik"-hemijskom reakcijom koja sledi, pomenuta je, ali nije objavljena.
[0015] Međutim, nedostatak glikosintaznih strategija objavljenih u WO 2007/133855, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030 i J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308 je dugotrajna i kompleksna sinteza željenih azidosadržavajućih oligosaharid oksazolina. Pored toga, azidosadržavajući oligosaharid oksazolini sadrže dve azido grupe. Do danas, nije pokazano da li ovaj postupak može biti pogodan za uvođenje samo jedne azido grupe u glikan antitela.
[0016] Qasba et al. objavljuju u J. Biol. Chem. 2002, 277, 20833 da mutantne galaktoziltransferaze GalT(Y289L), GalT(Y289I) i GalT(Y289N) mogu enzimski prikačiti GalNAc za neredukujući GlcNAc šećer (β-benzil-GlcNAc).
[0017] WO 2004/063344 (Nacionalni instituti za zdravlje), objavljuje mutantne galaktoziltransferaze GalT(Y289L), GalT(Y289I) i GalT(Y289N). Objavljen je postupak u kojem se kompleksni glikani kao što su oni na monoklonskim antitelima (rituksan, remikad, herceptin) prvo konvertuju u G0 glikane na antitelima, tretmanom galaktozidazom, u cilju uklanjanja terminalnih galaktoza sa lanca. Ova G0 antitela se zatim izlažu GalNAc-UDP u prisustvu GalT(Y289L), što daje antitela sa značajno homogenijim glikanskim strukturama. Qasba et al. objavljuju u Bioconjugate Chem.2009, 20, 1228, da se postupak objavljen u WO 2004/063344 odvija i sa neprirodnim GalNAc-UDP varijantama supstituisanim na N-acetil grupi. Monoklonska antitela tretirana β-galaktozidazom, koja imaju G0 glikoformu, potpuno se galaktoziluju u G2 glikoformu posle transfera galaktozne komponente koja sadrži C2-supstituisanu azidoacetamido komponentu (GalNAz) na terminalne GlcNAc rezidue glikana, što daje tetraazido-supstituisana antitela, tj. dve GalNAz komponente po teškom lancu. Ovaj postupak je šematski prikazan na Slici 3. Konjugacija pomenutih tetra-azido supstituisanih antitela sa molekulom od interesa nije objavljena. Transfer galaktozne komponente koja sadrži C2-supstituisanu keto grupu (C2-keto-Gal) na terminalne GlcNAc rezidue G0 glikoforme glikana, kao i povezivanje C2-keto-Gal sa amino-oksi biotinom, takođe su objavljeni. U svim slučajevima, GalT(Y289L) mutant upotrebljen je za transfer GalNAc-UDP (ili GalNAz-UDP) na antitela, ali upotreba mutanata GalT(Y289N) ili GalT(Y289I) nije objavljena.
[0018] Nedostatak postupka objavljenog u WO 2004/063344 i Bioconjugate Chem.2009, 20, 1228 je taj što bi konjugacija tetra-azido supstituisanih antitela sa molekulom od interesa dala konjugat antitela sa tipično dva molekula od interesa po glikanu (uz uslov da se pomenuta konjugacija nastavi uz potpunu konverziju). U nekim slučajevima, na primer kada je molekul od interesa lipofilni toksin, prisustvo previše molekula od interesa po antitelu je nepoželjno jer može dovesti do formiranja agregata (BioProcess International 2006, 4, 42-43).
[0019] WO 2007/095506 i WO 2008/029281 (Invitrogen Corporation), objavljuju postupak formiranja glikoproteinskog konjugata u kojem se glikoprotein dovodi u kontakt sa UDP-GalNAz u prisustvu GalT(Y289L) mutanta, što dovodi do inkorporisanja GalNAz na terminalnom neredukujućem GlcNAc ugljenog hidrata antitela. Bakrom katalisana "klik" hemija koja sledi, sa terminalnim alkinom ili Staudinger-ovom ligacijom, može posle toga da se upotrebi za konjugovanje reporterskog molekula, čvrste podloge ili nosačkog molekula za prikačenu azidnu komponentu. WO 2007/095506 i WO 2008/029281 objavljuju još i to da ako nema terminalnih GlcNAc šećera na antitelu, Endo H, Endo A ili Endo M enzim može da se upotrebi za stvaranje skraćenog lanca koji se završava jednom N-acetilglukozaminskom reziduom.
[0020] Konjugati antitela poznati u struci obično imaju nekoliko nedostataka. Za konjugate antitela i leka, mera opterećivanja antitela toksinom data je odnosom leka i antitela (DAR), koji govori o prosečnom broju molekula aktivne supstance po antitelu. Međutim, DAR ne daje nikakvu indikaciju u vezi sa homogenošću takvog ADC.
[0021] Postupci za pripremanje konjugata antitela poznati iz stanja tehnike obično rezultuju proizvodom sa DAR između 1.5 i 4, ali u stvari takav proizvod sadrži mešavinu konjugata antitela sa brojem molekula od interesa koji varira od 0 do 8 ili više. Drugim rečima, konjugati antitela poznati iz stanja tehnike obično se formiraju tako da DAR ima visoku standardnu devijaciju.
[0022] Na primer, gemtuzumab ozogamicin je heterogena smeša 50% konjugata (0 do 8 kaliheamicinskih komponenti po IgG molekulu, sa prosekom od 2 ili 3, nasumično povezanih sa lizilskim reziduama antitela izloženim rastvaraču) i 50% nekonjugovanog antitela (Bross et al., Clin. Cancer Res. 2001, 7, 1490; Labrijn et al., Nat. Biotechnol. 2009 27, 767). Ali i za brentuksimab vedotin, T-DM1, i druge kliničke ADC, još uvek se ne može tačno kontrolisati koliko se leka prikačinje za svako dato antitelo (odnos lek-antitelo, DAR) i donija se ADC koji je statistička distribucija konjugata. Bez obzira na to da li je broj molekula leka po antitelu optimalan, na primer dva, četiri ili više, njihovo vezivanje u predvidljivom broju i na predvidljivim lokacijama konjugacijom specifičnom za mesto, sa uskom standardnom devijacijom, još uvek je problematično.
Kratak opis pronalaska
[0023] Predmetni pronalazak odnosi se na konjugat antitela za upotrebu u vidu leka, pri čemu se konjugat antitela može dobiti postupkom koji uključuje reakciju modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jednu ili više supstanci koje su farmaceutski aktivne, pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo ono antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent, pri čemu je GlcNAc N-acetilglukozamin, pri čemu je S(A)xšećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je pomenuti GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je pomenuti N-acetilglukozamin opciono fukozilovan, pri čemu su jedna ili više supstanci koje su farmaceutski aktivne citotoksini i pri čemu se antitelo specifično vezuje za kancerski antitegen.
[0024] Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupci za njihovo pripremanje imaju nekoliko prednosti u odnosu na postupke, modifikovana antitela i konjugate antitela poznate u struci.
[0025] Kao što je opisano ranije u ovom tekstu, i dalje postoji potreba za poboljšanjem poznatih postupaka konjugacije entiteta linker-toksin sa antitelima, u smislu kontrole specifičnosti mesta i stehiometrije. Uprkos sposobnosti ADC da se udome na svojim ciljevima, količina leka procenjena da ulazi u tumorske ćelije tipično je <2% primenjene doze. Ovaj problem povećavaju nepredviđeni rezultati konjugacije ADC poznatih u stanju tehnike. Važno je izbeći antitela sa sniženom konjugacijom, što snižava njihovu snagu, kao i visokokonjugovane vrste, koje mogu imati upadljivo skraćeni poluživot u cirkulaciji, ometeno vezivanje za ciljni protein, i povećanu toksičnost.
[0026] Za konjugate antitelo-lek, mera opterećenja antitela molekulima od interesa (npr. lekovi, aktivne supstance) je takozvani odnos leka prema antitelu (DAR), koji govori o prosečnom broju molekula aktivne supstance po antitelu, izračunatom na osnovu statističe distribucije. Teorijska maksimalna vrednost DAR za određeni tip ADC jednaka je broju ukotvljujućih mesta. Kao što je opisano ranije u ovom tekstu, postupci pripremanja ADC poznati u stanju tehnike obično rezultuju porizvodom koji sadrži smešu konjugata antitela sa različitim brojem molekula od interesa prisutnim u svakom konjugatu antitela, i DAR sa visokom standardnom devijacijom.
[0027] Jedna od prednosti pronalaska je ta što su ova antitela i konjugati antitela homogeni u pogledu specifičnosti mesta i stehiometrije. DAR pomenutih dobijenih modifikovanih antitela i konjugata antitela veoma je blizak teorijskoj vrednosti, a standardna devijacija je niska. Ovo takođe znači da konjugati antitela za upotrebu u skladu sa pronalaskom rezultuju konzistentnijim proizvodom za prekliničko testiranje.
[0028] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovano antitelo i konjugat antitela homogeni su i u pogledu specifičnosti mesta i u pogledu stehiometrije. U ovom tekstu, antitelo ili konjugat antitela smatraju se homogenim kada se konjugacija dešava samo na unapred određenom mestu i sa unapred određenim odnosom lek-antitelo. Konjugat antitela je heterogen kada se konjugacija antitela dešava na različitim mestima u antitelu, dajući smešu proizvoda sa nepredvidljivim odnosom lek-antitelo. U ovom drugom slučaju, odnos lekantitelo biće prosek cele grupe konjugata antitelo-lek.
[0029] U drugom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela ima DAR koji je u okviru 10% od teorijske vrednosti.
[0030] Još jedna prednost postupaka i antitela uključuje smanjenje otpada u proizvodnji, koji povećava troškove kompanija.
[0031] Pored toga, kada se antitelo modifikovano azidom, reakcijom cikloadicije kupluje sa linkerskim konjugatom koji sadrži alkinil grupu, rezultujući triazoli nisu podložni hidrolizi ili drugim putevima degradacije.
[0032] Dodatne prednosti su, prema tome, stabilnost konjugata antitela, kao i direktni i opšte primenljiv postupak uvođenja azido grupe u antitelo.
[0033] Kao što je opisano ranije u ovom tekstu, enzimska konjugacija neprirodnog šećera sa terminalnim GlcNAc oligomernog glikana prikačenog za antitelo, u prisustvu mutantne galaktoziltransfereaze Y289L, kao što je prikazano na Slici 3, poznata je u struci.
[0034] Do danas, međutim, pogodnost mutantnih galaktoziltransferaza poznatih u struci za prenos šećera nukleotida ili derivata šećera nukleotida na sržni GlcNAc supstituent na antitelu, i pogodnost takve strategije za stvaranje konjugata antitela, još nisu pokazane. U postupcima poznatim u stanju tehnike, šećer nukleotida ili derivat šećera nukleotida prenosi se na terminalni GlcNAc oligo- ili polisaharidnog glikana vezanog za antitelo.
[0035] Dodatno, do danas nije pokazana pogodnost mutantnih galaktoziltransferaza poznatih u struci za prenos šećera nukleotida ili derivata šećera nukleotida u unutrašnje šećere i derivate šećera. Sadašnjim postupcima moguće je preneti derivat šećera koji sadrži jednu ili više azido grupa, u sržni GlcNAc supstituent prisutan na antitelu, bez obzira da li je navedeni GlcNAc fukozilovan ili ne. Poželjno, uklanjanje fukoze pre postupka stoga nije potrebno, jer se u postupku može koristiti smeša antitela koja sadrži i sržni GlcNAc i sržni GlcNAc(Fuc) supstituent.
Opisi slika
[0036]
Slika 1 prikazuje različite glikoforme antitela sa glikanima G2F, G1F, G0F, G2, G1 i G0.
Slika 2 prikazuje postupak prenosa tetrasaharida koji sadrži dve azido grupe na sržni GlcNAc supstituent u prisustvu mutantne EndoS-D233A, što za rezultat ima modifikovano antitelo koje sadrži četiri azido grupe, kako je objavljeno u J. Am. Chem. Soc.2012, 134, 12308.
Slika 3 prikazuje postupak prenosa GalNAz na terminalne GlcNAc rezidue antititela sa glikanima, što daje modifikovano antitelo koje sadrži četiri azido grupe, kako je objavljeno u Bioconjugate Chem.2009, 20, 1228.
Slika 4 prikazuje poželjan primer izvođenja postupka za pripremanje azidom modifikovanog antitela, pri čemu je opciono supstituisano antitelo koje sadrži sržni GlcNAc supstituent reagovalo sa GalNAz-UDP u prisustvu GalT Y289L kao katalizatora.
Slika 5 prikazuje deglikozilaciju smeše glikoformi u prisustvu EndoS kao katalizatora. Slika 6 prikazuje poželjan primer izvođenja postupka za pripremanje konjugata antitela, pri čemu je azidom modifikovano antitelo konjugovano sa linkerskim konjugatom koji sadrži jedan ili više molekula od interesa.
Slika 7 prikazuje šemu reakcije sinteze neisecajućih linkerskih BCN-doksorubicin konjugata 28a i 28b.
Slika 8 prikazuje šemu reakcije sinteze DIBAC-biotin konjugata 30
Slika 9 prikazuje šemu reakcije sinteze isecajućeg linkerskog BCN-vc-PABA-doksorubicin konjugata 33 počevši od Fmoc-citrulina 31.
Slika 10a prikazuje šemu reakcije sinteze isecajućih BCN-konjugata do vc-PABA-MMAE (37a), vc-PABA-MMAF (37b), neisecajućeg BCN-MMAF konjugata (38), isecajućeg BCN-vc-PABA-majtanzinoid konjugata (38) i maleimid-vc-PABA-majtanzinoid konjugata (40).
Slika 10b prikazuje strukturu neisecajućeg BCN-MMAF konjugata 57.
Slika 11 prikazuje šemu reakcije sinteze isecajućeg DIBAC-vc-PABA-MMAF 41. Slika 12 prikazuje šemu reakcije sinteze tri ciklooktin-doksorubicinska konjugata 42-44.
Slika 13 prikazuje strukture tri funkcionalizovana biotinisana reagensa 45-47.
Slika 14 prikazuje šemu reakcije sinteze 2-modifikovanih UDP-GalNAc derivata 52-54 i strukture 6-azido modifikovanih UDP-Gal (55) i UDP-GalNAc (56).
Slika 15 prikazuje MS profil (A) trastuzumaba, (B) trastuzumaba posle orezivanja pomoću endo S, (C) posle galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 i (D) posle konjugacije sa BCN-MMAF 37b.
Slika 16 prikazuje MS profil pulovanog IgG plazme (A), posle orezivanja pomoću endo S (B) i posle galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 (C).
Slika 17 prikazuje MS profil endo S-orezanog trastuzumaba, zatim galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 i na kraju posle bakrom katalisane konjugacije sa alkin-biotinom 45.
Slika 18 prikazuje MS profil endo S-orezanog trastuzumaba, (A) posle galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAcin 53 i (B) posle bakrom katalisane konjugacije sa azido-biotinom 46, što dovodi do 50% konverzije.
Slika 19 prikazuje MS profil endo S-orezanog trastuzumaba, (A) posle galaktoziltransferaze sa UDP-GalNLev 55 i (B) posle konjugacije oksima sa hidroksilamin-biotinom 47.
Slika 20 prikazuje SDS-PAGE pod redukujućim uslovima (trake 1-4) ili neredukujućim uslovima (trake 5-8) za trastuzumab (trake 1 i 5), trastuzumab posle orezivanja i galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 (trake 2 i 6), konjugat trastuzumaba dobijen tretmanom trast(GalNAz)2sa BCN-biotinom 25 (trake 3 i 7) konjugat trastuzumaba dobijen tretmanom trast(GalNAz)2alkin-biotinom 45 posle Cu(I)-katalisane "klik" reakcije (trake 4 i 8). Nekoliko pruga na trakama 4 i 8 ukazuju na formiranje kovalentnih i/ili redukovanih fragmenata, kao i agregaciju, što je rezultat bakrom katalisane "klik" konjugacije, čega svega nema kod konjugacije pokrenute naprezanjem u trakama 3 i 7.
1
Slika 21 prikazuje hromatogram zasnovan na veličini čestica trastuzumab(MMAF)2konjugata izvedenog iz trastuzumab(GalNAz)2i BCN-MMAF 37b.
Slika 22 prikazuje vremenski zavisan MS profil za trastuzumab(doksorubicin)2izveden iz 28a, u humanoj plazmi oslobođenoj IgG.
Slika 23 prikazuje nivo agregacije različitih mAb ili ADC, netretiranih ili posle 5 ciklusa zamrzavanja i otapanja.
Slika 24 prikazuje in vitro citotoksičnost niza ADC na ćelijskoj liniji SK-BR-3.
Slika 25 prikazuje in vitro citotoksičnost niza ADC na ćelijskoj liniji SK-OV-3.
Slika 26 prikazuje in vitro citotoksičnost niza ADC na ćelijskoj liniji MDA-MB-231 (kontrola).
Slika 27 prikazuje klirens iz krvi za<111>In-obeleženi trastuzumab(MMAF)2izveden iz 37b, trastuzumab(majtanzinoid)2izveden iz 39, deglikozilovani trastuzumab (dobijen orezivanjem trastuzumaba pomoću endo S) i nativni trastuzumab.
Slika 28 prikazuje biodistribuciju za<111>In-obeleženi trastuzumab(MMAF)2izveden iz 37b, trastuzumab(majtanzinoid)2izveden iz 39, deglikozilovani trastuzumab (dobijen orezivanjem trastuzumaba pomoću endo S) i nativni trastuzumab. Miševima se injektira 25 µg i disekuju se 21 d posle injektiranja. Preuzimanje u tkiva izraženo je kao %ID/g.
Slika 29 prikazuje in vivo efikasnost u modelu mišjeg ksenografta. Evaluirani ADC je trastuzumab N297 konjugovan sa vc-majtanzinoidom (3 mg/kg i 9 mg/kg) i upoređivan sa T-DM1 (9 mg/kg). Model ksenografta poreklom iz pacijenta obolelog od kancera (cancer patient derived xenograft, PDX) odabran je supkutanom implantacijom tumora sa šifrom (HBx-13B) u ženke SHO miševa. Tumori su mereni na dan 0, 4, 7, 11 i 14.
Slika 30 prikazuje in vivo efikasnost u modelu mišjeg ksenografta. Evaluirani ADC bili su trastuzumab N297 konjugovan sa vc-majtanzinoidom (3 mg/kg i 9 mg/kg), trastuzumab N297 konjugovan sa vc-MMAF (3 mg/kg i 9 mg/kg) i upoređivani su sa T-DM1 (9 mg/kg). Model ksenografta poreklom iz pacijenta obolelog od kancera (PDX) odabran je supkutanom implantacijom tumora sa šifrom (HBx-13B) u ženke SHO miševa. Tumori su mereni na 0, 4, 7, 11, 14, 18 i 21 za vc-majtanzinoid ADC, T-DM1 i prenosnik na dan 0, 3, 7 i 10.
Slika 31 prikazuje detaljnu maseno-spektralnu analizu intaktnih proteinskih vrsta (nanoLC-MS) uz korišćenje nanoLC kuplovane sa ultravisoko rezolucionom QTOF MS (maXis 4G) lakog lanca (light chain, LC) (A) nativnog trastuzumaba, (B) trast(GalNAz)2, (C) trast(GalNAz)2posle konjugacije sa BCN-biotinom 25 i (D) trast(GalNAz)2posle bakrom katalisane konjugacije sa alkin-biotinom 45. Dok je osnovni pik identičan za (A)-(C), trastuzumab konjugat formiran uz katalizu bakrom (D) pokazuje jasni prevoj na 23441.5 i još jedan na 23459, što ukazuje na formiranje značajnih količina (>20%) oksidisanih i/ili deaminisanih sporednih proizvoda.
Detaljan opis pronalaska
Definicije
[0037] Glagol "sadržati", kako se koristi u ovom opisu i patentnim zahtevima, i njegove konjugacije, koristi se u neograničavajućem smislu da označi da su uključeni artikli posle reči, ali da nisu isključeni artikli koji nisu specifično pomenuti.
[0038] Pored toga, upućivanje na element u jednini ne isključuje mogućnost prisustva više od jednog elementa, ukoliko kontekt jasno ne nalaže postojanje jednog i samo jednog od elemenata. Izraz u jednini obično znači "najmanje jedan".
[0039] Jedinjenja objavljena u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu sadržati jedan ili više asimetričnih centara, i mogu postojati različiti dijastereomeri i/ili enantiomeri jedinjenja. Opis bilo kojeg jedinjenja u ovom opisu i u patentnim zahtevima treba da uključi sve dijastereomere, i njihove smeše, ukoliko nije drugačije navedeno. Pored toga, opis bilo kojeg jedinjenja u ovom opisu i u patentnim zahtevima treba da uključi i pojedinačne enantiomere, kao i svaku smešu, racemsku ili drugu, enantiomera, ukoliko nije drugačije navedeno. Kada je struktura jedinjenja prikazana u vidu specifičnog enantiomera, podrazumeva se da pronalazak predmetne patentne prijave nije ograničen na taj specifičan enantiomer.
[0040] Jedinjenja se mogu naći u različitim tautomernim formama. Jedinjenja prema pronalasku treba da uključe sve tautomerne forme, ukoliko nije drugačije navedeno Kada je struktura jedinjenja prikazana u vidu specifičnog tautomera, podrazumeva se da pronalazak predmetne patentne prijave nije ograničen na taj specifičan tautomer.
[0041] Jedinjenja objavljena u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu postojati i kao egzo i endo dijastereoizomeri. Ukoliko nije drugačije navedeno, opis bilo kojeg jedinjenja u opisu i patentnim zahtevima treba da uključi i pojedinačne egzo i pojedinačne endo dijastereoizomere jedinjenja, kao i njihove smeše. Kada je struktura jedinjenja prikazana kao specifični endo ili egzo dijastereomer, podrazumeva se da pronalazak predmetne patentne prijave nije ograničen na taj specifični endo ili egzo dijastereomer.
[0042] Pored toga, jedinjenja objavljena u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu postojati i kao cis i trans izomeri. Ukoliko nije drugačije navedeno, opis bilo kojeg jedinjenja u opisu i patentnim zahtevima treba da uključi i pojedinačni cis i pojedinačni trans izomer jedinjenja, kao i njehove smeše. Kao primer, kada je prikazana struktura jedinjenja kao cis izomera, podrazumeva se da odgovarajući trans izomer ili smeše cis i trans izomera nisu isključeni iz pronalaska predmetne patentne prijave. Kada je struktura jedinjenja prikazana u vidu specifičnog cis ili trans izomera, podrazumeva se da pronalazak predmetne patentne prijave nije ograničen na taj specifični cis ili trans izomer. Jedinjenja objavljena u ovom opisu i patentnim zahtevima mogu postojati i kao regioizomeri. Ukoliko nije drugačije napomenuto, opis bilo kojeg jedinjenja u opisu i u patentnim zahtevima treba da uključi i regioizomere jedinjenja kao i njihove smeše. Kada je struktura jedinjenja prikazana u vidu specifičnog regioizomera, podrazumeva se da pronalazak predmetne patentne prijave nije ograničen na taj specifični regioizomer.
[0043] Nesupstituisane slkil grupe imaju opštu formulu CnH2n+1i mogu biti linearne ili granate. Nesupstituisane slkil grupe mogu sadržati i cikličnu komponentu, i tako posledično mogu imati opštu formulu CnH2n-1. Opciono, alkil grupe su supstituisane jednim ili više supstituenata dodatno specifikovanih u ovom dokumentu. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, propil, 2-propil, t-butil, 1-heksil, 1-dodecil, itd.
[0044] Aril grupa sadrži šest do dvanaest ugljenikovih atoma i može uključivati monociklične i biciklične strukture. Opciono, aril grupa može biti supstituisana jednim ili više supstituenata dodatno specifikovanih u ovom dokumentu. Primeri aril grupa su fenil i naftil.
[0045] Heteroaril grupa sadrži pet do dvanaest atoma ugljenika pri čemu su jedan do četiri atoma ugljenika zamenjeni heteroatomima odabranim iz grupe koja se sastoji od kiseonika, azota, fosfora i sumpora. Heteroaril grupa može imati monocikličnu ili bicikličnu strukturu. Opciono, heteroaril grupa može biti supstituisana jednim ili više supstituenata koji su dodatno specifikovani u ovom dokumentu. Primeri pogodnih heteroaril grupa uključuju piridinil, hinolinil, pirimidinil, pirazinil, pirazolil, pirolil, furanil, benzofuranil, indolil, purinil, benzoksazolil, tienil, fosfolil i oksazolil.
[0046] Arilalkil grupe i alkilaril grupe sadrže najmanje sedam ugljenikovih atoma i mogu uključivati monociklične i biciklične strukture. Opciono, arilalkil grupe i alkilaril grupe mogu biti supstituisane jednim ili više supstituenata koji su dodatno specifikovani u ovom dokumentu. Arilalkil grupa je na primer benzil. Alkilaril grupa je na primer 4-t-butilfenil.
[0047] Alkinil grupa sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik trostrukih veza. Nesupstituisana alkinil grupa koja sadrži jednu trostruku vezu ima opštu formulu CnH2n-3. Terminalni alkinil je
1
alkinil grupa u kojoj je trostruka veza smeštena na terminalnoj poziciji alkinil grupe. Opciono, alkinil grupa je supstituisana jednim ili više supstituenata koji su dodatno specifikovani u ovom dokumentu, i/ili je prekinuta heteroatomima odabranim iz grupe koju čine kiseonik, azot i sumpor. Primeri alkinil grupa uključuju etinil, propinil, butinil, oktinil, itd.
[0048] Cikloalkinil grupa je ciklična alkinil grupa. Nesupstituisana cikloalkinil grupa koja sadrži jednu trostruku vezu ima opštu formulu CnH2n-5. Opciono, cikloalkinil grupa je supstituisana jednim ili više supstituenata koji su dodatno specifikovani u ovom dokumentu. Primer cikloalkinil grupe je ciklooktinil.
[0049] Heterocikloalkinil grupa je cikloalkinil grupa prekinuta heteroatomima odabranim iz grupe koju čine kiseonik, azot i sumpor. Opciono, heterocikloalkinil grupa je supstituisana jednim ili više supstituenata koji su dodatno specifikovani u ovom dokumentu. Primer heterocikloalkinil grupe je azaciklooktinil.
[0050] (Hetero)aril grupa uključuje aril grupu i heteroaril grupu. Alkil(hetero)aril grupa uključuje alkilaril grupu i alkilheteroaril grupu. (Hetero)arilalkil grupa uključuje arilalkil grupu i heteroarilalkil grupu. (Hetero)alkinil grupa uključuje alkinil grupu i heteroalkinil grupu. (Hetero)cikloalkinil grupa uključuje cikloalkinil grupu i heterocikloalkinil grupu.
[0051] (Hetero)cikloalkinsko jedinjenje je ovde definisano kao jedinjeje koje sadrži (hetero)cikloalkinil grupu.
