ES2663497T3

ES2663497T3 - Inhibición de proteasas

Info

Publication number: ES2663497T3
Application number: ES06848187.8T
Authority: ES
Inventors: Robert C. Ladner
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2026-12-27
Also published as: US8828703B2; JP2009521926A; PL1981519T3; PT1981519T; US20080255025A1; CA2635589C; EP1981519A2; HUE038243T2; CA2635589A1; LT1981519T; JP5632126B2; EP1981519A4; CY1119967T1; JP2012235793A; DK1981519T3; EP1981519B1; WO2007079096A3; SI1981519T1; AU2006332774A1; WO2007079096A2

Abstract

Proteína aislada que inhibe al menos calicreína tisular humana (h.K1) y calicreína plasmática humana, comprendiendo la proteína aislada al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética, en la que al menos uno de los dominios Kunitz comprende la región de entramado del dominio Kunitz 1 del inhibidor de la ruta de factor tisular humano (TFPI), y comprende sustitución o modificación en uno o más de los residuos 11-19, 31, 32, 34 y 38-40, numerados con respecto a la secuencia de inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) proporcionada en la tabla 7.

Description

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DESCRIPCION

Inhibición de proteasas Antecedentes

Los aspectos de la patología de muchas enfermedades incluyen la actividad excesiva de proteasas. Pueden usarse agentes farmacéuticos que reducen tal actividad proteasa para mejorar estados patológicos.

Sumario

Los dominios Kunitz son inhibidores de proteasas robustos. Los ejemplos de dominios Kunitz incluyen dominios Kunitz que no se producen de manera natural que inhiben calicreína plasmática humana, plasmina humana, hepsina humana, matriptasa humana, endoteliasa humana 1 (hET-1), endoteliasa humana 2 (hET-2) y elastasa de neutrófilos humana (también conocida como elastasa leucocitaria humana). Los dominios Kunitz pueden modificarse por ingeniería genética para que tenga una afinidad y especificidad muy altas por la mayoría de las serina proteasas.

Algunas veces, en un único estado patológico, hay más de una proteasa cuya actividad es perjudicial. En diferentes pacientes, un síntoma dado puede resultar de la actividad aberrante de dos proteasas diferentes, una en un paciente, otra en otro paciente. En estos casos, sería útil tener un único agente farmacológico activo que inhiba dos o más proteasas. A menudo, los inhibidores de baja especificidad (por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña) provocan efectos secundarios graves inhibiendo proteasas distintas de las dianas previstas. Puede usarse una molécula que contiene múltiples dominios, que tienen cada uno alta afinidad y especificidad por una proteasa diferente, para proporcionar inhibición de diferentes proteasas diana sin provocar efectos secundarios debido a reacción cruzada del inhibidor con proteasa(s) distinta(s) de la(s) diana(s). Esto permite el desarrollo de un único agente para el tratamiento de pacientes con múltiples o diversas proteasas desreguladas.

En un aspecto, la divulgación presenta una proteína aislada que incluye una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética, en la que la proteína inhibe dos o más proteasas humanas, tal como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la proteína inhibe las dos o más proteasas humanas, cada una con una Ki de menos de 100 nM, 10 nM, 1 nM o 0,1 nM.

La proteína de divulgación puede comprender dos o más dominios Kunitz, cada uno de los cuales inhibe la misma proteasa y la proteína tiene una residencia en el suero más prolongada que la que tendría un único dominio Kunitz debido a la masa molecular aumentada. La proteína puede estar o no glicosilada.

La proteína puede contener un único dominio Kunitz modificado por ingeniería genética que inhibe dos o más proteasas humanas como secuencia inhibidora de proteasas modificada por ingeniería genética.

Las secuencias inhibidoras de proteasas pueden ser, por ejemplo, dominios Kunitz, péptidos (por ejemplo, péptidos cíclicos o péptidos lineales de longitud menor de 24 aminoácidos), y dominios variables de fragmentos de unión a antígeno. Por ejemplo, las secuencias inhibidoras de proteasas pueden incluir la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena pesada que se une a e inhibe una proteasa humana conjuntamente con un dominio variable de cadena ligera.

En una realización, la proteína incluye al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho dominios Kunitz, como secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. Por ejemplo, la proteína contiene dos, tres, cuatro, cinco o seis dominios Kunitz. En algunos casos, al menos uno de los dominios Kunitz comprende la región de entramado de un dominio Kunitz humano que se produce de manera natural (por ejemplo, TFPI u otra proteína humana mencionada en el presente documento), pero que difiere del dominio Kunitz humano que se produce de manera natural en no menos de un residuo en los bucles de unión a proteasas.

En una realización, la proteína tiene un peso molecular de al menos 15 kiloDaltons y/o una semivida en fase beta de al menos 30 minutos en ratones. El peso molecular de las proteínas y/o la semivida en fase beta pueden aumentarse, por ejemplo, modificando la proteína para que incluya uno o más restos PEG o uniendo covalentemente la proteína a un portador tal como seroalbúmina humana (HSA). Tal unión covalente puede lograrse mediante la reticulación covalente de la proteína y el portador tras la producción de la proteína o mediante la expresión de la proteína como una proteína de fusión con el portador.

En una realización, al menos uno de los dominios Kunitz contiene solo dos enlaces disulfuro. Por ejemplo, la proteína no incluye cisteínas en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácido 14 y 38 en el inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI).

Las proteínas a modo de ejemplo pueden inhibir:

• dos o más proteasas cuya actividad excesiva contribuye a artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad de

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Crohn, cáncer y trastorno pulmonar obstructivo crónico;

• dos o más de (por ejemplo, todas de) elastasa de neutrófilos, proteinasa 3 y catepsina G;

• dos o más de (por ejemplo, todas de) elastasa de neutrófilos humana, proteinasa 3, catepsina G y triptasa;

• calicreína plasmática humana y elastasa de neutrófilos humana;

• dos o más de (por ejemplo, todas de) calicreína humana 6 (hK6), calicreína humana 8 (hK8) y calicreína humana 10 (hK10);

• hK6 y elastasa de neutrófilos humana;

• calicreína tisular humana (h.K1) y calicreína plasmática humana

• dos o más de plasmina humana, hepsina humana, matriptasa humana, endoteliasa humana 1 y endoteliasa humana 2.

Por ejemplo, la proteína puede incluir al menos dos dominios Kunitz, un primer dominio Kunitz específico para elastasa de neutrófilos y un segundo dominio Kunitz específico para proteinasa 3. El primer dominio Kunitz puede ser N-terminal o C-terminal con respecto al segundo dominio Kunitz.

DX-88 es un inhibidor de dominio Kunitz de calicreína plasmática humana (hpKal1) y DX-890 es un inhibidor de dominio Kunitz de elastasa de neutrófilos humana (hNE). En una realización, la proteína incluye (i) DX-88, un dominio al menos el 85, el 90, el 92, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 % idéntico a DX-88, o un dominio Kunitz que incluye al menos el 70, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100 % de los residuos de aminoácido en los bucles de unión a proteasas de DX-88 y (ii) DX-890, un dominio al menos el 85, el 90, el 92, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 % idéntico a DX-890, o un dominio Kunitz que incluye al menos el 70, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100 % de los residuos de aminoácido en los bucles de unión a proteasas de DX-890.

Alternativamente, la proteína incluye al menos dos dominios Kunitz, y al menos dos de los cuales son idénticos o al menos el 90 o el 95 % idénticos. En un ejemplo, la proteína incluye al menos dos dominios Kunitz, cada uno de los cuales es DX-88, un dominio al menos el 85, el 90, el 92, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 % idéntico a DX-88, o un dominio Kunitz que incluye al menos el 70, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100 % de los residuos de aminoácido en los bucles de unión a proteasas de DX-88. En otro ejemplo, la proteína incluye al menos dos dominios Kunitz, cada uno de los cuales es DX-890, un dominio al menos el 85, el 90, el 92, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 % idéntico a DX- 890, o un dominio Kunitz que incluye al menos el 70, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% de los residuos de aminoácido en los bucles de unión a proteasas de DX-890.

En una realización, la proteína incluye al menos dos dominios Kunitz, y los dominios Kunitz difieren entre sí.

En una realización, los al menos dos dominios Kunitz está conectados por un ligador, por ejemplo, un ligador hidrófilo flexible. Por ejemplo, el ligador tiene menos de 35, 22, 15, 13, 11 o 9 aminoácidos de longitud. El ligador puede incluir al menos dos, tres o cuatro residuos de glicina. En una realización, los al menos dos dominios Kunitz están separados por un resto seroalbúmina. En otra realización, los al menos dos dominios Kunitz no están separados por un resto seroalbúmina. En una realización, los al menos dos dominios Kunitz están conectados por un ligador que no incluye epítopos de células T. Por ejemplo, los al menos dos dominios Kunitz están conectados por un ligador que carece de residuos cargados y residuos hidrófobos de medios a grandes. El ligador puede incluir o no un sitio de glicosilación. Por ejemplo, el ligador tiene menos de tres, dos o un sitio de glicosilación, es decir, ningún sitio de glicosilación. El ligador puede carecer de sitios de glicosilación unida N.

En una realización, la proteína inhibe las proteasas humanas en presencia de defensinas de neutrófilos. La proteína puede ser resistente a la degradación por proteasas residentes, por ejemplo, metaloproteasas, por ejemplo, MT6- MMP (leucolisina). Por ejemplo, la proteína no incluye sitios de escisión reconocidos por MMP-8 o MMP-12. En una realización, la proteína no inhibe ninguno de factor VIIa y factor Xa. La proteína puede diferir de bikunina humana en al menos dos aminoácidos.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de un sujeto. El método incluye administrar, al sujeto, una proteína descrita en el presente documento, por ejemplo, una proteína que incluye una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética, en el que la proteína inhibe dos o más proteasas humanas, tal como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, el sujeto es un sujeto que necesita una reducción en la actividad proteasa de al menos dos proteasas diferentes. El sujeto puede tener un trastorno al que contribuyen proteasas humanas primera y segunda y la proteína administrada inhibe las proteasas humanas primera y segunda. Por ejemplo, la proteína incluye un dominio Kunitz que inhibe específicamente la primera proteasa humana y un dominio Kunitz que inhibe específicamente la segunda proteasa humana.

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La divulgación también presenta una proteína aislada que incluye (i) un dominio Kunitz que inhibe una serina proteasa humana, y (ii) una secuencia de polipéptido que contribuye a la unión e inhibición de una proteasa humana, por ejemplo, una metaloproteasa. En un ejemplo, la proteína consiste en una única cadena polipeptídica. En otro ejemplo la proteína incluye al menos dos cadenas polipeptídicas. En una realización, una cadena polipeptídica incluye un dominio variable de cadena pesada de un fragmento de unión a antígeno y otra cadena polipeptídica incluye un dominio variable de cadena ligera de un fragmento de unión a antígeno, de manera que el fragmento de unión a antígeno se une a e inhibe una proteasa humana, por ejemplo, una metaloproteasa.

El dominio Kunitz puede ser un componente de la misma cadena polipeptídica que el dominio variable de cadena pesada del fragmento de unión a antígeno. Alternativamente, el dominio Kunitz puede ser un componente de la misma cadena polipeptídica que el dominio variable de cadena ligera del fragmento de unión a antígeno. Por ejemplo, el dominio Kunitz puede ser C-terminal con respecto a un dominio constante de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o N-terminal con respecto a un dominio variable. En otro ejemplo, un dominio Kunitz es N-terminal con respecto a un dominio de anticuerpo variable y un segundo dominio Kunitz es N- terminal con respecto al dominio constante final de la misma cadena. Los dos dominios Kunitz pueden tener la misma actividad inhibidora o diferentes actividades inhibidoras.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método para proporcionar una proteína que inhibe dos o más proteasas humanas. El método incluye: proporcionar secuencias de aminoácidos de un primer dominio Kunitz que inhibe una primera proteasa humana y un segundo dominio Kunitz que inhibe una segunda proteasa humana; proporcionar la secuencia de aminoácidos de una proteína receptora que incluye una pluralidad de dominios Kunitz; y preparar un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos modificada de la proteína receptora, en el que la proteína receptora se modifica de manera que (a) se sustituyen aminoácidos de uno de los dominios Kunitz en la proteína receptora por residuos de aminoácido que contribuyen a la unión o especificidad del primer dominio Kunitz y (b) se sustituyen aminoácidos de otro de los dominios Kunitz en la proteína receptora por residuos de aminoácido que contribuyen a la unión o especificidad del segundo dominio Kunitz.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método para proporcionar una proteína que inhibe dos o más proteasas humanas. El método incluye: proporcionar secuencias de aminoácidos de un primer dominio Kunitz que inhibe una primera proteasa humana y un segundo dominio Kunitz que inhibe una segunda proteasa humana; y preparar un polinucleótido que codifica un polipéptido en el que las secuencias que codifican los dominios Kunitz primero y segundo están en marco. Los dominios pueden estar separados por una secuencia que codifica una secuencia de ligador. En determinadas realizaciones, (a) el ligador no incluye residuos hidrófobos medios o largos, ni residuos cargados, o (b) no se forman epítopos de CMH I por aminoácidos de los dominios Kunitz primero y segundo y el ligador. Las proteasas humanas primera y segunda pueden contribuir a una única enfermedad humana.

Estos métodos pueden incluir además expresar el polinucleótido preparado en una célula, por ejemplo, una célula en un animal transgénico (por ejemplo, una célula mamaria), o una célula huésped cultivada. El método puede incluir además formular una proteína codificada por el polinucleótido preparado como una composición farmacéutica.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de artritis reumatoide. El método incluye: administrar, al sujeto que tiene o se sospecha que tiene artritis reumatoide, una cantidad eficaz de una proteína que comprende una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la proteína inhibe tanto calicreína plasmática humana como calicreína tisular humana.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de inflamación pulmonar. El método incluye: administrar, a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene inflamación pulmonar, una cantidad eficaz de una proteína que comprende una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la proteína inhibe dos o más de elastasa de neutrófilos humana, proteinasa 3, catepsina G y triptasa.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de esclerosis múltiple. El método incluye: administrar, a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene esclerosis múltiple, una cantidad eficaz de una proteína que comprende una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la proteína inhibe dos o más de calicreína humana 6 (hK6), calicreína humana 8 (hK8) y calicreína humana 10 (hK10).

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de lesión de la médula espinal. El método incluye: administrar, a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene lesión de la médula espinal, una cantidad eficaz de una proteína que comprende una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la proteína inhibe ambas de hK6 y elastasa de neutrófilos humana.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de trastorno pulmonar obstructivo crónico. El método incluye: administrar, a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene trastorno pulmonar obstructivo crónico, una cantidad eficaz de una proteína que comprende una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la proteína inhibe dos o más de elastasa de neutrófilos humana, PR3

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y catepsina G.

En otro aspecto, la divulgación presenta un método de tratamiento de una enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa). El método incluye: administrar, a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene enfermedad de Crohn, una cantidad eficaz de una proteína que comprende una o más secuencias inhibidoras de proteasas modificadas por ingeniería genética. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína tisular humana (hK1) y calicreína plasmática humana.

En otro aspecto, la divulgación presenta una proteína que comprende un dominio Kunitz modificado por ingeniería genética que inhibe una proteasa humana, en la que el dominio Kunitz carece del disulfuro 14-38 encontrado en la mayoría de los dominios Kunitz que se producen de manera natural. En algunas realizaciones, la proteasa se selecciona del grupo que consiste en calicreína plasmática, elastasa de neutrófilos humana, plasmina u otra proteasa descrita en el presente documento. En una realización, los bucles de unión del dominio Kunitz son idénticos a los bucles de unión de DX-88, DX-890 o DX-1000, o al menos el 80, el 85, el 90 o el 95 % idénticos. En una realización, el dominio Kunitz es al menos el 85, el 90, el 95 o el 100 % idéntico a DX-88, DX-890 o DX-1000, pero no incluye cisteínas en las posiciones correspondientes a cisteína 14 y cisteína 38 de BPTI.

