ES2267285T3 - Alfa 2,8/2.,9-polisialiltranferasa. - Google Patents
Alfa 2,8/2.,9-polisialiltranferasa. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2267285T3 ES2267285T3 ES99941028T ES99941028T ES2267285T3 ES 2267285 T3 ES2267285 T3 ES 2267285T3 ES 99941028 T ES99941028 T ES 99941028T ES 99941028 T ES99941028 T ES 99941028T ES 2267285 T3 ES2267285 T3 ES 2267285T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polysialyltransferase
- gene
- alpha
- coli
- neuac
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 22
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 47
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 36
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 abstract description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 29
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 23
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 22
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 20
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 19
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 13
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 9
- 238000001262 western blot Methods 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 6
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 abstract description 6
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 abstract description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract description 4
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 abstract description 4
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 abstract 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 29
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 101001121800 Neisseria meningitidis Polysialic acid O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 11
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 11
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 8
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 8
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 5
- TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N CMP-N-acetyl neuraminic acid Natural products O1C(C(O)C(O)CO)C(NC(=O)C)C(O)CC1(C(O)=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 4
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical class N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000617590 Escherichia coli K1 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005608 Neuronal Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010059604 Neuronal Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- -1 amyl carbonyl Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000007273 lactonization reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000004085 sialosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 108020002982 thioesterase Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 2-thiobarbituric acid Chemical compound O=C1CC(=O)NC(=S)N1 RVBUGGBMJDPOST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710187837 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase Proteins 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029945 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000001308 Fasciculation Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101150055501 K1 gene Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical group NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028293 Muscle contractions involuntary Diseases 0.000 description 1
- NYWZBRWKDRMPAS-GRRZBWEESA-N N-acetyl-9-O-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)COC(C)=O NYWZBRWKDRMPAS-GRRZBWEESA-N 0.000 description 1
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000005488 Thioesterase Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010064886 beta-D-galactoside alpha 2-6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006267 polysialylation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Bipolar Transistors (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
- Shaping Of Tube Ends By Bending Or Straightening (AREA)
Abstract
Plásmido de DNA que contiene el gen neuS de escherichia coli K92 y que codifica 2, 8/2, 9- polisialiltransferasa que tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo N-terminal de escherichia
Description
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa.
La invención se refiere a
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa y a métodos
para producir y usar
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa
recombinante.
Los ácidos
9-carbono-5-amino-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulo-sónicos
o ácidos siálicos comprenden una familia de derivados de ácido
neuramínico que están ampliamente extendidos en la naturaleza,
variando de origen bacteriano a humano. Este resto de azúcar
conectado a cadenas de carbohidrato de glicolípidos y glicoproteínas
representa un papel clave en muchos episodios biológicos
importantes mediados por interacciones
carbohidrato-proteína (Schauer, R. y otros (1995)
Biology of the Sialic Acids, pp 7-67, Plenum
Press, Nueva York., Rosenberg, A. ed). Los ácidos siálicos también
se encuentran en homopolímeros lineales (poliSia) de ácido
N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido
N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) ligados por enlaces
\alpha2,8-, \alpha2,9- o
\alpha2,8/\alpha2,9-cetosídicos (Troy, F. A.
(1992) Glycobiology 2, 5-23). El grado
de polimerización puede extenderse más allá de 200 residuos de ácido
siálico (Rohr, T.E. y otros (1980) J. Biol. Chem.,
255, 2332-2342), constituyendo de ese modo
un grupo estructuralmente único de polímeros de carbohidrato que
modifican covalentemente glicoconjugados de la superficie celular
(Troy, F.A. (1990) Trends Glycosci. Glycotechnol. 2,
430-449). La polisialilación de las moléculas de
adhesión de células neuronales (NCAM) de mamífero, por ejemplo,
afecta a interacciones adhesivas célula-célula
durante la embriogénesis, incluyendo fasciculación de neuritas e
interacciones neuromusculares (Edelman, G.M. (1985) Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 877-889 y
Cunningham, B.A. y otros (1987) Science 236:
799-806). Aunque la bacteria neuroinvasiva
Escherichia coli K1 contiene un homopolímero de
(-8-NeuAc\alpha2-) (Troy, F.A. y otros (1979)
J. Biol. Chem. 254, 7377-7387), el
Grupo C de Neisseria meningitidis (Liu, T.Y. y otros (1971)
J. Biol. Chem. 246: 4703-4712 y Vann,
W.F. y otros (1978) J. Bacteriol. 133,
1300-1306) presenta un homopolímero de enlaces
(-9-NeuAc\alpha2-). Por otra parte, los antígenos
capsulares de poliSia de E. coli K92 neuroinvasiva están
compuestos por residuos de poli(-8NeuAc\alpha2,9NeuAc\alpha2-)
(Egan, W. y otros (1977) Biochemistry, 16,
3687-3692). Enlaces alternativos de
\alpha2,8NeuAc- y \alpha2,9NeuAc- no podrían encontrarse en
sistemas de mamífero y por lo tanto podrían utilizarse para provocar
una respuesta inmunológica. De hecho, el heteropolímero procedente
de la cepa K92 de E. coli se está empleando como una vacuna
de carbohidrato en los experimentos clínicos de pacientes que sufren
meningitis aguda (Devi, S.J. y otros (1991) Proc Natl Acad
Sci USA, 88, 7175-9).
Las sialiltransferasas que catalizan la adición
de ácido siálico para formar tales diversas moléculas de
reconocimiento de carbohidratos están dentro de al menos dos
familias. Mientras que se han obtenido 13 clones de sistemas de
mamífero (Tsuji, S. y otros (1996) Glycobiology 6,
v-vii), solo se han clonado hasta la fecha 4 de
sistemas bacterianos (Vimr, E.R. y otros (1992) J. Bacteriol
174, 5127-5131; Gilbert, M. y otros (1997)
Eur. J. Biochem. 249: 187-194 y
Yamamoto T. y otros (1998) J. Biochem (Tokyo) 123,
94-100). La clonación reciente de
sialiltransferasas tanto de mamífero como bacterianas mostraba que
estas dos familias de genes surgían de forma diferente. La
polisialiltransferasa (poliST) codificada por neuS en E.
coli usa ácido CMP-siálico como un donante y
cataliza una adición secuencial de ácido siálico al extremo no
reductor de un aceptor (Kundig, F.D. y otros (1971) J. Biol
Chem. 246: 2543-2550 y Steenbergen, S.M.
y otros (1990) Molecular Microbiology 4:
603-611). En un estudio detallado que usa la cepa
patógena de E. coli K1, se ha clonado el gen que codifica
para
CMP-Neu5Ac:poli-\alpha2,8-sialosil
sialiltransferasa, denominado neuS. Se encontró que este gen
estaba aglomerado en la región kps que está implicada en la
iniciación, la polimerización y posiblemente la traslocación de
cadenas de poliSia a través de la membrana interna (Weisgerber, C. y
otros (1991) Glycobiology 1, 357-365;
Weisgerber, C. y otros (1990) J. Biol. Chem. 265,
1578-1587 y Steenbergen, S.M. y otros (1991)
Glycoconjugate J. 8, 145). Un gen similar se ha
identificado mediante hibridación a la cepa K92 de E. coli,
cuya cápsula contiene poli (-8NeuAc\alpha2,9NeuAc\alpha2-)
(ibid, Egan, W. y otros 1977). La secuencia de nucleótidos
completa de este gen neuS de K92 mostraba que este producto génico
difiere en 70 aminoácidos del producto génico neuS de K1
(ibid, Vimr, E.R. 1992). Aunque un estudio in vitro
indicaba que el neuS de E. coli K1 que codifica para una
proteína de 47 kb tiene actividad de polisialiltransferasa, no se
había demostrado claramente hasta ahora tal actividad para el
producto neuS de E. coli K92.
