RS56953B2 - Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu - Google Patents

Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu

Info

Publication number
RS56953B2
RS56953B2 RS20180180A RSP20180180A RS56953B2 RS 56953 B2 RS56953 B2 RS 56953B2 RS 20180180 A RS20180180 A RS 20180180A RS P20180180 A RSP20180180 A RS P20180180A RS 56953 B2 RS56953 B2 RS 56953B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
group
hetero
glcnac
leu
Prior art date
Application number
RS20180180A
Other languages
English (en)
Inventor
Delft Floris Louis Van
Geel Remon Van
Maria Antonia Wijdeven
Original Assignee
Synaffix Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50544942&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS56953(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Synaffix Bv filed Critical Synaffix Bv
Publication of RS56953B1 publication Critical patent/RS56953B1/sr
Publication of RS56953B2 publication Critical patent/RS56953B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] Tehnička oblast pronalaska
[0005] Predmetni pronalazak se odnosi na modifikovana antitela koja specifično vezuju antigen kancera konjugovan za citotoksin kao aktivnu supstancu da bi se formirao konjugat antitela za upotrebu kao lek. Pronalazak se prema tome takođe odnosi na konjugate antitela i leka (ADCs) za upotrebu kao lek. Prijava dalje otkriva postupak za pripremu modifikovanih antitela prema pronalasku, i postupak za pripremu konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku.
[0007] Osnova pronalaska
[0009] Konjugati antitela, tj antitela konjugovana sa molekulom od interesa preko linkera, su poznati u stanju tehnike. Postoji veliki interes za konjugatima antitela u kojima je molekul od intersa – lek, na primer citotoksična hemikalija. Konjugati antitela i leka su poznati u stanju tehnike, i sastoje se od rekombinantnog antitela kovalentno vezanog za citotoksičnu hemikaliju preko sintetičkog linkera (S.C. Alley et al, Curr. Opin. Chem. Biol.2010, 14, 529-537). Glavni cilj konjugata antitela i leka (ADC), takođe označenog kao imunotoksin, je kombinovanje visoke specifičnosti monoklonskog antitela za antigen povezan sa tumorom sa farmakološkom potencijom "malog" citotoksičnog leka (tipično 300 do 1,000 Da). Primeri ADCs obuhvataju gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg; anti-CD33 mAb konjugovano sa kalihemicinom, Pfizer/Wyeth); brentuksimab vedotin (SGN-35, Adcetris, ADC koji ciljno deluje na CD30i koji se sastoji od brentuksimaba, kovalentno vezan za MMAE (monometilauristatin), Seattle Genetics); trastuzumab-DM1 konjugat (T-DM1).
[0010] Jedna prednost u oblasti obuhvata pojavu ekstremno potentnih toksina, naročito taksana, kalihemicina, majtanzina, pirolobenzodiazepina, duokarmicina i auristatina. Niska nanomolarna do pikomolarna toksičnost ovih supstanci je glavno pokretačko poboljšanje u odnosu na ranije primenjene toksine. Sledeća važna tehnološka prednost obuhvata upotrebu optimizovanih linkera koji se mogu hidrolizovati u citoplazmi, koji su otporni ili podložni delovanju proteaza, ili otporni na efluksne pumpe sa koje omogućvaju rezistenciju na više lekova koja je povezana sa visoko toksičnim lekovima.
[0011] ADCs poznati iz prethodne tehnike uobičajeno su pripremljeni konjugacijom linkeratoksina sa aminokiselinom lizin ili cistein bočnog lanca antitela, acilacijom ili alkilacijom, respektivno.
[0012] Za lizine, konjugacija se poželjno dešava na bočnim lancima lizina sa najvećim steričkim pristupom, najnižim pKa, ili njihovom kombinacijom. Nedostatak ovog postupka je da je kontrola mesta konjugacije niska.
[0013] Bolja kontrola specifičnosti za mesto dobija se alkilacijom cisteina, na osnovu činjenice da u antitelu tipično nisu prisutni slobodni cisteini, čime se nudi mogućnost alkilacije samo onih cisteina koji su selektivno oslobođeni korakom redukcije ili specifično dobijeni inženjeringom u antitelu kao slobodni cisteini (kao u takozvanim Thiomabs). Selektivno oslobađanje cisteina redukcijom tipično se izvodi tretmanom celog antitela sa redukujućim sredstvom (npr. TCEP ili DTT), što dovodi do konverzije disulfidne veze u dva slobodna tiola (pretežno u zglobnom regionu antitela). Oslobođeni tioli su zatim alkilovani sa elektrofilnim reagensom, tipično zasnovanim na maleimidom vezanim sa linker-toksinom, što se generalno odvija brzo i sa visokom selektivnošću. U odnosu na inženjering dodatnog (slobodnog) cisteina u antitelu, poboljšana kontrola mesta je postignuta u odnosu na lokaciju dodatog cisteina (ili više njih) i nije neophodan reduktivni korak, čime se u idealnom slučaju izbegava višestruko cepanje disulfidnih veza i višestruka alkilacija. Takođe u ovoj strategiji alkilacija slobodnih cisteina je postignuta sa maleimidnom hemijom, ali nije postignuta potpuna homogenost.
[0014] Istovremeno, nedostatak ADCs dobijenih preko alkilacije sa maleimidima je u tome što su generalno rezultujući konjugati nestabilni usled reverzije alkilacije, tj. retro-Michael reakcije, što vodi oslobađanju linker-toksina sa antitela. Konjugacija zasnovana na cisteinmaleimid alkilaciji očigledno nije idealna tehnologija za razvoj ADCs koji poželjno ne treba da pokazuju prerano oslobađanje toksina.
[0015] U tehnici je poznato da azidi (N3 grupe, takođe označene kao azido grupe) mogu podleći selektivnoj cikloadiciji sa terminalnim alkinima (uz bakar kao katalizator) ili sa cikličnim alkinima (preko tenzije prstena). Triazoli koji rezultuju iz reakcije sa alkinima nisu podložni hidrolizi ili drugim putevima degradacije. Takođe je poznato u tehnici da ketoni mogu podleći selektivnoj konjugaciji sa hidroksilaminima ili hidrazinima, što rezultuje respektivno u oksimima ili hidrazonima. Oksimi i hidrazoni su takođe relativno inertni u neutralnim uslovima ali mogu podleći hidrolizi na nižem pH.
[0016] Nekoliko postupaka za introdukciju azida u protein je nedavno dato pregledno od strane Delft et al., ChemBioChem. 2011, 12, 1309: (a) hemoselektivna diazo transfer reakcija, (b) enzimska konverzija, (c) ekspresija u auksotrofnim bakterijama i (d) genetičko kodiranje.
[0017] Reakcije hemoselektivnog diazo transfera (a) imaju ograničenu primenu za antitela jer se tipično odigravaju na N-terminusu proteina, dok su u antitelima N-terminusa i teškog i lakog lanca u vezujućem regionu antitela. Ekspresija u auksotrofnim bakterijama (c) i genetičko kodiranje (d) su, iako moćne, veoma kompleksne strategije za nespecijalizovane laboratorije i dodatno se ne mogu koristiti za jednostavnu post-modifikaciju postojećih rekombinantnih antitela i stoga nisu generalno primenjive.
[0018] U odnosu na enzimsku konverziju proteina (b), tokom godina objavljeno je da je nekoliko enzima sposobno da postigne takvu transformaciju sa neprirodnim supstratima koji sadrže azid, npr. transglutaminaza, ligaza lipoinske kiseline, sortaza, FGE i drugi (pregledno dato u Bertozzi et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974). Bez izuzetka, međutim, ovi enzimi zahtevaju za prepoznavanje specifične sekvence u proteinu, koje se moraju napraviti specifičnim inženjeringom, i konjugacija može biti ograničena na terminuse proteina.
[0019] Potencijalno svestrana strategija koja se može generalno primeniti na sva monoklonska antitela uključuje specifičnu enzimsku konjugaciju sa Fc-vezanim glikanom, koji je prirodno prisutan u svim antitelima eksprimiranim u sisarskim (ili kvaščevim) kulturama ćelija. Nekoliko strategija zasnovanih na ovom konceptu je poznato u tehnici, kao što je preko oksidacije terminalne galaktoze ili preko transfera (neprirodne) sijalinske kiseline za isti galaktozni deo. Međutim, za ADC svrhu takva strategija je suboptimalna jer su glikani uvek formirani kao kompleksna smeša izoformi, koje mogu sadržati različite nivoe galaktozilacije (G0, G1, G2) i stoga će dati ADCs sa slabom kontrolom odnosa lek-antitelo (DAR, videti u nastavku).
[0020] Slika 1 prikazuje antitelo koje sadrži glikan na svakom teškom lancu. Ovi glikani su prisutni u različitim izoformama u odnosu na galaktozilaciju (G0, G1 i G2) i fukozilaciju (G0F, G1F i G2F).
[0021] [0013] U WO 2007/133855 (University of Mariland Biotechnology Institute), opisan je hemoenzimski postupak za pripremu homogenog glikoproteina ili glikopeptida, uključujući strategiju iz dva stadijuma koja podrazumeva prvo skoro potpuno isecanje glikanskih grana (pod dejstvom endo A ili endo H) ostavljajući samo jezgro N-acetilglukozamin (GlcNAc) dela (takozvani GlcNAc-protein), nakon čega sledi reglikozilacioni događaj gde je, u prisustvu katalizatora koji sadrži endoglikozidazu (ENGase), oligosaharidni deo prenet na GlcNAcprotein da bi se dobio homogeni glikoprotein ili glikopeptid. Strategija za glikoproteine sa azidnom funkcionalnom grupom je opisana, gde je GlcNAc-protein reagovao u prisustvu ENGase sa tetrasaharid oksazolinom koji sadrži dva 6-azidomanozna dela, čime se uvode istovremeno dva azida u glikan. Glikoprotein sa azidnom funkcionalnom grupom može zatim katalitički reagovati sa „klik hemijskom“ cikloadicionom reakcijom, u prisustvu katalizatora (npr. Cu(I) katalizator) sa terminalnim alkinom koji nosi funkcionalni deo X od interesa. Nisu opisani stvarni primeri pomenute klik hemijske reakcije.
[0022] U J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 13790, Wang et al. opisano je efikasno vezivanje terminalnog alkin-modifikovanog trisaharida sa bis-azido modifikovanog ribonukleazom B preko klik hemijske reakcije katalizovane bakrom.
[0023] U J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8030, Davis et al. opisuju transfer oligosaharidnih oksazolina na fukozilovanom jezgru kao i na nefukozilovanom jezgru-GlcNAc-Fc domena intaktnog antitela, u prisustvu glikosintaze EndoS.
[0024] U J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308, Wang et al. opisuju transfer tetrasaharid oksazolina koji sadrži dve 6-azidomanozne grupe na fukozilovanom jezgru kao i na nefukozilovanom jezgru-GlcNAc-Fc domena intaktnog antitela, (Rituximab) u prisustvu mutanata gllikosintaze EndoS-D233A i EndoS-D233Q. Ovaj postupak je šematski prikazan na Slici 2, i rezultuje u antitelu koje sadrži četiri azido grupe. Naknadna konjugacija azidomodifikovanih IgG sa klik hemijskom reakcijom je pomenuta ali nije opisana.
[0025] Međutim, nedostatak strategije sa glikosintazom opisana u WO 2007/133855, J. Am. Chem. Soc.2012, 134, 8030 i J. Am. Chem. Soc.2012, 134, 12308 je dugotrajana i kompleksna sinteza neophodnih oligosaharidnih oksazolina koji sadrže azido grupu. Dodatno, oligosaharidi koji sadrže azido sadrže dve azido grupe. Do sada, nije pokazano da li je ovaj postupak pogodan za uvođenje samo jedne azido grupe na glikan antitela.
[0026] Qasba et al. opisuju u J. Biol. Chem. 2002, 277, 20833, da mutantne galaktoziltransferaze GaIT(Y289L), GalT(Y289I) i GaIT(Y289N) mogu enzimski vezati GalNAc za ne-redukujući GlcNAc šećer (β-benzil-GlcNAc).
[0027] WO 2004/063344 (National Institutes of Health), opisuje mutantne galaktoziltransferaze GaIT(Y289L), GalT(Y289I) i GaIT(Y289N). Opisan je postupak gde su kompleksni glikani kao što su oni na monoklonskim antitelima (Rituxan, Remicade, Herceptin) prvo konvertovani u G0 glikane na antitelima tretmanom sa galaktozidazom, da bi se uklonile sve terminalne galakoze sa lanca. Ova G0 antitela su nakon toga podvrgnuta GaINAc-UDP u prisustvu GalT(Y289L), što vodi do antitela sa značajno više homogenim strukturama glikana.
[0028] [0020] Qasba et al. opisuju u Bioconjugate Chem.2009, 20, 1228, da se postupak opisan u WO 2004/063344 takođe odvija za ne-prirodne GaINAc-UDP varijante supstituisane na N-acetil grupi. β-galaktozidazom tretirana monoklonska antitela sa G0 glikoformom su potpuno galaktozilovana do G2 glikoforme nakon transfera galaktoznog dela koji sadrži C2-supstituisani azidoacetamido deo (GalNAz) na terminalne GlcNAc ostatke glikana, što vodi do tetraazido-supstituisanih antitela, tj. dva GalNAz dela po teškom lancu. Ovaj postupak je prikazan šematski na Slici 3. Konjugacija pomenutih tetraazido-supstituisanih antitela sa molekulom od interesa nije opisana. Transfer galaktoznog dela koji sadrži C2-supstituisanu keto grupu (C2-keto-Gal) na terminalne GlcNAc ostatke G0 glikoforme glikana, kao i vezivanje C2-keto-Gal za aminooksi biotin, je takođe opisano. U svim slučajevima, GalT(Y289L) mutant je korišćen za transfer GaINAc-UDP (ili GalNAz-UDP) na antitela, ali upotreba mutanata GalT(Y289N) ili GalT(Y289I) nije opisana.
[0029] Nedostatak postupka opisanog u WO 2004/063344 i Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1228 je taj što bi konjugacija tetraazido-supstituisanih antitela sa molekulom od interesa vodila konjugatu antitela sa tipično dva molekula od interesa po glikanu (uz uslov da bi se pomenuta konjugacija odvijala sa kompletnom konverzijom). U nekim slučajevima, na primer kada je molekul od interesa lipofilni toksin, prisustvo previše molekula od interesa po antitelu nije poželjno jer ovo može voditi formiranju agregata (BioProcess International 2006, 4, 42-43).
[0030] WO 2007/095506 i WO 2008/029281 (Invitrogen Corporation) opisuju postupak za formiranje glikoproteinskog konjugata gde je glikoprotein doveden u kontakt sa UDP-GalNAz u prisustvu GalT(Y289L) mutanta, što vodi inkorporaciji GalNAz na terminalnom neredukujućem GlcNAc ugljenog hidrata antitela. Nakon toga se može koristiti klik hemijska reakcija sa terminalnim alkinom katalizovana bakrom ili Staudinger vezivanje da bi se konjugovao reporter molekul, čvrsta potpora ili molekul nosača sa vezanim azidnim delom. WO 2007/095506 i WO 2008/029281 dodatno opisuju da ukoliko nisu prisutni terminalni GlcNAc šećeri na antitelu, mogu se koristiti Endo H, Endo A ili Endo M enzim da bi se generisao skraćeni lanac koji se završava sa jednim N-acetilglukozamin ostatkom.
[0031] Konjugati antitela poznati u tehnici generalno imaju nekoliko nedostataka. Za konjugate antitela i leka, mera za punjenje antitela sa toksinom data je odnosom lek-antitelo (DAR), koja daje prosečan broj molekula aktivne supstance po antitelu. Međutim, DAR ne daje nikakvu indikaciju u pogledu homogenosti takvog ADC.
[0032] Postupci za pripremu konjugata antitela poznati iz prethodne tehnike generalno rezultuju u proizvodu sa DAR između 1.5 i 4, ali ustvari takav proizvod sadrži smešu konjugata antitela sa određenim brojem molekula od interesa koji varira od 0 do 8 ili više. Drugim rečima, konjugati antitela poznati iz prethodne tehnike generalno su formirani sa DAR sa velikom standardnom devijacijom.
[0033] [0025] Na primer, gemtuzumab ozogamicin je heterogena smeša od 50% konjugata (0 do 8 kalihemicin delova po molekulima IgG sa prosečnom vrednošću od 2 ili 3, po principu slučajnosti vezanih sa lizil ostacima antitela izloženim rastvaraču) i 50% nekonjugovanog antitela (Bross et al., Clin. Cancer Res.2001, 7, 1490; Labrijn et al., Nat. Biotechnol. 200927, 767). Ali takođe za brentuximab vedotin, T-DM1, i druge ADCs u klinici, i dalje se ne može kontrolisati koliko tačno lekova se vezuje za bilo koje dato antitelo (odnos lek-antitelo, DAR) i ADC je dobijen kao statistička distribucija konjugata. Bilo da je optimalni broj lekova po antitelu, na primer dva, četiri ili više, njihovo vezivanje u predvidivom broju i na predvidivim lokacijama preko konjugacije specifične za mesto sa uskom standardnom devijacijom je i dalje problematično.
[0035] Rezime pronalaska
[0037] Predmetni pronalazak je naveden u priloženom setu patentnih zahteva.
[0038] Predstavljeni opis opisuje postupak za pripremu modifikovanog antitela, koji sadrži dovođenje u kontakt antitela koje sadrži supstituent jezgra N-acetilglukozamina (GlcNAc) sa jedinjenjem formule S(A)x-P u prisustvu pogodnog katalizatora, gde je pomenuti supstituent jezgra N-acetilglukozamina izborno fukozilovan, gde pomenuti katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, gde S(A)x je derivat šećera koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde A je nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, gde P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i gde je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)x supstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)x supstituenta. Izborno, GlcNAc pomenutog GlcNAc-S(A)x supstituenta je fukozilovan.
[0039] Opis takođe opisuje modifikovano antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)x supstituent, gde GlcNAc je jezgro N-acetilglukozamin, gde S(A)x je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde A je izabrano iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, gde je pomenuti GlcNAc- S(A)x supstituent vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)x supstituenta, i gde je pomenuti N-acetilglukozamin izborno fukozilovan.
[0040] Opis takođe opisuje postupak za pripremu konjugata antitela, koji sadrži reakciju modifikovanog antitela koje je ovde otkriveno sa konjugatom linkera, gde pomenuti konjugat linkera sadrži funkcionalnu grupu B i jedan ili više molekula od interesa, gde je pomenuta funkcionalna grupa B funkcionalana grupa koja je sposobna da reaguje sa funkcionalanom grupom A GlcNAc-S(A)x supstituenta na pomenutom modifikovanom antitelu.
[0041] Pronalazak se odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek, pri čemu konigat antitela se može dobiti postupkom, koji sadrži reakciju modifikovanog antitela opisanog gore sa konjugatom linkera, gde modifikovano antitelo je antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent, gde GlcNAc je jezgro N-acetilglukozamin, gde S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, gde pomenuti GlcNAc-S(A)<x>supstituent je vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina pomenutog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta preko N-glikozidne veze za atom azota amida u bočnom lancu aminokiseline asparagina antitela, i gde je pomenuti GlcNAc izborno fukozilovan i gde pomenuti linkerkonjugat sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više citotoksina kao molekula od interesa i pri čemu antitelo specifično vezuje antigen kancera.
[0042] Pronalazak se dalje odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek koji se može dobiti postupkom za pripremu konjugata antitela koji je ovde opisan.
[0043] Modifikovano antitelo opisano ovde, i konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku i postupci za njihovu pripremu opisani ovde imaju nekoliko prednosti u odnosu na postupke, modifikovana antitela i konjugate antitela poznate u tehnici.
[0044] Kao što je prethodno opisano, poznati postupci za konjugaciju linker-toksin entiteta sa antitelima još uvek moraju da se poboljšaju, u odnosu na kontrolu i specifičnosti za mesto i stehiometrije. Uprkos sposobnosti ADCs da se vežu za svoja ciljna mesta, količina leka procenjena da ulazi u tumorske ćelije je tipično <2% primenjene doze. Ovaj problem je pojačan nepredvidim rezultatima konjugacije ADCs poznatih u tehnici. Važno je izbeći slabo konjugovana antitela, koja smanjuju potenciju, kao i visoko konjugovane vrste, koje izrazito smanjuju polu-život u cirkulaciji, pogoršano vezivanje sa ciljnim proteinom, i povećanu toksičnost.
[0045] Za konjugate antitelo-lek, mera punjenja molekula od interesa (npr. lekova, aktivnih supstanci) na antitelo je takozvani odnos leka prema antitelu (DAR), koji daje prosečan broj molekula aktivne supstance po antitelu, izračunat iz statističke distribucije. Teoretska maksimalna vrednost DAR za određeni tip ADC je jedanka broju usidrenih mesta. Kao što je prethodno opisano, postupak za pripremu ADCs poznatih iz prethodne tehnike generalno rezultuju u proizvodu koji sadrži smešu konjugata antitela sa različitim brojem molekula od interesa prisutnih u svakom konjugatu antitela, i u DAR sa visokom standardnom devijacijom.
[0046] [0035] Jedna od prednosti modifikovanih antitela opisanih ovde i konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku je da su ova antitela i konjugati antitela homogeni, i u odnosu na specifičnost za mesto i stehiometriju. Pomenuta modifikovana antitela i konjugati antitela su dobijeni sa DAR veoma bliskim teoretskoj vrednosti, i sa veoma niskom standardnom devijacijom. Ovo takođe znači da konjugati antitela koji su ovde otkriveni rezultuju u konzistentnijem proizvodu za prekliničko testiranje.
[0047] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno i konjugati antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku su homogeni, i u odnosu na specifičnost za mesto i stehiometriju. Ovde, antitelo ili konjugat antitela smatra se homogenim kada je konjugacija postignuta samo na prethodno određenom mestu i sa prethodno određenim odnosom lek-antitelo. Konjugat antitela je heterogen kada se konjugacija antitela dešava na različitim mestima na antitelu, što dovodi do smeše proizvoda sa nepredvidivim odnosom lekantitelo. U poslednje pomenutom slučaju, odnos lek-antitelo biće prosečna vrednost cele grupe konjugata antitelo-leka.
[0048] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku ima DAR koji je unutar 10% njegove teoretske vrednosti.
[0049] Druga prednost postupaka otkrivenih ovde i antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku uključuje redukciju otpada u proizvodnji, čime se poboljšava cena za kompaniju.
[0050] Dodatno, kada je azid-modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno kuplovano sa konjugatom linkera koji sadrži alkinil grupu, ili kada je alkin-modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno kuplovano sa konjugatom linkera koji sadrži azid deo, preko reakcije cikloadicije, rezultujući triazoli nisu podložni hidrolizi ili drugim putevima degradacije. Kada je keton-modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno kuplovano sa konjugatom linkera koji sadrži hidroksilamin ili hidrazin, rezultujući oksimi ili hidrazoni su takođe relativno inertni u neutralnim uslovima.
[0051] Dodatne prednosti su stoga stabilnost konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku, kao i jednostavnost i generalno primenjiv postupak za uvođenje azido grupe, keto grupe ili alkinil grupe u antitelo.
[0052] Kao što je prethodno opisano, enzimska konjugacija ne-prirodnog šećera za terminalni GlcNAc oligomernog glikana vezanog za antitelo, u prisustvu mutantne galaktoziltransferaze Y289L, kao što je prikazano na Slici 3, poznata je u tehnici.
[0053] Do sada, međutim, pogodnost mutantne galaktoziltransferaze poznate u tehnici za transfer nukleotida šećera ili nukelotida sa derivatima šećera na supstituent jezgra-GlcNAc na antitelu, i pogodnost takve strategije za generisanje konjugata antitela, još uvek nije demonstrirana. U postupcima poznatim u prethodnoj tehnici, nukleotid šećera ili nukelotid sa šećernim derivatima prenet je na terminalni GlcNAc oligo- ili polisaharidnog glikana vezanog za antitelo.
[0054] Dodatno, do sada pogodnost mutantne galaktoziltransferaze poznate u tehnici za transfer šećera nukelotida ili šećernih derivata nukleotida na interne šećere i šećerne derivate nije demonstrirana. Sa postupcima otkrivenim ovde, sada je moguće preneti šećerni derivat koji sadrži funkcionalne grupe kao što je jedna ili više azido, keto i/ili alkin grupa, na supstituent jezgra-GlcNAc prisutan na antitelu, nezavisno od toga da li je pomenuti GlcNAc fukozilovan ili ne. Kao prednost, uklanjanje fukoze pre postupka otkrivenog ovde stoga nije neophodno, jer se smeša antitela koja sadrži i supstituent jezgra-GlcNAc i supstituent jezgro-GlcNAc(Fuc) može koristiti u postupku.
[0056] Opis slika
[0058] Slika 1 prikazuje različite glikoforme glikana antitela G2F, G1F, G0F, G2, G1 i G0. Slika 2 prikazuje postupak za transfer tetrasaharida koji sadrži dve azido grupe na supstituent jezgra-GlcNAc u prisustvu mutantne EndoS-D233A, što rezultuje u modifikovanom antitelu koje sadrži četiri azido grupe, kao što je opisano u J. Am. Chem. Soc.2012, 134, 12308.
[0059] Slika 3 prikazuje postupak za transfer GalNAz na terminalne GlcNAc ostatke glikana antitela, što vodi ka modifikovanom antitelu koje sadrži četiri azido grupa, kao što je opisano u Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1228.
[0060] Slika 4 prikazuje poželjni primer izvođenja postupka za pripremu azid-modifikovanog antitela, gde izborno supstituisano antitelo koje sadrži supstituent jezgra-GlcNAc reaguje sa GalNAz-UDP u prisustvu GalT Y289L kao katalizatora.
[0061] Slika 5 prikazuje deglikozilaciju smeše glikoformi u prisustvu EndoS kao katalizatora.
[0062] Slika 6 prikazuje poželjan primer izvođenja postupka za pripremu konjugata antitela, gde je azid-modifikovano antitelo konjugovano sa konjugatom linkera koji sadrži jedan ili više molekula od interesa.
[0063] Slika 7 prikazuje šemu reakcije sinteze linker BCN-doksorubicin konjugata 28a i 28b koji se ne isecaju.
[0064] Slika 8 prikazuje šemu reakcije za sintezu DIBAC-biotin konjugata 30.
[0065] Slika 9 prikazuje šemu reakcije sinteze linker BCN-vc-PABA-doksorubicin konjugata 33 koji se iseca počinjući od Fmoc-citrulina 31.
[0066] Slika 10a prikazuje šemu reakcije za sintezu BCN-konjugata koji se iseca do vc-PABA-MMAE (37a), vc-PABA-MMAF (37b), BCN-MMAF konjugata koji se ne iseca (38), BCN-vc-PABA-majtanzinoid konjugata koji se iseca (38) i maleimid-vc-PABA-majtazinoid konjugata (40).
[0067] Slika 10b prikazuje strukturu BCN-MMAF konjugata 57 koji se ne iseca.
[0068] Slika 11 prikazuje šemu reakcije za sintezu DIBAC-vc-PABA-MMAF 41 koji se iseca.
[0069] Slika 12 prikazuje šemu reakcije za sintezu tri ciklooktin-doksorubicin konjugata 42-44.
[0070] Slika 13 prikazuje strukture tri funkcionalizovana biotinilujuća reagensa 45-47.
[0071] Slika 14 prikazuje šemu reakcije za sintezu 2-modifikovanih UDP-GalNAc derivata 52-54 i strukture 6-azido modifikovanih UDPGal (55) i UDP-GalNAc (56).
[0072] Slika 15 prikazuje MS profil (A) trastuzumaba, (B) trastuzumaba nakon isecanja sa endo S, (C) nakon galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 i (D) nakon konjugacije sa BCN-MMAF 37b.
[0073] Slika 16 prikazuje MS profil pulovanog plazma IgG (A), nakon isecanja sa endo S (B) i nakon galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 (C).
[0074] Slika 17 prikazuje MS profil endo S-isečenog trastuzumaba, zatim galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 i konačno konjugaciju sa alkil biotinom 45 katalizovanu bakrom.
[0075] Slika 18 prikazuje MS profil endo S-isečenog trastuzumaba, (A) nakon galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAcinom 53 i (B) nakon konjugacije sa azido-biotinom 46 katalizovane bakrom, što vodi do 50% konverzije.
[0076] Slika 19 prikazuje MS profil endo S-isečenog trastuzumaba, (A) nakon galaktoziltransferaze sa UDP-GalNLev 55 i (B) nakon konjugacije oksima sa hidroksilamin-biotinom 47.
[0077] Slika 20 prikazuje SDS-PAGE pod redukujućim uslovima (staza 1-4) ili ne-redukujućim uslovima (staza 5-8) trastuzumaba (staza 1 i 5), trastuzumab nakon isecanja i galaktoziltransferaze sa UDP-GalNAz 52 (staza 2 i 6), trastuzumab konjugat dobijen sa tretmanom trast(GalNAz)<2>sa BCN-biotinom 25 (staza 3 i 7) i trastuzumab konjugat dobijen sa tretmanom trast(GalNAz)<2>sa alkin-biotinom 45 nakon Cu(I)-katalizovane klik reakcije (staza 4 i 8). Nekoliko traka u stazi 4 i 8 ukazuju na formiranje kovalentnih i/ili redukovanih fragmenata, kao i agregaciju, koja je rezultat klik konjugacije katalizovane bakrom, koje su sve odsutne iz tenziono-promovisane konjugacije u stazama 3 i 7.
[0078] Slika 21 prikazuje ekskluzioni hromatogram trastuzumab(MMAF)<2>konjugata izvedenog iz trastuzumab(GalNAz)<2>i BCN-MMAF 37b.
[0079] Slika 22 prikazuje vremenski zavisni MS profil trastuzumab(doksorubicin)<2>izvedenog iz 28a, u IgG-depletiranoj humanoj plazmi.
[0080] Slika 23 prikazuje nivo agregacije različitih mAbs ili ADCs netretiranih ili nakon 5 ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja.
[0081] Slika 24 prikazuje in vitro citotoksičnost opsega ADCs na SK-BR-3 ćelijsku liniju.
[0082] Slika 25 prikazuje in vitro citotoksičnost ADCs na SK-OV-3 ćelijsku liniju.
[0083] Slika 26 prikazuje in vitro citotoksičnost opsega ADCs na MDA-MB-231 ćelijsku liniju (kontrolu).
[0084] Slika 27 prikazuje klirens iz krvi<111>In-obeleženog trastuzumab(MMAF)<2>izvedenog iz 37b, trastuzumab(majtanzinoid)<2>izvedenog iz 39, deglikozilovanog trastuzumaba (dobijenog sa endo S isecanjem trastuzumaba) i nativnog trastuzumaba.
[0085] Slika 28 prikazuje biodistribuciju<111>In-obeleženog trastuzumab(MMAF)<2>izvedenog iz 37b, trastuzumab(majtanzinoid)<2>izvedenog iz 39, deglikozilovanog trastuzumaba (dobijenog sa endo S isecanjem trastuzumaba) i nativnog trastuzumaba. Miševi su injektirani sa 25 µg i disekovani 21 d nakon injekcije. Preuzimanje tkiva je izraženo kao %ID/g.
[0086] Slika 29 prikazuje in vivo efikasnost modela ksenografta miša. ADCs koji su procenjivani bili su trastuzumab N297-konjugovan sa vc-majtanzinoidom (3 mg/kg i 9 mg/kg) i poređeni sa T-DM1 (9 mg/kg). Model ksenografta kancera izvedenog iz pacijenta (PDX) izabran je sa potkožnom implantacijom tumor koda (HBx-13B) u ženke SHO miševa. Tumori su mereni na dan 0, 4, 7, 11 i 14.
[0087] Slika 30 prikazuje in vivo efikasnost modela ksenografta miša. ADCs koji su procenjeni bili su trastuzumab N297-konjugovan sa vc-majtanzinoidom (3 mg/kg i 9 mg/kg), trastuzumab N297-konjugovan sa vc-MMAF (3 mg/kg i 9 mg/kg) i poređen sa T-DM1 (9 mg/kg). Model ksenografta kancera izvedenog iz pacijenta (PDX) izabran je sa potkožnom implantacijom tumor koda (HBx-13B) u ženke SHO miševa. Tumori su mereni na dan 0, 4, 7, 11, 14, 18 i 21 za vc-majtanzinoid ADCs, T-DM1 i vehikulum na dan 0, 3, 7 i 10.
[0088] Slika 31 prikazuje detaljnu masenu spektralnu analizu intaktnih proteinskih vrsta (nanoLC-MS) korišćenjem nanoLC kuplovanog sa QTOF MS (maXis 4G) ultra visoke rezolucije lakog lanca (LC) (A) nativnog trastuzumaba, (B) trast(Gal- NAz)<2>, (C) trast(GalNAz)<2>nakon konjugacije sa BCN-biotinom 25 i (D) trast(GalNAz)<2>nakon konjugacije sa alkin-biotinon 45 katalizovane bakrom. Iako je bazalni pik identičan za (A)-(C), trastuzumab konjugat formiran katalizom sa bakrom (D) prikazuje jasno rame na 23441.5 i još jedno na 23459.5, što ukazuje na formiranje značajnih količina (>20%) oksidovanih i/ili deamidovanih sporednih proizvoda.
[0090] Detaljan opis pronalaska
[0092] Definicije
[0094] Glagol "sadržati" kao što je korišćen u ovom opisu i u patentnim zahtevima i njegovim konjugacijama korišćen je u svom neograničavajućem smislu da označava da su predmeti koji prate reč uključeni, ali predmeti koji nisu specifično pomenuti nisu isključeni.
[0095] Dodatno, referenca na element sa neodređenim članom "a" ili "an" ne isključuje mogućnost da je više od jednog elementa prisutno, ukoliko kontekst jasno ne zahteva da postoji jedan i samo jedan od elemenata. Neodređeni član "a" ili "an" stoga obično označava "najmanje jedan".