En otro aspecto, la divulgación presenta una colección de polinucleótidos. La colección incluye una pluralidad de polinucleótidos, cada uno de los cuales comprende una secuencia que codifica un dominio Kunitz que carece de cisteínas en las posiciones correspondientes a la posición 14 y 38 de BPTI. Los polinucleótidos de la pluralidad varían de manera que uno o más residuos en los bucles de unión primero y/o segundo de los dominios Kunitz difieren entre los polinucleótidos de la pluralidad. En una realización, los codones que codifican las posiciones 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34, 39 y 40 (numerados con respecto a la secuencia de BPTI) varían.

En otro aspecto, la divulgación presenta un polinucleótido que codifica un polipéptido que incluye al menos dos dominios Kunitz que difieren en no más del 80, el 85, el 90, el 95, el 98 %. Las secuencias de polinucleótido que codifican los dominios Kunitz usan diferentes codones en las posiciones correspondientes a uno o más residuos que son idénticos entre los al menos dos dominios Kunitz. Las secuencias de aminoácidos de los dominios Kunitz pueden ser idénticas. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de los dominios Kunitz son idénticas, aunque las secuencias de polinucleótido que codifican los dominios Kunitz idénticos difieren en al menos diez o veinte codones. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican el dominio Kunitz son menos del 90, el 80, el 70, el 60 o el 50 % idénticas.

Es posible modificar por ingeniería genética proteínas que contienen múltiples dominios Kunitz, por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis dominios Kunitz. Cada dominio Kunitz se modifica por ingeniería genética para tener alta afinidad y especificidad por una o más serina proteasas de manera que la proteína resultante pueda inhibir de una a varias proteasas con alta afinidad y especificidad. Además, el tamaño de la proteína modificada por ingeniería genética puede ser tal que el tiempo de vida en suero se potencia (por ejemplo, incluyendo residuos de aminoácido fuera de los dominios Kunitz para aumentar el peso molecular de la proteína). Puede usarse cualquier método para modificar por ingeniería genética una proteína con múltiples dominios Kunitz. Los ejemplos incluyen fusionar diferentes dominios y seleccionar uno o más dominios de una colección de dominios Kunitz variados.

En un aspecto de la divulgación, se construye una colección de dominios Kunitz que carecen del disulfuro 14-38 y se seleccionan inhibidores de alta afinidad. Por ejemplo, la colección incluye variaciones en una o más posiciones en los bucles de unión primero y/o segundo de los dominios Kunitz. Por ejemplo, las posiciones 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34, 38, 39 y 40 con respecto a la secuencia de BPTI varían. En otros aspectos, la divulgación comprende la construcción de diversidad genética que codifica secuencias de aminoácidos constantes o casi constantes para evitar la inestabilidad genética, por ejemplo, recombinación entre secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes segmentos de la proteína.

El documento US 6.583.108 (también publicado como documento WO 97/33996) notifica la proteína bikunina, y variantes y fragmentos de la misma.

Descripción detallada

Varios trastornos implican múltiples proteasas (Churg y Wright, 2005, Curr Opin Pulm Med, 11:153-9), y por tanto proteínas que inhibieran al menos dos proteasas humanas serían agentes farmacológicos útiles para tratar (por ejemplo, mejorar y/o prevenir) tales trastornos. Tales proteínas pueden incluir uno o más dominios Kunitz, u otras secuencias que inhiben proteasas.

Algunos de estos trastornos están asociados con la actividad proteasa excesiva de serina proteasas diferentes. En tales casos, los sitios catalíticos de cualquier par de serina proteasas pueden diferir lo suficiente como para que ningún dominio Kunitz individual pueda unirse a ambas proteasas con afinidad útil. Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento composiciones que incluyen dos o más dominios Kunitz, en las que la composición incluye al menos dos dominios Kunitz diferentes modificados por ingeniería genética (o dominios Kunitz con diferentes especificidades) unidos por medio de una unión covalente. Los dominios Kunitz se unen normalmente

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por medio de un enlace peptídico (aunque debe entenderse que no es necesario que los dominios Kunitz estén unidos directamente por un enlace peptídico en el sentido de que el extremo carboxilo terminal de un dominio Kunitz se una directamente por medio de un enlace peptídico al extremo amino terminal de otro dominio Kunitz); un ligador de uno o más aminoácidos puede separar los dominios Kunitz). Un ligador peptídico puede ser de cualquier longitud deseada, pero en algunas realizaciones el ligador tiene un tamaño limitado, por ejemplo, menos de 35, 22, 15, 13, 11 o 9 aminoácidos de longitud. El ligador puede incluir al menos dos, tres o cuatro residuos de glicina.

En una realización, los al menos dos dominios Kunitz no están separados por un resto seroalbúmina. En una realización, los al menos dos dominios Kunitz están conectados por un ligador que no incluye epítopos de células T. Por ejemplo, los al menos dos dominios Kunitz están conectados por un ligador que carece de residuos cargados y residuos hidrófobos de medios a grandes. El ligador puede incluir o no un sitio de glicosilación. Por ejemplo, el ligador tiene menos de tres, dos o un sitio de glicosilación, es decir, ningún sitio de glicosilación. El ligador puede carecer de sitios de glicosilación unida a N.

En algunas realizaciones, se producen proteínas que comprenden múltiples dominios Kunitz modificados por ingeniería genética diferentes transfiriendo los determinantes de unión de un dominio Kunitz modificado por ingeniería genética a una proteína receptora que incluye de manera natural una pluralidad de dominios Kunitz (por ejemplo, modificando las secuencias que se producen de manera natural mediante referencia a una secuencia modificada por ingeniería genética para producir una proteína que comprende al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética (o dominios Kunitz con diferentes especificidades).

Si dos o más serina proteasas son similares, puede seleccionarse un dominio Kunitz que inhibe todas las serina proteasas diana, por ejemplo, inhibe cada proteasa diana con una Ki de menos de 10 nM. Tal como se usa en el presente documento, dos serina proteasas son “similares” si los aproximadamente 20 residuos que corresponden a los residuos de tripsina que tocan BPTI en el complejo tripsina-BPTI son el 80 % idénticos. Tal como se entenderá, la probabilidad de obtener un único dominio Kunitz que inhibe dos o más serina proteasas diana aumenta con el aumento de la identidad entre las proteasas diana. En algunas realizaciones, proteínas que comprenden dominios Kunitz con especificidad por más de una proteasa tienen una Ki de menos de 100 nM, 10 nM, 1 nM o 0,1 nM para cada una de las proteasas diana.

Adicionalmente, en algunas realizaciones, la proteína comprende un dominio Kunitz unido a un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo, tal como Fab, (Fab)2, scFv, Fd, Fv) o péptido distinto de dominio Kunitz que se une a e inhibe una serina proteasa.

Algunos trastornos implican no solo serina proteasas, sino otros tipos de proteasas también (por ejemplo, metaloproteasas, tales como las metaloproteasas de la matriz, o MMP, o cisteína proteasas). Por consiguiente la invención también proporciona proteínas que comprenden al menos un dominio Kunitz unido a al menos un péptido o una proteína que inhibe una metaloproteasa o una cisteína proteasa. Las proteínas a modo de ejemplo que inhiben metaloproteasas son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos (por ejemplo, Fab, (Fab)2, scFv, Fd, Fv) que se unen a e inhiben metaloproteasas, particularmente los que se unen a e inhiben miembros de la familia de metaloproteasas de la matriz (MMP). Proteínas a modo de ejemplo que inhiben cisteína proteasas son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno o derivados de los mismos (Fab, (Fab)2, scFv, Fd, Fv) que se unen a e inhiben cisteína proteasas, particularmente los que se unen a e inhiben miembros de la familia de catepsinas (por ejemplo catepsina L y/o catepsina W).

Las fusiones entre una única o múltiples secuencias que contienen dominio Kunitz y un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno o derivado del mismo) pueden estar en cualquier configuración, tal como fusión de la secuencia que contiene dominio Kunitz a: a) el extremo N-terminal de la cadena ligera de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo de longitud completa, b) el extremo C-terminal de la cadena ligera de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo de longitud completa, c) el extremo N-terminal de la cadena pesada de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo de longitud completa, o d) el extremo C-terminal de la cadena pesada de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo de longitud completa. Los anticuerpos pueden disponerse como Fab, (Fab)2, scFv, Fd, Fv. Por ejemplo, puede ser suficiente usar una proteína que incluye el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada.

Los péptidos que inhiben también pueden incorporarse en las proteínas de la invención. Tales péptidos inhibidores pueden fusionarse a un dominio Kunitz o a una proteína que contiene múltiples dominios Kunitz y cualquier componente de anticuerpo o albúmina que garantizará una residencia prolongada en la sangre. Los péptidos que inhiben metaloproteinasas podrían fusionarse a cualquier extremo de una proteína que contiene uno o más dominios Kunitz terapéutico. Otra configuración a modo de ejemplo es la inserción de un péptido inhibidor entre dominios Kunitz (por ejemplo, el péptido puede usarse para reemplazar a un ligador entre dominios Kunitz en una versión modificada por ingeniería genética de TFPI humano, o puede usarse como ligador para conectar dos dominios Kunitz separados).

Pueden identificarse anticuerpos y/o péptidos que se unen a proteasas mediante selección de colecciones de anticuerpos o péptidos con la proteasa diana (por ejemplo, documento U.S. 2005/0180977 y Huang et al., J Biol

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Chem. 2003, 278:15532-40). Tal selección está acoplada normalmente con una etapa de examen para identificar los miembros de la colección que inhiben la proteasa diana también. Tales métodos son similares a los métodos de selección y examen divulgados en el presente documento, tal como entenderán los expertos en la técnica.

Tal como se denomina en el presente documento, una secuencia de proteína “modificada por ingeniería genética” (por ejemplo, un dominio Kunitz modificado por ingeniería genética) es una proteína que tiene una secuencia que no se produce de manera natural. En algunas realizaciones, un dominio Kunitz modificado por ingeniería genética variará con respecto a un dominio Kunitz que se produce de manera natural en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse usando BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410), particularmente BLAST 2 Sequences tal como describen Tatusova y Madden (1999, FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250) y tal como lo implementa el National Center for Biotechnology Information (disponible por medio de Internet en ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi). Los parámetros para la comparación de dos secuencias de nucleótidos (por ejemplo, BLASTN) son recompensa por una coincidencia: 1; penalización por una falta de coincidencia:-2; penalización por hueco abierto: 5; penalización por extensión de huecos: 2; gap x_dropoff: 50; expectativa: 10,0; tamaño de palabra: 11. Los parámetros para la comparación de dos secuencias de aminoácidos (por ejemplo, BLASTP) son matriz: BLOSUM62; penalización por hueco abierto: 11; penalización por extensión de hueco: 1; gap x_dropoff: 50; expectativa: 10,0; y tamaño de palabra 3.

Tal como se usa en el presente documento, la referencia a hibridación en condiciones de “rigurosidad baja”, “rigurosidad media”, “rigurosidad alta” o “rigurosidad muy alta” describe condiciones para la hibridación y el lavado. Puede encontrarse orientación para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y puede usarse cualquiera. Condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en el presente documento son las siguientes: (a) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados puede aumentarse hasta 55 °C para condiciones de rigurosidad baja); (b) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 60 °C; (c) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en 6x SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C; y (d) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta son fosfato de sodio 0,5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 1 % a 65 °C.

Dominios Kunitz

Un “dominio Kunitz” es un dominio polipeptídico que tiene al menos 51 aminoácidos y que contiene al menos dos, y quizá tres, disulfuros. El dominio se pliega de manera que las cisteínas primera y sexta, la cisteína tercera y quinta, y opcionalmente la segunda y la cuarta forman enlaces disulfuro (por ejemplo, en un dominio Kunitz que tiene 58 aminoácidos, pueden estar presentes cisteínas en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 5, 14, 30, 38, 51 y 55, según el número de la secuencia de BPTI proporcionado a continuación, y pueden formarse disulfuros entre las cisteínas en la posición 5 y 55, 14 y 38, y 30 y 51), o, si están presentes dos disulfuros, pueden formar entre 5 y 55 y 30 y 51. La separación entre las respectivas cisteínas puede estar dentro de 7, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de la siguiente separación entre las posiciones correspondientes a: 5 a 55, 14 a 38 y 30 a 51, según la numeración de la secuencia de BPTI proporcionada en el presente documento (tabla 7). La secuencia de BPTI puede usarse como referencia para referirse a posiciones específicas en cualquier dominio Kunitz genérico. La comparación de dominios Kunitz de interés con BPTl puede realizarse identificando la alineación de mejor ajuste en la que el número de cisteínas alineadas se maximiza.

Se conoce la estructura tridimensional (a alta resolución) del dominio Kunitz de BPTI. Una de las estructuras de rayos X de BPTI está depositada en el Brookhaven Protein Data Bank como “6PTI”. Se conoce asimismo la estructura tridimensional de algunos homólogos de BPTI (Eigenbrot et al., (1990) Protein Engineering, 3(7):591-598; Hynes et al., (1990) Biochemistry, 29:10018-10022). Se conocen al menos veinte secuencias de dominio Kunitz naturales. Los homólogos humanos conocidos incluyen tres dominios Kunitz de TFPI (Wun et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(13):6001-6004; Girard et al., (1989) Nature, 338:518-20; Novotny et al, (1989) J. Biol. Chem., 264(31):18832-18837; en algunas de estas referencias, TFPI se identifica LACI (inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas) o EPI (inhibidor de la ruta extrínseca)), dos dominios Kunitz de inhibidor de inter-a-tripsina, APP-I (Kido et al., (1988) J. Biol. Chem., 263(34):18104-18107), un dominio Kunitz de colágeno y tres dominios Kunitz de TfPI-2 (Sprecher et al., (1994) PNAS USA, 91:3353-3357). TFPI es una glicoproteína sérica humana con un peso molecular de 39 kDa (secuencia de aminoácidos en la tabla 1) que contiene tres dominios Kunitz.

Los dominios Kunitz interaccionan con la proteasa diana usando, principalmente, aminoácidos en dos regiones de bucle (“bucles de unión”). La primera región de bucle está entre aproximadamente los residuos correspondientes a los aminoácidos 11-21 de BPTI. La segunda región de bucle está entre aproximadamente los residuos correspondientes a los aminoácidos 31-42 de BPTI. Una colección a modo de ejemplo de dominios Kunitz varía en una o más posiciones de aminoácido en las regiones de bucle primera y/o segunda. Las posiciones particularmente

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útiles de variar incluyen: posiciones 13, 15, 16, 17, 18,19, 31, 32, 34 y 39 con respecto a la secuencia de BPTI. Se espera que al menos algunas de estas posiciones estén en contacto estrecho con la proteasa diana.

La “región de entramado” de un dominio Kunitz se define como los residuos que son parte del dominio Kunitz, pero excluyendo específicamente residuos en las regiones de bucles de unión primera y segunda, por ejemplo, aproximadamente los residuos correspondientes a los aminoácidos 11-21 de BPTI y 31-42 de BPTI. La región de entramado puede derivarse de un dominio Kunitz humano, por ejemplo, dominio 1 de TFPI. Las regiones de entramado a modo de ejemplo pueden incluir al menos una, dos o tres lisinas. En una realización, las lisinas están presentes en las posiciones correspondientes a las posiciones encontradas en la región de entramado de LACI, o dentro de al menos tres, dos o un aminoácido de tal posición.

A la inversa, los residuos que no están en estas posiciones particulares o que no están en las regiones de bucle pueden tolerar una gama más amplia de sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas y/o no conservativas) que estas posiciones de aminoácido.

BPTI es el dominio Kunitz prototípico con 58 aminoácidos y residuos de cisteína en la posición 5, 14, 30, 38, 51 y 55. Éstas forman los disulfuros 5:55, 14:38 y 30:51.

Hay residuos de fenilalanina en 33 y 45 en casi todos los dominios Kunitz. Hay residuos de glicina en las posiciones 12 y 37 en casi todos los dominios Kunitz. Existe la posibilidad de un residuo extra entre las posiciones 9 y 10, denominado 9a. Si está presente 9a, no es necesario que 12 sea glicina. Se observa la inserción de hasta tres residuos después de la posición 26 en algunos dominios Kunitz naturales; estos residuos insertados pueden numerarse como 26a, 26b y 26c. Se observa la inserción de hasta tres residuos después de la posición 42 en algunos dominios Kunitz naturales (numerados 42a, 42b y 42c). Se observan residuos de cisteína distintos de los nombrados (por ejemplo, tal como se observa en bungarotoxina) y pueden conducir a disulfuros que unen el dominio Kunitz a otras proteínas.