Se describe aquí la clonación del gen neuS de la
cepa K92 de E. coli mediante PCR usando los cebadores
descritos previamente (ibid, Vimr, E.R. y otros 1992), se
expresó el gen en E. coli y se observó que la enzima
procedente de este gen cataliza la síntesis de ácidos polisiálicos
con enlaces tanto \alpha2,8 como \alpha2,9 in vitro e
in vivo.
Un aspecto de la invención se dirige a plásmido
de DNA que contiene el gen neuS de escherichia coli K92 y que
codifica \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa a
partir de escherichia coli K92, teniendo la
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa una etiqueta
de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal.
Otro aspecto de la invención se dirige a una
célula transformada que tiene un gen que codifica
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una
etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal de escherichia coli K92, siendo el
gen según se indica en el párrafo precedente.
Otro aspecto de la invención se dirige a un
procedimiento para obtener
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una
etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal. En la primera etapa del procedimiento,
una célula transformada que tiene un gen para
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una
etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal expresa tal gen. La
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa expresada que
tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal se libera a continuación de la célula.
La \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa puede ser
de escherichia coli K92.
Otro aspecto de la invención se dirige a
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa recombinante
que no está unida a una membrana celular y que tiene una etiqueta
de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal. En una modalidad preferida, la
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa es de
escherichia coli K92.
Otro aspecto de la invención se dirige a un
procedimiento para convertir un substrato de
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa en un
producto. En este procedimiento, el substrato se pone en contacto
con \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que
tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal y que no está unida a una membrana
celular bajo condiciones que promueven la catálisis enzimática de
una conversión del substrato en el producto. En un modo preferido,
la \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa es de
escherichia coli K92.
La Figura 1 ilustra la construcción del vector
de expresión para la expresión de neuS de K92 como una proteína de
fusión. El fragmento de PCR de 91,2 kb obtenido para la forma de
longitud completa de gen neuS de K92 usando su DNA genómico como
plantilla se subclonó en el vector pRSET (Novagen, Madison, WI)
usando dos sitios de restricción únicos Bam HI y Eco RI. Esto daba
como resultado la expresión de la proteína con una etiqueta de
histidina hexámera fusionada en su extremo
N-terminal. El vector proporciona el codón de parada
seguido por la secuencia para la histidina hexámera. La forma de
longitud completa de la proteína permanece principalmente como
forma unida a la membrana. Sin embargo, aproximadamente
30-40% de la proteína se "libera" en el Sobr.
de 40K durante el tratamiento con un detergente. Esta proteína
liberada retiene la actividad catalítica completa y se usó en este
estudio.
La Figura 2 ilustra una gráfica de hidrofilia y
la estructura secundaria predicha para la
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa. La gráfica
de hidrofilia de la forma de longitud completa del producto génico
neuS de K92 sugiere la presencia de dos señales de retención de la
membrana predichas en el medio del polipéptido. La presencia de esta
proteína (forma de longitud completa tanto natural como
recombinante) como forma unida a la membrana también apoya este
modelo. Se describe que aproximadamente 30-40% de la
proteína se "libera" en el Sobr. de 40K usando un detergente
adecuado. Esta proteína liberada retiene la actividad catalítica
completa y se usó en este estudio. La gráfica de hidrofilia se
comparó con la de ST6Gal 1 de mamífero (Weinstein y otros, 1987)
como un representante. Se predice que esta enzima solo contiene un
dominio de traspaso de membrana.
La Figura 3 ilustra un análisis de transferencia
Western de la proteína expresada por neuS de K92. Células de E.
coli de BL21(DE3) transformadas con el gen neuS de
K92 en el vector de expresión pRSET se indujeron con IPTG
(concentración final 1 mM) y se recogieron después de 4 horas. Las
células transformadas con el vector pRSET solamente también se
hicieron crecer y se usaron como control negativo. Como un control
positivo, BL21(DE3) previamente transformadas con el gen de
tioesterasa etiquetado con histidina (40) subclonado en pET20B(+) se
hicieron crecer, se indujeron y se recogieron de forma similar.
Después de la recogida, las células se sometieron a lisis y los
sobrenadantes se recogieron después de la centrifugación a 15.000
rpm (Sobr. de 15K). Las proteínas se desplazaron usando un SDS al
12%-PAGE según se menciona en los "Materiales y Métodos". Las
muestras eran: Sobr. de 15K del control negativo (carril 1), Sobr.
de 15K de las células transformadas con gen neuS de K92
(carril 2) y Sobr. de 15 K del control positivo (carril 3). La
transferencia se reveló usando anticuerpo anti-(His)_{5}
(Qiagen) y estuche de substrato de DAB potenciado con metal
(Pierce). La \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa
expresada por neuS migraba en el gel a aproximadamente 47,5 kd. En
el carril 3, el control positivo para la transferencia Western
mostraba una banda a \sim23 kd para la tioesterasa. Puede
apuntarse que el nivel de expresión para el gen neuS era
comparativamente inferior que el gen de tiotransferasa.
La Figura 4 ilustra un análisis de los productos
de reacción enzimática mediante cromatografía en capa fina (TLC).
El Sobr. de 40K se usó como una fuente de la enzima en la mezcla de
reacción que contenía aceptor 1 mM y
CMP[^{14}]NeuAc (9 nmol; 1 Ci) como donante en un
tampón de reacción que contenía Tris-HCl 25 mM (pH
8,0), MgCl_{2} 5 mM, DTT 5 mM y Triton CF-54 al
0,5%. Como un ejemplo, se observó el análisis con la mezcla de
reacción que contenía ácido siálico y GM_{3} como aceptores y
CMP[^{14}]NeuAc como substrato donante. Como un
control negativo, la mezcla de reacción contenía ácido siálico como
aceptor sin la adición de ninguna enzima. Para A y B, se usaron
placas de TLC de gel de sílice 60 para las muestras: mezcla de
reacción sin la enzima (carril 1), GM_{3} como aceptor (carril 2),
ácido siálico como aceptor (carril 3) y mezcla de reacción sin ácido
siálico exógeno (carril 4). Los disolventes usados eran: (A)
n-propanol:NH_{4}OH 1M:agua: 7:1:2; (B)
cloroformo:metanol:CaCl_{2} al 0,02%: 45:55:10. Las mezclas de
reacción también se analizaron mediante TLC en
DEAE-celulosa. Después de que la reacción fuera
completa, una parte de la muestra se acidificó con ácido acético al
10% y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para C,
se usó placa de TLC de DEAE-celulosa. Las muestras
eran: mezcla de reacción con ácido siálico como aceptor (carril 1) y
después de la acidificación (carril 2); mezcla de reacción sin
enzima (carril 3) y después de la acidificación (carril 4); usando
GM_{3} como aceptor (carril 5) y después de la acidificación
(carril 6); mezcla de reacción sin aceptor exógeno (carril 7) y
después de la acidificación (carril 8). Los disolventes en C usados
eran: n-propanol:NH_{4}OH 14,5 M:agua: 6:1:3. Las
placas se secaron después del recorrido y se expusieron a una
película XAR-5 de Kodak. La marca de la flecha
indica la posición del producto o los productos de reacción libres
de células potenciales. También se mostraba la posición de
CMP-NeuAC y ácido siálico libre. Se encontró que
tanto la enzima como sus productos de reacción son inestables y se
degradan a lo largo del tiempo.
La Figura 5 ilustra una estructura de producto
de reacción libre de células. El producto obtenido mediante la
reacción libre de células usando proteína de neuS de K92
indicaba la estructura de un ácido siálico pentámero con enlaces
\alpha2,9/2,8 alternos (I). También se muestra la forma lactónica
principal propuesta (II) obtenida en la reacción enzimática.