[0096] Jedinjenja za upotrebu kao lek opisana u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu sadržati jedan ili više asimetričnih centara, i mogu postojati različiti dijastereomeri i/ili enantiomeri jedinjenja. Opis bilo kojeg jedinjenja u ovom opisu i patentnim zahtevima uključuje sve dijastereomere, i njihove smeše, ukoliko nije drugačije naznačeno. Dodatno, opis bilo kog jedinjenja u ovom opisu i patentnim zahtevima uključuje i pojedinačne enantiomere, kao i bilo koju smešu, recemsku ili drugačiju, enantiomera, ukoliko nije drugačije naznačeno. Kada je struktura jedinjenja prikazana kao specifični enantiomer, podrazumeva se da pronalazak predmetne prijave nije ograničen na taj specifični enantiomer.
[0097] Jedinjenja se mogu pojaviti u različitim tautomernim oblicima. Jedinjenja za upotrebu kao lek prema pronalasku uključuju sve tautomerne oblike, ukoliko nije drugačije naznačeno. Kada je struktura jedinjenja prikazana kao specifični tautomer, podrazumeva se da pronalazak predmetne prijave nije ograničen na taj specifični tautomer.
[0098] Jedinjenja za upotrebu kao lek opisana u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu dodatno postojati kao egzo i endo dijastereoizomeri. Ukoliko nije drugačije naznačeno, opis bilo kog jedinjenja u opisu i u patentnim zahtevima uključuje i pojedinačne egzo i pojedinačne endo dijastereoizomere jedinjenja, kao i njihove smeše. Kada je struktura jedinjenja prikazana kao specifični endo ili egzo dijastereomer, podrazumeva se da pronalazak predmetne prijave nije ograničen na taj specifični endo ili egzo dijastereomer.
[0099] Dodatno, jedinjenja za upotrebu kao lek opisana u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu postojati kao cis i trans izomeri. Ukoliko nije drugačije naznačeno, opis bilo kog jedinjenja u opisu i u patentnim zahtevima uključuje i pojedinačni cis i pojedinačni trans izomer jedinjenja, kao i njihove smeše. Kao primer, kada je struktura jedinjenja prikazna kao cis izomer, podrazumeva se da odgovarajući trans izomer ili smeše cis i trans izomera nisu isključeni iz pronalaska predmetne prijave. Kada je struktura jedinjenja prikazana kao specifični cis ili trans izomer, podrazumeva se da pronalazak predmetne prijave nije ograničen na taj specifični cis ili trans izomer.
[0100] [0051] Jedinjenja za upotrebu kao lek opisana u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu dodatno postojati kao regioizomeri. Ukoliko nije drugačije naznačeno, opis bilo kog jedinjenja u opisu i u patentnim zahtevima uključuje i regioizomere jedinjenja, kao i njihove smeše. Kada je struktura jedinjenja prikazana kao specifični regioizomer, podrazumeva se da pronalazak predmetne prijave nije ograničen na taj specifični regioizomer.
[0101] Nesupstituisane alkil grupe imaju opštu formulu C<n>H<2n+1>i mogu biti linearni ili granati. Nesupstituisane alkil grupe mogu takođe sadržati ciklični deo, i stoga istovremeno imati generalnu formulu C<n>H<2n-1>. Izborno, alkil grupe su supstituisane sa jednim ili više supstituenata dalje specifikovanih u ovom dokumentu. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, propil, 2-propil, t-butil, 1-heksil, 1-dodecil, itd.
[0102] Aril grupa sadrži šest do dvanaest ugljenikovih atoma i može uključivati monociklične i biciklične strukture. Izborno, aril grupa može biti supstituisana sa jednim ili više supstituenata dalje specifikovaih u ovom dokumentu. Primeri aril grupa su fenil i naftil.
[0103] Heteroaril grupa sadrži pet do dvanaest ugljenikovih atoma gde su jedan do četiri ugljenikova atoma zamenjena heteroatomima izabranih iz grupe koja se sastoji od kiseonika, azota, fosfora i sumpora. Heteroaril grupa može imati monocikličnu ili bicikličnu strukturu. Izborno, heteroaril grupa može biti supstituisana sa jednim ili više supstituenata dodatno specifikovanih u ovom dokumentu. Primeri pogodnih heteroaril grupa uključuju piridinil, hinolinil, pirimidinil, pirazinil, pirazolil, pirolil, furanil, benzofuranil, indolil, purinil, benzoksazolil, tienil, fosfolil i oksazolil.
[0104] Arilalkil grupe i alkilaril grupe sadrže najmanje sedam ugljenikovih atoma i mogu uključiti monociklične i biciklične strukture. Izborno, arilalkil grupe i alkilaril mogu biti supstituisane sa jednim ili više supstituenata dodatno specifikovanih u ovom dokumentu. Arilalkil grupa je na primer benzil. Alkilaril grupa je na primer 4-t-butilfenil.
[0105] Alkinil grupa sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik trogubih veza. Nesupstituisana alkinil grupa koja sadrži jednu trogubu vezu ima opštu formulu C<n>H<2n-3>. Terminalna alkinil je alkinil grupa gde je troguba veza smeštena na terminalnoj poziciji alkinil grupe. Izborno, alkinil grupa je supstituisana sa jednim ili više supstituenata dodatno specifikovanih u ovom dokumentu, i/ili prekinuta sa heteroatomima izabranim iz grupe od kiseonika, azota i sumpora. Primeri alkinil grupe uključuju etinil, propinil, butinil, oktinil, itd.
[0106] Cikloalkinil grupa je ciklična alkinil grupa. Nesupstituisana cikloalkinil grupa koja sadrži jednu trogubu vezu ima opštu formulu C<n>H<2n-5>. Izborno, cikloalkinil grupa je supstituisana sa jednim ili više supstituenata dodatno specifikovanih u ovom dokumentu. Primer cikloalkinil grupe je ciklooktinil.
[0107] [0058] Heterocikloalkinil grupa je cikloalkinil grupa prekinuta heteroatomima izabranim iz grupe od kiseonika, azota i sumpora. Izborno, heterocikloalkinil grupa je supstituisana sa jednim ili više supstituenata dalje specifikovanih u ovom dokumentu. Primer heterocikloalkinil grupe je azaciklooktinil.
[0108] (Hetero)aril grupa sadrži aril grupu i heteroaril grupu. Alkil(hetero)aril grupa sadrži alkilaril grupu i alkilheteroaril grupu. (Hetero)arilalkil grupa sadrži arilalkil grupu i heteroarilalkil grupe. (Hetero)alkinil grupa sadrži alkinil grupu i heteroalkinil grupu. (Hetero)cikloalkinil grupa sadrži cikloalkinil grupu i heterocikloalkinil grupu.
[0109] (Hetero)cikloalkin jedinjenje je ovde definisano kao jedinjenje koje sadrži (hetero)cikloalkinil grupu.
[0110] Nekoliko od jedinjenja navedenih u ovom opisu i u patentnim zahtevima mogu biti opisana kao fuzionisana (hetero) cikloalkin jedinjenja, tj. (hetero)cikloalkin jedinjenja pri čemu je struktura drugog prstena fuzionisana, tj. anelirana, sa (hetero)cikloalkinil grupom. Na primer u fuzionisanom (hetero)ciklooktin jedinjenju, cikloalkil (npr. ciklopropil) ili aren (npr. benzen) može biti aneliran sa (hetero)ciklooktinil grupom. Troguba veza (hetero)ciklooktinil grupe u fuzionisanom (hetero)ciklooktin jedinjenju može biti locirana na bilo kojoj od tri moguće lokacije, tj. na 2, 3 ili 4 položaju ciklooktin grupe (numeracija prema "IUPAC Nomenclature of Organic Chemistry", Rule A31.2). Opis bilo kog fuzionisanog (hetero)ciklooktin jedinjenja u ovom opisu i u patentnim zahtevima je određen tako da obuhvata sva tri pojedinača regioizomera ciklooktin grupe.
[0111] [0062] Kada je alkil grupa, (hetero)aril grupa, alkil(hetero)aril grupa, (hetero)arilalkil grupa, (hetero)cikloalkinil grupa izborno supstituisana, navedene grupe su nezavisno izborno supstituisane sa jednim ili više supstituenata nezavisno izabranih iz grupe koja se sastoji od C<1>- C<12>alkil grupa, C<2>- C<12>alkenil grupa, C<2>- C<12>alkinil grupa, C<3>- C<12>cikloalkil grupa, C<1>-C<12>alkoksi grupa, C<2>- C<12>alkeniloksi grupa, C<2>- C<12>alkiniloksi grupa, C<3>- C<12>cikloalkiloksi grupa, halogena, amino grupa, okso grupa i silil grupa, pri čemu su alkil grupe, alkenil grupe, alkinil grupe, cikloalkil grupe, alkoksi grupe, alkeniloksi grupe, alkiniloksi grupe i cikloalkiloksi grupe izborno supstituisane, alkil grupe, alkoksi grupe, cikloalkil grupe i cikloalkoksi grupe su izborno prekinute jednim ili više heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su silil grupe predstavljene formulom (R<6>)<3>Si-, gde R<6>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od C<1>- C<12>alkil grupa, C<2>- C<12>alkenil grupa, C<2>- C<12>alkinil grupa, C<3>- C<12>cikloalkil grupa, C<1>- C<12>alkoksi grupa, C<2>- C<12>alkeniloksi grupa, C<2>- C<12>alkiniloksi grupa i C<3>- C<12>cikloalkiloksi grupa, pri čemu su alkil grupe, alkenil grupe, alkinil grupe, cikloalkil grupe, alkoksi grupe, alkeniloksi grupe, alkiniloksi grupe i cikloalkiloksi grupe izborno supstituisane, pri čemu su alkil grupe, alkoksi grupe, cikloalkil grupe i cikloalkoksi grupe izborno prekinute sa jednim ili više heteroatoma izabrana iz grupe koja se sastoji od O, N i S.
[0112] Antitelo je protein generisan od strane imunog sistema koji je sposoban da prepoznaje i vezuje se za specifičan antigen. Termin antitelo ovde je korišćen u njegovom najširem smislu i specifično obuhvata monoklonska antitela, poliklonska antitela, dimere, multimere, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela), fragmente antitela, i dvolančana i jednolančana antitela. Termin "antitelo" je ovde takođe označeno da obuhvata humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela. U kontekstu predmetnog pronalaska, antitelo specifično vezuje antigen kancera. Termin "antitelo" je određen tako da obuhvata cela antitela, ali takođe fragmente antitela, na primer Fab fragment antitela, F(ab’)<2>, Fv fragment ili Fc fragment iz odcepljenog antitela, scFv-Fc fragment, minitelo, diatelo ili scFv. Pored toga, termin obuhvata genetički konstruisane derivate antitela. Antitela, fragmenti antitela i genetički konstruisana antitela mogu biti dobijena pomoću postupaka koji su poznati u stanju tehnike. Pogodna antitela na tržištu obuhvataju, pored ostalih, abciksimab, rituksimab, basiliksimab, palivizumab, infliksimab, trastuzumab, alemtuzumab, adalimumab, tositumomab-I131, cetuksimab, ibrituksimab tiuksetan, omalizumab, bevacizumab, natalizumab, ranibizumab, panitumumab, eculizumab, certolizumab pegol, golimumab, canakinumab, catumaksomab, ustekinumab, tocilizumab, ofatumumab, denosumab, belimumab, ipilimumab i brentuksimab.
[0113] Opšti termin "šećer" je ovde korišćen za označavanje monosaharida, na primer glukoze (Glc), galaktoze (Gal), manoze (Man) i fukoze (Fuc). Termin "šećerni derivat" je ovde korišćen za označavanje derivata monosaharidnog šećera, tj. monosaharidni šećer koji sadrži supstituente i/ili funkcionalne grupe. Primeri šećernog derivata obuhvataju amino šećere i šećerne kiseline, npr. glukozamin (GlcN), galaktozamin (GalN) N-acetilglukozamin (GlcNAc), N-acetilgalaktozamin (GalNAc), N-acetilneuraminsku kiselinu (NeuNAc) i N-acetilmuraminsku ksielinu (MurNAc), glukuronsku kiselinu (GlcA) i iduroninsku ksielinu (IdoA). Primeri šećernog derivata takođe obuhvataju jedinjenja ovde označena kao S(A)<x>, pri čemu S je šećer ili šećerni derivat, i pri čemu S sadrži x funkcionalnih grupa A.
[0114] Supstituent jezgra N-acetilglukozamina (supstituent jezgra-GlcNAc) je ovde definisan kao GlcNAc koji je vezan preko C1 sa antitelom, poželjno preko N-glikozidne veze za atomom azota amida u bočnom lancu aminokiseline asparagina antitela. Supstituent jezgra-GlcNAc može biti prisutan na nativnom glikozilacionom mestu antitela, ali takođe može biti uveden na različito mesto na antitelu. Ovde, supstituent jezgra-N-acetilglukozamina je monosaharidni supstituent, ili ako je navedeni supstituent jezgra-GlcNAc fukozilovan, disaharidni supstituent jezgra-(Fucα1-6)GlcNAc, dodatno označen kao GlcNAc(Fuc). Ovde, "supstituent jezgraGlcNAc" ne bi trebalo mešati sa "jezgrom-GlcNAc". Jezgro-GlcNAc je ovde definisano kao unutrašnji GlcNAc koji je deo poli- ili oligosaharida koji sadrži više od dva saharida, tj. GlcNAc preko koga je poli- ili oligosaharid vezan za antitelo.
[0115] Antitelo koje sadrži supstituent jezgra-N-acetilglukozamina kao što je ovde definisan je na taj način antitelo, koje sadrži monosaharidni supstituent jezgro-GlcNAc kao što je definisano u prethodnom tekstu, ili ako je navedeni supstituent jezgro-GlcNAc fukozilovan, disaharadini supstituent jezgro-GIcNAc(Fuc).
[0116] Ako je supstituent jezgro-GlcNAc ili GlcNAc u supstituentu GlcNAc-S(A)<x>fukozilovan, fukoza je najčešće vezana α-1,6 za C6 supstituenta jezgra-GlcNAc. Fukozilovani supstituent jezgra-GlcNAc je označen kao jezgro-Glc-NAc(Fuc), fukozilovani GlcNAc-S(A)<x>supstituent je označen kao GlcNAc(Fuc)-S(A)<x>.
[0117] Termini "tretman," "lečenje," i slično označavaju dobijanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički prema potpunoj ili delimičnoj prevenciji bolesti ili njenog simptoma i/ili može biti terapeutski prema delimičnom ili potpunom lečenju bolesti i/ili štetenog efekta koji se može pripisati bolesti. "Tretman/lečenje," kao što je ovde korišćeno, pokriva svaki tretman/lečenje bolesti kod sisara, naročito čoveka, i obuhvata prevenciju pojave bolesti kod subjekta koji može imati predispoziciju za bolest, ali još uvek nema dijagnozu te bolesti; inhibiciju bolesti, tj., zaustavljanja njenog razvoja; olakšavanja bolesti, tj., izazivanja regresije bolesti.
[0119] Postupak za pripremu modifikovanog antitela
[0121] Predmetni pronalazak opisuje postupak za pripremu modifikovanog antitela, koji sadrži dovođenje u kontakt antitela koje sadrži supstituent jezgro N-acetilglukozamin (supstitent jezgro-GlcNAc) sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je navedeni supstituent jezgro-GlcNAc izborno fukozilovan, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i pri čemu modifikovano antitelo je definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog supstituenta GlcNAc-S(A)<x>.
[0122] [0070] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo koje sadrži supstituent jezgro-N-acetilglukozamin (supstituent jezgro-GlcNAc) je modifikovano antitelo (mAb). Poželjno, navedeno antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitela. Poželjnije, navedeno antitelo je IgG antitelo, i najpoželjnije navedeno antitelo je IgG1 antitelo. Kada je navedeno antitelo celo antitelo, antitelo poželjno sadrži jedan ili više, poželjnije jedan, supstituent jezgra-GlcNAc na svakom teškom lancu, pri čemu je navedeni supstituent jezgro-GlcNAc izborno fukozilovan. Navedeno celo antitelo na taj način poželjno sadrži dva ili više, poželjno dva, izborno fukozilovana, supstituenta jezgra-GlcNAc. Kada je navedeno antitelo jednolančano antitelo ili fragment antitela, npr. Fab fragment, antitelo poželjno sadrži jedan ili više supstituenata jezgro-GlcNAc, koji je izborno fukozilovan.
[0123] U antitelu koje sadrži supstituent jezgro-GlcNAc (tj. početni materijal postupka), navedeni supstituent jegro-GlcNAc može biti postavljen bilo gde na antitelu, uz uslov da navedeni supstituent ne ometa mesto antitela koje vezuje antigen. U jednom primeru izvođenja, navedeni supstituent jezgro-GlcNAc je postavljen u Fc fragment antitela, poželjnije u C<H>2 domenu. U sledećem primeru izvođenja, navedeni supstituent jezgro-GlcNAc je postavljen na Fab fragment antitela.
[0124] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje sadrži supstituent jezgro-GlcNAc, pri čemu je navedeni supstituent jezgro-GlcNAc izborno fukozilovan, je formule (1), gde AB predstavlja antitelo, GlcNAc je N-acetilglukozamin, Fuc je fukoza, b je 0 ili 1 i y je 1 do 20.
[0127]
[0129] U poželjnom primeru izvođenja, y je 1 do 10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, još poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
[0130] Primer izvođenja postupka koji je ovde otkriven početni materijal postupka je antitelo koje sadrži jedan izborno fukozilovani supstituent jezgro-GlcNAc (1a, y je 1) i primer izvođenja gde je navedeni početni materijal antitelo koje sadrži dva izborno fukozilovana supstituenta jezgra-GlcNAc (1b, y je 2) prikazani su u Šemi 1, gde AB predstavlja antitelo i gde b je 0 ili 1. S(A)<x>i P su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0131] Modifikacija antitela (1a) dovodi do modifikovanog antitela koje sadrži jedan supstituent GlcNAc-S(A)<x>(2) i modifikacija antitela (1b) dovodi do modifikovanog antitela koje sadrži dva supstituenta GlcNAc-S(A)<x>(3).
[0132]
[0135] Šema 1
[0136] Nekoliko pogodnih katalizatora za postupak otkriven ovde su poznati u stanju tehnike. Pogodan katalizator za specifičan postupak je katalizator zbog čega je specifičan šećerni derivat nukleotid S(A)x-P u tom specifičnom postupku - supstrat. Poželjno, katalizator je izabran iz grupe galaktoziltransferaza, poželjnije iz grupe β(1,4)-galaktoziltransferaza ili α(1,3)-N-galaktoziltransferaza, čak poželjnije iz grupe β(1,4)-galaktoziltransferaza ili α(1,3)-N-galaktoziltransferaza koje sadrže mutantni katalitički domen.
[0137] Pogodan katalizator je na primer katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)- galaktoziltransferaze I. Katalitički domen ovde se odnosi na aminokiselinski segment koji se savija u domen koji je sposoban da katalizuje vezivanje specifičnog šećernog derivata nukleotida S(A)<x>-P sa supstituentom jezgrom-GlcNAc u specifičnom postupku koji je ovde otkriven. Katalitički domen može imati aminokiselinsku sekvencu kao što se nalazi u enzimu divljeg tipa, ili ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od sekvence divljeg tipa. Katalitički domen koji ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od sekvence divljeg tipa je ovde označen kao mutantni katalitički domen. Mutacija može npr. da sadrži jednu aminokiselinsku promenu (tačkasta mutacija), ali takođe višestruku aminokiselinsku promenu (npr. od 1 do 10, poželjno od 1 do 6, poželjnije od 1, 2, 3 ili 4, još poželjnije od 1 ili 2 aminokiseline), ili deleciju ili inserciju jedne ili više (npr. od 1 do 10, poželjno od 1 do 6, poželjnije od 1, 2, 3 ili 4, čak poželjnije od 1 ili 2) aminokiseline. Navedeni mutantni katalitički domen može biti prisutan u enzimu pune dužine, npr. enzimu β(1,4)-galaktoziltransferazi I, ali takođe u npr. polipeptidnom fragmentu ili rekombinantnom polipeptidu koji sadrži navedeni mutantni katalitički domen, izborno vezan za dodatne aminokiseline.
[0138] β(1,4)-galaktoziltransferaza I je ovde dalje označena kao GalT. Takvi mutantni GalT katalitički domeni su na primer navedeni u WO 2004/063344 (National Institutes of Health).
[0139] WO 2004/063344 navodi Tyr-289 mutante GalT, koji su označeni kao Y289L, Y289N i Y289I. Postupak pripreme navedenih mutantnih katalitičkih domena Y289L, Y289N i Y289I je detaljno naveden u WO 2004/063344, p.34,1. 6 - p.36,1. 2.
[0140] Mutantni GalT domeni koji katalizuju formiranje veze glukoza-β(1,4)-N-acetilglukozamina su navedeni u WO 2004/063344 on p.10, 1, 25 - p.12, 1.4. Mutantni GalT domeni koji katalizuju formiranje veze N-acetilgalaktozamina- β(1,4)-N-acetilglukozamina navedeni su u WO 2004/063344 on p. 12, 1, 6 - p. 13, 1. 2. Mutantni GalT domeni koji katalizuju formiranje veze N-acetilglukozamina-β(1,4)-N-acetilglukozamina i veze manozaβ(1,4)-N-acetilglukozamina su navedeni u WO 2004/063344 on p. 12, 1, 19 - p. 14, 1. 6. Navedeni mutantni GalT domeni mogu biti uključeni unutar enzima GalT pune dužine, ili u rekombinantne molekule koji sadrže katalitičke domene, kao što je navedeno u WO 2004/063344 on p.14,1,31-p. 16,1.28.
[0141] Sledeći mutantni GalT domen je na primer Y284L, naveden od strane Bojarová et al., Glycobiology 2009, 19, 509. Mutacija na položaju 284 se odnosi na tirozinski ostatak.
[0142] Sledeći mutantni GalT domen je na primer R228K, naveden od strane Qasba et al., Glycobiology 2002, 12, 691, gde je Arg228 zamenjen lizinom.
[0143] U poželjnom primeru izvođenja postupka za pripremu modifikovanog antitela kao što je ovde otkriveno, navedeni katalizator može biti katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno goveđe β(1,4)-galaktoziltransferaze. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, navedeni katalizator je katalizator koji sadrži GalT mutantni katalitički domen izabran iz grupe koja se sastoji od Y289L, Y289N, Y289I, Y284L i R228K, poželjno Y289L. U specifičnom primeru izvođenja, katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289L, GalT Y289N i GalT Y289I, poželjnije GalT Y289L ili GalT Y289N, i najpoželjnije GalT Y289L.
[0144] [0083] U sledećem primeru izvođenja, katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz goveđe β(1,4)-galaktoziltransferaze, izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289F i GalT Y289M. GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A mogu biti obezbeđeni preko procesa mutageneze usmerene na mesto, na sličan način kao što je navedeno u WO 2004/063344, u Qasba et al., Prot. Expr. Pur. 2003, 30, 219 i u Qasba et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 20833 za Y289L, Y289N i Y289I. U GalT Y289F aminokiselina tirozin (Y) na položaju 289 je zamenjena aminokiselinom fenilalaninom (F), u GalT Y289M navedeni tirozin je zamenjen aminokiselinom metioninom (M), u GalT Y289V aminokiselinom valinom (V), u GalT Y289G aminokiselinom glicinom (G), u GalT Y289I aminokiselinom izoleucinom (I) i u Y289A aminokiselinom alaninom (A).
[0145] Sledeći tip pogodnih katalizatora je katalizator na bazi α(1,3)-N-galaktoziltransferaze (dodatno označena kao a3Gal-T), poželjno α(1,3)-N-acetilgalaktozaminiltransferaze (dodatno označena kao a3GalNAc-T), kao što je navedeno u WO 2009/025646. Mutacija a3Gal-T može da proširi donorsku specifičnost enzima i čini a3GalNAc-T. Mutacija a3GalNAc-T može da proširi donorsku specifičnost enzima. Polipeptidni fragmenti i katalitički domeni α(1,3)-N-acetilgalaktozaminiltransferaza su navedeni u WO 2009/025646 on p.26, l.18 - p.47, l.15 i p.
[0146] 77,1. 21 - p.82,1. 4.
[0147] U jednom primeru izvođenja, katalizator je galaktoziltransferaza divljeg tipa, poželjnije β(1,4)-galaktoziltransferaza divljeg tipa ili β(1,3)-N-galaktoziltransferaza divljeg tipa, i čak poželjnije β(1,4)-galaktoziltransferaza I divljeg tipa. β(1,4)-Galaktoziltransferaza je ovde dodatno označena kao GalT. Čak poželjnije, β(1,4)-galaktoziltransferaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od goveđeg β(1,4)-Gal-T1, humanog β(1,4)-Gal-T1, humanog β(1,4)-Gal-T2, humanog β(1,4)-Gal-T3 i humanog β(1,4)-Gal-T4. Čak poželjnije, β(1,4)-galaktoziltransferaza je β(1,4)-Gal-T1. Kada je katalizator β(1,3)-N-galaktoziltransferaza divljeg tipa, poželjan je humani β(1,3)-Gal-T5.
[0148] Ovaj primer izvođenja u kome je katalizator - galaktoziltransferaza divljeg tipa je naročito poželjan kada je funkcionalna grupa A u šećernom derivatu S(A)<x>prisutna na C2 ili C6, poželjno C6, navedenog šećernog derivata. U ovom primeru izvođenja, dalje je poželjno da Su(A)<x>sadrži jednu funkcionalnu grupu A, tj. poželjno x je 1. P, Su(A)<x>i Su(A)<x>-P su opisani detaljnije u daljem tekstu.
[0149] Prema tome, pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu modifikovanog glikoproteina, pri čemu postupak sadrži dovođenje u kontakt antitela koje sadrži supstituent jezgro N-acetilglukozamin (GlcNAc) sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je navedeni katalizator galaktoziltransferaza divljeg tipa, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i pri čemu x je 1, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži supstituent GlcNAc-S(A)<x>vezan za antitelo preko C1 N-acetilglukozamina navedenog supstituenta GlcNAc-S(A)<x>.
[0150] Postupak za pripremu modifikovanog antitela je poželjno izveden u pogodnom rastvoru pufera, kao što je na primer fosfat, puferisani fiziološki rastvor (npr. fosfatno-puferisani fiziološki rastvor, tris-puferisani fiziološki rastvor), citrat, HEPES, tris i glicin. Pogodni puferi su poznati u stanju tehnike. Poželjno, puferski rastvor je fosfatno-puferisani fiziološki rastvor (PBS) ili tris pufer.
[0151] Postupak je poželjno izveden na temperaturi u opsegu od oko 4 do oko 50°C, poželjnije u opsegu od oko 10 do oko 45°C, čak poželjnije u opsegu od oko 20 do oko 40°C, i najpoželjnije u opsegu od oko 30 do oko 37°C.
[0152] Postupak je poželjno izveden na pH u opsegu od oko 5 do oko 9, poželjno u opsegu od oko 5.5 do oko 8.5, poželjnije u opsegu od oko 6 do oko 8. Najpoželjnije, postupak je izveden na pH u opsegu od oko 7 do oko 8.
[0153] U postupku, smeša antitela može biti korišćena kao početno antitelo, pri čemu navedena smeša sadrži antitela koja sadrže jedan ili više supstituenata jezgra-GlcNAc i/ili jedan ili više supstituenata jezgra -GlcNAc(Fuc). Na primer kada početna smeša antitela sadrži celo antitelo sa jednim izborno fukozilovanim supstituentom jezgra-GlcNAc na svakom teškom lancu, celo antitelo može da sadrži dva supstituenta jezgra-GlcNAc, ili dva supstituenta jezgra-GlcNAc(Fuc), ili jedan supstituent jezgra-GlcNAc i jedan supstituent jezgra-GlcNAc(Fuc).
[0154] GlcNAc u monosaharidnom supstituentu jezgra-GlcNAc je na terminalnom položaju, pri čemu je GlcNAc u disaharidnom supstituentu jezgra-GlcNAc(Fuc) na unutrašnjem položaju, je vezan za antitelo preko C1 i za Fuc preko C6. S obzirom na to, kao što je opisano u prethodnom tekstu, navedene galaktoziltransferaze mutantni enzimski katalizatori su takođe sposobni da prepoznaju unutrašnje šećere i šećerne derivate kao akceptor, šećeri derivat S(A)<x>je vezan za supstituent jezgro-GlcNAc u postupku koji je ovde opisan, bez obzira na to da li je navedeni GlcNAc fukozilovan ili ne. Povoljno, uklanjanje fukoze pre postupka koji je ovde opisan prema tome nije neophodno, s obzirom na to da smeša antitela koja sadrži supstituente jezgra-GlcNAc i jezgra-GlcNAc(Fuc) može biti korišćena u postupku. Međutim, ako je poželjno, fukoza može biti uklonjena sa bilo kojih supstituenata jezgra-GlcNAc(Fuc) pre postupka koji je ovde opisan, na primer defukolizacijom u prisustvu α-fukozidaze kao što je poznato u stanju tehnike.
[0155] S(A)<x>je definisan kao šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu je A nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe, i pri čemu x je 1, 2, 3 ili 4.
[0156] [0094] Azido grupa je funkcionalna grupa azida -N<3>. Keto grupa je -[C(R<7>)<2>]<o>C(O)R<6>grupa, pri čemu R<6>je metil grupa ili izborno supstituisana C<2>- C<24>alkil grupa, R<7>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena i R<6>, i o je 0 - 24, poželjno 0 - 10, i poželjnije 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Poželjno, R<7>je vodonik. Alkinil grupa je poželjno terminalna alkinil grupa ili (hetero)cikloalkinil grupa kao što je definisana u prethodnom tekstu. U jednom primeru izvođenja alkinil grupa je -[C(R<7>)<2>]<o>C≡C-R<7>grupa, pri čemu R<7>i o su kao što su definisani u prethodnom tekstu; R<7>je poželjno vodonik.
[0157] Šećerni derivat S(A)<x>može da sadrži jednu ili više funkcionalnih grupa A. Kada S(A)<x>sadrži dve ili više funkcionalnih grupa A, svaka funkcionalna grupa A je nezavisno izabrana, tj. jedan S(A)<x>može da sadrži različitu funkcionalnu grupu A, npr. azido grupu i keto grupu, itd. U poželjnom primeru izvođenja, x je 1 ili 2, poželjnije x je 1. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, funkcionalna grupa A je azido grupa ili keto grupa, poželjnije azido grupa.
[0158] Šećerni derivat S(A)<x>je poreklom od šećera ili šećernog derivata S, npr. amino šećera ili na drugi način derivatizovanog šećera. Primeri šećera i šećernih derivata obuhvataju galaktozu (Gal), manozu (Man), glukozu (Glc), glukuronsku kiselinu (Gcu) i fukozu (Fuc). Amino šećer je šećer u kome hidroksil (OH) grupa je zamenjena grupom amina i primeri obuhvataju N-acetilglukozamin (GlcNAc) i N-acetilgalaktozamin (GalNAc). Primeri na drugi način derivatizovanog šećera obuhvataju glukuronsku kiselinu (Gcu) i N-acetilneuraminsku kiselinu (sialinsku kiselinu).
[0159] Šećerni derivat S(A)<x>je poželjno poreklom od galaktoze (Gal), manoze (Man), N-acetilglukozamina (Glc- NAc), glukoze (Glc), N-acetilgalaktozamina (GalNAc), glukuronske kiseline (Gcu), fukoze (Fuc) i N-acetilneuraminske kiseline (sialinske kiseline), poželjno iz grupe koja se sastoji od GlcNAc, Glc, Gal i GalNAc. Poželjnije S(A)<x>je derivatizovan od Gal ili GalNAc, i najpoželjnije S(A)<x>je derivatizovan iz GalNAc.
[0160] Jedna ili više funkcionalnih grupa A u S(A)<x>mogu biti vezane za šećer ili šećerni derivat S na nekoliko načina. Jedna ili više funkcionalnih grupa A mogu biti vezane za C2, C3, C4 i/ili C6 šećera ili šećernog derivata, umesto hidroksil (OH) grupe. Trebalo bi naglasiti da, s obzirom na to da fukoza nema OH-grupu na C6, ako je A vezan za C6 u Fuc, tada A uzima mesto H-atoma.
[0161] Kada je A jednak azido grupi, poželjno je da je A vezan za C2, C4 ili C6. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, jedan ili više azidnih supstituenata u S(A)<x>mogu biti vezani za C2, C3, C4 ili C6 šećera ili šećernog derivata S, umesto hidroksil (OH) grupe ili, u slučaju 6-azidofukoze (6-AzFuc), umesto atoma vodonika. Alternativno ili dodatno, N-acetil supstituent amino šećernog derivata može biti supstituisan sa azidoacetil supstituentom. U poželjnom primeru izvođenja S(A)<x>je izabran iz grupe koja se sastoji od 2-azidoacetamidogalaktoze (GalNAz), 6-azido-6-deoksigalaktoze (6-AzGal), 6-azido-6-deoksi-2-acetamidogalaktoze (6AzGalNAc), 4-azido-4-deoksi-2-acetamidogalaktoze (4-AzGalNAc), 6-azido-6-deoksi-2-azidoacetamidogalaktoze (6-AzGalNAz), 2-azidoacetamidoglukoze (GlcNAz), 6-azido-6-deoksiglukoze (6-AzGlc), 6-azido-6-deoksi-2-acetamidoglukoze (6-AzGlcNAc), 4-azido-4-deoksi-2-acetamidoglukoze (4-AzGlcNAc) i 6-azido-6-deoksi-2-azidoacetamidoglukoze (6-AzGlcNAz), poželjnije iz grupe koja se sastoji od GalNAz, 4-AzGalNAc, GlcNAz i 6-AzGlcNAc. Primeri S(A)<x>-P pri čemu A je azido grupa su prikazani u daljem tekstu.