La mayoría de los dominios Kunitz tienen 58 aminoácidos con Cys en las posiciones 5, 14, 30, 38, 51 y 55. Estos dominios se denominan “dominios Kunitz canónicos” en el presente documento. Todos los dominios Kunitz canónicos tienen esencialmente estructuras tridimensionales de cadena principal idénticas. El primer dominio Kunitz de TFPI es un dominio Kunitz canónico. Se ha construido una colección de presentación en fagos de dominios Kunitz de TFPI-K1 (véase, por ejemplo, el documento U.S. 6.333.402). Además, es posible seleccionar un dominio Kunitz que tiene la región de entramado de TFPIK1 para la unión a una proteasa diana particular. Luego los residuos 13, 15-21, 34, 39-40 pueden transferirse a cualquier otro dominio Kunitz canónico de manera que el dominio Kunitz receptor obtiene afinidad por la proteasa diana particular.

Una clase de dominios Kunitz no canónicos tiene un aminoácido extra en la posición 9a. En esta clase de dominios Kunitz, no es necesario que el residuo 12 sea glicina y la estructura tridimensional en esa región es diferente de la de dominios Kunitz canónicos. En TFPI-2, el segundo dominio Kunitz tiene esta característica no canónica. Para volver a modificar por ingeniería genética el dominio Kunitz 2 de TFPI-2, una realización preferida es construir una colección de dominios Kunitz 2 de TFPI-2 y seleccionar las propiedades de unión deseadas. Alternativamente, podrían cambiarse los residuos 8-12 y 39-43 para que fuesen canónicos. Es decir, se delecionaría S9a y se cambiaría D12 a G. En 13 y 39 se pondrían los aminoácidos necesarios para la unión y se cambiarían 40-45 a GNANNF puesto que estos son los aminoácidos más comunes en esas posiciones.

Cuando un dominio Kunitz se une a una serina proteasa, solo un pequeño número de los aminoácidos del dominio Kunitz entran en contacto con la serina proteasa. El número exacto depende de la serina proteasa y el dominio Kunitz, pero está habitualmente en el intervalo de 12 a 20. En el caso de BPTI y tripsina, 13 residuos (T11, G12, P13, C14, K15, A16, R17, I18, I19, G36, G37, C38 y R39) de BPTI tienen al menos un átomo situado dentro de 4 A de un átomo en tripsina. Los residuos 12, 14, 16, 37 y 38 están altamente conservados en dominios Kunitz canónicos. En BPTI, el residuo 34 es valina que se encuentra dentro de 5 A de un átomo de tripsina. La carga (o la falta de la misma) y/o una cadena lateral voluminosa en esta posición podría influir en la unión, por tanto la sustitución de un residuo grande o cargado en 34 podría influir en la unión.

Hay aproximadamente 20 residuos de tripsina (usando la numeración de quimotripsinógeno) que se encuentran dentro de 4 A de un átomo en BPTI: Y39, H40, F41, C42, H57, N97, L99, Y151, D189, S190, C191, Q192, G193, D194, S195, S214, W215, G216, G219 y G226. De estas posiciones, C42, H57, G193, D194, S195, S214, están absolutamente conservadas entre serina proteasas homólogas a tripsina. Las posiciones 39, 41, 97, 99, 151 y 192 son altamente variables. La posición 40 es a menudo histidina pero muestra considerable variabilidad. La posición 189 es lo más a menudo D, pero pueden aparecer S, G, A y T en serina proteasas conocidas. La posición 190 es a menudo S, pero se observan G, V, T, A, I y P. La posición 191 es lo más a menudo C, pero se observan F e Y. La posición 215 es lo más a menudo W, pero se observan F, Y, G, N, S y K. La posición 216 es lo más a menudo G, pero se observan V, S y K. La posición 219 es lo más a menudo G, pero se observan S, T, E, P, D, N y T, así como deleción del residuo. La posición 226 es a menudo G, pero se observan T, D, S, E y A. Estos residuos son los más directamente responsables de la especificidad de sustrato de una serina proteasa particular porque entran en contacto con el sustrato. Para otras proteasas, el de aminoácidos que entrarían en contacto con un dominio Kunitz

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BPTI y otros dominios Kunitz inhiben serina proteasas uniéndose en el sitio catalítico de la proteasa pero resistiendo la escisión y liberación. Para que un dominio Kunitz inhiba una serina proteasa, debe ajustarse fuertemente al sitio catalítico. En algunos casos, el enlace entre el residuo 15 del dominio Kunitz y el residuo 16 se escinde, pero el dominio Kunitz escindido no se libera de la proteasa.

BPTI no es especialmente específico e inhibe una variedad de serina proteasas con afinidad mejor de 10 nM. Por ejemplo, sus afinidades por diferentes proteasas son: (calicreína de orina humana (4 nM), calicreína pancreática porcina (0,55 nM), plasmina humana (0,89 nM), proteína C activada (1 |iM) (Taby, et al., 1990, Thromb Res, 59:27- 35) trombina (30 |iM) (Pintigny y Dachary-Prigent, 1992, Eur J Biochem, 207:89-95) y tripsina bovina (0,06 pM)).

Otros dominios Kunitz pueden ser altamente específicos. Por ejemplo, DX-88 inhibe calicreína plasmática humana con Kd « 30 pM mientras que su afinidad por (calicreína de orina humana (>100 |iM), calicreína pancreática porcina (27 |iM), C1ractivada humana (> 20 |iM), C1sactivada (>20 |iM), plasmina humana (137 nM), elastasa de neutrófilos humana (>20 |iM), F.XIIa plasmático humano (>20 |iM), F.XIa plasmático humano (10 nM), trombina humana (>20 |iM), tripsina humana (>20 |iM) y quimotripsina humana (>20 |iM)) es menor en un factor de al menos 250.000. La secuencia de aminoácidos de DX-88 se muestra en la tabla 5 y el ADN que codifica DX-88 se muestra en la tabla 6. La tabla 8 muestra el gen de DX-88 con sitios de restricción.

Se divulgan además dominios Kunitz modificados por ingeniería genética en la patente estadounidense n.° 6.333.402, 5.663.143, 6.953.674.

Un dominio Kunitz puede estar ubicado dentro de una proteína más grande, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias N- y/o C-terminales con respecto al dominio Kunitz.

TFPI: La secuencia del inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI; también denominado LACI) (GeneBank NM_006287) se muestra en la tabla 3. La cinética de la unión de TFPI al factor Xa se publicó en 1993 (Huang, et al., 1993, J Biol Chem, 268:26950-5). Se conocen las secuencias de proteínas TFPI para Danio rerio (pez cebra), Canis familiaris (perro), Macaca mulatta (macaco de la India), Oryctolagus cuniculus (conejo), Pan troglodytes (chimpancé), Mus musculus (ratón), Gallus gallus (pollo) y Homo sapiens (ser humano). TFPI contiene tres dominios Kunitz. El primer dominio Kunitz se une a e inhibe el factor VIIa en el complejo de factor VIIa/factor tisular, el dominio Kunitz 2 se une a e inhibe el factor Xa, y el dominio Kunitz 3 está implicado en la unión a células (Piro y Broze, 2004, Circulation, 110:3567-72). La unión a células por el dominio Kunitz 3 puede reducirse cambiando la arginina P1 a leucina (Piro y Broze, 2004, Circulation, 110:3567-72).

TFPI humano puede modificarse para proporcionar una proteína modificada por ingeniería genética que inhibe al menos dos proteasas humanas diferentes (por ejemplo, proteasas distintas de factor VIIa y factor Xa) y que tiene una pluralidad de dominios Kunitz. Muchas de las proteínas modificadas de la presente invención serán muy similares a TFPI humano. Una proteína que incluye TFPI o sus dominios Kunitz puede alterarse de modo que no se une a células ya que la unión de un polipéptido a superficies celulares puede aumentar la antigenicidad (Leonetti, et al., 1998, J Immunol, 160:3820-7). Por ejemplo, la modificación de TFPI humano para delecionar el péptido C-terminal GGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM al tiempo que se retiene el dominio Kunitz 3 reduce la unión a células y otros acontecimientos de señalización celular consecuentes. En una realización preferida, la proteína terapéutica no tiene efecto sobre la expresión de ningún gen y no se une a células.

Mine et al. (Biochemistry (2002) 41:78-85) han notificado que tres residuos de lisina en el tercer KuDom de TFPI (que corresponde a K241, K260 y K268 en la tabla 1) forman una agrupación cargada positivamente que puede unirse a heparina y promover la unión a células. En una realización de la invención, uno o más de K241, K260 y K268 se cambian a un aminoácido que no está cargado positivamente. En la posición 29, K es el tipo de AA más común y Q es el segundo más común, por tanto K241Q es una mutación preferida para la eliminación de la carga positiva en KuDom 3 de TFPI. En la posición 48, E es el tipo de AA más común. Por tanto K260E es una mutación preferida para la eliminación de la carga positiva en KuDom 3 de TFPI. En la posición 56, G es el tipo de AA más común. Por tanto K268G es una mutación preferida para la eliminación de la carga positiva en KuDom 3 de TFPI. La eliminación de al menos una de las tres lisinas reducirá la posibilidad de que la variante de TFPI se una a glucosaminoglucanos.

TFPI se escinde en sitios particulares por metaloproteinasas, por ejemplo, por MMP-8 tras S174 y tras K20. P18, L19 y L21 conforman el sustrato 3 en la tabla 42. En una realización, la proteína usada se basa en TFPI, pero incluye modificaciones en las secuencias de ligador para impedir la escisión por MMP. Por ejemplo, los sitios de escisión por MMP se cambian para evitar tal escisión. En determinados casos se alteran S174 y K20, por ejemplo, a alanina. En otra realización, los sitios se dejan tal cual. En la mayoría de los casos, los dominios Kunitz modificados por ingeniería genética tendrán una afinidad muy alta por sus dianas, por tanto puede no ser necesaria la modificación por ingeniería genética de proteínas basadas en TFPI para reducir o eliminar la sensibilidad a la digestión por MMP.

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TFPI por sí mismo no tiene una afinidad especialmente alta por el factor Xa y el factor VIIa. Petersen et al. (Petersen, et al., 1996, Eur J Biochem, 235:310-6) notifican que el dominio Kunitz 1 se une al factor VIIa/TF con Kd = 250 nM y el dominio Kunitz 2 se une al factor Xa con Kd = 90 nM. Las proteínas con dominio Kunitz modificado por ingeniería genética basadas en TFPI tendrán una afinidad mucho más alta por sus dianas (por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética dominios Kunitz de TFPI para aumentar la afinidad por el factor Xa y el factor VIIa hasta una Kd de menos de o igual a 10 nM o 1 nM). El segmento C-terminal básico (ligador 4) también está implicado en la unión al F.Xa (Cunningham, et al., 2002, Biochem J, 367:451-8). Por ejemplo, una proteína descrita en el presente documento tiene una Kd de más de 10 nM o 100 nM para uno o ambos de factor VIIa y factor Xa.

TFPI-2: La secuencia de aminoácidos de TFPI-2 se muestra en la tabla 11. Obsérvese que el segundo dominio Kunitz no es canónico, teniendo un residuo 9a y residuos 42a y 42b. Los ligadores son más cortos que en TFPI. El ligador C-terminal es bastante básico, pero los ligadores 1, 2, y 3 son mucho más cortos que los ligadores correspondientes en TFPI. TFPI-2 puede modificarse por ingeniería genética para que sea un inhibidor de proteasas múltiples remodelando el dominio Kunitz 1 y el dominio Kunitz 3 del mismo modo que se remodelan los dominios Kunitz de TFPI en los ejemplos 2, 3 y 5. El dominio Kunitz 2 o bien podría forzarse para que fuera canónico o bien podría prepararse una colección de derivados de dominio Kunitz 2, seleccionar un miembro que tiene las propiedades de unión deseadas y remodelar el dominio Kunitz 2 según se necesitase. TFPI-2, como TFPI, se une a superficies celulares. Los derivados de TFPI-2 preferidos se modifican para suprimir la unión a células y los efectos sobre la expresión génica.

La tabla 12 muestra una secuencia de ADN que podría provocar la presentación del dominio Kunitz 2 de TFPI-2 sobre el muñón de M13 III en el fago derivado de M13. La secuencia del vector de fago original se muestra en la tabla 13. Los sitios de restricción que se unieron al casete de presentación de la tabla 12 están en negrita en la tabla 13. Para generar una colección de dominios Kunitz 2 de TFPI-2, se sintetiza el ADN entre PstI y SspEI con la diversidad mostrada en la tabla 12. La tabla 14 muestra oligonucleótidos (ON) que pueden usarse para esta síntesis. ON1U96 y ON71L97 son complementarios en sus extremos 3' en donde están subrayados. ON1U21T2 y ON147L21 son idénticos a los extremos 5' de los oligonucleótidos largos y pueden usarse para cebar la amplificación por PCR de los oligonucleótidos largos. Hay sitios PstI y SspEI cerca de los extremos del producto final. El ADN bicatenario se corta con PstI y SspEI y se liga con un vector escindido de manera similar. La diversidad teórica de la colección

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es de 6,7 x 10 secuencias de aminoácidos. Las colecciones reales pueden incluir al menos 10 , 10 o 10 transformantes. También podría usarse mutagénesis basada en codones para sintetizar las mezclas mostradas en la tabla 12.

Inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos 1 y 2: Ejemplos adicionales de una proteína de mamífero que incluye múltiples dominios Kunitz son: inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos 1 (HAI-1) e inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos 2 (HAI-2). Cada uno contiene dos dominios Kunitz.

HAI-1 y HAI-2 son proteínas unidas a células. Pueden prepararse derivados que no están asociados con células, por ejemplo, produciendo una forma de la proteína que incluye solo el dominio Kunitz y secuencias intermedias. Las regiones de HAI-1 y HAI-2 responsables de la unión a células pueden inactivarse, por ejemplo, mediante deleción.

Sikunina: La tabla 39 muestra cuatro secuencias de aminoácidos para “bikunina humana” notificadas en el documento US 6.583.108 (la patente 108, también publicada como documento WO 97/33996). Las SEQ ID NO de del documento 108 se muestran como “SEQ_ID_NO:2”, “SEQ_ID_NO:45” y “SEQ_ID_NO:47” y tienen diferencias en la secuencia señal y en la secuencia de aminoácidos que sigue al segundo dominio Kunitz. La tabla 38 muestra datos de afinidad de la patente 108 para los dos dominios Kunitz de bikunina contra una variedad de serina proteasas.

Dianas de proteasas

Las proteasas están implicadas en una amplia variedad de procesos biológicos, incluyendo inflamación y lesión tisular. Las serina proteasas producidas por células inflamatorias, incluyendo neutrófilos, están implicadas en diversos trastornos, tales como enfisema pulmonar. Como tales, múltiples proteasas diferentes pueden contribuir a un único trastorno.

Los ejemplos de proteasas particulares incluyen las siguientes. La elastasa de neutrófilos es una serina proteasa producida por leucocitos polimorfonucleares con actividad contra componentes de la matriz extracelular y patógenos. El enfisema pulmonar se caracteriza por destrucción alveolar que conduce a una alteración importante de la función pulmonar. La elastasa de neutrófilos humana consiste en aproximadamente 238 residuos de aminoácido, contiene 2 cadenas laterales de hidratos de carbono unidas a asparagina, y está unida entre sí por 4 enlaces disulfuro (entrada de GeneBank P08246). Se sintetiza normalmente en el neutrófilo en desarrollo como una proenzima pero se almacena en los gránulos primarios en su forma activa, lista con actividad enzimática completa cuando se libera de los gránulos, normalmente en sitios de inflamación (Gullberg U, et al. Eur J Haematol. 1997; 58:137-153; Borregaard N, Cowland JB. Blood. 1997; 89:3503-3521).