[0052] Nekoliko jedinjenja objavljenih u ovom opisu i u patentnim zahtevima može se opisati kao fuzionisana (hetero) cikloalkin jedinjenja, tj. (hetero)cikloalkin jedinjenja u kojima je druga prstenasta struktura fuzionisana, tj. anelirana, na (hetero)cikloalkinil grupu. Na primer, u fuzionisanom (hetero)ciklooktinskom jedinjenju, cikloalkil (npr. ciklopropil) ili aren (npr. benzen) mogu biti fuzionisani sa (hetero)ciklooktinil grupom. Trostruka veza (hetero)ciklooktinil grupe u fuzionisanom (hetero)ciklooktinskom jedinjenju može se nalaziti na jednoj od tri moguće pozicije, tj. na poziciji 2, 3 ili 4 ciklooktinske komponente (numerisanje prema "IUPAC Nomenclature of Organic Chemistry", pravilo A31.2). Opis bilo kojeg fuzionisanog (hetero)ciklooktinskog jedinjenja u ovom opisu i u patentnim zahtevima treba da uključi sva tri pojedinačna regioizomera ciklooktinske komponente.
[0053] Kada su alkil grupa, (hetero)aril grupa, alkil(hetero)aril grupa, (hetero)arilalkil grupa, (hetero)cikloalkinil grupa opciono supstituisane, pomenute grupe su nezavisno opciono supstituisane jednim ili više supstituenata koji se nezavisno biraju iz grupe koja se sastoji od C1- C12alkil grupe, C2- C12alkenil grupe, C2- C12alkinil grupe, C3- C12cikloalkil grupe, C1- C12alkoksi grupe, C2- C12alkeniloksi grupe, C2- C12alkiniloksi grupe, C3- C12cicloalkiloksi grupe, halogena, amino grupe, okso grupe i silil grupe, pri čemu su alkil grupe, alkenil grupe, alkinil grupe, cikloalkil grupe, alkoksi grupe, alkeniloksi grupe, alkiniloksi grupe i cikloalkiloksi grupe opciono supstituisane, alkil grupe, alkoksi grupe, cikloalkil grupe i cikloalkoksi grupe su opciono prekinute jednim ili više heteroatoma odabranih iz grupe koju čine O, N i S, pri čemu su silil grupe predstavljene formulom (R<6>)3Si-, pri čemu je R<6>nezavisno odabran iz grupe koju čine C1- C12alkil grupe, C2- C12alkenil grupe, C2- C12alkinil grupe, C3- C12cikloalkil grupe, C1- C12alkoksi grupe, C2- C12alkeniloksi grupe, C2-C12alkiniloksi grupe i C3- C12cicloalkiloksi grupe, pri čemu su alkil grupe, alkenil grupe, alkinil grupe, cikloalkil grupe, alkoksi grupe, alkeniloksi grupe, alkiniloksi grupe i cikloalkiloksi grupe opciono supstituisane, alkil grupe, alkoksi grupe, cikloalkil grupe i cikloalkoksi grupe su opciono prekinute jednim ili više heteroatoma odabranih iz grupe koju čine O, N i S.
[0054] Antitelo je protein stvoren imunskim sistemom koji je sposoban da prepozna i veže se za specifični antigen. Izraz antitelo u ovom tekstu koristi se u svom širem smislu i specifično uključuje monoklonska antitela, poliklonska antitela, dimere, multimere, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), fragmente antitela, i dvo- i jednolančana antitela. Izraz "antitelo" u ovom tekstu treba da uključi i humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela i antitela koja se specifično vezuju sa kancerskim antigenom. Izraz "antitelo" treba da uključi cela antitela, ali i fragmente antitela, na primer Fab fragment antitela, F(ab’)2, Fv fragment ili Fc fragment isečenog antitela, scFv-Fc fragment, minitelo, dijatelo ili scFv. Pored toga, izraz uključuje genetički inženjerisane derivate antitela. Antitela, fragmenti antitela i genetički inženjerisana antitela mogu se dobiti postupcima koji su poznati u struci. Antitela poznata na tržištu obuhvataju, između ostalih, abciksimab, rituksimab, bailiksimab, palivizumab, infliksimab, trastuzumab, alemtuzumab, adalimumab, tositumomab-I131, cetuksimab, ibrituksimab tiuksetan, omalizumab, bevacizumab, natalizumab, ranibizumab, panitumumab, ekulizumab, certolizumab pegol, golimumab, kanakinumab, katumaksomab, ustekinumab, tocilizumab, ofatumumab, denosumab, belimumab, ipilimumab i brentuksimab.
[0055] Opšti izraz "šećer" u ovom tekstu se koristi da označi monosaharid, na primer glukozu (Glc), galaktozu (Gal), manozu (Man) i fukozu (Fuc). Izraz "derivat šećera" u ovom tekstu se koristi da označi derivat monosaharidnog šećera, tj. monosaharidni šećer koji uključuje supstituente i/ili funkcionalne grupe. Primeri derivata šećera uključuju amino šećere i šećerne kiseline, npr. glukozamin (GlcN), galaktozamin (GalN) N-acetilglukozamin (GlcNAc), N-acetilgalaktozamin (GalNAc), N-acetilneuraminsku kiselinu (NeuNAc) i N-acetilmuraminsku kiselinu (MurNAc), glukuronsku kiselinu (GlcA) i iduronsku kiselinu (IdoA). Primeri
1
derivata šećera uključuju i jedinjenja ovde označena kao S(A)x, gde je S šećer ili derivat šećera, i gde S sadrži x funkcionalnih grupa A.
[0056] Sržni N-acetilglukozaminski supstituent (sržni GlcNAc supstituent) u ovom tekstu je definisan kao GlcNAc koji je vezan preko C1 za antitelo, poželjno preko N-glikozidne veze za amidni atom azota u bočnom lancu asparaginske amino-kiseline antitela. Sržni GlcNAc supstituent može biti prisutan na nativnom mestu glikozilacije antitela, ali može biti uveden i na drugom mestu na antiitelu. U ovom tekstu, sržni N-acetilglukozaminski supstituent je monosaharidni supstituent, ili ako je pomenuti sržni GlcNAc supstituent fukozilovan, disaharidni sržni (Fucα1-6)GlcNAc supstituent, dalje označen kao GlcNAc(Fuc). U ovom tekstu, "sržni GlcNAc supstituent" ne treba mešati sa "sržni GlcNAc". Sržni GlcNAc je u ovom tekstu definisan kao unutrašnji GlcNAc koji je deo poli ili oligosaharida koji sadrži više od dva saharida, tj. GlcNAc preko kojeg je poli- ili oligosaharid povezan sa antitelom.
[0057] Antitelo koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski supstituent kako je ovde definisano je, prema tome, antitelo koje sadrži monosaharidni sržni GlcNAc supstituent kako je definisano gore, ili ako je pomenuti sržni GlcNAc supstituent fukozilovan, disaharidni sržni GlcNAc(Fuc) supstituent.
[0058] Ako je sržni GlcNAc supstituent ili GlcNAc u GlcNAc-S(A)xsupstituentu fukozilovan, fukoza je najćešće povezana vezom α-1,6 za C6 sržnog GlcNAc supstituenta. Fukozilovani sržni GlcNAc supstituent je označen kao sržni Glc-NAc(Fuc), fukozilovani GlcNAc-S(A)xsupstituent je označen kao GlcNAc(Fuc)-S(A)x.
[0059] Izraz "tretman/lečenje", "tretirati/lečiti" i slično odnose se na dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu potpune ili delimične prevencije bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenih efekata koji se pripisuju bolesti. "Tretman/lečenje", kako se koristi u ovom tekstu, obuhvata svaki tretman/lečenje bolesti kod sisara, posebno ljudi, i uključuje prevenciju pojave bolesti kod subjekta koji može biti predisponiran za bolest, ali kod kojeg bolest još uvek nije dijagnostikovana; zaustavljanje bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja; olakšanje bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti.
Postupak za pripremanje modifikovanog antitela
[0060] Konjugat antitela za upotrebu prema predmetnom pronalasku može se napraviti postupkom koji uključuje korak (i) za pripremanje modifikovanog antitela, koji uključuje dovođenje u kontakt antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski supstituent (sržni GlcNAc supstituent) sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri
1
čemu je pomenuti sržni GlcNAc supstituent opciono fukozilovan, pri čemu pomenuti katalizator uključuje mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (guanosine diphosphate, GDP) i citidin difosfata (cytidine diphosphate, CDP), i pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta.
[0061] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski supstituent (sržni GlcNAc supstituent) je monoklonsko antitelo (monoclonal antibody, mAb). Poželjno, pomenuto antitelo se bira iz grupe koja se sastoji od IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitela. Poželjnije, pomenuto antitelo je IgG antitelo, i najpoželjnije, pomenuto antitelo je IgG1 antitelo. Kada je pomenuto antitelo celo antitelo, antitelo poželjno sadrži jedan ili više, poželjnije jedan, sržni GlcNAc supstituent na svakom teškom lancu, pomenuti sržni GlcNAc supstituent je opciono fukozilovan. Pomenuto celo antitelo prema tome poželjno sadrži dva ili više, poželjno dva, opciono fukozilovana, sržna GlcNAc supstituenta. Kada je pomenuto antitelo jednolančano antitelo ili fragment antitela, npr. Fab fragment, antitelo poželjno sadrži jedan ili više sržnih GlcNAc supstituenata, opciono fukozilovanih.
[0062] U antitelu koje sadrži sržni GlcNAc supstituent (tj. polaznom materijalu postupka), pomenuti sržni GlcNAc supstituent može biti smešten bilo gde na antitelu, uz uslov da pomenuti supstituent ne ometa antigen-vezujuće mesto antitela. U jednom primeru izvođenja, pomenuti sržni GlcNAc supstituent smešten je na Fc fragmentu antitela, poželjnije u CH2 domenu. U drugom primeru izvođenja, pomenuti sržni GlcNAc supstituent smešten je na Fab fragmentu antitela.
[0063] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje sadrži sržni GlcNAc supstituent, gde je pomenuti sržni GlcNAc supstituent opciono fukozilovan, ima Formulu (1), gde AB predstavlja antitelo, GlcNAc je N-acetilglukozamin, Fuc je fukoza, b je 0 ili 1 i y je 1 do 20.
[0064] U poželjnom primeru izvođenja, y je 1 do 10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, još poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
1
[0065] Primer izvođenja koraka (i) postupka u kojem je polazni materijal postupka antitelo koje sadrži jedan opciono fukozilovani sržni GlcNAc supstituent (1a, y je 1) i primer izvođenja u kojem je pomenuti polazni materijal antitelo koje sadrži dva opciono fukozilovana sržna GlcNAc supstituenta (1b, y je 2) prikazani su na Šemi 1, gde AB predstavlja antitelo i gde je b 0 ili 1. S(A)xi P su kako je definisano ranije u ovom tekstu.
[0066] Modifikacija antitela (1a) daje modifikovano antitelo koje sadrži jedan GlcNAc-S(A)xsupstituent (2) i modifikacija antitela (1b) daje modifikovano antitelo koje sadrži dva GlcNAc-S(A)xsupstituenta (3).
[0067] U struci je poznato nekoliko pogodnih katalizatora za korak (i) postupka. Pogodan katalizator za specifičan postupak je katalizator za koji supstrat u tom specifičnom postupku predstavlja specifični derivat šećera nukleotida S(A)x-P. Poželjno, katalizator se bira iz grupe galaktoziltransferaza, poželjnije iz grupe β(1,4)-galaktoziltransferaza ili α(1,3)-N-galaktoziltransferaza, još poželjnije iz grupe β(1,4)-galaktoziltransferaza ili α(1,3)-N-galaktoziltransferaza koje sadrže mutantni katalitički domen. Pogodan katalizator je na primer katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze I. Katalitički domen ovde označava segment aminokiselina koji se savija u domen koji može da katališe vezivanje specifičnog derivata šećera nukleotida S(A)x-P za sržni GlcNAc supstituent u specifičnom postupku za pripremanje konjugata antitela za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Katalitički domen može imati aminokiselinsku sekvencu koja se nalazi u divljem tipu enzima, ili aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od divljeg tipa sekvence. Katalitički domen koji ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od divljeg tipa sekvence ovde se označava kao mutantni katalitički domen. Mutacija može npr. sadržati jednu aminokiselinsku promenu (tačkastu mutaciju), ali i više aminokiselinskih promena (npr 1 do 10, poželjno 1 do 6, poželjnije 1, 2, 3 ili 4, još poželjnije 1 ili 2 amino-kiseline), ili deleciju ili inserciju jedne ili
1
više (npr. 1 do 10, poželjno 1 do 6, poželjnije 1, 2, 3 ili 4, još poželjnije 1 ili 2) aminokiselina. Pomenuti mutantni katalitički domen može biti prisutan u enzimu pune dužine, npr. enzimu β(1,4)-galaktoziltransferazi I, ali i u npr. polipeptidnom fragmenti ili rekombinantnom polipeptidu koji sadrži pomenuti mutantni katalitički domen, opciono vezan za dodatne amino-kiseline.
[0068] β(1,4)-galaktoziltransferaza I je ovde dalje označena kao GalT. Takvi mutantni GalT katalitički domeni su na primer objavljeni u WO 2004/063344 (Nacionalni institut za zdravlje). WO 2004/063344 objavljuje Tyr-289 mutante GalT, koji su označeni kao Y289L, Y289N i Y289I. Postupak pripremanja pomenutih mutantnih katalitičkih domena Y289L, Y289N i Y289I objavljen je detaljno u WO 2004/063344, str.34, I.6 - str.36, I.2.
[0069] Mutantni GalT domeni koji katališu formiranje glukoza-β(1,4)-N-acetilglukozamin veza objavljeni su u WO 2004/063344 na str. 10, I, 25 - str. 12, I. 4. Mutantni GalT domeni koji katališu formiranje veze N-acetilgalaktozamin-β(1,4)-N-acetilglukozamin objavljeni su u WO 2004/063344 na str.12, I, 6 - str.13, I.2. Mutantni GalT domeni koji katališu formiranje veze N-acetilglukozamin-β(1,4)-N-acetilglukozamine i veze manoza-β(1,4)-N-acetilglukozamin objavljeni su u WO 2004/063344 na str. 12, I, 19 - str. 14, I. 6. Objavljeni mutantni GalT domeni mogu biti uključeni u GalT enzime pune dužine, ili u rekombinantne molekule koji sadrže katalitičke domene, kako je objavljeno u WO 2004/063344 na str.14, I, 31 - str.16, I.28.
[0070] Drugi mutantni GalT domen je na primer Y284L, objavljen u Bojarová et al., Glycobiology 2009, 19, 509. Mutacija na poziciji 284 tiče se tirozinske rezidue.
[0071] Sledeći mutantni GalT domen je na primer R228K, koji su objavili Qasba et al., Glycobiology 2002, 12, 691, gde je Arg228 zamenjen lizinom.
[0072] U poželjnom primeru izvođenja postupka za pripremanje modifikovanog antitela u skladu, pomenuti katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno goveđe β(1,4)-galaktoziltransferaze. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti katalizator je katalizator koji sadrži GalT mutantni katalitički domen odabran iz grupe koja se sastoji od Y289L, Y289N, Y289I, Y284L i R228K, poželjno Y289L. U specifičnom primeru izvođenja, katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno odabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289L, GalT Y289N i GalT Y289I, poželjnije GalT Y289L ili GalT Y289N, i najpoželjnije GalT Y289L.
[0073] U sledećem primeru izvođenja, katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz goveđe β(1,4)-galaktoziltransferaze, odabran iz grupe koja se sastoji od
1
GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A, poželjno odabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289F i GalT Y289M. GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A mogu se obezbediti preko postupka usmerene mutageneze, na sličan način kao što je objavljeno u WO 2004/063344, u Qasba et al., Prot. Expr. Pur.2003, 30, 219 i u Qasba et al., J. Biol. Chem.2002, 277, 20833 za Y289L, Y289N i Y289I. U GalT Y289F amino-kiselina tirozin (Y) na poziciji 289 zamenjena je amino-kiselinom fenil-alanin (F), u GalT Y289M pomenuti tirozin zamenjen je aminokiselinom metionin (M), u GalT Y289V amino-kiselinom valin (V), u GalT Y289G aminokiselinom glicin (G), u GalT Y289I amino-kiselinom izoleucin (I) i u Y289A amino-kiselinom alanin (A).
[0074] Drugi tip pogodnih katalizatora je katalizator na bazi α(1,3)-N-galaktoziltransferaze (u nastavku označen kao a3Gal-T), poželjno α(1,3)-N-acetilgalaktozaminiltransferaza (u nastavku označena kao a3GalNAc-T), kako je objavljeno u WO 2009/025646. Mutacija a3Gal-T može proširiti donorsku specifičnost enzima, i učiniti ga a3GalNAc-T. Mutacija a3GalNAc-T može proširiti donorsku specifičnost enzima. Polipeptidni fragmenti i katalitički domeni α(1,3)-N-acetilgalaktozaminiltransferaza objavljeni su u WO 2009/025646 na str. 26, I. 18 - str.47, I.15 i str.77, I.21 - str.82, I.4.
[0075] U jednom primeru izvođenja, katalizator je divlji tip galaktoziltransferaze, poželjnije divlji tip β(1,4)-galaktoziltransferaze ili divlji tip β(1,3)-N-galaktoziltransferaze, i još poželjnije divlji tip β(1,4)-galaktoziltransferaze I. β(1,4)-galaktoziltransferaza je ovde označena i kao GalT. Još poželjnije, β(1,4)-galaktoziltransferaza se bira iz grupe koja se sastoji od goveđe β(1,4)-Gal-T1, humane β(1,4)-Gal-T1, humane β(1,4)-Gal-T2, humane β(1,4)-Gal-T3 i humane β(1,4)-Gal-T4. Još poželjnije, β(1,4)-galaktoziltransferaza je β(1,4)-Gal-T1. Kada je katalizator divlji tip β(1,3)-N-galaktoziltransferaze, poželjna je humana β(1,3)-Gal-T5.
[0076] Ovaj primer izvođenja u kojem je katalizator divlji tip galaktoziltransferaze posebno je poželjan kada je funkcionalna grupa A u derivatu šećera S(A)xprisutna na C2 ili C6, poželjno C6, pomenutog derivata šećera. U ovom primeru izvođenja, poželjno je i to da Su(A)xsadrži jednu funkcionalnu grupu A, tj. poželjno x je 1. P, Su(A)xi Su(A)x-P opisani su detaljno u nastavku.
[0077] Prema tome, modifikovano antitelo može se pripremiti postupkom koji uključuje dovođenje u kontakt antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski (GlcNAc) supstituent sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je pomenuti katalizator divlji tip galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x
2
funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i pri ćemu je x 1, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta.
[0078] Postupak za pripremanje modifikovanog antitela poželjno se izvodi u odgovarajućem rastvoru pufera kao što je na primer fosfat, puferisanom slanom rastvoru (npr. fosfatom puferisani slani rastvor, tris-puferisani slani rastvor), citrat, HEPES, tris i glicin. Pogodni puferi poznati su u struci. Poželjno, puferski rastvor je fosfatom puferisani slani rastvor (phosphate-buffered saline, PBS) ili tris pufer.
[0079] Postupak se poželjno izvodi na temperaturi u rasponu od oko 4 do oko 50°C, poželjnije u rasponu od oko 10 do oko 45°C, još poželjnije u rasponu od oko 20 do oko 40°C, i najpoželjnije u rasponu od oko 30 do oko 37°C.
[0080] Postupak se poželjno izvodi na pH u rasponu od oko 5 do oko 9, poželjno u rasponu od oko 5.5 do oko 8.5, poželjnije u rasponu od oko 6 do oko 8. Najpoželjnije, postupak se izvodi na pH u rasponu od oko 7 do oko 8.
[0081] U postupku, smeša antitela može se koristiti kao polazno antitelo, pomenuta smeša sadrži antitela koja uključuju jedan ili više sržnih GlcNAc supstituenata i/ili jedan ili više sržnih GlcNAc(Fuc) supstituenata. Na primer kada smeša polaznog antitela sadrži celo antitelo sa jednim opciono fukozilovanim sržnim GlcNAc supstituentom na svakom teškom lancu, celo antitelo može sadržati dva sržna GlcNAc supstituenta, ili dva sržna GlcNAc(Fuc) supstituenta, ili jedan sržni GlcNAc supstituent i jedan sržni GlcNAc(Fuc) supstituent.
[0082] GlcNAc u monosaharidnom sržnom GlcNAc supstituentu je na terminalnoj poziciji, dok je GlcNAc u disaharidnom sržnom GlcNAc(Fuc) supstituentu na unutrašnjoj poziciji, vezan za antitelo preko C1 i za Fuc preko C6. S obzirom na to da su, kao što je gore opisano, pomenuti galaktoziltransferazni mutantni enzimski katalizatori takođe sposobni da prepoznaju unutrašnje šećere i derivate šećera kao akceptor, derivat šećera S(A)xvezan je za sržni GlcNAc supstituent u postupku, bez obzira na to da li je pomenuti GlcNAc fukozilovan ili nije. Kao prednost, uklanjanje fukoze pre koraka (i) postupka dakle nije neophodno, jer se u postupku može koristiti smeša antitela koja sadrži i sržne GlcNAc i sržne Glc-NAc(Fuc) supstituente. Međutim, po želji, fukoza može da se ukloni sa bilo kojeg sržnog Glc-NAc(Fuc) supstituenta pre koraka (i) postupka, na primer defukozilacijom u prisustvu α-fukozidaze, kako je poznato u struci.
[0083] S(A)xse definiše kao derivat šećera, koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde je A azido grupa i gde je x 1, 2, 3 ili 4. Azido grupa je azidna funkcionalna grupa -N3. Derivat šećera S(A)xmože sadržati jednu ili više funkcionalnih grupa A. U poželjnom primeru izvođenja, x je 1 ili 2, poželjnije x je 1.
[0084] Derivat šećera S(A)xizveden je iz šećera ili derivata šećera S, npr. amino šećera ili na drugi način derivatizovanog šećera. Primeri šećera i derivata šećera uključuju galaktozu (Gal), manozu (Man), glukozu (Glc), glukuronsku kiselinu (Gcu) i fukozu (Fuc). Amino šećer je šećer u kojem je hidroksil (OH) grupa zamenjena amino grupom i primeri uključuju N-acetilglukozamin (GlcNAc) i N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Primeri na drugi način derivatizovanog šećera uključuju glukuronsku kiselinu (Gcu) i N-acetilneuraminsku kiselinu (sijalinska kiselina). Derivat šećera S(A)xpoželjno je izveden iz galaktoze (Gal), manoze (Man), N-acetilglukozamina (GlcNAc), glukoze (Glc), N-acetilgalaktozamina (GalNAc), glukuronske kiseline (Gcu), fukoze (Fuc) i N-acetilneuraminske kiseline (sijalinske kiseline), poželjno iz grupe koja se sastoji od GlcNAc, Glc, Gal i GalNAc. Poželjnije S(A)xje izveden iz Gal ili GalNAc, i najpoželjnije S(A)xje izveden iz GalNAc.
[0085] Jedna ili više funkcionalnih grupa A u S(A)xmogu biti vezane za šećer ili derivat šećera S na nekoliko načina. Jedna ili više funkcionalnih grupa A mogu biti vezane za C2, C3, C4 i/ili C6 šećera ili derivata šećera, umesto hidroksil (OH) grupe. Treba napomenuti da, pošto fukoza nema OH-grupu na C6, ako je A vezano za C6 Fuc, onda A zauzima mesto H-atoma.
[0086] A je azido grupa, i poželjno je da je A vezan za C2, C4 ili C6. Kako je opisano ranije u ovom tekstu, jedan ili više azidnih supstituenata u S(A)xmože biti vezano za C2, C3, C4 ili C6 šećera ili derivata šećera S, umesto hidroksil (OH) grupe ili, u slučaju 6-azidofukoze (6-AzFuc), umesto vodonikovog atoma. Alternativno ili dodatno, N-acetil supstituent amino šećernog derivata može biti supstituisan azidoacetil supstituentom. U poželjnom primeru izvođenja S(A)xse bira iz grupe koja se sastoji od 2-azidoacetamidogalaktoze (GalNAz), 6-azido-6-deoksigalaktoze (6-AzGal), 6-azido-6-deoksi-2-acetamidogalaktoze (6-AzGalNAc), 4-azido-4-deoksi-2-acetamidogalaktoze (4-AzGalNAc), 6-azido-6-deoksi-2-azidoacetamidogalaktoze (6-AzGalNAz), 2-azidoacetamidoglukoze (GlcNAz), 6-azido-6-deoksiglukoze (6-AzGlc), 6-azido-6-deoksi-2-acetamidoglukoze (6-AzGlcNAc), 4-azido-4-deoksi-2-acetamidoglukoze (4-AzGlcNAc) i 6-azido-6-deoksi-2-azidoacetamidoglukoze (6-AzGlcNAz), poželjnije iz grupe koja se sastoji od GalNAz, 4-AzGalNAc, GlcNAz i 6-AzGlcNAc. Primeri S(A)x-P u kojima je A azido grupa prikazani su u nastavku ovog teksta.
[0087] Jedinjenja formule S(A)x-P, u kojima je nukleozid monofosfat ili nukleozid difosfat P vezan za šećerni derivat S(A)x, poznati su u struci. Na primer Wang et al., Chem. Eur. J.2010, 16, 13343-13345, Piller et al., ACS Chem. Biol. 2012, 7, 753, Piller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5459-5462 i WO 2009/102820 objavljuju brojna jedinjenja S(A)x-P i njihove sinteze.
[0088] U poželjnom primeru izvođenja nukleozid mono- ili difosfat P u S(A)x-P bira se iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP), timidin difosfata (TDP), citidin difosfata (CDP) i citidin monofosfata (CMP), poželjno UDP.
[0089] Nekoliko primera (5 - 7) uridin difosfata vezanih za azido-supstituisane šećere i šećerne derivate, S(A)x-UDP, prikazano je dole.
[0090] Poželjno, S(A)x-P bira se iz grupe koja se sastoji od GalNAz-UDP (5), 6-AzGal-UDP (6), 6-AzGalNAc-UDP (7), 4-AzGalNAz-UDP, 6-AzGalNAz-UDP, 6-AzGlc-UDP, i 6-AzGlcNAz-UDP.
[0091] Najpoželjnije, S(A)x-P je GalNAz-UDP (5) ili 4-AzGalNAc-UDP (7). Sinteze GalNAz-UDP (5) i 6-AzGalNAc-UDP (7) objavljene su u Piller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5459-5462 i Wang et al., Chem. Eur. J.2010, 16, 13343-13345.
[0092] Kako je opisano ranije u ovom tekstu, u postupku modifikacije antitela, S(A)x-P može biti bilo koji derivat šećera nukleotida koji je supstrat za pogodni galaktoziltransferazni katalizator.
[0093] Poželjni primer izvođenja postupka prikazan je na Slici 4. Slika 4 prikazuje monoklonsko antitelo (mAb) koje sadrži opciono fukozilovani (b = 0 ili 1), sržni GlcNAc
2
supstituent na svakom teškom lancu antitela. Ovi sržni GlcNAc (b = 0) i sržni GlcNAc(Fuc) (b = 1) supstituenti konvertuju se u GlcNAc-GalNAz, odnosno Glc-NAc(Fuc)-GalNAz supstituente. Pomenuta konverzija vrši se preko reakcije sa GalNAz-UDP (5) u prisustvu mutantnog GalT Y289L enzima kao katalizatora.
[0094] Korak (i) postupka uopšteno se odnosi na pripremanje modifikovanog antitela, postupak uključuje:
(a) obezbeđivanje antitela koje sadrži opciono fukozilovani sržni N-acetilglukozaminski supstituent (sržni GlcNAc supstituent), što je praćeno
(b) dovođenjem u kontakt pomenutog antitela sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta.