[0162] Kada je A keto grupa, poželjno je da je A vezan za C2 umesto OH-grupe od S. Alternativno A može biti vezan za N-atom amino šećernog derivata, poželjno 2-amino šećernog derivata. Šećerni derivat zatim sadrži -NC(O)R<6>supstituent. R<6>je poželjno C<2>- C<24>alkil grupa, izborno supstituisana. Poželjnije, R<6>je etil grupa. U poželjnom primeru izvođenja S(A)<x>je izabran iz grupe koja se sastoji od 2-deoksi-(2-oksopropil)galaktoze (2-ketoGal), 2-N-propionilgalaktozamina (2-N-propionilGalNAc), 2-N-(4-oksopentanoil)galaktozamina (2-NLevGal) i 2-N-butirilgalaktozamina (2-N-butirilGalNAc), poželjnije 2-ketoGalNAc i 2-N-propionilGalNAc. Primeri S(A)<x>-P pri čemu A je keto grupa su prikazani u daljem tekstu.
[0163] Kada je A - alkinil grupa, poželjno terminalna alkinil grupa ili (hetero)cikloalkinil grupa, poželjno je da je navedena alkinil grupa prisutna na 2-amino šećernom derivatu. Primer S(A)<x>u kome A je alkinil grupa je 2-(but-3-ionska kiselina amido)-2-deoksi-galaktoza. Primer S(A)<x>-P gde A je alkinil grupa je prikazan u daljem tekstu.
[0164] Jedinjenja formule S(A)<x>-P, u kojima je nukleozid monofosfat ili nukleozid difosfat P vezan za šećerni derivat S(A)<x>, su poznata u stanju tehnike. Na primer Wang et al., Chem. Eur. J. 2010, 16, 13343-13345, Piller et al., ACS Chem. Biol. 2012, 7, 753, Piller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5459-5462 i WO 2009/102820, navode određeni broj jedinjenja S(A)<x>-P i njihove sinteze.
[0165] U poželjnom primeru izvođenja nukleozid mono- ili difosfat P u S(A)<x>-P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), gunaozin difosfata (GDP), timidin difosfata (TDP), citidin difosfata (CDP) i citidin monofosfata (CMP), poželjno UDP.
[0166] Nekoliko primera (5 - 10) uridin difosfata vezanih za azido-, keto- i alkinil-supstituisane šećere i šećerne derivate, S(A)<x>-UDP, prikazano je u daljem tekstu.
[0167]
[0170] Poželjno, S(A)<x>-P je izabran iz grupe koja se sastoji od GalNAz-UDP (5), 6-AzGal-UDP (6), 6-AzGalNAc-UDP (7), 4-AzGalNAz-UDP, 6-AzGalNAz-UDP, 6-AzGlc-UDP, 6-AzGlcNAz-UDP, 2-ketoGal-UDP (8), 2-N-propionil-GalNAc-UDP (9, gde je R<6>jednako etil) i 2-(but-3-ionska kiselina amido)-2-deoksi-galaktoza-UDP (10).
[0171] Najpoželjnije, S(A)<x>-P je GalNAz-UDP (5) ili 4-AzGalNAc-UDP (7). Sinteze GalNAz-UDP (5) i 6-AzGalNAc-UDP (7) su navedene u Piller et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005, 15, 5459-5462 i Wang et al., Chem. Eur. J.2010, 16, 13343-13345.
[0172] Sinteza 2-ketoGal-UDP (8) je navedena u Qasba et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 16162, naročito u Pratećim informacijama
[0173] Sinteza 2-(but-3-inoinske kiseline amido)-2-deoksi-galaktoza-UDP je navedena u WO 2009/102820.
[0174] Kao što je opisano u prethodnom tekstu, u postupku za modifikaciju antitela koje je ovde opisano, S(A)<x>-P može biti bilo koji nukleotid šećernog derivata koji je supstrat za pogodan katalizator galaktoziltransferazu.
[0175] Poželjan primer izvođenja postupka koji je ovde opisan je prikazan na Slici 4. Slika 4 prikazuje monoklonsko antitelo (mAb) koje sadrži, izborno fukozilovani (b = 0 ili 1), supstituent jezgra-GlcNAc na svakom teškom lancu antitela. Ovi supstituenti jezgra-GlcNAc (b = 0) i jezgra-GlcNAc(Fuc) (b = 1) su prevedeni u GlcNAc- GalNAz i GlcNAc(Fuc)-GalNAz supstituente, respektivno. Navedena konverzija je izvedena preko reakcije sa GalNAz- UDP (5) u prisustvu mutantnog GalT Y289L enzima kao katalizatora.
[0176] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na postupak za pripremu modifikovanog antitela, postupak koji sadrži:
[0178] (a) obezbeđivanje antitela koje sadrži, izborno fukozilovani, supstituent jezgra N-acetilglukozamina (supstituent jezgra-GlcNAc), nakon čega sledi (b) dovođenje u kontakt navedenog antitela sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta.
[0179] [0112] Antitelo koje sadrži izborno fukozilovani supstituent jezgra-GlcNAc može biti obezbeđeno na različite načine. Navedena antitela, npr. cela antitela, fragmenti antitela, genetički konstruisana antitela, itd. mogu biti obezbeđena pomoću postupaka koji su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Na primer Fab ili Fc fragmenti mogu biti pripremljeni proteolitičkim razlaganjem značajno intaktnih molekula imunoglobulina sa papainom, ili rekombinantnom ekspresijom željenih delova teškog i lakog lanca imunoglobulina.
[0180] U jednom primeru izvođenja, postupak koji je ovde opisan dalje sadrži deglikozilaciju glikana antitela koji ima jezgro N-acetilglukozamin, u prisustvu endoglikozidze, u cilju dobijanja antitela koje sadrži supstit]uent jezgra N-acetilglukozamina, pri čemu navedeno jezgro N-acetilglukozamina i navedeni supstituent jezgra N-acetilglukozamina su izborno fukozilovani. U zavisnosti od prirode glikana, može biti izabrana pogodna endoglikozidaza. Endoglikozidaza je poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo A, Endo F, Endo M, Endo D i Endo H enzima i/ili njihove kombinacije, čiji izbor zavisi od prirode glikana. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S, Endo S49, Endo F ili njihova kombinacija. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S, Endo F ili njihova kombinacija. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S. U sledećem poželjnom primeru izvođenja endoglikozidaza je Endo S49.
[0181] Antitelo glikan koji ima jezgro N-acetilglukozamin je ovde definisan kao antitelo koje sadrži glikan koji je vezan za antitelo preko C1, izborno fukozilovanog, GlcNAc (jezgro-GlcNAc). Osim navedenog jezgra-GlcNAc i izbornog Fuc, navedeni glikan sadrži najmanje jedan šećer ili šećerni derivat.
[0182] Poželjan primer izvođenja navedenog koraka deglikozilacije postupka je prikazan na Slici 5, gde je smeša glikoformi antitela G2F, G1F, G0F, G2, G1 i G0, i moguće još glikoformi kao što su triantenarni glikani, prevedena je u antitela koja sadrže, izborno fukozilovani (b je 0 ili 1), supstituent jezgra N-acetilglukozamina. Glikoforme G2F, G1F, G0F, G2, G1 i G0 su prikazane na Slici 1.
[0183] Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na postupak za pripremu modifikovanog antitela, pri čemu postupak sadrži: (a) deglikozilaciju antitela glikana koje ima jezgro N-acetilglukozamin, u prisustvu endoglikozidaze, u cilju dobijanja antitela koje sadrži supstituent jezgra N-acetilglukozamina, pri čemu je navedeni supstituent jezgra N-acetilglukozamina izborno fukozilovan, nakon čega sledi (b) dovođenje u kontakt navedenog antitela sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, gde S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde A je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, gde P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), i gde je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta.
[0184] Dodatni postupak za pripremu modifikovanog antitela je ovde opisan, pri čemu postupak sadrži:
[0185] 1. a) deglikozilaciju antitela glikana koje ima jezgro N-acetilglukozamin, u prisustvu endoglikozidaze, u cilju dobijanja antitela koje sadrži supstituent jezgra N-acetilglukozamina, pri čemu je navedeni supstituent jezgra N-acetilglukozamina izborno fukozilovan, pri čemu je navedeni supstituent jezgra N-acetilglukozamina je vezan preko N-glikozidne veze za atom azota amida u bočnom lancu aminokiseline asparagina antitela, i pri čemu navedena endoglikozidaza je Endo S, Endo S49, Endo F, ili njihova kombinacija; nakon čega sledi
[0186] 2. (b) dovođenje u kontakt navedenog antitela sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, gde S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde A je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, gde P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), gde je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta.
[0187] U poželjnom primeru izvođenja, navedena endoglikozidaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo F, ili njihove kombinacije. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, endoglikozidaza je Endo S, Endo F ili njihova kombinacija. U još poželjnijem primeru izvođenja, navedena endoglikozidaza je Endo S. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedena endoglikozidaza je Endo S49. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedena endoglikozidaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo S49, Endo F i/ili njihove kombinacije. Poželjnije, navedena endoglikozidaza je Endo S ili Endo S49. Najpoželjnije, navedena endoglikozidaza je Endo S ili Endo F.
[0188] Endo S, Endo A, Endo F, Endo M, Endo D i Endo H su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Endo S49 je opisan u WO 2013/037824 (Genovis AB). Endo S49 je izolovan iz Streptococcus pyogenes NZ131 i homolog je sa Endo S. Endo S49 ima specifičnu aktivnost endoglikozidaze na nativnom IgG i cepa raznovrsnije Fc glikane od Endo S.
[0189] [0120] U poželjnom primeru izvođenja, navedeno jezgro N-acetilglukozamina je prisutno na nativnom N-glikozilacionom mestu antitela. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je IgG i navedeno jezgro N-acetilglukozamina je prisutno na nativnom N-glikozilacionom mestu od IgG. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je IgG, navedeno jezgro N-acetilglukozamina je prisutno na nativnom N-glikozilacionom mestu od IgG, i nativno mesto je N297 N-glikozilaciono mesto od IgG. N297 N-glikozilacionomesto je prisutno u Fc regionu teškog lanca IgG antitela.
[0190] Kada je navedeno jezgro N-acetilglukozamina prisutno na nativnom N-glikozilacionom mestu IgG antitela, poželjno je da je endoglikozidaza izabrana iz grupe koja se sastoji od Endo S, Endo S49 i Endo F, i njihove kombinacije. Poželjnije, endoglikozidaza je Endo S, Endo S49 ili Endo F, čak poželjnije Endo S ili Endo F, i najpoželjnije Endo S. Kao što je poznato u stanju tehnike, Endo H, Endo M, Endo F1 su manje pogodni za deglikozilaciju glikana koji je prisutan na nativnom mestu IgG antitela. Naročito, oni su manje pogodni za deglikozilaciju glikana koji je prisutan na N297.
[0192] Modifikovano antitelo
[0194] Pronalazak se takođe odnosi na antitelo koje se može dobiti pomoću postupka za pripremu modifikovanog antitela kao što je ovde opisano. Navedeni postupak za pripremu modifikovanog antitela, kao i poželjnih njegovih primera izvođenja, je opisan detaljno u prethodnom tekstu.
[0195] Pronalazak se dalje odnosi na antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent, pri čemu GlcNAc je N-acetilglukozamin, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituent je vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog supstituenta GlcNAc-S(A)<x>, i pri čemu navedeni N-acetilglukozamin je izborno fukozilovan. Takvo antitelo je ovde označeno kao modifikovano antitelo.
[0196] U jednom primeru izvođenja modifikovano antitelo je formule (4), pri čemu AB predstavlja antitelo, GlcNAc je N-acetilglukozamin, Fuc je fukoza, b je 0 ili 1 i y je 1 do 20, i pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od azido grupe, keto grupe i alkinil grupe i x je 1, 2, 3 ili 4. U poželjnom primeru izvođenja, y je 1 do 10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, čak poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
[0197]
[0199] Šećerni derivat S(A)<x>u GlcNAc-S(A)<x>supstituentu modifikovanog antitela može na primer biti vezan za C4 od GlcNAc preko β(1,4)-glkozidne veze ili za C3 navedenog GlcNAc preko α(1,3)-glikozidne veze. N-acetilglukozamin navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta je vezan preko C1 za antitelo, poželjno preko N-glikozidne veze za atom azota amida u bočnom lancu aminokiseline asparagina antitela (GlcNAcβ1-Asn). GlcNAc u navedenom GlcNAc-S(A)<x>supstituentu je izborno fukozilovan. Da li je šećerni derivat S(A)<x>u GlcNAc-S(A)<x>supstituentu modifikovanog antitela vezan za C4 od GlcNAc preko β(1,4)-glikozidne veze ili za C3 navedenog GlcNAc preko α(1,3)-glikozidne veze zavisi od katalizatora koji je korišćen u postupku za pripremu modifikovanog antitela. Kada je postupak izveden u prisustvu katalizatora β(1,4)-galaktoziltransferaze tada se vezivanje javlja preko C1 od S(A)<x>i C4 od GlcNAc preko β(1,4)-glikozidne veze. Kada je postupak izveden u prisustvu katalizatora α(1,3)-galaktoziltransferaze tada se vezivanje javlja preko C1 od S(A)<x>i C3 od GlcNAc preko α(1,3)-glikozidne veze.
[0200] Kada je A - azido funkcionalna grupa, modifikovano antitelo je označeno kao azidommodifikovano antitelo. Kada je A - keto funkcionalna grupa, modifikovano antitelo je označeno kao keto-modifikovano antitelo. Kada je A - alkinil funkcionalna grupa, modifikovano antitelo je označeno kao alkinom-modifikovano antitelo. Poželjno, modifikovano antitelo je azidom- ili keto-modifikovano antitelo, poželjnije azidom-modifikovano antitelo.
[0201] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni S(A)<x>je poreklom od šećera ili šećernog derivata izabranog iz grupe koja se sastoji od galaktoze (Gal), manoze (Man), N-acetilglukozamina (GlcNAc), glukoze (Glc), N-acetilgalaktozamina (GalNAc), glukuronske kiseline (Gcu), fukoze (Fuc) i N-acetilneuramininske kiseline (sialinske kiseline), poželjno Gal, GlcNAc, glukoze i GalNAc.
[0202] U sledećem poželjnom primeru izvođenja S(A)<x>je izabran iz grupe koja se sastoji od GalNAz, 6-AzGal, 6-AzGalNAc, 4-AzGalNAz, 6-AzGalNAz, 6-AzGlc, 6-AzGlcNAz, 2-ketoGal, 2-N-propionilGalNAc i 2-(but-3-ioniska kiselina amido)-2-deoksi-galaktoza. Najpoželjnije, S(A)<x>je GalNAz ili 4-AzGalNAc.
[0203] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, modifikovano antitelo je azidommodifikovano antitelo, tj funkcionalna grupa A u S(A)<x>je azido grupa. Azidom-modifkovano antitelo može imati strukturu prikazanu u daljem tekstu, pri čemu S(A)<x>, sa A je azido, je prikazan kao S[(Q)p-N<3>]<x>:
[0206]
[0209] pri čemu
[0211] b je 0 ili 1;
[0212] x je 1, 2, 3 ili 4;
[0213] S je šećerni derivat;
[0214] p je 0 ili 1;
[0215] Q je -N(H)C(O)CH<2>- ili -CH<2>-;
[0216] y je 1 - 20;
[0217] i pri čemu AB je antitelo, S je šećer ili šećerni derivat, GlcNAc je N-acetilglukozamin. GlcNAc je izborno fukozilovan (b je 0 ili 1).
[0218] Azidom-modifikovano antitelo može da sadrži 1 do 20 izborno fukozilovanih supstituenata GlcNAc-S(A)<x>(y je 1 do 20). Poželjno, y je 1 do 10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, čak poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
[0219] Vrednost od p i priroda Q zavisi od azidom-supstituisanog šećernog derivata S(A)<x>koji je prisutan u azidom-modifikovanom antitelu. Ako je azido grupa u S(A)<x>prisutna na C2, C3, ili C4 položaju šećera ili šećernog derivata, tj. umesto šećer-OH-grupe, tada je p jednako 0. Ako je azido grupa u S(A)<x>jednaka 2-azidoacetamido grupi, tj. S(A)<x>je npr. GalNAz ili GlcNAz, tada je p jednako 1 i Q je -N(H)C(O)CH<2>-. Ako je azido grupa u S(A)<x>prisutna na C6 položaju šećera ili šećernog derivata, tj. umesto šećer-OH-grupe ili u slučaju 6-AzFuc umesto H-atoma, tada je p jednako 1 i Q je -CH<2>-.
[0220] [0132] Poželjno modifikovano antitelo je monoklonsko antitelo, poželjnije izabrano iz grupe koja se sastoji od IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitela. Čak poželjnije navedeno antitelo je IgG antitelo, i najpoželjnije navedeno antitelo je IgG1 antitelo. Kada je modifikovano antitelo celo antitelo, antitelo poželjno sadrži dva ili više, poželjnije dva, GlcNAc-S(A)<x>supstituenta, pri čemu su navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituenti izborno fukozilovani. Međutim, ako je modifikovano antitelo fragment antitela, npr. Fab ili Fc fragment, antitelo može imati samo GlcNAc-S(A)<x>supstituent, koji je izborno fukozilovan.
[0221] U modifikovanom antitelu, GlcNAc-S(A)<x>supstituent može da se nalazi bilo gde na antitelu, uz uslov da navedeni supstituent ne ometa vezivanje antigena za antigen-vezujuće mesto antitela. U jednom primeru izvođenja, navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituent se nalazi u Fc domenu atitela, poželjnije u CH<2>domenu. U sledećem primeru izvođenja, navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituent se nalazi na Fab domenu antitela. U sledećem primeru izvođenja, navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituent se nalazi na Fab ili Fc fragmentu antitela.
[0222] Kao što je opisan u prethodnom tekstu, postupak za pripremu modifikovanog-antitela može da obezbedi modifikovana antitela koja sadrže više od jednog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta. Broj supstituenata na antitelima zavisi ne samo od prirode antitela koje se modifikuje (npr. celo antitelo, jedan lanac, fragment, itd.), ali takođe od broja supstituenata jezgra-GlcNAc koji je prisutan na antitelu koje se modifikuje.
[0224] Postupak za pripremu konjugata antitela
[0226] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu modifikovanog antitela koje je ovde opisano u pripremi konjugata antitela (AC) za upotrebu kao lek. Konjugat antitela (AC) je ovde definisan kao antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i koje je konjugovano sa cittotoksinom kao molekulom od interesa (D) preko linkera (L). Konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku može biti konjugovan sa jednim ili više od jednog molekula od interesa (D) preko navedenog linkera (L).
[0227] [0136] Ovde je opisan molekul od interesa koji može na primer biti reporter molekul, aktivna supstanca, enzim, (nekatalitički) protein, peptid, oligonukleotid, glikan, azid ili (hetero)cikloalkinil grupa, poželjno bivalentna ili bifunkcionalna (hetero)cikloalkinil grupa. Ovde su opisani dodatni primeri molekula od interesa koji mogu da obuhvataju dijagnostičko jedinjenje, aminokiselinu (uključujući neprirodnu aminokiselinu), polipeptid, (poli)etilen glikol diamin (npr.1,8-diamino-3,6-dioksaoktan ili ekvivalente koji sadrže duže lance etilen glikola), lanac polietilen glikola, lanac polietilen oksida, lanac polipropilen glikola, lanac polipropilen oksida i 1,x-diaminoalkan (gde x je broj atoma ugljenika u alkanu). Molekul od interesa opisan ovde koji može biti izabran iz grupe koja se sastoji od aminokiseline (naročito lizina), aktivne supstance, reporter molekula, azida i (hetero)cikloalkinil grupe. Dodatni molekul od interesa je opisan ovde koji može biti izabran iz grupe koja se sastoji od aktivne supstance, reporter molekula, azida i (hetero)cikloalkinil grupe.
[0228] Aktivna supstanca je farmakološka i/ili biološka supstanca, tj. supstanca koja je biološki i/ili farmaceutski aktivna, na primer lek ili prolek, dijagnostičko sredstvo, protein, peptid, aminokiselina, glikan, lipid, vitamin, steroid, nukleotid, nukleozid, polinukleotid, RNK ili DNK. Primeri pogodnih peptidnih obeležeivača obuhvataju peptide koji prodiru u ćeliju kao što je humani laktoferin ili poliarginin. Primer pogodnog glikana je oligomanoza.
[0229] Aktivna supstanca može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od lekova i prolekova. Poželjno, aktivna supstanca može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od farmaceutski aktivnih jedinjenja, naročito jedinjenja niske do srednje molekulske težine (npr. oko 200 do oko 1500 Da, poželjno oko 300 do oko 1000 Da), kao što su na primer citotoksini, antivirusna sredstva, antibakterijska sredstva, peptidi i oligonukleotidi. Prema opredmetnom pronalasku molekul od interesa je citotoksin. Primeri citotoksina obuhvataju kaptotecine, staurosporin, doksorubicin, daunorubicin, kolhicin, metotreksat, taksane, kalihemicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivati majtanzina), auristatine, tubulizin M, kriptoficin ili pirolobenzodiazepine (PBDs). Primeri auristatina obuhvataju dolastatin 10, auristatin F, monometil auristatin F (MMAF), auristatin E, monometil auristatin E (MMAE), auristatin PE, auristatin TP i auristatin AQ. Primeri majtanzina i majtanzinoida obuhvataju mertanzin i ansamitocin.
[0230] Reporter molekul je molekul čije prisustvo se lako detektuje, na primer dijagnostičko sredstvo, boja, fluorofora, radioaktivni izotop obeleživač, kontrastno sredstvo, sredstvo za magnetni rezonantniimadžing ili obeleživač mase. Primeri fluorofora obuhvataju sve vrste Alexa Fluor (npr. Alexa Fluor 555), cijaninske boje (npr. Cy3 ili Cy5), derivate kumarina, fluorescein, rodamin, alofikocijanin i hromomicin.
[0231] Primer radioaktivnog izotopa obeleživača obuhvataju<99m>Tc,<111>In,<18>F,<14>C,<64>Cu,<131>I ili<123>I, koji može ili ne mora biti vezan preko helatirajuće grupe kao što je DTPA, DOTA, NOTA ili HYNIC.
[0232] U konjugatu antitela (AC) za upotrebu kao lek prema pronalasku, molekul od interesa je konjugovan sa antitelom preko linkera (L). Linkeri ili vezujuće jedinice su dobro poznati u stanju tehnike, i opisani su detaljnije u daljem tekstu.
[0233] [0142] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu konjugata antitela, koji sadrži reakciju modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, pri čemu navedeni konjugat linkera sadrži funkcionalnu grupu B i jedan ili više molekula od interesa, pri čemu navedena funkcionalna grupa B je funkcionalna grupa koja je sposobna da reaguje sa funkcionalnom grupom A od GlcNAc-S(A)<x>supstituenta na navedenom modifikovanom antitelu. Navedeni konjugat linkera poželjno je formule BL(D)<r>, gde B, L i D su kao što su definisani u prethodnom tekstu, i r je 1 - 20, poželjno r je 1 - 10, poželjnije r je 1 - 8, čak poželjnije r je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, čak poželjnije r je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije r je 1 ili 2.
[0234] Komplementarne funkcionalne grupe B za funkcionalnu grupu A na modifikovanom antitelu (A je azido grupa, keto grupa ili alkinil grupa) su poznate u stanju tehnike.
[0235] Kada je A - azido grupa, vezivanje azidom-modifikovanog antitela i konjugata linkera poželjno se odigrava preko reakcije cikloadicije. Funkcionalna grupa B je zatim poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji od alkinil grupa, poželjno terminalnih alkinil grupa, i (hetero)cikloalkinil grupa.
[0236] Kada je A - keto grupa, vezivanje keto-modifikovanog antitela sa konjugatom linkera se poželjno odigrava preko selektivne konjugacije sa hidroksilamin derivatima ili hidrazinima, rezultujući u respektivno oksimima ili hidrazonima. Funkcionalna grupa B je zatim poželjno primarna amino grupa, npr. -NH<2>grupa, aminooksi grupa, npr. -O-NH<2>, ili hidrazinil grupa, npr. -N(H)NH<2>. Konjugat linkera je zatim poželjno H<2>N-L(D)<r>, H<2>N-O-L(D)<r>ili H<2>N-N(H)-L(D)<r>respektivno, gde L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0237] Kada je A jednako alkinil grupa, vezivanje alkinom-modifikovanog antitela sa konjugatom linkera poželjno se odigrava preko reakcije cikloadicije, poželjno 1,3-dipolarne cikloadicije. Funkcionalna grupa B je zatim poželjno 1,3- dipol, kao što je azid, nitron ili nitril oksid. Konjugat linkera je zatim poželjno N<3>-L(D)<r>, gde L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0238] Pronalazak se na taj način odnosi na postupak za pripremu konjugata antitela, koji sadrži reakciju modifikovanog antitela opisana ovde sa konjugatom linkera, u kome:
[0240] 1. a. Kada je navedeno modifikovano antitelo - azidom-modifikovano antitelo, navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu ili alkinil grupu, i jedan ili više molekula od interesa; ili
[0241] 2. b. Kada je navedeno modifikovano antitelo - keto-modifikovano antitelo, navedeni konjugat linkera sadrži primarnu grupu amina, aminooksi grupu ili hidrazinil grupu, i jedan ili više molekula od interesa; ili
[0242] 3. c. kada je navedeno modifikovano antitelo - alkinom-modifikovano antitelo, navedeni konjugat linkera sadrži azido grupu, i jedan ili više molekula od interesa.
[0243] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek, pri čemu konjugat antitela se može dobiti pomoću postupka koji sadrži reakciju azidommodifikovanog antitela sa konjugatom linkera, pri čemu navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više citotoksina kao molekula od interesa i pri čemu se antitelo specifično vezuje za antigen kancera.
[0244] U navedenom postupku, azid na azidom-modifikovanom antitelu prema pronalasku reaguje sa alkinil grupom, poželjno terminalnom alkinil grupom, ili (hetero)cikloalkinil grupom konjugata linkera preko reakcije cikloadicije. Reakcija cikloadicije molekula koji sadrži azid sa molekulom koji sadrži terminalnu alkinil grupu ili (hetero)cikloalkinil grupu je jedna od reakcija koja je poznata u stanju tehnike kao "klik hemija". U slučaju konjugata linkera koji sadrži terminalnu alkinil grupu, navedena reakcija cikloadicije trebalo bi da se izvede u prisustvu pogodnog katalizatora, poželjno Cu(I) katalizatora. Međutim, prema pronalasku, konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu, poželjnije tenzionu (hetero)cikloalkinil grupu. Kada je (hetero)cikloalkinil – tenziona (hetero)cikloalkinil grupa, prisustvo katalizatora nije neophodno, i navedena reakcija može čak da se javi spontano preko reakcije označene tenziono-stimulisana azid-alkin cikloadicija (SPAAC). Ovo je jedna od reakcija poznatih u stanju tehnike kao "klik hemija bez metala". Tenzione (hetero)cikloalkinil grupe su poznate u stanju tehnike i opisane su detaljnije u daljem tekstu.
[0245] Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, postupak za pripremu konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku sadrži reakciju modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, pri čemu navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više citotoksina kao molekula od interesa, pri čemu navedeno modifikovano antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent, pri čemu GlcNAc je jezgro N-acetilglikozamin, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu je navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta, i pri čemu navedeni GlcNAc je izborno fukozilovan. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, navedena (hetero)cikloalkinil grupa je tenziona (hetero)cikloalkinil grupa.
[0246] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, navedeni postupak za pripremu konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku sadrži korake:
[0248] 1. (i) dovođenja u kontakt antitela koji sadrži supstituent jezgra N-acetilglukozamina (GlcNAc) sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu pogodnog katalizatora, pri čemu navedeni supstituent jezgra N-acetilglukozamina je izborno fukozilovan, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), da bi se dobilo modifkovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta, i pri čemu navedeno modifikovano antitelo je prema formuli (4):
[0251]
[0254] gde:
[0255] S(A)<x>i x su kao što su definisnai u prethodnom tekstu;
[0256] AB predstavlja antitelo;
[0257] GlcNAc je N-acetilglukozamin;
[0258] Fuc je fukoza;
[0259] b je 0 ili 1; i
[0260] y je 1 do 20; i
[0262] 2. (ii) reakciju navedenog modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, pri čemu navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa.
[0263] [0152] Prednost ovog primera izvođenja postupka za pripremu konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku je ta da prisustvo bakarnog katalizatora nije neophodno. Navedeni postupak na taj način se odvija u odsustvu bakarnog katalizatora. Prisustvo bakarnog katalizatora u navedenom postupku ima nekoliko nedostataka, međutim. Generalno, najpogodniji postupak za konugaciju azida sa terminalnim alkinima zahteva prisustvo Cu(I). Bakar (I) je tipično generisan in situ od Cu(II), što zahteva dodavanje odgovarajućeg redukcionog sredstva, npr. DTT, natrijum askorbata ili hidrazina i dodavanje pogodnog liganda da bi se bakar održavao u Cu(I) oksidacionom stanju. Međutim, ekstenzivna optimizacija i fino podeševanje uslova može biti potrebno za nalaženje optimalnih parametara za efikasnu konverziju. Ipak čak pod takvim uslovima, istovremeno formiranje reaktivnih kiseoničnih vrsta ne može uvek biti potpuno izbegnuto, koje zauuzvrat mogu da indukuju oksidativno oštećenje proteina, na primer oksidaciju metionina, histidina, cisteina ili disulfidnih veza. Drugi protokoli su koristili izvore bakra (I) kao što je CuBr za obeležavanje fiksiranih ćelija i sintezu glikoproteina. U ovim slučajevima, nestabilnost CuI na vazduhu nameće potrebu za velikim viškom Cu (više od 4 mm) i ligandom za efikasne reakcije, što takođe daje probleme vezane za oštećenje ili taloženje proteina, plus prisustvo rezidualnog metala posle prečišćavanja. Nađeno je da konjugacija antitela koja sadrže azid sa terminalnim alkinima u prisustvu bakra dovodi do ekstenzivnog formiranja sporednih proizvoda preko neželjene oksidacije aminokiseline. Na primer, masena spektralna analiza visoke rezolucije lakog lanca trastuzumaba (LC) posle bakrom-katalizovane konjugacije ukazuje na formiranje od >20% vrsta sa molekulskim težinama 16/+18 (videti Sliku 31). Detaljna analiza peptidnog fragmenata teškog lanca trastuzumaba (HC) posle razlaganja tripsinom ukazuje na oksidaciju najmanje jednog određenog histidina kao 69%, kao što je ilustrovano u Primeru 39. Detaljna analiza peptidnog fragmenata lakog lanca trastuzumaba (LC) posle razlaganja tripsinom ukazuje na oksidaciju najmanje jednog određenog metionina, što je takođe ilustrovano u Primeru 39.
[0264] Molekuli od interesa su opisani detaljnije u prethodnom tekstu. Molekul od interesa može biti izabran iz grupe koja se sastoji od aktivne supstance, reporter molekula, azida i (hetero)cikloalkinil grupe. Kada je molekul od interesa - (hetero)cikloalkinil grupa, navedena grupa može biti (hetero)ciklooktin grupa. Primeri struktura (hetero) ciklooktin grupa su opisane detaljnije u daljem tekstu.
[0265] Postupak za pripremu modifikovanog antitela opisanog ovde je poželjno izveden na temperaturi u opsegu od oko 20 do oko 50°C, poželjnije u opsegu od oko 25 do oko 45°C, čak poželjnije u opsegu od oko 30 do oko 40°C, i najpoželjnije u opsegu od oko 32 do oko 37°C.
[0266] Postupak je poželjno izveden na pH u opsegu od oko 5 do oko 9, poželjno u opsegu od oko 5.5 do oko 8.5, poželjnije u opsegu od oko 6 do oko 8. Najpoželjnije, postupak je izveden na pH u opsegu od oko 7 do oko 8.
[0267] Postupak je poželjno izveden u vodi. Poželjnije, navedena voda je prečišćena voda, čak poželjnije ultra-čista voda ili voda tipa I kao što je definisana prema ISO 3696. Pogodna voda je na primer milliQ® voda. Navedena voda je poželjno puferisana, na primer sa fosfatnopuferisanim fiziološkim rastvorom ili tris. Pogodni puferi su poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. U poželjnom primeru izvođenja, postupak je izveden u milliQ vodi koja je puferisana sa fosfatno puferisanim fiziološkim rastvorom ili tris.
[0268] Poželjno, konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu. U poželjnom primeru izvođenja navedeni konjugat linkera ima formulu (11):
[0269]
[0271] gde:
[0272] L je linker;
[0273] D je citotoksin;
[0274] r je 1 - 20;
[0275] R<1>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO<2>, -CN, -S(O)<2>R<5>, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe izborno supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti vezana zajedno tako da formiraju anelirani cikloalkil ili anelirani (hetero)aren supstituent, i pri čemu R<5>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
[0276] X je C(R<1>)<2>, O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je R<1>ili L(D)<r>, i pri čemu su L, D i r kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0277] q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q jednako 0, tada je X jednako N-L(D)<r>; i
[0278] a je 5, 6 ili 7.
[0279] U sledećem poželjnom primeru izvođenja navedeni konjugat linkera ima formulu (11b): gde:
[0282]
[0285] L je linker;
[0286] D je citotoksin;
[0287] r je 1 - 20;
[0288] R<1>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO<2>, -CN, -S(O)<2>R<5>, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe izborno supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti vezana zajedno tako da formiraju anelirani cikloalkil ili anelirani (hetero)aren supstituent, i pri čemu R<5>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
[0289] X je C(R<1>)<2>, O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je R<1>ili L(D)<r>, i pri čemu L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu; q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q jednako 0 tada je X jednako N-L(D)<r>; a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7;
[0290] a’ je 0,1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7; i
[0291] a a’ je 5, 6 ili 7.
[0292] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, a a’ je 5 ili 6 i poželjnije a a’ je 5. puferisani fiziološki rastvor ili tris.
[0293] U poželjnom primeru izvođenja, ako je q jednako 1, tada je X jednako C(R<1>)<2>, O, S ili NR<1>.
[0294] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, a je 5, tj. navedena (hetero)cikloalkinil grupa je poželjno (hetero)ciklooktin grupa. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, X je C(R<2>)<2>ili NR<2>. Kada je X jednako C(R<2>)<2>poželjno je da je R<2>jednako vodonik. Kada je X jednako NR<2>, poželjno je da je R<2>jednako L(D)<r>. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, r je 1 do 10, poželjnije, r je 1, 2, 3, 4, 5, 67 ili 8, poželjnije r je 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, poželjnije r je 1, 2, 3 ili 4.