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Otras dianas de proteasas a modo de ejemplo incluyen: plasmina, calicreína tisular, calicreína plasmática, factor VIIa, factor XIa, trombina, urocinasa, tripsina 1, tripsina 2, quimotripsina pancreática, elastasa pancreática, triptasa y factor IIa. Las clases de proteasas relevantes incluyen: proteasas asociadas con la coagulación sanguínea, proteasas asociadas con fibrinólisis, proteasas asociadas con el complemento, proteasas que digieren componentes de la matriz extracelular, proteasas que digieren membranas basales y proteasas asociadas con células endoteliales. Por ejemplo, la proteasa es una serina proteasa. Pueden modificarse por ingeniería genética proteínas descritas en el presente documento que inhiben una o más proteasas para que inhiban una o más proteasas dentro de estas clases.

Identificación de dominios Kunitz y otros inhibidores de proteasas

Pueden usarse una variedad de métodos para identificar un dominio Kunitz que se une a y/o inhibe una proteasa, por ejemplo, una proteasa humana. Estos métodos pueden usarse para identificar dominios Kunitz que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural que pueden usarse como componentes de una proteína que inhibe una pluralidad de proteasas, por ejemplo, una pluralidad de proteasas humanas. Otros inhibidores de proteasas pueden identificarse de manera similar, por ejemplo, variando inhibidores de proteasas o proteínas resistentes a proteasa conocidos, usando colecciones de péptidos o proteínas aleatorizados, o usando colecciones de anticuerpos por ejemplo, tal como se describe en el documento US 2004-0071705 (incluyendo 102-112). Tal como entenderán los expertos en la técnica, aunque la descripción de métodos de identificación de inhibidores de proteasas en el presente documento se dirigen en gran medida hacia dominios Kunitz, los métodos pueden adaptarse para identificar inhibidores de proteasas basados en péptidos o basados en anticuerpos.

Por ejemplo, puede identificarse un dominio Kunitz a partir de una colección de proteínas en la que cada uno de una pluralidad de miembros de la colección incluye un dominio Kunitz variado. Pueden variarse diversos aminoácidos en el dominio. Véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 5.223.409; U.S. 5.663.143 y U.S. 6.333.402. Los dominios Kunitz pueden variarse, por ejemplo, usando mutagénesis de ADN, intercambio de ADN, síntesis química de oligonucleótidos (por ejemplo, usando codones como subunidades) y clonación de genes naturales. Véanse, por ejemplo, los documentos U.S. 5.223.409 y U.S. 2003-0129659.

Pueden generarse colecciones de dominios Kunitz variando uno o más residuos de aminoácido de bucles de unión de un dominio Kunitz descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio Kunitz que tiene una región de entramado descrita en el presente documento, por ejemplo, una región de entramado modificada o que se produce de manera natural. En una realización, los residuos que se varían se varían entre una pluralidad de aminoácidos.

La colección puede ser una colección de expresión que se usa para producir proteínas. Las proteínas pueden disponerse, por ejemplo, usando una matriz de proteínas. Documento US 5.143.854; De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al. (1999) Anal. Biochem. 270:103-111; Ge (2000) Nucleic Acids Res. 28, e3, I- VII; MacBeath y Schreiber (2000) Science 289:1760-1763; documentos WO 01/98534, WO 01/83827, WO 02/12893, WO 00/63701, WO 01/40803 y WO 99/51773.

Los dominios Kunitz también pueden presentarse sobre un paquete genético replicable, por ejemplo, en forma de una colección de fagos tal como una colección de presentación en fagos, de presentación en levaduras, de presentación en ribosomas o una colección de fusión de ácidos nucleicos-proteínas. Véanse, por ejemplo, el documento U.S. 5.223.409; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; el documento WO 03/029456; y el documento U.S. 6.207.446. Pueden obtenerse miembros de unión de tales colecciones mediante selección y examen en un formato de alto rendimiento. Véase, por ejemplo, el documento U.S. 2003-0129659.

Selección de colecciones de presentación

Esta sección describe métodos a modo de ejemplo de selección de miembros de una colección de presentación para identificar un dominio Kunitz que inhibe una proteasa. Los métodos divulgados en el presente documento también pueden modificarse y usarse en combinación con otros tipos de colecciones, por ejemplo, una colección de expresión o una matriz de proteínas, y así sucesivamente. Los dominios Kunitz pueden presentarse en fagos, especialmente en fagos filamentosos (por ejemplo, M13). En una realización preferida, la colección contiene miembros que tienen una variedad de tipos de aminoácidos en las posiciones del dominio Kunitz que es probable que entren en contacto con una serina proteasa en donde pueden afectar a la unión. Usando serina proteasa inmovilizada o que puede inmovilizarse (por ejemplo, mediante modificación con un miembro de un par de unión, tal como avidina o estreptavidina) como diana, pueden seleccionarse los miembros de la colección que tienen alta afinidad por la serina proteasa de interés.

En una selección de colecciones de presentación a modo de ejemplo, se pone en contacto una colección de fagos con y se permite que se une a la proteasa diana que puede ser una forma activa o inactivada de la proteasa (por ejemplo, proteína mutante o químicamente inactivada) o un fragmento de la misma. Para facilitar la separación de elementos que se unen y elementos que no se unen en el proceso de selección, a menudo es conveniente inmovilizar la proteasa sobre un soporte sólido, aunque también es posible permitir en primer lugar la unión a la proteasa diana en disolución y luego segregar los elementos que se unen de los que no se unen acoplando la

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proteasa diana a un soporte. A modo de ilustración, cuando se incuba en presencia de la proteasa, un fago que presenta un dominio Kunitz que interacciona con proteasa diana forma complejos con la proteasa diana inmovilizada sobre un soporte sólido mientras que un fago que no se une permanece en disolución y se elimina por lavado con tampón. El fago unido puede liberarse entonces de la proteasa por varios medios, tales como cambiar el tampón a un pH ácido o básico relativamente alto (por ejemplo, pH 2 o pH 10), cambiar la fuerza iónica del tampón, añadir desnaturalizantes, añadir un competidor, añadir células huésped que pueden infectarse (Hogan et al. (2005) Biotechniques 38(4):536, 538), u otros medios conocidos.

Por ejemplo, para identificar péptidos de unión a proteasas, la proteasa puede adsorberse en una superficie sólida, tal como la superficie de plástico de los pocillos de una placa de ensayo de múltiples pocillos. Posteriormente, se añade una alícuota de una colección de presentación en fagos a un pocillo en condiciones apropiadas que mantienen la estructura de la proteasa inmovilizada y el fago, tal como pH 6-7. El fago que presenta polipéptidos que se unen a la proteasa inmovilizada se une a la proteasa y se retiene en el pocillo. El fago que no se une puede eliminarse (por ejemplo, mediante lavado con tampón). También es posible incluir un agente de bloqueo o agente competidor durante la unión de la colección de fagos a la proteasa inmovilizada.

El fago unido a la proteasa inmovilizada puede eluirse entonces mediante lavado con una disolución tampón que tiene un pH ácido relativamente fuerte (por ejemplo, pH 2) o un pH alcalino (por ejemplo, pH 8-9). Las disoluciones de fago recuperado que se eluyen de la proteasa se neutralizan entonces y, si se desea, pueden agruparse como población de colección mixta enriquecida de péptidos de unión a proteasas de presentación en fagos. Alternativamente el fago eluido de cada colección puede mantenerse separado como población enriquecida específica de colección de elementos de unión a proteasas. Las poblaciones enriquecidas de péptidos de unión a proteasas de presentación en fagos pueden hacerse crecer entonces mediante métodos convencionales para rondas de selección adicionales y/o para análisis de péptido presentado sobre el fago y/o para la secuenciación del ADN que codifica el péptido de unión presentado.

El fago recubierto puede amplificarse entonces mediante infección de células bacterianas y el proceso de examen puede repetirse con el nuevo conjunto de fagos que está ahora empobrecido en elementos que no se unen a proteasas y enriquecido en elementos de unión a proteasas. La recuperación de incluye pocos fagos de unión puede ser suficiente para llevar el proceso hasta su finalización. Tras unas pocas rondas de selección (por ejemplo 2 o 3), se determinan las secuencias génicas que codifican los restos de unión derivados de clones de fagos seleccionados en el conjunto de unión mediante métodos convencionales, revelando la secuencia peptídica que confiere afinidad de unión del fago a la diana. Un aumento en el número de fagos recuperados tras cada ronda de selección y la recuperación de secuencias estrechamente relacionadas incidan que el examen está convergiendo sobre secuencias de la colección que tienen una característica deseada.

Tras identificarse un conjunto de polipéptidos de unión, la información de secuencia puede usarse para diseñar colecciones secundarias. Por ejemplo, las colecciones secundarias pueden explorar un segmento más pequeño de espacio de secuencia en más detalle que la colección inicial. En algunas realizaciones, la colección secundaria incluye proteínas que están sesgadas para miembros que tienen propiedades deseadas adicionales, por ejemplo, secuencias que tienen un alto porcentaje de identidad con una proteína humana.

Selección iterativa. La tecnología de colecciones de presentación puede usarse de un modo iterativo. Se usa una primera colección de presentación para identificar uno o más dominios Kunitz que se unen a una proteasa diana. Estos dominios Kunitz identificados se varían entonces usando un método de mutagénesis para formar una segunda colección de presentación. Entonces se seleccionan proteínas de mayor afinidad a partir de la segunda colección, por ejemplo, usando una mayor rigurosidad o condiciones de unión y lavado más competitivas.

En algunas implementaciones, la mutagénesis se dirige a regiones que se sabe o es probable que estén en la superficie de contacto de unión. Para dominios Kunitz, se conocen muchas posiciones cerca de la superficie de contacto de unión. Tales posiciones incluyen, por ejemplo, las posiciones 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34, 38 y 39 con respecto a la secuencia de BPTI. Algunas técnicas de mutagénesis a modo de ejemplo incluyen: síntesis de ADN con nucleótidos mixtos, PCR propensa a errores (Leung et al. (1989) Technique 1:11-15), recombinación, intercambio de ADN usando escisión al azar (Stemmer (1994) Nature 389-391; denominado “intercambio de ácido nucleico”), RACHITT™ (Coco et al. (2001) Nature Biotech. 19:354), mutagénesis dirigida al sitio (Zoller et al. (1987) Nucl Acids Res 10:6487-6504), mutagénesis de casete (Reidhaar-Olson (1991) Methods Enzymol. 208:564-586) y la incorporación de oligonucleótidos degenerados (Griffiths et al. (1994) EMBO J 13:3245). Las mezclas de nucleótidos usados en la síntesis pueden ser, por ejemplo, NNK, lo que permite cualquier base en las primeras dos posiciones de un codón variado y G o T en la base final y permite que aparezcan los 20 tipos de aminoácidos. Alternativamente, pueden usarse codones variados que excluyen algunos tipos de aminoácidos y quizá codones de terminación. NNK proporciona 32 codones, uno de los cuales es TAG, uno de terminación. NNK también proporciona tres codones para cada uno de Ser, Leu y Arg; dos codones para cada uno de Val, Ala, Pro, Thr y Gly; los otros doce tipos de aminoácidos tienen un único codón. El codón variado NNT proporciona 15 tipos de aminoácidos y ningún codón de terminación. NNG proporciona 13 tipos de aminoácidos y un codón de terminación.

También puede llevarse a cabo mutagénesis de un modo más limitado o dirigido. Por ejemplo, si el aminoácido

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original en una posición de interés es Ser, puede emplearse una mezcla de codones con (0,85 T, 0,05 C, 0,05 A, 0,05 G) en la primera base, (0,85 C, 0,05 T, 0,05 A, 0,5 G) en la segunda base y (0,85 T, 0,05 C, 0,05 A, 0,05 G) en la tercera base. La mayoría de las moléculas de ADN tendrán TCT que codifica Ser, pero otras tendrán codones que difieren en una, dos o tres bases, proporcionando una diversidad de tipos de aminoácidos.

En un ejemplo de selección iterativa, los métodos descritos en el presente documento se usan para identificar en primer lugar dominios Kunitz de una colección de presentación que se unen a una proteasa diana con al menos una especificidad de unión mínima, por ejemplo, una constante de disociación en equilibrio para la unión de menos de 100 nM, 10 nM o 1 nM. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios Kunitz que se identifican inicialmente se usan como ácido nucleico molde para la introducción de variaciones, por ejemplo, para identificar un segundo dominio Kunitz que tiene propiedades potenciadas (por ejemplo, afinidad de unión, cinética o estabilidad) en relación con el dominio Kunitz de la proteína inicial.

Selección o examen para determinar la especificidad. Los métodos de selección y examen de colecciones de presentación descritos en el presente documento pueden incluir un proceso de selección o examen que descarta miembros de la colección de presentación que se unen a una molécula no diana, por ejemplo, una proteasa distinta de la proteasa diana. En una realización, la molécula no diana es una proteasa que se ha inactivado mediante tratamiento con un inhibidor unido irreversiblemente, por ejemplo, un inhibidor covalente.

En una implementación, se usa una denominada etapa de “selección negativa” o “empobrecimiento” para discriminar entre la diana y una molécula no diana relacionada, pero distinta o una molécula no diana no relacionada. La colección de presentación o un conjunto de la misma se pone en contacto con la proteasa no diana. Se recogen miembros de la muestra que no se unen a la proteasa no diana y se usan en selecciones posteriores para la unión a la molécula diana o incluso para selecciones negativas posteriores. La etapa de selección negativa puede ser antes o después de seleccionar miembros de la colección que se unen a la proteasa diana.

En otra implementación, se usa una etapa de examen. Tras aislarse miembros de la colección de presentación para la unión a la molécula diana, cada miembro de la colección aislado se somete a prueba para determinar su capacidad de unirse a una proteasa no diana. Por ejemplo, puede usarse un examen de ELISA de alto rendimiento para obtener estos datos. El examen de ELISA puede usarse también para obtener datos cuantitativos para la unión de cada miembro de la colección a la diana. Se comparan datos de unión a dianas y no dianas (por ejemplo, usando un ordenador y software) para identificar miembros de la colección que se unen específicamente a la proteasa diana.

Dominios Kunitz individuales con múltiples especificidades

Se obtienen dominios Kunitz individuales con más de una especificidad mediante selección alterna de colecciones usando las serina proteasas diana. Se seleccionan en primer lugar miembros de una colección de dominios Kunitz para la unión a la primera serina proteasa diana, y los miembros de la colección que se unen a la primera diana se seleccionan y examinan frente a la segunda serina proteasa diana. Esta selección y examen alternos puede llevarse a cabo sobre tantas serina proteasas dianas como se desee. Adicionalmente, la selección puede repetirse, de manera que los miembros de la colección que se unen a todas las proteasas diana se examinan entonces para la unión deseada. Se realizan comúnmente de dos a cuatro rondas de selecciones repetidas.

Por ejemplo, puede usarse selección alterna para obtener un único dominio Kunitz que inhibe tanto calicreína humana 1 (h.K1, también conocida como calicreína tisular) y calicreína murina 1 (m.K1). Tal como se describió anteriormente, se seleccionaría una colección en primer lugar frente a una de las dianas (por ejemplo, hK1), luego los dominios Kunitz identificados en la primera selección se seleccionan entonces frente a la otra diana (por ejemplo, mK1). Un dominio Kunitz que inhibe una serina proteasa humana y su homólogo de otra especie de mamífero (por ejemplo, murina) es útil porque sus características pueden evaluarse en un modelo animal de enfermedad.

En otro ejemplo, se selecciona un dominio Kunitz que inhibe tanto calicreína plasmática humana (h.pKal) como calicreína tisular humana mediante selección alterna con las dos dianas. Un inhibidor de este tipo sería ventajoso en una enfermedad, tal como artritis, en la que tanto calicreína plasmática humana como calicreína tisular humana son excesivamente activas. En una realización, el dominio Kunitz difiere de bikunina humana (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense 6.583.108) en al menos dos, tres, cinco o diez aminoácidos.

