ES2662015T3 - Purificación de polisacáridos capsulares bacterianos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento de purificación de un polisacárido capsular bacteriano, que comprende las etapas de (a) precipitación del polisacárido, (b) solubilización del polisacárido precipitado utilizando un alcohol, (c) tratamiento del polisacárido obtenido en la etapa (b) para eliminar contaminantes utilizando una o más etapas de filtración o ultrafiltración por tamaño, después, (d) precipitación del polisacárido obtenido en la etapa (c) mediante cationes de intercambio, en el que la etapa (a) utiliza uno o más detergentes catiónicos que tienen la siguiente fórmula general:**Fórmula** en la que: R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno significa alquilo o arilo; o R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que estos están unidos forman un anillo heterocíclico saturado de 5 o 6 miembros, y R3 significa alquilo o arilo; o R1, R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al que estos están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, insaturado en el átomo de nitrógeno, R4 significa alquilo o arilo, y X- significa un anión.

Description

imagen1
DESCRIPCIÓN
Purificación de polisacáridos capsulares bacterianos
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de las vacunas, particularmente contra infección y enfermedad por 5 meningococos.
Antecedentes de la técnica
Neisseria meningitidis es un patógeno humano Gram negativo. Coloniza la faringe, causando meningitis y ocasionalmente, septicemia en ausencia de meningitis. Está muy relacionado con N. gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia claramente el meningococo es la presencia de una cápsula polisacárida que está
10 presente en todos los meningococos patogénicos.
En base al polisacárido capsular del organismo, se han identificado doce serogrupos de N. meningitidis (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y y Z). El grupo A es el patógeno más habitualmente implicado en enfermedad epidémica en África subsahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la inmensa mayoría de casos en los Estados Unidos y en la mayoría de países desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables de los casos restantes
15 en Estados Unidos y países desarrollados.
Los polisacáridos capsulares de N. meningitidis se preparan típicamente por un procedimiento que comprende las etapas de precipitación del polisacárido (por ejemplo, usando un detergente catiónico), fraccionamiento con etanol, extracción con fenol frío (para retirar la proteína) y ultracentrifugación (para retirar LPS) [por ejemplo, ref. 1].
Se ha conocido durante muchos años [2, 3] una vacuna tetravalente de polisacáridos capsulares de los serogrupos
20 A, C, Y y W135 y ha obtenido licencia para uso humano. Aunque es eficaz en adolescentes y adultos, induce una mala respuesta inmunitaria y corta duración de protección y no puede usarse en bebés [por ejemplo, 4]. Esto se debe a que los polisacáridos son antígenos independientes de linfocito T que inducen una débil respuesta inmunitaria que no puede reforzarse. Los polisacáridos en esta vacuna no están conjugados y están presentes en una relación 1:1:1:1 [5]. MENCEVAX ACWY™ contiene 50 μg de cada polisacárido purificado una vez reconstituido
25 a partir de su forma liofilizada.
Los oligosacáridos conjugados de serogrupo C se han aprobado para uso humano [por ejemplo, Menjugate™; ref. 6]. Sigue existiendo, sin embargo, una necesidad de mejoras en vacunas conjugadas contra los serogrupos A, W135 e Y, y en su fabricación.
El documento EP 0 072 513 B1 describe un procedimiento para la preparación de polisacáridos capsulares
30 bacterianos antigénicos purificados, los productos obtenidos y su uso. Scott JE (1965) (Methods in Carbohydrate Chemistry, páginas 38-44) describe el fraccionamiento mediante precipitación con sales de amonio cuaternario. Scott JE (1961) (Methods of Biochemical Analysis vol. VIII, páginas 145-197) describe sales de amonio alifáticas en el ensayo de polisacáridos ácidos procedentes de tejidos.
Divulgación de la invención
35 La invención proporciona un procedimiento de purificación de un polisacárido capsular bacteriano, que comprende las etapas de (a) la precipitación del polisacárido, (b) la solubilización del polisacárido precipitado utilizando un alcohol, (c) el tratamiento del polisacárido obtenido en la etapa (b) para eliminar contaminantes utilizando una o más etapas de filtración o ultrafiltración por tamaño, después, (d) la precipitación del polisacárido obtenido en la etapa (c) mediante intercambio de cationes, en el que la etapa (a) utiliza uno o más detergentes catiónicos que tienen la
40 siguiente fórmula general:
imagen2
en la que: R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno significa alquilo o arilo; o R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico saturado de 5 o 6 miembros, y R3 significa alquilo o arilo; o R1, R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, insaturado en el átomo de nitrógeno,
R4 significa alquilo o arilo, y
X-significa un anión.
imagen3
Precipitación y solubilización en etanol
Se conocen en la técnica muchas técnicas para precipitar polisacáridos solubles. Los procedimientos preferentes usan uno o más detergentes catiónicos. Los detergentes preferentemente tienen la siguiente fórmula general:
imagen4
5 en la que: R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno significa alquilo o arilo; o R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico saturado de 5 o 6 miembros, y R3 significa alquilo o arilo; o R1, R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, insaturado en el átomo de nitrógeno, R4 significa alquilo o arilo, y
10 X-significa un anión.
Los detergentes particularmente preferidos para su uso en el procedimiento son sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo, las sales bromuro). El bromuro de cetiltrimetilamonio ('CTAB') es particularmente preferido [8]. CTAB también es conocido como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de cetrimonio, Cetavlon y Centimida. Otros detergentes incluyen bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio.
15 Los polisacáridos capsulares se liberan en el medio durante cultivo. Por consiguiente, el material de partida para la precipitación típicamente será el sobrenadante de un cultivo bacteriano centrifugado o será un cultivo concentrado.
La etapa de precipitación puede ser selectiva para los polisacáridos, pero típicamente también coprecipitará otros componentes (por ejemplo, proteínas, ácido nucleico, etc.).
El polisacárido precipitado puede recogerse por centrifugación antes de la solubilización.
20 Después de la precipitación, el polisacárido (típicamente en forma de un complejo con el detergente catiónico) se solubiliza. Se prefiere usar un disolvente que sea relativamente selectivo para el polisacárido, para minimizar los contaminantes (por ejemplo, proteínas, ácido nucleico, etc.). Se ha descubierto que el etanol es ventajoso a este respecto, y es muy selectivo para el complejo CTAB-polisacárido. Pueden usarse otros alcoholes inferiores (por ejemplo, metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles
25 etc.).
El etanol se añade preferentemente al polisacárido precipitado para dar una concentración final de etanol (basada en el contenido total de etanol y agua) entre el 50 % y el 95 % (por ejemplo, aproximadamente el 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o aproximadamente el 90 %), y preferentemente entre el 75 % y el 95 %. La concentración óptima final de etanol puede depender del serogrupo de la bacteria de la cual se obtiene el polisacárido.
30 El etanol puede añadirse al polisacárido precipitado en forma pura o puede añadirse en una forma diluida con un disolvente miscible (por ejemplo, agua). Mezclas preferidas de disolvente son mezclas de etanol:agua, con una relación preferida entre aproximadamente 70:30 y aproximadamente 95:50 (por ejemplo, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10).
En comparación con procedimientos convencionales para preparar polisacáridos capsulares, el procedimiento de dos etapas de precipitación seguido por extracción con etanol es más rápido y más simple.
35 En contraste con el procedimiento descrito en la ref. 9, el procedimiento usa detergente catiónico en lugar de detergente aniónico. A diferencia del procedimiento de la ref. 10, el polisacárido se resolubiliza usando etanol, en lugar de por intercambio catiónico usando sales de calcio o magnesio. A diferencia del procedimiento de la ref. 11, la precipitación no requiere un soporte poroso inerte. Además, a diferencia de los procedimientos de la técnica anterior, se usa alcohol para resolubilizar el polisacárido en lugar de precipitarlo.
40 El polisacárido capsular bacteriano habitualmente será de Neisseria. Preferentemente es de N. meningitidis, incluyendo los serogrupos A, B, C, W135 e Y. Los serogrupos preferidos son A, W135 e Y.
El procedimiento también es adecuado para preparar polisacárido capsular de Haemophilus influenzae (particularmente tipo B, o 'Hib') y de Streptococcus pneumoniae (neumococos).
Procesamiento adicional del polisacárido solubilizado
45 Después de la resolubilización, el polisacárido se puede tratar adicionalmente para retirar los contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones en que no es aceptable incluso una contaminación mínima (por ejemplo, para producción de vacunas humanas). Esto implicará típicamente una o más etapas de filtración.
imagen5
Puede usarse filtración en profundidad. Esto es particularmente útil para el aclarado.
Puede usarse filtración a través de carbono activado. Esto es útil para retirar pigmentos y compuestos orgánicos traza. Puede repetirse hasta, por ejemplo, DO275nm <0,2.
Puede usarse filtración por tamaño o ultrafiltración.
5 Una vez filtrado para retirar los contaminantes, el polisacárido puede precipitarse para tratamiento y/o procesamiento adicional. Esto puede conseguirse convenientemente por intercambio de cationes (por ejemplo, mediante la adición de sales de calcio o sodio).
El polisacárido puede modificarse químicamente. Por ejemplo, puede modificarse para remplazar uno o más grupos hidroxilo con grupos bloqueantes. Esto es particularmente útil para MenA [12]. Los polisacáridos del serogrupo B
10 pueden estar N-propionilados [13].
El polisacárido (opcionalmente modificado) típicamente se hidrolizará para formar oligosacáridos. Esto se realiza preferentemente para dar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacárido de menos de 30 (por ejemplo, entre 10 y 20, preferentemente de aproximadamente 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferentemente de aproximadamente 15-20; etc.). Se prefieren oligosacáridos a
15 polisacáridos para su uso en vacunas. El DP puede medirse convenientemente por cromatografía de intercambio iónico o por ensayo de colorimetría [14].