[0095] Antitelo koje sadrži opciono fukozilovani sržni GlcNAc supstituent može se obezbediti na različite načine. Pomenuta antitela, npr. cela antitela, fragmenti antitela, genetički inženjerisana antitela, itd. mogu se obezbediti postupcima koji su poznati osobi obučenoj u struci. Na primer Fab ili Fc fragmenti mogu se pripremiti proteolitičkom digestijom suštinski intaktnih imunoglobulinskih molekula papainom, ili rekombinantnom ekspresijom željenih delova imunoglobulinskog teškog i lakog lanca.
[0096] U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje još i deglikozilaciju glikana antitela sa sržnim N-acetilglukozaminom, u prisustvu endoglikozidaze, u cilju dobijanja antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski supstituent, gde su pomenuti sržni N-acetilglukozamin i pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovani. U zavisnosti od prirode glikana, može se odabrati pogodna endoglikozidaza. Endoglikozidaza se poželjno bira iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo A, Endo F, Endo M, Endo D i Endo H enzima i/ili njihove kombinacije, čiji izbor zavisi od prirode glikana. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S, Endo S49, Endo F ili njihova kombinacija. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S, Endo F ili njihova kombinacija. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S49.
[0097] Glikansko antitelo koje ima sržni N-acetilglukozamin ovde je definisan kao antitelo koje sadrži glikan vezan za antitelo preko C1 opciono fukozilovanog GlcNAc (sržni GlcNAc). Pored pomenutog sržnog-GlcNAc i opciono, Fuc, pomenuti glikan sadrži najmanje još jedan šećer ili derivat šećera.
[0098] Poželjni primer izvođenja pomenutog koraka deglikozilacije postupka prikazan je na Slici 5, gde se smeša glikoformi antitela G2F, G1F, G0F, G2, G1 i G0, i moguće još glikoformi kao što su triantenalni glikani, konvertuje u antitela koja sadrže opciono fukozilovani (b je 0 ili 1), sržni N-acetilglukozaminski supstituent. Glikoforme G2F, G1F, G0F, G2, G1 i G0 prikazane su na Slici 1.
[0099] Korak (i) postupka se prema tome odnosi i na pripremanje modifikovanog antitela, postupak uključuje:
(a) deglikozilaciju glikana antitela sa sržnim N-acetilglukozaminom, u prisustvu endoglikozidaze, u cilju dobijanja antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski supstituent, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, što je praćeno
(b) dovođenjem u kontakt pomenutog antitela sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xšećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)x supstituenta.
[0100] Korak (i) odnosi se i na pripremanje modifikovanog antitela, postupak uključuje:
(a) deglikozilaciju glikana antitela sa sržnim N-acetilglukozaminom, u prisustvu endoglikozidaze, u cilju dobijanja antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski supstituent, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent vezan preko N-glikozidne veze za amidni atom azota u pomenutom bočnom lancu asparaginske amino-kiseline antitela, i pri čemu je pomenuta endoglikozidaza Endo S, Endo S49, Endo F, ili njihova kombinacija; što je praćeno
2
(b) dovođenjem u kontakt pomenutog antitela sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xšećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP),
pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta.
[0101] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuta endoglikozidaza bira se iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo F, ili njihove kombinacije. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S, Endo F ili njihova kombinacija. U još poželjnijem primeru izvođenja, pomenuta endoglikozidaza je Endo S. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuta endoglikozidaza je Endo S49. U još poželjnijem primeru izvođenja, pomenuta endoglikozidaza se bira iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo S49, Endo F i/ili njihove kombinacije. Poželjnije, pomenuta endoglikozidaza je Endo S ili Endo S49. Najpoželjnije, pomenuta endoglikozidaza je Endo S ili Endo F.
[0102] Endo S, Endo A, Endo F, Endo M, Endo D i Endo H poznate su stručnjaku u oblasti. Endo S49 opisana je u WO 2013/037824 (Genovis AB). Endo S49 izolovana je iz Streptococcus pyogenes NZ131 i homologna je Endo S. Endo S49 ima specifičnu endoglikozidaznu aktivnost za nativni IgG i seče više različitih Fc glikana nego Endo S. U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti sržni N-acetilglukozamin prisutan je na nativnom N-glikozilacionom mestu antitela. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je IgG i pomenuti sržni N-acetilglukozamin je prisutan na nativnom N-glikozilacionom mestu IgG. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je IgG, pomenuti sržni N-acetilglukozamin prisutan je na nativnom N-glikozilacionom mestu IgG, i nativno mesto je N297-glikozilaciono mesto IgG. N297 N-glikozilaciono mesto prisutno je u Fc regionu teškog lanca IgG antitela.
[0103] Kada je pomenuti sržni N-acetilglukozamin prisutan na nativnom N-glikozilacionom mestu IgG antitela, poželjno je da se endoglikozidaza bira iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo S49 i Endo F, i njihove kombinacije. Poželjnije, endoglikozidaza je Endo S, Endo S49 ili Endo F, još poželjnije Endo S ili Endo F, i najpoželjnije Endo S. Kako je poznato u struci, Endo H, Endo M, Endo F1 manje su pogodne za deglikozilaciju glikana koji je prisutan na
2
nativnom mestu IgG antitela. Posebno, one su manje pogodne za deglikozilaciju glikana koji je prisutan na N297.
Modifikovano antitelo
[0104] Prosec za pripremanje modifikovanog antitela daje antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent, pri čemu je GlcNAc N-acetilglukozamin, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je navedeni GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 sržnog N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je navedeni N-acetilglukozamin opciono fukozilovan. Takvo antitelo se ovde naziva modifikovano antitelo.
[0105] U jednom primeru izvođenja, modifikovano antitelo ima Formulu (4), gde AB predstavlja antitelo, GlcNAc je N-acetilglukozamin, Fuc je fukoza, b je 0 ili 1 i y je 1 do 20, i pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4. U poželjnom primeru izvođenja, y je 1 do 10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, još poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
[0106] Šećerni derivat S(A)xu GlcNAc-S(A)xsupstituentu modifikovanog antitela može na primer biti vezan za C4 GlcNAc preko β(1,4)-glikozidne veze ili za C3 pomenutog GlcNAc preko α(1,3)-glikozidne veze. N-acetilglukozamin pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta vezan je preko C1 za antitelo, poželjno preko N-glikozidne veze, za amidni atom azota u bočnom lancu asparaginske amino-kiseline antitela (GlcNAcβ1-Asn ). GlcNAc u pomenutom GlcNAc-S(A)xsupstituentu opciono je fukozilovan. Da li je derivat šećera S(A)xu GlcNAc-S(A)xsupstituentu modifikovanog antitela vezan za C4 GlcNAc preko β(1,4)-glikozidne veze ili za C3 pomenutog GlcNAc preko α(1,3)-glikozidne veze zavisi od katalizatora upotrebljenog u postupku za pripremanje modifikovanog antitela. Kada se postupak izvodi u prisustvu katalizatora β(1,4)-galaktoziltransferaze, tada se vezivanje dešava preko C1 S(A)xi C4 GlcNAc, β(1,4)-glikozidnom vezom. Kada se postupak izvodi u prisustvu katalizatora α(1,3)-galaktoziltransferaze, onda se vezivanje dešava preko C1 S(A)xi C3 GlcNAc, α(1,3)-glikozidnom vezom.
2
[0107] A je azido funkcionalna grupa, a modifikovano antitelo se označava kao antitelo modifikovano azidom. Modifikovano antitelo je antitelo modifikovano azidom.
[0108] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti S(A)xje izveden iz šećera ili derivata šećera odabranog iz grupe koja se sastoji od galaktoze (Gal), manoze (Man), N-acetilglukozamina (GlcNAc), glukoze (Glc), N-acetilgalaktozamina (GalNAc), glukuronske kiseline (Gcu), fukoze (Fuc) i N-acetilneuraminske kiseline (sijalinska kiselina), poželjno Gal, GlcNAc, glukoze i GalNAc.
[0109] U još jednom poželjnom primeru izvođenja S(A)xse bira iz grupe koja se sastoji od GalNAz, 6-AzGal, 6-AzGalNAc, 4-AzGalNAz, 6-AzGalNAz, 6-AzGlc, i 6-AzGlcNAz. Najpoželjnije, S(A)xje GalNAz ili 4-AzGalNAc.
[0110] Antitelo modifikovano azidom koje može imati strukturu prikazanu u nastavku, gde je S(A)x, sa A za azido, prika
pri čemu:
b je 0 ili 1;
x je 1, 2, 3 ili 4;
S je šećerni derivat;
p je 0 ili 1;
Q je -N(H)C(O)CH2- ili -CH2-;
y je 1 - 20;
i pri čemu je AB antitelo, S je šećer ili derivat šećera, GlcNAc je N-acetilglukozamin. GlcNAc je opciono fukozilovan (b je 0 ili 1).
[0111] Azidom modifikovano antitelo može sadržati 1 do 20 opciono fukozilovanih supstituenata GlcNAc-S(A)x(y je 1 do 20). Poželjno, y je 1 do 10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, još poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
[0112] Vrednost p i priroda Q zavise od azidom supstituisanog šećernog derivata S(A)xkoji je prisutan u azidom modifikovanom antitelu. Ako je azido grupa u S(A)xprisutna na C2, C3 ili C4 poziciji šećera ili derivata šećera, tj. umesto OH grupe šećera, onda je p 0. Ako je azido grupa u S(A)x2-azidoacetamido grupa, tj. S(A)xje npr. GalNAz ili GlcNAz, tada je p 1 i Q je
2
-N(H)C(O)CH2-. Ako je azido grupa u S(A)xprisutna na C6 poziciji šećera ili derivata šećera, tj. umesto OH grupe šećera ili u slučaju 6-AzFuc umesto H-atoma, onda je p 1 i Q je -CH2-.
[0113] Poželjno modifikovano antitelo je monoklonsko antitelo, poželjnije odabrano iz grupe koja se sastoji od IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitela. Još poželjnije pomenuto antitelo je IgG antitelo, a najpoželjnije pomenuto antitelo je IgG1 antitelo. Kada je modifikovano antitelo celo antitelo, antitelo poželjno sadrži dva ili više, poželjnije dva, GlcNAc-S(A)xsupstituenta, pri čemu su navedeni GlcNAc-S(A)xsupstituenti opciono fukozilovani. Međutim, ako je modifikovano antitelo fragment antitela, npr. Fab ili Fc fragment, antitelo može imati samo GlcNAc-S(A)xsupstituent, koji je opciono fukozilovan.
[0114] U modifikovanom antitelu, GlcNAc-S(A)xsupstituent može se nalaziti bilo gde na antitelu, pod uslovom da navedeni supstituent ne ometa vezivanje antigena za mesto vezivanja na antitelu. U jednom primeru izvođenja, pomenuti GlcNAc-S(A)xsupstituent smešten je u Fc domenu antitela, poželjnije u CH2 domenu. U drugom primeru izvođenja, pomenuti GlcNAc-S(A)xsupstituent nalazi se na Fab domenu antitela. U još jednom primeru izvođenja, pomenuti GlcNAc-S(A)xsupstituent nalazi se na Fab ili Fc fragmentu antitela.
[0115] Kao što je gore opisano, postupak za pripremanje modifikovanog antitela može dati modifikovana antitela koja sadrže više od jednog GlcNAc-S(A)xsupstituenta. Broj supstituenata na antitelima ne zavisi samo od prirode antitela koje treba modifikovati (npr. celo antitelo, pojedinačni lanac, fragment, itd.), već i od broja sržnih GlcNAc supstituenata prisutnih na antitelu koje treba da se modifikuje.
Postupak za pripremanje konjugata antitela
[0116] Modifikovano antitelo može se koristiti za pripremanje konjugata antitela (antibodyconjugate, AC). Konjugat antitela (AC) se ovde definiše kao antitelo koje je konjugovano sa molekulom od interesa (D) preko linkera (L). Konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku može biti konjugovan sa jednim ili više molekula od interesa (D) preko pomenutog linkera (L).
[0117] Molekul od interesa je aktivna supstanca. Aktivna supstanca je farmakološka supstanca, odnosno supstanca koja je farmaceutski aktivna. Aktivna supstanca je citotoksin. Primeri citotoksina uključuju kamptotecine, staurosporin, doksorubicin, daunorubicin, kolhicin, metotreksat, taksane, kaliheamicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivate majtanzina), auristatine, tubulizin M, kriptoficin ili pirolobenzodiazepine (PBD). Primeri auristatina uključuju dolastatin 10, auristatin F, monometil auristatin F (MMAF),
2
auristatin E, monometil auristatin E (MMAE), auristatin PE, auristatin TP i auristatin AQ. Primeri majtanzina i majtanzinoida uključuju mertanzin i ansamitocin.
[0118] U konjugatu antitela (AC) za upotrebu prema pronalasku, molekul od interesa konjugovan je sa antitelom preko linkera (L). Linkeri ili linkerske jedinice su dobro poznate u struci, i opisane su detaljnije u nastavku.
[0119] Konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku može se pripremiti postupkom za pripremanje konjugata antitela, koji uključuje reakciju modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu pomenuti linkerski konjugat sadrži funkcionalnu grupu B i jedan ili više molekula od interesa, pri čemu je navedena funkcionalna grupa B ona funkcionalna grupa koja je sposobna da reaguje sa funkcionalnom grupom A GlcNAc-S(A)xsupstituenta na pomenutom modifikovanom antitelu. Pomenuti linkerski konjugat poželjno ima formulu B-L(D)r, gde su B, L i D kao što je definisano gore, a r je 1-20, poželjno r je 1-10, poželjnije r je 1-8, i još poželjnije r je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, još poželjnije r je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije r je 1 ili 2.
[0120] A je azido grupa, i povezivanje antitela modifikovanog azidom i linkerskog konjugata poželjno se odvija preko cikloadicione reakcije. Funkcionalna grupa B je (hetero)cikloalkinil grupa.
[0121] U pomenutom postupku, azid na antitelu modifikovanom azidom reaguje sa (heter)cikloalkinil grupom linkerskog konjugata cikloadicionom reakcijom. Ova cikloadiciona reakcija molekula koji sadrži azid sa molekulom koji sadrži (hetero)cikloalkinil grupu jedna je od reakcija koje su u struci poznate kao "klik"-hemija. Linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu, poželjno napregnutu (hetero)cikloalkinil grupu. Kada je (hetero)cikloalkin napregnuta (hetero)cikloalkinil grupa, prisustvo katalizatora nije neophodno, a pomenuta reakcija se čak može desiti spontano, reakcijom koja se naziva naprezanjem pokrenuta azid-alkin cikloadicija (strain-promoted azide-alkyne cycloaddition, SPAAC). Ovo je jedna od reakcija poznatih u struci kao "klik"-hemija bez metala. Napregnute (hetero)cikloalkinil grupe poznate su u struci i detaljnije su opisane u nastavku ovog teksta.
[0122] Prema tome, postupak pripremanja konjugata antitela uključuje reakciju modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa, pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo ono antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent, pri čemu je GlcNAc N-acetilglukozamin, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa, i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je pomenuti GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je pomenuti GlcNAc opciono fukozilovan. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuta (hetero)cikloalkinil grupa je napregnuta (hetero)cikloalkinil grupa.
[0123] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti postupak za pripremanje konjugata antitela uključuje korake:
(i) dovođenja u kontakt antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozaminski (GlcNAc) supstituent sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa, i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je P odabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP ), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), kako bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitielo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i gde je navedeno modifikovano antitelo u skladu sa formulom (4):
gde:
S(A)xi x su kako je gore definisano; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
(ii) reakciju pomenutog modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa.
[0124] Prednost ovog primera izvođenja postupka za pripremanje konjugata antitela je ta što nije neophodno prisustvo bakarnog katalizatora. Pomenuti postupak se dakle odvija u odsustvu bakarnog katalizatora. Prisustvo bakarnog katalizatora u pomenutom postupku ima nekoliko nedostataka. Uopšteno, najpogodnija procedura za konjugaciju azida sa terminalnim alkinima zahteva prisustvo Cu(I). Bakar(I) se obično stvara in situ od Cu(II), što zahteva
1
dodavanje odgovarajućeg redukcionog sredstva, npr. DTT, natrijum askorbata ili hidrazina i dodavanje pogodnog liganda za održavanje bakra u oksidacionom stanju Cu(I). Međutim, opsežna optimizacija i fino podešavanje uslova mogu biti potrebni kako bi se pronašli optimalni parametri za efikasnu konverziju. Ipak, čak i pod takvim uslovima, propratno stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika ne može se uvek u potpunosti izbeći, što zauzvrat može izazvati oksidativno oštećenje proteina, na primer oksidaciju metionina, histidina, cisteina ili disulfidnih veza. Drugi protokoli koriste izvore bakra(I) kao što je CuBr za označavanje fiksiranih ćelija i sintetisanje glikoproteina. U tim slučajevima, nestabilnost CuI na vazduhu nameće potrebu za velikim viškom Cu (većim od 4 mm) i liganda za efikasnost reakcija, što takođe izaziva zabrinutost zbog oštećenja proteina ili precipitacije, plus prisustvo rezidualnog metala posle prečišćavanja. Utvrđeno je da konjugacija antitela koja sadrže azid, sa terminalnim alkinima u prisustvu bakra, dovodi do opsežnog stvaranja sporednih proizvoda, neželjenom oksidacijom amino-kiselina. Na primer, visokorezoluciona maseno-spektralna analiza lakog lanca (LC) trastuzumaba posle konjugacije katalisane bakrom ukazuje na stvaranje >20% vrsta sa molekulskim težinama 16/+18 (vidi Sliku 31). Detaljna analiza fragmenata peptida teškog lanca (HC) trastuzumaba posle digestije tripsinom ukazuje na oksidaciju bar jednog određenog histidina za čak 69%, kao što je prikazano u Primeru 39. Detaljna analiza fragmenata peptida lakog lanca (LC) trastuzumaba posle digestije tripsinom ukazuje na oksidaciju najmanje jednog određenog metionina, što je takođe prikazano u Primeru 39.
[0125] Molekuli od interesa su detaljnije opisani rabije u ovom tekstu. Molekul od interesa je aktivna supstanca. Molekul od interesa je (hetero)cikloalkinil grupa, a poželjno je da pomenuta komponenta bude (hetero)ciklooktin komponenta. Poželjne strukture (hetero)ciklooktin grupa opisane su detaljnije u nastavku.
[0126] Postupak za pripremanje modifikovanog antitela poželjno se izvodi na temperaturi u rasponu od oko 20 do oko 50 °C, poželjnije u rasponu od oko 25 do oko 45 °C, još poželjnije u rasponu od oko 30 °C. do oko 40 °C, a najpoželjnije u rasponu od oko 32 do oko 37 °C.
[0127] Poželjno je da se postupak izvodi na pH u rasponu od oko 5 do oko 9, poželjno u rasponu od oko 5,5 do oko 8,5, poželjnije u rasponu od oko 6 do oko 8. Najpoželjnije je da se postupak izvodi pri pH u rasponu od oko 7 do oko 8.
[0128] Postupak se poželjno izvodi u vodi. Poželjnije, pomenuta voda je prečišćena voda, još poželjnije ultračista voda ili voda tipa I kako je definisano prema ISO 3696. Pogodna voda je na primer milliQ<®>voda. Pomenuta voda je poželjno puferisana, na primer fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom ili tris. Pogodni puferi poznati su stručnjaku u oblasti. U
2
poželjnom primeru izvođenja, postupak se izvodi u milliQ vodi koja je puferisana fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom ili tris.
[0129] U poželjnom primeru izvođenja pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (11):
pri čemu:
L je linker;
D je molekul od interesa;
r je 1 - 20;
R<1>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO2, -CN, -S(O)2R<5>, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe opciono supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti povezana zajedno da formiraju fuzionisani cikloalkil ili fuzionisani (hetero)aren supstituent, i gde se R<5>nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa; X je C(R<1>)2, O, S ili NR<2>, gde je R<2>R<1>ili L(D)r, i gde su L, D i r kako je definisano gore; q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q 0 onda je X N-L(D)r; i
a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8.
[0130] U drugom poželjnom primeru izvođenja pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (11b):
pri čemu:
L je linker;
D je molekul od interesa;
r je 1 - 20;
R<1>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO2, -CN, -S(O)2R<5>, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7-C24(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe opciono supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti povezana da formiraju fuzionisani cikloalkil ili fuzionisani (hetero)aren supstituent, i gde je R<5>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa; X je C(R<1>)2, O, S ili NR<2>, gde je R<2>R<1>ili L(D)r, i gde su L, D i r kako je gore definisano; q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q 0 onda je X N-L(D)r;
a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8;
a’ je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8; i
a a’ < 10.
[0131] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, a a’ je 4, 5, 6 ili 7, poželjnije a a’ je 4, 5 ili 6 i najpoželjnije a a’ je 5.
[0132] U poželjnom primeru izvođenja, ako je q 1 onda je X C(R<1>)2, O, S ili NR<1>.
[0133] U drugom poželjnom primeru izvođenja, a je 5, tj. pomenuta (hetero)cikloalkinil grupa je poželjno (hetero)ciklooktin grupa. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, X je C(R<2>)2ili NR<2>. Kada je X C(R<2>)2poželjno je da je R<2>vodonik. Kada je X NR<2>, poželjno je da je R<2>L(D)r. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, r je 1 do 10, poželjnije, r je 1, 2, 3, 4, 5, 6 7 ili 8, poželjnije r je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, najpoželjnije r je 1, 2, 3 ili 4.
[0134] Supstituent L(D)rmože biti prisutan na C-atomu u navedenoj (hetero)cikloalkinil grupi, ili, u slučaju heterocikloalkinil grupe, na heteroatomu pomenute heterocikloalkinil grupe. Kada (hetero)cikloalkinil grupa sadrži supstituente, na pr. fuzionisani cikloalkil, supstituent L(D)rmože takođe biti prisutan na pomenutim supstituentima.
[0135] Postupci povezivanja linkera L sa (hetero)cikloalkinil grupom na jednom kraju i sa molekulom od interesa na drugom kraju, kako bi se dobio linkerski konjugat, zavise od tačne prirode linkera, (hetero)cikloalkinil grupe i molekula od interesa. Pogodni postupci poznati su u struci.
4
[0136] Poželjno, linkerski konjugat sadrži (hetero)ciklooktin grupu, poželjnije napregnutu (hetero)ciklooktin grupu. Pogodne (hetero)cikloalkinil komponente poznate su u struci. Na primer, DIFO, DIFO2 i DIFO 3 objavljeni su u US 2009/0068738. DIBO je objavljen u WO 2009/067663. DIBO može opciono biti sulfatisan (S-DIBO) kako je objavljeno u J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 5381. BARAC je objavljen u J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688 -3690 i US 2011/0207147.
[0137] Poželjni primeri linkerskih konjugata koji sadrže (hetero)ciklooktin grupu prikazani su u nastavku.
[0138] Druge ciklooktin komponente poznate u struci su DIBAC (poznat i kao ADIBO ili DBCO) i BCN. DIBAC je objavljen u Chem. Comun. 2010, 46, 97 - 99. BCN je objavljen u WO 2011/136645.
[0139] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (12), (13), (14), (15) ili (16). U drugom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti linkerski konjugat ima formulu (17):
pri čemu:
R<1>, L, D i r su kako je definisano gore;
Y je O, S ili NR<2>, gde je R<2>kako je definisano gore;
R<3>je nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa;
R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero) aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa, pri čemu su alkil grupe opciono prekinute jednim ili više heteroatoma odabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil( hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno opciono supstituisane; i
n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0140] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<1>je vodonik. U drugom poželjnom primeru izvođenja, R<3>je vodonik. U drugom poželjnom primeru izvođenja, n je 1 ili 2. U drugom poželjnom primeru izvođenja, R<4>je vodonik, Y-L(D)rili -(CH2)n-Y-L(D)r. U drugom primeru izvođenja, R<2>je vodonik ili L(D)r. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, linkerski konjugat ima Formulu 18:
gde su Y, L, D, n i r kako je definisano gore.
[0141] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (19):
gde su L, D i r kako je definisano gore.
[0142] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (15):
gde su L, D i r kako je definisano gore.
[0143] Cikloadiciona reakcija antitela modifikovanog azidom i linkerskog konjugata koji sadrži poželjan tip ciklooktin grupe BCN-L(D)r(17) prikazana je na Šemi 2.
pri čemu su R<1>, R<3>, R<4>, S, Q, Y, L, D, b, p, x, n kako je definisano gore, i y je 1 - 20.
[0144] Vrednost p i priroda Q zavise od azidom supstituisanog šećera ili šećernog derivata S(A)xkoji je prisutan u azidom modifikovanom antitelu koje je povezano sa linkerskim konjugatom. Ako je azid u S(A)xprisutan na poziciji C2, C3 ili C4 šećera ili derivata šećera (umesto OH grupe šećera), onda je p 0. Ako je S(A)xderivat azidoacetamido-šećera, S(A)xje na pr. GalNAz ili GlcNAz, onda je p 1 i Q je -N(H)C(O)CH2-. Ako je azid u S(A)xprisutan na C6 poziciji šećera ili derivata šećera, onda je p 1, a Q je -CH2-.
[0145] Linkeri (L), koji se označavaju i kao povezujuće jedinice, dobro su poznati u struci. U linkerskom konjugatu kako je opisano u ovom tekstu, L je vezan za molekul od interesa kao i za funkcionalnu grupu B, kao što je gore opisano.
[0146] Pogodni linkerski konjugat za pripremanje antitela modifikovanog azidom je linkerski konjugat koji sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i molekul od interesa. U struci su poznati brojni postupci za vezivanje pomenute (hetero)cikloalkinil grupe i pomenutog molekula od interesa za L. Kao što će biti jasno osobi obučenoj u struci, izbor pogodnog postupka za vezivanje (hetero)cikloalkinil grupe na jednom kraju linkera i molekula od interesa na drugom kraju, zavisi od tačne prirodi (hetero)cikloalkinil grupa, linkera i molekula od interesa.
[0147] Linker može imati opštu strukturu F<1>-L(F<2>)r, gde F<1>predstavlja funkcionalnu grupu koja može reagovati sa funkcionalnom grupom F na funkcionalnoj grupi B kao što je gore opisano, a koja je (hetero)cikloalkinil grupa. F<2>predstavlja funkcionalnu grupu koja može reagovati sa funkcionalnom grupom F na molekulu od interesa.
[0148] S obzirom na to da za linker može biti vezano više od jednog molekula od interesa, više od jedne funkcionalne grupe F<2>može biti prisutno na L. Kao što je gore opisano, r je 1 do 20, poželjno 1 do 10, poželjnije 1 do 8, još poželjnije 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, još poželjnije 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije, r je 1 ili 2.
[0149] L se na primer može odabrati iz grupe koja se sastoji od linearnih ili granatih C1-C200alkilen grupa, C2-C200alkenilen grupa, C2-C200alkinilen grupa, C3-C200cikloalkilen grupa, C5-C200cikloalkenilen grupa, C8-C200cikloalkinilen grupa, C7-C200alkilarilen grupa, C7-C200arilalkilen grupa, C8-C200arilalkenilen grupa, C9-C200arilalkinilen grupa. Opciono, alkilen grupe, alkenilen grupe, alkinilen grupe, cikloalkilen grupe, cikloalkenilen grupe, cikloalkinilen grupe, alkilarilen grupe, arilalkilen grupe, arilalkenilen grupe i arilalkinilen grupe mogu biti supstituisane i, opciono, pomenute grupe mogu biti prekinute jednim ili više heteroatoma, poželjno 1 do 100 heteroatoma, pri čemu se pomenuti heteroatomi poželjno biraju iz grupe koju čine O, S i NR<5>, gde je R<5>nezavisno odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa. Najpoželjnije, heteroatom je O.