Transferencia de determinantes de especificidad

Pueden modificarse proteínas naturales que tienen más de un dominio Kunitz para proporcionar una proteína con al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética que inhiben, respectivamente, dos proteasas humanas diferentes, por ejemplo, calicreína plasmática (pKal) y elastasa de neutrófilos humana (hNE). Por ejemplo, pueden transferirse residuos de los bucles de unión a proteasas de DX-88 a un dominio Kunitz de la proteína receptora y pueden transferirse residuos de los bucles de unión a proteasas de DX-890 a otro de los dominios Kunitz. La proteína resultante inhibe calicreína plasmática y elastasa de neutrófilos humana.

En una realización, se sustituyen residuos que contribuyen a la unión y/o especificidad en los dominios Kunitz de

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una proteína preexistente, por ejemplo, una proteína que se produce de manera natural tal como una proteína sérica. Varias proteínas séricas contienen dos o tres dominios Kunitz. Cada uno de estos dominios Kunitz podría modificarse por ingeniería genética para inhibir una diana. Por ejemplo, el compartimento extracelular del tejido humano contiene inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI, también conocido como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI)), inhibidor de la ruta del factor tisular-2 (TFPI-2), inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos-1 (HAI-1), inhibidor del activador del factor de crecimiento de hepatocitos-2 (HAI-2, también conocido como bikunina placentaria) y bikunina (también conocido como inhibidor de inter-alfa tripsina). Una estrategia es usar una de las proteínas humanas de múltiples dominios Kunitz como molde y cambiar solo los residuos que confieren la afinidad y especificidad necesarias.

Los residuos que confieren afinidad y especificidad pueden transferirse de un dominio Kunitz a otro con alta retención de las propiedades deseadas mediante sustitución de unos pocos residuos. Por ejemplo, DX-88 se basa en el dominio Kunitz 1 de TFPI y tiene cinco aminoácidos dentro del dominio Kunitz cambiados basándose en la selección de una colección presentada en fagos. DX-88 es un inhibidor de 30 pM de calicreína plasmática humana (h.pKal) mientras que el dominio Kunitz 1 de TFPI apenas tiene ninguna afinidad por h.pKal. La tabla 7 muestra las secuencias de aminoácidos de varios dominios Kunitz, algunos de tipo natural, algunos seleccionados de colecciones de fagos, algunos diseñados, y algunos diseñados, construidos y sometidos a prueba. BPTI, TFPI-K1, TFPI-K2 y TFPI-K3 son dominios Kunitz que se producen de manera natural. DX-88 y DX-1000 se seleccionaron de una colección de derivados de dominio Kunitz 1 de TFPI derivados e inhiben calicreína plasmática humana y plasmina humana respectivamente. TF890 se diseña mediante comparación con DX-890 y debe inhibir elastasa de neutrófilos humana con alta afinidad. TFPI-K2_88 es una modificación de TFPI-K2 que debe inhibir calicreína plasmática humana. TFPI-K3_88 es un derivado de dominio Kunitz 3 de TFPI que debe inhibir calicreína plasmática humana. ITI-K2 es el segundo dominio Kunitz de bikunina. DX-890 es un potente inhibidor de elastasa de neutrófilos humana que se diseñó basándose en el inhibidor seleccionado de una colección de derivados de BPTI para la unión a elastasa de neutrófilos humana. TFPI-K2_890 es un derivado de dominio Kunitz 2 de TFPI que se diseñó para inhibir elastasa de neutrófilos humana. TFPIK3_890 es un derivado de dominio Kunitz 3 de TFPI que se diseñó para inhibir elastasa de neutrófilos humana.

(*)Pueden seleccionarse nuevas secuencias de dominios Kunitz modificadas por ingeniería genética usando la tecnología de colecciones de presentación. La secuencia de 'base', o 'armazón' puede ser cualquier proteína que contenga dominios Kunitz, pero en determinadas realizaciones, la secuencia de 'base' se deriva de una proteína que se produce de manera natural que contiene dos o más dominios Kunitz (por ejemplo, TFPI, por ejemplo, TFPI K1). Puede usarse cualquier serina proteasa de interés como diana, incluyendo elastasa de neutrófilos (por ejemplo, elastasa de neutrófilos humana), proteinasa 3 (por ejemplo, proteinasa humana 3), catepsina G (por ejemplo, catepsina humana G), triptasa (por ejemplo, triptasa humana), calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana), elastasa de neutrófilos (por ejemplo, elastasa de neutrófilos humana), calicreína 6 (por ejemplo, calicreína humana 6), calicreína 8 (por ejemplo, calicreína humana 8), calicreína 10 (por ejemplo, calicreína humana 10), calicreína tisular (por ejemplo, calicreína tisular humana), plasmina (por ejemplo, plasmina humana), hepsina (por ejemplo, hepsina humana), matriptasa (por ejemplo, matriptasa humana), endoteliasa 1 (por ejemplo, endoteliasa humana 1) y endoteliasa 2 (por ejemplo, endoteliasa humana 2).

En algunas realizaciones, el dominio Kunitz receptor se modifica de modo que las posiciones de residuos 13, 15, 16, 17, 18, 19, 31, 32, 34 y 39 (numeradas con respecto a la secuencia de BPTI) son las mismas que los residuos en el dominio Kunitz de origen. Alternativamente, podrían variarse los residuos 11, 13, 15-19, 31, 32, 34, 39 y 40. En otra realización, podrían variarse 11-19, 31, 32, 34 y 38-40; en este caso se permite que se cambie el disulfuro 14-38 a otros tipos de aminoácidos. En otras realizaciones, el dominio Kunitz receptor se modifica de modo que los residuos en los bucles de unión primero y segundo son los mismos que los residuos en el dominio Kunitz de origen.

Modificación y variación de polipéptidos

También es posible variar un dominio Kunitz u otra proteína descrita en el presente documento para obtener una variante útil que tiene propiedades mejoradas o alteradas similares. Normalmente, son posibles varias variantes. Puede prepararse una variante y luego someterse a prueba, por ejemplo, usando un ensayo de unión descrito en el presente documento (tal como anisotropía de fluorescencia).

Un tipo de variante es un truncamiento de un dominio Kunitz u otra proteína descrita en el presente documento. En este ejemplo, la variante se prepara eliminando uno o más residuos de aminoácido del dominio del extremo N o C terminal. En algunos casos, se prepara una serie de tales variantes y se someten a prueba. La información de las pruebas de las series se usa para determinar una región del dominio que es esencial para la unión y/o estabilidad de la proteasa en suero. Puede construirse y someterse a prueba de manera similar una serie de deleciones o inserciones internas. Para dominios Kunitz, puede ser posible eliminar, por ejemplo, entre uno y cinco residuos o uno y tres residuos que son N-terminales con respecto a C5, la primera cisteína, y entre uno y cinco residuos o uno y tres residuos que son C-terminales con respecto a C55, la cisteína final, en el que cada una de las cisteínas corresponde a una cisteína numerada respectivamente en BPTI.

Otro tipo de variante es una sustitución. En un ejemplo, el dominio Kunitz se somete a exploración de alanina para

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identificar residuos que contribuyen a la estabilidad y o actividad de unión. En otro ejemplo, se construye una colección de sustituciones en una o más posiciones. La colección puede no estar sesgada o, particularmente si se varían múltiples posiciones, sesgada hacia un residuo original. En algunos casos, las sustituciones son todas sustituciones conservativas.

En otro ejemplo, cada lisina se reemplaza por arginina y se mide la afinidad de unión. Por tanto, puede obtenerse una proteína de unión que no tiene lisinas y que conserva las propiedades de unión seleccionadas. Proteínas que carecen de residuos de lisina con la cadena polipeptídica proporcionan solo un único sitio para la pegilación (el extremo amino terminal), y por tanto proporcionan un producto más homogéneo tras la pegilación.

Otro tipo de variante incluye uno o más aminoácidos que no se producen de manera natural. Tales variantes pueden producirse mediante síntesis química o modificación. Una o más posiciones pueden sustituirse por un aminoácido que no se produce de manera natural. En algunos casos, el aminoácido sustituido puede estar químicamente relacionado con el residuo que se produce de manera natural original (por ejemplo, alifático, cargado, básico, ácido, aromático, hidrófilo) o un isóstero del residuo original.

También es posible incluir uniones no peptídicas y otras modificaciones químicas. Por ejemplo, parte o todo el dominio Kunitz u otra proteína puede sintetizarse como un peptidomimético, por ejemplo, un peptoide (véanse, por ejemplo, Simon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71 y Horwell (1995) Trends Biotecbnol. 13:132-4).

Producción de proteínas

Producción recombinante de polipéptidos. Pueden usarse métodos de ácidos nucleicos recombinantes convencionales para expresar una proteína descrita en el presente documento (por ejemplo, una proteína que incluye uno o más dominios Kunitz). Generalmente, se clona una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína en un vector de expresión de ácido nucleico. Si la proteína es suficientemente pequeña, por ejemplo, la proteína es un péptido de menos de 60 aminoácidos, la proteína puede sintetizarse usando métodos de síntesis orgánica automatizados.

El vector de expresión para expresar la proteína puede incluir un segmento que codifica la proteína y secuencias reguladoras, por ejemplo, un promotor, operativamente unido al segmento codificante. Los expertos en la técnica conocen vectores y promotores adecuados y están disponibles comercialmente para generar los constructos recombinantes de la presente invención. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989).

La expresión de proteínas que no contienen sitios de glicosilación unida a N puede llevarse a cabo en bacterias, levaduras o células de mamífero. Las proteínas que tienen sitios de glicosilación unida a N pueden expresarse en bacterias para obtener versiones no glicosiladas o en células de levadura o mamífero si se desea glicosilación. Para su uso en seres humanos, se producen preferiblemente versiones glicosiladas en células de mamífero tales como células CHO o HEK293T.

Scopes (1994) Protein Purification: Principles and Practice, Nueva York: Springer-Verlag y otros textos proporcionan varios métodos generales para purificar proteínas recombinantes (y no recombinantes).

Producción sintética de péptidos. Un polipéptido también puede producirse por medios sintéticos. Véase, por ejemplo, Merrifield (1963) J. Am. Chem.Soc., 85: 2149. Por ejemplo, el peso molecular de péptidos sintéticos o miméticos peptídicos puede ser de desde aproximadamente 250 hasta aproximadamente 8.0000 Daltons. Un péptido puede modificarse, por ejemplo, mediante unión a un resto que aumenta el peso molecular eficaz del péptido. Si el péptido se oligomeriza, dimeriza y/o derivatiza, por ejemplo, con un polímero hidrófilo (por ejemplo, para aumentar la afinidad y/o actividad de los péptidos), sus pesos moleculares pueden ser mayores y pueden oscilar en cualquier punto entre aproximadamente 500 y aproximadamente 50.000 Daltons.

Pegilación y otras modificaciones

Un único dominio Kunitz tiene baja masa molecular y al menos en algunos casos se filtran rápidamente por los riñones. El aumento de la masa molecular puede aumentar la residencia en el suero.

Una variedad de restos pueden unirse covalentemente a la proteína para aumentar el peso molecular de una proteína que incluye un dominio Kunitz. En una realización, el resto es un polímero, por ejemplo, un polímero soluble en agua y/o sustancialmente no antigénico tal como un homopolímero o un polímero no biológico. Los polímeros sustancialmente no antigénicos incluyen, por ejemplo, poli(óxidos de alquileno) o poli(óxidos de etileno). El resto puede mejorar la estabilización y/o retención del dominio Kunitz en circulación, por ejemplo, en sangre, suero, linfa u otros tejidos, por ejemplo, en al menos 1,5, 2, 5, 10, 50, 75 o 100 veces. Pueden unirse uno o una pluralidad de restos a una proteína que incluye un dominio Kunitz. Por ejemplo, la proteína se une a al menos tres restos del polímero. En una realización, particularmente si no hay lisinas en los bucles de unión a proteasas, cada lisina de la

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proteína puede unirse a un resto del polímero.

Los polímeros adecuados pueden variar sustancialmente en peso. Por ejemplo, es posible usar polímeros que tienen pesos moleculares promedio que oscilan entre aproximadamente 200 Daltons y aproximadamente 40 kDa, por ejemplo, 1-20 kDa, 4-12 kDa o 3-8 kDa, por ejemplo, aproximadamente 4, 5, 6 o 7 kDa. En una realización, el peso molecular promedio de restos individuales del polímero que están asociados con el compuesto es de menos de 20, 18, 17, 15, 12, 10, 8 o 7 kDa. El peso molecular final también puede depender del tamaño eficaz deseado del conjugado, la naturaleza (por ejemplo, estructura, tal como lineal o ramificada) del polímero, y el grado de derivatización.

Una lista no limitativa de polímeros a modo de ejemplo incluyen homopolímeros de poli(óxido de alquileno) tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. El polímero puede ser un polímero de polivinilo hidrófilo, por ejemplo poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Los polímeros útiles adicionales incluyen polioxialquilenos tales como polioxietileno, polioxipropileno, y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); poli(ácido láctico); poli(ácido glicólico); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros de sacárido D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo poli(ácido manurónico), o ácido algínico), D- glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, celulosa, amilopectina, almidón, hidroxietilalmidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparona. En algunas realizaciones, el polímero incluye una variedad de diferentes bloques de copolímero.

Se describen métodos a modo de ejemplo adicionales de unión de más de un resto de polímero a una proteína en el documento US 2005-0089515.

Otro método de aumento del peso molecular de una proteína es preparando multímeros de la proteína (por ejemplo, produciendo la proteína de manera que al menos dos copies de la proteína se fusionan, normalmente en tándem, pero también son posibles fusiones de cabeza a cabeza). Pueden producirse multímeros mediante reticulación química o mediante expresión de un constructo que codifica el multímero. Debido a que las repeticiones largas de ADN pueden ser inestables, se prefiere que los polinucleótidos que codifican las diferentes copias de la proteína tengan secuencias diferentes.

Caracterización de las interacciones de unión

Las propiedades de unión de una proteína (por ejemplo, una proteína que incluye uno o más dominios Kunitz) pueden evaluarse fácilmente usando diversos formatos de ensayo. Por ejemplo, las propiedades de unión pueden someterse a ensayo mediante medición cuantitativa de la capacidad para inhibir las proteasas diana y no diana. Alternativamente, por ejemplo, la propiedad de unión de una proteína puede medirse en disolución mediante anisotropía de fluorescencia (Bentley et al., (1985) J. Biol. Chem. 260(12):7250-56; Shimada et al., (1985) J. Biochem. 97(6):1637-44; Terpetschnig et al., (1995) Anal. Biochem. 227(1):140-7; Durkop et al., (2002) Anal. Bioanal. Chem. 372(5-6):688-94), lo que proporciona un método conveniente y exacto de determinación de una constante de disociación (Kd) o constante de asociación (Ka) de la proteína para una proteasa diana particular. En un procedimiento de este tipo, la proteína que va a evaluarse se marca con fluoresceína. La proteína marcada con fluoresceína se mezcla en los pocillos de una placa de ensayo de múltiples pocillos con diversas concentraciones de la proteasa diana o proteasa no diana particular. Se llevan a cabo mediciones de anisotropía de fluorescencia usando un lector de placas de polarización de fluorescencia.

Las interacciones de unión también pueden analizarse usando un ensayo ELISA. Por ejemplo, la proteína que va a evaluarse se pone en contacto con una placa de microtitulación cuya superficie inferior se ha recubierto con la proteasa diana, por ejemplo, una cantidad limitante de la proteasa diana. La molécula se pone en contacto con la placa. La placa se lava con tampón para eliminar moléculas no unidas específicamente. Entonces se determina la cantidad de la proteína unida a la placa estudiando con sonda la placa con un anticuerpo que reconoce la proteína. Por ejemplo, la proteína puede incluir una etiqueta de epítopo. El anticuerpo puede unirse a una enzima tal como fosfatasa alcalina, que produce un producto colorimétrico cuando se proporcionan sustratos apropiados. En el caso en el que un miembro de la colección de presentación incluya la proteína que va a someterse a prueba, el anticuerpo puede reconocer una región que es constante entre todos los miembros de la colección de presentación, por ejemplo, para un miembro de una colección de presentación en fagos, una proteína de la envuelta principal del fago.