Si se realiza hidrólisis, al hidrolizado generalmente se le ajusta el tamaño para retirar oligosacáridos de longitud corta. Esto puede conseguirse de diversos modos, tales como ultrafiltración seguida por cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización de menos de o igual a aproximadamente 6 se
20 retiran preferentemente para el serogrupo A, y los de menos de aproximadamente 4 se retiran preferentemente para los serogrupos W135 e Y.
Para potenciar la inmunogenicidad, los polisacáridos u oligosacáridos de la invención se conjugan preferentemente con un vehículo (Figura 18). La conjugación con proteínas vehículo es particularmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo, ref. 15] y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisado en las ref. 16 a 24, etc.).
25 Las proteínas vehículo preferentes son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide diftérico o tetánico. El toxoide diftérico CRM197 [25, 26, 27] es particularmente preferido. Otras proteínas vehículo adecuadas incluyen la proteína de membrana externa de N. meningitidis [28], péptidos sintéticos [29, 30], proteínas de choque térmico [31, 32], proteínas pertussis [33, 34], citoquinas [35], linfoquinas [35], hormonas [35], factores de crecimiento [35], proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocitos T CD4+ humanos de diversos antígenos
30 derivados del patógeno [36, proteína D de H. influenzae [37], toxina A o B de C. difficile [38], etc. Es posible usar mezclas de proteínas vehículo.
Se prefieren conjugados con una relación sacárido:proteína (p/p) entre 0,5:1 (es decir, exceso de proteína) y 5:1 (es decir, exceso de sacárido), y aquellos con una relación entre 1:1,25 y 1:2,5 son más preferidos.
Una proteína vehículo individual puede portar múltiples sacáridos diferentes [39]. Los conjugados pueden usarse 35 junto con proteína vehículo libre [40]
Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier enlazador adecuado si fuera necesario
El sacárido típicamente se activará o funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo, tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio [41, 42, etc.]). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p
40 nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; véase también la introducción a la referencia 22.
Los enlaces mediante un grupo enlazador pueden hacerse usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 43 y 44. Un tipo de enlace implica aminación reductora del polisacárido, acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo enlazador de ácido adípico, y después acoplamiento de una proteína al otro extremo del grupo enlazador de ácido adípico [20, 45, 46]. Otros
45 enlazadores incluyen B-propionamido [47], nitrofeniletilamina [48], haluros de haloacilo [49], enlaces glucosídicos [50], ácido 6-aminocaproico [51], ADH [52], restos C4 a C12 [53] etc. Como alternativa al uso de un enlazador, puede usarse enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender oxidación del polisacárido seguido por aminación reductora con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 54 y 55.
Se prefiere un procedimiento que implica la introducción de grupos amino en el sacárido (por ejemplo, por remplazo
50 terminal = grupos o con -NH2) seguido por derivatización con un diéster adípico (por ejemplo, N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico) y reacción con la proteína vehículo.
Después de la conjugación, pueden separarse los sacáridos libres y conjugados. Existen muchos procedimientos adecuados, incluyendo cromatografía hidrófoba ultrafiltración trangencial, diafiltracion etc. [véanse también las ref. 56 y 57, etc.].
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Mezclas y composiciones que comprenden los sacáridos
Los oligosacáridos, polisacáridos y conjugados de la invención pueden mezclarse con otras moléculas biológicas. Se prefieren mezclas de sacáridos de más de un serogrupo de N. meningitidis, por ejemplo, composiciones que comprenden sacáridos de los serogrupos A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y,
5 C+W135+Y, A+C+W135+Y, etc. Se prefiere que la eficacia protectora de los antígenos sacáridos individuales no se elimine combinándolos, aunque puede reducirse la inmunogenicidad real (por ejemplo, títulos ELISA).
Cuando se usa un sacárido de serogrupo C, este preferentemente tiene ~12 a ~22 unidades repetitivas.
Pueden conjugarse sacáridos de diferentes serogrupos de N. meningitidis a la misma o diferentes proteínas vehículo.
10 Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, se prefiere que la relación (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC sea mayor de 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Sorprendentemente, se ha observado inmunogenicidad mejorada del componente MenA cuando está presente en exceso (masa/dosis) al componente MenC.
Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares (por ejemplo, oligosacáridos) del serogrupo W135 y al menos
15 uno de los serogrupos A, C e Y, se ha descubierto sorprendentemente que la inmunogenicidad del sacárido MenW135 es mayor cuando se administra en combinación con el sacárido o sacáridos del otro u otros serogrupos que cuando se administra solo (a la misma dosificación, etc.) [cf. ref. 58]. Por tanto, la capacidad del antígeno MenW135 de provocar una repuesta inmunitaria es mayor que la respuesta inmunitaria provocada por una cantidad equivalente del mismo antígeno cuando se suministra sin asociación con los antígenos de los otros serogrupos.
20 Dicha inmunogenicidad potenciada puede determinarse administrando el antígeno MenW135 a animales de control y la mezcla a animales de ensayo y comparando los títulos de anticuerpo contra los dos usando ensayos convencionales tales como títulos bactericidas, radioinmunoensayo y ELISA etc. Vacunas que comprenden combinaciones sinérgicas de sacáridos del serogrupo W135 y otro serogrupos son inmunológicamente ventajosas. Permiten respuestas anti-W135 potenciadas y/o dosis inferiores de W135.
25 Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y y uno o ambos de los serogrupos C y W135, se prefiere que la relación (p/p) de sacárido MenY:sacárido W135 sea mayor de 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1,
10:1 o mayor) y/o que la relación (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenC sea menor de 1 (por ejemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o inferior).
Relaciones preferentes (p/p) para sacáridos de los serogrupos A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 30 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1.
Las mezclas también pueden comprender proteínas. Se prefiere incluir proteínas del serogrupo B de N. meningitidis (por ejemplo, ref. 59 a 64) o preparaciones OMV [por ejemplo, ref. 65 a 68 etc.].
También pueden incluirse antígenos que no son de meningococos y no son de Neisseria, preferentemente los que no disminuyen la respuesta inmunitaria contra los componentes de meningococos. La ref. 69, por ejemplo, desvela
35 combinaciones de oligosacáridos de N. meningitidis serogrupos B y C junto con el sacárido Hib. Se prefieren antígenos de neumococos, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, B. pertussis, difteria, tétanos, Helicobacter pylori, polio y/o H. influenzae. Antígenos no de Neisseria particularmente preferidos incluyen:
-antígenos de Helicobacter pylori tales como CagA [70 a 73], VacA [74, 75], NAP [76, 77, 78], HopX [por ejemplo, 79], HopY [por ejemplo, 79] y/o ureasa.
40 -un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 80, 81,82]. -un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como un virus inactivado [por ejemplo, 83, 84]. -un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o centrales [por ejemplo, 84, 85],
estando preferentemente el antígeno de superficie adsorbido en un fosfato de aluminio [86]. -un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 87], preferentemente no adsorbido o adsorbido
45 en un fosfato de aluminio [88]. -un antígeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo, 89]. -un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo 59 a 62]. -un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, ref. 90 a 96]. -un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 97].
50 -un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 98]. -uno o más antígenos de polio [por ejemplo, 99, 100] tales como IPV. -uno o más antígenos de la rabia [por ejemplo 101] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 102,
RabAvert™]. -antígenos del sarampión, paperas y rubéola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 103]. 55 -uno o más antígenos de influenza [por ejemplo, capítulo 19 de la ref. 103], tal como las proteínas de superficie
hemaglutinina y/o neuraminidasa. -un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 104]. -un antígeno de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 105, 106].
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-un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 106, 107, 108]. -un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 109]. -uno o más antígenos de un paramixovirus tal como virus sincitial respiratorio (RSV [110, 111]) y/o virus de
parainfluenza (PIV3 [112]). 5 -un antígeno de Bacillus anthracis [por ejemplo, 113, 114, 115].
-un antígeno de un virus de la familia flaviviridae (género flavivirus), tal como del virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, cuatro serotipos de virus del Dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo occidental.
-un antígeno de pestivirus, tal como del virus clásico de la fiebre porcina, virus de la diarrea vírica bovina, y/o virus
de la enfermedad de la frontera.
-un antígeno de parvovirus, por ejemplo, de parvovirus B19.
-un toxoide tetánico [por ejemplo, ref. 116].
-holotoxina pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, ref. 117 y 118].
15 -antígeno pertussis celular.
La mezcla puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales que pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificación de toxina pertussis por medios químicos y/o genéticos).
Cuando se incluye un antígeno diftérico en la mezcla se prefiere también incluir antígeno tetánico y antígenos pertussis. Asimismo, cuando se incluye un antígeno tetánico se prefiere también incluir antígenos diftéricos y pertussis. Asimismo, cuando se incluye un antígeno pertussis se prefiere también incluir antígenos diftéricos y tetánicos.
Los antígenos en la mezcla típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1 μg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.
25 Como alternativa al uso de antígenos proteicos en la mezcla, puede usarse el ácido nucleico que codifica al antígeno. Los componentes proteicos de la mezcla por tanto pueden remplazarse por ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido) que codifica la proteína.
Vacunas multivalentes de sacárido
La invención también proporciona vacunas y composiciones inmunogénicas que comprenden sacáridos capsulares de al menos dos (es decir, 2, 3 o 4) de los serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis, en las que dichos sacáridos capsulares se conjugan a una o más proteínas vehículo y/o son oligosacáridos. Cuando la vacuna tiene solamente dos oligosacáridos o polisacáridos conjugados de los serogrupos A, C, W135 e Y, estos preferentemente no son de los serogrupos A y C (cf. ref. 6, 119 y 120). Composiciones preferidas comprenden sacáridos de los serogrupos C e Y. Otras composiciones preferidas comprenden sacáridos de los serogrupos C, W135 e Y.