Las abreviaturas usadas aquí: NeuAc, ácido
neuramínico; PCR, reacción en cadena de la polimerasa;
CMP-NeuAc, ácido CMP-neuramínico o
ácido CMP-siálico; nt, nucleótido(s); TLC,
cromatografía en capa fina.
El DNA genómico aislado de la cepa K92 de
Escherichia coli (ATCC 35860) usando un estuche de extracción
de DNA (Qiagen Co., Valencia, CA) se usó para la amplificación del
gen neuS mediante PCR. Esto se realizó en una mezcla de
reacción de 100 ml que contenía 100 mg de DNA genómico como
plantilla, 300 nmoles de cebadores, 200 mM de dNTPs, KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 2 mM, gelatina
al 0,01%, Triton X-100 al 0,1% y una mezcla tanto
de DNA polimerasa de Taq como de DNA polimerasa de pfu
(1 unidad de cada una). Dos cebadores, el cebador directo con el
sitio Bam H1 interno (subrayado)
[5'ATATTGGATCCATATTTGATGCTAGTT TA 3'; nt.
3-20] y un cebador inverso con el sitio Eco
R^{1}, ((5'GGCGCGAATTCTTACTC CCCCAAGAAAA 3'; nt.
1230-1214), diseñados basándose en la secuencia
previamente publicada (ibid, Vimr, E.R. 1992), se usaron
para la PCR usando las siguientes condiciones: 94ºC, 1 minuto; 50ºC,
1 minuto y 72ºC, 2 minutos durante 35 ciclos. El análisis en gel de
agarosa del producto mostraba la presencia de una banda principal
con el tamaño esperado de aproximadamente 1,2 kb. El fragmento
obtenido se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa, se
digirió con Bam HI y Eco RI y se subclonó en un vector
pRSET digerido de forma similar (Invitrogen Co., San Diego, CA)
siguiendo técnicas de biología molecular estándar (Sambrook, J. y
otros (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.). La mezcla
de ligación se usó a continuación para la transformación de células
competentes de la cepa BL21(DE3) de E. coli (Novagen,
Madison, WI). El clon que contenía el vector de expresión se
confirmó mediante secuenciación de ambas hebras usando un
secuenciador de DNA automatizado (ABI 377) en las instalaciones de
TSRI Core.
Puesto que la cepa DH5\alpha de E. coli
que carece del aglomerado génico kps no tiene actividad de
sialiltransferasa (ibid, Steenbergen, S.M. 1990), se usó
inicialmente para expresar el gen. Esta cepa tiene un gen formador
de vellosidades en su cromosoma y por lo tanto no requiere ninguna
presión para la expresión de sus vellosidades sexuales. El fago M13
que contiene el gen de RNA polimerasa de T7 (Invitrogen) se usó
para infectar DH5\alphaF' transformadas con el vector pRSET que
contiene el gen de neuS clonado. Las células transformadas
se hicieron crecer en medio LB (con MgCl_{2} 1 mM) que contenía
100 \mug de carbicilina/ml a 37ºC a D.O._{600} \sim0,3 y a
continuación se añadió IPTG 1 mM. Después de una hora de incubación,
el fago M13/T7 se añadió para infectar las células según se
describe por el suministrador (Invitrogen) y se recogió después de
5 horas de incubación. Un ensayo de actividad enzimática y
SDS-PAGE del lisado celular (sobrenadante de 15K)
mostraban la expresión del gen neuS en DH5\alphaF'. Una
banda que migra como \sim47,5 kd en la SDS al 12%-PAGE aparecía
en una hora de incubación después de la infección con gen de RNA
polimerasa de T7 que contenía M13 en presencia de IPTG (según se
juzgaba por transferencia Western). La intensidad relativa de la
banda de 47,5 kd se incrementaba con el tiempo y alcanzaba un máximo
después de 4 horas. El ensayo enzimático del extracto libre de
células usando ácido siálico como aceptor también indicaba la
expresión de la polisialiltransferasa de K92. Sin embargo, las
células DHSaF' transformadas con vector pRSET también daban una
banda que comigraba con la banda de 47,5 kd en
SDS-PAGE. Un intento de separar estas bandas usando
agarosa Ni^{2+}-NTA resultaba ser difícil. Por
lo tanto, se decidió expresar esta proteína en la cepa
HMS174(DE3) Lys o BL21(DE3) de E. coli
(Invitrogen).
Las células BL21 transformadas (DE3) que
contenían el gen neuS de la cepa K92 de E. coli se hicieron
crecer exponencialmente en medio LB (con MgCl_{2} 1 mM) que
contenía 100 \mug de carbicilina/ml a 37ºC hasta que se alcanzaba
A600 \sim0,3. La expresión del gen neuS se alcanzaba a 37ºC
mediante la inducción con IPTG según se describe en el estuche de
expresión (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se recogieron
después de 5 horas de incubación.
Un plásmido de DNA denominado BL21/DE3
(8,9-PST) que contenía el gen neuS de K92, obtenido
anteriormente, se originó de la cepa K92 de escherichia coli
mediante PCR para clonar la
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa. El DNA se
subclonó en el vector pRSET (Invitrogen) y el DNA plasmídico
resultante (8,9-PST) se transformó en escherichia
coli GL21(DE3).
Este análisis se realizó siguiendo una técnica
estándar (Harlow, E. y otros (1988) Antibodies, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.). Las muestras de proteína se
hirvieron durante 8-10 minutos en 1 x tampón de
muestra de gel de Laemmli en ausencia o presencia de mercaptoetanol
al 10%. La electroforesis se realizó usando SDS al 10%-gel de
poliacrilamida en tampón de Tris/glicina-SDS.
Después de que las proteínas se transfirieran a una membrana de
nitrocelulosa, la transferencia se bloqueó con un tampón de bloqueo
(transferido en TBS y Tween-20 al 0,1%) y se reveló
mediante adsorción con el anticuerpo monoclonal anti-(His)g
de ratón (Qiagen, Valencia, CA) diluido (1:500) con el tampón de
bloqueo. La transferencia se incubó con anticuerpo secundario
anti-ratón de oveja conjugado a peroxidasa de rábano
picante (1:1000; Amersham Corp.). Las bandas proteínicas se
visualizaron mediante quimioluminiscencia según se sugiere mediante
el suministrador de los reaccionantes (Amersham Corporation) o
tiñendo con el immunoPure Metal Enhanced DAB Substrate Kit (Pierce,
Rockford, IL).
El ensayo se llevó a cabo esencialmente como se
describe por Vimr y otros (Steenbergen, S.M. y otros (1992) J.
Bacteriol. 174: 1099-1108) con las siguientes
modificaciones: después de recoger, las células se lavaron tres
veces con Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) y a continuación
se resuspendieron en Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) que
contenía MgCl_{2} 5 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM y 1 \mul/ml de
cóctel inhibidor de proteasa (Sigma). Las células se sometieron a
lisis tres veces usando una French Press (AMINCO; 1, 35,2
kg/cm^{2} (500 psi)). El residuo celular se retiró mediante
centrifugación dos veces a 15.000 rpm y el sobrenadante se recogió
(denominado Sobr. de 15K). Este sobrenadante se centrifugó de nuevo
a 100.000 x g (\sim40 K rpm) usando una ultracentrífuga Beckman
(Modelo L5-50). Tanto el sobrenadante (denominado el
Sobr. de 40K) como el nódulo se conservaron. El nódulo se suspendió
en un tampón que contenía Tris-HCl 25 mM, MgCl_{2}
5 mM, DTT 5 mM y Triton CF-54 al 0,1%. Los
sobrenadantes y el nódulo se almacenaron sobre hielo y se usaron
para el ensayo en menos de 2 horas.