Una interacción de unión entre una proteína y una proteasa diana particular puede analizarse usando resonancia de plasmón superficial (SPR). Por ejemplo, tras la secuenciación de un miembro de la colección de presentación presente en una muestra, y opcionalmente verificado, por ejemplo, mediante ELISA, la proteína presentada puede producirse en cantidad y someterse a ensayo para determinar la unión a la diana usando SPR. SPR o análisis de interacción biomolecular (BIA) en tiempo real detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar

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ninguno de los elementos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un acontecimiento de unión) del chip de BIA dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Se describen métodos para usar SPR, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.641.640; Raeter (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705.

La información de SPR puede usarse para proporcionar una medida exacta y cuantitativa de la constante de disociación (Kd) en equilibrio, y parámetros cinéticos, incluyendo kon y koff, para la unión de una proteína (por ejemplo, una proteína que incluye dominios Kunitz) a una proteasa diana. Tales datos pueden usarse para comparar diferentes proteínas. La información de SPR también puede usarse para revelar la relación de estructura-actividad (SAR). Por ejemplo, si las proteínas son todas variantes mutadas de un único anticuerpo original o un conjunto de anticuerpos originales conocidos, pueden identificarse aminoácidos variantes en posiciones dadas que se correlacionan con parámetros de unión particulares, por ejemplo, alta afinidad y baja koff.

Los métodos adicionales para medir afinidades de unión incluyen resonancia magnética nuclear (RMN) y valoraciones de unión (por ejemplo, usando transferencia de energía de fluorescencia).

Otras medidas de solución para estudiar propiedades de unión incluyen transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), RMN, cristalografía de rayos X, modelado molecular y medición de moléculas unidas frente a libres. La medición de moléculas unidas frente a libres puede lograrse con un instrumento KinExA de Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID.

Caracterización de la inhibición de proteasas

Puede ser útil caracterizar la capacidad de una proteína descrita en el presente documento para inhibir proteasas diana, así como proteasas no diana.

Pueden seleccionarse dominios Kunitz por su potencia y selectividad de inhibición de las proteasas diana. En un ejemplo, se combinan la proteasa diana y un sustrato en condiciones de ensayo que permiten la reacción de la proteasa con su sustrato. El ensayo se realiza en ausencia de la proteína que está sometiéndose a prueba, y en presencia de concentraciones crecientes de la proteína que está sometiéndose a prueba. La concentración de proteína de prueba a la que la actividad proteasa se inhibe en un 50 % es el valor de CI50 (concentración inhibidora) o el valor de CE50 (concentración eficaz) para esa proteína de prueba. Proteínas que tienen valores de CI50 o CE50 inferiores se consideran inhibidores más potentes de la proteasa diana que las proteínas que tienen valores de CI50 o CE50 superiores. Las proteínas preferidas según este aspecto tienen un valor de CI50 de 100 nM, 10 nM, 1 nM o 0,1 nM o menos tal como se mide en un ensayo in vitro para la inhibición de la actividad proteasa.

Una proteína de prueba también puede evaluarse para determinar su selectividad hacia diferente(s) proteasa(s). Una proteína de prueba se somete a ensayo para determinar su potencia hacia un panel de proteasas y otras enzimas y se determina un valor de CI50 para cada una. Una proteína que demuestra un valor de CI50 bajo para la proteasa diana, y un valor de CI50 superior para otras proteasas dentro del panel de prueba (por ejemplo, tripsina, plasmina, quimotripsina), se considera que es selectiva hacia la proteasa diana. Generalmente, una proteína se considera selectiva si su valor de CI50 es al menos un orden de magnitud menor que el siguiente valor de CI50 más pequeño medido en el panel de enzimas.

También es posible evaluar la actividad de dominios Kunitz in vivo o en muestras (por ejemplo, lavados pulmonares o suero) de sujetos a los que se les ha administrado un compuesto descrito en el presente documento.

Composiciones farmacéuticas y tratamientos

También se presenta una composición, por ejemplo, una composición farmacéuticamente aceptable, que incluye una proteína descrita en el presente documento (por ejemplo, una proteína que inhibe al menos dos proteasas humanas). En una realización, la proteína incluye uno o más dominios Kunitz. Por ejemplo, la proteína inhibe una pluralidad de proteasas diana. La composición farmacéutica puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable.

Los portadores a modo de ejemplo incluyen todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

La composición farmacéutica puede incluir una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado (véase por

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ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

La composición farmacéutica puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como disoluciones líquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración previsto y la aplicación terapéutica. Composiciones típicas están en forma de disoluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para la administración de anticuerpos a seres humanos. Un modo de administración común es parenteral (por ejemplo, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal). En una realización, el compuesto se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización, el compuesto se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento.

La composición puede formularse como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y liofilización que produce un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede provocarse la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las proteínas descritas en el presente documento pueden administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Para muchas aplicaciones, la vía/el modo de administración es inyección o infusión intravenosa. Por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, el compuesto puede administrarse mediante infusión intravenosa a una velocidad de menos de 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min hasta alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o de 7 a 25 mg/m2. Alternativamente, la dosis podría ser de 100 |ig/kg, 500 |ig/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg. La vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

En determinadas realizaciones, la proteína se prepara con un portador que protege frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o se conocen generalmente. Véanse por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. La formulación farmacéutica es una técnica bien establecida, y se describe adicionalmente en Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); y Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X).

También se contemplan kits que comprenden una proteína descrita en el presente documento (por ejemplo, una proteína que inhibe al menos dos proteasas humanas) e instrucciones para su uso, por ejemplo, uso de tratamiento, profiláctico o de diagnóstico. En una realización, el kit incluye (a) el compuesto, por ejemplo, una composición que incluye el compuesto, y, opcionalmente, (b) material de información. El material de información puede ser descriptivo, instructivo, de comercialización u otro material que se refiere a los métodos descritos en el presente documento y/o al uso del compuesto para los métodos descritos en el presente documento.

En una realización, el material de información puede incluir instrucciones para administrar el compuesto de una manera adecuada, por ejemplo, en una dosis, forma de dosificación o modo de administración adecuado (por ejemplo, una dosis, forma de dosificación o modo de administración descrito en el presente documento). En otra realización, el material de información puede incluir instrucciones para identificar un sujeto adecuado, por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un ser humano que tiene, o corre el riesgo de un trastorno caracterizado por actividad

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elastasa excesiva. El material de información puede incluir información sobre la producción del compuesto, el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de caducidad, el lote o información del sitio de producción, y así sucesivamente. El material de información de los kits no está limitado en su forma. En muchos casos, el material de información, por ejemplo, instrucciones, se proporciona impreso, por ejemplo, un texto, dibujo y/o fotografía impresa, por ejemplo, una etiqueta u hoja impresa. Sin embargo, el material de información también puede proporcionarse en otros formatos, tales como braille, material legible por ordenador, grabación de vídeo o grabación de audio. En otra realización, el material de información del kit es un vínculo o información de contacto, por ejemplo, una dirección física, dirección de correo electrónico, hipervínculo, sitio web o número de teléfono, en donde un usuario del kit puede obtener información sustancial sobre el compuesto y/o su uso en los métodos descritos en el presente documento. Por supuesto, el material de información también puede proporcionarse en cualquier combinación de formatos.

Además del compuesto, la composición del kit puede incluir otros componentes, tales como un disolvente o tampón, un estabilizador o un conservante y/o un segundo agente para tratar un estado o trastorno descrito en el presente documento. Alternativamente, los otros componentes pueden incluirse en el kit, pero en composiciones o recipientes diferentes al compuesto. En tales realizaciones, el kit puede incluir instrucciones para mezclar el compuesto y los otros componentes, o para usar el compuesto junto con los otros componentes.

El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene el compuesto. En algunas realizaciones, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimentos para la composición y el material de información. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en una botella, un vial o una jeringuilla, y el material de información puede estar contenido en un paquete o funda de plástico. En otras realizaciones, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un único recipiente no dividido. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, un vial o una jeringuilla que tiene unido a la misma el material de información en forma de una etiqueta. En algunas realizaciones, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un paquete) de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o más formas de dosificación unitarias (por ejemplo, una forma de dosificación descrita en el presente documento) del compuesto. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringuillas, ampollas, paquetes de aluminio o paquetes de blíster, conteniendo cada uno una única dosis unitaria del compuesto. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, estancos (por ejemplo, impermeables a cambios en la humedad o evaporación) y/u opacos.

Una proteína descrita en el presente documento (por ejemplo, una proteína que inhibe al menos dos proteasas humanas) puede administrarse sola o en combinación con un segundo agente a un sujeto, por ejemplo, un paciente, por ejemplo, un paciente, que tiene un trastorno (por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento), un síntoma de un trastorno o una predisposición hacia un trastorno, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, superar, mejorar o afectar al trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición hacia el trastorno. El tratamiento también puede retrasar la aparición, por ejemplo, prevenir la aparición o prevenir el deterioro de un estado.

Puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz, normalmente una cantidad del compuesto que es eficaz, tras una única o múltiples administraciones de la dosis a un sujeto, en el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, curado, alivio, mitigación o mejora de al menos un síntoma de un trastorno en un sujeto hasta un grado más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición puede variar según factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se compensa por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una dosificación terapéuticamente eficaz modula preferiblemente un parámetro medible, favorablemente, en relación con sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir un parámetro medible puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en un trastorno humano.

Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente tal como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma unitaria de dosificación tal como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente diferenciadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido.

Un intervalo a modo de ejemplo, no limitativo para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto descrito en el presente documento es 0,1-20 mg/kg, más preferiblemente 1-10 mg/kg. El compuesto puede administrarse mediante infusión parenteral (por ejemplo, intravenosa o subcutánea) a una velocidad de menos de 20, 10, 5 o 1 mg/min hasta alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 50 mg/m2 o aproximadamente de 5 a 20 mg/m2. Debe indicarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad del estado que va a mitigarse. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, deben ajustarse regímenes de dosificación específicos a lo largo del tiempo según la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que

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administra o supervisa la administración de las composiciones (por ejemplo, el médico supervisor), y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son solo a modo de ejemplo.

Usos terapéuticos

Las proteínas de la invención pueden usarse en terapias para el tratamiento o la profilaxis de trastornos mediados por dos o más proteasas, tal como se define en las reivindicaciones. Asimismo, las proteínas de la invención pueden usarse para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos mediados por dos o más proteasas.

Artritis reumatoide (RA): Calicreína plasmática humana, calicreína tisular humana (h.K1) y elastasa de neutrófilos humana participan todas en RA (Volpe-Junior, et al., 1996, Inflamm Res, 45:198-202; Cassim, et al., 2002, Pharmacol Ther, 94:1-34; Colman, 1999, Immunopharmacology, 43:103-8; Dela Cadena, et al., 1995, Faseb J, 9:446-52; Rahman, et al., 1995, Ann Rheum Dis, 54:345-50; Tremblay, et al., 2003, Curr Opin Investig Drugs, 4:556- 65). Por tanto, se proporciona un método de tratamiento de artritis reumatoide (por ejemplo, estabilización o mejora de la puntuación de Sharp total, la puntuación de erosión de Sharp o el índice de discapacidad de HAQ) administrando a un sujeto que tiene (o se sospecha que tiene) RA una cantidad eficaz de una proteína que inhibe al menos dos proteasas del grupo de calicreína plasmática humana, calicreína tisular humana (h.K1) y elastasa de neutrófilos humana.

MMP 1, 2, 3, 9 y 13 también participan en RA (Burrage et al. (2006) Front Biosci. 11:529-43). Por consiguiente, también se proporciona un método de tratamiento de RA (por ejemplo, estabilización o mejora de la puntuación de Sharp total, la puntuación de erosión de Sharp o el índice de discapacidad de HAQ) administrando una cantidad eficaz de una proteína que inhibe (a) al menos dos proteasas del grupo de calicreína plasmática humana, calicreína tisular humana (h.K1) y elastasa de neutrófilos humana, (b) al menos una proteasa del grupo de MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9 y MMP-13.

La RA puede evaluarse mediante una variedad de medidas clínicas. Algunos indicios a modo de ejemplo incluyen la puntuación de Sharp total (TSS), la puntuación de erosión de Sharp y el índice de discapacidad de HAQ. Se administra una proteína de la invención para tratar RA, por ejemplo, para mejorar una evaluación en una o más de estas medidas clínicas.

Trastornos pulmonares: En los trastornos inflamatorios del pulmón participan varias proteasas diferentes, incluyendo elastasa de neutrófilos humana, proteinasa 3, catepsina G, triptasa, MMP-12 y MMP-9. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos pulmonares que implican inflamación (por ejemplo, mejora o estabilización de las puntuaciones de PFT o ralentización, prevención o reducción de un deterioro en las puntuaciones de PFT, o para pacientes con COPD reduciendo la puntuación de índice de destrucción en al menos el 10, el 20, el 30 o el 40 % o hasta al menos dentro del 50, el 40, el 30 o el 20 % de las puntuaciones de índice de destrucción normales para la población normal de edad y género coincidente) administrando a un sujeto que tiene (o se sospecha que tiene) un trastorno pulmonar que implica inflamación una cantidad eficaz de una proteína que inhibe la actividad de dos o más (o todas) de estas proteasas. Los trastornos pulmonares a modo de ejemplo que implican inflamación incluyen asma, enfisema, fibrosis quística y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), particularmente exacerbaciones agudas de COPD. En particular, se han asociado elastasa de neutrófilos humana, proteinasa 3, catepsina G y MMP-12 con COPD, y por tanto las proteínas para el tratamiento de COPD inhiben al menos dos proteasas del grupo: elastasa de neutrófilos humana, proteinasa 3 y catepsina G, y, en algunas realizaciones inhiben adicionalmente MMP-9 y/o MMP-12.

Están disponibles una variedad de medidas clínicas para evaluar enfermedades pulmonares y la eficacia de tratamiento de las mismas. Pueden usarse pruebas de la función pulmonar (PFT) tal como volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV4), volumen espiratorio forzado en seis segundo (FEV6), capacidad vital forzada (FVC), flujo espiratorio pico, la razón de FEV1 con respecto a FVC, expresada como porcentaje (FEV1/FVC), el flujo espiratorio forzado menos el flujo espiratorio forzado promedio durante la porción media (25 - 75 %) de la FVC (FEF25-75), y tomografía computarizada de secciones finas para evaluar enfermedades pulmonares y la eficacia de tratamiento. El “índice de destrucción”, que es una medida del daño de tabiques alveolares y enfisema, puede ser particularmente útil en la monitorización de COPD y el efecto terapéutico de las proteínas y métodos en el presente documento. Véase, por ejemplo, Am Rev Respir Dis julio de 1991; 144(1):156-59.

Esclerosis múltiple: La esclerosis múltiple (MS) puede implicar a calicreína humana 6 (hK6), calicreína humana 8 (hK8) y calicreína humana 10 (hK10). Por consiguiente, la invención proporciona métodos de tratamiento de la esclerosis múltiple (por ejemplo, reducción o estabilización de la puntuación de EDSS, reducción de la intensidad o frecuencia de exacerbaciones, o reducción del tamaño, el número o la tasa de aumento del tamaño o número de lesiones escleróticas) administrando a un sujeto que tiene (o se sospecha que tiene) MS una cantidad eficaz de una proteína que inhibe dos o más (por ejemplo, las tres) de estas proteasas. Pueden identificarse pacientes que tienen MS mediante criterios reconocidos en las técnicas médicas tales como estableciendo un diagnóstico de MS definida clínicamente, tales como los criterios definidos por el seminario sobre el diagnóstico de MS (Poser et al., Ann. Neurol. 13:227,1983).

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La eficacia del tratamiento de esclerosis múltiple puede examinarse usando cualquier método o criterio reconocido en la técnica. Se usan comúnmente tres criterios: EDSS (escala de estado de discapacidad extendida, Kurtzke, Neurology 33:1444, 1983), aparición de exacerbaciones o MRI (obtención de imágenes por resonancia magnética).

Lesión de la médula espinal: La lesión de la médula espinal puede exacerbarse mediante hK6, elastasa de neutrófilos humana, y otras serina proteasas. Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos de tratamiento de la lesión de la médula espinal (por ejemplo, mejora de las habilidades motoras gruesas o finas, aumento de las actividades de la vida diaria (ADL) que puede realizar el paciente, mejora en las respuestas reflejas, o mejora en el comportamiento de locomoción compleja) administrando a un sujeto con una lesión de la médula espinal una cantidad eficaz de una proteína que inhibe al menos las dos serina proteasas hK6 y elastasa de neutrófilos humana.