[0295] L(D)<r>supstituent može biti prisutan na C-atomu u navedenoj (hetero)cikloalkinil grupi, ili, u slučaju heterocikloalkinil grupe, na heteroatomu navedene heterocikloalkinil grupe. Kada (hetero)cikloalkinil grupa sadrži supstituente, npr. anelirani cikloalkil, L(D)<r>supstituent takođe može biti prisutan na navedenim supstituentima.
[0296] Postupci za vezivanje linkera L sa (hetero)cikloalkinil grupom na jednom kraju i sa molekulom od interesa na drugom kraju, u cilju dobijanja konjugata linkera, zavise od tačne prirode linkera, (hetero)cikloalkinil grupe i molekula od interesa. Pogodni postupci su poznati u stanju tehnike.
[0297] Poželjno, konjugat linkera sadrži (hetero)ciklooktin grupu, poželjnije zategnutu (hetero)ciklooktin grupu. Pogodne (hetero)cikloalkinil grupe su poznate u stanju tehnike. Na primer DIFO, DIFO2 i DIFO 3 su navedeni u US 2009/0068738. DIBO je naveden u WO 2009/067663. DIBO može izborno biti sulfatiran (S-DIBO) kao što je navedeno u J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 5381. BARAC je naveden u J. Am. Chem. Soc.2010, 132, 3688 - 3690 i US 2011/0207147.
[0298] Poželjni primeri konjugata linkera koji sadrže (hetero)ciklooktin grupu su prikazani u daljem tekstu.
[0299]
[0301] Druge ciklooktin grupe koje su poznate u stanju tehnike su DIBAC (takođe poznate kao ADIBO ili DBCO) i BCN. DIBAC je naveden u Chem. Commun. 2010, 46, 97 - 99. BCN je naveden u WO 2011/136645.
[0302] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni konjugat linkera ima formulu (12), (13), (14), (15) ili (16).
[0303] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedeni konjugat linkera ima formulu (17):
[0306]
[0309] gde:
[0310] R<1>, L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0311] Y je O, S ili NR<2>, gde R<2>je definisan u prethodnom tekstu;
[0312] R<3>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
[0313] R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)<r>, -(CH<2>)<n>-Y-L(D)<r>, halogena, C<1>-C<24>alkil grupe, C<6>- C<24>(hetero)aril grupe, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupe i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupe, pri čemu su alkil grupe izborno prekinute sa jednim ili više heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno izborno supstituisane; i
[0314] n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0315] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, R<1>je vodonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<3>je vodonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, n je 1 ili 2. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<4>je vodonik, Y-L(D)<r>ili -(CH<2>)<n>-Y-L(D)<r>. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<2>je vodonik ili L(D)<r>. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat linkera ima formulu 18:
[0318]
[0321] gde Y, L, D, n i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0322] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedeni konjugat linkera ima formulu (19):
[0325]
[0328] gde L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0329] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedeni konjugat linkera ima formulu (15):
[0332]
[0333] gde L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0334] Reakcija cikloadicije azidom-modifikovanog antitela sa konjugatom linkera koji sadrži poželjan tip ciklooktin grupe BCN-L(D)<r>(17) prikazana je u Šemi 2.
[0337]
[0339] Šema 2
[0341] gde R<1>, R<3>, R<4>, S, Q, Y, L, D, b, p, x, n su kao što su definisani u prethodnom tekstu, i y je 1 -20.
[0342] Vrednost od p i priroda Q zavise od azidom-supstituisanog šećera ili šećernog derivata S(A)<x>koji je prisutan u azidom-modifikovanom antitelu koje je ovde otkrivenio koje je vezano za konjugat linkera. Ako je azid u S(A)<x>prisutan na C2, C3 ili C4 položaju šećera ili šećernog konjugata (umesto šećerne OH-grupe), tada je p jednako 0. Ako je S(A)<x>jednak azidoacetamido-šećernom derivatu, S(A)<x>ne npr. GalNAz ili GlcNAz, tada je p jednak 1 i Q je -N(H)C(O)CH<2>-. Ako je azid u S(A)<x>prisutan na C<6>položaju šećera ili šećernog derivata, tada je p jednako 1 i Q je -CH<2>-.
[0343] Linkeri (L), takođe označeni kao linkerske jedinice, su dobro poznati u stanju tehnike. U konjugatu linkera kao što je ovde opisan, L je vezan za molekul od interesa kao i za funkcionalnu grupu B, kao što je opisan u prethodnom tekstu.
[0344] [0174] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo. Pogodan konjugat linkera za pripremu azidom-modifikovanog antitela je konjugat linkera koji sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i molekul od interesa. Brojni postupci za vezivanje navedene (hetero)cikloalkinil grupe i navedenog molekula od interesa za L poznati su u stanju tehnike. Kao što će biti jasno stručnjaku iz date oblasti tehnike, izbor pogodnog postupka za vezivanje (hetero) cikloalkinil grupe za jedan kraj linkera i molekula od interesa za drugi kraj zavisi od tačne prirode (hetero)cikloalkinil grupe, linkera i molekula od interesa.
[0345] Linker može da ima opštu strukturu F<1>-L(F<2>)<r>, gde F<1>predstavlja funkcionalnu grupu koja je sposobna da reaguje sa funkcionalnom grupom F na funkcionalnoj grupi B kao što je opisana u prethodnom tekstu, npr. (hetero)cikloalkinil grupa, terminalna alkinil grupa, primarni amin, aminooksi grupa, hidrazil grupa ili azido grupa. F<2>predstavlja funkcionalnu grupu koja je sposobna da reaguje sa funkcionalnom grupom F na molekulu od interesa.
[0346] S obzirom na to da više od jednog molekula od interesa može biti vezano za linker, više od jedne funkcionalne grupe F<2>može biti prisutno na L. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, r je 1 do 20, poželjno 1 do 10, poželjnije 1 do 8, čak poželjnije 1, 2, 3, 4, 5 ili 6, čak poželjnije 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije, r je 1 ili 2.
[0347] L može na primer biti izabran iz grupe koja se sastoji od linearnih ili granatih C<1>-C<200>alkilen grupa, C<2>-C<200>alkenilen grupa, C<2>-C<200>alkinilen grupa, C<3>-C<200>cikloalkilen grupa, C<5>-C<200>cikloalkenilen grupa, C<8>-C<200>cikloalkinilen grupa, C<7>-C<200>alkilarilen grupa, C<7>-C<200>arilalkilen grupa, C<8>-C<200>arilalkenilen grupa, C<9>-C<200>arilalkinilen grupa. Izborno alkilen grupe, alkenilen grupe, alkinilen grupe, cikloalkilen grupe, cikloalkenilen grupe, cikloalkinilen grupe, alkilarilen grupe, arilalkilen grupe, arilalkenilen grupe i arilalkinilen grupe mogu biti supstituisane i izborno navedene grupe mogu biti prekinute sa jednim ili više heteroatoma, poželjno 1 do 100 heteroatoma, navedeni heteroatomi su poželjno izabrani iz grupe koja se sastoji od O, S i NR<5>, gde je R<5>nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa. Najpoželjnije, heteroatom je O.
[0348] F, F<1>i F<2>mogu na primer biti nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, R<5>, C<4>- C<10>(hetero)cikloalkin grupa, -CH=C(R<5>)<2>, -C=CR<5>, -[C(R<5>)<2>C(R<5>)<2>O]<q>-R<5>, gde je q u opsegu od 1 do 200, -CN, -N<3>, -NCX, -XCN, -XR<5>, -N(R<5>)<2>, -+N(R<5>)<3>, -C(X)N(R<5>)<2>, -C(R<5>)<2>XR<5>, -C(X)R<5>, -C(X)XR<5>, -S(O)R<5>, -S(O)<2>R<5>, -S(O)OR<5>, -S(O)<2>OR<5>, -S(O)N(R<5>)<2>, -S(O)<2>N(R<5>)<2>, -OS(O)R<5>, -OS(O)<2>R<5>, -OS(O)OR<5>, -OS(O)<2>OR<5>, -P(O)(R<5>)(OR<5>), -P(O)(OR<5>)<2>, -OP(O)(OR<5>)<2>, -Si(R<5>)<3>, -XC(X)R<5>, -XC(X)XR<5>, -XC(X)N(R<5>)<2>, -N(R<5>)C(X)R<5>, -N(R<5>)C(X)XR<5>i -N(R<5>)C(X)N(R<5>)<2>, gde, X je kiseonik ili sumpor i gde R<5>je kao što je definisan u prethodnom tekstu.
[0349] [0179] Primeri pogodnih vezujućih jedinica obuhvataju (poli)etilen glikol diamin (npr. 1,8-diamino-3,6-dioksaoktan ili ekvivalenti koji sadrže duže etilen glikol lance), polietilen glikol ili polietilen oksid lance, polipropilen glikol ili polipropilen oksid lance i 1,x-diaminoalkani gde x je broj atoma ugljenika u alkanu.
[0350] Sledeća klasa pogodnih linkera sadrži linkere koji se mogu odcepiti. Linkeri koji se mogu odcepiti su dobro poznati u stanju tehnike. Na primer Shabat et al., Soft Matter 2012, 6, 1073, navode linkere koji se mogu odcepiti koji sadrže auto-žrtvujuće grupe koje su oslobođene preko biološkog pokretača, npr. enzimatskog cepanja ili oksidacionog događaja. Neki primeri pogodnih linkera koji se mogu odcepiti su peptidni-linkeri koji su odcepljeni po specifičnom prepoznavanju od stane proteaze, npr. katepsina, plazmina ili metaloproteaza, ili linkera na bazi glikozida koji su odcepljeni posle specifičnog prepoznavanja od strane glikozidaze, npr. glukuronidaze, ili nitroaromatika koji su redukovani u hipoksičnim regionima sa niskim sadržajem kiseonika.
[0352] Konjugat antitela
[0354] Pronalazak se odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek koji se može dobiti pomoću postupka za pripremu konjugata antitela koji je ovde opisan. Navedeni postupak za pripremu konjugata antitela i poželjni primeri izvođenja navedenog postupka su detaljno opisani u prethodnom tekstu.
[0355] Pronalazak se prema tome takođe odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek, koji se može dobiti pomoću postupka koji sadrži korake:
[0357] 1. (i) dovođenja u kontakt antitela koje sadrži jezgro N-acetilglukozamina (GlcNAc) supstituenta sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prirustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je navedeno jezgro N-acetilglukozamina supstituenta izborno fukozilovano, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A gde A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), da bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan sa antitelom preko C<1>od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta, i gde je navedeno modifikovano antitelo prema formuli (4):
[0358]
[0361] gde:
[0362] S(A)<x>i x su kao što su definisani u prethodnom tekstu; AB predstavlja antitelo koje specifično vezuje antigen kancera; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
[0364] 2. (ii) reakcije navedenog modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, gde:
[0366] navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu ili alkinil grupu, i jedan ili više molekula od interesa i
[0368] pri čemu je molekul od interesa (Dje ) konjugovan sa antitelom preko linkera (L), i pri čemu navedeni molekul od interesa je citotoksin.
[0369] Pronalazak se dalje odnosi na konjugat antitela prema formuli (20) za upotrebu kao lek:
[0372]
[0374] gde AB je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera, S je šećer ili šećerni derivat, GlcNAc je N-acetilglukozamin, gde y je 1 - 20, i gde su L, D, X, R<1>, Q, a, b, p, r, x, y i q kao što su definisani u prethodnom tekstu, kao i njegove poželjne primere izvođenja.
[0375] Pronalazak se dalje odnosi na konjugat antitela prema formuli (20b) za upotrebu kao lek:
[0376]
[0378] gde AB je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera, S je šećer ili šećerni derivat, GlcNAc je N-acetilglukozamin, gde y je 1 - 20, i gde su L, D, X, R<1>, Q, a, a’, b, p, r, x, y i q kao što su definisani u prethodnom tekstu, kao i njegove poželjne primere izvođenja.
[0379] U konjugovanom antitelu formule (20) i (20b), GlcNAc je izborno fukozilovan (b je 0 ili 1). antitelo može da sadrži do 20 konjugovanih supstituenata (y je 1 - 20). Poželjno y je 1 -10, poželjnije y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, čak poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i najpoželjnije y je 1 ili 2.
[0380] Poželjne strukture šećernog derivata (S), linkera (L), supstituenta R<1>i poželjne vrednosti za r i a su detaljno opisani u prethodnom tekstu.
[0381] Kao što je opisano u prethodnom tekstu, vrednost p i priroda Q zavise od azidomsupstitiuisanog šećera ili šećernog derivata S(A)<x>koji je prisutan u azidom-modifikovanom antitelu koji je ovde otkriven koji je vezan za konjugat linkera. Ako je azid u S(A)<x>prisutan na C2, C3 ili C4 položaju šećernog derivata, tada je p jednako 0. Ako je S(A) jednak azidoacetamido-šećernom derivatu, S(A)<x>ne npr. GalNAz ili GlcNAz, tada je p jednako 1 i Q je -N(H)C(O)CH<2>-. Ako je azid u S(A)<x>prisutan na C6 položaju šećera ili šećernog derivata, tada je p jednako 1 i Q je -CH<2>-.
[0382] Molekuli od interesa (D) su citotoksini kao što su detaljnije opisani u prethodnom tekstu. Konjugat antitela može da sadrži više od jednog molekula od interesa. Konjugat antitela sadrži više od jednog molekula od interesa na primer kada je vezan za više od jednog konjugata linkera, kada jedan konjugat linkera sadrži više od jednog molekula od interesa, ili oba.
[0383] Molekul od interesa je citotoksin kao aktivna supstanca, tako da konjugat antitela takođe može biti označen kao konjugat antitela i leka (ADC).
[0384] U poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku je formule (21):
[0385]
[0387] gde AB, L, D, Y, S, Q, x, y, b, p, R<2>, GlcNAc, R<1>R<3>, R<4>, n i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu i gde je navedeni N-acetilglukozamin izborno fukozilovan (b je 0 ili 1).
[0388] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, R<1>, R<3>i R<4>su vodonik i n je 1 ili 2, i u čak poželjnijem primeru izvođenja x je 1.
[0389] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela za upotrebu kao lek je formule (22):
[0392]
[0395] gde su AB, L, D, X, S, b, p, x, y, Q i GlcNAc kao što su definisani u prethodnom tekstu, i gde je navedeni N-acetilglukozamin izborno fukozilovan (b je 0 ili 1).
[0396] Konjugat antitela 22 je primer jedinjenja koje može da postoji u nekoliko regioizomera. Sledeći regioizomer je prikazan u daljem tekstu.
[0397]
[0400] gde su AB, L, D, X, S, b, p, x, y, Q i GlcNAc kao što su definisani u prethodnom tekstu, i gde je navedeni N-acetilglukozamin izborno fukozilovan.
[0401] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela za upotrebu kao lek je formule (15b):
[0404]
[0406] gde su AB, L, D, X, S, b, p, x, y, Q i GlcNAc kao što su definisani u prethodnom tekstu, i gde je navedeni N-acetilglukozamin izborno fukozilovan.
[0407] Na Slici 6, prikazan je sledeći poželjan primer izvođenja konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku. Antitelo koje sadrži dva teška lanca i dva laka lanca sadrži izborno fukozilovano jezgro-GlcNAc na svakom teškom lancu. Konjugat linkera prema formuli (17) je vezan za antitelo preko reakcije cikloadicije ciklooktinil grupe navedenog konjugata linkera sa azidom na azidom-modifikovanom antitelu koje je ovde opisano koji ima -GlcNAc-GalNAz supstituent.
[0408] Pronalazak se odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, za upotrebu kao lek. Poželjni primeri izvođenja navedenog konjugata antitela su opisani detaljnije u prethodnom tekstu.
[0410] Konjugat antitela i leka
[0412] Kada je molekul od interesa u konjugatu antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku – aktivna supstanca, konjugat antitela takođe biti označen kao konjugat antitela i leka (ADC). Predmetni pronalazak se na taj način takođe odnosi na konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek, pri čemu je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L); pri čemu je navedeni molekul od interesa (D) citotoksin.
[0413] Pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek koji se može dobiti pomoću postupka za pripremu konjugata antitela opisanog ovde, gde je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L); pri čemu je navedeni molekul od interesa (D) je citotoksin. Navedeni postupak za pripemu konjugata antitela i poželjni primeri izvođenja navedenog postupka su opisani detaljno u prethodnom tekstu.
[0414] U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela za upotrebu kao lek, koji se može dobiti pomoću postupka koji sadrži korake:
[0416] 1. (i) dovođenja u kontakt antitela koje sadrži jezgro N-acetilglukozamina (GlcNAc) supstituenta sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prirustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je navedeno jezgro N-acetilglukozamina supstituenta izborno fukozilovano, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A gde A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP),
[0417] da bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan sa antitelom preko C<1>od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta, i gde je navedeno modifikovano antitelo prema formuli (4):
[0418]
[0421] gde:
[0422] S(A)<x>i x su kao što su definisani u prethodnom tekstu; AB predstavlja antitelo koje specifično vezuje antigen kancera; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
[0424] 2. (ii) reakcije navedenog modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, gde:
[0425] navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu ili alkinil grupu, i jedan ili više molekula od interesa; i
[0427] pri čemu je molekul od interesa (D) konjugovan sa antitelom preko linkera (L), i pri čemu navedeni molekul od interesa (D) je citotoksin.
[0428] Molekuli od interesa (D) i linkeri (L) su detaljnije opisani u prethodnom i u daljem tekstu.
[0429] Korak (i) i korak (ii) postupka pomoću koga se može dobiti konjugat antitela i leka, kao i njihovi poželjni primeri izvođenja, opisani su detaljno u prethodnom tekstu.
[0430] Konjugat antitela i leka se poželjno može dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, gde x je 1 ili 2, i poželjnije, x je 1. Kao posledica, u modifikovanom antitelu prema formuli (4) kao i u konjufgatu antitela i leka svaka šećerna grupa S je poželjno vezana za 1 ili 2, poželjnije 1, konjugata linkera L(D)<r>.
[0431] Konjugat antitela i leka se poželjno može dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, gde y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, poželjnije y je 1, 2, 3 ili 4 i čak poželjnije, y je 1 ili 2. Dalje je poželjno da r je 1, 2, 3 ili 4, poželjnije r je 1 ili 2 i najpoželjnije r je 1.
[0432] Dalje je poželjno da je u konjugatu antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku antitelo – celo antitelo, pri čemu y je 2. U ovom primeru izvođenja, konjugat antitela i leka može na taj način biti vezan za 2, 4 ili 8 molekula od interesa, poželjnije antitelo je vezano za 2 ili 4 molekula od interesa i najpoželjnije antitelo je vezano za 2 molekula od interesa.
[0433] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitela, poželjnije antitelo je IgG antitelo, poželjno IgG1 antitelo.
[0434] U sledećem primeru izvođenja konjugata antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku, antitelo je fragment antitela. U ovom primeru izvođenja, poželjno je da je y jednako 1.
[0435] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, x je 1 i y je 1. U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, x je 2 i y je 2. Dalje je poželjno da je r jednako 1. U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, x je 1, y je 1 i r je 1. U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, x je 1, y je 2 i r je 1. U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, x je 2, y je 2 i r je 1.
[0436] U poželjnom primeru izvođenja konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek se može dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, pri čemu u koraku (ii) navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo, i pri čemu navedeni konjugat linkera ima formulu (11) ili (11b):
[0439]
[0441] gde:
[0442] D i L su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0443] r je 1 - 20;
[0444] R<1>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO<2>, -CN, -S(O)<2>R<5>, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa i gde su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe izborno supstituisane, gde dva supstituenta R<1>mogu biti vezana zajedno tako da formiraju anelirani cikloalkil ili anelirani (hetero)aren supstituent, i gde R<5>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupe, C<6>- C<24>(hetero)aril grupe, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupe i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupe;
[0445] X je C(R<1>)<2>, O, S ili NR<2>, gde R<2>je R<1>ili L(D)<r>gde L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0446] q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q jednako 0, tada je X jednako N-L(D)<r>;
[0447] pri čemu, u formuli 11, a je 5, 6 ili 7,
[0448] i pri čemu, u formuli 11b
[0449] a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7;
[0450] a’ je 0,1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7; i
[0451] a+a’ je 5, 6 ili 7.
[0452] Poželjno, a a’ je 5 ili 6 i poželjnije a a’ je 5.
[0453] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku se može dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, pri čemu u koraku (ii) navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo i pri čemu navedeni konjugat linkera ima formulu (12), (13), (14), (15) ili (16).
[0454] U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku se može dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, gde u koraku (ii) navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo i gde navedeni konjugat linkera ima formulu (17):
[0457]
[0460] gde:
[0461] R<1>, L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0462] Y je O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je kao što je definisan u prethodnom tekstu;
[0463] R<3>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
[0464] R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)<r>, -(CH<2>)<n>-Y-L(D)<r>, halogena, C<1>-C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa, pri čemu su alkil grupe izborno prekinute jednim od više heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno izborno supstituisane; i
[0465] n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0466] U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, R<1>je vodonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<3>je vodonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, n je 1 ili 2. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<4>je vodonik, Y-L(D)<r>ili -(CH<2>)<n>-YL(D)<r>. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<2>je vodonik ili L(D)<r>. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat linkera ima formulu 18:
[0467]
[0470] gde su Y, L, D, n i r kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0471] U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku može se dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, pri čemu u koraku (ii) navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo i pri čemu navedeni konjugat linkera ima formulu (19):
[0474]
[0477] gde su L, D i r kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0478] U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku može se dobiti pomoću postupka koji je ovde otkriven, pri čemu u koraku (ii) navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo i pri čemu navedeni konjugat linkera ima formulu (15):
[0481]
[0483] gde su L, D i r kao što su definisano u prethodnom tekstu.
[0484] In vivo eksperimenti efikasnosti pokazuju da konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku ima efekat na zapreminu tumora.
[0485] Pronalazak se dalje odnosi na konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku, gde je molekul od interesa – citotoksin, za upotrebu kao lek.
[0486] Pronalazak se takođe odnosi na upotrebu konjugata antitela i leka koji je ovde otkriven, pri čemu je molekul od interesa – citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera.
[0487] Pronalazak se dalje odnosi na konjugat antitela i leka koji je ovde otkriven, pri čemu je molekul od interesa – citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2-pozitivnog kancera dojke.
[0488] Ovde je takođe otkriven postupak postupak za lečenje kancera primenom konjugata antitela i leka koji je ovde otkriven.
[0489] Ovde je takođe otkriven postupak za lečenje kancera dojke primenom konjugata antitela i leka koji je ovde otkriven.
[0490] Ovde je takođe otkriven postupak za lečenje HER2-pozitivnog kancera dojke primenom konjugata antitela i leka koji je ovde otkriven.
[0491] U poželjnom primeru izvođenja, antitelo u navedenom konjugatu antitela i leka je trastuzumab. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, molekul od interesa je citotoksin, poželjno majtanzinoid, auristatin E, auristatin F, duokarmicin ili pirolobenzodiazepin.
[0492] U konjugatu antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku, molekul od interesa je citotoksin. Pored toga, ovde je opisana aktivna supstanca koja može biti farmakološka i/ili biološka supstanca, tj. supstanca koja je biološki i/ili farmaceutskki aktivna, na primer lek ili prolek, dijagnostičko sredstvo, protein, peptid, aminokiselina, glikan, lipid, vitamin, steroid, polietilenglikol, nukleotid, nukleozid, polinukleotid, RNK ili DNK. Primeri pogodnih peptidnih obeleživača obuhvataju peptide koji prodiru u ćelije kao što je humani laktoferin ili poliarginin. Primer pogodnog glikana je oligomanoza.
[0493] [0223] Aktivna supstanca može biti izabarana iz grupe koja se sastoji od lekova i prolekova. Poželjno, aktivna supstanca može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od farmaceutski aktivnih jedinjenja, naročito jedinjenja niske do srednje molekulske težine (npr. oko 200 do oko 1500 Da, poželjno oko 300 do oko 1000 Da), kao što su na primer citotoksini, antivirusna sredstva, antibakterijska serdstva, peptidi i oligonukleotidi. Prema predmetnom pronalasku molekul od interesa je citotoksin. Primeri citotoksina obuhvataju kamptotecine, staurosporin, doksorubicin, daunorubicin, kolhicin, metotreksat, taksane, kalihemicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivate majtanzina), auristatine, tubulizin M, kriptoficin ili pirolobenzodiazepine (PBDs). Primeri auristatina obuhvataju dolastatin 10, auristatin F, monometil auristatin F (MMAF), auristatin E, monometil auristatin E (MMAE), auristatin PE, auristatin TP i auristatin AQ. Primeri majtanzina i majtanzinoida obuhvataju mertanzin i ansamitocin.
[0494] Prema pronalasku, antitelo u navedenom konjugatu antitela je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera. Primeri antitela koje specifično vezuje antigen kancera obuhvataju trastuzumab, pertuzumab, cetuksimab, rituksimab, bevacizumab, girentuksimab, gemtuzumab, inotuzumab, alemtuzumab, tositumumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, elotuzumab, zanolimumab, obinutuzumab, necitumumab, farletuzumab, vedolizumab, tabalumab, itolizumab, okrelizumab, epratuzumab, mepolizumab, reslizumab, sarilumab i ramicurumab.
[0495] Prema tome, pronalazak se odnosi na konjugat antitela i leka prema pronalasku, pri čemu antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i pri čemu molekul od interesa je citotoksin, za upotrebu kao lek. Pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela i leka prema pronalasku, pri čemu antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i pri čemu molekul od interesa je citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera. Takođe, pronalazak se odnosi na konjugat antitela prema pronalasku, pri čemu antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i pri čemu molekul od interesa je citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera dojke, i poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
[0496] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela prema pronalasku, pri čemu konjugat antitela je trastuzumab-(MMAF)<2>, trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)<2>, trastuzumab(majtanzinoid)<2>ili trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)<2>, za upotrebu u lečenju kancera. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela prema pronalasku, pri čemu konjugat antitela je trastuzumab-(MMAF)<2>, trastuzumab-(vc-PABA-MMAF)<2>, trastuzumab(majtanzinoid)<2>ili trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)<2>za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
[0497] Pored toga, ovde je otkriven postupak za lečenje kancera primenom konjugata antitela i leka koji je ovde opisan. Pored toga, ovde je otkriven postupak za lečenje kancera dojke primenom konjugata antitela i leka koji je ovde opisan. Pored toga, ovde je takođe opisan postupak za lečenje HER2-pozitivnog kancera dojke primenom konjugata antitela i leka koji je ovde opisan. Poželjni primeri izvođenja antitela i molekula od interesa su opisani u prethodnom tekstu.
[0499] Postupak za pripremu konjugata antitela i leka
[0500] Pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek koji se može dobiti pomoću postupka, koji sadrži korake:
[0502] 1. (i) dovođenja u kontakt antitela koje sadrži jezgro N-acetilglukozamina (GlcNAc) supstituenta sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prirustvu pogodnog katalizatora, pri čemu je navedeno jezgro N-acetilglukozamina supstituenta izborno fukozilovano, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A gde A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP),
[0503] da bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu je modifikovano antitelo definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan sa antitelom preko C<1>od N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta, i gde je navedeno modifikovano antitelo prema formuli (4):
[0506]
[0509] gde:
[0510] S(A)<x>i x su kao što su definisani u prethodnom tekstu; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
[0512] 2. (ii) reakcije navedenog modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, gde:
[0513] navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu ili alkinil grupu, i jedan ili više molekula od interesa; i
[0515] pri čemu je molekul od interesa (D) je konjugovan sa antitelom preko linkera (L), pri čemu navedeni molekul od interesa je citotoksin.
[0516] [0229] U poželjnom primeru izvođenja, navedeni katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289L, GalT Y289N i GalT Y289I. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, navedeni katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289F i GalT Y289M.
[0517] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, x je 1, 2, 3 ili 4, poželjno x je 1 ili 2, poželjnije x je 1. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, y je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8, poželjno y je 1, 2, 3 ili 4 i poželjnije y je 1 ili 2.
[0518] U specifičnom poželjnom primeru izvođenja, antitelo je celo antitelo i y je 2, i u sledećem poželjnom primeru izvođenja, antitelo je fragment antitela i y je 1.
[0519] U poželjnom primeru izvođenja postupka za pripremu konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku, navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo, i navedeni konjugat antitela ima formulu (11) ili (11b):
[0522]
[0525] gde:
[0526] D i L su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0527] r je 1 - 20;
[0528] R<1>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO<2>, -CN, -S(O)<2>R<5>, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa i pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe izborno supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti vezana zajedno tako da formiraju anelirani cikloalkil ili anelirani (hetero)aren supstituent, i pri čemu R<5>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
[0529] X je C(R<1>)<2>, O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je R<1>ili L(D)<r>gde su L, D i r kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0530] Q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q jednako 0, tada je X jednako N-L(D)<r>; i
[0531] pri čemu, u formuli 11, a je 5, 6 ili 7,
[0532] i pri čemu, u formuli 11b
[0533] a je 0,1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7; i
[0534] a’ je 0,1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7; i
[0535] a+a’ je 5, 6 ili 7.
[0536] Poželjno, a a’ je 5 ili 6 i poželjnije a a’ je 5.
[0537] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja postupka koji je ovde otkriven, navedeno modifikovano antitelo je azid-om modifikovano antitelo, i navedeni konjugat linkera ima formulu (12), (13), (14), (15) ili (16).
[0538] U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja postupka koji je ovde otkriven, navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo, i navedeni konjugat linkera ima formulu (17):
[0541]
[0544] gde:
[0545] R<1>, L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
[0546] Y je O, S ili NR<2>, gde je R<2>kao što je definisan u prethodnom tekstu;
[0547] R<3>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
[0548] R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)<r>, -(CH<2>)<n>-Y-L(D)<r>, halogena, C<1>-C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa, pri čemu su alkil grupe izborno prekinute jednim ili više heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno izborno supstituisane; i n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10.
[0549] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja postupka koji je ovde otkriven, R<1>je vodonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<3>je vodonik. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, n je 1 ili 2. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<4>je vodonik, Y-L(D)<r>ili -(CH<2>)<n>-Y-L(D)<r>. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, R<2>je vodonik ili L(D)<r>. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, konjugat linkera ima formulu 18:
[0550]
[0553] gde su Y, L, D, n i r kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0554] U sledećem dodatnom poželjnom primeru izvođenja postupka koji je ovde otkriven, navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo, i navedeni konjugat linkera ima formulu (19):
[0557]
[0559] gde su L, D i r kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0560] U sledećem poželjnom primeru izvođenja postupka koji je ovde otkriven, navedeno modifikovano antitelo je azidom-modifikovano antitelo, i navedeni konjugat linkera ima formulu (15):
[0563]
[0566] pri čemu L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0568] Modifikovano antitelo, konjugat antitela i konjugat antitela i leka prema pronalasku
[0569] Modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno, konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku, konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku i postupci za njihovu pripremu koji su ovde otkriveni imaju nekoliko prednosti u odnosu na modifikovana antitela, konjugate antitela i postupke za njihovu pripremu poznate u stanju tehnike.
[0570] Kao što je opisano u prethodnom tekstu, još uvek postoji potreba za poboljšanjem poznatih postupaka za konjugaciju linker-toksina za antitela, ne samo prema kontroli specifičnosti za mesto i stehiometriji, već takođe prema efikasnosti postupka konjugacije. Uprkos sposobnosti ADCs da se vrate na njihova ciljna mesta, količina leka za koju je procenjeno da dospeva unutar ćelija tumora je tipično <2% od primenjene doze. Ovaj problem je proširen nepredvidivim rezultatima konjugacije ADCs poznatih u stanju tehnike. Važno je izbeći antitela koja nisu u dovoljnom stepenu konjugovana, što smanjuje potenciju, kao i visoko konjugovane vrste, koje izrazito smanjuju polu-živote u cirkulaciji, smanjuju vezivanje za ciljni protein i povećavaju toksičnost.
[0571] Za konjugate antitela i leka, mera za punjenje molekula od interesa (npr. lekova, aktivnih supstanci) na antitelo je takozvani odnos leka prema antitelu (DAR), koji daje srednju vrednost broja molekula aktivne supstance po antitelu, izračunatih iz statističke raspodele. Teorijska maksimalna vrednost DAR za određeni tip ADC je jednaka broju mesta za usidrenje. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, postupci za pripremu ADCs poznati iz stanja tehnike generalno imaju za rezultat proizvod koji sadrži smešu konjugata antitela sa različitim brojem molekula od interesa prisutnih u svakom konjugatu antitela, i u DAR sa visokom standardnom devijacijom.
[0572] Jedna od prednosti modifikovanih antitela opisanih ovde i konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku je ta što su ova antitela i konjugati antitela homogeni, u spcifičnosti za mesto i stehiometriji. Pronalazak se prema tome takođe odnosi na konjugat antitela i leka za upotrebu kao lek, pri čemu konjugat antitela i leka je homogen. Dalje je poželjno da je konjugat antitela i leka homogen u specifičnosti za mesto i stehiometriji. Takođe je poželjno da je konjugat antitela i leka dobijen sa odnosom leka prema antitelu (DAR) blizu teorijske vrednosti, i sa niskom standardnom devijacijom.
[0573] [0242] U poželjnom primeru izvođenja, modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno i konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku su homogeni, u specifičnosti za mesto i stehiometriji. Ovde, antitelo ili konjugat antitela se smatra homogenim kada je konjugacija postignuta samo na unapred određenom mestu i sa unapred određenim odnosom leka prema antitelu. Konjugat antitela je heterogen kada se konjugacija antitela odigrava na različitim mestima u antitelu, dovodeći do smeše proizvoda sa odnosom leka prema antitelu koji se ne može predvideti. U poslednjem navedenom slučaju, odnos leka prema antitelu će biti srednja vrednost cele grupe konjugata antitela i leka.