Sin la adición de aceptor, se determinó la
actividad enzimática endógena. La actividad exógena se detectó a
continuación mediante la adición de ácido siálico como aceptor y
CMP[^{14}C]NeuAc como donante en un tampón de
reacción que contenía Tris-HCl 25 mM (pH 8,0),
MgCl_{2} 5 mM, DTT 5 mM y Triton CF-54 al 0,5%.
También se usaron otros substratos, incluyendo ácido colomínico.
Los ensayos de actividad enzimática tanto endógena como exógena
miden la transferencia de NeuAc marcado con ^{14}C al aceptor. Los
substratos radiomarcados sin reaccionar se separaron mediante TLC
en DEAE-celulosa
(n-propanol/NH_{4}OH 14M/H_{2}O: 6:1:3) o
mediante cromatografía en columna Sephadex G-25. La
radiactividad restante en el origen y/o en la parte superior de la
placa de TLC o el producto obtenido en el volumen de huecos de la
columna Sephadex G-25 se cuantificó mediante
espectrometría de centelleo de líquidos. Para el análisis usando
cromatografía en columna Sephadex G-25, se preparó
una columna (1 cm x 3,5 cm) de Sephadex G-25
(Pharmacia) en agua. La mezcla de reacción libre de células
radiomarcada (60 \mul) se cargó y se lavó con 1,5 ml de agua, que
se recogieron y se contaron. En algunos experimentos, la actividad
se determinó separando el CMP[^{14}]NeuAc no usado
mediante cromatografía en columna de Dowex 1X8 (forma fosfatada)
(Williams, M.A. y otros (1995) Glycoconj. J. 12:
755-761). Las velocidades iniciales se estimaron
gráficamente y la actividad se expresó como pmoles de ácido siálico
transferidos por hora.
Después de que la reacción libre de células
fuera completa, las proteínas se retiraron mediante un filtro
Amicon (PMCO 10K) y el sobrenadante que contenía productos de
reacción oligómeros se separó mediante cromatografía en capa fina
(TLC) en gel de sílice 60 (con soporte de aluminio) y/o
DEAE-celulosa (con soporte de plástico) usando los
siguientes sistemas disolventes: (a) n-propanol,
NH_{4}OH 14 M, H_{2}O: 6:1:3; (b) cloroformo:metanol:CaCl_{2}
al 0,02%: 30:55:15. Los cromatogramas de control se calibraron con
oligómeros de mono- a hexa-sialosilo (Calbiochem,
San Diego, CA) que se detectaron mediante aerosol de orcinol, según
se describe por Corfield y Schauer (Sialic Acids: Chemistry,
Metabolism, and Function. (Schauer, R., ed) Cell Biology
Monograph, Vol 10, pp. 77-94,
Springer-Verlag, Nueva York, 1982). Este método
resolvía ácidos siálicos de monómeros a octámeros. Los oligómeros
compuestos por nueve o más residuos de sialosilo se retenían en el
origen. Los cromatogramas marcados se pulverizaron con En^{3}Hance
(New England Nuclear) y se sometieron a fluorografía contra una
pantalla intensificadora. Después de la fluorografía, los
oligómeros de sialosilo se detectaron en placas de TLC de gel de
sílice 60 mediante aerosol de orcinol para el alineamiento de
señales radiactivas con bandas detectadas colorimétricamente. Para
el análisis usando TLC en DEAE-celulosa, la posición
del producto o los productos de reacción marcados con ^{14}C
libres de células se marcó después del alineamiento de las señales
radiactivas, se cortaron y se contaron.
Cepas de Escherichia coli transformadas
solamente con vector o con el gen neuS de K92 se usaron para
la extracción de polisacárido siguiendo el método de Kasper y otros
(Kasper, D.L. y otros (1973) J. Immunol. 110,
262-268) con las siguientes modificaciones. Para el
polisacárido de K92, la cepa K92 de E. coli se hizo crecer
en 2 l de medio mínimo complementario de Davis (formulación de medio
ATCC Nº 54) a 37ºC durante la noche. La cepa K1 de E. coli
transformada con el gen neuS de K92 se hizo crecer en 2 l de
medio mínimo complementario de Davis que contenía 2% de glicerol en
lugar de glucosa. Las células se hicieron crecer hasta D.O._{600}
\sim0,3 y se añadió IPTG 1 mM (concentración final). Después de la
incubación a 37ºC durante 1 hora, se añadieron fagos M13/T7
(Invitrogen; 10 pfu/célula) y se incubaron a 37ºC. Después del
crecimiento nocturno los organismos se retiraron mediante
centrifugación (48.000 x g durante 30 minutos a 4ºC) y el
sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro Millipore
de 0,45 \mu. Se añadió bromuro de hexadeciltrimetilamonio
(Cetavlon; 0,3%; Sigma) al sobrenadante con agitación y el
precipitado formado se recogió mediante centrifugación. El
precipitado se solubilizó en CaCl_{2} 0,9 M y se reprecipitó con
tres volúmenes de etanol absoluto frío (-20ºC). La precipitación
con etanol de CaCl_{2} 0,9 M se repitió tres veces. El producto
final se dializó contra agua y se liofilizó. La purificación final
se realizó usando una columna (2 cm x 25 cm) de Biogel P2
(Pharmacia) eluida con agua siguiendo el procedimiento habitual, y
se verificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida
siguiendo el método de Troy y McCloskey (ibid, 1979). Después
de la hidrólisis mediante ácido sulfúrico (H_{2}SO_{4} 0,1 N,
80ºC), la cuantificación de ácido siálico se determinó mediante el
procedimiento de ácido tiobarbitúrico según se describe previamente
(Liu, J. y otros (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:
3901-3910).
Este se realizó usando reactivo de ácido
bicincónico (BCA) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el
suministrador (Pierce Chemical Co.).
Se realizaron experimentos de espectrometría de
masas con ionización por electropulverización
(ES-MS) en un espectrómetro de masas cuadrupolar
triple API III Perkin Elmer SCIEX. Las muestras de
electropulverización se introdujeron típicamente en el analizador
de masas a una velocidad de 4,0 ml/minuto. Los iones positivos y
negativos, generados mediante evaporación de gotículas cargadas,
entran en el analizador a través de una placa interfacial y un
orificio de 100 mm, mientras que el potencial de desaglomeración se
mantiene entre 50-200 V para controlar la energía
de colisión de los iones que entran en el analizador de masas. El
voltaje del emisor se mantiene típicamente a 5000 V. La m/z
se determinó para los picos principales.
Se registraron espectros de resonancia magnética
nuclear de ^{13}C alrededor de 23ºC en un espectrómetro
AMX-400 o DRX-600 de Bruker que
funcionaba en el modo de transformación de Fourier pulsatorio usando
desacoplamiento del ruido de protones de banda ancha. Los
polisacáridos se trasladaron como soluciones en óxido de deuterio a
pH 7,0. El disolvente, D_{2}O, servía como una señal de cierre
interna. A menudo se usó DMSO como referencia interna. Se encontró
que el espectro de ^{13}C de polisacáridos de K1 y K92 determinado
en este estudio era idéntico al presentado por Egan y otros
(ibid, Egan, W., 1977). La resonancia de NHCO (carbonilo de
amida) del polisacárido K1 de los estudios presentes y de Egan se
tomó para tener el mismo desplazamiento químico y todas las señales
restantes referidas de acuerdo con esto.