Las evaluaciones del comportamiento a veces no pueden definir la naturaleza exacta de los déficits motores o evaluar el retorno del comportamiento motor tras la lesión de la médula espinal. Además de la evaluación del comportamiento motor grueso, es apropiado usar pruebas complejas para la locomoción para evaluar los déficits enmascarados en la evaluación de la recuperación funcional tras la lesión de la médula espinal. Suresh et al. han diseñado pruebas cuantitativas sensibles para respuestas reflejas y comportamiento locomotor complejo como puntuación de comportamiento combinada (CBS) para evaluar la recuperación de la función en el mono Bonnet (Macaca radiata) (J Neurol Sci. (2000) 178(2):136-52). Puesto que estas mediciones no son invasivas, pueden adaptarse para su uso en pacientes humanos.

Enfermedad inflamatoria intestinal: Las enfermedades inflamatorias intestinales (IBD) incluyen dos trastornos distintos, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (UC). La colitis ulcerosa se produce en el intestino grueso, mientras que en la enfermedad de Crohn, la enfermedad puede implicar a todo el tubo tracto GI así como a los intestinos delgado y grueso. Para la mayoría de los pacientes, IBD es un estado crónico con síntomas que incluyen hemorragia rectal intermitente, dolor abdominal con cólicos, pérdida de peso y diarrea, que dura durante meses a años. Se ha implicado a calicreína tisular humana (h.K1), calicreína plasmática humana y elastasa de neutrófilos humana en tanto la enfermedad de Crohn como la colitis ulcerosa (Colman, 1999, Immunopharmacology, 43:103-8; Devani et al., (2005) Dig. Liver Dis. 37(9):665-73; Kuno et al., (2002) J. Gastroenterol. 37(Suppl 14):22-32; Stadnicki et al., (1997) Dig. Dis. Sci. 42(11):2356-66). Por consiguiente, la divulgación también proporciona métodos de tratamiento y/o profilaxis de enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerosa (por ejemplo, reducción o eliminación de la hemorragia rectal, dolor/calambres abdominales, pérdida de peso o diarrea, mejora del hematocrito/eliminación o mejora de la anemia, o mejora del índice de actividad clínica para puntuaciones de colitis ulcerosa en pacientes con UC) administrando a un sujeto una cantidad eficaz de una proteína que inhibe al menos dos (o las tres) de calicreína tisular humana (h.K1), calicreína plasmática humana y elastasa de neutrófilos humana. El sujeto tiene, se sospecha que tiene o corre el riesgo de desarrollar una IBD.

Muchos de los síntomas de IBD (por ejemplo, hemorragia rectal, dolor/calambres abdominales, diarrea, pérdida de peso, hematocrito/anemia) pueden cuantificarse usando metodologías convencionales. Adicionalmente, puede usarse un índice clínico tal como el índice de actividad clínica para colitis ulcerosa para monitorizar IBD. (Véanse también, por ejemplo, Walmsley et al. Gut. Julio de 1998; 43(1):29-32 y Jowett et al. (2003) Scand J Gastroenterol. 38(2):164-71).

Pancreatitis. La pancreatitis aguda se caracteriza por activación intrapancreática súbita de zimógenos pancreáticos, dando como resultado una destrucción esencialmente autolítica del páncreas si no se controla. Las principales enzimas implicadas son tripsinas humanas 1 y 2, quimotripsina pancreática humana y elastasa pancreática humana. Por consiguiente, la invención proporciona un método para el tratamiento de pancreatitis aguda (por ejemplo, estabilización o mejora de la puntuación de Ranson, puntuación de evaluación de fisiología aguda y salud crónica (Acute Physiology and Chronic Health Evaluation) (APACHE II) o índice de gravedad de tomografía computarizada (CTSI)) de Balthazar administrando a un sujeto que tiene (o se sospecha que tiene) pancreatitis aguda una proteína que inhibe al menos dos de las proteasas tripsina humana 1, tripsina humana 2, quimotripsina pancreática humana y elastasa pancreática humana.

Cáncer. Varias serina proteasas están implicadas en cáncer y rutas oncógenas. La hepsina y matriptasa están implicadas en la activación del factor de crecimiento de hepatocitos. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es un factor de crecimiento para muchos tumores y el bloqueo de su liberación privará a las células tumorales de un factor de crecimiento necesario. Además, la matriptasa también puede escindir pro-uPA para dar uPA, la enzima responsable de la generación de plasmina a partir de plasminógeno. La plasmina está implicada en la activación de diversas metaloproteinasas de la matriz (MMP). Tras la conversión de plasminógeno en plasmina activa, la plasmina permanece asociada con la superficie de una variedad de células cancerosas epiteliales. La actividad de MMP es importante en la escisión de una variedad de proteínas de la matriz que permiten que las células cancerosas escapen de un sitio o invadan nuevos sitios. Además, la matriptasa también puede escindir pro-uPA para dar uPA, la enzima responsable de la generación de plasmina a partir de plasminógeno. También se ha implicado a las endoteliasas 1 y 2 en cáncer.

Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, ralentización, eliminación o reversión del crecimiento tumoral, prevención o reducción, o bien en número o bien en tamaño, de las metástasis,

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reducción o eliminación de la invasividad de células tumorales, proporción de un intervalo aumentado para la progresión tumoral, o aumento del tiempo de supervivencia libre de enfermedad) de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, incluyendo cáncer de mama Her2+, Her2-, ER+, ER-, Her2+/ER+, Her2+/ER-, Her2-/ER+ y Her2-/ER-), cáncer de cabeza y cuello, cáncer de la cavidad oral, cáncer de laringe, condrosarcoma, cáncer de ovarios, carcinoma testicular, melanoma, tumores cerebrales (por ejemplo, astrocitomas, glioblastomas, gliomas)) administrando una cantidad eficaz de una proteína con múltiples dominios Kunitz modificada por ingeniería genética de la invención que inhibe al menos dos proteasas implicadas en cáncer, por ejemplo al menos dos proteasas del grupo de plasmina humana, hepsina humana, matriptasa humana, endoteliasa humana 1 y endoteliasa humana 2.

Los métodos divulgados son útiles en la prevención y el tratamiento de tumores sólidos, tumores de tejidos blandos y metástasis de los mismos. Los tumores sólidos incluyen tumores malignos (por ejemplo, sarcomas, adenocarcinomas y carcinomas) de los diversos sistemas de órganos, tales como los de pulmón, mama, tejido linfoide, tubos gastrointestinal (por ejemplo, colon) y genitourinario (por ejemplo, tumores renales, uroteliales o testiculares), faringe, próstata y ovario. Los adenocarcinomas a modo de ejemplo incluyen cánceres colorrectales, carcinoma de células renales, cáncer de hígado, carcinoma no microcítico de pulmón y cáncer del intestino delgado. Los tumores sólidos a modo de ejemplo adicionales incluyen: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumores de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, carcinomas del sistema genitourinario, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, carcinomas del sistema endrocrino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma microcítico de pulmón, carcinoma no microcítico de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. Las metástasis de los cánceres mencionados anteriormente también pueden tratarse o prevenirse según los métodos descritos en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Expresión de TFPI en células eucariotas

La tabla 1 muestra la secuencia de aminoácidos de LACI (también conocido como inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI)). La tabla 2 muestra la secuencia de aminoácidos de los diferentes dominios Kunitz dentro de LACI. Las posiciones marcadas con “|” (11, 13, 15-19, 34, 39-40) son ejemplos de residuos que pueden variarse para cambiar la especificidad de proteasa del dominio. Las posiciones marcadas con “A” (21 y 32) también pueden variarse.

Las posiciones marcadas “$” pueden contribuir a la estructura del dominio Kunitz. En algunas implementaciones, estas posiciones se mantienen invariantes. En otras implementaciones, pueden variarse, pero en un grado limitado, por ejemplo, para permitir sustituciones conservativas.

LACI contiene tres posibles sitios de glicosilación unida a N (Nx(S/T)). Los residuos de Asn (N) se muestran en negrita y subrayados en la tabla 1. En el dominio Kunitz2, N25 (numeración desde el comienzo del dominio) es un posible sitio de glicosilación. Esta posición está lejos de los residuos que entran en contacto con serina proteasas y la glicosilación en este sitio es poco probable que interfiera con la unión a o inhibición de proteasas. La glicosilación de una segunda Asn en el ligador 3 tampoco es probable que afecte a la actividad. El tercer posible sitio en el dominio Kunitz 3 está lejos del sitio de unión y la glicosilación en este sitio no impedirá la unión a o inhibición de una proteasa.

La tabla 3 muestra el ADNc que codifica TFPI. El ADN que codifica la secuencia señal supuesta va desde la base 133 hasta la base 216 (subrayada). La tabla 32 muestra el ADNc para TFPI de conejo. Allí se identifica una secuencia señal más corta. La proteína madura esta codificada por las bases 217-1044. La tabla 4 muestra la secuencia de ADN anotada de un vector, pFTFPI_V1, que tiene una secuencia modificada de TFPI que se expresaría en células CHO o HEK293T. Las modificaciones proporcionan sitios de restricción de modo que partes de TFPI pueden alterarse fácilmente. Pueden usarse otros vectores y otras secuencias señal. La secuencia de ADN se ha modificado para introducir varios sitios de restricción de modo que partes de TFPI pueden eliminarse o modificarse fácilmente. Las bases alteradas se muestran en mayúsculas, en negrita o subrayadas. En cada línea de la tabla 4, cada carácter que sigue a un punto de exclamación (!) es un comentario. La secuencia de ADN desnudo en esta tabla y otras tablas de aspecto similar puede recuperarse quitando los puntos de exclamación y todos los caracteres que le siguen en esa línea.

La secuencia de ADN en la tabla 4 puede construirse usando el ADNc de TFPI humano y los oligonucleótidos en la tabla 15. En primer lugar se usa el ADNc como molde y se usan ONMatureT y ON1019L27 para amplificar la región

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codificante, un segmento de 829 bases. Este ADN puede usarse como molde para diez reacciones PCR que usan los cebadores 1:(ONSfiT, ONSacHinL), 2:(ONSacHinU, ONMluIL), 3:(ONMluIU, ONBBBL), 4:(ONBBBU, ONXhoBamL), 5:(ONXhoBamU, ONBsmBIL), 6:(ONBsmBIU, ONApaSalL), 7:(ONApaSalU, ONSac2L), 8:(ONSac2U, ONBspE2L), 9:(ONBspE2U, ONBssH2L) y 10:(ONBssH2U, ONfinalL). Los diez productos (que tienen 20 o más bases de solapamiento con otro producto) se mezclan y se amplifican con los cebadores ONSfiT y ONfinalL para producir un producto de 874 bases. Este ácido nucleico se corta con SfiI y XbaI y se liga a un vector de expresión cortado de manera similar.

Ejemplo 2: Un derivado de TFPI que inhibe h.pKal y elastasa de neutrófilos humana

La elastasa de neutrófilos humana y calicreína plasmática humana pueden estar ambas implicadas en la respuesta inflamatoria asociada con cirugía de derivación coronaria (CBPS). Por tanto, una proteína que inhibe tanto elastasa de neutrófilos humana como calicreína plasmática humana puede tener efectos beneficiosos sinérgicos cuando se usa para tratar pacientes, por ejemplo, antes, durante o después de cirugía de derivación coronaria.

Un inhibidor que es altamente potente y específico para cada una de calicreína plasmática humana (h.pKal) y elastasa de neutrófilos humana está codificado por el gen presentado en la tabla 9. Los aminoácidos alterados se muestran en negrita y las bases mutadas se muestran en negrita y en mayúsculas. Los sitios de restricción se muestran en negrita. Podría usarse cualquier otra secuencia señal funcional en células eucariotas. Esta proteína se denomina TF88890. Este gen puede expresarse en el mismo vector que se usó para TFPI de longitud completa mostrado en la tabla 4 o en cualquier vector de expresión adecuado. Se corta el vector de expresión con SfiI y XbaI y se liga el ADN mostrado en la tabla 9 al ADN de vector digerido. La tabla 10 muestra los oligonucleótidos que pueden usarse para hacer cambios en el dominio Kunitz 1 y dominio Kunitz 2 de TFPI. El procedimiento es tal como sigue.

La PCR de pFTFPI_V1 con ON1U23 y ON718L21 proporciona un producto de 522 bases, PNK1, que comprende la secuencia madura hasta S174. Usando PNK1 como molde, ON1U23 y ONK1Bot proporcionan un producto de 141 bases, PNK2, que incluye cambios alrededor de los residuos 13-20 del dominio Kunitz1 de TFPI. Dentro del dominio Kunitz 1, los cambios son K15R, R17A, I18H, I19P y F21W. La PCR de PNK1 con ONK1T y ONK2B1 proporciona un producto de 265 bases, PNK3, que se solapa con el primer producto en 57 bases. Esta PCR introduce cambios en el dominio Kunitz 2: I13P, R15I, G16A, Y17F, I18F, T19P y Y21W. La PCR de PNK1 con ONK2T1 y ONK2B2 proporciona PNK4 de longitud de 104 que comprende un solapamiento de 51 bases con PNK3 y los cambios en el dominio Kunitz2 de TFPI. Esto introduce los cambios R32L, K34P y L39Q. La PCR de PNK1 con ONK2T2 y ON718L21 proporciona PNK5 con longitud de 165. Se mezclan PNK2, PNK3, PNK4 y PNK5 y se usan ONSfiTop y BotAmp para amplificar un fragmento de 573 bases. Se corta el producto de PCR final con SfiI y XbaI y se liga a un vector de expresión escindido de manera similar. El nuevo vector se denomina pFTFPI_V2.

La molécula codificada por pFTFPI_V2, TF88890, tiene las siguientes características esperadas. El primer dominio Kunitz inhibirá calicreína plasmática humana y el segundo dominio Kunitz inhibirá elastasa de neutrófilos humana (hNE). La proteína madura debe tener 174 aminoácidos y puede estar glicosilada en N117 y N167. N117 está en la posición 26 en el dominio Kunitz 2. Este sitio está ubicado en un lado diferente de la proteína con respecto al sitio de unión a proteasa y, por consiguiente, no se espera que interfiera con la unión a la proteasa. El N167 está en el ligador 3 y no se espera que interfiera con la inhibición de hNE. La proteína termina en S174. MMP-8 y MMP12 escinden TFPI de tipo natural en este sitio. Por tanto, la presencia de una proteína que termina con esta secuencia es menos probable que provoque una respuesta inmunitaria porque justo tal péptido resulta de la escisión con MMP- 8 o MMP12 de TFPI de tipo natural. El peso molecular esperado de TF88890 es de 19 KDa más la glicosilación. No se espera que TF88890 se una a superficies celulares a diferencia de TFPI porque la región de TFPI implicada en la unión a la superficie celular está ausente. La masa molecular de TF88890 es de aproximadamente 14 KDa y tendría una residencia corta en suero. Una residencia corta puede ser útil para tratar pacientes que se someten a cirugía de derivación coronaria. Sin embargo, puede crearse por ingeniería genética un tiempo de residencia prolongado, por ejemplo, uniendo uno o más restos de polímero (por ejemplo, restos de PEG).

En las tablas 20-25 se muestran diseños alternativos para TF88890. Un diseño alternativo adicional es usar la secuencia mostrada en la tabla 9 con las bases 508-579 delecionadas. Este constructo sería TF88890S y comprendería 150 aminoácidos con dos posibles sitios de glicosilación unida a N. TF88890S inhibiría calicreína plasmática humana y elastasa de neutrófilos humana. Las secuencias en estas tablas son secuencias de aminoácidos maduras a modo de ejemplo. Para producir una proteína que incluye estas secuencias mediante secreción, puede añadirse una secuencia señal adecuada para la expresión en células eucariotas (tales como células de mamífero (por ejemplo, CHO o HEK293T) o de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris), o células bacterianas (tales como E. coli o Caulobacter crescentus).