[0150] F, F<1>i F<2>mogu se, na primer, nezavisno odabrati iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, R<5>, C4- C10(hetero)cikloalkin grupa, -CH=C(R<5>)2, -C≡CR<5>, -[C(R<5>)2C(R<5>)2O]q-R<5>, gde je q u rasponu od 1 do 200, -CN, -N3, NCX, -XCN, -XR<5>, -N(R<5>)2,<+>N(R<5>)3, -C(X)N(R<5>)2, -C(R<5>)2XR<5>, -C(X)R<5>, -C(X)XR<5>, -S(O)R<5>, -S(O)2R<5>, -S(O)OR<5>, -S(O)2OR<5>, -S(O)N(R<5>)2, -S(O)2N (R<5>)2, -OS(O)R<5>, -OS(O)2R<5>, -OS(O)OR<5>, -OS(O)2OR<5>, -P(O)(R<5>)(OR<5>), -P(O)(OR<5>)2, -OP(O)(OR<5>)2, -Si(R<5>)3, -XC(X)R<5>, -XC(X)XR<5>, -XC(X)N(R<5>)2, -N(R<5>)C(X)R<5>, -N(R<5>)C(X)XR<5>i -N( R<5>)C(X)N(R<5>)2, gde je X kiseonik ili sumpor i gde je R<5>kako je definisano gore.
[0151] Primeri pogodnih linkerskih jedinica uključuju (poli)etilen glikol diamine (npr. 1,8-diamino-3,6-dioksaoktan ili ekvivalente koji sadrže duže etilen-glikol lance), polietilen glikol ili polietilenoksid lance, polipropilenglikol ili polipropilenoksid lance i 1,x-diaminoalkane gde je x broj ugljenikovih atoma u alkanu.
[0152] Druga klasa pogodnih linkera uključuje isecajuće linkere. Isecajući linkeri dobro su poznati u struci. Na primer, Shabat et al., Soft Matter 2012, 6, 1073, objavljuju isecajuće linkere koji sadrže samorazgrađujuće komponente koje se oslobađaju posle biološkog okidača, npr. enzimskog isecanja ili oksidacionog događaja. Neki primeri pogodnih linkera koji se mogu isecati su peptidni linkeri koji se isecaju posle specifičnog prepoznavanja proteazom, npr. katepsinom, plazminom ili metaloproteazama, ili linkeri na bazi glikozida koji se isecaju posle specifičnog prepoznavanja glikozidazom, npr. glukoronidazom ili nitroaromatici koji se redukuju u kiseonikom siromašnim, hipoksičnim područjima.
Konjugat antitela
[0153] Konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku može se dobiti postupkom za pripremanje konjugata antitela. Pomenuti postupak za pripremanje konjugata antitela i poželjni primeri izvođenja pomenutog postupka detaljno su opisani ranije u ovom tekstu.
[0154] Konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku može se dobiti postupkom koji uključuje korake:
(i) dovođenje u kontakt antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozamin (GlcNAc) supstituent sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa, a x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je P odabrano iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), kako bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo u skladu sa Formulom (4):
pri čemu:
S(A)xi x su kako je definisano gore; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
(ii) reakciju pomenutog modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo, a pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa;
gde je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L), i gde su D i L kako je definisano gore.
[0155] Konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku može biti u skladu sa Formulom (20):
pri čemu je AB antitelo, S je šećer ili derivat šećera, GlcNAc je N-acetilglukozamin, gde je y 1-20, i gde su L, D, X, R<1>, Q, a, b, p, r, x, y i q kako je definisano gore, kao i poželjni primeri izvođenja istog.
[0156] Konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku može biti u skladu sa Formulom (20b):
4
pri čemu je AB antitelo, S je šećer ili derivat šećera, GlcNAc je N-acetilglukozamin, gde je y 1-20, i gde su L, D, X, R1, Q, a, a', b, p, r , x, y i q kako je definisano gore, kao i poželjni primeri izvođenja istog.
[0157] U konjugovanom antitelu Formule (20) i (20b), GlcNAc je opciono fukozilovan (b je 0 ili 1). Antitelo može sadržati do 20 konjugovanih supstituenata (y je 1-20). Poželjno je da y bude 1-10, poželjnije je da je y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, još poželjnije je da je y 1, 2, 3 ili 4, a najpoželjnije je da je y 1 ili 2.
[0158] Poželjne strukture šećernog derivata (S), linkera (L), supstituenta R<1>i poželjne vrednosti r i a opisane su detaljno ranije u ovom tekstu.
[0159] Kao što je gore opisano, vrednost p i priroda Q zavise od azidom supstituisanog šećera ili šećernog derivata S(A)xkoji je prisutan u azidom modifikovanom antitelu povezanom sa linkerskim konjugatom. Ako je azid u S(A)xprisutan na C2, C3 ili C4 poziciji šećernog derivata, onda je p 0. Ako je S(A) azidoacetamido-šećerni derivat, S(A)xje npr. GalNAz ili GlcNAz, onda je p 1 i Q je -N(H)C(O)CH2-. Ako je azid u S(A)xprisutan na C6 poziciji šećera ili derivata šećera, tada je p 1, a Q je -CH2-.
[0160] Molekuli od interesa (D) takođe su detaljnije opisani ranije u ovom tekstu. Konjugat antitela može sadržati više od jednog molekula od interesa. Konjugat antitela sadrži više od jednog molekula od interesa, na primer kada je vezan za više od jednog linkerskog konjugata, kada jedan linkerski konjugat sadrži više od jednog molekula od interesa, ili oba.
[0161] Molekul od interesa je aktivna supstanca, a konjugat antitela može se označiti i kao konjugat antitela i leka (ADC).
[0162] U poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela ima Formulu (21):
pri čemu su AB, L, D, Y, S, Q, x, y, b, p, R<2>, GlcNAc, R<1>, R<3>, R<4>, n i r kako je gore definisano i pri čemu je navedeni N-acetilglukozamin opciono fukozilovan (b je 0 ili 1 ).
[0163] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<1>, R<3>i R<4>su vodonik i n je 1 ili 2, i u još poželjnijem primeru izvođenja x je 1.
[0164] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela ima Formulu (22):
pri čemu su AB, L, D, X, S, b, p, x, y, Q i GlcNAc kako je definisano gore, i pri čemu je pomenuti N-acetilglukozamin opciono fukozilovan (b je 0 ili 1).
[0165] Konjugat antitela 22 je primer jedinjenja koje može postojati u nekoliko regioizomera. Drugi regioizomer prikazan je dole.
pri čemu su AB, L, D, X, S, b, p, x, y, Q i GlcNAc kako je definisano gore, i pri čemu je pomenuti N-acetilglukozamin opciono fukozilovan.
[0166] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela ima Formulu (15b):
pri čemu su AB, L, D, X, S, b, p, x, y, Q i GlcNAc kako je definisano gore, i pri čemu je pomenuti N-acetilglukozamin opciono fukozilovan.
[0167] Na Slici 6 prikazan je drugi poželjan primer izvođenja konjugata antitela za upotrebu prema pronalasku. Antitelo koje se sastoji od dva teška lanca i dva laka lanca sadrži opciono fukozilovani sržni GlcNAc na svakom teškom lancu. Linkerski konjugat prema Formuli (17) povezan je sa antitelom cikloadicionom reakcijom ciklooktinil grupe pomenutog linkerskog konjugata sa azidom na antitelu modifikovanom azidom, koje ima -GlcNAc-GalNAz supstituent.
4
[0168] Pronalazak se odnosi na konjugat antitela za upotrebu u vidu leka. Poželjni primeri izvođenja pomenutog konjugata antitela su detaljnije opisana gore.
Konjugat antitela i leka
[0169] Kada je molekul od interesa u konjugatu antitela aktivna supstanca, konjugat antitela može se označiti i kao konjugat antitela i leka (ADC). Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na konjugat antitelo-lek za upotrebu u vidu leka, pri čemu je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L); pri čemu je pomenuti molekul od interesa (D) aktivna supstanca; i pti čemu je aktivna supstanca citotoksin.
[0170] Pronalazak se odnosi i na konjugat antitela za upotrebu u vidu leka, koji se može dobiti postupkom za pripremanje konjugata antitela, pri čemu je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L); pri čemu je pomenuti molekul od interesa (D) aktivna supstanca; i pri čemu je aktivna supstanca citotoksin. Pomenuti postupak za pripremu konjugata antitela i poželjni primeri izvođenja pomenutog postupka detaljno su opisani gore.
[0171] U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela za upotrebu u vidu leka, koji se može dobiti postupkom koji uključuje korake:
(i) dovođenje u kontakt antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozamin (GlcNAc) supstituent sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa, a x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), kako bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo u skladu sa Formulom (4):
pri čemu:
S(A)xi x su kako je definisano gore; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
(ii) reakciju pomenutog modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa; ili gde je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L);
pri čemu je pomenuti molekul od interesa (D) aktivna supstanca; i pri čemu je aktivna supstanca citotoksin.
[0172] Molekuli od interesa (D) i linkeri (L) opisani su detaljnije ranije u ovom tekstu i u nastavku.
[0173] Korak (i) i korak (ii) postupka kojima se može dobiti konjugat antitelo-lek, kao i njihovi poželjni primeri izvođenja, opisani su detaljno ranije u ovom tekstu.
[0174] Konjugat antitelo-lek poželjno se dobija postupkom, gde je x 1 ili 2, i poželjnije, x je 1. Kao posledica toga, u modifikovanom antitelu prema Formuli (4), kao i u konjugatu antitelo-lek svaka šećerna komponenta S je poželjno vezana za 1 ili 2, poželjnije 1, linkerski konjugat L(D)r.
[0175] Konjugat antitelo-lek poželjno se dobija postupkom, gde je y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4, a još poželjnije y je 1 ili 2. Poželjno je i da r bude 1, 2, 3 ili 4, poželjnije je da r bude 1 ili 2, a najpoželjnije je da bude 1.
[0176] Poželjno je i to da u konjugatu antitelo-lek, antitelo bude celo antitelo, pri čemu je y 2. U ovom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek može, prema tome, biti vezan sa 2, 4 ili 8 molekula od interesa, poželjnije za antitelo su vezana 2 ili 4 molekula od interesa, a najpoželjnije za antitelo su vezana 2 molekula od interesa.
[0177] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, antitelo se bira iz grupe koja se sastoji od IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitela, poželjnije antitelo je IgG antitelo, poželjno IgG1 antitelo.
[0178] U drugom primeru izvođenja konjugata antitelo-lek, antitelo je fragment antitela. U ovom primeru izvođenja, poželjno je da y bude 1.
[0179] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, x je 1, i y je 1. U još jednom poželjnom primeru izvođenja x je 2, i y je 2. Poželjno je i to da je r 1. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, x je 1, y je 1 i r je 1. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, x je 1, y je 2 i r je 1. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, x je 2, y je 2 i r je 1.
4
[0180] U poželjnom primeru izvođenja konjugat antitelo-lek može se dobiti postupkom, pri čemu je u koraku (ii) pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo, i pri čemu pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (11) ili (11b) :
pri čemu:
D i L su kako je gore definisano;
r je 1-20;
R<1>se nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO2, -CN, -S(O)2R<5>, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7-C24(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe opciono supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti povezana da formiraju fuzionisani cikloalkil ili fuzionisani (hetero)aren supstituent, i gde se R<5>nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa;
X je C(R<1>)2, O, S ili NR<2>, gde je R<2>R<1>ili L(D)r, gde su L, D i r kako je definisano gore;
q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q 0 onda je X N-L(D)r;
a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8;
a’ je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8; i
a+a’ < 10.
[0181] Poželjno, a a’ je 4, 5, 6 ili 7, poželjnije a a’ je 4, 5 ili 6 i najpoželjnije a a’ je 5.
[0182] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek za upotrebu prema pronalasku može se dobiti postupkom, pri čemu je u koraku (ii) pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo i pri čemu pomenuti linkerski konjugat ima formulu (12), (13), (14), (15) ili (16).
4
[0183] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitelo-lek za upotrebu prema pronalasku može se dobiti postupkom, pri čemu je u koraku (ii) pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo i pri čemu pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (17):
pri čemu:
R1, L, D i r su kako je definisano gore;
Y je O, S ili NR<2>, gde je R<2>kako je definisano gore;
R<3>se nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa;
R<4>se bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa, pri čemu su alkil grupe opciono prekinute jednim ili više heteroatoma odabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno opciono supstituisane; i
n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0184] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<1>je vodonik. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<3>je vodonik. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, n je 1 ili 2. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<4>je vodonik, Y-L(D)rili -(CH2)n-YL(D)r. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<2>je vodonik ili L(D)r. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, linkerski konjugat ima Formulu 18:
4
pri čemu su Y, L, D, n i r kako je definisano gore.
[0185] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitielo-lek za upotrebu u skladu sa pronalaskom dobija se postupkom, pri čemu je u koraku (ii) pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo i pri čemu pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (19):
gde su L, D i r kako je definisano gore.
[0186] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitielo-lek za upotrebu u skladu sa pronalaskom dobija se postupkom, pri čemu je u koraku (ii) pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo i pti črmu pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (15):
gde su L, D i r kako je definisano gore.
[0187] Eksperimenti efikasnosti in vivo pokazuju da konjugat antitelo-lek za upotrebu u skladu sa pronalaskom ima efekat na zapreminu tumora.
4
[0188] Pronalazak se odnosi i na konjugat antitelo-lek, gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u vidu leka.
[0189] Pronalazak se odnosi i na upotrebu konjugata antitelo-lek, gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera.
[0190] Pronalazak se odnosi i na konjugat antitelo-lek, gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2-pozitivnog kancera dojke.
[0191] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo u pomenutom konjugatu antitelo-lek je trastuzumab. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, citotoksin je majtanzinoid, auristatin E, auristatin F, duokarmicin ili pirolobenzodiazepin.
[0192] U konjugatu antitelo-lek za upotrebu prema pronalasku, molekul od interesa je aktivna supstanca. Kao što je gore opisano, aktivna supstanca je farmakološka supstanca, tj. supstanca koja je farmaceutski aktivna. Efikasna supstanca je citotoksin. Primeri citotoksina uključuju kamptotecine, staurosporin, doksorubicin, daunorubicin, kolhicin, metotreksat, taksane, kaliheamicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivate majtanzina), auristatine, tubulizin M, kriptoficin ili pirolobenzodiazepine (PBD). Primeri auristatina uključuju dolastatin 10, auristatin F, monometil auristatin F (MMAF), auristatin E, monometil auristatin E (MMAE), auristatin PE, auristatin TP i auristatin AQ. Primeri majtanzina i majtanzinoida uključuju mertanzin i ansamitocin. Antitelo u pomenutom konjugatu antitela je antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen. Primeri antitela koja se specifično vezuju za kancerski antigen uključuju trastuzumab, pertuzumab, cetuksimab, rituksimab, bevacizumab, girentuksimab, gemtuzumab, inotuzumab, alemtuzumab, tozitumumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, elotuzumab, zanolimumab, obinutuzumab, necitumumab, farletuzumab, vedolizumab, tabalumab, itolizumab , okrelizumab, epratuzumab, mepolizumab, reslizumab, sarilumab i ramikurumab.
[0193] Prema tome, pronalazak se odnosi na konjugat antitelo-lek, pri čemu je antitelo ono antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen i pri čemu je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u vidu leka. Pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitelo-lek, pri čemu je antitelo ono antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen i pri čemu je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera. Pronalazak se odnosi i na konjugat antitela, gde je antitelo ono antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen i gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera dojke, i poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
4
[0194] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, pri čemu je konjugat antitela trastuzumab-(MMAF)2, trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2, trastuzumab(majtanzinoid)2ili trastuzumab-(vc- PABA-majtanzinoid)2, za upotrebu u lečenju kancera. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, pri čemu je konjugat antitela trastuzumab-(MMAF)2, trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2, trastuzumab(majtanzinoid)2ili trastuzumab-(vc- PABA-majtanzinoid)2, za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
Postupak za pripremanje konjugata antitelo-lek
[0195] Konjugat antitelo-lek prema pronalasku može se pripremiti prema postupku koji uključuje sledeće korake:
(i) dovođenje u kontakt antitela koje sadrži sržni N-acetilglukozamin (GlcNAc) supstituent sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, pri čemu pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xderivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa, i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), kako bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i gde je pomenuto modifikovano antitelo u skladu sa Formulom (4):
pri čemu:
S(A)xi x su kako je definisano gore; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
(ii) reakciju pomenutog modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa;
pri čemu je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L); pri čemu je pomenuti molekul od interesa aktivna supstanca; i pri čemu je aktivna supstanca citotoksin.
[0196] U poželjnom primeru izvođenja, pomenuti katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno odabran iz grupe koju čine GalT Y289L, GalT Y289N i GalT Y289I. U drugom poželjnom primeru izvođenja, pomenuti katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, odabran iz grupe koju čine GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A, poželjno odabran iz grupe koju čine GalT Y289F i GalT Y289M.
[0197] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, x je 1, 2, 3 ili 4, poželjno x je 1 ili 2, poželjnije x je 1. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, poželjno y je 1, 2, 3 ili 4, a poželjnije y je 1 ili 2.
[0198] U specifičnom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je celo antitelo i y je 2, i u drugom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je fragment antitela i y je 1.
[0199] U poželjnom primeru izvođenja postupka za pripremanje konjugata antitela, pomenuto modifikovano antitelo je azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (11) ili (11b):
pri čemu:
D i L su kako je gore definisano;
r je 1-20;
R<1>se nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO2, -CN, -S(O)2R<5>, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7-C24(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe,
1
alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe opciono supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti povezana da formiraju fuzionisani cikloalkil ili fuzionisani (hetero)aren supstituent, i gde se R<5>nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa;
X je C(R<1>)2, O, S ili NR<2>, gde je R<2>R<1>ili L(D)r, gde su L, D i r kako je gore definisano;
q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q 0 onda je X N-L(D)r; i
a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8; i
a’ je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8; i
a+a’ < 10.
[0200] Poželjno, a a’ je 4, 5, 6 ili 7, poželjnije a a’ je 4, 5 ili 6 i najpoželjnije a a’ je 5.
[0201] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuto modifikovano antitelo je azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (12), (13), (14), (15) ili (16).
[0202] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuto modifikovano antitelo je azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (17):
pri čemu:
R<1>, L, D i r su kako je definisano gore;
Y je O, S ili NR<2>, gde je R<2>kako je definisano gore;
R<3>se nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa;
R<4>se bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero) aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa, pri čemu su alkil grupe opciono prekinute jednim ili više
2
heteroatoma odabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno opciono supstituisane; i
n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0203] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, R<1>je vodonik. U drugom poželjnom primeru izvođenja, R<3>je vodonik. U drugom poželjnom primeru izvođenja, n je 1 ili 2. U drugom poželjnom primeru izvođenja, R<4>je vodonik, Y-L(D)rili -(CH2)n-Y-L(D)r. U drugom poželjnom primeru izvođenja, R<2>je vodonik ili L(D)r. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, linkerski konjugat ima Formulu 18:
pri čemu su Y, L, D, n i r kako je gore definisano.
[0204] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuto modifikovano antitelo je azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (19):
pri čemu su L, D i r kako je definisano gore.
[0205] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pomenuto modifikovano antitelo je azidom modifikovano antitelo, i pomenuti linkerski konjugat ima Formulu (15):
pričemu su L, D i r kako je definisano gore.
Modifikovano antitelo, konjugat antitela i konjugat antitelo-lek
[0206] Modifikovano antitelo, konjugat antitela, konjugat antitelo-lek i postupci za njihovo pripremanje imaju nekoliko prednosti u odnosu na modifikovana antitela, konjugate antitela i postupke za njihovo pripremanje, koji su poznati u struci.
[0207] Kao što je gore opisano, potrebno je poboljšati poznate postupke za konjugaciju linker-toksina sa antitelima, ne samo u smislu kontrole specifičnosti mesta i stehiometrije, nego i u smislu efikasnosti postupaka konjugacije. Uprkos sposobnosti ADC da se usmere ka svojim ciljevima, procenjuje se da količina leka koja ulazi u tumorsku ćeliju iznosi obično <2% od primenjene doze. Ovaj problem je pojačan nepredvidljivim rezultatima konjugacije ADC poznatih u struci. Važno je izbeći nedovoljno konjugovana antitela koja snižavaju snagu, kao i visoko konjugovane vrste koje mogu imati izrazito skraćeni poluživot u cirkulaciji, oslabljeno vezivanje za ciljni protein i povećanu toksičnost.
[0208] Za konjugate antitelo-lek, mera opterećivanja antitela molekulom od interesa (npr. lekovi, aktivne supstance) je takozvani odnos leka prema antitelu (DAR), koji govori o prosečnom broju molekula aktivne supstance po antitelu, izračunatom na osnovu statističke distribucije. Teorijska maksimalna vrednost DAR za određeni tip ADC jednaka je broju ukotvljujućih mesta. Kao što je gore opisano, postupci za pripremanje ADC poznati u struci obično rezultuju proizvodom koji sadrži mešavinu konjugata antitela sa različitim brojem molekula od interesa prisutnih u svakom konjugatu antitela, i DAR koji ima visoku standardnu devijaciju.
[0209] Jedna od prednosti pronalaska je da su ova antitela i konjugati antitela homogeni, kako u specifičnosti mesta tako i u stehiometriji. Pronalazak se prema tome odnosi i na konjugat antitelo-lek za upotrebu, pri čemu je konjugat antitelo-lek homogen. Pored toga, poželjno je da konjugat antitelo-lek bude homogen u specifičnosti mesta i stehiometriji. Poželjno je i to
4
da se dobije konjugat antitelo-lek sa odnosom leka prema antitelu (DAR) blizu teorijske vrednosti i sa niskom standardnom devijacijom.
[0210] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovano antitelo i konjugat antitela su homogeni, i u specifičnosti mesta i u stehiometriji. Ovde se antitelo ili antitelo-konjugat smatra homogenim kada se konjugacija vrši samo na unapred određenom mestu i sa unapred određenim odnosom lek-antitelo. Konjugat antitela je heterogen kada se konjugacija antitela odvija na različitim mestima u antitelu, što dovodi do mešavine proizvoda sa nepredvidljivim odnosom lek-antitelo. U ovom drugom slučaju, odnos lek-antitelo biće prosek cele grupe konjugata antitelo-lek.
[0211] U drugom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku ima DAR koji je u okviru 10% od teorijske vrijednosti.
[0212] Pomenuta modifikovana antitela i konjugati antitela dobijaju se sa DAR veoma blizu teorijske vrednosti i sa vrlo niskom standardnom devijacijom. To takođe znači da konjugati antitela za upotrebu prema pronalasku rezultuju konzistentnijim proizvodom za pretklinička testiranja.
[0213] Još jedna prednost pronalaska uključuje smanjenje proizvodnog otpada kojim se povećavaju troškovi kompanija.
[0214] Pored toga, postupak za pripremanje modifikovanog antitela i za pripremanje konjugovanog antitela odvija se veoma efikasno. Kinetika reakcija je vrlo povoljna, što rezultira gotovo potpunom konverzijom u relativno kratkom vremenskom razdoblju, posebno u poređenju sa postupcima poznatim u struci, i bez ili gotovo bez nastanka ikakvih sporednih proizvoda.
[0215] Pored toga, kada se antitelo modifikovano azidom veže za linkerski konjugat koji sadrži alkinil grupu putem reakcije cikloadicije, nastali triazoli nisu podložni hidrolizi ili drugim putevima razgradnje.
[0216] Dodatne prednosti su prema tome stabilnost konjugata antitela za upotrebu prema pronalasku, kao i jednostavan i opšte primenljiv postupak za uvođenje azido grupe u antitelo.
[0217] Kao što je gore opisano, konjugati antitela za upotrebu prema pronalasku imaju nekoliko prednosti u odnosu na konjugate antitela koji su poznati u stanju tehnike. Jedna od prednosti modifikovanih antitela, konjugata antitela i postupaka za njihovo pripremanje je da su ta antitela i konjugati antitela homogeni, kako u specifičnosti mesta tako i u stehiometriji.
[0218] Modifikovana antitela i konjugati antitela za upotrebu prema pronalasku dobijaju se sa DAR koji je vrlo blizu teorijskoj vrednosti i sa vrlo niskom standardnom devijacijom. To takođe znači da konjugati antitela za upotrebu prema pronalasku rezultuju konzistentnijim proizvodom za pretklinička testiranja.
[0219] Svojstva konjugata antitela za upotrebu prema pronalasku modulisana su dizajnom, ekspresijom i preradom u konjugate antitelo-lek monoklonskih antitela sa različitim profilima glikozilacije. Svojstva koja se mogu modulisati su npr. antitumorsko dejstvo, maksimalna podnošljiva doza, farmakokinetika kao što je klirens iz plazme, terapijski indeks, kako u smislu efikasnosti tako i toksičnosti, atenuisanje leka, stabilnost prikačinjanja leka i oslobađanja leka pošto stigne do cilja. Tačnije, postoji korelacija između mesta leka i in vivo efikasnosti ADC.
[0220] In vivo i in vitro eksperimenti pokazuju da konjugat antitela za upotrebu prema pronalasku ima citotoksični efekat na ćelije koje eksprimiraju HER2. In vitro eksperimenti pokazuju da su konjugati antitelo-lek za upotrebu prema pronalasku sposobni da selektivno ubiju ćelijsku liniju koja eksprimira HER2 u odnosu na HER2-negativnu ćelijsku liniju, kao što je sumirano na slikama 24 - 26. In vivo eksperiment pokazuje da jedna doza nekoliko konjugata antitela za upotrebu prema pronalasku može eliminisati tumor koji eksprimira HER2 u mišjem ksenograftskom modelu, kao što postaje jasno na Slikama 29 i 30. Pored toga, pokazano je da konjugati antitela za upotrebu prema pronalasku imaju identičan farmakokinetički profil kao nativno antitelo trastuzumab, kao što je sumirano na Slici 27.
[0221] Pronalazak se stoga odnosi na konjugat antitela za upotrebu u vidu leka. Pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela za upotrebu u lečenju kancera. Pronalazak se odnosi još i na konjugat antitela za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2-pozitivnog kancera dojke.
[0222] Molekul od interesa u pomenutom konjugatu antitela je citotoksin. Primeri citotoksina uključuju kamptotecine, staurosporin, doksorubicin, daunorubicin, kolhicin, metotreksat, taksane, kaliheamicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivate majtanzina), auristatine, tubulizin M, kriptoficin ili pirolobenzodiazepine (PBD). Primeri auristatina uključuju dolastatin 10, auristatin F, monometil auristatin F (MMAF), auristatin E, monometil auristatin E (MMAE), auristatin PE, auristatin TP i auristatin AQ. Primeri majtanzina i majtanzinoida uključuju mertanzin i ansamitocin.