[0574] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku ima DAR koji je unutar 10% njegove teorijske vrednosti.
[0575] Navedena modifikovana antitela i konjugati antitela su dobijeni sa DAR veoma blizu teorijske vrednosti, i sa veoma niskom standardnom devijacijom. Ovo takođe znači da konjugati antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku rezultuju u konzistentnijem proizvodu za prekliničko testiranje.
[0576] Sledeća prednost postupaka i antitela koji su ovde otkriveni obuhvata redukciju otpada u proizvodnji, čime se poboljšava cena za kompaniju.
[0577] Pored toga, postupak za pripremu modifikovanog antitela i za pripremu konjugovanog antitela koje je ovde otkriveno se odvija veoma efikasno. Reakciona kinetike su veoma povoljne, rezultujući u skoro potpunoj konverziji u relativno kratkom periodu vremena, naročito u poređenju sa postupcima poznatim u stanju tehnike, i nisu formirani sporedni proizvodi ili skoro da nisu formirani sporedni proizvodi.
[0578] Pored toga, kada je azidom-modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno spojeno sa konjugatom linkera koji sadrži alkinil grupu, ili kada je alkinom-modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno spojeno sa konjugatom linkera koji sadrži azid grupu, preko reakcije cikloadicije, rezultujući triazoli nisu podložni hidrolizi ili drugim putevima razgradnje. Kada je ketonom-modifikovano antitelo koje je ovde otkriveno spojeno sa konjugatom linkera koji sadrži hidroksilamin ili hidrazin, rezultujući oksimi ili hidrazoni su takođe relativno inertni na neutralnim uslovima.
[0579] Dodatne prednosti su na taj način stabilnost konjugata antitela za upotrebu kao lek, kao i direktan i generalno primenljiv postupak za uvođenje azido grupe, keto grupe i/ili alkinil grupe u antitelo.
[0580] Kao što je opisano u prethodnom tekstu, konjugati antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku imaju nekoliko prednosti u odnosu na konjugate antitela poznate u stanju tehnike. Jedna od prednosti modifikovanih antitela koji su ovde otkriveni, konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku i postupka za njihovu pripremu koji je ovde otkriven je ta da su ova antitela i konjugati antitela homogeni, u specifičnosti za mesto i stehiometriji. Modifikovana antitela i konjugati antitela prema pronalasku su dobijeni sa DAR veoma blizu teorijske vrednosti, i sa veoma niskom standardnom devijacijom. Ovo takođe znači da konjugati antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku rezultuju u konzistentnijem proizvodu za prekliničko testiranje.
[0581] Osobine konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku su modulirane dizajniranjem, ekspresijom i obradom u konjugatima antitela i leka monoklonskih antitela sa različitim glikozilacionim profilima. Osobine koje mogu biti modulirane su npr. anti-tumorska aktivnost, maksimalna tolerisana doza, farmakokinetika kao što je klirens plazme, terapeutski, oba prema efikasnosti i toksičnosti, slabljenje leka, stabilnost vezivanja leka i oslobađanje leka posle dostizanja ciljnog mesta. Naročito, postoji korelacija između lokacije leka i in vivo efikasnosti ADC.
[0582] In vivo i in vitro eksperimenti pokazuju da konjugat antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku ima citotoksičan efekat na ćelije koje eksprimiraju HER2. In vitro eksperimenti pokazuju da su konjugati antitela i leka za upotrebu kao lek prema pronalasku sposobni da selektivno ubijaju ćelijsku liniju koja eksprimira HER2 u odnosu na HER2-negativnu ćelijsku liniju, kao što je rezimirano na slikama 24 - 26. In vivo eksperiment pokazuje da je jedna doza od nekoliko konjugata antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku sposobna da eliminiše tumor koji eksprimira HER2 iz mišjeg ksenografta, kao što je jasno sa slike 29 i 30. Pored toga, pokazano je da konjugati antitela za upotrebu kao lek prema pronalasku imaju identičan farmakokinetički profil kao nativno antitelo trastuzumab, kao što je rezimirano na slici 27.
[0583] Pronalazak se prema tome odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, za upotrebu kao lek. Pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, za upotrebu u lečenju kancera. Pronalazak se dalje odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2-pozitivnog kancera dojke.
[0584] Prema pronalasku, molekul od interesa u navedenom konjugatu antitela je citotoksin. Primeri citotoksina obuhvataju kamptotecine, doksorubicin, daunorubicin, taksane, kalihemicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivate majtanzina), auristatine ili pirolobenzodiazepine (PBDs). Primeri citotoksina obuhvataju kamptotecine, staurosporin, doksorubicin, daunorubicin, kolhicin, metotreksat, taksane, kalihemicine, duokarmicine, majtanzine i majtanzinoide (tj. derivate majtanzina), auristatine, tubulizin M, kriptoficin ili pirolobenzodiazepine (PBDs). Primeri auristatina obuhvataju dolastatin 10, auristatin F, monometil auristatin F (MMAF), auristatin E, monometil auristatin E (MMAE), auristatin PE, auristatin TP i auristatin AQ. Primeri majtanzina i majtanzinoida obuhvataju mertanzin i ansamitocin.
[0585] [0254] Prema predmetnom pronalasku, antitelo u navedenom konjugatu antitela je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera. Primeri antitela koje specifično vezuje antigen kancera obuhvataju trastuzumab, pertuzumab, cetuksimab, rituksimab, bevacizumab, girentuksimab, gemtuzumab, inotuzumab, alemtuzumab, tositumumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, elotuzumab, zanolimumab, obinutuzumab, necitumumab, farletuzumab, vedolizumab, tabalumab, itolizumab, okrelizumab, epratuzumab, mepolizumab, reslizumab, sarilumab i ramicurumab.
[0586] Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela prema pronalasku, pri čemu antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i pri čemu molekul od interesa je citotoksin, za upotrebu kao lek. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se takođe odnosi na konjugat antitela prema pronalasku, pri čemu antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i pri čemu molekul od interesa je citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera. U sledećem poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, pri čemu antitelo je antitelo koje specifično vezuje antigen kancera i pri čemu molekul od interesa je citotoksin, za upotrebu u lečenju kancera dojke, i poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
[0587] U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, pri čemu konjugat antitela je trastuzumab-(MMAF)<2>ili trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)<2>, za upotrebu u lečenju kancera. U dodatnom poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na konjugat antitela koji je ovde otkriven, pri čemu konjugat antitela je trastuzumab-(MMAF)<2>ili trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoid)<2>za upotrebu u lečenju kancera dojke, poželjnije za upotrebu u lečenju HER2 pozitivnog kancera dojke.
[0588] Pored toga, ovde je otkriven postupak za lečenje kancera primenom konjugata antitela i leka koji je ovde opisan. Pored toga, ovde je otkriven postupak za lečenje kancera dojke primenom konjugata antitela i leka koji je ovde opisan. Pored toga, ovde je takođe otkriven postupak za lečenje HER2-pozitivnog kancera dojke primenom konjugata antitela i leka koji je ovde opisan. Poželjni primeri izvođenja antitela i molekula od interesa su opisani u prethodnom tekstu.
[0590] Komplet od delova
[0592] Pronalazak se takođe odnosi na komplet od delova, koji sadrži modifikovano antitelo kao što je ovde otkriveno i konjugat linkera. Navedeni konjugat modifikovanog antitela i linkera, i njegovi poželjni primeri izvođenja, su opisani detaljnije u prethodnom tekstu.
[0593] Pronalazak se dalje odnosi na komplet od delova, koji sadrži azidom-modifikovano antitelo kao što je ovde otkriveno i konjugat linkera prema formuli 11:
[0594]
[0596] gde su R<1>, X, L, D, a, r i q kao što su definisani u prethodnom tekstu.
[0597] Poželjni primeri izvođenja konjugata azidom-modifikovanog antitela i linkera 11 opisani su detaljnije u prethodnom tekstu.
[0599] Primeri
[0601] Sinteza
[0603] Primeri 1 - 4: Sinteza BCN-doksorubicina 28a i 28b
[0605] Reakciona šema sinteze konjugata linkera BCN-doksorubicina 28a počevši od BCN-OSu 23, kao što je izvedeno u Primerima 1 - 4, prikazana je na Slici 7.
[0607] Primer 1. Sinteza BCN-amina 24
[0609] U rastvor 2,2’-(etilendioksi)bis(etilamina) (11.78 mL, 80.5 mmol) u DCM (200 mL) ukapavanjem je dodavan BCNOSu 23 (7.82 g, 26.8 mmol) u DCM (100 mL) tokom 3 časa. Pošto je dodavanje završeno, smeša je mešana u trajanju od 10 min, a zatim je usledilo ispiranje zasićenim vodenim rastvorom NH<4>Cl (3 x 200 mL). Organski sloj je sušen preko Na<2>SO<4>, filtriran i koncentrovan in vacuo. „Flash“ hromatografija na koloni (DCM:MeOH 99:1-93:7 1% Et<3>N) dala je proizvod 24 (5.95 g, 54.7 mmol, 68%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl<3>) δ 5.38 (s, 1H), 4.13 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.59 (s, 4H), 3.56-3.50 (m, 4H), 3.35 (q, J= 5.1 Hz, 2H), 2.88 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.32 (br s, 2H), 2.27-2.15 (m, 6H), 1.62-1.42 (m, 2H), 1.33 (qn, J = 8.7 Hz, 1H), 0.97-0.85 (m, 2H).<13>C-NMR (CDCl<3>, 75 MHz) δ 156.4, 98.3, 68.7 (2C), 62.2, 45.5, 40.3, 40.2, 28.6, 20.9, 19.6, 17.3. HRMS (ESI<+>) izrač. za C<17>H<28>N<2>NaO<4>(M+Na<+>) 347.1947, zabeleženo 347.1952.
[0611] Primer 2. Sinteza BCN-biotina 25
[0612] U rastvor BCN derivata 24 (0.80 g, 2.47 mmol) u DCM (25 mL) dodati su biotin-OSu (0.93 g, 2.71 mmol) i Et<3>N (0.86 mL, 6.16 mmol). Reakciona smeša je mešana u trajanju od 5 časova i zatim je dodat zasićeni vodeni rastvor NaHCO<3>(20 mL). Organski sloj je ispran zasićenim vodenim rastvorom NaHCO<3>(2 x 20 mL), sušen preko Na<2>SO<4>, filtriran i koncentrovan pod sniženim pritiskom. „Flash“ hromatografija na koloni (DCM:MeOH 99:1-92:8) dala je BCN biotin 25 (1.14 g, 2.1 mmol, 84%).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl<3>): δ 6.57 (s, 1H), 6.44 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 5.37 (s, 1H), 4.52-4.48 (m, 1H), 4.33-4.30 (m,1H), 4.16 (d, J = 8 Hz, 2H), 3.62 (s, 4H), 3.57 (t, J = 5.2 Hz, 4H), 3.45 (q, J = 5.2 Hz, 2H), 3.40-3.36 (m, 2H), 3.17-3.12 (m, 1H), 2.92 (dd, J = 8, 4.8 Hz, 1H), 2.72 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 2.33-2.18 (m, 8H), 1.88 (br s, 1H), 1.80-1.57 (m, 6H), 1.49-1.33 (m, 3H), 0.95 (t, J = 9.6 Hz, 2H).<13>C-NMR (CDCl<3>, 75 MHz) δ 172.9, 163.6, 156.4, 98.3, 69.6, 61.3, 59.7, 55.2, 40.3, 40.0, 38.7, 35.5, 28.6, 27.8, 27.6, 25.1, 21.0, 19.7, 17.3. HRMS (ESI<+>) izrač. za C<27>H<43>N<4>O<6>S (M+H<+>) 551.2903, zabeleženo 551.2911.
[0614] Primer 3. Sinteza aktiviranog estra 26
[0616] BCN-amin 24 (3.6 g, 11.1 mmol) je rastvoren u DCM (150 mL) i dodati su anhidrid glutarne kiseline (1.39 g, 12.2 mmol) i Et<3>N (4.61 mL, 33.3 mmol). Reakciona smeša je mešana u trajanju od 2 časa, nakon čega je usledilo dodavanje DSC (4.3 g, 16.7 mmol). Posle 2 časa reakcija je ugašena sa H<2>O (100 mL) i organski sloj je ispran vodom (2 x 150 mL), sušen preko Na<2>SO<4>, filtriran i koncentrovan in vacuo. „Flash“ hromatografija na koloni (EtOAc:MeOH 99:1-94:6) dala je aktivirani estar 26 (4.63 g, 8.6 mmol, 78%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl<3>): δ 4.14 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.59 (s, 4H), 3.57-3.52 (m, 4H), 3.44 (q, J = 5.1 Hz, 2H), 3.35 (q, J = 4.8 Hz, 2H).2.83 (br s, 4H), 2.67 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.33-2.16 (m, 7H), 2.08 (qn, J = 6.9 Hz, 2H), 1.65-1.49 (m, 2H), 1.33 (t, J = 9.0 Hz, 1H), 0.97-0.87 (m, 2H). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<26>H<37>N<3>O<9>(M+H+) 536.26, zabeleženo 536.0.
[0618] Primer 4. Sinteza konjugata BCN-doksorubicina 28a
[0620] U rastvor aktiviranog estra 26 (5 mg, 0.0093 mmol) i doksorubicina.HCl (27, 10 mg, 0.017 mmol) u DMF (0.5 mL) dodat je Et<3>N (5 µL, 0.036 mmol) i smeša je mešana preko noći. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod je prečišćen pomoću „flash“ hromatografije na koloni (DCM:MeOH 99:1-80:20) da bi se dobio BCN-doksorubicin 28a (6 mg, 0.0062 mmol, 66%). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<49>H<61>N<3>O<17>(M+H<+>) 964.4, zabeleženo 963.9.
[0621] Primer 4-2. Sinteza konjugata BCN-doksorubicina 28b
[0623] U rastvor H<2>N-PEG<8>-COOH (822 mg, 1.86 mmol) u THF:H<2>O 1:1 (20 mL) dodati su BCN-OSu (23) (651 mg, 2.23 mmol) i Et<3>N (774 µL, 5.59 mmol). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 1.5 časa i zakišeljena do pH 1, nakon čega je usledila ekstrakcija sa EtOAc (3 x 35 mL). Spojeni organski slojevi su sušeni preko Na<2>SO<4>, filtrirani i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je zatim rastvoren u suvom DCM (20 mL) i zatim su dodati DCC (461 mg, 2.23 mmol) i NHS (257 mg, 2.23 mmol). Posle mešanja na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa, reakcija je filtrirana i filtrat je koncentrovan in vacuo. „Flash“ hromatografija (MeCN, MeCN:H<2>O 30:1) je dala BCNPEG<8>- COOSu.<1>H-NMR (300 MHz, CDCl<3>): δ 5.44 (br s, 1H), 4.14) d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.68-3.63 (m, 30H), 3.56 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.34 (q, J = 5.4 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.36-2.14 (m, 6H).1.72-1.49 (m, 2H), 1.36 (qn, J = 8.7 Hz, 1H), 1.02-0.88 (m, 2H). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<34>H<54>N<2>O<14>(M+Na<+>) 737.35, zabeleženo 737.3.
[0624] U rastvor doksorubicina.HCl (27, 500 mg, 0.862 mmol) u anhidrovanom DMF (10 mL) dodati su trietilamin (361 µL, 262 mg, 2.59 mmol) i rastvor BCN-PEG<8>-COOSu (678 mg, 0.948 mmol) u DMF (10 mL). Dobijena smeša je mešana u trajanju od 22 časa i koncentrovana sa 3 g silikagela. Posle prečišćavanja preko hromatografije na koloni, proizvod je dobijen kao crveni amorfni materijal (757 mg, 0.66 mmol, 77%). LRMS (HPLC, ESI-) izrač. za C<57>H<77>N<2>O<22>(M-H<+>) 1141.5, zabeleženo 1142.2.
[0626] Primer 5. Sinteza DIBAC-biotina 30 (Šematski prikazana na Slici 8)
[0628] U rastvor amina 29, komercijalno dostupnog iz ClickChemistryTools (50 mg, 0.18 mmol) u DMF (2 mL) dodat je biotin-OSu (62 mg, 0.18 mmol) i Et<3>N (50 µL, 0.36 mmol). Reakciona smeša je mešana u trajanju od 3 časa, nakon čega je usledilo koncentrovanje pod sniženim pritiskom. „Flash“ hromatografija na koloni (DCM:MeOH 99:1-90:10) dala je DIBAC-biotin 30 (44 mg, 0.09 mmol, 49%).<1>H-NMR (300 MHz, CDCl<3>): δ 7.66-7.62 (m, 1H), 7.40-7.24 (m, 7H), 6.67-6.60 (m, 1H), 6.53-6.49 (m, 1H), 5.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.13 (dd, J = 2.9, 14.0 Hz, 1H), 4.47-4.43 (m, 1H), 4.29-4.28 (m, 1H), 3.68 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 3.34-3.30 (m, 1H), 3.17-3.08 (m, 2H), 2.92-2.67 (m, 3H), 2.50-2.42 (m, 1H), 2.10-1.95 (m, 2H), 1.73-1.24 (m, 6H). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<28>H<30>N<4>O<3>S (M+H<+>) 503.2, zabeleženo 503.1.
[0629] Primeri 6 - 9: Sinteza konjugata BCN-doksorubicina 35
[0631] Reakciona šema za sintezu konjugata BCN-doksorubicina 35 počevši od Fmoc-citrulina 31, kao što je izvedena u Primerima 7 - 10, prikazana je na Slici 9.
[0633] Primer 6. Sinteza derivata citrulina 32
[0635] Izobutilhloroformat (99 µL, 0.76 mmol) i N-metilmorfolin (83 µL, 0.76 mmol) su dodati u rastvor Fmoc-citrulina 31 (300 mg, 0.76 mmol) u THF na -40°C. Rastvor je mešan u trajanju od 2 časa, nakon čega sledi dodavanje p-aminobenzilalkohola (112 mg, 0,91 mmol) i N-metilmorfolina (100 µL, 0.91 mmol). Posle 1 časa mešanja rastvor je lagano zagrevan do sobne temperature i posle 2 časa reakciona smeša je koncentrovana pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje preko „flash“ hromatografije na koloni (DCM:MeOH 99:1-80:20) dalo je derivat citrulina 32 (346 mg, 0.69 mmol, 90%). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<28>H<30>N<4>O<5>(M+H<+>) 503.2, zabeleženo 503.1.
[0637] Primer 7. Sinteza dipeptida 33
[0639] Derivat citrulina 32 (100 mg, 0.20 mmol) rastvoren je u DMF (1.6 mL) i dodat je piperidin (333 µL). Posle 2 časa reakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom i sirovi proizvod je rastvoren u DMF (2 mL). Dodati su Alloc-Val-OSu (60 mg, 0.20 mmol) i Et<3>N (58 µL, 0.40 mmol), smeša je mešana preko noći i zatim koncentrovana in vacuo. Prečišćavanje preko „flash“ hromatografije na koloni (DCM:MeOH 99:1-90:10) dalo je dipeptid 33 (65 mg, 0.14 mmol, 70%). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<22>H<33>N<5>O<6>(M+H<+>) 464.2, zabeleženo 464.0.
[0641] Primer 8. Sinteza dipeptid-doksorubicina 34
[0643] [0272] U rastvor dipeptida 33 (40 mg, 0.086 mmol) u DMF (0.5 mL) dodati su Et<3>N (36 µL, 0.26 mmol) i DSC (66 mg, 0.26 mmol). Reakciona smeša je mešana preko noći, nakon čega je usledilo koncentrovanje pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje preko „flash“ hromatografije na koloni (DCM:MeOH 99:1-90:10) dalo je proizvod (30 mg, 0.05 mmol, 58%) koji je neposredno rastvoren u DMF (0.5 mL). Dodati su doksorubicin.HCl 27 (29 mg, 0.05 mmol) i Et<3>N (20 µL, 0.15 mmol), reakciona smeša je mešana u trajanju od 2 časa i zatim koncentrovana pod sniženim pritiskom. Prečišćavanje preko „flash“ hromatografije na koloni (DCM:MeOH 99:1-80:20) dalo je dipeptid-doksorubicin 34 (34 mg, 0.033 mmol, 66%). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<50>H<60>N<6>O<18>(M+H<+>) 1033.4, zabeleženo 1032.9.
[0645] Primer 9. Sinteza konjugata BCN-doksorubicina 35
[0647] Dipeptid-doksorubicin 34 (8 mg, 0.008 mmol) je rastvoren u DMF (0.5 mL) i dodati su trifenilsilan (7 µL, 0.054 mmol) i Pd(PPh<3>)<4>(0.6 mg, 0.0005 mmol). Posle mešanja preko noći reakcija je koncentrovana pod sniženim pritiskom i suspendovana u DCM (2 mL). Posle filtracije sirovi proizvod je dobijen kao crvena čvrsta supstanca koja je rastvorena u DMF (0.5 mL). Dodati su derivat BCN 26 (3 mg, 0.006 mmol) i Et<3>N (2 µL, 0.014 mmol) i reakcija je mešana preko noći. Rastvarači su uklonjeni pod sniženim pritiskom i prečišćavanje preko „flash“ hromatorafije na koloni (DCM:MeOH 99:1-60:40) dalo je konjugat BCN-doksorubicina 35 (3 mg, 0.002 mmol, 27%). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<68>H<88>N<8>O<22>(M+H<+>) 1369.8, zabeleženo 1369.3.
[0649] Primer 9-2. Sinteza BCN-vc-PABA-MMAE (37a)
[0651] U rastvor Val-Cit-PAB-MMAE.TFA (8.0 mg, 6.5 µmol) i trietilamina (3.5 µL) u anhidrovanom DMF (1 mL) dodat je BCN-PEG<2>-OSu (2.7 mg, 6.5 µmol) (36) kao rastvor u DMF (0.78 mL). Proizvod (6 mg, 4 µmol, 62%) je dobijen posle prečišćavanja preko reverznofazne HPLC (C18, gradijent H<2>O/MeCN). LRMS (ESI<+>) izrač. za C<74>H<115>N<11>NaO<17>(M+Na<+>) 1452.84, zabeležiti 1452.7.
[0653] Primer 9-3. Sinteza BCN-vc-PABA-MMAF (37b)
[0655] U rastvor Val-Cit-PAB-MMAF.TFA (17.9 mg, 14.3 µmol) u DMF (2 mL) dodat je BCN-PEG<2>-OSu (17.9 mg, 14.3 µmol) (36) kao rastvor u DMF (0.78 mL) i trietilaminu (6.0 µL). Proizvod (7 mg, 5 µmol, 35%) je dobijen posle prečišćavanja preko reverzno-fazne HPLC (C18, gradijent H<2>O/MeCN 1% AcOH). LRMS (HPLC, ESI<+>) izrač. za C<74>H<114>N<11>O<18>(M+H<+>) 1444.83, zabeleženo 1445.44.
[0657] Primer 9-4. Sinteza BCN-MMAF (38)
[0658] U rastvor Val-Cit-PABA-MMAF (7.6 mg, 0.0074 mmol) u DMF (0.2 mL) dodat je BCN-OSu estar 26 (8 mg, 0.015 mmol) i Et<3>N (3 µL, 2.2 mg, 0.022 mmol). Posle prekonoćne reakcije, smeša je koncentrovana. Prečišćavanje preko hromatografije na koloni (MeOH/DCM 1/3) proizvelo je željeni proizvod (3.4 mg, 0.0022 mmol, 29%). LRMS (HPLC, ESI<+>) izrač. za C<80>H<125>N<12>O<19>(M+H<+>) 1557.92, zabeleženo 1558.16.
[0660] Primer 9-5. Sinteza BCN-vc-PABA-majtanzinoida (39)
[0662] U suspenziju Val-Cit-PABA-β-alaninoil-majtanzinoida (komercijalno dostupan iz Concortis) (27 mg, 0.022 mmol) u MeCN (2 mL) dodat je trietilamin (9.2 µL, 6.7 mg, 0.066 mmol) i rastvor BCN-PEG<2>OSu karbonata (9.2 mg, 0.022 mmol) u MeCN (1 mL). Posle 23 časa, smeša je sipana u smešu EtOAc (20 mL) i vode (20 mL). Posle odvajanja, organska faza je sušena (Na<2>SO<4>) i koncentrovana. Posle prečišćavanja preko hromatografije na koloni (EtOAc → MeOH/EtOAc 1/4) dobijeno je 22 mg (0.015 mmol, 70%) željenog proizvoda. LRMS (ESI<+>) izrač. za C<7>0H<97>CN<10>O<20>(M+H<+>) 1432.66, zabeleženo 1434.64.
[0664] Primer 9-6. Sinteza maleimid-vc-PABA-majtanzinoida (40)
[0666] U rastvor Val-Cit-PABA-β-alaninoil-majtanzinoida (13.9 mg, 0.011 mmol) (komercijano dostupan iz Concortis, San Diego, USA) u anhidrovanom DMF (1 mL) dodat je trietilamin (4.5 µL, 3.3 mg, 0.033 mmol) i N-sukcinimidil 6-maleimidokaproat (3.9 mg, 0.013 mmol). Posle mešanja tokom odgovarajućeg vremena, smeša je podeljena između EtOAc (20 mL) i vodenog zasićenog rastvora NaHCO<3>(10 mL). Posle odvajanja, vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (20 mL). Kombinovani organski slojevi su sušeni (Na<2>SO<4>) i koncentrovani. Posle prečišćavanja preko reverzno-fazne HPLC (C18, gradijent H<2>O/MeCN), dobijeno je 10 mg (0.0077 mmol) željenog proizvoda. LRMS (HPLC, ESI<+>) izrač. za C<64>H<88>ClN<10>O<18>(M+H<+>) 1390.60, zabeleženo 1390.52.
[0667] Gore navedeni Primeri 9-3 do 9-6 su šematski prikazani u Šemi 10a.
[0669] Primer 9-7. Sinteza DIBAC-vc-PABA-MMAF 41 (Šematski prikazana u Šemi 11)
[0671] [0280] DIBAC-amin 29, komercijalno dostupan iz ClickChemistryTools (430 mg, 1.50 mmol) je rastvoren u DCM (15 mL) i tretiran anhidridom glutarne kiseline (213 mg, 1.87 mmol) i Et<3>N (647 µL, 4.67 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakcija je mešana u trajanju od 2 časa, a zatim je usledilo dodavanje DSC (478 mg, 1.87 mmol). Posle još 2 časa mešanja na sobnoj temperaturi, dodat je DCM (30 mL) i reakcija je isprana sa H<2>O (3 x 20 mL). Organska faza je sušena preko Na<2>SO<4>i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. „Flash“ hromatografija (0:100-2:98 EtOAc:MeOH) dala je DIBACOSu estar (368 mg, 0.75 mmol, 48%).
[0672] Sledeće, u rastvor DIBAC-OSu estra (1 mg, 0.003 mmol) u DMF (0.2 mL) dodat je vc-PABA-MMAF (2 mg, 0.002 mmol) i trietilamin (1 µL, 0.007 mmol). Rastvor je mešan preko noći nakon čega je usledilo koncentrovanje. Prečišćavanje sa HPLC (reverzno-fazna, MeCN:H<2>O 0.1% TFA) dalo je 41 (0.9 mg, 0.0006 mmol, 33%). LCMS analiza je dala jedan pik sa masom 1510.40 (očekivana za C<81>H<113>N<12>O<16>= 1510.83).
[0674] Primeri 9-8 - 9-11. Opšti protokol za sintezu drugih doksorubicin-ciklooktina
[0676] U 0.1 M rastvor aktiviranog ciklooktina (1-2 ekviv.) u DCM/DMF (1:1) dodat je doksorubicin.HCl (27, 1 ekviv.) i trietilamin (1.5 ekviv.). Crveni rastvor je mešan preko noć, nakon čega je usledilo koncentrovanje in vacuo. Sirova smeša je prethodno pakovana na siliki upotrebom DMF kao rastvarača, nakon čega je usledila hromatografija na koloni (DCM→DCM:MeOH 8:2) da bi se proizveo željeni proizvod.
[0678] Primer 9-9. Sinteza doksorubicina-MFCO 42.
[0680] MFCO-OSu estar (komercijano dostupan iz Berry and Associates, Dexter, Michigan, USA) (3.4 mg, 0.009 mmol) je reagovao sa doksorubicinom.HCl (27, 5 mg, 0.009 mmol) prema opštem postupku za proizvodnju doksorubicina MCFO 42 (5 mg, 0.006 mmol, 69%). LCMS analiza je dala jedan pik sa masom 831.88 (očekivano za C<42>H<49>FN<2>NaO<13>= 831.31).
[0682] Primer 9-10. Sinteza doksorubicin-ciklooktina 43.
[0684] Ciklookt-4-in-1-ol (Chem. Ber. 1986, 119, 297-312.) je preveden u njegov derivat pnitrofenil karbonata (5 mg, 0.017 mmol), koji je reagovao sa doksorubicinom.HCl (27, 5 mg, 0.009 mmol) prema opštem postupku da bi se dobio doksorubicin-ciklooktin 43 (6 mg, 0.008 mmol, 94%).
[0686] Primer 9-11. Sinteza doksorubicin-DIBO 44
[0687] Prema opštem postupku DIBO OSu karbonat (komercijano dostupan iz LifeTechnologies, 5 mg, 0.013 mmol) reagovao je sa doksorubicinom (27, 5 mg, 0.009 mmol) da bi se dobio DIBO-doksorubicin 44 (7 mg, 0.008 mmol, 90%).
[0688] Gore navedeni primeri 9-8 do 9-11 su šematski prikazani u Šemi 12.
[0690] Primer 9-12. Sinteza alkin-biotina 45
[0692] U rastvor biotin-PEG<3>-NH<2>u dihlorometanu (6 mL) dodat je trietilamin (54 µL, 39 mg, 0.39 mmol) i sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline (25 mg, 0.13 mmol). Posle 19 časova, reakciona smeša je koncentrovana i ostatak je prečišćen preko hromatografije na koloni (5→20% MeOH u DCM). Prečišćeni proizvod je rastvoren u DCM, filtriran i koncentrovan, čime je proizveden željeni proizvod kao bela čvrsta supstanca (52 mg, 0.11 mmol, 85%).
[0694] Primer 9-13. Sinteza O-alkil hidroksilamin biotina 47
[0696] U rastvor dietilenglikola (0.89 mL, 1g, 9.42 mmol) u 80 mL suvog THF dodat je PPh<3>(5.43 g, 20.7 mmol) i N-hidroksiftalimid. Posle hlađenja do 0°C dodat je 40% DEAD rastvor u toluenu (9.44 mL, 20.7 mmol). Smeša je mešana u trajanju od 21 časa. Proizvod je otfiltriran i ispran sa EtOAc. Proizvod je dobijen kao bela čvrsta supstanca (1.73 g, 4.37 g).<1>H NMR (300 MHz, CDCl<3>) δ (ppm) 7.85 - 7.66 (m, 8H), 4.31 - 4.20 (m, 4H), 3.92 - 3.78 (m, 4H). Sledeće, 1.5 g (3.78 mmol) proizvoda dobijenog u prethodnom koraku je rastvoreno u 7 N NH<3>u MeOH, zagrevano do 40°C i mešano u trajanju od 20 časova. Zatim je hlađeno do sobne temperature dok je argon barbotiran kroz reakcionu smešu. Reakciona smeša je koncentrovana i ostatak je rastvoren u DCM (50 mL), filtriran i koncentrovan. Ostatak je prečišćen preko hromatografije na koloni (2→5% MeOH u DCM). Prinos: 0.46 g (3.38 mmol, 89%).<1>H NMR (300 MHz, CDCl<3>) δ 5.51 (s, 4H), 3.88-3.82 (m, 4H), 3.71-3.64 (m, 4H).
[0697] Gore navedeni Primeri 9-12 i 9-13 su šematski prikazani u Šemi 13.
[0699] Primeri 9-14 - 9.17: Sinteza derivata UDP-GalNAc 52-55
[0701] Reakciona šema sinteze derivata UDP-GalNAc 52-54, počevši od 51, prikazana je na Slici 14. Jedinjenja 55 i 56 su kupljena iz Glycohub, Inc. (USA).
[0703] Primer 9-14. Sinteza UDP-GalNH<2>51
[0704] Jedinjenje 48 je pripremljeno od D-galaktozamina prema postupku opisanom za D-glukozamin u Linhardt et al., J. Org. Chem. 2012, 77, 1449-1456.<1>H-NMR (300 MHz, CD<3>OD): δ 5.69 (dd, J = 6.84, 6.84 Hz, 1H), 5.43-5.41 (m, 1H), 5.35 (dd, J = 10.9, 3.4 Hz, 1H), 4.54 (t, J = 6.48 Hz, 1H), 4.23-4.12 (m, 1H), 4.04 (dd, J = 10.9, 6.1 Hz, 1H), 3.82 (dt, J = 11.1, 2.7 Hz, 1H), 2.12 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99 (s, 3H). LRMS (ESI-) izrač. za C<12>H<18>N<3>O<11>(M-H<+>) 410.06, zabeleženo 410.1.
[0705] Sledeće, jedinjenje 48 je spojeno sa UMP prema Baisch et al. Bioorg. Med. Chem., 1997, 5, 383-391).
[0706] Na taj način, rastvor D-uridin-5’-monofosfat dinatrijum soli (1.49 g, 4.05 mmol) u H<2>O (15 mL) je zagrevan sa DOWEX 50Wx8 (H<+>oblik) u trajanju od 30 minuta i filtriran. Filtrat je snažno mešan na sobnoj temperaturi dok je ukapavanjem dodavan tributilamin (0.966 mL, 4.05 mmol). Posle 30 minuta dodatnog mešanja, reakciona smeša je liofilizovana i dodatno sušena preko P<2>O<5>pod vakuumom 5 č.