Previamente, se clonó el gen neuS de la
cepa K1 de E. coli y se encontró que tenía la actividad de
\alpha2,8-polisialiltransferasa. Usando el gen
neuS de K1 como una sonda, Vimr y otros clonaron un gen de
1230 pb (ibid, Vimr, E.R., 1992) de la cepa K92 de E.
coli que tenía 87,3% de homología con el gen de K1. La
secuencia proteínica deducida de este gen indicaba el mismo número
de aminoácidos (total 409 aa) con 83% de homología con la de K1 a
nivel proteínico. Estudios estructurales previos sobre el antígeno
de polisacárido de esta cepa K92 de E. coli
(Bos-12) sugería la presencia de ácido polisiálico
con enlaces \alpha-2,8 y
\alpha-2,9 alternos (ibid, Egan, W., 1977).
Por lo tanto, se supone que el producto génico de la cepa K92
confiere actividad de polisialiltransferasa (14, 13). Sin embargo,
la expresión del gen neuS de K92 no se demostró claramente,
ni tampoco se mostró formar un polímero de ácido siálico in
vitro con enlaces \alpha2,8/2,9 alternos.
Para caracterizar el producto del gen
neuS de K92, se ha clonado este gen a partir de la cepa K92
de E. coli usando un enfoque basado en PCR. Los cebadores se
diseñaron basándose en la secuencia previamente publicada
(ibid, Vimr, E.R., 1992) y se usaron para amplificar el clon
de longitud completa del gen neuS a partir del DNA genómico
de la cepa K92. El fragmento de 1,23 kb obtenido mediante PCR se
subclonó en pRSET (Invitrogen) para la expresión del producto del
gen neuS como una proteína de fusión con la etiqueta de
histidina hexámera fusionada en su extremo
N-terminal (Fig. 1). El clon se verificó mediante
secuenciación de doble hebra de todo el fragmento incluyendo los
sitios de restricción.
Una gráfica de la hidrofilia (Hopp, T.P. y otros
(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78,
3824-3828 y Kyte, J. y otros (1982) J. Mol.
Biol. 157,105-132) revelaba dos regiones
potenciales de cruce de la membrana en esta proteína de 409 residuos
de aminoácido. La primera está situada a 177 residuos desde el
extremo N. Consiste en 19 aminoácidos hidrófobos bordeados por tres
residuos de lisina aguas arriba. De forma interesante, este primer
dominio de transmembrana está bordeado en cada extremo por un
residuo de prolina. Se sabe que la prolina confiere restricciones
de conformación de muchas proteínas biológicamente importantes,
según se evidencia por estudios de mutagénesis dirigida al sitio
(ibid, Datta, A.K. 1998; para una revisión, véase Vanhoop,
G. y otros (1995) FASEB J. 9,
736-744). Un motivo KKKP similar, que se encontró
que estaba presente en el polipéptido ST6Gal I (para la
nomenclatura, véase la Ref. 12), es parte de una secuencia de
anclaje de señal propuesta (Weinstein, J. y otros (1987) J.
Biol. Chem., 262, 17735-17743). El
segundo dominio de transmembrana está situado a 327 residuos desde
el extremo N. Consiste en 17 residuos de aminoácido hidrófobos
bordeados por dos residuos de lisina aguas arriba y un residuo de
prolina en su extremo C. De forma notable, la lisina y la serina
están presentes predominantemente en este dominio. La presencia de
estos dos dominios de transmembrana sugiere que esta proteína está
unida a la membrana, según se apoya adicionalmente mediante la
transferencia Western (véase posteriormente). Esta característica
parece ser única entre las sialiltransferasas bacterianas clonadas,
cuya gráfica de hidrofilia sugiere la presencia de solo una región
potencial de cruce de membrana.
Para la expresión, se usó pRSET (Invitrogen), un
vector de expresión procariótico diseñado para obtener una etiqueta
de histidina hexámera fusionada en la secuencia
N-terminal de la proteína deseada. Debido a la falta
de cualquier anticuerpo disponible contra el producto del gen
neuS de K92, la polisialiltransferasa se expresó como una
proteína de fusión y se detectó mediante la transferencia Western
usando anticuerpo anti-(His)_{5} (Qiagen Inc., Valencia,
CA).
Electroforesis en SDS-gel de
poliacrilamida y transferencia Western: El extracto en bruto
libre de células (Sobr. de 15 K y Sobr. de 40 K) y el nódulo
celular, suspendidos en Tris-HCl 25 mM (pH 8,0) que
contenía MgCl_{2} 5 mM y Triton CF-54 al 0,1%,
obtenidos mediante ultracentrifugación se analizaron mediante
SDS-PAGE. La tinción con azul de Coomassie
mostraban la presencia de diversas bandas incluyendo una banda
principal a aproximadamente 47,5 kd, el tamaño esperado para el
producto del gen neuS. Esta banda estaba ausente en el
control (células transformadas con vector pRSET solamente). Se usó
un gel de réplica para transferir las proteínas a una membrana de
nitrocelulosa y se detectó usando anticuerpo monoclonal
ant-(His)_{5} de ratón (Qiagen, Valencia, CA). La
transferencia se reveló finalmente usando substratos de DAB
potenciados siguiendo el protocolo del suministrador (Pierce) o
mediante una técnica quimioluminiscente según se describe
previamente (Datta, A.K. y otros (1998) J. Biol. Chem.
273, 9608-9614). La transferencia Western
mostraba claramente la presencia de una sola banda a
aproximadamente 47,5 kd (Fig. 3). También se encontró que la
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa estaba
presente en el sobrenadante de 40K. El intento inicial de purificar
la proteína usando columna de agarosa Ni^{2+}NTA fallaba. Aunque
la proteína de fusión se une aparentemente a la agarosa
Ni^{2+}NTA, también se observó unión no específica con otras
proteínas celulares. Por lo tanto, el Sobr. de 40K se usó en este
estudio para el ensayo enzimático y el análisis de su producto o
productos.
El extracto en bruto libre de células (Sobr. de
15K), el sobrenadante de 40K (Sobr. de 40K) y el nódulo se usaron
para el ensayo de diversos substratos aceptores y CMP
[^{14}C]NeuAc como substrato donante. La actividad podía
seguirse en todas estas fracciones. Después de que la reacción
hubiera terminado, los productos se analizaron mediante TLC o
mediante cromatografía en columnas Sephadex G-25. La
Figura 4 muestra un análisis representativo. Usando ácido siálico
frío como aceptor y CMP[^{14}C]NeuAc como donante,
se detectó una mancha principal en TLC usando diversos sistemas
disolventes. De forma interesante, esta nueva mancha se comportaba
como material no polar en TLC de DEAE-celulosa
(Fig. 4C). Se encontró que el ácido siálico servía como un buen
aceptor, mientras que el ácido colomínico no (Tabla I). El ácido
9-O-acetilsiálico no era bien aceptado, indicando que la
polimerización probablemente comienza en la posición C9 del aceptor
de ácido siálico. De forma notable, los polisialósidos pentámeros y
hexámeros con enlaces \alpha2,8 no eran aceptados, mientras que el
dímero y trímero correspondientes (Calbiochem) servían como
aceptores pobres. Entre los glicolípidos probados, GD_{3} y
GQ_{1b} también servían como buenos aceptores. Sin embargo, otros
sialilgangliósidos probados eran substratos pobres (Tabla I).
Para la determinación estructural, se llevaron a
cabo reacciones libres de células, usando el sobrenadante de 40K
como la fuente de enzima, con ácido siálico y
CMP-NeuAc no marcado en una relación molar de 1:10
para obtener el producto o los productos de reacción en una
cantidad suficiente. Puesto que se sabía que el subproducto CMP
inhibe la reacción directa, se añadió fosfatasa alcalina para
retirar CMP para incrementar el rendimiento. Según se menciona
anteriormente, el producto se movía como un material no polar sobre
TLC en DEAE-celulosa, una característica utilizada
para la purificación del producto o los productos de reacción libres
de células. Después de que la reacción fuera completa, la mezcla de
reacción se hizo pasar a través de una columna de Dowex 1X8 (forma
fosfatada) para retirar CMP-NeuAc y ácido siálico
sin reaccionar. El análisis espectral de masas de iones negativos
(ES-MS) mostraba un pico principal en m/z
1419 para (M-3H_{2}O-H) y una
m/z 1401 para
(M-4-H_{2}O-H).