[0223] Antitelo u pomenutom konjugatu antitela je antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen. Primeri antitela koja se specifično vezuju za kancerski antigen uključuju trastuzumab, pertuzumab, cetuksimab, rituksimab, bevacizumab, girentuksimab, gemtuzumab, inotuzumab, alemtuzumab, tositumumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, elotuzumab, zanolimumab, obinutuzumab, necitumumab, farletuzumab, vedolizumab, tabalumab, itolizumab, okrelizumab, epratuzumab, mepolizumab, reslizumab, sarilumab i ramikurumab.
[0224] Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, gde je antitelo ono antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen i gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u vidu leka. U drugom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, gde je antitelo ono antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen i gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera. U drugom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, gde je antitelo ono antitelo koje se specifično vezuje za kancerski antigen i gde je molekul od interesa citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera dojke, i poželjnije za upotrebu u lečenje HER2 pozitivnog kancera dojke.
[0225] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, pri čemu je konjugat antitela trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2ili trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)2, za upotrebu u lečenju kancera. U još jednom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela, pri čemu je konjugat antitela trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2ili trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)2, za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
Primeri
Sinteza
Primeri 1 - 4: Sinteza BCN-doksorubicina 28a i 28b
[0226] Šema reakcije sinteze linkerskog konjugata BCN-doksorubicina 28a počevši od BCN-OSu 23, kako je izvedeno u Primerima 1 - 4, prikazana je na Slici 7.
Primer 1. Sinteza BCN-amina 24
[0227] U rastvor 2,2’-(etilendioksi)bis(etilamina) (11.78 mL, 80.5 mmol) u DCM (200 mL) dodaje se BCNOSu 23 (7.82 g, 26.8 mmol) u DCM (100 mL) u kapima tokom 3 h. Posle završetka dodavanja, smeša se meša 10 min posle čega sledi ispiranje zasićenim vodenim rastvorom NH4Cl (3 × 200 mL). Organski sloj se suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje u vakuumu. Fleš hromatografija na koloni (DCM:MeOH 99:1-93:7 1% Et3N) daje proizvod 24 (5.95 g, 54.7 mmol, 68%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.38 (s, 1H), 4.13 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.59 (s, 4H), 3.56-3.50 (m, 4H), 3.35 (q, J = 5.1 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.32 (br s, 2H), 2.27-2.15 (m, 6H), 1.62-1.42 (m, 2H), 1.33 (qn, J = 8.7 Hz, 1H), 0.97-0.85 (m, 2H).<13>C-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 156.4, 98.3, 68.7 (2C), 62.2, 45.5, 40.3, 40.2, 28.6, 20.9, 19.6, 17.3. HRMS (ESI+) izračunato za C17H28N2NaO4(M+Na<+>) 347.1947, nađeno 347.1952.
Primer 2. Sinteza BCN-biotina 25
[0228] U rastvor BCN derivata 24 (0.80 g, 2.47 mmol) u DCM (25 mL) dodaju se biotin-OSu (0.93 g, 2.71 mmol) i Et3N (0.86 mL, 6.16 mmol). Reakciona smeša se meša 5 h i zatim se doda zasićeni vodeni rastvor NaHCO3(20 mL). Organski sloj se ispere zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3(2 × 20 mL), suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija na koloni (DCM:MeOH 99:1-92:8) daje BCN biotin 25 (1.14 g, 2.1 mmol, 84%).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.57 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 5.37 (s, 1H), 4.52-4.48 (m, 1H), 4.33-4.30 (m,1H), 4.16 (d, J = 8 Hz, 2H), 3.62 (s, 4H), 3.57 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.45 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 3.40-3.36 (m, 2H), 3.17-3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 8, 4.8 Hz, 1H), 2.72 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.33-2.18 (m, 8H), 1.88 (br s, 1H), 1.80-1.57 (m, 6H), 1.49-1.33 (m, 3H), 0.95 (t, J = 9.6 Hz, 2H).<13>C-NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 172.9, 163.6, 156.4, 98.3, 69.6, 61.3, 59.7, 55.2, 40.3, 40.0, 38.7, 35.5, 28.6, 27.8, 27.6, 25.1, 21.0, 19.7, 17.3. HRMS (ESI+) izračunato za C27H43N4O6S (M+H<+>) 551.2903, nađeno 551.2911.
Primer 3. Sinteza aktiviranog estra 26
[0229] BCN-amin 24 (3.6 g, 11.1 mmol) rastvori se u DCM (150 mL) i dodaju se glutarni anhidrid (1.39 g, 12.2 mmol) i Et3N (4.61 mL, 33.3 mmol). Reakciona smeša se meša 2 h posle čega sledi dodavanje DSC (4.3 g, 16.7 mmol). Posle 2 h reakcija se prekida pomoću H2O (100 mL) i organski sloj se ispere vodom (2 × 150 mL), suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje u vakuumu. Fleš hromatografija na koloni (EtOAc:MeOH 99:1-94:6) daje aktivirani estar 26 (4.63 g, 8.6 mmol, 78%).
[0230]<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 4.14 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.59 (s, 4H), 3.57-3.52 (m, 4H), 3.44 (q, J = 5.1 Hz, 2H), 3.35 (q, J = 4.8 Hz, 2H). 2.83 (br s, 4H), 2.67 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.33-2.16 (m, 7H), 2.08 (qn, J = 6.9 Hz, 2H), 1.65-1.49 (m, 2H), 1.33 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 0.97-0.87 (m, 2H). LRMS (ESI+) izračunato za C26H37N3O9(M+H<+>) 536.26, nađeno 536.0.
Primer 4. Sinteza BCN-doksorubicin konjugata 28a
[0231] U rastvor aktiviranog estra 26 (5 mg, 0.0093 mmol) i doksorubicin‧HCl (27, 10 mg, 0.017 mmol) u DMF (0.5 mL) doda se Et3N (5 µL, 0.036 mmol) i smeša se meša preko noći.
Rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod se prečisti fleš hromatografijom na koloni (DCM:MeOH 99:1-80:20) da se dobije BCN-doksorubicin 28a (6 mg, 0.0062 mmol, 66%). LRMS (ESI+) izračunato za C49H61N3O17(M+H<+>) 964.4, nađeno 963.9.
Primer 4-2. Sinteza BCN-doksorubicin konjugata 28b
[0232] U rastvor H2N-PEG8-COOH (822 mg, 1.86 mmol) u THF:H2O 1:1 (20 mL) dodaju se BCN-OSu (23) (651 mg, 2.23 mmol) i Et3N (774 µL, 5.59 mmol). Reakcija se meša na r.t. (room temperature, sobna temperatura) 1.5 h i acidifikuje na pH 1, što je praćeno ekstrakcijom sa EtOAc (3 × 35 mL). Kombinovani organski slojevi se suše preko Na2SO4, filtriraju i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod se zatim rastvori u sirovom DCM (20 mL) i zatim se dodaju DCC (461 mg, 2.23 mmol) i NHS (257 mg, 2.23 mmol). Posle mešanja na r.t. 1 h, reakcija se filtrira i filtrat koncentruje u vakuumu. Fleš hromatografija (MeCN, MeCN:H2O 30:1) daje BCNPEG8-COOSu.
[0233]<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 5.44 (br s, 1H), 4.14 )d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.68-3.63 (m, 30H), 3.56 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.34 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.36-2.14 (m, 6H). 1.72-1.49 (m, 2H), 1.36 (qn, J= 8.7 Hz, 1H), 1.02-0.88 (m, 2H). LRMS (ESI+) izračunato za C34H54N2O14(M+Na<+>) 737.35, nađeno 737.3.
[0234] U rastvor doksorubicin‧HCl (27, 500 mg, 0.862 mmol) u anhidrovanom DMF (10 mL) dodaju se trietilamin (361 µL, 262 mg, 2.59 mmol) i rastvor BCN-PEG8-COOSu (678 mg, 0.948 mmol) u DMF (10 mL). Dobijena smeša se meša 22 h i koncentruje sa 3 g silikagela. Posle prečišćavanja hromatografijom na koloni, dobija se proizvod u vidu crvenog amorfnog materijala (757 mg, 0.66 mmol, 77%).
[0235] LRMS (HPLC, ESI-) izračunato za C57H77N2O22(M-H<+>) 1141.5, nađeno 1142.2.
Primer 5. Sinteza DIBAC-biotina 30 (šematski prikazana na Slici 8)
[0236] U rastvor amina 29, komercijalno nabavljenog kod ClickChemistryTools (50 mg, 0.18 mmol) u DMF (2 mL) dodaju se biotin-OSu (62 mg, 0.18 mmol) i Et3N (50 µL, 0.36 mmol). Reakciona smeša se meša 3 h, posle čega sledi koncentrovanje pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija na koloni (DCM:MeOH 99:1-90:10) daje DIBAC-biotin 30 (44 mg, 0.09 mmol, 49%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 7.66-7.62 (m, 1H), 7.40-7.24 (m, 7H), 6.67-6.60 (m, 1H), 6.53-6.49 (m, 1H), 5.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.13 (dd, J = 2.9, 14.0 Hz, 1H), 4.47-4.43 (m, 1H), 4.29-4.28 (m, 1H), 3.68 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 3.34-3.30 (m, 1H), 3.17-3.08 (m, 2H), 2.92-2.67 (m, 3H), 2.50-2.42 (m, 1H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.73-1.24 (m, 6H). LRMS (ESI+) izračunato za C28H30N4O3S (M+H<+>) 503.2, nađeno 503.1.
Primeri 6 - 9: Sinteza konjugata BCN-doksorubicin 35
[0237] Šema reakcije za sintezu BCN-doksorubicin konjugata 35 počevši od Fmoc-citrulina 31, kako je izvedeno u Primerima 7 - 10, prikazana je na Slici 9.
Primer 6. Sinteza citrulinskog derivata 32
[0238] Izobutilhloroformat (99 µL, 0.76 mmol) i N-metilmorfolin (83 µL, 0.76 mmol) dodaju se u rastvor Fmoc-citrulina 31 (300 mg, 0.76 mmol) u THF na -40 °C. Rastvor se meša 2 h posle čega sledi dodavanje p-aminobenzilalkohola (112 mg, 0,91 mmol) i N-metilmorfolina (100 µL, 0.91 mmol). Posle 1 h mešanja, rastvor se polako zagreva do rt i posle 2 h reakciona smeša se koncnetruje pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (DCM:MeOH 99:1-80:20) daje citrulinski derivat 32 (346 mg, 0.69 mmol, 90%). LRMS (ESI+) izračunato za C28H30N4O5(M+H<+>) 503.2, nađeno 503.1.
Primer 7. Sinteza dipeptida 33
[0239] Citrulinski derivat 32 (100 mg, 0.20 mmol) rastvori se u DMF (1.6 mL) i doda se piperidin (333 µL). Posle 2 h reakcija se koncentruje pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod se rastvori u DMF (2 mL). Dodaju se Alloc-Val-OSu (60 mg, 0.20 mmol) i Et3N (58 µL, 0.40 mmol), smeša se meša preko noći i zatim koncentruje u vakuumu. Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (DCM:MeOH 99:1-90:10) daje dipeptid 33 (65 mg, 0.14 mmol, 70%). LRMS (ESI+) izrač. za C22H33N5O6(M+H<+>) 464.2, nađeno 464.0.
Primer 8. Sinteza dipeptid-doksorubicina 34
[0240] U rastvor dipeptida 33 (40 mg, 0.086 mmol) u DMF (0.5 mL) dodaju se Et3N (36 µL, 0.26 mmol) i DSC (66 mg, 0.26 mmol). Reakciona smeša se meša preko noći posle čega sledi koncentrovanje pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (DCM:MeOH 99:1-90:10) daje proizvod (30 mg, 0.05 mmol, 58%) koji se odmah rastvori u DMF (0.5 mL). Dodaju se doksorubicin‧HCl 27 (29 mg, 0.05 mmol) i Et3N (20 µL, 0.15 mmol), Reakciona smeša se meša 2 h i zatim koncentruje pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (DCM:MeOH 99:1-80:20) daje dipeptiddoksorubicin 34 (34 mg, 0.033 mmol, 66%). LRMS (ESI+) izrač. za C50H60N6O18(M+H<+>) 1033.4, nađeno 1032.9.
Primer 9. Sinteza BCN-doksorubicin konjugata 35
[0241] Dipeptid-doksorubicin 34 (8 mg, 0.008 mmol) rastvori se u DMF (0.5 mL) i trifenilsilan (7 µL, 0.054 mmol) i Pd(PPh3)4(0.6 mg, 0.0005 mmol) se dodaju. Posle mešanja preko noći reakcija se koncentruje pod sniženim pritiskom i suspenduje u DCM (2 mL). Posle filtriranja dobija se sirovi proizvod u vidu crvene čvrste supstance koja se rastvori u DMF (0.5 mL). Dodaju se BCN derivat 26 (3 mg, 0.006 mmol) i Et3N (2 µL, 0.014 mmol) i reakcija se meša preko noći. Rastvarači se uklone pod sniženim pritiskom i prečišćavanje fleš hromatografijom na koloni (DCM:MeOH 99:1-60:40) daje BCN-doksorubicin konjugat 35 (3 mg, 0.002 mmol, 27%). LRMS (ESI+) izrač. za C68H88N8O22(M+H<+>) 1369.8, nađeno 1369.3.
Primer 9-2. Sinteza BCN-vc-PABA-MMAE (37a)
[0242] U rastvorVal-Cit-PAB-MMAE.TFA (8.0 mg, 6.5 µmol) i trietilamina (3.5 µL) u anhidrovanom DMF (1 mL) doda se BCN-PEG2-OSu (2.7 mg, 6.5 µmol) (36) kao rastvor u DMF (0.78 mL). Proizvod (6 mg, 4 µmol, 62%) se dobija posle prečišćavanja reverznofaznom HPLC (C18, gradijent H2O/MeCN). LRMS (ESI+) izrač. za C74H115N11NaO17(M+Na<+>) 1452.84, nađeno 1452.7.
Primer 9-3. Sinteza BCN-vc-PABA-MMAF (37b)
[0243] U rastvor Val-Cit-PAB-MMAF.TFA (17.9 mg, 14.3 µmol) u DMF (2 mL) doda se BCN-PEG2-OSu (17.9 mg, 14.3 pmol) (36) kao rastvor u DMF (0.78 mL) i trietilaminu (6.0 µL). Proizvod (7 mg, 5 µmol, 35%) se dobija posle prečišćavanja reverzno-faznom HPLC (C18, gradijent H2O/MeCN 1% AcOH). LRMS (HPLC, ESI+) izrač. za C74H114N11O18(M+H<+>) 1444.83, nađeno 1445.44.
Primer 9-4. Sinteza BCN-MMAF (38)
[0244] U rastvor Val-Cit-PABA-MMAF (7.6 mg, 0.0074 mmol) u DMF (0.2 mL) dodaju se BCN-OSu estar 26 (8 mg, 0.015 mmol) i Et3N (3 µL, 2.2 mg, 0.022 mmol). Posle reakcije preko noći, smeša se koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (MeOH/DCM 1/3) daje željeni proizvod (3.4 mg, 0.0022 mmol, 29%). LRMS (HPLC, ESI+) izrač. za C80H125N12O19(M+H<+>) 1557.92, nađeno 1558.16.
1
Primer 9-5. Sinteza BCN-vc-PABA-majtanzinoida (39)
[0245] U suspenziju Val-Cit-PABA-β-alaninoil-majtanzinoida (komercijalno nabavljen od Concortis) (27 mg, 0.022 mmol) u MeCN (2 mL) doda se trietilamin (9.2 µL, 6.7 mg, 0.066 mmol) i rastvor BCN-PEG2OSu karbonata (9.2 mg, 0.022 mmol) u MeCN (1 mL). Posle 23 h, smeša se sipa u smešu EtOAc (20 mL) i vode (20 mL). Posle razdvajanja, organska faza se suši (Na2SO4) i koncentruje. Posle prečišćavanja hromatografijom na koloni (EtOAc → MeOH/EtOAc 1/4) dobija se 22 mg (0.015 mmol, 70%) željenog proizvoda. LRMS (ESI+) izrač. za C70H97ClN10O20(M+H<+>) 1432.66, nađeno 1434.64.
Primer 9-6. Sinteza maleimid-vc-PABA-majtanzinoida (40) [uporedno]
[0246] U rastvor Val-Cit-PABA-β-alaninoil-majtanzinoida (13.9 mg, 0.011 mmol) (komercijalno nabavljen od Concortis, San Diego, USA) u anhidrovanom DMF (1 mL) dodaju se trietilamin (4.5 µL, 3.3 mg, 0.033 mmol) i N-sukcinimidil 6-maleimidokaproat (3.9 mg, 0.013 mmol). Posle mešanja u odgovarajućem trajanju, smeša se raspodeli između EtOAc (20 mL) i zasićenog vodenog rastvora NaHCO3(10 mL). Posle razdvajanja, vodeni sloj se ekstrahuje pomoću EtOAc (20 mL). Kombinovani organski slojevi se suše (Na2SO4) i koncentruju. Posle prečišćavanja reverzno-faznom HPLC (C18, gradijent H2O/MeCN), dobija se 10 mg (0.0077 mmol) željenog proizvoda. LRMS (HPLC, ESI+) izrač. za C64H88ClN10O18(M+H<+>) 1390.60, nađeno 1390.52.
[0247] Gornji Primeri 9-3 do 9-6 šematski su prikazani na Šemi 10a.
Primer 9-7. Sinteza DIBAC-vc-PABA-MMAF 41 (šematski prikazana na Šemi 11)
[0248] DIBAC-amin 29, komercijalnu nabavljen kod ClickChemistryTools (430 mg, 1.50 mmol) rastvori se u DCM (15 mL) i tretira anhidridom glutarne kiseline (213 mg, 1.87 mmol) i Et3N (647 µL, 4.67 mmol) na rt. Reakcija se meša 2 h, posle čega sledi dodavanje DSC (478 mg, 1.87 mmol). Posle još 2 h mešanja na rt, doda se DCM (30 mL) i reakcija se ispere pomoću H2O (3 × 20 mL). Organska faza se suši preko Na2SO4i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (0:100-2:98 EtOAc:MeOH) daje DIBACOSu estar (368 mg, 0.75 mmol, 48%).
[0249] Zatim, u rastvor DIBAC-OSu estra (1 mg, 0.003 mmol) u DMF (0.2 mL) dodaju se vc-PABA-MMAF (2 mg, 0.002 mmol) i trietilamin (1 µL, 0.007 mmol). Rastvor se meša preko noći posle čega sledi koncentrovanje. Prečišćavanje pomoću HPLC (reverzno-fazna,
2
MeCN:H2O 0.1% TFA) daje 41 (0.9 mg, 0.0006 mmol, 33%). LCMS analiza daje jedan pik sa masom 1510.40 (očekivano za C81H113N12O16= 1510.83).
Primeri 9-8 - 9-11. Opšti protokol za sintezu drugih doksorubicin-ciklooktina
[0250] U 0.1 M rastvor aktiviranog ciklooktina (1-2 ekv) u DCM/DMF (1:1) dodaju se doksorubicin‧HCl (27, 1 ekv) i trietilamin (1.5 ekv). Crveni rastvor se meša preko noći posle čega sledi koncentrovanje u vakuumu. Sirova smeša se prepakuje na silika-gelu uz korišćenje DMF kao rastvarača posle čega sledi hromatografija na koloni (DCM→DCM:MeOH 8:2) da se dobije željeni proizvod.
Primer 9-9. Sinteza doksorubicin-MFCO 42.
[0251] MFCO-OSu estar (komercijalno nabavljen kod Berry and Associates, Dexter, Michigan, USA) (3.4 mg, 0.009 mmol) reaguje sa doksorubicin‧HCl (27, 5 mg, 0.009 mmol) prema opštem postupku, da se dobije doksorubicin-MCFO 42 (5 mg, 0.006 mmol, 69%). LCMS analiza daje jedan pik sa masom 831.88 (očekivano za C42H49FN2NaO13= 831.31).
Primer 9-10. Sinteza doksorubicin-ciklooktina 43.
[0252] Ciklookt-4-in-1-ol (Chem. Ber. 1986, 119, 297-312.) konvertuje se u p-nitrofenil karbonatni derivat (5 mg, 0.017 mmol), koji reaguje sa doksorubicin‧HCl (27, 5 mg, 0.009 mmol) prema opštoj proceduri da se dobije doksorubicin-ciklooktin 43 (6 mg, 0.008 mmol, 94%).
Primer 9-11. Sinteza doksorubicin-DIBO 44
[0253] Prema opštoj proceduri DIBO OSu karbonat (komercijalno nabavljen od LifeTechnologies, 5 mg, 0.013 mmol) reaguje sa doksorubicinom (27, 5 mg, 0.009 mmol) da se dobije DIBO-doksorubicin 44 (7 mg, 0.008 mmol, 90%).
[0254] Gornji Primeri 9-8 do 9-11 šematski su prikazani na Šemi 12.
Primer 9-12. Sinteza alkin-biotina 45 [uporedno]
[0255] U rastvor biotin-PEG3-NH2u dihlorometanu (6 mL) dodaju se trietilamin (54 µL, 39 mg, 0.39 mmol) i sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline (25 mg, 0.13 mmol). Posle 19 h, reakciona smeša se koncentruje i rezidua se prečisti hromatografijom na koloni (5→20% MeOH u DCM). Prečišćeni proizvod se rastvori u DCM, filtrira i koncentruje, što daje željeni proizvod u vidu bele čvrste supstance (52 mg, 0.11 mmol, 85%).
Primer 9-13. Sinteza O-alkil hidroksilamin biotina 47
[0256] U rastvor dietilenglikola (0.89 mL, 1 g, 9.42 mmol) u 80 mL suvog THF dodaju se PPh3(5.43 g, 20.7 mmol) i N-hidroksiftalimid. Posle hlađenja do 0°C doda se 40% DEAD rastvor u toluenu (9.44 mL, 20.7 mmol). Smeša se meša 21 h. Proizvod se isfiltrira i ispere korišćenjem EtOAc. Proizvod se dobija u vidu bele čvrste supstance (1.73 g, 4.37 g).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ (ppm) 7.85 - 7.66 (m, 8H), 4.31 - 4.20 (m, 4H), 3.92 - 3.78 (m, 4H).
[0257] Zatim, 1.5 g (3.78 mmol) proizvoda dobijenog u prethodnom koraku rastvori se u 7 N NH3u MeOH, greje do 40 °C i meša 20 h. To se zatim ohladi na rt dok se argon propušta kroz reakcionu smešu. Reakciona smeša se koncentruje i rezidua rastvori u DCM (50 mL), filtrira i koncentruje. Rezidua se prečisti hromatografijom na koloni (2→5% MeOH u DCM). Prinos: 0.46 g (3.38 mmol, 89%).<1>H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5.51 (s, 4H), 3.88-3.82 (m, 4H), 3.71-3.64 (m, 4H).
[0258] Gornji Primeri 9-12 i 9-13 šematski su prikazani na Šemi 13.
Primeri 9-14 - 9.17: Sinteza UDP-GalNAc derivata 52-55
[0259] Reakciona šema sinteze UDP-GalNAc derivata 52-54, počevši od 51, prikazana je na Slici 14. Jedinjenja 55 i 56 kupljena su od Glycohub, Inc. (USA).
Primer 9-14. Sinteza UDP-GalNH251
[0260] Jedinjenje 48 priprema se od D-galaktozamina prema proceduri opisanoj za D-glukozamin u Linhardt et al., J. Org. Chem.2012, 77, 1449-1456.
[0261]<1>H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 5.69 (dd, J = 6.84, 6.84 Hz, 1H), 5.43-5.41 (m, 1H), 5.35 (dd, J = 10.9, 3.4 Hz, 1H), 4.54 (t, J = 6.48 Hz, 1H), 4.23-4.12 (m, 1H), 4.04 (dd, J = 10.9, 6.1 Hz, 1H), 3.82 (dt, J = 11.1, 2.7 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99 (s, 3H). LRMS (ESI-) izrač. za C12H18N3O11(M-H<+>) 410.06, nađeno 410.1.
[0262] Zatim, jedinjenje 48 se kupluje sa UMP prema Baisch et al. Bioorg. Med. Chem., 1997, 5, 383-391).
[0263] Prema tome, rastvor D-uridin-5’-monofosfat dinatrijumove soli (1.49 g, 4.05 mmol) u H2O (15 mL) tretira se korišćenjem DOWEX 50Wx8 (H<+>forma) u trajanju od 30 minuta i
4
filtrira. Filtrat se snažno meša na rt dok se dodaje tributilamin (0.966 mL, 4.05 mmol) u kapima. Posle 30 minuta dodatnog mešanja, reakciona smeša se liofilizuje i suši preko P2O5pod vakuumom 5 h.
[0264] Dobijeni tributilamonijum uridin-5’-monofosfat se rastvori u suvom DMF (25 mL) u atmosferi argona. Karbonildiimidazol (1.38 g, 8.51 mmol) se doda i reakciona smeša se meša na r.t. 30 min. zatim, doda se suvi MeOH (180 µL) i meša 15 min da se ukloni višak CDI. Zaostali MeOH se ukloni pod jakim vakuumom 15 min. Zatim se jedinjenje 48 (2.0 g, 4.86 mmol) rastvori u suvom DMF (25 mL) i u kapima doda u reakcionu smešu. Reakcija se ostavi da se meša na rt 2 d pre koncentrovanja u vakuumu. Prati se konzumiranje imidazol-UMP intermedijara pomoću MS. Fleš hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:Me-OH:H2O) daje proizvod 49 (1.08 g, 1.51 mmol, 37%).<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ 7.96 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 5.98-5.94 (m, 2H), 5.81-5.79 (m, 1H), 5.70 (dd, J = 7.1, 3.3 Hz, 1H), 5.49 (dd, J= 15.2, 2.6 Hz, 1H), 5.30 (ddd, J= 18.5, 11.0, 3.2 Hz, 2H), 4.57 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 4.35-4.16 (m, 9H), 4.07-3.95 (m, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.07 (s, 3H).
[0265] LRMS (ESI-) izrač. za C21H29N5O19P2(M-H<+>) 716.09, nađeno 716.3.
[0266] Jedinjenje 49 deacetiliše se prema Kiso et al., Glycoconj. J., 2006, 23, 565-573).
[0267] Prema tome, jedinjenje 49 (222 mg, 0.309 mmol) rastvori se u H2O (2.5 mL) i dodaju se trietilamin (2.5 µL) i MeOH (6 mL). Reakciona smeša se meša 3 h i zatim koncentruje u vakuumu da se dobije sirova UDP-2-azido-2-deoksi-D-galaktoza (50).<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.02-5.98 (m, 2H), 5.73 (dd, J = 7.4, 3.4 Hz, 1H), 4.42-4.37 (m, 2H), 4.30-4.18 (m, 4H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.80-3.70 (m, 2H), 3.65-3.58 (m, 1H). LRMS (ESI-) izrač. za C15H23N5O16P2(M-H<+>) 590.05, nađeno 590.2.
[0268] Konačno, u rastvor jedinjenja 50 u H2O:MeOH 1:1 (4 mL) doda se Lindlar-ov katalizator (50 mg). Reakcija se meša u atmosferi vodonika 5 h i filtrira preko celita. Filter se ispere koriščenjem H2O (10 ml) i filtrat se koncentruje u vakuumu da se dobije UDP-D-galaktozamin (UDP-GalNH2, 51) (169 mg, 0.286 mmol, 92% prinos iz dva koraka).<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ 7.93 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 5.99-5.90 (m, 2H), 5.76-5.69 (m, 1H), 4.39-4.34 (m, 2H), 4.31-4.17 (m, 5H), 4.05-4.01 (m, 1H), 3.94-3.86 (m, 1H), 3.82-3.70 (m, 3H), 3.30-3.16 (m, 1H). LRMS (ESI-) izrač. za C15H25N3O16P2(M-H<+>) 564.06, nađeno 564.1.