35 También se desvela una composición inmunogénica que comprende un conjugado de oligosacárido de serogrupo A y un conjugado de oligosacárido de serogrupo C, y que comprende adicionalmente (i) un adyuvante de fosfato de aluminio o de hidróxido de aluminio y (ii) un tampón. Cuando la composición comprende un adyuvante de fosfato de aluminio, el tampón es preferentemente un tampón fosfato, cuando comprende un adyuvante de hidróxido de aluminio, el tampón es preferentemente un tampón histidina.
Cuando la vacuna comprende sacárido capsular del serogrupo A, se prefiere que el sacárido del serogrupo A se combine con el otro u otros sacáridos poco antes de su uso, para minimizar su hidrólisis (cf. sacáridos Hib). Esto puede conseguirse convenientemente teniendo el componente de serogrupo A en forma liofilizada y el componente
o componentes de los otros serogrupos en forma líquida, usándose el componente líquido para reconstituir el componente liofilizado cuando está listo para su uso. El componente líquido preferentemente comprende un
45 adyuvante de sal de aluminio, mientras que el componente de serogrupo A liofilizado puede comprender o no un adyuvante de sal de aluminio.
También se desvela un kit que comprende: (a) sacárido capsular de N. meningitidis serogrupo A, en forma liofilizada; y (b) uno o más sacáridos capsulares de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3) de N. meningitidis serogrupos C, W135 e Y, en forma líquida. Los sacáridos se conjugan preferentemente a una o más proteínas vehículo y/o son a oligosacáridos. El kit puede adoptar la forma de dos viales.
También se desvela un procedimiento para preparar una composición de vacuna desvelada en el presente documento, que comprende mezclar un sacárido capsular liofilizado de N. meningitidis serogrupo A con uno o más sacáridos capsulares de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3) de N. meningitidis serogrupos C, W135 e Y, en el que dicho uno o más sacáridos están en forma líquida.
55 También se desvela un kit que comprende: (a) oligosacárido capsular conjugado de N. meningitidis serogrupo A, en forma liofilizada; y (b) uno o más antígenos adicionales en forma líquida. El antígeno adicional puede estar conjugado o no al oligosacárido capsular de N. meningitidis serogrupo C.
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Composiciones inmunogénicas y vacunas
Los polisacáridos, oligosacáridos y conjugados de la invención son particularmente adecuados para su inclusión en composiciones inmunogénicas y vacunas. Un procedimiento de la invención, por lo tanto, puede incluir la etapa de formular el polisacáridos, oligosacárido o conjugado como una composición inmunogénica o vacuna. La invención
5 proporciona describe una composición o vacuna que se puede obtener de este modo.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas de la invención típicamente comprenderán, además de los sacáridos de meningococos, vehículos farmacéuticamente aceptables, que incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos 10 polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, trehalosa [121], agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas), y partículas de virus inactivo. Dichos vehículos son bien conocidos para los expertos en la materia. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Está disponible un análisis minucioso de
15 los excipientes farmacéuticamente aceptables en la ref. 122.
Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno sacárido, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según lo necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la 20 salud y estado físico del individuo a tratarse, edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo de sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico que está tratando, de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de ensayos rutinarios. La dosificación de tratamiento puede ser un programa de una única
25 dosis o un programa de múltiples dosis (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo). La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.
La vacuna puede administrarse junto con otros agentes inmunorreguladores.
La vacuna puede incluir un adyuvante. Adyuvantes preferidos para potenciar la eficacia de la composición incluyen, aunque sin limitación: (1) sales de amonio (alumbre), tales como hidróxidos de aluminio (incluyendo oxihidróxidos), 30 fosfatos de aluminio (incluyendo hidroxifosfatos), sulfato de aluminio, etc. [Capítulos 8 y 9 en la ref. 123]; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como muramil péptidos [los muramil péptidos incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoilsn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE), etc.] o componentes de pared celular bacteriana), tales como, por 35 ejemplo, (a) MF59™ [Capítulo 10 en las ref. 123; 124, 125], que contiene escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 %, y Span 85 al 0,5 % (que contiene opcionalmente MTP-PE) formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizador, (b) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado con Pluronic al 5 %, y el thr-MDP microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado con vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, 40 Hamilton, MT) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 %, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared bacteriana (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); (3) adyuvantes de saponina [capítulo 22 de la ref. 123], tales como QS21 o Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), en forma simple o en forma de partículas generadas a partir de las mismas tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores; capítulo 23 de la 45 ref. 123), dichos ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional, por ejemplo, ref. 126; (4) adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA); (5) citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [127], etc.), interferones (por ejemplo, interferón gamma), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc.; (6) monofosforil lípido A (MPL) o MPL 3-O-desacilado (3dMPL) por ejemplo, ref. 128 y 129, opcionalmente en ausencia sustancial de 50 alumbre cuando se usa con sacáridos de neumococos, por ejemplo, ref. 130; (7) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua, por ejemplo, ref. 131, 132 y 133; (8) oligonucleótidos que comprenden motivos CpG (Roman y col., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner y col., PNAS USA, 1997, 94, 1083310837; Davis y col., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu y col., J. Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford y col., Eur. J. Immunol, 1997, 27, 2340-2344; Moldoveanu y col., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg y col., Nature, 1995, 55 374, 546-549; Klinman y col., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas y col., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery y col., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern y col., Cell. Immunol, 1996, 167, 72-78; Yamamoto y col., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey y col., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina y col., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi y col., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi y col., J. ImmunoL., 1998, 160, 4755-4761; y Yi y col., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; solicitudes 60 de patente internacional WO96/02555, WO98/16247, WO98/18810, WO98/40100, WO98/55495, WO98/37919 y WO98/52581) es decir, que contienen al menos un dinucleótido CG, usándose opcionalmente 5-metilcitosina en lugar de citosina; (8) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno, por ejemplo, ref. 134; (9) un tensioactivo de
5
10
15
20
25
30
35
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45
éster de polioxietilen sorbitán en combinación con un octoxinol [135] o un tensioactivo de éter o éster alquílico de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [136]; (10) una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulador (por ejemplo, un oligonucleótido CpG) [137]; (11) un inmunoestimulante y una partícula de sal metálica, por ejemplo, ref. 138; (12) una saponina y una emulsión de aceite en agua, por ejemplo, ref. 139; (13) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) por ejemplo, ref. 140; (14) enterotoxina inestable al calor ("LT") de E. coli, o mutantes destoxificados de la misma, tales como los mutantes K63 o R72 [por ejemplo, Capítulo 5 de la ref. 141]; (15) toxina colérica ("CT"), o mutantes destoxificados de la misma [por ejemplo, Capítulo 5 de la ref. 141]; (16) liposomas [capítulos 13 y 14 de la ref. 123];
(17) quitosana [por ejemplo, ref. 142]; (18) ARN bicatenario; (19) micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 µm de diámetro, más preferentemente de ~200 nm a ~30 µm de diámetro, y mucho más preferentemente de ~500 nm a ~10 µm de diámetro) firmadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, a poli(α-hidroxi ácido) tal como poli(lactida-co-glicolida), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona etc.), opcionalmente tratados para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB); o (20) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para potenciar la eficacia de la composición [por ejemplo, capítulo 7 de la ref. 123].
Se prefieren sales de aluminio (especialmente fosfatos y/o hidróxidos de aluminio) y MF59 para su uso con los antígenos sacáridos de la presente invención. Cuando se usa un fosfato de aluminio, es posible adsorber uno o más de los sacáridos en la sal de aluminio, pero se prefiere no adsorber los sacáridos a la sal, y esto se favorece incluyendo iones fosfato libres en solución (por ejemplo, mediante el uso de un tampón fosfato). Cuando se usa un hidróxido de aluminio, se prefiere adsorber los sacáridos a la sal. El uso de hidróxido de aluminio como adyuvante es particularmente ventajoso para el sacárido del serogrupo A.
Es posible en composiciones de la invención adsorber algunos antígenos a un hidróxido de aluminio pero que tengan otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. Para combinaciones tetravalentes de serogrupo de
N. meningitidis, por ejemplo, están disponibles las siguientes permutaciones:
Serogrupo
Sal de aluminio (H = un hidróxido; P = un fosfato)
A
P H P H H H P P P H H H P P P H
C
P H H P H H P H H P P H P H P P
W135
P H H H P H H P H H P P P P H P
Y
P H H H H P H H P P H P H P P P
Para combinaciones trivalentes de serogrupo de N. meningitidis, están disponibles las siguientes permutaciones:
Serogrupo
Sal de aluminio (H = un hidróxido; P = un fosfato)
C
P H H H P P P H
W135
P H H P H P H P
Y
P H P H H H P P
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden administrarse directamente al sujeto. Los sujetos a tratarse pueden ser animales; en particular, pueden tratarse sujetos humanos. Las vacunas son particularmente útiles para vacunar niños y adolescentes. Pueden suministrarse por vías sistémicas y/o a la mucosa.
Típicamente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de su inyección. La preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para efecto adyuvante potenciado. El suministro directo de las composiciones generalmente será parenteral (por ejemplo, por inyección, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular o suministrada al espacio intersticial de un sujeto). Las composiciones también pueden administrarse a una lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios, y aplicaciones transdérmicas y transcutáneas (por ejemplo, véase la ref. 143), agujas e vaporizador hipodérmico. La dosificación de tratamiento puede ser un programa de una única dosis o un programa de múltiples dosis (por ejemplo, incluyendo dosis de refuerzo).