[0707] Dobijeni tributilamonijum uridin-5’-monofosfat je rastvoren u suvom DMF (25 mL) u atmosferi argona. Dodat je karbonildiimidazol (1.38 g, 8.51 mmol) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 min. Sledeće, dodat je suvi MeOH (180 µL) i mešan u trajanju od 15 min da bi se uklonio višak CDI. Preostali MeOH je uklonjen pod visokim vakuumom u trajanju od 15 min. Zatim, jedinjenje 48 (2.0 g, 4.86 mmol) je rastvoreno u suvom DMF (25 mL) i dodato ukapavanjem u reakcionu smešu. Reakcija je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi u trajanju od 2 dana pre koncentrovanja in vacuo. Potrošnja imidazol-UMP intermedijera je praćena pomoću MS. „Flash“ hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:Me-OH:H<2>O) dala je proizvod 49 (1.08 g, 1.51 mmol, 37%).<1>H-NMR (300 MHz, D<2>O): δ 7.96 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.98-5.94 (m, 2H), 5.81-5.79 (m, 1H), 5.70 (dd, J = 7.1, 3.3 Hz, 1H), 5.49 (dd, J = 15.2, 2.6 Hz, 1H), 5.30 (ddd, J = 18.5, 11.0, 3.2 Hz, 2H), 4.57 (q, J = 6.0 Hz, 2H), 4.35-4.16 (m, 9H), 4.07-3.95 (m, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.07 (s, 3H). LRMS (ESI-) izrač. za C<21>H<29>N<5>O<19>P<2>(M-H<+>) 716.09, zabeleženo 716.3.
[0708] Jedinjenje 49 je deacetilovano prema Kiso et al., Glycoconj. J., 2006, 23, 565-573).
[0709] Na taj način, jedinjenje 49 (222 mg, 0.309 mmol) je rastvoreno u H<2>O (2.5 mL) i dodati su trietilamin (2.5 mL) i MeOH (6 mL). Reakciona smeša je mešana u trajanju od 3 časa i zatim je koncentrovana in vacuo da bi se dobila sirova UDP- 2-azido-2-deoksi-D-galaktoza (50).<1>H-NMR (300 MHz, D<2>O): δ 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.02-5.98 (m, 2H), 5.73 (dd, J = 7.4, 3.4 Hz, 1H), 4.42-4.37 (m, 2H), 4.30-4.18 (m, 4H), 4.14-4.04 (m, 2H), 3.80-3.70 (m, 2H), 3.65-3.58 (m, 1H). LRMS (ESI-) izrač. za C<15>H<23>N<5>O<16>P<2>(M-H<+>) 590.05, zabeleženo 590.2.
[0710] Konačno, u rastvor jedinjenja 50 u H<2>O:MeOH 1:1 (4mL) dodat je Lindlar-ov katalizator (50 mg). Reakcija je mešana pod atmosferom vodonika u trajanju od 5 časova i filtrirana preko celita. Filter je ispran sa H<2>O (10 ml) i filtrat je koncentrovan in vacuo da bi se dobio UDP-D-galaktozamin (UDP-GalNH<2>, 51) (169 mg, 0.286 mmol, 92% prinos u dva koraka).<1>H-NMR (300 MHz, D<2>O): δ 7.93 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.99-5.90 (m, 2H), 5.76-5.69 (m, 1H), 4.39-4.34 (m, 2H), 4.31-4.17 (m, 5H), 4.05-4.01 (m, 1H), 3.94-3.86 (m, 1H), 3.82-3.70 (m, 3H), 3.30-3.16 (m, 1H). LRMS (ESI-) izrač. za C<15>H<25>N<3>O<16>P<2>(M-H+) 564.06, zabeleženo 564.1.
[0712] Primer 9-15. Sinteza UDP-GalNAz 52
[0714] Sukcinimidil estar azidosirćetne kiseline je pripremljen prema postupku u Hamilton et al, Chem. Eur. J., 2012, 18, 2361-2365.
[0715] UDP-D-galaktozamin (51) (82 mg, 0.145 mmol) je rastvoren u 0.1 M NaHCO<3>(2 mL) i dodati su sukcinimidil estar azidosirćetne kiseline (86 mg, 0.435 mmol) i DMF (2 mL). Reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi i zatim koncentrovana in vacuo. „Flash“ hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H<2>O) dala je UDP-GalNAz (52) (34 mg, 0.052 mmol, 36%).<1>H-NMR (300 MHz, D<2>O): δ 8.73 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 5.90-5.82 (m, 2H), 5.49 (dd, J = 6.9, 3.3 Hz, 1H), 4.29-4.05 (m, 7H), 4.03-3.85 (m, 4H), 3.72-3.61 (m, 2H). LRMS (ESI-) izrač. za C<17>H<26>N<6>O<17>P<2>(M-H<+>) 647.08, zabeleženo 647.1.
[0717] Primer 9-16. Sinteza UDP-GalNAc-ina 53
[0719] Sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline je pripremljen prema postupku u Rademann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 9441-9447.
[0720] UDP-D-galaktozamin (51) (53 mg, 0.094 mmol) je rastvoren u 0.1 M NaHCO<3>(2 mL) i dodati su sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline (37 mg, 0.188 mmol) i DMF (2 mL). Reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi i koncentrovan in vacuo. „Flash“ hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H<2>O) dala je UDP-GalNAc-in (53) (42 mg, 0.065 mmol, 69%).<1>H-NMR (300 MHz, D<2>O): δ 7.78 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.84-5.76 (m, 2H), 5.39 (dd, J = 6.8, 3.2 Hz, 1H), 4.22-4.16 (m, 2H), 4.14-3.97 (m, 5H), 3.88-3.85 (m, 1H), 3.81-3.75 (m, 1H), 3.63-3.55 (m, 2H), 2.45-2.28 (m, 5H), 2.19 (t, J = 2.4 Hz, 1H). LRMS (ESI-) izrač. za C<20>H<29>N<3>O<17>P<2>(M-H<+>) 644.09, zabeleženo 644.1.
[0722] Primer 9-17. Sinteza UDP-GalNLev 54
[0723] Sukcinimidil estar levulinske kiseline je pripremljen prema postupku za sukcinimidil estar pent-4-inoinske kiseline u Rademann et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51, 9441-9447.
[0724] 1H-NMR (300 MHz, CDCl<3>): δ 2.81 (s, 4H), 2.77 (s, 4H), 2.14 (s, 3H).
[0725] UDP-D-galaktozamin (51) (53 mg, 0.094 mmol) je rastvoren u 0.1 M NaHCO<3>(2 mL) i dodati su sukcinimidil estar levulinske kiseline (40 mg, 0.188 mmol) i DMF (2 mL). Reakcija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi i rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. „Flash“ hromatografija (7:2:1-5:2:1 EtOAc:MeOH:H<2>O) dala je UDPGalNLev (54) (10 mg, 0.015 mmol, 16%).<1>H-NMR (300 MHz, D<2>O): δ 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.82-5.77 (m, 2H), 5.36 (dd, J = 6.8, 3.2 Hz, 1H), 4.22-4.15 (m, 2H), 4.13-3.95 (m, 5H), 3.88-3.84 (m, 1H), 3.82-3.75 (m, 1H), 3.64-3.52 (m, 3H), 2.74-2.61 (m, 2H), 2.47-2.37 (m, 2H), 2.05 (s, 3H). LRMS (ESI-) izrač. za C<20>H<31>N<3>O<18>P<2>(M-H<+>) 662.10, zabeleženo 662.1.
[0727] Primer 9-18. Sinteza BCN-MMAF (56)
[0729] U rastvor MMAF.TFA (8.1 mg, 0.0096 mmol) u DMF (0.3 mL) dodat je Et<3>N (5 mL, 3.6 mg, 0.036 mmol) i BCN-PEG<2>-OSu (36) (19 mg, 0.045 mmol). Posle prekonoćne reakcije, smeša je koncentrovana. Prečišćavanje preko hromatografije na koloni (DCM → MeOH/DCM 1/3) proizvelo je željeni proizvod. LRMS (HPLC, ESI<+>) izrač. za C<55>H<87>N<6>O<13>(M+H<+>) 1039.63, zabeleženo 1039.72.
[0731] Opšti protokol za modifikaciju IgGs
[0733] Skraćivanje IgG glikana sa endo S
[0735] Skraćivanje IgG glikana izvedeno je upotrebom endo S iz Streptococcus pyogenes (komercijano dostupan iz Genovis, Lund, Sweden). IgG (10 mg/mL) je inkubiran sa endo S (40 U/mL) u 25 mM Tris pH 8.0 približno 16 časova na 37°C. Deglikozilovani IgG je koncentrovan i ispran sa 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 upotrebom Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore).
[0737] Masena spektralna analiza
[0738] Rastvor 50 mg (modifikovanog) IgG, 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA i 30 mM DTT sa ukupnom zapeminom od približno 70 µL je inkubiran u trajanju od 20 minuta na 37°C da bi se redukovali disulfidni mostovi omogaćuvajući analizu lakog i teškog lanca. Ako su prisutne, azidne-funkcionalne grupe su redukovane do amina pod ovim uslovima. Redukovani uzorci su isprani tri puta sa milliQ upotrebom Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) i koncentrovani do 10 µM (modifikovanog) IgG. Redukovani IgG je analiziran pomoću elekstrosprej jonizacije sa vremenom preleta (ESI-TOF) na JEOL AccuTOF. Razloženi spektri su dobijeni upotrebom Magtran softvera.
[0740] Primer 10. Skraćenje trastuzumaba (Slika 15a 15b)
[0742] Trastuzumab je podvrgnut protokolu skraćenja iz prethodnog teksta. Posla razlaganja pikova, maseni spektar je pokazao jedan pik lakog lanca i dva pika teškog lanca. Dva pika teškog lanca pripadala su jednom glavnom proizvodu (49496 Da, 90% od ukupnog teškog lanca), rezultujući iz transtuzumaba supstitituisanog sa jezgrom GlNAc(Fuc), i manjem proizvodu (49351 Da, ±10% od ukupnog teškog lanca), rezultujući iz transtuzumaba supstitituisanog sa jezgrom GlcNac.
[0744] Primer 11. Skraćenje bevacizumaba
[0746] Tretman bevacizumaba sličnog trastuzumabu dovelo je do formiranja jednog glavnog proizvoda teškog lanca (50062 Da, ± 90%) zajedno sa nekoliko manjih proizvoda teškog lanca (±10%).
[0748] Primer 12. skraćenje cetuksimaba
[0750] Cetuksimab se razlikuje od trastuzumaba po tome što sadrži drugo N-glikozilaciono mesto na N88. Glikan na N88 je lociran u Fab regionu i ima drugačiju konstituciju od glikana na N297. Tretman cetuksimaba sličnog trastuzumabu doveo je do formiranja opsega proizvoda teškog lanca sa masama od 51600 Da-52300 Da (glavni pikovi na 51663 Da i 51808 Da), što ukazuje na to da je samo jedan glikan skraćen sa Endo S, verovatno na N297.
[0752] Primer 12-1. Skraćenje rituksimaba
[0753] Tretman rituksimaba sličnog trastuzumabu doveo je do formiranja jednog glavnog proizvoda teškog lanca (49408 Da).
[0755] Primer 12-2. Pokušaj skraćenja trastuzumaba sa endo H
[0757] Trastuzumab je inkubiran sa endoglikozidazom H (EndoH) iz Streptomyces picatus (komercijalno dostupan iz New England BioLabs). Rastuće koncentracije endo H (≤ 115 U/µL) du dodate u trastuzumab (10 mg/mL) u 50 mM natrijum citratu pH 5.5 i inkubirane u trajanju od 16 časova na 37°C. Maseni spektri su pokazali samo pikove koji odgovaraju nativnom glikozilovanom teškom lancu (50589 i 50752 Da odgovaraju G0F i G1F izoformama, respektivno), što ukazuje na to da trastuzumab ne može biti skraćen upotrebom endo H.
[0759] Primer 12-3. Pokušaj skraćenja trastuzumaba sa endo M
[0761] Trastuzumab (10 mg/mL) je inkubiran sa rastućim koncentracijama endo-β-N-acetilglukozaminidaze (endo M, ≤ 231 mU/mL) iz Mucor hiemalis (komercijalno dostupna iz TCI Europe N.V.) u 50 mM natrijum citratu pH 6.0 i inkubiran u trajanju od 16 časova na 37°C. Maseni spektar je pokazao glavne pikove koji odgovaraju nativnom glikozilovanom teškom lancu (50589 i 50752 Da odgovaraju G0F i G1F izoformama, respektivno). Pored toga, manji proizvod je zabeležen (49347 Da, ±5% od ukupnog teškog lanca), rezultujući iz teškog lanca supstituisanog sa jezgrom GlcNac. Ovi rezultati pokazuju da samo trastuzumab glikoforme kojima nedostaje jezgro fukoze mogu biti skraćene sa endo M.
[0763] Glikoziltransfer derivata galaktoze (npr. azidošećera) sa Gal-T1(Y289L)
[0765] Enzimatsko uvođenje derivata galaktoze (npr. šećer koji sadrži azido) na IgG je postignuto sa mutantom goveđe β(1,4)-galaktoziltransferaze [β(1,4)-Gal-T1(Y289L)]. Deglikozilovani IgG (pripremljen kao što je opisano u prethodnom tekstu, 10 mg/mL) je inkubiran sa modifikovanim derivatom UDP-galaktoze (npr. azido-modifikovani šećer-UDP derivat) (0.4 mM) i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) (1 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C.
[0766] [0314] Funkcionalizovani IgG (npr. azido-funkcionalizovani IgG) je inkubiran sa protein A agarozom (40 µL po mg IgG) u trajanju od 2 časa na 4°C. Protein A agaroza je isprana tri puta sa PBS i IgG je eluiran sa 100 mM glicinom-HCl pH 2.7. Eluirani IgG je neutralizovan sa 1 M Tris-HCl pH 8.0 i koncentrovan i ispran sa PBS upotrebom Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) do koncentracije od 15-20 mg/mL.
[0768] Primer 13. Trastuzumab(GalNAz)<2>(Slika 15c)
[0770] Trastuzumab je podvrgnut glikoziltransfer protokolu sa UDP-N-azidoacetilgalaktozaminom 52 (UDPGalNAz). Posle protein A afinitetnog prečišćavanja, masena spektralna analiza je ukazala na formiranje jednog glavnog proizvoda od (49713 Da, 90% od ukupnog teškog lanca), rezultujući iz GalNAz transfera do trastuzumaba supstituisanog sa jezgrom GlcNAc(Fuc), i manjeg proizvoda (49566 Da, ±10% od ukupnog teškog lanca), rezultujući iz GalNAz transfera do trastuzumaba supstituisanog sa jezgrom GlcNAc.
[0772] Primer 14. Bevacizumab(GalNAz)<2>
[0774] Bevacizumab (7.5 mg, 10mg/mL) je skraćen sa Endo S prema opštem protokolu. Skraćeni bevacizumab (10 mg/mL) je inkubiran sa UDP-GalNAz 52 (65 µL, 10 mM) i β(1,4)-GalT1(Y289L) (75 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C. Prečišćavanje sa ProtA dalo je modifikovani bevacizumab (3.2 mg). AccuTOF analiza je pokazala formiranje glavnog proizvoda teškog lanca (50282 Da, ± 95%).
[0776] Primer 15. Cetuksimab(GalNAz)<2>
[0778] Cetuksimab (7.5 mg, 10 mg/mL) je skraćen sa endo S prema opštem protokolu. Skraćeni cetuksimab (10 mg/mL) je inkubiran sa UDP-GalNAz 52 (65 µL, 10 mM) i β(1,4)-GalT1(Y289L) (75 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C. Prečišćavanje sa ProtA dalo je modiikovani cetuksimab (3.2 mg). AccuTOF analiza je pokazala formiranje dva glavna proizvoda teškog lanca (51884 Da i 52029 Da), prema skraćenju N297 glikana, ali ne Fab glikana.
[0780] Primer 15-1. Rituksimab(GalNAz)<2>
[0782] [0318] Rituksimab (7.5 mg, 10mg/mL) je skraćen sa Endo S prema opštem protokolu. Skraćeni rituksimab (10 mg/mL) je inkubiran sa UDP-GalNAz 52 (65 µL, 10 mM) i β(1,4)-GalT1(Y289L) (75 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C. Prečišćavanje sa ProtA dalo je modifikovani rituksimab (3.2 mg). AccuTOF analiza je pokazala potpunu konverziju u željeni proizvod (masa 49625, očekivana masa 49627).
[0784] Primer 15-2. Girentuksimab(GalNAz)<2>
[0786] Girentuksimab je skraćen upotrebom endo S prema opštem protokolu opisanom u prethodnom tekstu, što dovodi do formiranja jednog glavnog proizvoda teškog lanca (49427 Da). Skraćeni girentuksimab je zatim inkubiran sa UDP-GalNAz i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) kao što je opisano u prethodnom tekstu, što je dovelo do formiranja jednog glavnog proizvoda teškog lanca (49643 Da).
[0788] Primer 15-3. Trastuzumab(GalNAc-yne)<2>
[0790] Skraćeni trastuzumab (100 µL, 10 mg/mL, 6.6 nmol), dobijen pomoću endo S tretmana trastuzumaba prema opštem protokolu, je inkubiran sa UDP-GalNAc-inom (53) (5 µL, 10 mM) i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) (5 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C. Sirova smeša je prečišćena sa ProtA da bi se dobio trast-(GalNAc-in)<2>(0.43 mg). AccuTOF analiza je pokazala 90% konverziju do željenog proizvoda (masa 49735, očekivana masa 49736), zabeleženo je 10% sporednog proizvoda (masa 50379).
[0792] Primer 15-4. Trastuzumab(GalNLev)<2>
[0794] Skraćeni trastuzumab (100 µL, 10 mg/mL, 6.6 nmol), dobijen pomoću endo S tretmana trastuzumaba prema opštem protokolu, je inkubiran sa UDP-GalNLev (54) (10 µL, 10 mM) i β(1,4)-Gal-T1(Y289L) (7.5 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C. Sirova smeša je prečišćena sa ProtA da bi se dobio trast-(GalNLev)<2>(0.53 mg). AccuTOF analiza je pokazala 95% konverziju u željeni proizvod (masa 49753, očekivana masa 49754), zabeleženo je 5% sporednog proizvoda (masa 50417).
[0796] Skraćenje GalNAz-transfer za pulovani IgG plazme
[0798] Primer 15-5. Masena spektrometrijska analiza IgG plazme
[0799] U reakcionu smešu koja sadrži 0.5 mg pulovanog IgG plazme (Lee Biosolutions, Inc) dodat je PBS (220 µL) i pufer za digestiju (250 µL, 0.1 mg/mL papain, 0.02 M cistein, 0.02 M EDTA u PBS), a zatim je usledila inkubacija u trajanju od 1 časa na 37°C. Zatim je dodata suspenzija proteina A (100 µL) i smeša je rotirana sa kraja na kraj u trajanju od 1 časa. Protein A je ispran sa PBS (3 x 1 mL), a zatim je usledilo eluiranje sa glicin.HCl puferom (pH 2.7, 0.1 M, 300 µL). Pufer za eluiranje je neutralizovan sa Tris-HCl (pH 8.0, 1 M, 80 µL) i zatim je uzorak uzet za masenu analizu prema standardnom protokolu (Slika 14a).
[0801] Primer 15-6. Skraćenje pulovanog IgG plazme
[0803] Pulovani IgG plazme (170 µL, 14 mg/mL) je skraćen sa endo S (16 µL, 20 U/µL) u 98 µL Tris-HCl (25 mM, pH 8.0) u trajanju od 16 časova na 37°C. Analiza je izvedena prema protokolu za analizu. AccuTOF merenja su pokazala potpunu konverziju.
[0804] Gore navedeni Primeri 15-5 i 15-6 su šematski prikazani u Šemi 16.
[0806] Primer 15-7. GalNAz-transfer do IgG plazme
[0807] Skraćeni IgG plazme (46 µL, 10.8 mg/mL, 3.3 nmol) inkubiran je sa UDP-GalNAz 52 (3.3 µL, 10 mM) i β1,4-Gal-T1(Y289L) (2.5 µL, 2 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C. Analiza je izvedena prema protokolu za analizu IgG plazme i AccuTOF merenja su pokazala potpunu konverziju.
[0809] Konjugacija azido-modifikovanog IgG pomoću cikloadicije sa ciklooktin probom
[0811] Kovalentno vezani BCN- ili DIBAC-funkcionalizovani molekul (u DMSO) je razblažen u PBS. Prečišćeni IgG koji sadrži azide (100 µL od 10 mg/mL) je dodat i reakciona smeša je rotirana sa kraja na kraj u trajanju od 12 do 72 časa na 4°C. Rezultujući konjugat IgG je koncentrovan i ispran sa PBS upotrebom Amicon Ultra-0.5, Ultracel- 10 Membrane (Millipore) do krajnje koncentracije od 10 mg/mL.
[0813] Reakcije konjugacije azido-modifikovanog IgG pomoću cikloadicije tenziono stimulisane sa ciklooktin probom
[0815] [0327] Posle prečišćavanja proteina A, IgG koji sadrži azido (100 µM ili 15 mg/mL) dodat je u 0.01 zapreminu od 40 mM stok rastvora kovalentno vezanog ciklooktin-funkcionalizovanog molekula (4 ekvivalenta) u DMSO ili DMF, odmah je mešano i rotirano sa kraja na kraj u trajanju od 12 do 24 časova na sobnoj temperaturi. Ako je potrebno, ovaj postupak je ponovljen da bi se dobila potpuna konverzija.
[0816] Rezultujući konjugat IgG je koncentrovan i ispran sa PBS upotrebom Amicon Ultra-0.5, Ultracel-10 Membrane (Millipore) do krajnje koncentracije od 10 mg/mL.
[0817] U slučaju ADC, ovaj korak je zamenjen prečišćavanjem preko hromatografije koja je ekskluziona prema veličini na Superdex200 koloni.
[0819] Primer 16. Konjugacija BCN-biotina sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0821] BCN-biotin konjugat 25 (2 µL 100 mM u DMSO) je razblažen u PBS (98 µL) i 5 mL ovog rastvora je podvrgnuto trastuzumabu (GalNAz)<2>(5 µL 10 mg/ml u PBS). Ispiranje i koncentrovanje, praćeno masenom spektralnom analizom ukazali su na prisustvo jednog glavnog proizvoda (50294 Da, 90% ukupnog teškog lanca) i manjeg proizvoda (50148 Da, ±10% ukupnog teškog lanca).
[0823] Primer 17. Konjugacija DIBAC-biotina sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0825] DIBAC-biotin konjugat 30 (2 µL 100 mM u DMSO) je razblažen u PBS (98 µL) i 5 µL ovog rastvora je podvrgnuto trastuzumabu (GalNAz)<2>(5 µL 10 mg/ml u PBS). Ispiranje i koncentrovanje, praćeno masenom spektralnom analizom ukazali su na prisustvo jednog glavnog proizvoda (50247 Da, 90% od ukupnog teškog lanca) i manjeg proizvoda (50101 Da, ±10% od ukupnog teškog lanca).
[0827] Primer 17-1. Konjugacija DIBAC-vc-PABA-MMAF 41 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0829] Posle 1 dana prema AccuTOF analizi – potpuna konverzija. Zabeležena masa 51248, očekivana masa 51248.
[0831] Primer 18. Konjugacija BCN-doksorubicina 28a sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0833] [0333] BCN-doksorubicin 28a (4 µL od 50 mM rastvora u DMSO) je razblažen u PBS (896 µL) i podvrgnut trastuzumabu (GalNAz)<2>kao što je opisano u opštem postupku. Ispiranje i koncentrovanje, praćeno masenom spektralnom analizom ukazalo je na prirsustvo jednog glavnog proizvoda (50708 Da, 90% od ukupnog teškog lanca) i manjeg proizvoda (50294 Da, ±10% od ukupnog teškog lanca).
[0835] Primer 19. Konjugacija BCN-doksorubicina 35 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0837] BCN-doksorubicin 35 (4 µL 50 mM u DMSO) je razblažen u PBS (896 µL) i podvrgnut trastuzumabu (GalNAz)<2>kao što je opisano u opštem postupku. Ispiranje i koncentrovanje, praćeno masenom spektralnom analizom ukazali su na prisustvo konjugata trastuzumaba (GalNAz)<2>i BCN-doksorubicina 35 (51114 Da).
[0839] Primer 20. Konjugacija BCN-PEG<8>-doksorubicina 28b sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0841] Inkubacija BCN-PEG<8>-doksorubicina (400 µM, 4 ekv.) sa trastuzumabom (GalNAz)<2>(100 µM) u PBS u trajanju od 16 časova dovela je do potpune konverzije u trastuzumab (PEG<8>-doksorubicin)<2>(proizvodi teškog lanca između 50467 i 51134 Da sa glavnim pikom od 50881 Da koji odgovara teškom lancu sa jezgrom GalNAzGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCNPEG<8>-doksorubicinom).
[0843] Primer 21. Konjugacija BCN-vc-PABA-doksorubicina 33 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0845] BCN-doksorubicin 33 (4 µL od 50 mM rastvor u DMSO) razblažen je u PBS (896 µL) i podvrgnut trastuzumabu (GalNAz)<2>kao što je opisano u opštem postupku. Ispiranje i koncentrovanje, praćeno masenom spektralnom analizom ukazali su na prisustvo konjugata trastuzumaba (GalNAz)<2>i BCN-vc-PABA-doksorubicina 33 (51114 Da).
[0847] Primer 22. Konjugacija BCN-vc-PABA-MMAE 37a sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0849] Inkubacija BCN-vc-PABA-MMAE 37a (125 µM, 5 ekv.) sa trastuzumabom (GalNAz)<2>(25 µM) u PBS u trajanju od 16 časova dovela je do potpune konverzije u trastuzumab(vc-PABA-MMAE)<2>(proizvodi teškog lanca između 51137 i 51600 Da sa glavnim pikom od 51283 Da koji odgovara teškom lancu sa jezgrom GalNAzGlcNac(Fuc) konjugovanim sa BCN-vc-MMAE, ±95% ukupng teškog lanca, i manjim pikom na 50520 Da zbog fragmentacije PABA linkera u toku masene spektrometrije, 65% od ukupnog teškog lanca).
[0850] Primer 23. Konjugacija BCN-vc-PABA-MMAF 37b sa trastuzumabom (GalNAz)<2ž>
[0852] Inkubacija BCN-vc-PABA-MMAF 37b (600 µM, 4 2 ekv.) sa trastuzumabom (GalNAz)<2>(100 µM) u PBS u trajanju od približno 16 časova dovela je do poptune konverzije u trastuzumab(vc-PABA-MMAF)<2>(proizvodi teškog lanca između 51032 i 51500 Da sa glavnim pikom od 51181 Da koji odgovara teškom lancu sa jezgrom GalNazGlcNac(Fuc) konjugovanom sa BCN-vc-PABA-MMAF, ±95% od ukupnog teškog lanca, i manjim pikom na 50407 Da zbog fragmentacije PABA linkera u toku masene spektrometrije, ±5% od ukupnog teškog lanca).
[0854] Primer 24. Konjugacija BCN-MMAF 38 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0856] Trastuzumab(MMAF)<2>: Inkubacija BCN-MMAF 38 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>(100 µM) u PBS u trajanju od približno 16 časova dovela je do potpune konverzije u trastuzumab (MMAF)<2>(proizvodi teškog lanca između 50636 i 51100 Da sa glavnim pikom od 50783 Da koji odgovara teškom lancu sa jezgrom GalNazGlcNac(Fuc) konjugovanom sa BCN-MMAF).
[0858] Primer 24-2. Konjugacija BCN-MMAF 57 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0860] Trastuzumab(MMAF)<2>: Inkubacija BCN-MMAF (57, Slika 10b) sa trastuzumabom(GalNAz)<2>(100 µM) u PBS u trajanju od približno 16 časova dovela je do potpune konverzije u trastuzumab(MMAF)<2>(proizvodi teškog lanca između 50636 i 51100 Da sa glavnim pikom od 50783 Da koji odgovara teškom lancu sa jezgrom GalNAzGlcNAc(Fuc) konjugovanom sa BCN-MMAF 57).
[0862] Primer 25. Konjugacija BCN-vc-PABA-majtanzinoida 39 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>
[0864] Inkubacija BCN-vc-PABA-majtanzinoida (39) (800 µM, 2 x 4 ekv.) sa trastuzumabom (GalNAz)<2>(100 µM) u PBS u trajanju od približno 40 časova dovela je do poptune konverzije u trastuzumab(vc-PABA-majtanzinoid)<2>(proizvodi teškog lanca između 50781 i 51600 Da sa glavnim pikom od 51172 Da koji odgovara teškom lancu sa jezgrom GalNAzGlc- Nac(Fuc) konjugovanom sa BCN-vc-PABA-majtanzinoidom, ±95% od ukupnog teškog lanca).
[0865] Konjugacija konjugata ciklooktina-doksorubicina 42-44 sa trastuzumabom (GalNAz)<2>pomoću tenziono stimulisane cikooadicije
[0867] U rastvor trastuzumaba-(GalNAz)<2>(7.5 µL, 20 mg/ml, 1 nmol) u PBS dodat je rastvor ciklooktina (2.5 µL, 2.4 mM 5% DMF u MiliQ, 6 nmol). Reakcija je rotirana sa kraja na kraj i praćena AccuTOF analizom.
[0869] Primer 26: Konjugacija MCFO-doksorubicina 42 sa trast(GalNAz)<2>
[0871] Posle 5 dana prema AccuTOF analizi bilo je 80% konverzije. Zabeležena masa 50548, očekivana masa 50550.
[0873] Primer 27: Konjugacija DIBO-doksorubicina 43 sa trast(GalNAz)<2>
[0875] Posle 5 dana prema AccuTOF analizi bilo je 30% konverzije. Zabeležena masa 50530, očekivana masa 50544.
[0877] Primer 28: Konjugacija ciklooktin-doksorubicina 44 sa trast(GalNAz)<2>
[0879] Posle 5 dana prema AccuTOF analizi bilo je 50% konverzije. Zabeležena masa 50434, očekivana masa 50449.
[0881] Primer 29: CuAAC trastuzumaba-(N<3>)<2>sa alkin-biotinom 45
[0883] U rastvor trast-(GalNAz)<2>(10 µL, 9.6 mg/ml, 0.64 nmol) (poreklom od 52) u PBS dodat je rastvor biotin-alkina (45, 1 µL, 10 mM, 10 nmol) i stok premešavina (1 µL, 10 mM CuSO<4>, 10 mM natrijum askorbat, 10 mM tris((1-((O-etil)karboksimetil)-(1,2,3-triazol-4-il))metilamin u 20% MeCN u miliQ). Reakcija je rotirana sa kraja na kraj preko noći, nakon čega je AccuTOF analiza pokazala potpuno formiranje željenog proizvoda (zabeležena masa 50195), kao što je naznačeno na Slici 17.
[0885] Primer 30: CuAAC trastuzumab-ina<2>sa azido-biotinom 46
[0886] U rastvor trast-(GalNAc-ina)<2>poreklom od 53 (10 µL, 9.6 mg/ml, 0.64 nmol) u PBS dodat je rastvor biotin-N<3>46 (1 µL, 10 mM, 10 nmol) i stok premešavina (1 µL, 10 mM CuSO<4>, 10 mM natrijum askorbat, 10 mM tris((1-((O-etil)karboksimetil)-(1,2,3-triazol-4-il))metilamin u 20% MeCN u miliQ). Reakcija je rotirana sa kraja na kraj preko noći i zatim je AccuTOF analiza pokazala 50% konverziju (masa 50353, očekivana masa 50351), kao što je naznačeno na Slici 18.
[0888] Primer 31: Konjugacija maleimida-vc-PABA-majtanzinoida 40 sa trastuzumabom (N297C)
[0890] Trastuzumab(N297C) (4 mg, 10 mg/mL) je inkubiran sa DTT (10 ekv.) u PBS pH 7.4 u trajanju od 2 časa na 22°C. Višak DTT je uklonjen pomoću prečišćavanja spinfilterom i redukovani IgG (10 mg/mL) je inkubiran sa dehidroaskorbinskom kiselinom (20 ekv.) u trajanju od 3 časa na 22°C. Dodat je maleimid-vc-PABA-majtanzinoid 40 (3 ekv.) i reakciona smeša je inkubirana na sobnoj temperaturi u trajanju od 1 časa, nakon čega je višak maleimidvc-PABA-majtanzinoida 40 uklonjen prečišćavanjem spinfilterom. AccuTOF analiza je pokazala formiranje tri proizvoda teškog lanca, koji odgovaraju nemodifikovanom teškom lancu (49133 Da, ±10% od ukupnog teškog lanca), teškom lancu konjugovanom sa 1 majtanzinoidom (50454 Da, ±85% od ukupnog teškog lanca) i teškom lancu konjugovanom sa 2 majtanzinoidima (50774 Da, ±5% od ukupnog teškog lanca). Nije detektovana konjugacija sa lakim lancem.
[0892] Primer 32: Analiza in vitro stabilnosti u plazmi
[0894] [0349] Humana plazma (pripremljena upotrebom heparina) je centrifugirana na 200 g u trajanju od 10 minuta na 4°C i supernatant je inkubiran sa protein A agarozom (Kem-En-Tec) u trajanju od 1 časa na 4°C da bi se smanjila količina IgG. Plazma sa smanjenom količinom IgG je filterski sterilizovana upotrebom 0.22 µm filtera (Whatman). Trastuzumab-doksorubicin konjugat poreklom od 28a dodat je u sterilnu humanu plazmu do krajnje koncentracije od 100 µg/ml i inkubiran je na 37°C u CO<2>inkubatoru da bi se pH nivoi plazme održavali blizu fiziološke pH od 7.2. Uzorci su uzimani na 0, 24, 48 i 144 časa i čuvani na -80°C. Konjugat trastuzumaba je prečišćen sa protein A agarozom, a zatim je izvršena MS analiza. Uzorci humane plazme su inkubirani sa protein A agarozom u trajanju od 1 časa na 4°C, isprani tri puta sa fosfatnopuferisanim fiziološkim rastvorom (PBS) i konjugat trastuzumaba je eluiran sa 100 mM glicin-HCl pH 2.7, nakon čega je usledila neutralizacija sa 1 M Tris-HCl pH 8.0. MS analiza je pokazala da se pik koji odgovara konjugatu trastuzumaba-doksorubicina (50708 Da) vremenom nije smanjio. Pored toga, nisu se mogli detektovati pikovi koji odgovaraju proizvodima razlaganja, što dokazuje da je konjugat stabilan u trajanju od najmanje 144 časova u humanoj plazmi.