Primer 9-15. Sinteza UDP-GalNAz 52
[0269] Sukcinimidil estar azidosirćetne kiseline priprema se prema proceduri u Hamilton et al, Chem. Eur. J., 2012, 18, 2361-2365.
[0270] UDP-D-galaktozamin (51) (82 mg, 0.145 mmol) rastvori se u 0.1 M NaHCO3(2 mL) i dodaju se sukcinimidil estar azidosirćetne kiseline (86 mg, 0.435 mmol) i DMF (2 mL). Reakcija se meša preko noći na r.t. i zatim koncentruje u vakuumu. Fleš hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) daje UDP-GalNAz (52) (34 mg, 0.052 mmol, 36%).
[0271]<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ 8.73 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 5.90-5.82 (m, 2H), 5.49 (dd, J = 6.9, 3.3 Hz, 1H), 4.29-4.05 (m, 7H), 4.03-3.85 (m, 4H), 3.72-3.61 (m, 2H).
[0272] LRMS (ESI-) izrač. za C17H26N6O17P2(M-H<+>) 647.08, nađeno 647.1.
Primer 9-16. Sinteza UDP-GalNAc-ina 53 [uporedno]
[0273] Sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline priprema se prema proceduri u Rademann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 9441-9447.
[0274] UDP-D-galaktozamin (51) (53 mg, 0.094 mmol) se rastvori u 0.1 M NaHCO3(2 mL) i dodaju se sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline (37 mg, 0.188 mmol) i DMF (2 mL). Reakcija se meša preko noći na r.t. i koncentruje u vakuumu. Fleš hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) daje UDP-GalNAc-in (53) (42 mg, 0.065 mmol, 69%).
[0275]<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ 7.78 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 5.84-5.76 (m, 2H), 5.39 (dd, J = 6.8, 3.2 Hz, 1H), 4.22-4.16 (m, 2H), 4.14-3.97 (m, 5H), 3.88-3.85 (m, 1H), 3.81-3.75 (m, 1H), 3.63-3.55 (m, 2H), 2.45-2.28 (m, 5H), 2.19 (t, J = 2.4 Hz, 1H).
[0276] LRMS (ESI-) izrač. za C20H29N3O17P2(M-H<+>) 644.09, nađeno 644.1.
Primer 9-17. Sinteza UDP-GalNLev 54 [uporedno]
[0277] Sukcinimidil estar levulinske kiseline pripremi se prema proceduri za sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline u Rademann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 9441-9447.
[0278]<1>H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.81 (s, 4H), 2.77 (s, 4H), 2.14 (s, 3H).
[0279] UDP-D-galaktozamin (51) (53 mg, 0.094 mmol) se rastvori u 0.1 M NaHCO3(2 mL) i dodaju se sukcinimidil estar levulinske kiseline (40 mg, 0.188 mmol) i DMF (2 mL). Reakcija se meša preko noći na r.t. i rastvarač se ukloni pod sniženim pritiskom. Fleš hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H2O) daje UDPGalNLev (54) (10 mg, 0.015 mmol, 16%).
[0280]<1>H-NMR (300 MHz, D2O): δ 7.78 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 5.82-5.77 (m, 2H), 5.36 (dd, J = 6.8, 3.2 Hz, 1H), 4.22-4.15 (m, 2H), 4.13-3.95 (m, 5H), 3.88-3.84 (m, 1H), 3.82-3.75 (m, 1H), 3.64-3.52 (m, 3H), 2.74-2.61 (m, 2H), 2.47-2.37 (m, 2H), 2.05 (s, 3H).
[0281] LRMS (ESI-) izrač. za C20H31N3O18P2(M-H<+>) 662.10, nađeno 662.1.
Primer 9-18. Sinteza BCN-MMAF (56)
[0282] U rastvor MMAF.TFA (8.1 mg, 0.0096 mmol) u DMF (0.3 mL) dodaju se Et3N (5 µL, 3.6 mg, 0.036 mmol) i BCN-PEG2-OSu (36) (19 mg, 0.045 mmol). Posle reakcije preko noći smeša se koncentruje. Prečišćavanje hromatografijom na koloni (DCM → MeOH/DCM 1/3) daje željeni proizvod. LRMS (HPLC, ESI+) izrač. za C55H87N6O13(M+H<+>) 1039.63, nađeno 1039.72.
Opšti protokol za modifikaciju IgG
Orezivanje IgG glikana pomoću endo S
[0283] Orezivanje IgG glikana izvodi se korišćenjem endo S iz Streptococcus pyogenes (komercijalno se nabavlja od Genovis, Lund, Sweden). IgG (10 mg/mL) se inkubira sa endo S (40 U/mL) u 25 mM Tris pH 8.0 približno 16 sati na 37 °C. Deglikozilovani IgG se koncentruje i ispere korišćenjem 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 korišćenjem Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore).
Maseno-spektralna analiza
[0284] Rastvor od 50 µg (modifikovanog) IgG, 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA i 30 mM DTT u ukupnoj zapremini od približno 70 µL inkubira se 20 minuta na 37 °C da se redukuju disulfidni mostovi, omogućavajući analizu i lakog i teškog lanca. Ako su prisutne, azidne funkcionalne grupe se redukuju do amina pod ovim uslovima. Redukovani uzorci se isperu tri puta korišćenjem milliQ uz upotrebu Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) i koncentruju do 10 µM (modifikovanog) IgG. Redukovani IgG analizira se tehnikom elektrosprej-jonizacije-vreme leta (electrospray ionization time-of-flight, ESI-TOF) na JEOL AccuTOF. Dekonvolucija spektra dobija se korišćenjem Magtran softvera.
Primer 10. Orezivanje trastuzumaba (Slika 15a 15b)
[0285] Trastuzumab se podvrgava protokolu orezivanja opisanom ranije u ovom tekstu. Posle dekonvolucije pikova, maseni spektar pokazuje jedan pik lakog lanca i dva pika teškog lanca. Dva pika teškog lanca pripadaju glavnom proizvodu (49496 Da, 90% od ukupne količine teškog lanca), što je rezultat sržno-GlNAc(Fuc)-supstituisanog trastuzumaba, i manje zastupljenom proizvodu (49351 Da, ±10% od ukupne količine teškog lanca), što je rezultat sržno-GlcNac-supstitisanog trastuzumaba.
Primer 11. Orezivanje bevacizumaba
[0286] Tretman bevacizumaba sličan trastuzumabu, dovodi do formiranja jednog glavnog teškolančanog proizvoda (50062 Da, ±90%), zajedno sa nekoliko manje zastupljenih teškolančanih proizvoda (±10%).
Primer 12. Orezivanje cetuksimaba
[0287] Cetuksimab se razlikuje od trastuzumaba po činjenici da sadrži drugo N-glikozilaciono mesto na N88. Glikan na N88 lociran je u Fab regionu i ima konstituciju različitu od glikana na N297. Tretman cetuksimaba sličan trastuzumabu dovodi do formiranja raspona teškolančanih proizvoda sa masama od 51600 Da do 52300 Da (glavni pikovi na 51663 Da i 51808 Da), što ukazuje da se samo jedan glikan orezuje Endo S, verovatno na N297.
Primer 12-1. Orezivanje rituksimaba
[0288] Tretman rituksimaba sličan trastuzumabu dovodi do formiranja jednog glavnog teškolančanog proizvoda (49408 Da).
Primer 12-2. Pokušaj orezivanja trastuzumaba korišćenjem endo H
[0289] Trastuzumab se inkubira sa endoglikozidazom H (EndoH) iz Streptomyces picatus (komercijalno se nabavlja od New England BioLabs). Rastuće koncentracije endo H (≤ 115 U/µL) dodaju se trastuzumabu (10 mg/mL) u 50 mM natrijum citratu, pH 5.5 i inkubiraju 16 h na 37 °C. Maseni spektri pokazuju samo pikove koji odgovaraju nativnom glikozilovanom teškom lancu (50589 i 50752 Da što odgovara G0F, odnosno G1F izoformi), što ukazuje da trastuzumab ne može da se oreže korišćenjem endo H.
Primer 12-3. Pokušaj orezivanja trastuzumaba korišćenjem endo M
[0290] Trastuzumab (10 mg/mL) se inkubira sa rastućim koncentracijama endo-β-N-acetilglukozaminidaze (endo M, ≤ 231 mU/mL) iz Mucor hiemalis (komercijalno se nabavlja od TCI Europe N.V.) u 50 mM natrijum citratu pH 6.0 i inkubira 16 h na 37 °C. Maseni spektar pokazuje glavne pikove koji odgovaraju nativnom glikozilovanom teškom lancu (50589 i 50752 Da odgovaraju G0F, odnosno G1F izoformi). Pored toga, zapažen je manji proizvod (49347 Da, ±5% od ukupnog teškog lanca), koji je rezultat sržno-GlcNacsupstituisanog teškog lanca. Ovi rezultati pokazuju da samo glikoforme trastuzumaba koje nemaju sržnu fukozu mogu da se orežu koriščenjem endo M.
Glikoziltransfer galaktoznog derivata (npr. azidošećera) pomoću Gal-T1(Y289L)
[0291] Enzimsko uvođenje galaktoznog derivata (npr. azido-sadržavajućeg šećera) na IgG vrši se mutantnom goveđom β(1,4)-galaktoziltransferazom [β(1,4)-Gal-T1(Y289L)]. Deglikozilovani IgG (pripremljen kako je gore opisano, 10 mg/mL) inkubira se sa modifikovanim UDP-galaktoznim derivatom (npr. azido-modifikovani šećer-UDP derivat) (0.4 mM) i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) (1 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C.
[0292] Funkcionalizovani IgG (npr. azido-funkcionalizovani IgG) inkubira se sa protein A agarozom (40 µL po mg IgG) 2 sata na 4 °C. Protein A agaroza se ispere tri puta pomoću PBS i IgG se eluira sa 100 mM glicin-HCl pH 2.7. Eluirani IgG se neutrališe pomoću 1 M Tris-HCl, pH 8.0 i koncentruje i ispere pomoću PBS korišćenjem Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) do koncentracije od 15-20 mg/mL.
Primer 13. Trastuzumab(GalNAz)2(Slika 15c)
[0293] Trastuzumab se podvrgava protokolu glikoziltransfera sa UDP-N-azidoacetilgalaktozaminom 52 (UDPGalNAz). Posle afinitetnog prečišćavanja na proteinu A, maseno-spektralna analiza ukazala je na formiranje jednog glavnog proizvoda (od 49713 Da, 90% od svih teških lanaca), koji je rezultat GalNAz transfera na sržni GlcNAc(Fuc)-supstituisani trastuzumab, i manje zastupljenog proizvoda (49566 Da, ±10% od svih teških lanaca), koji je rezultat GalNAz transfera na sržni GlcNAc-supstituisani trastuzumab.
Primer 14. Bevacizumab(GalNAz)2
[0294] Bevacizumab (7.5 mg, 10 mg/mL) se oreže pomoću Endo S prema opštem protokolu. Orezani bevacizumab (10 mg/mL) inkubira se sa UDP-GalNAz 52 (65 µL, 10 mM) i β(1,4)-GalT1(Y289L) (75 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C. Prečišćavanje uz korišćenje ProtA daje modifikovani bevacizumab (3.2 mg). AccuTOF analiza pokazuje formiranje jednog glavnog teškolančanog proizvoda (50282 Da, ±95%).
Primer 15. Cetuksimab(GalNAz)2
[0295] Cetuksimab (7.5 mg, 10 mg/mL) se oreže pomoću endo S prema opštem protokolu. Orezani cetuksimab (10 mg/mL) inkubira se sa UDP-GalNAz 52 (65 µL, 10 mM) i β(1,4)-GalT1(Y289L) (75 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C. Prečišćavanje uz korišćenje ProtA daje modifikovani cetuksimab (3.2 mg). AccuTOF analiza pokazuje formiranje dva glavna teškolančana proizvoda (51884 Da i 52029 Da), u skladu sa orezivanjem N297 glikana, ali ne i Fab glikana.
Primer 15-1. Rituksimab(GalNAz)2
[0296] Rituksimab (7.5 mg, 10 mg/mL) se oreže pomoću Endo S prema opštem protokolu. Orezani rituksimab (10 mg/mL) inkubira se sa UDP-GalNAz 52 (65 µL, 10 mM) i β(1,4)-GalT1 (Y289L) (75 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C. Prečišćavanje uz korišćenje ProtA daje modifikovani rituksimab (3.2 mg). AccuTOF analiza pokazuje kompletnu konverziju do željenog proizvoda (masa 49625, očekivana masa 49627).
Primer 15-2. Girentuksimab(GalNAz)2
[0297] Girentuksimab se oreže pomoću endo S prema opštem protokolu opisanom gore, što dovodi do formiranja jednog glavnog teškolančanog proizvoda (49427 Da). Orezani girentuksimab se zatim inkubira sa UDP-GalNAz i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) kako je gore opisano, što dovodi do formiranja jednog glavnog teškolančanog proizvoda (49643 Da).
Primer 15-3. Trastuzumab(GalNAc-in)2[uporedno]
[0298] Orezani trastuzumab (100 µL, 10 mg/mL, 6.6 nmol), dobijen tretmanom trastuzumaba korišćenjem endo S prema opštem protokolu, inkubira se sa UDP-GalNAc-inom (53) (5 µL, 10 mM) i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) (5 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C. Sirova smeša se prečisti korišćenjem ProtA dajući trast-(GalNAc-in)2(0.43 mg). AccuTOF analiza pokazuje 90% konverziju do željenog proizvoda (masa 49735, očekivana masa 49736), zapaženo je 10% sporednog proizvoda (masa 50379).
Primer 15-4. Trastuzumab(GalNLev)2[uporedno]
[0299] Orezani trastuzumab (100 µL, 10 mg/mL, 6.6 nmol), dobijen tretmanom trastuzumaba korišćenjem endo S prema opštem protokolu, inkubira se sa UDP-GalNLev (54) (10 µL, 10 mM) i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) (7.5 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C. Sirova smeša se prečisti korišćenjem ProtA dajući trast-(GalNLev)2(0.53 mg). AccuTOF analiza pokazuje 95% konverziju do željenog proizvoda (masa 49753, očekivana masa 49754). Zapaženo je 5% sporednog proizvoda (masa 50417).
Orezivanje transfer GalNAz na IgG sakupljen iz plazme
Primer 15-5. Maseno-spektrometarska analiza IgG iz plazme
[0300] U reakcionu smešu koja sadrži 0.5 mg IgG sakupljenog iz plazme (Lee Biosolutions, Inc) dodaju se PBS (220 µL) i pufer za digestiju (250 µL, 0.1 mg/mL papaina, 0.02 M cistein, 0.02 M EDTA u PBS) posle čega sledi inkubacija 1 h na 37 °C. Zatim se doda suspenzija proteina A (100 µL) i smeša se rotira sa jednog kraja na drugi, 1 h. Protein A se ispere korišćenjem PBS (3 × 1 mL) što je praćeno eluiranjem uz korišćenje glicin‧HCl pufera (pH 2.7, 0.1 M, 300 µL). Pufer za eluiranje se neutrališe pomoću Tris-HCl (pH 8.0, 1 M, 80 µL) i zatim se uzorak uzme za analizu mase prema standardnom protokolu (Slika 14a).
Primer 15-6. Orezivanje IgG sakupljenog iz plazme
[0301] IgG sakupljen iz plazme (170 µL, 14 mg/mL) oreže se korišćenjem endo S (16 µL, 20 U/µL) u 98 µL Tris-HCl (25 mM, pH 8.0), 16 sati na 37 °C. Analiza se izvodi prema protokolu analize. AccuTOF merenja pokazuju potpunu konverziju.
[0302] Gornji Primeri 15-5 i 15-6 šematski su prikazani na Šemi 16.
Primer 15-7. transfer GalNAz na IgG iz plazme
[0303] Orezani IgG iz plazme (46 µL, 10.8 mg/mL, 3.3 nmol) inkubira se sa UDP-GalNAz 52 (3.3 µL, 10 mM) i β1,4-Gal-T1(Y289L) (2.5 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C. Analiza se izvodi u skladu sa protokolom analize IgG iz plazme i AccuTOF merenja pokazuju potpunu konverziju.
Konjugacija azido-modifikovanog IgG cikloadicijom sa ciklooktinskom probom
[0304] Kovalentno vezani BCN- ili DIBAC-funkcionalizovani molekul (u DMSO) razblaži se u PBS. Doda se prečišćeni IgG koji sadrži azide (100 µL od 10 mg/mL) i reakciona smeša se rotira od jednog kraja ka drugom, 12 do 72 sata, na 4 °C. Dobijeni IgG konjugat se koncentruje i ispira pomoću PBS uz korišćenje Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) do finalne koncentracije od 10 mg/mL.
1
Reakcije konjugacije azido-modifikovanog IgG cikloadicijom pokrenutom naprezanjem sa ciklooktinskom probom
[0305] Posle prečišćavanja pomoću proteina A, azido-sadržavajući IgG (100 µM) ili 15 mg/mL) doda se u 0.01 zapreminu 40 mM stok rastvora kovalentno vezanog ciklooktinfunkcionalizovanog molekula (4 ekvivalenta) u DMSO ili DMF, odmah izmeša i rotira od jednog kraja ka drugom 12 do 24 sata na sobnoj temperaturi. Po potrebi, ova procedura se ponavlja da se dobije potpuna konverzija. Dobijeni konjugat IgG koncentruje se i ispere pomoću PBS uz korišćenje Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) do finalne koncentracije od 10 mg/mL.
[0306] U slučaju ADC, ovaj korak se zameni prečišćavanjem hromatografijom na osnovu veličine na Superdex200 koloni.
Primer 16. Konjugacija BCN-biotina sa trastuzumab(GalNAz)2
[0307] BCN-biotin konjugat 25 (2 µL 100 mM u DMSO) razblaži se u PBS (98 µL) i 5 µL ovog rastvora se izloži trastuzumab(GalNAz)2(5 µL 10 mg/ml u PBS). Ispiranje i koncentrovanje, i zatim maseno-spektralna analiza pokazuju prisustvo jednog glavnog proizvoda (50294 Da, 90% od ukupne količine teškog lanca) i manje zastupljenog proizvoda (50148 Da, ±10% od ukupne količine teškog lanca).
Primer 17. Konjugacija DIBAC-biotina sa trastuzumab(GalNAz)2
[0308] DIBAC-biotin konjugat 30 (2 µL 100 mM u DMSO) razblaži se u PBS (98 µL) i 5 µL ovog rastvora izloži se trastuzumab(GalNAz)2(5 µL 10 mg/ml u PBS). Ispiranje i koncentrovanje, i zatim maseno-spektralna analiza pokazuju prisustvo jednog glavnog proizvoda (50247 Da, 90% od ukupne količine teškog lanca) i manje zastupljenog proizvoda (50101 Da, ±10% od ukupne količine teškog lanca).
Primer 17-1. Konjugacija DIBAC-vc-PABA-MMAF 41 sa trastuzumab(GalNAz)2
[0309] Posle 1 dana, prema AccuTOF analizi potpuna konverzija. Dobijena masa 51248, očekivana masa 51248.
Primer 18. Konjugacija BCN-doksorubicina 28a sa trastuzumab(GalNAz)2
2
[0310] BCN-doksorubicin 28a (4 µL 50 mM rastvora u DMSO) razblaži se u PBS (896 µL) i izloži trastuzumab(GalNAz)2kako je opisano u opštoj proceduri. Ispiranje i koncentrovanje, i zatim maseno-spektralna analiza pokazuju prisustvo jednog glavnog proizvoda (50708 Da, 90% od ukupne količine teškog lanca) i manje zastupljenog proizvoda (50294 Da, ±10% od ukupne količine teškog lanca).
Primer 19. Konjugacija BCN-doksorubicina 35 sa trastuzumab(GalNAz)2
[0311] BCN-doksorubicin 35 (4 µL 50 mM u DMSO) razblaži se u PBS (896 µL) i izloži trastuzumab(GalNAz)2kako je opisano u opštoj proceduri. Ispiranje i koncentrovanje, i zatim maseno-spektralna analiza pokazuju prisustvo konjugata trastuzumab(GalNAz)2i BCN-doksorubicina 35 (51114 Da).
Primer 20. Konjugacija BCN-PEG8-doksorubicina 28b sa trastuzumab(GalNAz)2
[0312] Inkubacija BCN-PEG8-doksorubicina (400 µM, 4 ekv) sa trastuzumab(GalNAz)2(100 µM) u PBS, 16 h, dovodi do potpune konverzije u trastuzumab(PEG8-doksorubicin)2(teškolančani proizvodi između 50467 i 51134 Da sa glavnim pikom na 50881 Da odgovara teškom lancu sa sržnim GalNAzGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCNPEG8-doksorubicinom).
Primer 21. Konjugacija BCN-vc-PABA-doksorubicina 33 sa trastuzumab(GalNAz)2
[0313] BCN-doksorubicin 33 (4 µL 50 mM rastvora u DMSO) razblaži se u PBS (896 µL) i izloži trastuzumab(GalNAz)2kako je opisano u opštoj proceduri. Ispiranje i koncentrovanje, i zatim maseno-spektralna analiza pokazuju prisustvo konjugata trastuzumab(GalNAz)2i BCN-vc-PABA-doksorubicina 33 (51114 Da).
Primer 22. Konjugacija BCN-vc-PABA-MMAE 37a sa trastuzumab(GalNAz)2
[0314] Inkubacija BCN-vc-PABA-MMAE 37a (125 µM, 5 ekv) sa trastuzumab(GalNAz)2(25 µM) u PBS, 16 h, dovodi do potpune konverzije u trastuzumab(vc-PABA-MMAE)2(teškolančani proizvodi između 51137 i 51600 Da sa glavnim pikom na 51283 Da odgovara teškom lancu sa sržnim GalNAzGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCN-vc-MMAE, ±95% od ukupne količine teškog lanca, i manji pik na 50520 Da zbog fragmentacije PABA linkera tokom masene spektrometrije, ±5% od ukupne količine teškog lanca).
Primer 23. Konjugacija BCN-vc-PABA-MMAF 37b sa trastuzumab(GalNAz)2
[0315] Inkubacija BCN-vc-PABA-MMAF 37b (600 µM, 4 2 ekv) sa trastuzumab(GalNAz)2(100 µM) u PBS u trajanju od približno 16 h dovodi do kompletne konverzije u trastuzumab(vc-PABA-MMAF)2(teškolančani proizvodi između 51032 i 51500 Da sa glavnim pikom od 51181 Da koji odgovara teškom lancu sa sržnim GalNazGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCN-vc-PABA-MMAF, ±95% od ukupne količine teškog lanca, i malim pikom na 50407 Da zbog fragmentacije PABA linkera tokom masene spektrometrije, ±5% od ukupne količine teškog lanca).
Primer 24. Konjugacija BCN-MMAF 38 sa trastuzumab(GalNAz)2
[0316] Trastuzumab(MMAF)2: Inkubacija BCN-MMAF 38 sa trastuzumab(GalNAz)2(100 µM) u PBS u trajanju od približno 16 h dovodi do kompletne konverzije u trastuzumab(MMAF)2(teškolančani proizvodi između 50636 i 51100 Da sa glavnim pikom od 50783 Da koji odgovara teškom lancu sa sržnim GalNazGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCN-MMAF).
Primer 24-2. Konjugacija BCN-MMAF 57 sa trastuzumab(GalNAz)2
[0317] Trastuzumab(MMAF)2: Inkubacija BCN-MMAF (57, Slika 10b) sa trastuzumab(GalNAz)2(100 µM) u PBS u trajanju od približno 16 h, dovodi do kompletne konverzije u trastuzumab(MMAF)2(teškolančani proizvodi između 50636 i 51100 Da sa glavnim pikom od 50783 Da koji odgovara teškom lancu sa sržnim GalNAzGlcNAc(Fuc) konjugovanim sa BCN-MMAF 57).
Primer 25. Konjugacija BCN-vc-PABA-majtanzinoida 39 sa trastuzumab(GalNAz)2
[0318] Inkubacija BCN-vc-PABA-majtanzinoida (39) (800 µM, 2 × 4 ekv) sa trastuzumab(GalNAz)2(100 µM) u PBS u trajanju od približno 40 h, dovodi do kompletne konverzije u trastuzumab(vc-PABA-majtanzinoid)2(teškolančani proizvodi između 50781 i 51600 Da sa glavnim pikom od 51172 Da koji odgovara teškom lancu sa sržnim GalNAzGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCN-vc-PABA-majtanzinoidom, ±95% od ukupne količine teškog lanca).
Konjugacija ciklooktin-doksorubicinskih konjugata 42-44 sa trastuzumab(GalNAz)2cikloadicijom pokrenutom napregnutošću
4
[0319] U rastvor trastuzumab-(GalNAz)2(7.5 µL, 20 mg/ml, 1 nmol) u PBS doda se rastvor ciklooktina (2.5 µL, 2.4 mM 5% DMF u MiliQ, 6 nmol). Reakcija se rotira sa jednog kraja na drugi posle čega sledi AccuTOF analiza.
Primer 26: Konjugacija MCFO-doksorubicina 42 sa trast(GalNAz)2
[0320] Posle 5 dana prema AccuTOF analizi konverzija je 80%. Zapažena masa 50548, očekivana masa 50550.
Primer 27: Konjugacija DIBO-doksorubicina 43 sa trast(GalNAz)2
[0321] Posle 5 dana prema AccuTOF analizi konverzija je 30%. Zapažena masa 50530, očekivana masa 50544.
Primer 28: Konjugacija ciklooktin-doksorubicina .44 sa trast(GalNAz)2
[0322] Posle 5 dana prema AccuTOF analizi konverzija je 50%. Zapažena masa 50434, očekivana masa 50449.
Primer 29: CuAAC trastuzumab-(N3)2sa alkin-biotinom 45 [uporedno]
[0323] U rastvor trast-(GalNAz)2(10 µL, 9.6 mg/ml, 0.64 nmol) (izveden iz 52) u PBS doda se rastvor biotin-alkina (45, 1 µL, 10 mM, 10 nmol) i stok rastvora premešavine (1 µL, 10 mM CuSO4, 10 mM natrijum askorbat, 10 mM tris((1-((O-etil)karboksimetil)-(1,2,3-triazol-4-il))metilamin u 20% MeCN u miliQ). Reakcija se rotira sa jednog kraja na drugi, posle čega sledi AccuTOF analiza koja je pokazala potpuno formiranje željenog proizvoda (zapažena masa 50195), kako je naznačeno na Slici 17.
Primer 30: CuAAC trastuzumab-ina2sa azido-biotinom 46 [uporedno]
[0324] U rastvor trast-(GalNAc-ina)2izvedenog iz 53 (10 µL, 9.6 mg/ml, 0.64 nmol) u PBS doda se rastvor biotin-N346 (1 µL, 10 mM, 10 nmol) i stok rastvor premešavine (1 µL, 10 mM CuSO4, 10 mM natrijum askorbat, 10 mM tris((1-((O-etil)karboksimetil)-(1,2,3-triazol-4-il))metilamin u 20% MeCN u miliQ). Reakcija se rotira sa jednog kraja na drugi preko noći i zatim je AccuTOF analiza pokazala 50% konverziju (masa 50353, očekivana masa 50351), kako je naznačeno na Slici 18.