Las vacunas de la invención son preferentemente estériles. Están preferentemente libres de pirógenos. Están tamponadas preferentemente, por ejemplo, entre pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. Cuando una vacuna comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere usar un tampón histidina [144].
Las vacunas de la invención pueden comprender detergente (`por ejemplo, un Tween, tal como Tween 80) a niveles bajos (por ejemplo, <0,01 %). Las vacunas de la invención pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) o trehalosa, por ejemplo, a aproximadamente 15 mg/ml, particularmente si tienen que liofilizarse.
Las dosis óptimas de los antígenos individuales pueden evaluarse empíricamente. En general, sin embargo, los antígenos sacáridos de la invención se administrarán a una dosis entre 0,1 y 100 µg de cada sacárido por dosis, con un volumen de dosificación típico de 0,5 ml. La dosis es típicamente entre 5 y 20 µg por sacárido por dosis. Estos valores se miden como sacárido.
5 Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad después de infección), pero típicamente serán profilácticas.
Se desvela un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un paciente, que comprende administrar a un paciente una vacuna. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora contra enfermedad por meningococos y puede comprender una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular. El
10 paciente es preferentemente un niño.
El procedimiento puede crear una respuesta de refuerzo en un paciente que ya se ha sensibilizado contra N. meningitidis.
La invención también proporciona el uso de un polisacárido, oligosacárido o conjugado de la invención en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un animal. El medicamento es
15 preferentemente una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna). El medicamento es preferentemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por Neisseria (por ejemplo, meningitis, septicemia, gonorrea etc.), por H. influenzae (por ejemplo, otitis media, bronquitis, neumonía, celulitis, pericarditis, meningitis, etc.) o por neumococos (por ejemplo, meningitis, sepsis, neumonía, etc.). Por tanto, se prefiere la prevención y/o tratamiento de meningitis bacteriana.
20 Las vacunas pueden ensayarse en modelos animales convencionales (por ejemplo, véase la ref. 145).
La invención también proporciona un procedimiento para solubilizar un polisacárido capsular bacteriano precipitado, en el que se usa etanol como disolvente.
Definiciones
La expresión "que comprende" significa "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que 25 comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.
El término "aproximadamente" en relaciona un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10 %.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el efecto de relaciones variables de etanol:agua sobre la solubilización de polisacáridos.
Las Figuras 2 a 4 muestran títulos de IgG obtenidos en ratones contra antígenos oligosacáridos: la Figura 2
30 muestra los resultados usando oligosacárido del serogrupo A; la Figura 3 muestra resultados para el serogrupo Y; y la Figura 4 muestra los resultados para el serogrupo W135.
La Figura 5 muestra títulos de IgG post-II obtenidos en ratones con una mezcla de conjugados de oligosacárido para los serogrupos A y C: la Figura 5a muestra las respuestas anti-serogrupo A; y la Figura 5b muestra las respuestas anti-serogrupo C.
35 Las Figuras 6 a 8 muestran los títulos de IgG obtenidos en ratones con una mezcla de conjugados de oligosacárido para los serogrupos C, W135 e Y: la Figura 6 muestra las respuestas anti-serogrupo W135; la Figura 7 muestra las respuestas anti-serogrupo Y; y la Figura 8 muestra las respuestas anti-serogrupo C.
Las Figura 9 a 11 muestran los títulos de IgG post-II obtenidos en ratones con una mezcla de conjugados de oligosacárido para los serogrupos A, C, W135 e Y: la Figura 9 muestra las respuestas anti-serogrupo W135; la
40 Figura 10 muestra las respuestas anti-serogrupo Y; y la Figura 11 muestra las respuestas anti-serogrupo A.
La Figura 12 es una curva de calibración obtenida usando muestras de ensayo de polisacárido MenA a diferentes tiempos de hidrólisis. La curva muestra la relación lineal entre el recíproco del grado de polimerización y la energía de rotación óptica.
La Figura 13 es una curva de calibración obtenida usando muestras de ensayo de polisacárido MenY a
45 diferentes tiempos de hidrólisis. La curva muestra la relación lineal entre el log del grado de polimerización y KD (coeficiente de distribución).
Las Figuras 14 a 16 muestran los títulos de IgG post-II, divididos por subclase de IgG, obtenidos en ratones después de inmunización con conjugados de oligosacárido para los serogrupos: (14) A; (15) C; (16) W135 y (17)
Y.
50 La Figura 17 muestra los títulos de IgG post-II, divididos por subclase de IgG, obtenidos en ratones después de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
inmunización con una mezcla tetravalente de conjugados de oligosacárido.
La Figura 18 ilustra la preparación de un conjugado de oligosacárido.
La Figura 19 muestra (A) GMT anti-MenA y (B) GMT anti-MenC (± intervalos de confianza del 95 %) obtenidos en un modelo de cobaya. Los valores por encima de las barras son títulos en ensayo bactericida en suero (SBA), es decir, el reciproco de la dilución en suero que produce el 50 % de eliminación.
Modos para realizar la invención
A. Producción y purificación de polisacáridos de meningococos
Se cultivaron meningococos de los serogrupos A, W135 e Y en matraces de 500 ml que contenían 150 ml de Franz A como medio, durante 12 horas a 35 ± 1 ºC. La agitación se estableció a 150 rpm usando un agitador de deslizamiento de 35 mm. Después se inocularon 85 ml del cultivo en un fermentador de 20 l que contenía Watson como medio.
Después de 18,5 horas (W135 e Y) o 16,5 horas (A), cuando se alcanzó DO=10, se interrumpió la fermentación añadiendo 300 ml de formalina y después, tras 2 horas de incubación, se enfrió el fermentador hasta 10 ºC. El sobrenadante se recogió por centrifugación seguido por filtración (0,22 µm), y ultrafiltración con una membrana de 30 kDa.
El polisacárido concentrado en bruto después se precipitó por adición de CTAB como una solución en agua de 100 mg/ml. Los volúmenes añadidos se muestran en la siguiente tabla. Después de 12 horas a temperatura ambiente, se recuperaron los complejos de CTAB por centrifugación. El complejo de CTAB se extrajo añadiendo una solución de etanol al 95 % a temperatura ambiente durante 16-20 horas en agitación vigorosa. El volumen de etanol añadido se muestra en la siguiente tabla:
Serogrupo
Volumen de CTAB (ml) Volumen de etanol al 95 % (litros por kg de pasta húmeda)
A
475 3,5 a 6
W135
200 4 a 6
Y
650 3,4
Las suspensiones resultantes se filtraron a través de un filtro de profundidad CUNO 10 SP. El filtrado se hizo recircular a través de un cartucho CUNO zetacarbon™ hasta DO275nm<0,2. El filtrado de Zcarbon después se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. El polisacárido finalmente se precipitó en la fase de etanol por adición de una solución en agua de CaCl2 2M (10-12 ml/l de solución final de EtOH). Después se recogió el polisacárido purificado por centrifugación, se lavó con etanol al 95 % y se secó al vacío.
En otros experimentos, se varió la concentración final de etanol usada (Figura 1). Para polisacárido de serogrupo A, un intervalo entre el 80 y el 95 % de etanol fue más eficaz, disminuyendo la eficacia de extracción a porcentajes inferiores. Para el serogrupo W135, se consiguió buena extracción con etanol entre el 75 % y el 90 %, siendo el 95 % menos eficaz. Para el serogrupo Y, los mejores resultados se consiguieron con etanol entre el 75 % y el 85 %, siendo menos eficaces porcentajes mayores (por ejemplo, el 90 %, el 95 %). En general, se apreció que porcentajes de etanol por debajo de los informados en el presente documento tendían a aumentar la co-extracción de contaminantes tales como proteínas. Los porcentajes de etanol dados en este párrafo se expresan como una concentración final (etanol como porcentaje de volumen total de etanol + agua) y se basan en un contenido de agua de las pastas de CTAB-polisacárido recuperadas por centrifugación de aproximadamente el 50 % (es decir, 500 g de H2O por kg de pasta húmeda). Este valor se determinó empíricamente en experimentos a pequeña escala.
B. Conjugación de polisacáridos de serogrupo A
a) Hidrólisis
Se hidrolizó el polisacárido de meningococos de serogrupo A en tampón acetato sódico 50 mM, pH 4,7 durante aproximadamente 3 horas a 73 ºC. La hidrólisis se controló para obtener polisacáridos con un grado promedio de polimerización (DP) de aproximadamente 10, como se determina por la relación (p/p) entre el fósforo orgánico total y el fosfato monoéster.
La relación DP (fósforo orgánico total) a (monoéster de fósforo) es inversamente proporcional a la energía de rotación óptica (a), como se muestra en la Figura 12. Esta relación puede usarse para controlar el grado de hidrólisis más convenientemente que con las mediciones directas de fósforo.
b) Ajuste del tamaño
Esta etapa retira oligosacáridos de longitud corta generados durante el procedimiento de hidrólisis. El hidrolizado obtenido anteriormente se ultrafiltró a través de una membrana de punto de corte de 30 kDa (12 volúmenes de diafiltración de tampón acetato 5 mM, pH 6,5). El retenido, que contenía las especies de alto Pm, se desechó; se cargó el permeado en una columna Q-Sepharose Fast Flow equilibrada en tampón acetato 5 mM, pH 6,5. La columna después se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrado, después con 10 CV de tampón acetato 5 mM/NaCl 125 mM pH 6,5 para retirar los oligosacáridos con DP≤6. El oligosacárido de tamaño
imagen9
5 ajustado después se eluyó con 5 CV de tampón acetato 5 mM/NaCl 5 M pH 6,5.