Este espectro era similar al de ácido
\alpha2,8-polisiálico obtenido comercialmente
(pentámero; Calbiochem). Aunque la muestra auténtica mostraba un
patrón de fragmentación que daba cuenta de los fragmentos tetrámero
(m/z en 1182 para
M-3H_{2}O-H), trímero (m/z
en 890 para M-3H_{2}O-H), dímero
(m/z en 599 para
M-3H_{2}O-H) y monómero
(m/z en 308 para
M-3H_{2}O-H), el patrón de
fragmentación para el producto de reacción era ligeramente
diferente, probablemente debido a la presencia de enlaces
\alpha2,8 y \alpha2,9 en el producto o los productos de
reacción libres de células. El grado de polimerización parece estar
limitado por la concentración de CMP-NeuAc. La
producción de un pentámero como el producto principal en la
reacción libre de células se debe probablemente a la limitación de
la concentración de CMP-NeuAc junto con el grado
limitado de polimerización. Incrementar la cantidad de
CMP-NeuAc en la reacción libre de células
incrementa en efecto la longitud de cadena del polímero de sialilo
según se juzga mediante espectrometría de masas. Aunque la
MALDI-MS (Core Facility, The Scripps Research
Institute) del pentámero disponible comercialmente (Calbiochem)
mostraba un pico para m/z a 1473, se obtenía un pico en
m/z 1474 con CMP-NeuAc 10 mM y una
m/z 3830 con CMP-NeuAc 20-30
mM.
La cepa K1 de E. coli que forma el
homopolímero de ácidos siálicos conectados por enlaces
\alpha-2,8 en su cápsula se transformó con el gen
neuS de K92. Esto se realizó para investigar si el producto
del gen neuS de K92 compite con la
\alpha2,8-polisialiltransferasa endógena con
respecto al mismo aceptor endógeno in vivo. El polisacárido
capsular de la K1 transformada se aisló y purificó mediante
cromatografía en columna Biogel P2 según se menciona en
"Materiales y Métodos". La ^{13}C-NRM de este
polisacárido en D_{2}O mostraba un espectro diferente del de los
ácidos polisiálicos derivados de K1 y K92. Los picos principales
para NCOCH_{3} y NCOCH_{3} eran similares tanto a los de
K1 como K92. Sin embargo, la señal para C-2 a
\delta 103,44 era comparativamente más débil. Esto puede deberse a
la naturaleza compleja del polisacárido procedente de células
transformadas. Por otra parte, los espectros de
^{13}C-NMR obtenidos para la K1 transformada eran
similares a los del polímero obtenido a partir de la cepa K92 de
E. coli, que también mostraban dos señales estrechamente
adyacentes en \delta 23,36 y 23,51. Se observó previamente que
esta cepa particular de E. coli contiene
heteropolisialiloligosacárido con enlaces \alpha2,8/2,9 alternos
(ibid, Egan, W., 1977). Esta complejidad también era evidente
en el espectro de ^{1}H-NMR que mostraba dos picos
a \delta 1,99 y \delta 1,96. Mientras está avanzando un estudio
estructural detallado, los datos preliminares indican que el
polisacárido aislado de la K1 transformada tiene enlaces tanto
\alpha2,8 como \alpha2,9 presentes en secuencias aleatorias.
Esto sugiere que no solo es el gen neuS de K92 funcional en
la cepa K1 de E. coli, sino también que su expresión
interrumpía el alargamiento de la cadena de polisialilo normal. Este
resultado se debe probablemente a la competición por el mismo
aceptor endógeno in vivo. Esto también sugiere que el aceptor
endógeno no es ni ácido siálico ni ácido colomínico, pero es común
para tanto las \alpha2,8 como las
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasas.
De forma interesante, el producto o los
productos de reacción enzimática libres de células parecen tender a
la formación de lactonas. El producto radiomarcado se traslada como
un sialósido no polar en la TLC en DEAE-celulosa y
también pasaba a través de una columna de Dowex 1X8 (forma
fosfatada). La formación de lactona parece depender de las
condiciones de preparación de la muestra y parece ser preferible a
pH inferior. Esta lactonización también se observó a pH 8,0,
presumiblemente debido a que el pH de la mezcla de reacción
disminuía durante la reacción. El análisis de masas por
electropulverización también sugería la formación de lactonas en el
producto o los productos de reacción libres de células. El pico para
m/z en 1401 está de acuerdo con la pérdida de cuatro
H_{2}O para formar 4 lactonas y el pico principal para m/z
a 1419 está de acuerdo con la formación de 3 lactonas a partir del
producto pentámero. La evidencia de apoyo adicional para la
presencia de lactonas son los picos de ^{13}C a \sim97 ppm que
también se observan en la lactona pentámera auténtica preparada a
partir de la hidrólisis parcial del polisacárido
de K92.
de K92.
Estos picos se desplazan hasta \sim103,5 ppm
cuando se realiza hidrólisis de lactona bajo condiciones básicas.
Basándose en la reciente observación de la lactonización
regioselectiva de ácido siálico oligómero conectado con enlaces
\alpha-2,8 (Cheng, M.C. y otros (1999) Angew.
Chem. Int. Ed. Engl., 38, 686-689 y
Zhang, Y. y otros (1999) J. Biol. Chem., 274,
6183-6189), el grupo carboxilo del ácido siálico del
extremo no reductor puede existir como una forma abierta.
Para el análisis espectral de masas del producto
de la reacción enzimática, la reacción libre de células se llevó a
cabo usando Sobr. de 40 K. La mezcla de reacción contenía ácido
siálico 1 mM y CMP-NeuAc 10 mM como donante en un
tampón de reacción que contenía Tris-HCl 25 mM (pH
8,0), MgCl_{2} 5 mM, DTT 5 mM, Triton CF-54 al
0,5%. Para conducir la reacción directa, el CMP liberado se retiró
mediante la adición de fosfatasa alcalina (1 U). Después de que la
reacción terminara, el material de reacción se hizo pasar a través
de un filtro Amicon (10 MWCO) y el filtrado se usó para el
análisis. El producto de reacción enzimática libre de células se
comportaba de manera similar al ácido siálico pentámero
(Calbiochem), durante la TLC, en varios sistemas disolventes. Los
espectros de masas se compararon con el de ácido siálico pentámero
disponible comercialmente. Espectro de masas de iones negativos
(ES-MS) de: (A) ácido polisiálico pentámero estándar
y (B) producto de reacción libre de células. Los picos principales
para m/z estaban marcados por una flecha y se describen en el
texto. El ion molecular (M-H^{+})^{-}
también se mostraba. También se observaron algunos productos
secundarios con masa (m/z) superior.
El análisis espectral de masas de los productos
de reacción enzimática se realizó con concentración creciente de
CMP-NeuAc. Las reacciones enzimáticas libres de
células se realizaron como anteriormente con ácido siálico 1 mM y
concentración creciente de CMP-NeuAc (10 mM, 15 mM,
20 mM y 30 mM). Después de que la reacción fuera completa, los
materiales se filtraron (Amicon; 10 MWCO) y el filtrado de cada tubo
de reacción se usó directamente para espectrometría de masas
(MALDI-MS). Los espectros eran: A, pentámero
estándar (Calbiochem), B, producto de reacción usando
CMP-NeuAc 10 mM y C, producto de reacción
usando CMP-NeuAc 20 mM. Los picos principales para
m/z se mostraron mediante una flecha y se describieron en el
texto. Se observó un espectro similar (a C) usando
CMP-NeuAc 30 mM.