Primer 31: Konjugacija maleimid-vc-PABA-majtanzinoida 40 sa trastuzumab(N297C) [uporedno]
[0325] Trastuzumab(N297C) (4 mg, 10 mg/mL) inkubira se sa DTT (10 ekv) u PBS pH 7.4 tokom 2 sata, na 22 °C. Višak DTT ukloni se spin-filter prečišćavanjem i redukovani IgG (10 mg/mL) se inkubira sa dehidroaskoribinskom kiselinom (20 ekv) 3 sata na 22 °C. Doda se maleimid-vc-PABA-majtanzinoid 40 (3 ekv) i reakciona smeša se inkubira na sobnoj temperaturi 1 sat, posle čega se višak maleimid-vc-PABA-majtanzinoida 40 ukloni spinfilter prečišćavanjem. AccuTOF analiza pokazala je formiranje tri teškolančana proivoda, koji odgovaraju nemodifikovanom teškom lancu (49133 Da, ±10% od ukupne količine teških lanaca), teškom lancu konjugovanom sa 1 majtanzinoidom (50454 Da, ±85% od ukupne količine teških lanaca) i teškom lancu konjugovanom sa 2 majtanzinoida (50774 Da, ±5% od ukupne količine teških lanaca. Nije detektovana konjugacija sa lakim lancem.
Primer 32: In vitro test stabilnosti u plazmi
[0326] Humana plazma (pripremljena korišćenjem heparina) centrifugira se na 200 g 10 minuta na 4°C i supernatant se inkubira sa protein A agarozom (Kem-En-Tec) 1 sat na 4°C da se isprazni od IgG. Ispražnjena plazma se steriliše filtriranjem uz korišćenje 0.22 µm filtera (Whatman). Trastuzumab-doksorubicin konjugat izveden iz 28a doda se u sterilnu humanu plazmu do finalne koncentracije od 100 µg/ml i inkubira na 37 °C u CO2inkubatoru, da se pH nivoi plazme zadrže blizu fiziološkom pH od 7.2. Uzorci se uzimaju na 0, 24, 48 i 144 sata i skladište na -80°C. Konjugat trastuzumaba se prečisti korišćenjem protein A agaroze, posle čega sledi MS analiza. Uzorci humane plazme se inkubiraju sa protein A agarozom, 1 sat na 4°C, isperu tri puta fosfatom puferisanim slanim rastvorom (PBS) i konjugat trastuzumaba se eluira sa 100 mM glicin-HCl pH 2.7 što je praćeno neutralizacijom sa 1 M Tris-HCl, pH 8.0. MS analiza pokazala jeda se pik koji odgovara konjugatu trastuzumab-doksorubicin (50708 Da) nije smanjivao tokom vremena. Pored toga, nije bilo moguće detektovati pikove koji odgovaraju degradacionim proizvodima, čime je dokazano da je u humanoj plazmi konjugat stabilan najmanje 144 sata.
Primer 33: Efikasnost in vitro
[0327] SK-Br-3 (Her2+), SK-OV-3 (Her2+) i MDA-MB-231 (Her2-) ćelije zaseju se na ploče sa 96 bunarčića (5000 ćelija/bunarčiću) u RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (fetal calf serum, FCS) (Invitrogen, 200 µL/bunarčiću) i inkubiraju preko noći na 37°C i 5% CO2. Trostruka serijska razblaženja (u rasponu od ±0.002 do 100 nM) sterilno filtriranih jedinjenja pripremi se u RPMI 1640 GlutaMAX dopunjenom sa 10% FCS. Posle uklanjanja medijuma za kulturu, serijske koncentracije se dodaju u kvadriplikatima i inkubiraju tri dana na 37°C i 5% CO2. Medijum za kulturu se zameni sa 0.01 mg/mL resazurina (Sigma Aldrich) u RPMI 1640 GlutaMAX dopunjenom sa 10% FCS. Posle 4 do 6 sati na 37°C i 5% CO2fluorescencija se detektuje pomoću čitača fluorescencije sa ploča (Tecan Infinite 200) na 540 nm ekscitacije i 590 nm emisije. Relativne fluorescentne jedinice (relative fluorescent units, RFU) normalizuju se prema procentu ćelijske vijabilnosti podešavanjem bunarčića bez ćelija na 0% vijabilnosti i bunarčića sa najnižom dozom jedinjenja na 100% vijabilnosti. Za svaki uslov prikazuje se prosek procenta vijabilnosti ćelija ± sem.
[0328] In vitro citotoksičnost trastuzumab-(vc-PABA-MMAE)2(izvedenog iz 37a), trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2(izvedenog iz 37b), trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)2(izvedenog iz 39), trastuzumab-(majtanzinoid)2i trastuzumab(N297C)-(vc-PABA-majtanzinoid)2(izvedenog iz 40) upoređuje se sa T-DM1 kao pozitivnom kontrolom i trastuzumabom i rituksimab-(vc-PABA-majtanzinoidom)2kao negativnim kontrolama. Svi ADC na bazi trastuzumaba utiču na vijabilnost Her2-pozitivnih ćelijskih linija SK-Br-3 i SK-OV-3, ali ne i Her2-negativnih ćelijskih linija MDA-MB-231, što pokazuje da ovi ADC specifično ciljaju Her2 pozitivne ćelije. U Her2 negativnoj ćelijskoj liniji MDA-MB-231, samo T-DM1 pokazuje blago sniženje ćelijske vijabilnosti pri najvišoj koncentraciji (100 nM).
Primer 34: DTPA konjugacija, radioobeležavanje i određivanje IRF
[0329] Trastuzumab(MMAF)2(izveden konjugacijom trast(GalNAz)2i 37b) i trastuzumab(majtanzinoid)2(izveden konjugacijom trast(GalNAz)2i 39), deglikozilovani trastuzumab (dobijen tretmanom trastuzumaba sa endo S) i nativni trastuzumab, konjuguju se sa izotiocijanat-DTPA (Macrocyclics, Houston, TX) i obeleže pomoću<111>In (Covidien, Petten). Za eksperimente sa životinjama, svi konstrukti se obeleže pri specifičnoj aktivnosti između 2.7 i 3.4 MBq/µg.
Primer 35: Studije PK/biodistribucije
[0330] BALB/c nude miševi (n=15) inokuliraju se supkutano sa 5 × 10<6>SK-OV-3 ćelija (injekciona zapremina: 200 µl) u desni bok. Četrnaest dana posle indukcije tumora, grupama od pet miševa injektira se i.v. 15-20 MBq<111>In-obeleženog antitela, obeleženog pri dozi proteina od 25 µg. Za procenu in vivo stabilnosti i farmakokinetike konjugata, uzorci krvi od 50 µl uzimaju se preko submandibularnog iskrvarenja na 0.5, 1, 30 min, 1, 2 i 4 sata i 1, 2, 5, 7, 9, 13, 16 i 21 dana posle injekcije preparata radioobeleženog antitela.
Primer 36: Biodistribucija
[0331] Nedelju dana posle injekcije (3 d p.i.) miševi se eutanaziraju i disekuju da bi se odredila biodistribucija radioobeleživača u relevantnim tkivima. Tkivna distribucija trastuzumab(MMAF)2(poreklom od 37b), trastuzumab(majtanzinoida)2(poreklom od 39) i deglikozilovanog trastuzumaba uporediva je sa onom nativnog trastuzumaba.
Primer 37: Efikasnost in vivo
[0332] Ženke SHO miševa (Crl:SHO-Prkdcscid Hrhr, 6- do 9 nedelja starosti na početku faze eksperimenta, dobijene od Charles River Laboratories, L’Arbresles, France) anesteziraju se ketaminom/ksilazinom, koža se aseptizuje rastvorom hlorheksdina, zaseče na nivou interskapularnog regiona, 20 mm<3>tumorskog fragmenta (model HBCx-13B ksenografta poreklom iz pacijenta sa kancerom dojke) stavi se u supkutano tkivo i koža se zatvori kopčama. Kada zapremina tumora bude u rasponu od 60 do 200 mm<3>, grupama od četiri miša injektira se i.v. prenosnik, trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)2(poreklom od 39, u dozama od 3 mg/kg i 9 mg/kg), trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)2(poreklom od 37b, u dozama od 3 mg/kg i 9 mg/kg), i T-DM1 (9 mg/kg).
Detaljna maseno-spektrometrijska analiza trastuzumaba i derivata
[0333] Nativni trastuzumab, trastuzumab(GalNAz)2, i biotinski konjugati pripremljeni od trastuzumab(GalNAz)2bakrom katalisanom "klik"-hemijom (konjugacija sa 46 prema protokolu opisanom u Primeru 29) ili "klik"-hemijom pokrenutom naprezanjem (konjugacija sa 25 kako je opisano u Primeru 16) izlože se detaljnoj analizi masenog spektra intaktnih proteinskih vrsta (nanoLC-MS) korišćenjem nanoLC povezanog sa QTOF MS (maXis 4G) ultravisoke rezolucije.
Primer 38: Analiza intaktnog proteina
Priprema uzorka
[0334] Redukcija proteina izvodi se 30 minuta u 10 mM DTT na 56 °C. Uzorci se pre analize razblaže 1:1 u 2% mravljoj kiselini.
Tečna hromatografija-masena spektrometrija
[0335] Razdvajanja proteina izvode se korišćenjem HPLC nanoflow tečne hromatografije (Bruker Daltonics nano-Advance) povezane online sa kvadripolnim masenim spektrometrom time-of-flight ultravisoke rezolucije (Bruker Daltonics maXis 4G ETD) preko aksijalnog desolvatizujućeg vakuumom asistiranog elektrosprej-izvora (Bruker Daltonics kaptivni raspršivač). Proteini se nanesu na trap kolonu (Dionex PepSwift, 0.2 × 5 mm) tokom 3 minuta pri stopi protoka od 5000 nL/min uz korišćenje 0.1% mravlje kiseline. Proteini se razdvoje na 0.2 × 150 mm koloni sa monolitnim česticama (Michrom 8 µm 4000Å PLRP-S) na 50°C uz korišćenje linearnog gradijenta od 20 do 50% acetonitrila i 0.1% mravlje kiseline, pri stopi protoka od 1000 nl/min. Desolvatacija i jonizacija peptida koji se eluiraju sa kolone izvode se korišćenjem 6 L/min gasovitog azota na 180 °C i pri kapilarnoj voltaži 1600 V. Maseni spektrometar se kalibriše eksterno korišćenjem Agilent smešom za kalibrisanje (G1969-85000) i korišćenjem lockmass kalibracije na 1221.9906 m/z (Agilent G1982-85001). Maseni spektrometar se programira na željeni spektar u rasponu od 500-4200 m/z pri 1 Hz sa sledećim podešavanjima: 400 Vpp levak RF, 10 eV isCID, 400 Vpp multipol RF, 8 eV kvadrupolna jonska energija, 510 m/z niža masa, 10 eV koliziona energija, 3500 Vpp koliziona RF, 110 µs vreme transfera, 450 Vpp jonski hladnjak RF i 18 µs prepulsno skladištenje.
Obrada podataka
[0336] Svi podaci se obrađuju softverom za analizu podataka. Posle lock mass kalibracije, MS spektri lakog i teškog lanca uproseče se preko svakog hromatografskog pika. Uprosečeni spektri se dekonvoluiraju korišćenjem algoritma maksimalne entropije u kombinaciji sa SNAP peak picking (odabir pika) algoritmom za spektar lakog lanca ili Sum peak picking za spektar teškog lanca.
Primer 39 Proteolitička analiza peptida
Priprema uzoraka
[0337] Od svakog uzorka, pet mikrograma proteina izloži se digestiji tripsinom u rastvoru. Ukratko, redukcija se izvodi u 10 mM DTT 30 minuta na 56 °C. Alkilacija redukovanih cisteina (karbamidometilacija) izvodi se korišćenjem 50 mM hloroacetamida. Proteinska digestija se prvo izvodi dodavanjem 0.5 µg LysC peptidaze i inkubacijom u trajanju od 3 sata na 37 °C. Zatim se 800 ng tripsina doda uzorku i inkubira preko noći na 37 °C. Peptidi dobijeni proteolizom se koncentruju i desalinizuju korišćenjem stop-and-go elucionih vrhova.
Tečna hromatografija - tandem masena spektrometrija
[0338] Razdvajanje peptida izvodi se korišćenjem UHPLC nanoflow tečnog hromatografa (Bruker Daltonics nano-Advance) povezanog online sa jonskim trapom visokog kapaciteta (Bruker Daltonics amaZon speed ETD) preko aksijalnog desolvatizujućeg vakuumom asistiranog elektrosprej izvora (Bruker Daltonics kaptivni raspršivač). Peptidi se nanesu na trap kolonu (Dionex PepSwift, 0.2 × 5 mm) u 3 minuta pri stopi protoka od 5000 nL/min uz korišćenje 0.1% mravlje kiseline. Peptidi se razdvajaju na 0.1 × 250 mm monolitnoj koloni (Dionex PepSwift) na 60°C uz korišćenje linearnog gradijenta od 5 do 25% acetonitrila i 0.1% mravlje kiseline pri stopi protoka od 800 nL/min. Desolvatacija i jonizacija peptida eluiranjem sa kolone izvode se korišćenjem 3 L/min gasovitog azota na 150 °C i pri kapilarnoj voltaži 1300V. Maseni spektrometar se programira za sticanje spektra jednog pregleda (MS) sa fragmentacionom analizom zavisnom od podataka (MS/MS) posle toga, za 6 najzastupljenijih jona. Spektri pregleda stiču se u modu povišene rezolucije i uz upotrebu sledećih podešavanja instrumenta: 50 ms maksimalno vreme akumulacije, 500.000 ICC cilj, podešeno na 1000 m/z, prosek 5 spektara. Fragmentacioni spektri stiču se u ekstremnom skenirajućem modu, sa dopuštenim autoselect modom fragmentacije koji se prebacuje između kolizijom indukovane disocijacije (collision induced dissociation, CID) i elektron-transfer disocijacije (electron transfer dissociation, ETD) kao postupaka fragmentacije na bazi odnosa mase prema naelektrisanju i stanja naelektrisanja prekurskorskog jona. Za skeniranje fragmentacije korišćena su sledeća podešavanja instrumenta: 500.000 ICC cilj, 200 ms maksimalno vreme akumulacije, SPS dopušteno, 70% CID energija i 0,2 min dinamičko isključenje.
Pretraživanja baze podataka
[0339] Sirovi podaci dobijeni masenom spektrometrijom obrađuju se softverom za analizu baze podataka (Bruker Daltonics, v4.1) da se generišu Mascot kompatibilni fajlovi za unos (GMF format). GMF fajlovi se unesu u ProteinScape softver (Bruker Daltonics, V3.1) i vrši se pretraživanje u odnosu na bazu podataka sekvenci korišćenjem Mascot softvera za pretraživanje baza podataka. Fasta baza podataka sekvenci sadrži proteinske sekvence lakog i teškog lanca trastuzumaba sa dodatim kontaminirajućim proteinskim sekvencama (npr. LysC, tripsin i keratini). Pretraživanja se vrše korišćenjem sledećih podešavanja: 0.35 Da tolerancija prekursorske mase, 0.35 Da tolerancija mase jonskog fragmenta, specifičnost tripsina sa najviše 2 pogrešna isecanja, karbamidometilacija (C) kao fiksirana modifikacija. Sledeće modifikacije varijabli su specifikovane: oksidacija (MHW), deamidacija (NQ), karbamilacija (K N-terminus) i acetilacija (proteinski N-terminus). Peptidi sa Mascot jonskim skorovima iznad praga za skor identiteta prihvataju se kao validna identifikacija (stopa lažnog otkrivanja peptida < 1%).
Relativna kvantifikacija
[0340] Za protein teškog lanca trastuzumaba, jedan peptid sa oksidacijom histidina (sekvenca K.FNWYVDGVEVH*NAK.T, sa oksidisanim H11) ekskluzivno se identifikuje u trastuzumab-konjugatu dobijenom bakrom katalisanom konjugacijom 46, ali ni jedan se ne detektuje u drugim uzorcima. Hromatogrami ekstrahovane jonske struje (extracted ion current, EIC) za peptid sa i bez oksidisanog histidina (EIC: 847.46 ± 0.5 m/z, odnosno EIC: 839.97 ± 0.5 m/z) generišu se u DataAnalysis softveru. Pored toga, EIC hromatogrami za sledeća dva peptida koriste se za normalizovanje: -.EVQLVESGGGLVQPGGSLR.L (EIC: 941.6 ± 0.5 m/z) i K.GPSVFPLAPSSK.S (EIC: 593.95 ± 0.5 m/z). Integrisana područja pikova tri ponovljena merenja se uproseče i izraze relativno u odnosu na nativni trastuzumab, ukazujući na to da je gornji fragment sa oksidisaniim histidinom prisutan u količini od 69% od ukupne količine tog određenog fragmenta (31% nemodifikovanog fragmenta). ;[0341] Za protein lakog lanca trastuzumaba, jedan peptid sa oksidacijom metionina (sekvenca - .DIQM*TQSPSSLSASVGDR.V, sa oksidisanim M4) ekskluzivno se identifikuje u trastuzumab-konjugatu dobijenom bakrom katalisanom konjugacijom 46, ali ni jedan se ne detektuje u drugim uzorcima.
Primer 40: Kloniranje i ekspresija GalT mutanata Y289N, Y289F, Y289M, Y289V, Y289A i Y289G i Y2891.
[0342] Geni GalT mutanta se amplifikuju iz konstrukta koji sadrži sekvencu kodirajuću za katalitički domen GalT koja se sastoji od 130-402 aa rezidua, postupkom PCR sa produžavanjem uz preklapanje. Divlji tip enzima predstavljen je SEQ ID NO: 17. Za Y289N mutanta (predstavljen kao SEQ ID NO: 18), prvi DNK fragment se amplifikuje sa parom prajmera: Oligo38_GalT_eksterni_Fw (CAG CGA CAT ATG TCG CTG ACC GCA TGC CCT GAG GAG TCC predstavljen kao SEQ ID NO: 1) i Oligo19_GalT_Y289N_Rw (GAC
1
ACC TCC AAA GTT CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA predstavljen kao SEQ ID NO: 2). Ndel restrikciono mesto je podvučeno, dok je mesto mutacije istaknuto podebljanim slovima. Drugi fragment se amplifikuje parom prajmera: Oligo29_GalT_eksterni_Rw (CTG ATG GAT GGA TCC CTA GCT CGG CGT CCC GAT GTC CAC predstavljen kao SEQ ID NO: 3) i Oligo18_GalT_Y289N_Fw (CCT TAC GTG CAG AAC TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA predstavljen kao SEQ ID NO: 4). BamHI restrikciono mesto je podvučeno, dok je mesto mutacije istaknuto podebljanim slovima. Dva fragmenta generisana u prvom krugu PCR fuzionišu se u drugom krugu korišćenjem prajmera Oligo38_GalT_Eksterni_Fw i Oligo29_GalT_eksterni_Rw. Posle digestije sa Ndel i BamHI. Ovaj fragment se poveže u pET16b vektor isečen istim restrikcionim enzimima. Novokonstruisani ekspresioni vektor sadrži gen koji kodira Y289N mutanta i sekvencu koja kodira His-marker iz pET16b vektora, što je potvrđeno rezultatima sekvenciranja DNK. Za konstruisanje Y289F (predstavljen kao SEQ ID NO: 19), Y289M (predstavljen kao SEQ ID NO: 20), Y289I (predstavljen kao SEQ ID NO: 21), Y289V (predstavljen kao SEQ ID NO: 22), Y289A (predstavljen kao SEQ ID NO: 23) i Y289G (predstavljen kao SEQ ID NO: 24) mutanata koristi se ista procedura, sa mestima mutacije promenjenim u TTT, ATG, ATT, GTG, GCG ili GGC triplete koji kodiraju fenilalanin, metionin, izoleucin, valin, alanin, odnosno glicin. Tačnije, za konstruisanje Y289F prvi DNK fragment se amplifikuje sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 5 i drugi se amplifikuje sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 6 (pogledati Tabelu 1 za odgovarajuće sekvence). Pored toga, za konstruisanje Y289M prvi DNK fragment se amplifikuje sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 7 i drugi se amplifikuje sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 8 (pogledati Tabelu 1 za odgovarajuće sekvence).
[0343] GalT mutanti se eksprimiraju, izoluju i ponovo saviju iz inkluzionih tela u skladu sa procedurom saopštenom u Qasba et al. (Prot. Expr. Pur. 2003, 30, 219-229). Posle ponovnog savijanja, precipitat se ukloni i rastvorljivi i savijeni protein se izoluje korišćenjem Ni-NTA kolone (HisTrap excel 1 mL kolona, GE Healthcare). Posle eluiranja sa 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl i 200 mM imidazola, protein se dijalizuje u odnosu na 25 mM Tris-HCl pH 8.0 i koncentruje do 2 mg/mL korišćenjem spinfiltera (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit sa Ultracel-10 membranom, Merck Millipore).
2
Tabela 1 Identifikacija sekvenci upotrebljenih prajmera
Primer 41: Transfer UDP-GalNAz GalT mutantima Y289N, Y289F i Y289M.
[0344] Enzimsko uvođenje galaktoznog derivata na trastuzumab vrši se jednim od β(1,4)-Gal-T1 mutanata, Y289N, Y289F ili Y289M. Prema tome, deglikozilovani trastuzumab (pripremljen kako je opisano ranije u ovom tekstu, 10 mg/mL) inkubira se sa UDP-N-azidoacetilgalaktozaminom 52 (UDP-GalNAz) (1 mM) i odgovarajućim β(1,4)-Gal-T1 mutantom (0.1 mg/mL) u 10 mM MnCl2i 25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 16 sati na 30 °C.
[0345] Za sva tri mutanta Y289N, Y289F ili Y289M, maseno-spektralna analiza sirove smeše pokazuje čistu konverziju sržnog GlcNAc(Fuc)-supstituisanog trastuzumaba u trastuzumab(GalNAz)2(49713 Da, 90% od ukupne količine teških lanaca).

Claims (15)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Konjugat antitela za upotrebu kao lek, naznačen time, što se konjugat antitela može dobiti postupkom koji uključuje reakciju modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jednu ili više supstanci koje su farmaceutski aktivne, pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo ono antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent, pri čemu je GlcNAc N-acetilglukozamin, S(A)xje šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je pomenuti GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 sržnog N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je pomenuti GlcNAc opciono fukozilovan, pri čemu su jedna ili više farmaceutski aktivnih supstanci citotoksini i pri čemu se antitelo specifično vezuje za kancerski antigen.
  2. 2. Konjugat antitela za upotrebu u lečenju kancera, naznačen time, što je konjugat antitela kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, poželjno pri čemu je kancer kancer dojke.
  3. 3. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačen time, što konjugat antitela utiče na zapreminu tumora.
  4. 4. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što postupak uključuje korake: (i) dovođenje u kontakt antitela koje uključuje sržni N-acetilglukozaminski (GlcNAc) supstituent sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu katalizatora, pri čemu je pomenuti sržni N-acetilglukozaminski supstituent opciono fukozilovan, pri čemu pomenuti katalizator uključuje mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu je S(A)xšećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu se P bira iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), da se dobije modifikovano antitelo, pri čemu se modifikovano antitelo definiše kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)xsupstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)xsupstituenta, i pri čemu je pomenuto modifikovano antitelo u skladu sa Formulom (4): 4
    pri čemu su S(A)xi x kako je definisano ranije u ovom tekstu; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i (ii) reakciju pomenutog modifikovanog antitela sa linkerskim konjugatom, pri čemu pomenuti linkerski konjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više citotoksina.
  5. 5. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno pri čemu se katalizator bira iz grupe koja se sastoji od GalT Y289L, GalT Y289N i GalT Y289I ili se bira iz grupe koja se sastoji od GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A.
  6. 6. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je (hetero)cikloalkinil grupa (hetero)ciklooktinil grupa.
  7. 7. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je konjugat antitela u skladu sa Formulom (20) ili (20b):
    pri čemu: - L je linker; - D je citotoksin; - r je 1 - 20; - R<1>se bira nezavisno iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NOz, -CN, -S(O)2R<5>, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe opciono supstituisane, pri čemu dva R<1>supstituenta mogu biti povezana da formiraju fuzionisani cikloalkil ili fuzionisani (hetero)aren supstituent, i pri čemu se R<5>bira nezavisno iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1-C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa; - X je C(R<1>)2, O, S ili NR<2>, pri čemu je R<2>R<1>ili L(D)r, i pri čemu su L, D i r kao što je definisano ranije u ovom tekstu; - q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q 0 onda je X N-L(D)r; - b je 0 ili 1; - p je 0 ili 1; - Q je -N(H)C(O)CH2- ili -CH2-; - x je 1, 2, 3 ili 4; - y je 1 - 20; - AB je antitelo; - S je šećer ili derivat šećera; - GlcNAc je N-acetilglukozamin; i - Fuc je fukoza, i pri čemu: - u Formuli (20), a je 4, 5, 6 ili 7; i - u Formuli (20b): - a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7; - a’ je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7; i - a+a’ je 4, 5, 6 ili 7, poželjno pri čemu je u Formuli (20) a 5, i u Formuli (20b) a+a’ je 5.
  8. 8. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, naznačen time, što konjugat antitela ima Formulu (15b), (21) ili (22):
    pri čemu: - AB, GlcNAc, Fuc, L, D, S, Q, x, y, b, p, r, R<1>i su kako je definisano u patentnom zahtevu 7; - Y je O, S ili NR<2>, pri čemu je R<2>kako je definisano u patentnom zahtevu 7; - R<3>se nezavisno bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7-C24(hetero)arilalkil grupa; - R<4>se bira iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)r, -(CH2)n-Y-L(D)r, halogena, C1- C24alkil grupa, C6- C24(hetero)aril grupa, C7- C24alkil(hetero)aril grupa i C7- C24(hetero)arilalkil grupa, alkil grupe su opciono prekinute jednim ili više heteroatoma odabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno opciono supstituisane; i - n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
  9. 9. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnim zahtevima 7 ili 8, naznačen time, što: - y je 1, 2, 3 ili 4, poželjno y je 1 ili 2; - x je 1 ili 2, poželjno x je 1; i - r je 1, 2, 3 ili 4, poželjno r je 1 ili 2, poželjnije pri čemu je x 1, y je 1 i r je 1, ili x je 1, y je 2 i r je 1, ili x je 2, y je 2 i r je 1.
  10. 10. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je farmaceutski aktivna supstanca citotoksin odabran iz grupe koja se sastoji od kamptotecina, doksorubicina, daunorubicina, taksana, kaliheamicina, duokarmicina, majtanzina, majtanzinoida, auristatina i pirolobenzodiazepina, najpoželjnije majtanzin ili monometil auristatin E (MMAE).
  11. 11. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što se antitelo bira između humanih antitela, humanizovanih antitela i himernih antitela.
  12. 12. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je antitelo trastuzumab i supstanca koja je farmaceutski aktivna je citotoksin koji se bira između majtanzinoida, auristatina E, auristatina F, duokarmicina ili pirolobenzodiazepina.
  13. 13. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je linker isecajući, poželjno pri čemu isecajući linker sadrži samorazgrađujuću komponentu koja se oslobađa posle dejstva biološkog okidača, poželjno enzimskim isecanjem ili oksidacionim događajem.
  14. 14. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time, što je konjugat antitela homogen po specifičnosti mesta i stehiometriji, pri čemu se konjugacija vrši samo na unapred određenom mestu i sa unapred određenim odnosom leka prema antitelu.