La población de oligosacárido eluido tiene un DP promedio de aproximadamente 15.
c) Introducción de un grupo amino primario en el extremo reductor
Se añadió sal de amonio (acetato o cloruro) a la solución de oligosacárido de tamaño ajustado para una concentración final que varía de 49-300 g/l, después se añadió cianoborohidruro sódico a una concentración final
10 que variaba de 12-73 g/l. Después de ajustar el pH entre 6-7,3, la mezcla se incubó a 37 ºC durante 5 días.
Los amino-oligosacáridos después se purificaron por ultrafiltración en flujo tangencial con una membrana de punto de corte de 1 kDa o 3 kDa usando 13 volúmenes de diafiltración de NaCl 0,5 M seguido por 7 volúmenes de diafiltración de NaCl 20 mM. La solución de amino-oligosacárido purificado se analizó para el contenido de fósforo (una actividad química del antígeno) por el procedimiento de la ref. 146 y la cantidad de grupos amino introducidos
15 por el procedimiento de la ref. 147.
Los oligosacáridos purificados después se secaron con rotavapor para retirar el agua.
d) Derivatización en éster activo
Los amino-oligosacáridos se solubilizaron en agua destilada a una concentración de grupo amino 40 mM, después se añadieron 9 volúmenes de DMSO seguido por trietilamina a una concentración final de 200 mM. A la solución
20 resultante, se añadió N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico para una concentración final de 480 mM.
La reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, después se precipitó el oligosacárido activado con acetona (80 % v/v de concentración final). El precipitado se recogió por centrifugación y se lavó varias veces con acetona para retirar el N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico sin reaccionar y los subproductos. Finalmente, el oligosacárido activado se secó al vacío.
25 Se determinó la cantidad de grupos éster activo introducidos en la estructura de oligosacárido por un procedimiento colorimétrico como se describe en la ref. 148.
e) Conjugación a CRM197
Se añadió el oligosacárido activado seco a una solución de 45 mg/ml de CRM197 en tampón fosfato 0,01 M pH 7,2 para una relación éster activo/proteína (mol/mol) de 12:1. La reacción se mantuvo en agitación a temperatura
30 ambiente durante una noche. Después de este período el conjugado se purificó por cromatografía hidrófoba o ultrafiltración en flujo tangencial. El conjugado purificado MenA-CRM197 se filtró a esterilidad y se almacenó a -20 ºC o -60 ºC hasta la formulación de la vacuna.
El conjugado se analizó para: el contenido de proteínas (ensayo de proteínas micro-BCA), el contenido de sacárido MenA (análisis colorimétrico de fósforo), contenido de sacárido libre, perfil de HPLC (en TSKgel G4000SW 7,5 mm
35 DI x 30 cm), y SDS-PAGE. Las características de las preparaciones típicas se muestran en la siguiente tabla:
Código de Lote
Sácarido (mg/ml) Proteína (mg/ml) Glucosilación KD
210201/A
0,257 0,864 0,3 0,489
210201/BS
0,308 1,354 0,23 0,503
210201/BL
0,28 1,482 0,19 0,501
35I230595
0,138 0,3 0,46
010900
0,092 0,337 0,27
DP29
0,105 0,245 0,43
A1 (no ajustado en tamaño)
0,08 0,291 0,27
A2 (ajustado en tamaño)
0,446 2,421 0,18
C. Conjugación de polisacáridos del serogrupo W135
a) Hidrólisis
El polisacárido de meningococos de grupo W se hidrolizó en tampón acetato sódico 50 mM acético, pH 4,7 durante aproximadamente 3 horas a 80 ºC. Esto produjo oligosacáridos con un DP promedio de aproximadamente 15 a 20 40 determinado por la relación entre ácido siálico (SA) y SA terminal reducido.
imagen10
La relación DP de (SA total) a (SA terminal reducido) se refiere a la KD determinada por HPLC-SEC, como se muestra en la Figura 13. Esta relación puede usarse para controlar el grado de hidrólisis más convenientemente que las mediciones directas de SA.
b) Ajuste de tamaño
5 El hidrolizado se ultrafiltró a través de una membrana de punto de corte de 30 kD (12 a 20 volúmenes de diafiltración de tampón acetato 5 mM/NaCl 15-30 mM pH 6,5). El retenido, que contenía las especies de alto PM, se desechó mientras el permeado se cargaba en una columna Q-Sepharose Fast Flow equilibrada en tampón acetato 5 mM/NaCl 15 mM pH 6,5. La columna después se lavó con 10 CV de tampón de equilibrado como para retirar los oligosacáridos con DP ≤ 3-4 y se eluyó con 3 CV de tampón acetato 5 mM/NaCl 500 mM pH 6,5.
10 c) Introducción de un grupo amino primario en el extremo reductor
Se añadió cloruro de amonio o acetato de amonio a la solución de oligosacárido de tamaño ajustado hasta una concentración final de 300 g/l, después se añadió cianoborohidruro sódico a concentración final de 49 g/l o 73 g/l. La mezcla se incubó a 50 ºC durante 3 días.
Los amino-oligosacáridos después se purificaron por ultrafiltración en flujo tangencial como se ha descrito para el
15 serogrupo A. El material purificado se analizó para su contenido de ácido siálico (procedimiento colorimétrico de acuerdo con la ref. 149) y/o galactosa (HPLC) (actividades químicas del antígeno MenW135). Los oligosacáridos purificados después se secaron con rotavapor para retirar el agua.
d) Derivatización en éster activo
Los animo-oligosacáridos secados se derivatizaron como se ha descrito anteriormente para el serogrupo A.
20 e) Conjugación a CRM197
La conjugación se realizó como se ha descrito anteriormente para el serogrupo A pero, para purificar el conjugado, se usó diafiltración con una membrana de 30 kD (50 volúmenes de diafiltración de tampón fosfato 10 mM, pH 7,2). El conjugado purificado se filtró a esterilidad y se almacenó a -20 ºC o -60 ºC hasta la formulación de la vacuna.
El conjugado se analizó para los mismos parámetros que se han descrito anteriormente para el serogrupo A. Se 25 ensayó el contenido de sacárido MenW por determinación colorimétrica de ácido siálico:
Código de Lote
Sácarido (mg/ml) Proteína (mg/ml) Glucosilación KD
lote 1
5,73 3,52 1,63 0,296
lote 2/4,5
3,51 2,88 1,22 0,308
lote 3S
2,49 2,25 1,11 0,380
lote 3Sd
2,03 2,24 0,91 0,394
lote 3L
2,32 2,3 1,01 0,391
lote 3Ld
1,94 2,29 0,85 0,383
Lote 3S/pr. Glic6
0,363 0,82 0,44 0,498
Lote 3S/pr. Glic9
0,424 0,739 0,57 0,447
Lote 3S/pr. Glic12
0,479 0,714 0,671 0,414
D. Conjugación de polisacáridos del serogrupo Y
a) Hidrólisis
Se hidrolizó el polisacárido de meningococos del grupo Y como se ha descrito anteriormente para el serogrupo W135. Esto dio oligosacáridos con un DP promedio de aproximadamente 15 a 20 determinado por la relación entre 30 SA y SA terminal reducido (medido convenientemente de forma indirecta como se describe en C (a) anterior).
b) Ajuste de tamaño, c) Introducción de grupo amino, d) Derivatización en éster activo y e) Conjugación
Estas etapas se realizaron como se ha descrito anteriormente para el serogrupo W135. El conjugado purificado se filtró a esterilidad y se almacenó a -20 ºC o -60 ºC hasta la formulación de la vacuna.
5
10
15
20
25
30
35
El conjugado se analizó del mismo modo que el descrito anteriormente para el serogrupo W135:
Código de Lote
Sácarido (mg/ml) Proteína (mg/ml) Glucosilación KD
lote 1A
1,16 0,92 1,26 0,303
lote 1B
4,57 3,55 1,29 0,339
Lote 2/4,5
2,32 6,1 0,38 0,467
lote 2/6
1,75 5,73 0,3 0,498
E. Inmunogenicidad de conjugados individuales
Se descongelaron los conjugados a granel congelados. Cada uno se diluyó, en agitación, hasta una concentración final de 20 μg de sacárido/ml, fosfato 5 mM, 9 mg/ml de NaCl, fosfato de aluminio (para dar una concentración de Al3+ de 0,6 mg/ml), pH 7,2. Las mezclas después se mantuvieron, sin agitación, a 2-8 ºC durante una noche y se diluyeron adicionalmente con solución salina hasta 4 μg de sacárido/ml para inmunización de ratones.
Se preparó un segundo conjunto de vacunas para cada serogrupo del mismo modo, pero la adición de fosfato de aluminio se remplazó con el mismo volumen de agua.
Se inyectó s.c. a diez ratones Balb/c para cada grupo de inmunización dos veces con 0,5 ml de vacuna en las semanas 0 y 4. Se realizaron extracciones de sangre antes de la inmunización, el día antes de la segunda dosis y dos semanas después de la segunda dosis. Las inmunizaciones e realizaron con (a) la vacuna de conjugado con o sin alumbre, (b) control de solución salina y (c) control de polisacárido no conjugado.
Se determinaron los anticuerpos IgG antipolisacárido específicos en los sueros de animales inmunizados esencialmente como se describe en la ref. 150. Cada suero de ratón individual se analizó por duplicado mediante una curva de titulación y se calculó la GMT para cada grupo de inmunización. Los títulos se calcularon en unidades ELISA de ratón (MEU) usando el software "Titerun" (FDA). Se determinó la especificidad del título antipolisacárido por ELISA competitivo con el polisacárido relevante como competidor.