El análisis por ^{13}C-NMR se
realizó sobre el polisacárido capsular. Los espectros se registraron
en un espectrómetro Brucker DRX-600. La escala es
en partes por millón y relativa al DMSO externo. Los espectros de
los polisacáridos capsulares purificados eran de K1 (A), K1
transformada con K92neuS (B) y K92 (C). La numeración de los
átomos de carbono se basa en los resultados previamente publicados
(ibid, Egan, W. 1977).
El análisis de ^{1}H-NMR se
realizó sobre el polisacárido capsular de K1 transformada con
K92/gen neuS. Los espectros se registraron en un
Brucker DRX-600 a temperatura ambiente. Solo se ha
mostrado la región para los grupos metilo de amida de los enlaces
\alpha2,8 y \alpha2,9 del polisacárido capsular purificado para
comparación. El aislamiento y la purificación de los polisacáridos
capsulares se mencionaban en Materiales y Métodos. Los
espectros de los polisacáridos capsulares eran de K1 (A), K92 (B) y
K1 transformada con K92/neuS (C). Aunque la muestra de K1 mostraba
solo un singlete en \delta 1,99, K92 mostraba dos picos en
\delta 2,00 y \delta 1,96. El espectro obtenido a partir de la
K1 transformada era ancho y complejo, especialmente en
\sim\delta 1,99.
\newpage
Se realizó el análisis por
^{13}C-NMR del producto de reacción enzimática.
Después de la reacción enzimática, la proteína se retiró mediante
filtración (Amicon; 10K). El producto de reacción enzimática se
separó de ácido siálico y CMP-NeuAc sin reaccionar
haciendo pasar a través de una columna de Dowex 1X8 (forma
PO_{4}^{-}) eluyendo con tampón de fosfato. El producto se
recogió en el volumen de huecos y se desaló haciendo pasar a través
de una pequeña columna de Sephadex G-50 eluyendo con
agua. El material deseado se recogió en el volumen de huecos, se
secó por congelación y se disolvió en D_{2}O para el análisis de
NMR. Los espectros se registraron en un espectrómetro Brucker
DRX-600 a temperatura ambiente (20ºC). La escala es
en partes por millón y relativa a DMSO externo. El espectro A,
ácido siálico pentámero conectado por enlaces
\alpha-2,8 disponible comercialmente, resulta de
acumulaciones de aproximadamente 25K. El espectro B, producto de
reacción libre de células parcialmente purificado, resulta de
acumulaciones de aproximadamente 40K.
Aunque el ácido siálico es ubicuo en eucariotas,
particularmente en mamíferos (ibid, Tsuji, S. 1996), no se
detecta en procariotas distintos de algunas bacterias patógenas.
Estas incluyen algunas cepas de Escherichia coli, algunas
cepas de Neisseria meningitidis y bacterias del serotipo O
que incluyen Salmonella (ibid, Barry, G.T. 1962 y 1965).
Aunque la presencia de actividad de polisialiltransferasa en E.
coli fue presentada previamente por Roseman y otros
(ibid, Kundig, F.D. 1971), la naturaleza del gen y su
producto no se ha demostrado claramente hasta hace poco. El gen
neuS clonado de K1 mostraba que su producto tiene tamaño
similar pero no homología de secuencia con ninguna de las
sialiltransferasas de mamífero. La expresión del gen neuS de
K1 indica que esta proteína de 47 kd sintetiza ácido polisiálico
in vitro (ibid, Weisgerber, C., 1991). Un gen similar
se clonó de la cepa K92 de E. coli, cuya cápsula se muestra
que contiene ácido heteropolisiálico
(-8NeuAc\alpha2,9NeuAc\alpha2-) (ibid, Egan, W., 1977).
Este producto génico difieren en 70 aminoácidos cuando se compara
con el producto génico neuS de la cepa K1 (ibid, Vimr,
E.R., 1992). De las substituciones de aminoácidos observadas, 36
eran conservativas. Sobre la base de tal homología, se postulaba que
el gen de K92 procedía de neuS de K1 (ibid, Vimr,
E.R., 1992). Mediante un ensayo de complementación, fue mostrado
por este grupo (ibid, Steenbergen, S.M., 1992) que el gen
neuS de K92 expresa actividad de polisialiltransferasa dando un
producto que fue reconocido por antisuero C de hombre in
vivo, sugiriendo que este gen podía producir sialósido con
enlaces de \alpha2,8/2,9 polisialilo alternos. Sin embargo, debido
a que el antisuero C de hombre interactúa tanto con ácido
homopolisiálico (-9-NeuAc\alpha2-) de Neisseria
meningitidis del Grupo C como con ácido heteropolisiálico
(-8NeuAc\alpha2,9NeuAc\alpha2-) de la cepa K92 de E. coli
(Barry, G.T. (1965) Bull. Soc. Chim. Biol. 47,
529-533.34), se garantizaba la identificación
estructural del producto o los productos de reacción libres de
células. Previamente, la expresión del gen neuS de K92 no se
había demostrado claramente, ni se había observado que este producto
génico catalizara la síntesis de ácido heteropolisiálico
(-8NeuAc\alpha2,9NeuAc\alphaa2-) in vitro.
La polisialiltransferasa (poliST) codificada por
neuS en E. coli usa ácido CMP-siálico
como un donante y cataliza la sialilación secuencial del extremo no
reductor de aceptores apropiados. Usando neuS de K1, la
actividad de polimerasa se detectó in vitro con
sialiloligómeros (denominados ácido colomínico) o con ciertos
gangliósidos, tales como GD_{3} (Weisgerber, C., 1991) como
substratos. Sin embargo, se observó previamente que este producto
génico no podía iniciar la síntesis de ácido polisiálico de
novo (ibid, Steenbergen, S.M., 1992), indicando un
requerimiento de un cebador in vivo hasta el momento no
definido. Este cebador, o iniciador de la polimerización, no parece
ser el ácido colomínico, ya que este polímero ni se alargaba
eficazmente in vitro (18) ni el producto clonado se
detectaba in vivo (Barry, G.T. y otros, (1962) J. Gen.
Microbiol. 29, 335-352). Usando
neuS de K92, se ha encontrado que el ácido colomínico no es
un aceptor. De hecho, entre los aceptores probados, solo el ácido
siálico y ciertos gangliósidos resultaban ser buenos aceptores.
En conclusión, se describe aquí que el producto
del gen neuS de E. coli K92 exhibe actividad de
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa tanto in
vitro como in vivo. Aparentemente, un solo polipéptido
(según se juzgaba por la transferencia Western) para esta
polisialiltransferasa cataliza la síntesis de ácido polisiálico
transfiriendo secuencialmente ácido siálico con enlaces \alpha2,9
y \alpha2,8 alternos. Previamente, se observó que
KDO-transferasa bacteriana posee tal doble
especificidad de enlace (Glode, M.P. y otros, (1977) J. Infect.
Diseases, 135, 94-102). Así, enzimas
capaces de formar múltiples enlaces diferentes pueden no ser raras
en la naturaleza. Aunque la enzima neuS de K92 unida a la membrana
aceptaba ácido neuramínico exógeno como el mejor substrato en este
estudio, puede preferir otros glicolípidos o glicoproteínas que
contienen ácido siálico. El trabajo está avanzando para definir la
especificidad de substrato de esta enzima y para determinar las
estructuras detalladas de los productos enzimáticos.