  15. 15. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, naznačen time, što je DAR u okviru 10% od svoje teorijske vrednosti, poželjno, pri čemu je DAR 2, 4 ili 8.
RS20230519A 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovo pripremanje RS64329B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261717187P 2012-10-23 2012-10-23
EP12189604 2012-10-23
EP13188607 2013-10-14
EP21171679.0A EP3912642B1 (en) 2012-10-23 2013-10-23 Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS64329B1 true RS64329B1 (sr) 2023-08-31

Family

ID=50544942

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180180A RS56953B2 (sr) 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu
RS20230519A RS64329B1 (sr) 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovo pripremanje

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180180A RS56953B2 (sr) 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu

Country Status (17)

Country Link
US (4) US10745488B2 (sr)
EP (3) EP2911699B2 (sr)
JP (3) JP6855661B2 (sr)
CN (2) CN110201186A (sr)
CY (1) CY1120041T1 (sr)
DK (2) DK2911699T4 (sr)
ES (2) ES2659270T5 (sr)
FI (2) FI3912642T3 (sr)
HR (2) HRP20180268T4 (sr)
HU (2) HUE038285T2 (sr)
LT (2) LT2911699T (sr)
PL (2) PL2911699T5 (sr)
PT (1) PT2911699T (sr)
RS (2) RS56953B2 (sr)
SI (2) SI3912642T1 (sr)
SM (2) SMT201800096T1 (sr)
WO (1) WO2014065661A1 (sr)

Families Citing this family (187)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10745488B2 (en) * 2012-10-23 2020-08-18 Synaffix B.V. Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof
EA038512B1 (ru) 2013-03-15 2021-09-08 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Конъюгаты майтанзиноидов и их терапевтическое применение
LT2991683T (lt) * 2013-05-02 2019-12-27 Glykos Finland Oy Glikoproteino arba glikano konjugatai su toksine medžiaga
US20160354482A1 (en) 2013-08-26 2016-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
JP2016538877A (ja) 2013-10-14 2016-12-15 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾糖タンパク質、タンパク質コンジュゲート及びそれらの調製方法
WO2015057066A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
EP3058083B1 (en) 2013-10-14 2018-04-11 SynAffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
EP3079668A1 (en) 2013-12-09 2016-10-19 Durect Corporation Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same
EP3925951A1 (en) 2014-01-24 2021-12-22 SynAffix B.V. Process for the cycloaddition of a(hetero)aryl 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
US10266502B2 (en) 2014-01-24 2019-04-23 Synaffix B.V. Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
AU2015243512B2 (en) 2014-04-08 2020-06-04 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
DK3160513T3 (da) 2014-06-30 2020-04-06 Glykos Finland Oy Saccharidderivat af en toksisk payload og antistofkonjugater deraf
EP2974744A1 (en) 2014-07-16 2016-01-20 Stichting Katholieke Universiteit Strain-promoted oxidation controlled cycloaddition with high reaction rate
JP2017528124A (ja) * 2014-08-04 2017-09-28 シンアフィックス ビー．ブイ． ベータ−（１，４）−ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体を用いる糖タンパク質の改変方法
WO2016053107A1 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation
BR112017011773A2 (pt) * 2014-12-04 2018-02-20 Celgene Corporation composto isolado, conjugados isolados, composiçôes farmacêuticas, e métodos de tratamento de um distúrbio em um mamífero
US20170369525A1 (en) * 2014-12-31 2017-12-28 Development Center For Biotechnology Site-specific conjugation through glycoproteins linkage and method thereof
US11559581B2 (en) * 2015-01-09 2023-01-24 Oxford University Innovation Limited Antibody conjugates and methods of making the antibody conjugates
KR102708103B1 (ko) 2015-03-27 2024-09-20 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 이의 컨주게이트, 및 사용 방법
ES2995336T3 (en) 2015-04-23 2025-02-10 Synaffix Bv Process for the modification of a glycoprotein using a glycosyltransferase that is or is derived from a beta-(1,4)-n-acetylgalactosaminyltransferase
WO2016172615A1 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 University Of Delaware Synthetic n-acetyl-muramic acid derivatives and uses thereof
ES2971045T3 (es) 2015-07-06 2024-06-03 Regeneron Pharma Moléculas multiespecíficas de unión a antígeno y usos de las mismas
WO2017032888A1 (en) * 2015-08-26 2017-03-02 Vib Vzw Means and methods for monitoring inflammation
KR20180058737A (ko) * 2015-10-07 2018-06-01 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 암 선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거-활성화 대사성 당 전구체
CN107043406B (zh) 2015-11-03 2021-08-17 财团法人工业技术研究院 化合物、连接子-药物、及配体-药物耦合体
AU2016366521A1 (en) 2015-12-11 2018-06-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to EGFR and/or ErbB3 blockade
CN108779127B (zh) 2016-01-25 2022-07-05 里珍纳龙药品有限公司 美登素类化合物衍生物、其偶联物和使用方法
CN108495653A (zh) 2016-01-27 2018-09-04 免疫医疗有限责任公司 用于制备具有定义的糖基化模式抗体的方法
EP4438727A3 (en) 2016-02-08 2025-02-12 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
WO2017137457A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
JP2017200902A (ja) * 2016-02-08 2017-11-09 シンアフィックス ビー．ブイ． Ｈｅｒ２腫瘍を標的化するための改善された治療指数を有する新規な抗体−コンジュゲート及び抗体−コンジュゲートの治療指数を改善するための方法
EP3413916A1 (en) * 2016-02-08 2018-12-19 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
US11951175B2 (en) 2016-02-08 2024-04-09 Synaffix B.V. Bioconjugates containing sulfamide linkers for use in treatment
US11338043B2 (en) 2016-02-08 2022-05-24 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting HER2 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137423A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Improved sulfamide linkers for use in bioconjugates
JP2017197512A (ja) * 2016-02-08 2017-11-02 シンアフィックス ビー．ブイ． Ｃｄ３０腫瘍を標的化するための改善された治療指数を有する新規な抗体−コンジュゲート及び抗体−コンジュゲートの治療指数を改善するための方法
DK3423105T3 (da) 2016-03-02 2021-07-26 Eisai R&D Man Co Ltd Antistof-lægemiddelkonjugater på basis af eribulin og fremgangsmåder til anvendelse heraf
US11352446B2 (en) 2016-04-28 2022-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
JP7020403B2 (ja) 2016-05-02 2022-02-16 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
WO2017218891A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Life Technologies Corporation Site-specific crosslinking of antibodies
CN121021395A (zh) 2016-06-28 2025-11-28 文塔纳医疗系统公司 点击化学用于ihc和ish测定中的信号扩增的应用
TW201811376A (zh) 2016-07-01 2018-04-01 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產權有限公司 抗體-藥物結合物及使用其之治療方法
CN109462989A (zh) * 2016-07-01 2019-03-12 第三共株式会社 Hanp-含fc分子缀合物
CA3037732A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
SG10202104259RA (en) 2016-11-08 2021-06-29 Regeneron Pharma Steroids and protein-conjugates thereof
WO2018090045A1 (en) * 2016-11-14 2018-05-17 Cho Pharma Inc Antibody-drug conjugates
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
CA3048452C (en) * 2016-12-29 2021-06-15 Development Center For Biotechnology Processes for preparing glycoprotein-drug conjugates
WO2018141959A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
KR20190126314A (ko) 2017-02-10 2019-11-11 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 암-선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거 활성화 가능한 당 접합체
US11891451B2 (en) 2017-05-11 2024-02-06 Vib Vzw Glycosylation of variable immunoglobulin domains
CN111065622A (zh) 2017-05-18 2020-04-24 里珍纳龙药品有限公司 双八氢菲羧酰胺类化合物及其蛋白质偶联物
KR20200007905A (ko) 2017-05-18 2020-01-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이클로덱스트린 단백질 약물 접합체
WO2018226861A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
AU2018315154B2 (en) 2017-08-09 2022-11-10 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH New targeted cytotoxic ratjadone derivatives and conjugates thereof
EP3441766B1 (en) * 2017-08-11 2020-03-11 Life Science Inkubator Sachsen GmbH & Co. KG Novel antibody conjugates suitable for use in discrete fluorescence quenching displacement immunoassays
IL301636B2 (en) 2017-09-29 2025-02-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugation of an antibody with a pyrrolobenzodiazepine derivative
EP3706805A2 (en) 2017-11-07 2020-09-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hydrophilic linkers for antibody drug conjugates
MX2020005473A (es) 2017-11-27 2020-08-27 Purdue Pharma Lp Anticuerpos humanizados que se dirigen al factor tisular humano.
CN111683686A (zh) * 2017-12-06 2020-09-18 西纳福克斯股份有限公司 烯二炔缀合物
BR112020013198A2 (pt) 2017-12-29 2020-12-01 Glycomimetics, Inc. inibidores heterobifuncionais de e-selectina e galectina-3
MA50259A1 (fr) 2018-01-08 2021-07-29 Regeneron Pharma Stéroïdes et leurs conjugués-anticorps
KR102871690B1 (ko) 2018-04-30 2025-10-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Her2 및/또는 aplp2에 결합하는 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자 및 접합체 그리고 이들의 용도
CA3098453A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-msr1 antibodies and methods of use thereof
KR20250140631A (ko) 2018-05-17 2025-09-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-cd63 항체, 콘쥬게이트, 및 이의 용도
JP2019206491A (ja) * 2018-05-29 2019-12-05 国立研究開発法人理化学研究所 乳がんまたは胃がんの治療のための抗体−薬物複合体
ES2995219T3 (en) * 2018-06-15 2025-02-07 Shanghai Miracogen Inc Methods and materials for treating cancer
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
KR20210081322A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
CA3108335A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes and uses thereof
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US20220193250A1 (en) 2018-08-02 2022-06-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2020028861A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US12370264B1 (en) 2018-08-02 2025-07-29 Dyne Therapeutics, Inc. Complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and method of delivering oligonucleotide to a subject
WO2020094670A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
KR20210094568A (ko) 2018-11-20 2021-07-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Lxr 작용물질로서 사용하기 위한 비스-옥타하이드로펜안트렌 카복스아미드 유도체 및 그의 단백질 접합체
CN113454097B (zh) 2018-12-21 2024-08-30 里珍纳龙药品有限公司 微管溶素及蛋白质-微管溶素偶联物
PH12021551476A1 (en) 2018-12-21 2022-04-25 Regeneron Pharma Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
US11845771B2 (en) 2018-12-27 2023-12-19 Glycomimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of E-selectin and galectin-3
CA3122321A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Glycomimetics, Inc. Galectin-3 inhibiting c-glycosides
SG11202107212QA (en) 2019-01-08 2021-07-29 Regeneron Pharma Traceless linkers and protein-conjugates thereof
GB201901608D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Vib Vzw Vaccine adjuvant conjugates
CN113727757A (zh) 2019-02-21 2021-11-30 瑞泽恩制药公司 使用结合met的抗-met抗体和双特异性抗原结合分子治疗眼癌的方法
WO2020196474A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CA3191804A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CA3139180A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate and parp inhibitor
WO2020245229A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Synaffix B.V. Acetal-based cleavable linkers
MX2022002886A (es) 2019-09-16 2022-04-06 Regeneron Pharma Proteinas de union met radiomarcadas para la obtencion de imagenes por inmuno-pet.
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
AU2019341067B2 (en) * 2019-09-29 2021-08-05 Mabplex International Co., Ltd. Method for producing antibody-drug conjugate intermediate by addition of acid and use thereof
GB201917388D0 (en) * 2019-11-28 2020-01-15 Cambridge Entpr Ltd Novel linker compounds
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
JP2023510349A (ja) * 2020-01-09 2023-03-13 メルサナ セラピューティクス インコーポレイテッド ペプチド含有リンカーとの部位特異的抗体－薬物コンジュゲート
CN115768483A (zh) * 2020-01-13 2023-03-07 西纳福克斯股份有限公司 抗体与免疫细胞衔接器的缀合物
CN115666656A (zh) 2020-01-13 2023-01-31 西纳福克斯股份有限公司 通过环加成双侧功能化抗体
CN115243727A (zh) 2020-01-13 2022-10-25 西纳福克斯股份有限公司 经由环加成的双侧官能化抗体
PH12022551810A1 (en) 2020-01-24 2024-02-19 Regeneron Pharma Protein-antiviral compound conjugates
WO2021174113A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind her2, and methods of use thereof
KR20230004651A (ko) 2020-04-16 2023-01-06 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 딜스-알더 접합 방법
WO2021231798A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Disc Medicine, Inc. Anti-hemojuvelin (hjv) antibodies for treating myelofibrosis
CN115697405A (zh) 2020-05-25 2023-02-03 公益财团法人神户医疗产业都市推进机构 用于治疗或预防Th2介导的疾病的含有PD-1激动剂的药物组合物
CN111560078A (zh) * 2020-06-19 2020-08-21 联宁（苏州）生物制药有限公司 具有马来酰亚胺接头的双臂中间体及其合成方法
JP2023533218A (ja) 2020-06-24 2023-08-02 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド ツブリシン及びタンパク質－ツブリシンコンジュゲート
EP4172141A1 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Synaffix B.V. Methods for the preparation of linker payload constructs
EP4178625A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
NL2026400B1 (en) * 2020-09-02 2022-05-04 Synaffix Bv Methods for the preparation of bioconjugates
EP4210767A1 (en) 2020-09-14 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
WO2022058395A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Synaffix B.V. Antibody-exatecan conjugates
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
MX2023004395A (es) 2020-10-16 2023-05-22 Univ Georgia Glicoconjugados.
NZ797493A (en) 2020-10-22 2024-05-31 Regeneron Pharma Anti-fgfr2 antibodies and methods of use thereof
NL2026947B1 (en) 2020-11-20 2022-07-01 Synaffix Bv Tyrosine-based antibody conjugates
WO2022136705A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Synaffix B.V. Glycan-conjugated antibodies binding to fc-gamma receptor
EP4271816A4 (en) 2020-12-31 2025-04-02 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND RELATED USES FOR THE TREATMENT OF MYOTONIC DYSTROPHY
JP2024506022A (ja) 2021-02-08 2024-02-08 シンアフィックス ビー．ブイ． 多機能性抗体
WO2022217022A1 (en) 2021-04-10 2022-10-13 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
US20250066490A1 (en) 2021-04-23 2025-02-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
US11672872B2 (en) 2021-07-09 2023-06-13 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor antibody and uses thereof
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3226366A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating dystrophinopathies
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
CA3220081A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Thomas Nittoli Protein-antiviral compound conjugates
CN118119633A (zh) * 2021-10-20 2024-05-31 岩唐生物科技(杭州)有限责任公司 位点特异性糖蛋白偶联物及其制备方法
KR102782629B1 (ko) * 2021-11-12 2025-03-19 닥터아이앤비(주) 생산 시간을 단축하고 안정성이 개선된 의약품 제조방법
EP4433160A1 (en) 2021-11-17 2024-09-25 Disc Medicine, Inc. Methods for treating anemia of kidney disease
WO2023129518A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
CA3241734A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Amy Han Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
CA3242639A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verrucarin A derivatives and their antibody-drug conjugates
US20250222124A1 (en) * 2022-01-27 2025-07-10 Glyco-Therapy Biotechnology Co., Ltd. Protein conjugates with multiple payloads and methods for making the same
AU2023223557A1 (en) 2022-02-22 2024-10-03 Adc Therapeutics Sa Conjugation method involving a transglutaminase at the fc region comprising a trimmed n-glycan
CA3243669A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ANTI-GLP1R ANTIBODY-DRUG CONJUGATES INCLUDING GLP1 PEPTIDOMIMETS AND THEIR USES
EP4496593A1 (en) 2022-03-23 2025-01-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing nectin-4
AU2023241225A1 (en) 2022-03-23 2024-08-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
EP4496595A1 (en) 2022-03-23 2025-01-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
JP2025510623A (ja) 2022-03-23 2025-04-15 シンアフィックス ビー．ブイ． Ｐｔｋ７を発現する腫瘍を標的化するための抗体コンジュゲート
KR20250004770A (ko) 2022-04-15 2025-01-08 다인 세라퓨틱스, 인크. 근긴장성 이영양증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제
EP4285934A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 CER Groupe Modified trimannose-oligosacharides, bisected n-glycans comprising said trimannose core and method for obtaining them
KR20250069711A (ko) 2022-07-21 2025-05-19 파이어플라이 바이오, 인크. 글루코코르티코이드 수용체 작용제 및 이의 접합체
CN119997985A (zh) 2022-08-15 2025-05-13 西纳福克斯股份有限公司 蒽环类药物及其缀合物
EP4344707A1 (en) 2022-09-29 2024-04-03 Emergence Therapeutics AG New anti-nectin-4 antibody drug conjugates
AU2023403422A1 (en) 2022-11-30 2025-07-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tlr7 agonists and antibody-drug-conjugates thereof
WO2024121123A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Synaffix B.V. Synthesis of endo-bicyclononene
CN120752059A (zh) 2022-12-21 2025-10-03 瑞泽恩制药公司 用于adc缀合的拓扑异构酶i抑制剂的前药及其使用方法
AU2023409727A1 (en) * 2022-12-22 2025-08-07 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of preparing antibody-polynucleotide conjugates
EP4389152A1 (en) 2022-12-23 2024-06-26 Synaffix B.V. Conjugates of pbd prodrugs
WO2024150074A2 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Coronavirus antibodies and therapeutic uses thereof
TW202434309A (zh) 2023-01-19 2024-09-01 大陸商上海盛迪醫藥有限公司 酪胺酸酶介導的蛋白定點偶聯及其應用
EP4410313A1 (en) 2023-01-31 2024-08-07 Synaffix B.V. Homogeneous antibody-conjugates with high payload loading
WO2024168199A1 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates via inverse electron demand diels-alder reactions
EP4673469A1 (en) 2023-03-02 2026-01-07 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-cd22 antibodies and uses thereof
CN121002057A (zh) * 2023-03-30 2025-11-21 启德医药科技（苏州）有限公司 二糖接头、含有该二糖接头的接头-有效载荷以及聚糖链重构的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN120981487A (zh) * 2023-03-30 2025-11-18 启德医药科技（苏州）有限公司 位点特异性正交生物偶联模式及其应用
WO2024218162A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Synaffix B.V. Cleavable immune cell engagers
EP4450093A1 (en) 2023-04-17 2024-10-23 Synaffix B.V. Cleavable immune cell engagers
EP4450489A1 (en) 2023-04-18 2024-10-23 Synaffix B.V. Stable 4-isoxazoline conjugates
AU2024265507A1 (en) 2023-05-02 2025-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
EP4709751A1 (en) 2023-05-08 2026-03-18 Sanofi Glycosylation of immunoglobulin single variable domains
WO2024251826A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Vib Vzw Glyco-engineered antibody-drug-conjugates comprising an oxime linker
CN121568720A (zh) 2023-07-10 2026-02-24 瑞泽恩制药公司 抗人类cacng1抗体-药物缀合物及其用途
CN121752581A (zh) * 2023-07-10 2026-03-27 杭州瑞奥生物医药有限公司 功能化的奥瑞他汀类、药物组合物和治疗应用
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
WO2025027529A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Advesya Anti-il-1rap antibody drug conjugates and methods of use thereof
US20250115680A1 (en) 2023-09-26 2025-04-10 Profoundbio Us Co. Ptk7 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
EP4541376A1 (en) 2023-10-17 2025-04-23 ADC Therapeutics SA Antibody-drug conjugates
US20250171516A1 (en) 2023-11-03 2025-05-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide acids as a glp1r agonist and antibody-drug conjugates thereof
WO2025117727A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Analogs of quinoxaline/quinoline cytotoxins, linker- payloads, protein-drug conjugates, and uses thereof
TW202530255A (zh) 2023-12-15 2025-08-01 法商亞維西亞有限公司 抗ｉｌ－１ｒａｐ結合結構域及其抗體－藥物偶聯物
EP4574174A1 (en) 2023-12-19 2025-06-25 Jack Elands Novel antibody-drug conjugates comprising an anti-(tcr)-cd3-complex binding antibody
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025163120A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Adcytherix Sas ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING AN ANTI-INTEGRIN ΑVβ6 BINDING ANTIBODY
WO2025172468A1 (en) 2024-02-13 2025-08-21 Synaffix B.V. Method for producing azido-sugars and compounds obtained thereby
US20250381289A1 (en) 2024-02-29 2025-12-18 Genmab A/S Egfr and c-met bispecific binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2025238253A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Synaffix B.V. Antibody-oligonucleotide conjugates
WO2025262641A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates that bind cdcp1 and uses thereof
WO2026006495A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-wt1/hla-a2 antibody and uses thereof
WO2026006494A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies and uses thereof
WO2026006492A2 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Ypsilon Therapeutics, Inc. Anti-prame/hla-a2 antibodies and uses thereof
WO2026008881A1 (en) 2024-07-05 2026-01-08 Synaffix B.V. Extracellular vesicles comprising biomolecule-conjugates
US20260078179A1 (en) 2024-07-18 2026-03-19 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Cdh17 antibodies and uses thereof
WO2026035986A1 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Bighat Biosciences, Inc. Humanized anti-cdh17 antibodies and use of the same
WO2026039642A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Ardeagen Corporation Anti-mesothelin antibody conjugates and methods of use thereof
WO2026052513A1 (en) 2024-09-09 2026-03-12 Adcytherix Sas Antibody-drug conjugates comprising an flt3 binding antibody

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI20011671L (fi) 2001-08-20 2003-02-21 Carbion Oy Tuumorispesifiset oligosakkaridisekvenssit ja niiden käyttö
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
CA2510550A1 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Pradman Qasba Catalytic domains of .beta./1,4)-galactosyltransferase i having altered donor and acceptor specificities, domains that promote in vitro protein folding, and methods for their use
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
CA2536882C (en) 2003-10-29 2009-12-15 Bsn Medical, Inc. Medical bandaging product
US7332355B2 (en) * 2003-11-18 2008-02-19 California Institute Of Technology Method and compositions for the detection of protein glycosylation
US20070258986A1 (en) * 2003-11-19 2007-11-08 Govt of the US as represented by the secretary, Targeted Delivery System for Bioactive Agents
JP4521490B2 (ja) * 2003-11-21 2010-08-11 国立大学法人高知大学 類似パターン検索装置、類似パターン検索方法、類似パターン検索プログラム、および分画分離装置
WO2005056783A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase i having altered metal ion specificity
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
US8431558B2 (en) 2004-11-01 2013-04-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
JP2009531289A (ja) * 2006-02-10 2009-09-03 ライフ テクノロジーズ コーポレーション オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
EP1987068B1 (en) * 2006-02-10 2018-08-08 Life Technologies Corporation Oligosaccharide modification and labeling of proteins
CA2647632C (en) 2006-03-27 2017-06-27 University Of Maryland Biotechnology Institute Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
WO2008143944A2 (en) * 2007-05-14 2008-11-27 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of glycosylation and bioconjugation
WO2009025645A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta 1,4-galactosyltransferases with altered donor and acceptor specificities, compositions and methods of use
US8425901B2 (en) 2007-08-22 2013-04-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Alpha 1-3 N-galactosyltransferase with altered donor specificities
DK2222341T3 (en) 2007-11-21 2015-03-09 Univ Georgia AND METHODS alkynes of reacting alkynes of 1,3-dipole FUNCTIONAL COMPOUNDS
WO2009102820A2 (en) * 2008-02-11 2009-08-20 Government Of The U.S A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified sugar substrates and methods of use
US7914904B2 (en) * 2008-03-25 2011-03-29 General Electric Company Component in a combustion system, and process for preventing slag, ash, and char buildup
JP5841072B2 (ja) * 2010-02-10 2016-01-06 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ｃｄ２０抗体およびその使用
US8519122B2 (en) 2010-02-12 2013-08-27 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
CN107235828B (zh) 2010-04-27 2024-06-07 西纳福克斯股份有限公司 稠合的环辛炔化合物及其在无金属点击反应中的应用
EP2383374A1 (en) * 2010-04-29 2011-11-02 BASF Corporation Nano-particles containing carbon and a ferromagnetic metal or alloy
EP2966061B1 (en) 2011-03-04 2017-05-03 Life Technologies Corporation Compounds and methods for conjugation of biomolecules
WO2012134925A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Life Technologies Corporation Heterobifunctional esters for use in labeling target molecules
PH12013501942A1 (en) * 2011-04-01 2019-11-29 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates
GB201115841D0 (en) 2011-09-13 2011-10-26 Genovis Ab Protein and method
US10745488B2 (en) 2012-10-23 2020-08-18 Synaffix B.V. Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PL2911699T5 (pl) 2025-12-22
HUE038285T2 (hu) 2018-10-29
CN105142672A (zh) 2015-12-09
EP3912642A1 (en) 2021-11-24
SI2911699T2 (sl) 2026-01-30
JP6855661B2 (ja) 2021-04-07
WO2014065661A1 (en) 2014-05-01
JP2023017820A (ja) 2023-02-07
JP2020090526A (ja) 2020-06-11
HRP20180268T4 (hr) 2026-03-27
US20150258210A1 (en) 2015-09-17
JP2015534996A (ja) 2015-12-07
JP7167071B2 (ja) 2022-11-08
LT2911699T (lt) 2018-03-26
US10745488B2 (en) 2020-08-18
FI3912642T3 (fi) 2023-07-07
US20250177554A1 (en) 2025-06-05
RS56953B2 (sr) 2026-02-27
PL2911699T3 (pl) 2018-04-30
ES2659270T3 (es) 2018-03-14
ES2949376T3 (es) 2023-09-28
US12194107B2 (en) 2025-01-14
CN105142672B (zh) 2019-04-05
HRP20180268T1 (hr) 2018-03-23
HRP20230690T1 (hr) 2023-10-13
JP7741788B2 (ja) 2025-09-18
US20210163623A1 (en) 2021-06-03
DK2911699T4 (da) 2025-12-08
EP2911699A1 (en) 2015-09-02
EP3912642B1 (en) 2023-04-12
ES2659270T5 (en) 2026-02-11
EP2911699B1 (en) 2017-11-15
EP3912642A8 (en) 2022-01-05
SMT202300208T1 (it) 2023-09-06
LT3912642T (lt) 2023-07-25
RS56953B1 (sr) 2018-05-31
SMT201800096T1 (it) 2018-05-02
EP2911699B2 (en) 2025-09-10
US9504758B2 (en) 2016-11-29
EP3335733A1 (en) 2018-06-20
PT2911699T (pt) 2018-02-23
DK3912642T3 (da) 2023-06-26
US20150320882A1 (en) 2015-11-12
CN110201186A (zh) 2019-09-06
HUE062385T2 (hu) 2023-10-28
SI3912642T1 (sl) 2023-09-29
PL3912642T3 (pl) 2023-08-14
CY1120041T1 (el) 2018-12-12
DK2911699T3 (en) 2018-02-12
FI2911699T4 (fi) 2025-12-09
SI2911699T1 (en) 2018-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250177554A1 (en) Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof
CN105814213B (zh) 经修饰的糖蛋白、蛋白质-缀合物及其制备方法
WO2022037665A1 (en) Site-specific antibody conjugates and the methods for preparation of the same
CN105829543B (zh) 糖基改造的抗体、抗体-缀合物及其制备方法
EP3057618B1 (en) Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
CN118541380A (zh) 具有多种载荷的蛋白偶联物及其制备方法