Como se muestra en la Figura 2, el conjugado MenA indujo altos títulos de anticuerpo en animales. Como se esperaba, el polisacárido no conjugado no fue inmunogénico. La formulación de conjugado con un fosfato de aluminio como adyuvante indujo un nivel mayor de anticuerpos en comparación con el título obtenido por el conjugado en solitario. Se observaron resultados similares para MenY (Figura 3) y MenW135 (Figura 4).
Se midió la subclase IgG de las respuestas inmunitarias post-II para diversos grupos. Se determinaron las subclases específicas usando el mismo procedimiento ELISA que el usado para la determinación del título total de IgG en la sección E anterior, pero usando fosfatasa alcalina-anti-IgG1,-IgG2a, -IgG2b o IgG3 de ratón (Zymed), como anticuerpo secundario. Los títulos se expresaron como DO405nm obtenida después de 30 minutos de revelado de sustrato usando suero diluido 1:3200, y se muestran en las Figuras 14 (MenA), 15 (MenW135) y 16(MenY). Las respuestas son principalmente de la subclase IgG1, que es la subclase predominantemente inducida en ratones por antígenos T-dependientes. Como los polisacáridos son de forma inherente antígenos T-independientes que no son capaces de inducir memoria inmunológica, estos datos muestran que la conjugación ha tenido el efecto deseado.
También se ensayaron sueros post-II para la actividad bactericida usando un ensayo in vitro para medir la lisis mediada por el complemento de bacterias. Se inactivaron sueros post-II durante 30 minutos a 56 ºC antes de su uso en el ensayo, y se usó complemento de cría de conejo al 25 % como fuente de complemento. Se expresó el título bactericida como la dilución de suero recíproca que produce el 50 % de eliminación de bacterias frente a las siguientes cepas: MenA G8238, A1, F6124; MenW135 5554(OAc+) y 242317(OAc-); MenY 242975(OAc-) y 240539(OAc+).
Los resultados para MenA incluían:
Vehículo
Poly/oligo sacárido Aprox. α DP Adyuvante de aluminio GMT Actividad bactericida
CRM197
O 15 - 461 F8238: 2048-4096; F6124: 2048-4096
CRM197
O 15 fosfato 920 F8238: 4096; F6124: 4096
-
P - fosfato 3 F8238: 8; F6124: 128
CRM197
O 15 - 290 F8238: 512-1024
-
P - - 2 F8238: <4
CRM197
O 15 - 155 F8238: 512-1024
CRM197
O 15 - 393 F8238:1024
CRM197
O 15 - 396 -
imagen11
(continuación)
Vehículo
Poly/oligo sacárido Aprox. α DP Adyuvante de aluminio GMT Actividad bactericida
CRM197
O 15 fosfato 1396 F8238: 4096
CRM197
O 15 fosfato 1461 F8238: 2048-4096
CRM197
O 15 fosfato 1654 F8238: 2048
CRM197
O 29 fosfato 1053 F8238: 2048
CRM197
O no ajustado en tamaño 10 fosfato 1449 F8238: 2048
CRM197
O 15 fosfato 626 F8238: 2048-4096
CRM197
O 15 - 742 -
CRM197
O 15 - 2207 -
CRM197
O 29 - 1363 -
CRM197
O no ajustado en tamaño 10 - 615 -
CRM197
O 15 fosfato 1515 -
CRM197
O 15 fosfato 876 -
CRM197
O 15 fosfato 1232 -
CRM197
O 15 fosfato 852 -
CRM197
O 15 fosfato 863 F8238: 2048; A1: 2048; F6124: >2048
CRM197
O 27 fosfato 1733 F8238: 4096-8192; F6124: 4096-8192
CRM197
O 15 fosfato 172 F8238: 1024; A1: 1024-2048; F6124: 2048
CRM197
O 15 hidróxido 619 F8238: 1024; A1: 2048; F6124: 2048
Los resultados para MenW135 incluían:
Vehículo
Poly/oligo sacárido OAc Adyuvante de aluminio GMT Actividad bactericida
CRM197
O + - 14 5554: 256-512
CRM197
O + fosfato 23 5554: 256-512
-
P - - 5554: 4
CRM197
O + - 45 5554: 1024
CRM197
O + - 101 5554: 64-128
CRM197
O + - 80 5554: 256-512
CRM197
O + fosfato 221 5554: 1024-2048; 242317: 1024-2048
CRM197
O - - 52 5554: 512-1024
CRM197
O - fosfato 329 5554: 1024-2048; 242317:1024-2048
CRM197
O + - 41 5554: 256-512
CRM197
O + fosfato 24 5554: 1024; 242317: 128-256
CRM197
O - - 116 5554: 256-512
CRM197
O - fosfato 185 5554: 1024; 242317: 512-1024
CRM197
O + fosfato 565 5554: 2048
CRM197
O + fosfato 328 5554: 512-1024
CRM197
O + fosfato 490 5554: 1024-2048
CRM197
O + hidróxido 189 5554: 512-1024; 242317: 512-1024
CRM197
O + fosfato 80 5554: 512-1024; 242317: 512-1024
CRM197
O + hidróxido 277 5554: 512-1024; 242317: 1024-2048
imagen12
Los resultados para MenY incluían:
Vehículo
Poly/oligo sacárido α DP Adyuvante de aluminio GMT Actividad bactericida
CRM197
O >15 - 751 242975: 8192
CRM197
O >15 fosfato 1190 242975: 8192-16384; 240539: 8192-16384
CRM197
O >15 - 284 242975: 2048-4096
CRM197
O >15 fosfato 775 242975: 2048-4096
-
P - - - 242975: 256
CRM197
O >15 - 1618 242975: 4096-8192
CRM197
O >15 - 2123 242975: 2048
CRM197
O <10 - 253 242975: 512-1024
CRM197
O <10 - 1060 242975: 256-512
CRM197
O >15 hidróxido 1167 242975: 8192; 240539: 8192-16384
CRM197
O >15 fosfato 665 242975: 8192; 240539: 8192-16384
CRM197
O >15 fosfato 328 242975: 4096; 240539: 2048-4096
CRM197
O >15 hidróxido 452 242975: 2048; 240539: 1024-2048
F. Inmunogenicidad de conjugado MenA en combinación con conjugado MenC
Se mezcló CRM-MenC concentrado a granel (de Chiron Vaccines, Italia) con CRM-MenA concentrado a granel
5 (obtenido como se ha descrito anteriormente), se diluyeron y mezclaron por agitación. Se prepararon tres preparaciones diferentes. Cada una contenía 20 μg de sacárido/ml para MenA, pero se incluyeron cantidades diferentes de conjugado MenC: (i) 20 μg de sacárido/ml (ii) 10 μg de sacárido/ml; (iii) 5 μg de sacárido/ml. Las relaciones de MenA:MenC (p/p) fueron por tanto: (i) 1:1; (ii) 2:1; (iii) 4:1.
Cada preparación también contenía fosfato sódico 5 mM, 9 mg/ml de NaCl, fosfato de aluminio (para dar una
10 concentración de Al3+ de 0,6 mg/ml), pH 7,2. Cada mezcla después se mantuvo, sin agitación, a 2-8 ºC durante una noche y se diluyó adicionalmente 1:5 con solución salina antes de la inmunización de los ratones.
Se preparó un segundo conjunto de vacunas del mismo modo, pero se remplazó la adición de fosfato de aluminio con un volumen igual de agua.
Para cada una de las seis vacunas, se inmunizaron diez ratones Balb/c como se ha descrito anteriormente. Los 15 grupos de control recibieron solución salina o conjugado MenA en solitario.
Se determinaron los anticuerpos antipolisacárido para MenA y MenC como se ha descrito anteriormente.
Los resultados obtenidos con la mezcla de conjugados MenA+MenC indican claramente que la relación (p/p) entre los componentes A y C desempeñan un papel crucial para la inmunogenicidad de MenA.
El título anti-MenApS específico obtenido con el control de conjugado MenA fue mayor (con o sin adyuvante de
20 alumbre) que para la combinación MenA+MenC a la misma dosificación (Figura 5a). Cuando se usa una cantidad inferior de conjugado MenC en la combinación, se induce un mejor título anti-MenApS por el componente de conjugado MenA. Al mismo tiempo, el título anti-MenC permanece aceptable (Figura 5b).
También se realizaron experimentos usando un modelo de cobaya. Se prepararon tres preparaciones diferentes, usando el mismo adyuvante de fosfato de aluminio que anteriormente (hidroxifosfato amorfo, relación molar PO4/Al
25 entre 0,84 y 0,92, 0,6 mg de Al3+/ml):
Preparación
Men A* Men C* Relación MenA : MenC
A
20 μg/ml 20 μg/ml 1 : 1
B
40 μg/ml 20 μg/ml 2 : 1
C
20 μg/ml 10 μg/ml 1 : ½
* Expresado como sacárido
Estas preparaciones se diluyeron 1:2 con solución salina y se usaron para inmunizar cobayas. Se inyectó s.c. a cinco cobayas (cepa Hartelley hembra, 450-500 gramos) para cada grupo de inmunización dos veces con 0,5 ml de vacuna en los días 0 y 28. Se realizaron extracciones de sangre antes de la primera inmunización y después en el
30 día 42. Los sueros se almacenaron a -70 ºC antes del análisis por ELISA y el ensayo bactericida en suero (contra MenA cepa MK 83/94 o MenC cepa C11). Los resultados se muestran en la Figura 19.
5
10
15
20
25
30
35
G. Vacuna de combinación para los serogrupos C, W135 e Y
Se mezclaron conjugados de polisacáridos de los serogrupos C, W135 e Y como se ha descrito anteriormente para dar una concentración final de 20 μg de sacárido/ml para cada conjugado. La vacuna contenía una concentración final de fosfato sódico 5 mM y 9 mg/ml de NaCl, pH 7,2. Después de almacenamiento durante una noche, la mezcla se diluyó para que contuviera 4 μg de sacárido/ml para cada conjugado para inmunización.