[0896] Primer 33: In vitro efikasnost
[0898] SK-Br-3 (HeR<2>+), SK-OV-3 (HeR2+) i MDA-MB-231 (HeR2-) ćelije su zasejane u 96-komorne ploče (5000 ćelija/komorici) u RPMI 1640 GlutaMAX (Invitrogen) dopunjene sa 10% fetusnim telećim serumom (FCS) (Invitrogen, 200 µL/komorici) i inkubirane preko noći na 37°C i 5% CO<2>. Serije trostrukih razblaženja (u opsegu od ±0.002 do 100 nM) sterilno filtriranih jedinjenja pripremljene su u RPMI 1640 GlutaMAX dopunjenom sa 10% FCS. Posle uklanjanja medijuma za kulturu, serije koncentracija su dodate u četiri ponavljaja i inkubirane tri dana na 37°C i 5% CO<2>. Medijum za kulturu je zamenjen sa 0.01 mg/mL resazurina (Sigma Aldrich) u RPMI 1640 GlutaMAX dopunjenom sa 10% FCS. Posle 4 do 6 časova na 37°C i 5% CO<2>fluorescencija je detektovana sa fluorescentnim uređajem za očitavanje ploče (Tecan Infinite 200) na 540 nm ekscitacije i 590 nm emisije. Relativne fluorescentne jedinice (RFU) su normalizovane do procenta ćelijske vijabilnosti postavljanjem komora bez ćelija na 0% vijabilnosti i komorica sa najnižom dozom jedinjenja na 100% vijabilnosti. Za svake od uslova prikazan je srednji procenat ćelijske vijabilnosti ± sem.
[0899] In vitro citotoksičnost trastuzumaba-(vc-PABA-MMAE)<2>(poreklom od 37a), trastuzumaba-(vc-PABA-MMAF)<2>(poreklom od 37b), trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoida)<2>(poreklom od 39), trastuzumab-(majtanzinoida)<2>i trastuzumab(N297C)-(vc-PABA-majtanzinoida)<2>(poreklom od 40) upoređivane su sa T-DM1 kao pozitivnom kontrolom i trastuzumabom i rituksimab-(vc-PABA-majtanzinoidom)<2>kao negativnim kontrolama. Svi ADC na bazi trastuzumaba utiču na vijabilnost HeR2-pozitivnih ćelijskih linija SK-Br-3 i SK-OV-3, ali ne HeR2-negativne ćelijske linije MDA-MB-231, što pokazuje da ovi ADC specifično ciljno deluju na HeR2 pozitivne ćelije. U HeR2 negativnoj ćelijskoj liniji MDA-MB-231, samo T-DM1 pokazuje malo smanjenje u ćelijskoj vijabilnosti na najvišoj koncentraciji (100 nM).
[0901] Primer 34: Konjugacija DTPA, radioaktivno obeleževanje i određivanje IRF
[0902] Trastuzumab(MMAF)<2>(poreklom od konjugacije trast(GalNAz)<2>i 37b) i trastuzumab(majtanzinoid)<2>(poreklom od konjugacije trast(GalNAz)<2>i 39), deglikozilovani trastuzumab (dobijen iz tretmana trastuzumaba i endo S) i nativni trastuzumab su konjugovani sa izotiocijanatom-DTPA (Macrocyclics, Houston, TX) i obeleženi sa<111>In (Covidien, Petten). Za životinjske eksperimente, svi konstrukti su obeleženi na specifičnoj aktivnosti između 2.7 i 3.4 MBq/mg.
[0904] Primer 35: PK/studije biološke raspodele
[0906] BALB/c goli miševi (n=15) su inokulisani subkutano sa 5 x 10<6>SK-OV-3 ćelija (zapremina injekcije: 200 ml) u desni bok.14 dana posle indukcije tumora, grupe od pet miševa su injektirane i.v. sa 15-20 MBq<111>In-obeleženog antitela, obeleženog na dozi proteina od 25 µg. Da bi se procenila in vivo stabilnost i farmakokinetika konjugata, 50 µl uzoraka krvi je uzeto preko submandibularnog krvarenja na 0.5, 1, 30 min, 1, 2 i 4 časa, i 1, 2, 5, 7, 9, 13, 16 i 21 dana posle injekcije radioaktivno obeleženog antitela.
[0908] Primer 36: Biološka raspodela
[0910] Jednu nedelju posle injekcije (3 dana p.i.) miševi su eutanazirani i disekovani da bi se odredila biološka raspodela radioaktivnog obeležavanja u relevantnim tkivima. Tkivna raspodela trastuzumaba(MMAF)<2>(poreklom od 37b), trastuzumab(majtanzinoida) 2 (poreklom od 39) i deglikozilovanog trastuzumaba je slična sa onom od nativnog trastuzumaba.
[0912] Primer 37: In vivo efikasnost
[0914] Ženke SHO miševa (Crl:SHO-Prkdcscid Hrhr, 6- do 9-nedelja-stari na početku eksperimentalne faze, dobijene iz Charles River Laboratories, L’Arbresles, France) su anestezirane sa ketaminom/ksilazinom, koža je aseptizirana sa rastvorom hlorheksidina, zasečene na nivou interskapularnog regiona, 20 mm<3>fragment tumora (HBCx-13B model ksenografta poreklom od pacijenta sa kancerom dojke) je postavljen u subkutano tkivo i koža je zatvorena spojnicama. Kada je zapremina tumora bila u opsegu od 60 do 200mm<3>, grupe od četiri miša su injektirane i.v. sa vehikulumom, trastuzumab-(vc-PABA-majtanzinoidom)<2>(poreklom od 39, u 3 mg/kg i 9 mg/kg), trastuzumab-(vc- PABA-MMAF)<2>(poreklom od 37b, u 3 mg/kg i 9 mg/kg), i T-DM1 (9 mg/kg).
[0915] Detaljna masena spektrometrijska analiza trastuzumaba i derivata
[0917] Nativni trastuzumab, trastuzumab(GalNAz)<2>, i konjugati biotina pripremljeni od trastuzumaba(GalNAz)<2>pomoću bakrom-katalizovane klik hemije (konjugacija sa 46 prema protokolu opisanom u primeru 29) ili pomoću tenziono stimulisane klik hemije (konjugacija sa 25 kao što je opisana u primeru 16) su podvrgnuti detaljnoj masenoj spektralnoj analizi intaktnih proteinskih vrsta (nano LC-MS) upotrebom nanoLC spojenog sa QTOF MS (maXis 4G) ultra visoke rezolucije.
[0919] Primer 38: Analiza intaktnog proteina
[0921] Priprema uzorka
[0923] Redukcija proteina je izvedena u trajanju od 30 minuta u 10 mM DTT na 56°C. Uzorci su razblaženi 1:1 u 2% mravljoj kiselini pre analize.
[0925] Tečna hromatografija – masena spektrometrija
[0927] [0358] Odvajanja proteina su izvedena upotrebom UHPLC nanoprotočne tečne hromatografije (Bruker Daltonics nano advance) spojene „online“ sa „quadrupole“ masenim spektrometrom ultra visoke rezolucije sa vremenom protoka (Bruker Daltonics maXis 4G ETD) preko aksijalnog desolvacionog vakuum potpomognutog izvora elektrospreja (Bruker Daltonics captive sprayer). Proteini su sipani na kolonu za hvatanje (Dionex PepSwift, 0.2 x 5 mm) za 3 minuta na stopi protoka od 5000 nL/min upotrebom 0.1% mravlje kiseline. Proteini su odvojeni na 0.2 x 150 mm monolitičkoj čestičnoj koloni (Michrom 8µm 4000Å PLRP-S) na 50°C upotrebom linearnog gradijenta od 20 do 50% acetonitrila i 0.1% mravlje kiseline na stopi protoka od 1000 nl/min. Desolvatacija i jonizacija peptida koji se eluiraju iz kolone izvedeni su upotrebom 6 L/min gasovitog azota na 180°C i 1600 V kapilarne voltaže. Maseni spektrometar je kalibrisan spolja upotrebom Agilent tuning mix (G1969-85000) i korišćenjem „lockmass“ kalibracije na 1221.9906 m/z (Agilent G1982-85001). Maseni spektrometar je programiran prerma stečenom spektru u opsegu od 500-4200 m/z na 1 Hz sa sledećim podešavanjima: 400 Vpp Funnel RF, 10 eV isCID, 400 Vpp Multipole RF, 8 eV Quadrupole jonska energija, 510 m/z niska masa, 10 eV Collision cell energy, 3500 Vpp Collision RF, 110 µs vreme tranfera, 450 Vpp Ion cooler RF i 18 µs Pre pulsno čuvanje.
[0929] Obrada podataka
[0931] Svi podaci su obrađeni u softveru za analizu podataka. Posle „lock mass“ kalibracije, izračunata je srednja vrednost MS spektara lakog i teškog lanca preko svakog hromatografskog pika, respektivno. Srednji spektri su razvijeni upotrebom algoritma maksimalne entropije u kombinaciji sa SNAP algoritma za biranje pikova za spektar lakog lanca ili Sum pik biranja za spektar teškog lanca.
[0933] Primer 39 Analiza proteolitičkih peptida
[0935] Priprema uzorka
[0937] Iz svakog uzorka, pet mikrograma proteina je podvrgnuto razlaganju sa tripsinom u rastvoru. Ukratko, redukcija je izvedena u 10 mM DTT u trajanju od 30 minuta na 56°C. Alkilacija redukovanih cisteina (karbamidometilacija) je izvedena upotrebom 50 mM hloroacetamida. Razlaganje proteina je prvo izvedeno dodavanjem 0.5 µg LysC peptidaze i inkubacijom u trajanju od 3 časa na 37°C. Sledeće, 800 ng tripsina dodato je u uzorak i inkubirano O/N na 37°C. Rezultujući proteolitički peptidi su koncentrovani i odsoljeni upotrebom stop-and-go vrhova za eluiranje.
[0939] Tečna hromatografija - tandem masena spektrometrija
[0941] [0361] Odvajanja peptida su izvedena upotrebom UHPLC nanoprotočne tečne hromatografije (Bruker Daltonics nano advance) spojene „online“ sa jonskom zamkom visokog kapaciteta (Bruker Daltonics amaZon speed ETD) preko aksijalnog desolvacionog vakuum potpomognutog izvora elektrospreja (Bruker Daltonics captive sprayer). Peptidi su sipani na kolonu za hvatanje (Dionex PepSwift, 0.2 x 5 mm) za 3 minuta na stopi protoka od 5000 nL/min upotrebom 0.1% mravlje kiseline. Peptidi su odvojeni na 0.1 x 250 mm monolitičkoj koloni (Dionex PepSwift) na 60°C upotrebom linearnog gradijenta od 5 do 25% acetonitrila i 0.1% mravlje kiseline na stopi protoka od 800 nL/min. Desolvatacija i jonizacija peptida koji se eluiraju iz kolone je izvedena upotrebom 3 L/min gasovitog azota na 150°C i 1300V kapilarne voltaže. Maseni spektrometar je programiran tako da se dobije jedan spektar ispitivanja (MS) sa kasnijom fragmentacionom analizom zavisnom od podataka (MS/MS) od gornjih 6 najšećih jona. Ispitivani spektri su dobijeni na pojačanom režimu rezolucije i korišćena su sledeća podešavanja instrumenta: 50 ms maksimalno vreme akumulacije, 500.000 ICC target, namešteno na 1000 m/z, srednja vrednost 5 spektara. Fragmentacioni spektri su dobijeni u ekstremnom režimu skeniranja sa omogućenim auto-izabranim režimom fragmentacije koji se prebacuje između postupaka fragmentacije sa disocijacijom indukovanom sudarom (CID) i elektron transfer disocijacije (ETD) na bazi odnosa mase prema naelektrisanju i stanjem naelektrisanja prekursorskog jona. Sledeća podešavanja instrumenta su korišćena za fragmentaciona skeniranja: 500.000 ICC target, 200 ms maksimalno vreme akumulacije, omogućen SPS, 70% CID energija i 0.2 min dinamička ekskluzija.
[0943] Pretrage baze podataka
[0945] Dobijeni sirovi podaci masene spektrometrije su obrađeni pomoću softvera za analizu podataka (Bruker Daltonics, v4.1) da bi se generisali Mascot kompatibilni ulazni fajlovi (GMF format). GMF fajlovi su uneti u ProteinScape softver (Bruker Daltonics, V3.1) i pretraživani naspram baze podataka sekvenci upotrebnom Mascot softvera za pretragu baze podataka. Fasta baza podataka sekvenci sadržala je sekvence lakog i teškog lanca trastuzumaba sa dodatim kontaminirajućim proteinskim sekvencama (npr. LysC, tripsin i keratini). Pretrage su izvedene upotrebom sledećih podešavanja: 0.35 Da tolerancija mase prekursora, 0.35 Da tolerancija mase fragmenta jona, specifičnost tripsina sa maksimumom od 2 promašena cepanja, karbamidometilacija (C) kao fiksirana modifikacija. Sledeće promenljive modifikacije su naznačene: oksidacija (MHW), deamidacija (NQ), karbamilacija (K N-terminus) i acetilacija (protein N-terminus). Peptidi sa Mascot jonskim skorovima iznad praga vrednosti skora identičnosti su prihvaćeni kao validne identifikacije (lažna stopa otkrića peptida < 1%).
[0947] Relativno kvantitativno određivanje
[0949] [0363] Za težak lanac trastuzumaba, jedan peptid sa histidinskom oksidacijom (sekvenca K.FNWYVDGVEVH* NAK.T, sa oksidovanim H11) je isključivo identifikovan u konjugatu trastuzumaba dobijenom pomoću bakrom katalizovane konjugacije 46, ali nijedan nije detektovan u drugim uzorcima. Hromatograni ekstrahovane jonske struje (EIC) za peptid sa i bez oksidovanog histidina (EIC: 847.46 ± 0.5 m/z i EIC: 839.97 ± 0.5 m/z, respektivno) su generisani u DataAnalysis softveru. Pored toga, EIC hromatogrami za sledeća dva peptida su korišćeni za svrhe normalizacije: -.EVQLVESGGGLVQPGGSLR.L (EIC: 941.6 ± 0.5 m/z) i K.GPSVFPLAPSSK.S (EIC: 593.95 ± 0.5 m/z). Iz integrisane površine pika iz tri ponovljena merenja izračunata je srednja vrednost i izražena je u odnosu na nativni trastuzumab, ukazujući na to da gore navedeni fragment sa oksidovanim histidinom čini do 69% od ukupnog određenog tog fragmenta (31% nemodifikovanog fragmenta).;[0950] Za protein lakog lanca trastuzumaba, jedan peptid sa oksidacijom metionina (sekvenca -.DIQM*TQSPSSLSASVGDR.V, sa oksidovanim M4) je isključivo identifikovan u konjugatu trastuzumaba dobijenom bakrom katalizovanom konjugacijom 46, ali nijedan nije detektovan u drugim uzorcima.
[0952] Primer 40: Kloniranje i ekspresija GalT mutanata Y289N, Y289F, Y289M, Y289V, Y289A i Y289G i Y289I.
[0954] [0365] GalT mutantni geni su amplifikovani iz konstrukta koji sadrži sekvencu koja kodira katalitički domen GalT koji se sastoji od 130-402 ak ostataka, pomoću preklapajućeg ekstenzionog PCR postupka. Enzim divljeg tipa je predstavljen sa SEQ ID NO: 17. Za Y289N mutant (predstavljen sa SEQ ID NO: 18), prvi fragment DNK je amplifikovan sa parom prajmera: Oligo38_GalT_External_Fw (CAG CGA CAT ATG TCG CTG ACC GCA TGC CCT GAG GAG TCC predstavljen sa SEQ ID NO: 1) i Oligo19_GalT_Y289N_Rw (GAC ACC TCC AAA GTT CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA predstavljen sa SEQ ID NO: 2). NdeI restrikciono mesto je podvučeno, dok je mesto mutacije istaknuto u boldu. Drugi fragment je amplifikovan sa parom prajmera: Oligo29_GalT_External_Rw (CTG ATG GAT GGA TCC CTA GCT CGG CGT CCC GAT GTC CAC predstavljen sa SEQ ID NO: 3) i Oligo18_GalT_Y289N_Fw (CCT TAC GTG CAG AAC TTT GGA GGT GTC TCT GCT CTA predstavljen sa SEQ ID NO: 4). BamHI restrikciono mesto je podvučeno, dok je mesto mutacije istaknuto u boldu. Dva fragmenta generisana u prvom krugu PCR-a su fuzionisana u drugom krugu upotrebom Oligo38_GalT_External_Fw i Oligo29_GalT_External_Rw prajmera. Posle razlaganja sa NdeI i BamHI. Ovaj fragment je ligatiran u pET16b vektor odcepljen sa istim restrikcionim enzimima. Novo konstruisani ekspresioni vektor sadržao je gen koji kodira Y289N mutant i sekvencu koja kodira His-obeležeivač iz pET16b vektora, što je potvrđeno pomoću rezultata sekvenciranja DNK. Za konstrukciju Y289F (predstavljen sa SEQ ID NO: 19), Y289M (predstavljen sa SEQ ID NO: 20), Y289I (predstavljen sa SEQ ID NO: 21), Y289V (predstavljen sa SEQ ID NO: 22), Y289A (predstavljen sa SEQ ID NO: 23) i Y289G (predstavljen sa SEQ ID NO: 24) mutanata korišćen je isti postupak, sa mestima mutacija promenjenim u TTT, ATG, ATT, GTG, GCG ili GGC triplete koji kodiraju fenilalanin, metionin, izoleucin, valin, alanin ili glicin, respektivno. Specifičnije, za konstrukciju Y289F, prvi DNK fragment je amplifikovan sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 5 i drugi fragment je amplifikovan sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 6 (videti Tabelu 1 za srodne sekvence). Pored toga, za konstrukciju Y289M, prvi fragment DNK je amplifikovan sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 7 i drugi fragment je amplifikovan sa parom prajmera definisanih ovde kao SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 8 (videti Tabelu 1 za srodne sekvence).
[0955] GalT mutanti su eksprimirani, izolovani i ponovo savijeni iz inkluzionih tela prema postupku objavljenom od strane Qasba et al. (Prot. Expr. Pur. 2003, 30, 219-229). Posle ponovnog savijanja, talog je uklonjen i rastvorljivi i savijeni protein je izolovan upotrebom Ni-NTA kolone (HisTrap excel 1 mL kolona, GE Healthcare). Posle eluiranja sa 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl i 200 mM imidazolom, protein je dijaliziran protiv 25 mM Tris-HCl pH 8.0 i koncentrovan do 2 mg/mL upotrebom spinfiltera (Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit sa Ultracel-10 membranom, Merck Millipore).
[0957] Tabela 1. Identifikacija korišćenih prajmera preko sekvenci
[0960]
[0961]
[0964] Primer 41: Transfer UDP-GalNAz sa GalT mutantima Y289N, Y289F i Y289M.
[0966] Enzimatsko uvođenje derivata galaktoze na trastuzumab postignuto je sa jednim od β(1,4)-Gal-T1 mutanata Y289N, Y289F ili Y289M. Na taj način, deglikozilovani trastuzumab (pripremljen kao što je opisano u prethodnom tekstu, 10 mg/mL) je inkubiran sa UDP-N azidoacetilgalaktozaminom 52 (UDP-GalNAz) (1 mM) i odgovarajućim β(1,4)-Gal-T1 mutantom (0.1 mg/mL) u 10 mM MnCl<2>i 25 mM Tris-HCl pH 8.0 u trajanju od 16 časova na 30°C.
[0967] Za sva tri mutanta Y289N, Y289F ili Y289M, masena spektralna analiza sirove smeše je pokazala čistu konverziju trastuzumab supstituisanog sa jezgrom GlcNAc(Fuc) u trastuzumab(GalNAz)<2>(49713 Da, 90% od ukupnog teškog lanca).
[0968] LISTING SEKVENCI
[0969]
[0970] <110> SynAffix B.V.
[0972] <120> Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu
[0974] <130> P6042904PCT
[0976] <150> EP12189604.7
[0977] <151> 2012-10-23
[0979] <150> US61/717,187
[0980] <151> 2012-10-23
[0982] <150> EP13188607.9
[0983] <151> 2013-10-14
[0985] <160> 24
[0987] <170> PatentIn verzija 3.3
[0989] <210> 1
[0990] <211> 39
[0991] <212> DNK
[0992] <213> veštačka
[0994] <220>
[0995] <223> prajmerska sekvenca
[0997] <400> 1
[0998] cagcgacata tgtcgctgac cgcatgccct gaggagtcc 39 <211> 36
[0999] <212> DNK
[1000] <213> veštačka
[1002] <220>
[1003] <223> prajmerska sekvenca
[1005] <400> 2
[1006] gacacctcca aagttctgca cgtaaggtag gctaaa 36
[1008] <210> 3
[1009] <211> 39
[1010] <212> DNK
[1011] <213> veštačka
[1013] <220>
[1014] <223> prajmerska sekvenca
[1016] <400> 3
[1017] ctgatggatg gatccctagc tcggcgtccc gatgtccac 39
[1019] <210> 4
[1020] <211> 36
[1021] <212> DNK
[1022] <213> veštačka
[1024] <220>
[1025] <223> prajmerska sekvenca
[1027] <400> 4
[1028] ccttacgtgc agaactttgg aggtgtctct gctcta 36
[1030] <210> 5
[1031] <211> 36
[1032] <212> DNK
[1033] <213> veštačka
[1035] <220>
[1036] <223> prajmerska sekvenca
[1038] <400> 5
[1039] gacacctcca aaaaactgca cgtaaggtag gctaaa 36
[1041] <210> 6
[1042] <211> 36
[1043] <212> DNK
[1044] <213> veštačka
[1046] <220>
[1047] <223> prajmerska sekvenca
[1049] <400> 6
[1050] ccttacgtgc agttttttgg aggtgtctct gctcta 36
[1052] <210> 7
[1053] <211> 36
[1054] <212> DNK
[1055] <213> veštačka
[1057] <220>
[1058] <223> prajmerska sekvenca
[1060] <400> 7
[1061] gacacctcca aacatctgca cgtaaggtag gctaaa 36
[1063] <210> 8
[1064] <211> 36
[1065] <212> DNK
[1066] <213> veštačka
[1068] <220>
[1069] <223> prajmerska sekvenca
[1071] <400> 8
[1072] ccttacgtgc agatgtttgg aggtgtctct gctcta 36
[1074] <210> 9
[1075] <211> 36
[1076] <212> DNK
[1077] <213> veštačka
[1079] <220>
[1080] <223> prajmerska sekvenca
[1082] <400> 9
[1083] gacacctcca aaaatctgca cgtaaggtag gctaaa 36 <211> 36
[1084] <212> DNK
[1085] <213> veštačka
[1087] <220>
[1088] <223> prajmerska sekvenca
[1090] <400> 10
[1091] ccttacgtgc agatttttgg aggtgtctct gctcta 36
[1093] <210> 11
[1094] <211> 36
[1095] <212> DNK
[1096] <213> veštačka
[1098] <220>
[1099] <223> prajmerska sekvenca
[1101] <400> 11
[1102] gacacctcca aacacctgca cgtaaggtag gctaaa 36
[1104] <210> 12
[1105] <211> 36
[1106] <212> DNK
[1107] <213> veštačka
[1109] <220>
[1110] <223> prajmerska sekvenca
[1112] <400> 12
[1113] ccttacgtgc aggtgtttgg aggtgtctct gctcta 36
[1115] <210> 13
[1116] <211> 36
[1117] <212> DNK
[1118] <213> veštačka
[1120] <220>
[1121] <223> prajmerska sekvenca
[1123] <400> 13
[1124] gacacctcca aacgcctgca cgtaaggtag gctaaa 36
[1126] <210> 14
[1127] <211> 36
[1128] <212> DNK
[1129] <213> veštačka
[1131] <220>
[1132] <223> prajmerska sekvenca
[1134] <400> 14
[1135] ccttacgtgc aggcgtttgg aggtgtctct gctcta 36
[1137] <210> 15
[1138] <211> 36
[1139] <212> DNK
[1140] <213> veštačka
[1142] <220>
[1143] <223> prajmerska sekvenca
[1145] <400> 15
[1146] gacacctcca aagccctgca cgtaaggtag gctaaa 36
[1148] <210> 16
[1149] <211> 36
[1150] <212> DNK
[1151] <213> veštačka
[1153] <220>
[1154] <223> prajmerska sekvenca
[1156] <400> 16
[1157] ccttacgtgc agggctttgg aggtgtctct gctcta 36
[1159] <210> 17
[1160] <211> 402
[1161] <212> PRT
[1162] <213> Bos taurus
[1164] <400> 17
[1166] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly
[1167] 1 5 10 15
[1168] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1170] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1172] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1174] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1176] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1177] 85 90 95
[1179] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1181] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1183] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1184] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1186] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1187] 165 170 175
[1189] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1191] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1193] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1195] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1197] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1198] 245 250 255
[1200] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1201] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1203] Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1205] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1207] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1208] 325 330 335
[1210] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1212] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1214] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1216] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400 Pro Ser
[1218] <210> 18
[1219] <211> 402
[1220] <212> PRT
[1221] <213> veštačka
[1223] <220>
[1224] <223> bos taurus GalT Y289N
[1226] <400> 18
[1228] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1230] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1232] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1234] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1236] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1237] 85 90 95
[1239] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1241] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1243] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1245] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1247] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1248] 165 170 175
[1250] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1252] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1254] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1256] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1257] 245 250 255
[1259] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1261] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1263] Asn Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1265] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1267] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1269] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1271] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1273] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1275] Pro Ser
[1277] <210> 19
[1278] <211> 402
[1279] <212> PRT
[1280] <213> veštačka
[1282] <220>
[1283] <223> bos taurus GalT Y289F
[1285] <400> 19
[1286] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1288] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1290] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1292] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1294] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1296] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1297] 85 90 95
[1299] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1301] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1302] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1304] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1306] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1307] 165 170 175
[1309] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1311] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1313] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1315] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1317] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1318] 245 250 255 Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1320] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1322] Phe Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1324] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1326] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1327] 325 330 335
[1329] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1331] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1333] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1334] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1336] Pro Ser
[1338] <210> 20
[1339] <211> 402
[1340] <212> PRT
[1341] <213> veštačka
[1343] <220>
[1344] <223> bos taurus GalT Y289M
[1346] <400> 20
[1348] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1350] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1352] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1354] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1356] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1357] 85 90 95
[1359] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1361] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1363] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1365] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1367] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1368] 165 170 175
[1370] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1372] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1374] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1376] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1377] 245 250 255
[1379] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1381] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1383] Met Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1385] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1386] 325 330 335
[1388] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1390] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1392] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1394] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1396] Pro Ser
[1398] <210> 21
[1399] <211> 402
[1400] <212> PRT
[1401] <213> veštačka
[1402] <223> bos taurus GalT Y289I
[1404] <400> 21
[1406] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1408] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1410] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1412] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1414] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1416] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1417] 85 90 95
[1419] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1420] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1422] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1424] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1426] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1427] 165 170 175
[1429] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1431] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1433] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1435] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240 Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1436] 245 250 255
[1438] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1440] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1442] Ile Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1444] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1446] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1447] 325 330 335
[1449] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1451] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1452] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1454] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1456] Pro Ser
[1458] <210> 22
[1459] <211> 402
[1460] <212> PRT
[1461] <213> veštačka
[1463] <220>
[1464] <223> bos taurus GalT Y289V
[1466] <400> 22
[1468] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1470] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1472] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1474] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1476] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1477] 85 90 95
[1479] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1481] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1483] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1485] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1487] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1489] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1491] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1493] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1495] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1496] 245 250 255
[1498] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1500] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1502] Val Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1504] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1505] 325 330 335
[1507] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1509] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1511] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1513] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1515] Pro Ser
[1517] <210> 23
[1518] <212> PRT
[1519] <213> veštačka
[1521] <220>
[1522] <223> bos taurus GalT Y289A
[1524] <400> 23
[1526] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1528] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu 20 25 30
[1530] His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1532] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1534] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1536] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1537] 85 90 95 Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1539] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1541] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1543] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln 145 150 155 160
[1545] Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1546] 165 170 175
[1548] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1550] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1552] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1553] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1555] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1556] 245 250 255
[1558] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1560] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln 275 280 285
[1562] Ala Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1564] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1566] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1567] 325 330 335
[1569] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1570] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1572] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1574] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1576] Pro Ser
[1578] <210> 24
[1579] <211> 402
[1580] <212> PRT
[1581] <213> veštačka
[1583] <220>
[1584] <223> bos taurus GalT Y289G
[1586] <400> 24
[1588] Met Lys Phe Arg Glu Pro Leu Leu Gly Gly Ser Ala Ala Met Pro Gly 1 5 10 15
[1590] Ala Ser Leu Gln Arg Ala Cys Arg Leu Leu Val Ala Val Cys Ala Leu His Leu Gly Val Thr Leu Val Tyr Tyr Leu Ala Gly Arg Asp Leu Arg 35 40 45
[1592] Arg Leu Pro Gln Leu Val Gly Val His Pro Pro Leu Gln Gly Ser Ser 50 55 60
[1594] His Gly Ala Ala Ala Ile Gly Gln Pro Ser Gly Glu Leu Arg Leu Arg 65 70 75 80
[1596] Gly Val Ala Pro Pro Pro Pro Leu Gln Asn Ser Ser Lys Pro Arg Ser
[1597] 85 90 95
[1599] Arg Ala Pro Ser Asn Leu Asp Ala Tyr Ser His Pro Gly Pro Gly Pro 100 105 110
[1601] Gly Pro Gly Ser Asn Leu Thr Ser Ala Pro Val Pro Ser Thr Thr Thr 115 120 125
[1603] Arg Ser Leu Thr Ala Cys Pro Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro 130 135 140
[1605] Met Leu Ile Glu Phe Asn Ile Pro Val Asp Leu Lys Leu Ile Glu Gln Gln Asn Pro Lys Val Lys Leu Gly Gly Arg Tyr Thr Pro Met Asp Cys
[1606] 165 170 175
[1608] Ile Ser Pro His Lys Val Ala Ile Ile Ile Leu Phe Arg Asn Arg Gln 180 185 190
[1610] Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu Tyr Tyr Leu His Pro Met Val Gln Arg 195 200 205
[1612] Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Glu Ser 210 215 220
[1614] Met Phe Asn Arg Ala Lys Leu Leu Asn Val Gly Phe Lys Glu Ala Leu 225 230 235 240
[1616] Lys Asp Tyr Asp Tyr Asn Cys Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile
[1617] 245 250 255
[1619] Pro Met Asn Asp His Asn Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His 260 265 270
[1621] Ile Ser Val Ala Met Asp Lys Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Gly Phe Gly Gly Val Ser Ala Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Ser Ile 290 295 300
[1623] Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp 305 310 315 320
[1625] Ile Tyr Asn Arg Leu Ala Phe Arg Gly Met Ser Val Ser Arg Pro Asn
[1626] 325 330 335
[1628] Ala Val Ile Gly Lys Cys Arg Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys 340 345 350
[1630] Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu 355 360 365
[1632] Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu Asn Ser Leu Thr Tyr Met Val Leu Glu 370 375 380
[1634] Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr Thr Lys Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr 385 390 395 400
[1636] Pro Ser

Claims (8)

1. Patentni zahtevi
1. Konjugat antitela prema formuli (20) ili (20b) za upotrebu kao lek:
pri čemu:
L je linker;
D je citotoksin;
r je 1 - 20;
R<1>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, ‑OR<5>, ‑NO<2>, ‑CN, ‑S(O)<2>R<5>, C<1>-C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa i pri čemu alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe su izborno supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti vezana
zajedno tako da formiraju aneliran cikloalkil ili aneliran (hetero)aren supstituent, i pri čemu R<5>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa;
X je C(R<1>)<2>, O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je R<1>ili L(D)<r>, i pri čemu L, D i r su kao što su definisani gore;
q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q jednako 0 tada je X jednako N-L(D)r;
b je 0 ili 1;
p je 0 ili 1;
Q je ‑N(H)C(O)CH<2>- ili ‑CH<2>‑;
x je 1, 2, 3 ili 4;
y je 1 - 20;
pri čemu, u formuli (20), a = 5, 6 ili 7,
pri čemu, u formuli (20b)
a je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 7;
a’ je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 i
a+a’ je 5, 6, ili 7,
i pri čemu AB je antitelo, pri čemu antitelo specifično vezuje antigen kancera,
S je šećer ili šećerni derivat,
GlcNAc je N-acetilglukozamin and Fuc je fukoza i pri čemu GlcNAc je vezan preko C1 za AB preko N-glikozidne veze za atom azota amida u bočnom lancu aminokiseline asparaganina od AB.
2. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu konjugat antitela je formule (21):
pri čemu AB, L, D, S, Q, x, y, b, p, R<1>, r i GlcNAc su kao što su definisani u patentnom zahtevu 1, i
Y je O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je kao što je definisan u patentnom zahtevu 1;
R<3>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)<r>, ‑(CH<2>)<n>‑Y-L(D)<r>, halogena, C<1>-C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa, pri čemu su alkil grupe izborno prekinute jednim ili više hetero-atoma izabranim iz grupe koja se sastoji od O, N i S,
pri čemu alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe su nezavisno izborno supstituisane; i n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10,
ili pri čemu, konjugat antitela je formule (15b) ili formule (22):
pri čemu AB, L, D, S, x, y, b, p, Q i GlcNAc su kao što su definisani u patentnom zahtevu 1.
3. Konjugat antitela za upotrebu kao lek, pri čemu se konjugat antitela može dobiti pomoću postupka koji sadrži reakciju modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, pri čemu navedeni konjugat linkera sadrži (hetero)cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa, pri čemu navedeni molekul od interesa je citotoksin,
pri čemu navedeno modifikovano antitelo je antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent, pri čemu GlcNAc je jezgro N-acetilglukozamin, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, pri čemu A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4,
pri čemu navedeni GlcNAc-S(A)<x>supstituent je vezan za antitelo preko C1 jezgra N-acetilglukozamina navedenog GlcNAc-S(A)<x>supstituenta preko N-glikozidne veze za atom azota amida u bočnom lancu aminokiseline asparagina antitela i pri čemu navedeni GlcNAc je izborno fukozilovan, i
pri čemu, antitelo specifično vezuje antigen kancera.
4. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu postupak sadrži korake:
(i) dovođenja u kontakt antitela koje sadrži supstituent jezgra N-acetilglukozamina (GlcNAc) sa jedinjenjem formule S(A)<x>-P u prisustvu katalizatora, pri čemu je supstituent jezgra N-acetilglukozamina izborno fukozilovan, pri čemu navedeni katalizator sadrži mutantni
katalitički domen iz galaktoziltransferaze, pri čemu S(A)<x>je šećerni derivat koji sadrži x funkcionalnih grupa A, gde A je azido grupa i x je 1, 2, 3 ili 4, pri čemu P je izabran iz grupe koja se sastoji od uridin difosfata (UDP), guanozin difosfata (GDP) i citidin difosfata (CDP), da bi se dobilo modifikovano antitelo, pri čemu modifikovano antitelo je definisano kao antitelo koje sadrži GlcNAc-S(A)<x>supstituent vezan za antitelo preko C1 od N-acetilglukozamina navedenog supstituenta GlcNAc-S(A)<x>, i pri čemu navedeno modifikovano antitelo je prema formuli (4):
gde:
S(A)<x>i x su kao što su definisani u prethodnom tekstu; AB predstavlja antitelo; GlcNAc je N-acetilglukozamin; Fuc je fukoza; b je 0 ili 1; i y je 1 do 20; i
(ii) reagovanja navedenog modifikovanog antitela sa konjugatom linkera, pri čemu navedeni konjugat linkera sadrži (hetero) cikloalkinil grupu i jedan ili više molekula od interesa.
5. Konjugat antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačen time što katalizator je katalizator koji sadrži mutantni katalitički domen iz β(1,4)-galaktoziltransferaze, poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od GalT Y289L, GalT Y289N, GalT Y289I, GalT Y289F, GalT Y289M, GalT Y289V, GalT Y289G, GalT Y289I i GalT Y289A.
6. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3 - 5, naznačen time što navedeni konjugat linkera ima formulu (11):
gde:
L je linker;
D je molekul od interesa, pri čemu navedeni molekul od interesa je citotoksin;
r je 1 - 20;
R<1>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, -OR<5>, -NO<2>, -CN, -S(O)<2>R<5>, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>-C<24>(hetero)arilalkil grupa i pri čemu alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe su izborno supstituisane, pri čemu dva supstituenta R<1>mogu biti vezani zajedno tako da formiraju anelirani cikloalkil ili anelirani (hetero)aren supstituent, i pri čemu R<5>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>-C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
X je C(R<1>)<2>, O, S ili NR<2>, pri čemu R<2>je R<1>ili L(D)<r>, i pri čemu L, D i r su kao što su definisani u prethodnom tekstu;
q je 0 ili 1, uz uslov da ako je q jednako 0, tada je X jednako N-L(D)<r>; i
a je 5, 6 ili 7.
7. Konjugat antitela za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 3 - 6, naznačen time što navedeni konjugat linkera ima formulu (17):
gde:
R<1>, L, D i r su kao što su definisani u patentnom zahtevu 6;
Y je O, S ili NR<2>, gde R<2>je kao što je definisan u patentnom zahtevu 6;
R<3>je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, halogena, C<1>- C<24>alkil grupa, C<6>- C<24>(hetero)aril grupa, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupa i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupa;
R<4>je izabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, Y-L(D)<r>, -(CH<2>)<n>-Y-L(D)<r>, halogena, C<1>-C<24>alkil grupe, C<6>- C<24>(hetero)aril grupe, C<7>- C<24>alkil(hetero)aril grupe i C<7>- C<24>(hetero)arilalkil grupe, pri čemu su alkil grupe izborno prekinute sa jednim ili više heteroatoma izabranih iz grupe koja se sastoji od O, N i S, pri čemu su alkil grupe, (hetero)aril grupe, alkil(hetero)aril grupe i (hetero)arilalkil grupe nezavisno izborno supstituisane; i
n je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10,
ili gde navedeni konjugat linkera ima formulu (15) ili formulu (19):
gde
L, D i r su kao što su definisani u patentnom zahtevu 6.
8. Konjugat antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 7 za upotrebu u lečenju kancera, poželjno kancera dojke, poželjnije HER2 pozitivnog kancera dojke.
RS20180180A 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu RS56953B2 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261717187P 2012-10-23 2012-10-23
EP12189604 2012-10-23
EP13188607 2013-10-14
PCT/NL2013/050744 WO2014065661A1 (en) 2012-10-23 2013-10-23 Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof
EP13786322.1A EP2911699B2 (en) 2012-10-23 2013-10-23 Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS56953B1 RS56953B1 (sr) 2018-05-31
RS56953B2 true RS56953B2 (sr) 2026-02-27

Family

ID=50544942

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180180A RS56953B2 (sr) 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovu pripremu
RS20230519A RS64329B1 (sr) 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovo pripremanje

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230519A RS64329B1 (sr) 2012-10-23 2013-10-23 Modifikovano antitelo, konjugat antitela i postupak za njihovo pripremanje

Country Status (17)

Country Link
US (4) US10745488B2 (sr)
EP (3) EP2911699B2 (sr)
JP (3) JP6855661B2 (sr)
CN (2) CN110201186A (sr)
CY (1) CY1120041T1 (sr)
DK (2) DK2911699T4 (sr)
ES (2) ES2659270T5 (sr)
FI (2) FI3912642T3 (sr)
HR (2) HRP20180268T4 (sr)
HU (2) HUE038285T2 (sr)
LT (2) LT2911699T (sr)
PL (2) PL2911699T5 (sr)
PT (1) PT2911699T (sr)
RS (2) RS56953B2 (sr)
SI (2) SI3912642T1 (sr)
SM (2) SMT201800096T1 (sr)
WO (1) WO2014065661A1 (sr)

Families Citing this family (187)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10745488B2 (en) * 2012-10-23 2020-08-18 Synaffix B.V. Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof
EA038512B1 (ru) 2013-03-15 2021-09-08 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Конъюгаты майтанзиноидов и их терапевтическое применение
LT2991683T (lt) * 2013-05-02 2019-12-27 Glykos Finland Oy Glikoproteino arba glikano konjugatai su toksine medžiaga
US20160354482A1 (en) 2013-08-26 2016-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising macrolide diastereomers, methods of their synthesis and therapeutic uses
JP2016538877A (ja) 2013-10-14 2016-12-15 シンアフィックス ビー．ブイ． 修飾糖タンパク質、タンパク質コンジュゲート及びそれらの調製方法
WO2015057066A1 (en) * 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
EP3058083B1 (en) 2013-10-14 2018-04-11 SynAffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
EP3079668A1 (en) 2013-12-09 2016-10-19 Durect Corporation Pharmaceutically active agent complexes, polymer complexes, and compositions and methods involving the same
EP3925951A1 (en) 2014-01-24 2021-12-22 SynAffix B.V. Process for the cycloaddition of a(hetero)aryl 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
US10266502B2 (en) 2014-01-24 2019-04-23 Synaffix B.V. Process for the cycloaddition of a halogenated 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
AU2015243512B2 (en) 2014-04-08 2020-06-04 University Of Georgia Research Foundation Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
DK3160513T3 (da) 2014-06-30 2020-04-06 Glykos Finland Oy Saccharidderivat af en toksisk payload og antistofkonjugater deraf
EP2974744A1 (en) 2014-07-16 2016-01-20 Stichting Katholieke Universiteit Strain-promoted oxidation controlled cycloaddition with high reaction rate
JP2017528124A (ja) * 2014-08-04 2017-09-28 シンアフィックス ビー．ブイ． ベータ−（１，４）−ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ又はその突然変異体を用いる糖タンパク質の改変方法
WO2016053107A1 (en) * 2014-10-03 2016-04-07 Synaffix B.V. Sulfamide linker, conjugates thereof, and methods of preparation
BR112017011773A2 (pt) * 2014-12-04 2018-02-20 Celgene Corporation composto isolado, conjugados isolados, composiçôes farmacêuticas, e métodos de tratamento de um distúrbio em um mamífero
US20170369525A1 (en) * 2014-12-31 2017-12-28 Development Center For Biotechnology Site-specific conjugation through glycoproteins linkage and method thereof
US11559581B2 (en) * 2015-01-09 2023-01-24 Oxford University Innovation Limited Antibody conjugates and methods of making the antibody conjugates
KR102708103B1 (ko) 2015-03-27 2024-09-20 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 메이탄시노이드 유도체, 이의 컨주게이트, 및 사용 방법
ES2995336T3 (en) 2015-04-23 2025-02-10 Synaffix Bv Process for the modification of a glycoprotein using a glycosyltransferase that is or is derived from a beta-(1,4)-n-acetylgalactosaminyltransferase
WO2016172615A1 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 University Of Delaware Synthetic n-acetyl-muramic acid derivatives and uses thereof
ES2971045T3 (es) 2015-07-06 2024-06-03 Regeneron Pharma Moléculas multiespecíficas de unión a antígeno y usos de las mismas
WO2017032888A1 (en) * 2015-08-26 2017-03-02 Vib Vzw Means and methods for monitoring inflammation
KR20180058737A (ko) * 2015-10-07 2018-06-01 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 암 선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거-활성화 대사성 당 전구체
CN107043406B (zh) 2015-11-03 2021-08-17 财团法人工业技术研究院 化合物、连接子-药物、及配体-药物耦合体
AU2016366521A1 (en) 2015-12-11 2018-06-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing or preventing growth of tumors resistant to EGFR and/or ErbB3 blockade
CN108779127B (zh) 2016-01-25 2022-07-05 里珍纳龙药品有限公司 美登素类化合物衍生物、其偶联物和使用方法
CN108495653A (zh) 2016-01-27 2018-09-04 免疫医疗有限责任公司 用于制备具有定义的糖基化模式抗体的方法
EP4438727A3 (en) 2016-02-08 2025-02-12 Synaffix B.V. Enzymes for trimming of glycoproteins
WO2017137457A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
JP2017200902A (ja) * 2016-02-08 2017-11-09 シンアフィックス ビー．ブイ． Ｈｅｒ２腫瘍を標的化するための改善された治療指数を有する新規な抗体−コンジュゲート及び抗体−コンジュゲートの治療指数を改善するための方法
EP3413916A1 (en) * 2016-02-08 2018-12-19 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
US11951175B2 (en) 2016-02-08 2024-04-09 Synaffix B.V. Bioconjugates containing sulfamide linkers for use in treatment
US11338043B2 (en) 2016-02-08 2022-05-24 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting HER2 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137423A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Improved sulfamide linkers for use in bioconjugates
JP2017197512A (ja) * 2016-02-08 2017-11-02 シンアフィックス ビー．ブイ． Ｃｄ３０腫瘍を標的化するための改善された治療指数を有する新規な抗体−コンジュゲート及び抗体−コンジュゲートの治療指数を改善するための方法
DK3423105T3 (da) 2016-03-02 2021-07-26 Eisai R&D Man Co Ltd Antistof-lægemiddelkonjugater på basis af eribulin og fremgangsmåder til anvendelse heraf
US11352446B2 (en) 2016-04-28 2022-06-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
JP7020403B2 (ja) 2016-05-02 2022-02-16 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
WO2017218891A1 (en) * 2016-06-17 2017-12-21 Life Technologies Corporation Site-specific crosslinking of antibodies
CN121021395A (zh) 2016-06-28 2025-11-28 文塔纳医疗系统公司 点击化学用于ihc和ish测定中的信号扩增的应用
TW201811376A (zh) 2016-07-01 2018-04-01 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產權有限公司 抗體-藥物結合物及使用其之治療方法
CN109462989A (zh) * 2016-07-01 2019-03-12 第三共株式会社 Hanp-含fc分子缀合物
CA3037732A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
SG10202104259RA (en) 2016-11-08 2021-06-29 Regeneron Pharma Steroids and protein-conjugates thereof
WO2018090045A1 (en) * 2016-11-14 2018-05-17 Cho Pharma Inc Antibody-drug conjugates
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
CA3048452C (en) * 2016-12-29 2021-06-15 Development Center For Biotechnology Processes for preparing glycoprotein-drug conjugates
WO2018141959A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Innate Pharma Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide
KR20190126314A (ko) 2017-02-10 2019-11-11 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 암-선택적 표지화 및 표적화를 위한 트리거 활성화 가능한 당 접합체
US11891451B2 (en) 2017-05-11 2024-02-06 Vib Vzw Glycosylation of variable immunoglobulin domains
CN111065622A (zh) 2017-05-18 2020-04-24 里珍纳龙药品有限公司 双八氢菲羧酰胺类化合物及其蛋白质偶联物
KR20200007905A (ko) 2017-05-18 2020-01-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이클로덱스트린 단백질 약물 접합체
WO2018226861A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
AU2018315154B2 (en) 2017-08-09 2022-11-10 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH New targeted cytotoxic ratjadone derivatives and conjugates thereof
EP3441766B1 (en) * 2017-08-11 2020-03-11 Life Science Inkubator Sachsen GmbH & Co. KG Novel antibody conjugates suitable for use in discrete fluorescence quenching displacement immunoassays
IL301636B2 (en) 2017-09-29 2025-02-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugation of an antibody with a pyrrolobenzodiazepine derivative
EP3706805A2 (en) 2017-11-07 2020-09-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hydrophilic linkers for antibody drug conjugates
MX2020005473A (es) 2017-11-27 2020-08-27 Purdue Pharma Lp Anticuerpos humanizados que se dirigen al factor tisular humano.
CN111683686A (zh) * 2017-12-06 2020-09-18 西纳福克斯股份有限公司 烯二炔缀合物
BR112020013198A2 (pt) 2017-12-29 2020-12-01 Glycomimetics, Inc. inibidores heterobifuncionais de e-selectina e galectina-3
MA50259A1 (fr) 2018-01-08 2021-07-29 Regeneron Pharma Stéroïdes et leurs conjugués-anticorps
KR102871690B1 (ko) 2018-04-30 2025-10-16 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Her2 및/또는 aplp2에 결합하는 항체 및 이중특이적 항원-결합 분자 및 접합체 그리고 이들의 용도
CA3098453A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-msr1 antibodies and methods of use thereof
KR20250140631A (ko) 2018-05-17 2025-09-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-cd63 항체, 콘쥬게이트, 및 이의 용도
JP2019206491A (ja) * 2018-05-29 2019-12-05 国立研究開発法人理化学研究所 乳がんまたは胃がんの治療のための抗体−薬物複合体
ES2995219T3 (en) * 2018-06-15 2025-02-07 Shanghai Miracogen Inc Methods and materials for treating cancer
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
KR20210081322A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
CA3108335A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes and uses thereof
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US20220193250A1 (en) 2018-08-02 2022-06-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2020028861A1 (en) * 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US12370264B1 (en) 2018-08-02 2025-07-29 Dyne Therapeutics, Inc. Complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and method of delivering oligonucleotide to a subject
WO2020094670A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
KR20210094568A (ko) 2018-11-20 2021-07-29 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Lxr 작용물질로서 사용하기 위한 비스-옥타하이드로펜안트렌 카복스아미드 유도체 및 그의 단백질 접합체
CN113454097B (zh) 2018-12-21 2024-08-30 里珍纳龙药品有限公司 微管溶素及蛋白质-微管溶素偶联物
PH12021551476A1 (en) 2018-12-21 2022-04-25 Regeneron Pharma Rifamycin analogs and antibody-drug conjugates thereof
US11845771B2 (en) 2018-12-27 2023-12-19 Glycomimetics, Inc. Heterobifunctional inhibitors of E-selectin and galectin-3
CA3122321A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 Glycomimetics, Inc. Galectin-3 inhibiting c-glycosides
SG11202107212QA (en) 2019-01-08 2021-07-29 Regeneron Pharma Traceless linkers and protein-conjugates thereof
GB201901608D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Vib Vzw Vaccine adjuvant conjugates
CN113727757A (zh) 2019-02-21 2021-11-30 瑞泽恩制药公司 使用结合met的抗-met抗体和双特异性抗原结合分子治疗眼癌的方法
WO2020196474A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 第一三共株式会社 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
CA3191804A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
CA3139180A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate and parp inhibitor
WO2020245229A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Synaffix B.V. Acetal-based cleavable linkers
MX2022002886A (es) 2019-09-16 2022-04-06 Regeneron Pharma Proteinas de union met radiomarcadas para la obtencion de imagenes por inmuno-pet.
US11814428B2 (en) 2019-09-19 2023-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PTCRA antibody-drug conjugates and uses thereof
AU2019341067B2 (en) * 2019-09-29 2021-08-05 Mabplex International Co., Ltd. Method for producing antibody-drug conjugate intermediate by addition of acid and use thereof
GB201917388D0 (en) * 2019-11-28 2020-01-15 Cambridge Entpr Ltd Novel linker compounds
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
JP2023510349A (ja) * 2020-01-09 2023-03-13 メルサナ セラピューティクス インコーポレイテッド ペプチド含有リンカーとの部位特異的抗体－薬物コンジュゲート
CN115768483A (zh) * 2020-01-13 2023-03-07 西纳福克斯股份有限公司 抗体与免疫细胞衔接器的缀合物
CN115666656A (zh) 2020-01-13 2023-01-31 西纳福克斯股份有限公司 通过环加成双侧功能化抗体
CN115243727A (zh) 2020-01-13 2022-10-25 西纳福克斯股份有限公司 经由环加成的双侧官能化抗体
PH12022551810A1 (en) 2020-01-24 2024-02-19 Regeneron Pharma Protein-antiviral compound conjugates
WO2021174113A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen binding molecules that bind her2, and methods of use thereof
KR20230004651A (ko) 2020-04-16 2023-01-06 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 딜스-알더 접합 방법
WO2021231798A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 Disc Medicine, Inc. Anti-hemojuvelin (hjv) antibodies for treating myelofibrosis
CN115697405A (zh) 2020-05-25 2023-02-03 公益财团法人神户医疗产业都市推进机构 用于治疗或预防Th2介导的疾病的含有PD-1激动剂的药物组合物
CN111560078A (zh) * 2020-06-19 2020-08-21 联宁（苏州）生物制药有限公司 具有马来酰亚胺接头的双臂中间体及其合成方法
JP2023533218A (ja) 2020-06-24 2023-08-02 レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド ツブリシン及びタンパク質－ツブリシンコンジュゲート
EP4172141A1 (en) 2020-06-26 2023-05-03 Synaffix B.V. Methods for the preparation of linker payload constructs
EP4178625A1 (en) 2020-07-13 2023-05-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
NL2026400B1 (en) * 2020-09-02 2022-05-04 Synaffix Bv Methods for the preparation of bioconjugates
EP4210767A1 (en) 2020-09-14 2023-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates comprising glp1 peptidomimetics and uses thereof
WO2022058395A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Synaffix B.V. Antibody-exatecan conjugates
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
MX2023004395A (es) 2020-10-16 2023-05-22 Univ Georgia Glicoconjugados.
NZ797493A (en) 2020-10-22 2024-05-31 Regeneron Pharma Anti-fgfr2 antibodies and methods of use thereof
NL2026947B1 (en) 2020-11-20 2022-07-01 Synaffix Bv Tyrosine-based antibody conjugates
WO2022136705A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Synaffix B.V. Glycan-conjugated antibodies binding to fc-gamma receptor
EP4271816A4 (en) 2020-12-31 2025-04-02 Dyne Therapeutics, Inc. MUSCLE TARGETING COMPLEXES AND RELATED USES FOR THE TREATMENT OF MYOTONIC DYSTROPHY
JP2024506022A (ja) 2021-02-08 2024-02-08 シンアフィックス ビー．ブイ． 多機能性抗体
WO2022217022A1 (en) 2021-04-10 2022-10-13 Profoundbio Us Co. Folr1 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
US20250066490A1 (en) 2021-04-23 2025-02-27 Profoundbio Us Co. Anti-cd70 antibodies, conjugates thereof and methods of using the same
US11672872B2 (en) 2021-07-09 2023-06-13 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor antibody and uses thereof
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3226366A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating dystrophinopathies
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
CA3220081A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Thomas Nittoli Protein-antiviral compound conjugates
CN118119633A (zh) * 2021-10-20 2024-05-31 岩唐生物科技(杭州)有限责任公司 位点特异性糖蛋白偶联物及其制备方法
KR102782629B1 (ko) * 2021-11-12 2025-03-19 닥터아이앤비(주) 생산 시간을 단축하고 안정성이 개선된 의약품 제조방법
EP4433160A1 (en) 2021-11-17 2024-09-25 Disc Medicine, Inc. Methods for treating anemia of kidney disease
WO2023129518A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tubulysins and protein-tubulysin conjugates
CA3241734A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Amy Han Camptothecin analogs conjugated to a glutamine residue in a protein, and their use
CA3242639A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Verrucarin A derivatives and their antibody-drug conjugates
US20250222124A1 (en) * 2022-01-27 2025-07-10 Glyco-Therapy Biotechnology Co., Ltd. Protein conjugates with multiple payloads and methods for making the same
AU2023223557A1 (en) 2022-02-22 2024-10-03 Adc Therapeutics Sa Conjugation method involving a transglutaminase at the fc region comprising a trimmed n-glycan
CA3243669A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ANTI-GLP1R ANTIBODY-DRUG CONJUGATES INCLUDING GLP1 PEPTIDOMIMETS AND THEIR USES
EP4496593A1 (en) 2022-03-23 2025-01-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing nectin-4
AU2023241225A1 (en) 2022-03-23 2024-08-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing trop-2
EP4496595A1 (en) 2022-03-23 2025-01-29 Synaffix B.V. Antibody-conjugates for targeting of tumours expressing carcinoembyronic antigen
JP2025510623A (ja) 2022-03-23 2025-04-15 シンアフィックス ビー．ブイ． Ｐｔｋ７を発現する腫瘍を標的化するための抗体コンジュゲート
KR20250004770A (ko) 2022-04-15 2025-01-08 다인 세라퓨틱스, 인크. 근긴장성 이영양증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제
EP4285934A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 CER Groupe Modified trimannose-oligosacharides, bisected n-glycans comprising said trimannose core and method for obtaining them
KR20250069711A (ko) 2022-07-21 2025-05-19 파이어플라이 바이오, 인크. 글루코코르티코이드 수용체 작용제 및 이의 접합체
CN119997985A (zh) 2022-08-15 2025-05-13 西纳福克斯股份有限公司 蒽环类药物及其缀合物
EP4344707A1 (en) 2022-09-29 2024-04-03 Emergence Therapeutics AG New anti-nectin-4 antibody drug conjugates
AU2023403422A1 (en) 2022-11-30 2025-07-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Tlr7 agonists and antibody-drug-conjugates thereof
WO2024121123A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Synaffix B.V. Synthesis of endo-bicyclononene
CN120752059A (zh) 2022-12-21 2025-10-03 瑞泽恩制药公司 用于adc缀合的拓扑异构酶i抑制剂的前药及其使用方法
AU2023409727A1 (en) * 2022-12-22 2025-08-07 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of preparing antibody-polynucleotide conjugates
EP4389152A1 (en) 2022-12-23 2024-06-26 Synaffix B.V. Conjugates of pbd prodrugs
WO2024150074A2 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Coronavirus antibodies and therapeutic uses thereof
TW202434309A (zh) 2023-01-19 2024-09-01 大陸商上海盛迪醫藥有限公司 酪胺酸酶介導的蛋白定點偶聯及其應用
EP4410313A1 (en) 2023-01-31 2024-08-07 Synaffix B.V. Homogeneous antibody-conjugates with high payload loading
WO2024168199A1 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates via inverse electron demand diels-alder reactions
EP4673469A1 (en) 2023-03-02 2026-01-07 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-cd22 antibodies and uses thereof
CN121002057A (zh) * 2023-03-30 2025-11-21 启德医药科技（苏州）有限公司 二糖接头、含有该二糖接头的接头-有效载荷以及聚糖链重构的抗体-药物偶联物及其制备方法和用途
CN120981487A (zh) * 2023-03-30 2025-11-18 启德医药科技（苏州）有限公司 位点特异性正交生物偶联模式及其应用
WO2024218162A1 (en) 2023-04-17 2024-10-24 Synaffix B.V. Cleavable immune cell engagers
EP4450093A1 (en) 2023-04-17 2024-10-23 Synaffix B.V. Cleavable immune cell engagers
EP4450489A1 (en) 2023-04-18 2024-10-23 Synaffix B.V. Stable 4-isoxazoline conjugates
AU2024265507A1 (en) 2023-05-02 2025-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human m-cadherin (cdh15) antibodies, conjugates, and uses thereof for delivery of genetic payloads to muscle cells
EP4709751A1 (en) 2023-05-08 2026-03-18 Sanofi Glycosylation of immunoglobulin single variable domains
WO2024251826A1 (en) 2023-06-05 2024-12-12 Vib Vzw Glyco-engineered antibody-drug-conjugates comprising an oxime linker
CN121568720A (zh) 2023-07-10 2026-02-24 瑞泽恩制药公司 抗人类cacng1抗体-药物缀合物及其用途
CN121752581A (zh) * 2023-07-10 2026-03-27 杭州瑞奥生物医药有限公司 功能化的奥瑞他汀类、药物组合物和治疗应用
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
WO2025027529A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Advesya Anti-il-1rap antibody drug conjugates and methods of use thereof
US20250115680A1 (en) 2023-09-26 2025-04-10 Profoundbio Us Co. Ptk7 binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
EP4541376A1 (en) 2023-10-17 2025-04-23 ADC Therapeutics SA Antibody-drug conjugates
US20250171516A1 (en) 2023-11-03 2025-05-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide acids as a glp1r agonist and antibody-drug conjugates thereof
WO2025117727A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Analogs of quinoxaline/quinoline cytotoxins, linker- payloads, protein-drug conjugates, and uses thereof
TW202530255A (zh) 2023-12-15 2025-08-01 法商亞維西亞有限公司 抗ｉｌ－１ｒａｐ結合結構域及其抗體－藥物偶聯物
EP4574174A1 (en) 2023-12-19 2025-06-25 Jack Elands Novel antibody-drug conjugates comprising an anti-(tcr)-cd3-complex binding antibody
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025163120A1 (en) 2024-02-01 2025-08-07 Adcytherix Sas ANTIBODY-DRUG CONJUGATES COMPRISING AN ANTI-INTEGRIN ΑVβ6 BINDING ANTIBODY
WO2025172468A1 (en) 2024-02-13 2025-08-21 Synaffix B.V. Method for producing azido-sugars and compounds obtained thereby
US20250381289A1 (en) 2024-02-29 2025-12-18 Genmab A/S Egfr and c-met bispecific binding agents, conjugates thereof and methods of using the same
WO2025238253A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Synaffix B.V. Antibody-oligonucleotide conjugates
WO2025262641A1 (en) 2024-06-19 2025-12-26 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates that bind cdcp1 and uses thereof
WO2026006495A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-wt1/hla-a2 antibody and uses thereof
WO2026006494A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Alloy Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies and uses thereof
WO2026006492A2 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Ypsilon Therapeutics, Inc. Anti-prame/hla-a2 antibodies and uses thereof
WO2026008881A1 (en) 2024-07-05 2026-01-08 Synaffix B.V. Extracellular vesicles comprising biomolecule-conjugates
US20260078179A1 (en) 2024-07-18 2026-03-19 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Cdh17 antibodies and uses thereof
WO2026035986A1 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Bighat Biosciences, Inc. Humanized anti-cdh17 antibodies and use of the same
WO2026039642A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Ardeagen Corporation Anti-mesothelin antibody conjugates and methods of use thereof
WO2026052513A1 (en) 2024-09-09 2026-03-12 Adcytherix Sas Antibody-drug conjugates comprising an flt3 binding antibody

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI20011671L (fi) 2001-08-20 2003-02-21 Carbion Oy Tuumorispesifiset oligosakkaridisekvenssit ja niiden käyttö
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
CA2510550A1 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Pradman Qasba Catalytic domains of .beta./1,4)-galactosyltransferase i having altered donor and acceptor specificities, domains that promote in vitro protein folding, and methods for their use
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
CA2536882C (en) 2003-10-29 2009-12-15 Bsn Medical, Inc. Medical bandaging product
US7332355B2 (en) * 2003-11-18 2008-02-19 California Institute Of Technology Method and compositions for the detection of protein glycosylation
US20070258986A1 (en) * 2003-11-19 2007-11-08 Govt of the US as represented by the secretary, Targeted Delivery System for Bioactive Agents
JP4521490B2 (ja) * 2003-11-21 2010-08-11 国立大学法人高知大学 類似パターン検索装置、類似パターン検索方法、類似パターン検索プログラム、および分画分離装置
WO2005056783A1 (en) * 2003-12-05 2005-06-23 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase i having altered metal ion specificity
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
US8431558B2 (en) 2004-11-01 2013-04-30 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
JP2009531289A (ja) * 2006-02-10 2009-09-03 ライフ テクノロジーズ コーポレーション オリゴ糖によるタンパク質の修飾及び標識方法
EP1987068B1 (en) * 2006-02-10 2018-08-08 Life Technologies Corporation Oligosaccharide modification and labeling of proteins
CA2647632C (en) 2006-03-27 2017-06-27 University Of Maryland Biotechnology Institute Glycoprotein synthesis and remodeling by enzymatic transglycosylation
US8398956B2 (en) 2007-01-11 2013-03-19 Immunomedics, Inc. In vivo copper-free click chemistry for delivery of therapeutic and/or diagnostic agents
WO2008143944A2 (en) * 2007-05-14 2008-11-27 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of glycosylation and bioconjugation
WO2009025645A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Beta 1,4-galactosyltransferases with altered donor and acceptor specificities, compositions and methods of use
US8425901B2 (en) 2007-08-22 2013-04-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Alpha 1-3 N-galactosyltransferase with altered donor specificities
DK2222341T3 (en) 2007-11-21 2015-03-09 Univ Georgia AND METHODS alkynes of reacting alkynes of 1,3-dipole FUNCTIONAL COMPOUNDS
WO2009102820A2 (en) * 2008-02-11 2009-08-20 Government Of The U.S A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified sugar substrates and methods of use
US7914904B2 (en) * 2008-03-25 2011-03-29 General Electric Company Component in a combustion system, and process for preventing slag, ash, and char buildup
JP5841072B2 (ja) * 2010-02-10 2016-01-06 イミュノジェン・インコーポレーテッド Ｃｄ２０抗体およびその使用
US8519122B2 (en) 2010-02-12 2013-08-27 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
CN107235828B (zh) 2010-04-27 2024-06-07 西纳福克斯股份有限公司 稠合的环辛炔化合物及其在无金属点击反应中的应用
EP2383374A1 (en) * 2010-04-29 2011-11-02 BASF Corporation Nano-particles containing carbon and a ferromagnetic metal or alloy
EP2966061B1 (en) 2011-03-04 2017-05-03 Life Technologies Corporation Compounds and methods for conjugation of biomolecules
WO2012134925A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Life Technologies Corporation Heterobifunctional esters for use in labeling target molecules
PH12013501942A1 (en) * 2011-04-01 2019-11-29 Wyeth Llc Antibody-drug conjugates
GB201115841D0 (en) 2011-09-13 2011-10-26 Genovis Ab Protein and method
US10745488B2 (en) 2012-10-23 2020-08-18 Synaffix B.V. Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PL2911699T5 (pl) 2025-12-22
HUE038285T2 (hu) 2018-10-29
CN105142672A (zh) 2015-12-09
EP3912642A1 (en) 2021-11-24
SI2911699T2 (sl) 2026-01-30
JP6855661B2 (ja) 2021-04-07
WO2014065661A1 (en) 2014-05-01
JP2023017820A (ja) 2023-02-07
JP2020090526A (ja) 2020-06-11
HRP20180268T4 (hr) 2026-03-27
US20150258210A1 (en) 2015-09-17
JP2015534996A (ja) 2015-12-07
JP7167071B2 (ja) 2022-11-08
LT2911699T (lt) 2018-03-26
US10745488B2 (en) 2020-08-18
FI3912642T3 (fi) 2023-07-07
US20250177554A1 (en) 2025-06-05
PL2911699T3 (pl) 2018-04-30
ES2659270T3 (es) 2018-03-14
ES2949376T3 (es) 2023-09-28
US12194107B2 (en) 2025-01-14
RS64329B1 (sr) 2023-08-31
CN105142672B (zh) 2019-04-05
HRP20180268T1 (hr) 2018-03-23
HRP20230690T1 (hr) 2023-10-13
JP7741788B2 (ja) 2025-09-18
US20210163623A1 (en) 2021-06-03
DK2911699T4 (da) 2025-12-08
EP2911699A1 (en) 2015-09-02
EP3912642B1 (en) 2023-04-12
ES2659270T5 (en) 2026-02-11
EP2911699B1 (en) 2017-11-15
EP3912642A8 (en) 2022-01-05
SMT202300208T1 (it) 2023-09-06
LT3912642T (lt) 2023-07-25
RS56953B1 (sr) 2018-05-31
SMT201800096T1 (it) 2018-05-02
EP2911699B2 (en) 2025-09-10
US9504758B2 (en) 2016-11-29
EP3335733A1 (en) 2018-06-20
PT2911699T (pt) 2018-02-23
DK3912642T3 (da) 2023-06-26
US20150320882A1 (en) 2015-11-12
CN110201186A (zh) 2019-09-06
HUE062385T2 (hu) 2023-10-28
SI3912642T1 (sl) 2023-09-29
PL3912642T3 (pl) 2023-08-14
CY1120041T1 (el) 2018-12-12
DK2911699T3 (en) 2018-02-12
FI2911699T4 (fi) 2025-12-09
SI2911699T1 (en) 2018-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250177554A1 (en) Modified antibody, antibody-conjugate and process for the preparation thereof
US20190225706A1 (en) Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
EP3057618B1 (en) Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
EP2935611B1 (en) Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
WO2022037665A1 (en) Site-specific antibody conjugates and the methods for preparation of the same