\newpage
La mezcla de reacción (60 \mul) contenía 1
\muM de cada uno de los siguientes aceptores y 9 nmol de
CMP[^{14}C]NeuAc (actividad específica: 8000
cpm/nmol) como substrato donante. Las reacciones se llevaron a cabo
a 37ºC durante 1 h usando 20 \mug de Sobr. de 40K según se
menciona en "Materiales y Métodos". La mezcla de reacción (1
\mul) se transfirió a manchas sobre una placa de TLC de
DEAE-celulosa con soporte de plástico y se hizo
avanzar en n-propanol:NH_{4}OH 14,5 M:agua: 6:1:3.
Después de secar al aire, la placa se expuso a película
XAR-5 de Kodak durante la noche a -70ºC. El área
correspondiente al producto de reacción se marcó, se cortó y a
continuación se contó en fluido de centelleo.
| Substratos aceptores | cmp obtenida | Ácido siálico total |
| potenciales probados | (por 60 \mul de reacción) | transferido (pmol) |
| Ácido siálico (5AcNeuAC) | ||
| \hskip0.5cm Monómero | 3780 | 470 |
| \hskip0.5cm Dímero | 1080 | 140 |
| \hskip0.5cm Trímero | 1560 | 140 |
| \hskip0.5cm Pentámero | 0 | 0 |
| \hskip0.5cm Hexámero | 0 | 0 |
| Ácido 9-O-acetilsiálico | 900 | 110 |
| Ácido colomínico | 0 | 0 |
| GD_{3} | 2880 | 360 |
| GM_{3} | 1440 | 180 |
| GD_{2} | 900 | 110 |
| GT_{1a} | 460 | 40 |
| GT_{1b} | 1140 | 130 |
| GQ_{1b} | 2460 | 310 |
| Mezclas de gangliósidos | 720 | 90 |
Claims (8)
1. Plásmido de DNA que contiene el gen neuS de
escherichia coli K92 y que codifica
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una
etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal de escherichia coli K92.
2. Una célula transformada que tiene un gen que
codifica \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que
tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal de escherichia coli K92, siendo
dicho gen como se especifica en la reivindicación 1.
3. Un procedimiento para obtener
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa, que comprende
las siguientes etapas:
- Etapa A:
- expresar un gen que codifica \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo N-terminal dentro de una célula transformada que tiene dicho gen para producir dicha \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa; y a continuación
- Etapa B:
- liberar \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo N-terminal y expresada en la Etapa A a partir de la célula.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa es de
escherichia coli K92.
5.
\alpha2,8/2,9-Polisialiltransferasa recombinante
que tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal, no estando dicha
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa unida a una
membrana celular.
6.
\alpha2,8/2,9-Polisialiltransferasa recombinante
que tiene una etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal de acuerdo con la reivindicación 5, en
donde la \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa es de
escherichia coli K92.
7. Un método para convertir un substrato de
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa en un
producto, comprendiendo dicho método la etapa de poner en contacto
el substrato con
\alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa que tiene una
etiqueta de histidina hexámera fusionada a su extremo
N-terminal que no está unida a una membrana celular
bajo condiciones que promueven la catálisis enzimática de una
conversión de un substrato en el producto.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que la \alpha2,8/2,9-polisialiltransferasa
es de escherichia coli K92.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9600398P | 1998-08-10 | 1998-08-10 | |
| US96003P | 1998-08-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2267285T3 true ES2267285T3 (es) | 2007-03-01 |
Family
ID=22254606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99941028T Expired - Lifetime ES2267285T3 (es) | 1998-08-10 | 1999-08-10 | Alfa 2,8/2.,9-polisialiltranferasa. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1105515B1 (es) |
| AT (1) | ATE331805T1 (es) |
| AU (1) | AU5475899A (es) |
| CA (1) | CA2339173A1 (es) |
| DE (1) | DE69932166T2 (es) |
| ES (1) | ES2267285T3 (es) |
| WO (1) | WO2000009736A1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002323358A1 (en) * | 2001-08-24 | 2003-03-10 | Karoliska Innovations Ab | Methods for preparing purified prostaglandin e synthase |
-
1999
- 1999-08-10 DE DE69932166T patent/DE69932166T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 AU AU54758/99A patent/AU5475899A/en not_active Abandoned
- 1999-08-10 ES ES99941028T patent/ES2267285T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-10 CA CA002339173A patent/CA2339173A1/en not_active Abandoned
- 1999-08-10 AT AT99941028T patent/ATE331805T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-08-10 WO PCT/US1999/018154 patent/WO2000009736A1/en not_active Ceased
- 1999-08-10 EP EP99941028A patent/EP1105515B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000009736A1 (en) | 2000-02-24 |
| CA2339173A1 (en) | 2000-02-24 |
| EP1105515B1 (en) | 2006-06-28 |
| DE69932166D1 (en) | 2006-08-10 |
| AU5475899A (en) | 2000-03-06 |
| EP1105515A1 (en) | 2001-06-13 |
| DE69932166T2 (de) | 2007-05-16 |
| ATE331805T1 (de) | 2006-07-15 |
| EP1105515A4 (en) | 2002-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9399765B2 (en) | Construction of new variants of dextransucrase DSR-S by genetic engineering | |
| US7608442B2 (en) | β1,3-galactosyltransferase polypeptides from the LOS locus of C. jejuni | |
| JP2005533525A (ja) | 細菌グリコシルトランスフェラーゼを用いたオリゴ糖、糖脂質、及び糖タンパク質の合成 | |
| JP2001503961A (ja) | 組換えα―２，３―シアリルトランスフェラーゼ及びそれらの使用 | |
| WO2009010251A2 (en) | Mutant dna polymerases and related methods | |
| US20030109693A1 (en) | Chondroitin polymerase and DNA encoding the same | |
| ES2267285T3 (es) | Alfa 2,8/2.,9-polisialiltranferasa. | |
| US11739305B2 (en) | Sialyltransferase variants having neosialidase activity | |
| CA2771672A1 (en) | Means and methods for producing artificial capsular polysaccharides of neisseria meningitidis | |
| Mattila et al. | The Centrally Acting β1, 6N-Acetylglucosaminyltransferase (GlcNAc to Gal): FUNCTIONAL EXPRESSION, PURIFICATION, AND ACCEPTOR SPECIFICITY OF A HUMAN ENZYME INVOLVED IN MIDCHAIN BRANCHING OF LINEAR POLY-N-ACETYLLACTOSAMINES | |
| KR101574952B1 (ko) | α-2,3 및 α-2,6 시알산 전이효소의 변이체 탐색 방법 및 시알릴올리고당 생산에의 응용 | |
| AU2004200191B2 (en) | Alpha2,8/2,9 polysialyltransferase | |
| Liang et al. | One-pot multienzyme-catalyzed assembly of pentasaccharide repeating units from Group B Streptococcus capsular polysaccharides and their related oligosaccharide derivatives | |
| JP2011505862A (ja) | 新規ラクトースホスホリラーゼ酵素 | |
| US20090087894A1 (en) | Method for improving enzymatic activity of glycosyltransferases | |
| US7381554B2 (en) | UDP-N-acetylglucosamine: galactose-β1,3-N-acetylgalactosamine-α-R/N-acetylglucosamine-β1,3-N-acetylgalactosamine-α-R (GlcNAc to GalNAc) β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase, C2/4GnT | |
| JP4629214B2 (ja) | Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素 | |
| Park et al. | A Mutagenic Study of β-1, 4-Galactosyltransferases from Neisseria meningitidis | |
| ES2365388T3 (es) | Condroitina-polimerasa y adn que la codifica. | |
| Warth | Large subunit of vaccinia cirus ribonucleotide reductase: affinity chromatography-based purification and photoaffinity labeling | |
| ES2359545A1 (es) | Fructufuranosidasa mejorada genéticamente para la obtención del prebiótico 6-kestosa. | |
| JP2005210923A (ja) | 糖転移酵素 |