Las inmunizaciones y el análisis tuvieron lugar como anteriormente.
Los resultados muestran que la inmunogenicidad del conjugado MenW135 se potencia cuando se administra en combinación con los conjugados MenC y MenY, en comparación con la obtenida con el conjugado MenW135 en solitario (Figura 6). La inmunogenicidad de MenY fue comparable en la combinación a la obtenida con el conjugado individual (Figura 7) y también fue comparable con la inmunogenicidad del conjugado MenC (Figura 8).
H. Vacuna de combinación para los serogrupos A, C, W135 e Y
Se mezclaron conjugados de polisacáridos de los serogrupos A, C, W135 e Y como se ha descrito anteriormente para dar una concentración final de 20 μg de sacárido/ml para los conjugados del serogrupo A, W135 e Y y 5 μg de sacárido/ml para el conjugado del serogrupo C. La vacuna contenía una concentración final de fosfato sódico 5 mM, 9 mg/ml de NaCl, fosfato de aluminio (para dar una concentración de Al3+ de 0,6 mg/ml), pH 7,2. La mezcla después se mantuvo sin agitación, a 2-8 ºC durante una noche y se diluyó adicionalmente con solución salina para dar 4 μg de sacárido/ml para los conjugados A, W135 e Y y 1 μg de sacárido/ml para el conjugado C. Esta mezcla diluida se usó para inmunización.
Las inmunizaciones y el análisis tuvieron lugar como anteriormente, incluyendo los controles los conjugados individuales excepto para el serogrupo C.
La Figura 9 muestra que, como anteriormente, la inmunogenicidad del conjugado MenW135 se potenciaba cuando se administraba en combinación con los conjugados MenA, MenC y MenY. La Figura 10 muestra que la inmunogenicidad del conjugado MenY no es significativamente diferente cuando se suministra en combinación con los conjugados MenA, MenC y MenW135. La Figura 11 muestra que la inmunogenicidad del conjugado MenA disminuye de forma marcada en la combinación, incluso con el conjugado MenC administrado a una dosificación inferior (¼). Esta competición antigénica no se observa en la vacuna de polisacárido tetravalente (ACWY) no conjugada [5].
I. Antígeno de serogrupo A liofilizado
El polisacárido capsular de N. meningitidis de serogrupo A es particularmente susceptible a hidrólisis. Por lo tanto, se prepararon conjugados del oligosacárido capsular MenA en forma liofilizada, lista para reconstitución en el momento de la administración. La forma liofilizada se preparó para que tuviera componentes que dan la siguiente composición después de la reconstitución en una dosis unitaria:
Componente
Concentración
CRM-MenA
20 μg de sacárido/ml
Tampón fosfato potásico
5 mM
Manitol
15 mg/ml
Esta composición no tiene adyuvante. Se prepararon dos adyuvantes para su reconstitución: Cuando se reconstituye con agua para inyección, la estabilidad del componente sacárido fue la siguiente:
Componente
Concentración Concentración
Hidróxido de aluminio
0,68 mg Al3+/ml -
Fosfato de aluminio *
- 0,6 mg Al3+/ml
Tampón fosfato sódico
- 10 mM
Tampón histidina
10 mM -
Cloruro sódico
9 mg/ml 9 mg/ml
Tween 80
0,005 % 0,005 %
PH
7,2 ± 0,05 7,2 ± 0,05
* hidroxifosfato amorfo, relación molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92
imagen13
Tiempo (días)
Almacenado a 2-8 °C Almacenado a 36-38 °C
Sacárido total (μg/ml)
Sacárido libre (μg /ml) Sacárido libre % Sacárido total (μg /ml) Sacárido libre (μg /ml) Sacárido libre %
0
17,72 1,04 5,9 17,72 1,04 5,9
15
17,01 0,88 5,2 16,52 2,26 13,7
30
17,82 0,89 5,0 17,29 2,64 15,3
Sobre la misma escala de tiempo de 4 semanas, el pH fue estable a 7,2 tanto a 2-8 ºC como a 36-38 ºC, el contenido de proteínas fue estable a aproximadamente 24,5 μg/ml, y el contenido de humedad estuvo por debajo de 2,5 %.
Cuando se reconstituye con la solución adyuvante de fosfato de aluminio y se almacena a 2-8 ºC, la estabilidad fue la siguiente:
Tiempo (horas)
Sacárido total (μg/ml) Sacárido libre (μg/ml) Sacárido libre %
0
16,62 1,09 6,6
24
16,51 0,98 5,9
48
16,83 0,99 5,9
J. Vacuna de combinación para los serogrupos A, C, W135 e Y (conjugado de serogrupo A liofilizado)
10 Se preparó una mezcla trivalente de los componentes MenC, W135 e Y adsorbidos en un adyuvante de hidróxido de aluminio (2 mg/ml) o mezclados con un adyuvante de fosfato de aluminio (hidroxifosfato amorfo, relación molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92, 0,6 mg/ml de Al3+, en presencia de tampón fosfato 10 mM). Las composiciones de las dos mezclas trivalentes fueron las siguientes:
Componente
Concentración Concentración
Hidróxido de aluminio
0,68 mg Al3+/Ml -
Fosfato de aluminio*
- 0,6 mg Al3+/ml
CRM-MenC
20 mg sacárido/ml 20 mg sacárido/ml
CRM-MenY
20 mg sacárido/ml 20 mg sacárido/ml
CRM-MenW135
20 mg sacárido/ml 20 mg sacárido/ml
Tampón de fosfato sódico
- 10 mM
Tampón histidina
10 mM -
Cloruro sódico
9 mg/ml 9 mg/ml
Tween 80
0,005 % 0,005%
* hidroxifosfato amorfo, relación molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92
Para la mezcla de hidróxido, la estabilidad de los componentes sacáridos fue la siguiente:
Tiempo (días)
Almacenado a 2-8 °C Almacenado a 36-38 °C
Sacárido libre (µg/ml)
Sacárido libre % Sacárido libre (µg/ml) Sacárido libre %
MenC a granel
0
<1,2 <6 <1,2 <6
15
<1,2 <6 <1,2 <6
30
<1,2 <6 <1,2 <6
Viales de MenC
0
<1,2 <6 <1,2 <6
15
<1,2 <6 <1,2 <6
30
<1,2 <6 1,3 6,6
imagen14
(continuación)
Tiempo (días)
Almacenado a 2-8 °C Almacenado a 36-38 °C
Sacárido libre (µg/ml)
Sacárido libre % Sacárido libre (µg/ml) Sacárido libre %
MenW135 a granel
0
2,5 12,5 2,5 12,5
15
2,3 11,4 3,4 16,8
30
2,3 11,5 3,5 17,3
Viales de MenW135
0
2,1 10,6 2,1 10,6
15
2,3 11,7 2,7 13,3
30
20. 10,2 3,3 16,3
MenY a granel
0
1,7 8,3 1,7 8,3
15
<1,3 <6,3 2,0 10,2
30
1,3 6,3 2,4 12,2
Viales de MenY
0
1,4 7,1 1,4 7,1
15
1,5 7,6 2,1 10,7
30
1,3 6,3 2,9 14,3
Sobre la misma escala de tiempo de 4 semanas, el pH fue estable a 7,15+0,05 tanto a 2-8 ºC como a 36-38 ºC. Para la mezcla de fosfato, la estabilidad de los componentes sacáridos fue la siguiente:
Tiempo (días)
Almacenado a 2-8 °C Almacenado a 36-38 °C
Sacárido total (µg/ml)
Sacárido libre (µg/ml) Sacárido libre % Sacárido total (µg/ml) Sacárido libre (µg/ml) Sacárido libre %
MenC a granel
0
22,8 <1,0 <5 22,8 <1,0 <5
15
17,2 <1,0 <5 18,6 <1,0 <5
30
18,9 <1,0 <5 20,5 <1,0 <5
Viales de MenC
0
20,5 <1,0 <5 20,5 <1,0 <5
15
18,3 <1,0 <5 23,4 <1,0 <5
30
18,0 <1,0 <5 20,5 <1,0 <5
MenW135 a granel
0
20,7 2,0 10,4 20,7 2,0 10,4
15
21,9 2,3 11,6 21,2 2,1 10,3
30
19,6 2,1 10,6 21,0 2,4 11,8
Viales de MenW135
0
23,4 1,7 8,4 23,4 1,7 8,4
15
21,2 1,9 9,5 20,1 2,2 11,1
30
20,1 2,2 11,2 21,3 3,2 16,1
MenY a granel
0
19,1 <1,1 <5,3 19,1 <1,1 <5,3
15
20,1 1,4 6,8 18,7 1,3 6,4
30
18,6 1,4 7,6 19,2 1,7 8,3
Viales de MenY
0
21,4 <1,1 <5,3 21,4 <1,1 <5,3
15
19,6 1,4 6,8 19,0 1,5 7,4
30
17,7 1,2 6,2 18,4 1,9 9,4
Sobre la misma escala de tiempo de 4 semanas, el pH fue estable a 7,5 ± 0,05 tanto a 2-8 ºC como a 36-38 ºC.
Las composiciones líquidas trivalentes se diluyeron y se usaron 0,5 ml para reconstituir el conjugado MenA liofilizado. La mezcla tetravalente resultante se administró a diez ratones Balb/c (hembras de 6-8 semanas de edad) por grupo por inyección subcutánea en el día 0 y 28. La mezcla contenía 2 µg de cada conjugado de sacárido por dosis, que representa 1/5 de la dosis humana individual (SHD). Los controles fueron solución salina o polisacáridos homólogos no conjugados. Se realizaron extracciones de sangre antes de la inmunización y después en el día 42, con sueros almacenados a -70 ºC. Se determinó la IgG como se ha descrito anteriormente.
Todos los conjugados usados eran seguros e inmunogénicos en los animales. Los títulos ELISA post-II GMT (con intervalos de confianza del 95 %) fueron los siguientes:
Vacuna
Adyuvante A Y W135 C
MenA (liofilizado y resuspendido)
Fosfato de aluminio 172 (69-439) - - -
Hidróxido de aluminio
619 (419-906) - - -
MenY
Fosfato de aluminio - 328 (147-731) - -
Hidróxido de aluminio
- 452 (344-593) - -
MenW
Fosfato de aluminio - - 80 (28-225) -
Hidróxido de aluminio
- - 277 (185-411) -
MenC
Fosfato de aluminio - - - 317 (152-659)
Hidróxido de aluminio
- - - 723 (615-851)
MenA (liofilizado) + MenC,W135,Y
Fosfato de aluminio 32 (15-68) 397 (252-627) 99 (35-288) 114 (53-246)
Hidróxido de aluminio
206 (112-372) 141 (97-205) 139 (76-251) 163 (122-218)
La Figura 17 muestra los resultados del análisis de subclase de IgG para: (17A) MenA; (17B) MenC; (17C) MenW135; y (17D) MenY. IgG1 es claramente la subclase más prominente.
Los títulos bactericidas en suero fueron los siguientes:
imagen15
K. Vacuna de combinación para los serogrupos A, C, W135 e Y (diferentes dosificaciones)
Se inmunizaron ratones como se ha descrito anteriormente, pero las composiciones de vacuna contenían diferentes relaciones de los diversos conjugados de oligosacárido. Las dosis fueron de forma variada 0,5, 1, 2 o 4 µg/dosis. Se usó oligo-conjugado MenA liofilizado en todos los experimentos.
Los títulos ELISA fueron los siguientes:
Cantidad de antígeno (µg/dosis)
Adyuvante dealuminio ELISA GMT (intervalo de confianza del 95 %)
A
C W135 Y A C W135 Y
4
2 2 2 Fosfato 177 (107-291) 367 (263-510) 239 (135-424) 239 (184-311)
4
2 2 2 Hidróxido 390 (313-486) 494 (345-706) 338 (266-430) 158 (96-260)
2
2
2
2
Fosfato 132 (59-296) 582 (268-1155) 143 (75-272) 247 (152-400)
2
2
2
2
Hidróxido 337 (239-476) 569 (462-679) 171 (117-251) 100 (59-169)
4
2 1 1 Fosfato 137 (47-397) 192 (88-421) 18 (4-75) 315 (174-571)
4
2 1 0,5 Fosfato 152 (85-271) 207 (100-428) 51 (21-125) 220 (125-388)
4
2 1 2 Fosfato 113 (49-263) 230 (98-540) 23 (6-91) 267 (81-877)
4
2 0,5 1 Fosfato 267 (109-656) 504 (300-847) 46 (15-134) 583 (330-1030)
4
2 2 1 Fosfato 87 (49-155) 118 (51-278) 24 (8-72) 214 (140-326)
2
2
1 1 Fosfato 217 (132-355) 514 (332-796) 110 (66-183) 206 (141-300)
2
2
1 0,5 Fosfato 105 (40-279) 381 (180-808) 90 (34-236) 206 (96-445)
2
2
1 2 Fosfato 155 (71-339) 374 (196-713) 53 (28-100) 502 (335-752)
2
2
0,5 1 Fosfato 224 (125-400) 358 (223-577) 43 (14-128) 624 (426-914)
2
2
2
1 Fosfato 180 (113-288) 306 (190-492) 70 (34-146) 423 (258-696)
Los títulos bactericidas en suero fueron los siguientes:
A Cantidad de antígeno (µg/dosis)
Adyuvante de aluminio Título de anticuerpo bactericida
A
C W135 Y A C W135 Y
4
2 2 2 Fosfato 256-512 1024-2048 1024-2048 4096-8192
4
2 2 2 Hidróxido 1024-2048 256-512 1024-2048 1024-2048
2
2
2
2
Fosfato 512-1024 1024-2048 128-256 8192-16384
2
2
2
2
Hidróxido 256 1024-2048 256 512-1024
4
2 1 1 Fosfato 512-1024 2048 128 2048-4096
4
2 1 0,5 Fosfato 512-1024 1024-2048 128 2048-4096
4
2 1 2 Fosfato 512-1024 2048-4096 128 8192-16384
4
2 0,5 1 Fosfato 1024-2048 8192 256-512 8192-16384
4
2 2 1 Fosfato - 2048-4096 128 4096-8192
2
2
1 1 Fosfato 1024-2048 1024-2048 256 4096-8192
2
2
1 0,5 Fosfato 1024-2048 2048-4096 256-512 2048-4096
2
2
1 2 Fosfato 512-1024 1024-2048 128 8192-16384
2
2
0,5 1 Fosfato 1024-2048 2048 256-512 4096-8192
2
2
2
1 Fosfato 128-256 512-1024 64-128 1024-2048
Se realizó un segundo conjunto de experimentos usando una dosificación de 2 µg/ml de sacárido para MenA y MenC, la mitad de esa dosificación para MenY, y una cuarta parte de la dosificación para MenW135. Los títulos ELISA fueron los siguientes:
Cantidad de antígeno (ng/dosis)
Adyuvante de aluminio ELISA GMT (intervalo de confianza del 95 %)
A
C W135 Y A C W135 Y
2
2
2
2
Fosfato 32 (15-68) 114 (53-246) 99 (35-288) 397 (252-627)
Hidróxido
206 (112-372) 163 (122-218) 139 (76-251) 141 (97-205)
2
2
1 0,5 Fosfato 96 (49-187) 238 (101-561) 42 (20-89) 315 (114-867)
Hidróxido
293 (144-597) 267 (158-451) 83 (43-163) 244 (152-392)
10 Los títulos bactericidas en suero fueron los siguientes:
21
imagen16
imagen17
L. Conjugados de oligosacárido MenA, W135 e Y
La siguiente tabla muestra los datos referidos a conjugados MenA, MenW135 y MenY adecuados para preparar composiciones de combinación de la invención:
A
W135 Y
DP después del ajuste de tamaño
16,6 21,9 21,1
Relación sacárido/proteína
0,5 1,1 0,7
KD
0,44 0,36 0,41
Sacárido libre
5 % 10 % 5 %
Proteína libre
<2 % <2 % <2 %
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35

Claims (13)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de purificación de un polisacárido capsular bacteriano, que comprende las etapas de (a) precipitación del polisacárido, (b) solubilización del polisacárido precipitado utilizando un alcohol, (c) tratamiento del polisacárido obtenido en la etapa (b) para eliminar contaminantes utilizando una o más etapas de filtración o ultrafiltración por tamaño, después, (d) precipitación del polisacárido obtenido en la etapa (c) mediante cationes de intercambio, en el que la etapa (a) utiliza uno o más detergentes catiónicos que tienen la siguiente fórmula general:
    imagen2
    en la que: R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno significa alquilo o arilo; o R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que estos están unidos forman un anillo heterocíclico saturado de 5 o 6 miembros, y R3 significa
    10 alquilo o arilo; o R1, R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al que estos están unidos forman un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros, insaturado en el átomo de nitrógeno, R4 significa alquilo o arilo, y X-significa un anión.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) utiliza bromuro de cetiltrimetilamonio.
    15 3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el alcohol utilizado en la etapa (b) comprende etanol.
  3. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que el etanol tiene una concentración final de entre el 50 % y el 95 %.
  4. 5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el polisacárido capsular bacteriano es un 20 polisacárido de meningococos y la filtración por tamaño de la etapa (c) es a través de un filtro de 0,22 μm.
  5. 6.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la precipitación de la etapa (d) es mediante la adición de sales de calcio o sodio.
  6. 7.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el polisacárido capsular bacteriano procede de
    N. meningitidis.
    25 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la N. meningitidis es del serogrupo A, W135 o Y.
  7. 9.
    El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polisacárido capsular bacteriano procede de Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.
  8. 10.
    El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente la etapa de hidrólisis para formar oligosacáridos.
    30 11. Un procedimiento de purificación y conjugación de un polisacárido capsular bacteriano a una proteína vehículo, que comprende: purificar el polisacárido mediante el procedimiento de cualquier reivindicación precedente, y la conjugación del polisacárido a una proteína vehículo.
  9. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la proteína vehículo es el toxoide diftérico o tetánico.
  10. 13.
    Un procedimiento para fabricar una mezcla, que comprende el procedimiento de cualquier reivindicación
    35 precedente y que comprende adicionalmente la etapa de mezclar el polisacárido o conjugado con otras moléculas biológicas para proporcionar la mezcla.
  11. 14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que i) las moléculas biológicas adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: antígenos sacáridos del serogrupo C de N. meningitidis y antígenos proteínicos del serogrupo B de N. meningitidis, o ii) se mezclan antígenos sacáridos de N. meningitidis de las cepas A, C, W135 y/o
    40 Y.
  12. 15.
    Un procedimiento de formulación de una vacuna, que comprende el procedimiento de cualquier reivindicación precedente y que comprende adicionalmente la etapa (o etapas) de formulación de vacuna.
  13. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que la etapa (o etapas) de formulación de vacuna comprende mezclar el antígeno (o antígenos) sacárido con un adyuvante.
    45 17. El procedimiento de la reivindicación 16, en el que el adyuvante es un fosfato de aluminio y/o un hidróxido de aluminio.
    26
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