La proteína puede diseñarse de modo que no incluya más de dos sitios de glicosilación, por ejemplo, la proteína puede carecer de sitios de glicosilación unida a N.

Los dominios Kunitz pueden unirse con un ligador, por ejemplo, un ligador hidrófilo, flexible (por ejemplo, mediante el ligador: GGSGGSSSSSG). Ligadores que carecen de epítopos de células T son particularmente útiles. Todos los

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ligandos para moléculas del CMH contienen al menos uno o dos tipos de aminoácidos seleccionados de: (a) hidrófobos de medios a grandes (VILMFWY), o (b) cargados (EDRKH). Por consiguiente, ligadores (por ejemplo, de doce aminoácidos) que no contienen ninguno de estos aminoácidos evitan la creación de un neo-epítopo de CMH-I, incluyendo epítopos que pueden surgir de la yuxtaposición de residuos de dominios Kunitz adyacentes. Cuando se usa más de un ligador (por ejemplo, para una proteína con al menos tres dominios Kunitz), los ligadores entre los dominios Kunitz podrían ser diferentes.

Por ejemplo, TF88890-2 es una alternativa al diseño de TF88890 y se muestra en la tabla 20. TF88890-2 contiene dos copias de dominio Kunitz 1 de TFPI, el primero modificado para convertirlo en un inhibidor de calicreína plasmática humana (h.pKal) y el segundo modificado para convertirlo en un inhibidor de elastasa de neutrófilos humana.

La secuencia de aminoácidos de TF88890-3 madura se muestra en la tabla 21. TF88890-3 contiene tres copias de dominio Kunitz 1 de TFPI, el primero y el tercero modificados para convertirlos en un inhibidor de calicreína plasmática humana y el segundo modificado para convertirlo en un inhibidor de elastasa de neutrófilos humana. Los ejemplos de dominio Kunitz 1 de TFPI se unen mediante ligadores hidrófilos, flexibles (GGSGGSSSSSG) que no se espera que proporcionen ningún epítopo de células T. El primer o tercer dominio Kunitz podría modificarse para inhibir una proteasa diferente, dando un inhibidor triespecífico. Se espera que la masa molecular aumentada aumente el tiempo de residencia en suero.

La secuencia de aminoácidos de TF88890-4 madura se muestra en la tabla 22. TF88890-4 contiene cuatro copias de dominio Kunitz 1 de TFPI, el primero y el tercero modificados para convertirlos en un inhibidor de h.pKal y el segundo y el tercero modificados para convertirlos en un inhibidor de elastasa de neutrófilos humana. Los ejemplos de dominio Kunitz 1 de TFPI se unen mediante ligadores hidrófilos, flexibles (GGSGGSSSSSG) que no se espera que proporcionen ningún epítopo de células T. No es necesario que los ligadores sean todos iguales. Los cuatro dominios Kunitz podrían estar dirigidos a proteasas diferentes.

La secuencia de aminoácidos de TF88890-5 madura se muestra en la tabla 23. TF88890-5 contiene cuatro copias de dominio Kunitz 1 de TFPI, el primero y el tercero modificados para convertirlos en un inhibidor de h.pKal y el segundo y el tercero modificados para convertirlos en un inhibidor de elastasa de neutrófilos humana. Los ejemplos de dominio Kunitz 1 de TFPI se unen mediante ligadores hidrófilos, flexibles (GGSGNGSSSSGGSGSG) que no se espera que proporcionen ningún epítopo de células T. Los ligadores mostrados contienen cada uno un sitio de glicosilación unida a N (NGS). Si se produce en células eucariotas, TF88890-5 debe portar glicosilación en tres sitios, lo que debe aumentar la solubilidad y el tiempo de residencia en suero. No es necesario que los ligadores sean todos iguales. Los cuatro dominios Kunitz podrían estar dirigidos a proteasas diferentes.

Ejemplo 3: Un inhibidor de plasmina humana, h.pKal, y elastasa de neutrófilos humana basado en TFPI.

La tabla 16 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína derivada de TFPI humano y denominada PlaKalEl01. La secuencia KGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVKNM se deleciona del extremo C-terminal de TFPI de tipo natural; esta secuencia está implicada en la unión a células y los efectos que tiene TFPI sobre la expresión génica. La eliminación de la secuencia y los cambios en el dominio Kunitz 3 proporcionan una proteína que ni se une a células ni modula la expresión génica celular. En el dominio Kunitz 1, se ha cambiado el residuo 15 del dominio Kunitz 1 de Lys a Arg. En el residuo 17, se ha cambiado Ile a Arg. En el residuo 18, Met se cambia a Phe. En el residuo 19, se cambia Lys a Asp. En el residuo 21 se cambia Phe a Trp. Estos cambios producen un dominio Kunitz idéntico a DX-1000, un potente inhibidor de plasmina humana.

En el dominio Kunitz 2 se hacen los siguientes cambios (todos indicados por la posición dentro del dominio Kunitz): I13P, G16A, Y17A, I18H, T19P, Y21W, K34I y L38E. Estos cambios hacen que un dominio Kunitz sea muy similar a DX-88 en la parte del dominio Kunitz que entra en contacto con calicreína plasmática humana. Es altamente probable que este dominio sea un inhibidor potente y específico de calicreína plasmática humana.

En el dominio Kunitz 3, se hacen los siguientes cambios: L13P, R15I, N17F, E18F, N19P, K34P, S36G, G39Q. Por tanto, el dominio Kunitz es muy similar a DX-890 que es un inhibidor de elastasa de neutrófilos humana altamente específico. Tal como notifican Piro y Broze (Circulation 2004, 110:3567-72.), la eliminación de la cola C-terminal altamente básica reduce enormemente la unión a células. Piro y Broze también notificaron que el cambio de R15 del dominio Kunitz 3 a Leu redujo enormemente la unión a células.

Puede construirse un gen que codifica PlaKalEl01 tal como sigue. Los oligonucleótidos mostrados en la tabla 17 se usan como cebadores con el ADNc de TFPI humano (mostrado en la tabla 3). Los oligonucleótidos Get_TFPI_top y ON937L24 se usan en primer lugar para amplificar la secuencia codificante desde el codón 1 hasta el codón 276, truncando por tanto los codones 3' terminales. El producto de 828 bases se denomina PKE_P1 y se usa como molde para seis reacciones PCR: a) Get_TFPI_top y MutK1:310L43 producen PKE_P2 (220 bases), b) MutK1:310U43 y MutK2:517L56 producen PKE_P3 (263 bases), c) MutK2:517U56 y MutK2:577L47 producen PKE_P4 (107 bases), d) MutK2:577U47 y MutK3:792L55 producen PKE_P5 (270 bases), e) MutK3:792U55 y MutK3:867L31 producen PKE_P6 (106 bases) y f) MutK3:867U31 y ONLowCapPKE producen PKE_P7 (114 bases). Se mezclan PKE_P2 a

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PKE_P7 y se amplifican por PCR con los cebadores ONLowCapPKE y ONNcoI para dar un producto de 861 bases que tiene los sitios NcoI y Xbal en los extremos. Este fragmento se corta con Sfil y Xbal y se liga a un vector de expresión escindido de manera similar que tiene un casete de expresión tal como se muestra en la tabla 9 (por ejemplo, pFcFuse) para la expresión en células eucariotas.

Ejemplo 4: Una modificación de PlaKalEl01 que es resistente a la escisión por MMP.

En la tabla 42 se muestran sustratos conocidos para MMP-8. Debe indicarse la preferencia de P en P3, G en P1 y I o L en P1'. En la tabla 43 se muestran sustratos conocidos para MMP-12.

Tabla 42: Sustratos de MMP-8 (de MEROPS(
http://merops.sanger.ac.uk/))

Sustrato: P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3' P4' Ref

1: G772 P Q G I A G Q
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2: Dpn P Q G I Q G 1

3: Dpn P L G L W A Dr 1

4: G P Q G I W G Q 1

5: Mca P L G L Dpa A R 1

Sustratos: 1: cadena alfa 1(I) de colágeno (Homo sapiens); escisión tras G775.

2: Dnp-P-Q-G-|-I-A-G-Q-dR-OH 3: Dnp-P-L-G-|-L-W-A-dR-NH2 4: G-P-Q-G-|-I-W-G-Q 5: Mca-P-L-G-|-L-Dpa-A-R-NH2

Ref. 1 = Tschesche, H., Pieper, M. & Wenzel, H. Neutrophil collagenase. En Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett, A.J., Rawlings, N.D. & Woessner, J.F. eds), págs. 480-486, Elsevier, Londres (2004).

Tabla 43: Algunas escisiones de sustratos conocidos para MMP-12

Sustrato: P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3' P4

1: R P F Q V K D T

2: G A M F L E A I

3: E A I P M S I P

4: L V E A L Y L V

5: E A L Y L V C G

Sustratos

1: Inhibidor de alfa1-proteinasa (Homo sapiens)

2: Inhibidor de alfa1-proteinasa 3: Inhibidor de alfa1-proteinasa 4: Cadena B de insulina (oxidada)

5: Cadena B de insulina (oxidada)

Referencia para todo: Shapiro, S.D., Hartzell, W.O. & Senior, R.M. Macrophage elastase. En Handbook of Proteolytic enzymen, 2 edn (Barrett, A.J., Rawlings, N.D. & Woessner, J.F. eds), págs. 540-544, Elsevier, Londres (2004).

La tabla 30 muestra la secuencia de aminoácidos de PlaKalE102. Esta proteína difiere de PlaKaLEl01 en que el codón 49 se cambia de un codón que codifica Leu a un codón que codifica Pro, el codón 112 se cambia de un codón que codifica Ile a un codón que codifica Pro, y el codón 203 se cambia de un codón que codifica Thr a un codón que codifica Pro para impedir la escisión por MMP-8 o MMP-12. Muchas proteasas tienen dificultades en la escisión antes de Pro y ninguno de los sustratos conocidos de MMP-8 o MMP-12 tienen Pro en la posición P1'.

Ejemplo 5: Semivida, metaloproteinasas y cisteína proteasas

La semivida de una proteína (a modo de ejemplo, la proteína PlaKalEl01) puede prolongarse mediante métodos que incluyen: 1) PEGilación, 2) fusión a Fc (por ejemplo, el dominio Fc de una IgG) en cualquiera del extremo amino o

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carboxilo terminal de Fc (por ejemplo, como PlaKalEl01::Fc o Fc::PlaKalE101), 3) fusión a seroalbúmina humana (o un fragmento de la misma) en el extremo amino o carboxilo terminal (por ejemplo, como PlaKalE101::hSA o hSA::PlaKalE101, o 4) produciendo multímeros de la proteína hasta que la masa molecular es lo suficientemente grande como para dar una semivida aceptable.

La tabla 18 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión PlaKalEl::GGSGGSGGSGGSGG::hSA. Aunque las moléculas son grandes, es muy probable que la semivida sea del orden de semanas, similar a IgG o hSA.

En la tabla 19 se muestra un dímero de PlaKalEl01. Tras el ligador 5, se inserta un ligador hidrófilo rico en glicina de 13 aminoácidos que evita secuencias antigénicas conocidas. Esto va seguido por otra copia de la secuencia de PlaKalEl01 madura. La proteína resultante tiene una secuencia de aminoácidos madura de 509, PKEPKE02. Se espera que la masa molecular aumentada proporcione a la molécula una semivida mucho más prolongada que PlaKalEl01. Se espera que PKEPKE02 y proteínas relacionadas tengan masas moleculares en exceso de 60 kDa y puedan tener semividas de varios días.

PKEPKE02 tiene dos sitios inhibidores para cada una de plasmina humana, h.pKal y elastasa de neutrófilos humana. Los dominios Kunitz de esta proteína pueden modificarse por ingeniería genética adicionalmente para crear una proteína que inhibe específicamente hasta seis serina proteasas diferentes. Adicionalmente, la proteína puede modificarse mediante fusión con una o más secuencias peptídicas cortas que inhiben: a) otra serina proteasa, b) metaloproteinasas o c) cisteína proteinasas.

Se inserta un gen que codifica PKEPKE02 tras una secuencia señal funcional en un vector adecuado para la expresión en levadura o células de mamífero, por ejemplo, expresión secretora. Por ejemplo, se inserta una secuencia de ADN que codifica PKEPKE02 entre los sitios SfiI y XbaI de un vector de expresión que tiene un casete de expresión similar al mostrado en la tabla 9. También es posible emplear la secuencia señal mostrada en la tabla 9 y seguir la secuencia de aminoácidos mostrada con uno o dos codones de terminación, como en la tabla 9.

La tabla 31 muestra la secuencia de Elsix, una proteína que comprende seis dominios Kunitz diseñados para inhibir elastasa de neutrófilos humana. La secuencia se deriva de un dímero de TFPI. Las mutaciones se indican en negrita. En el dominio Kunitz 1 las mutaciones son K15I, I17F, M18F, K19P y E39Q. En el dominio Kunitz 2, las mutaciones son I13P, R15I, G16A, Y17F, I18F, T19P y L39Q. En el dominio Kunitz 3, las mutaciones son L13P, R15I, N17F, E18F, N19P, S36G y G39Q. El dominio Kunitz 4 es una repetición del dominio Kunitz 1; el dominio Kunitz 5 es una repetición del dominio Kunitz 2 y el dominio Kunitz 6 es una repetición del dominio Kunitz 3. El ligador que une las dos mitades se compone de Gly y Ser. Hay seis posibles sitios de glicosilación mostrados como n, uno en N25 del dominio Kunitz 2, uno en el ligador 2 en N17, uno en N44 en el dominio Kunitz 3 y tres más en la segunda copia de TFPI modificado.

La tabla 24 muestra la secuencia madura de aminoácidos de TF890-6. Esta molécula tiene seis dominios Kunitz idénticos, cada uno diseñado para inhibir elastasa de neutrófilos humana. El dominio Kunitz 1 de TFPI se modifica mediante las mutaciones K15I, I17F, M18F, K19P y E39Q. Hay más de 1 secuencia de ADN de E 24 que codifica esta secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, cada ejemplo del dominio Kunitz sería diferente para evitar la posible inestabilidad genética. Los ligadores tienen cada uno doce aminoácidos de longitud y se componen de glicina y serina. La longitud es tal que el aminoácido carboxilo terminal de un dominio Kunitz conjuntamente con los aminoácidos amino terminales del siguiente dominio Kunitz no formarían un epítopo para CMH-I. Es improbable que péptidos compuestos completamente por glicina y serina produzcan epítopos de CMH-I de unión estrecha.

Para la expresión mediante secreción, puede añadirse una secuencia que codifica una secuencia señal antes del ADN que codifica TF890-6. Para la expresión eucariota mediante secreción, es posible añadir una secuencia señal eucariota y expresar la proteína en Pichia pastoris o células de mamífero. Puesto que TF890-6 incluye 408 aminoácidos, la masa molecular es de aproximadamente 44,8 KDa, lo que podría proporcionar a la proteína un tiempo de residencia en suero aumentado en relación con proteínas que tienen menos dominios Kunitz.

La tabla 25 muestra la secuencia de aminoácidos de TF890-8 que comprende 548 aminoácidos y tendría una masa molecular aproximada de 60,3 KDa. TF890-8 contiene ocho dominios Kunitz de secuencia de aminoácidos idéntica. Los ligadores se componen de glicina y serina y tienen todos 12 aminoácidos de longitud. Esta molécula es monoespecífica para elastasa de neutrófilos humana, pero puede tener una semivida mucho mayor que DX-890 (un único dominio Kunitz con masa molecular de aproximadamente 7 KDa).

Para evitar tener múltiples repeticiones de ADN idéntico, puede modificarse por ingeniería genética el gen para (TF890-ligador)n (n puede ser de 1 a 10) tal como sigue. La tabla 28 muestra aDn que codifica un ligador corto, una versión modificada del dominio Kunitz 1 de TFPI (numerado 1-58), y más ligador (con letras a-l). Estas secuencias están flanqueadas por un cebador que se aparea con la secuencia que incluye secuencias que facilitan la digestión por enzimas de restricción. Al final de la tabla 28 están los oligonucleótidos que pueden usarse con PCR para producir ADNbc. ONUPTF890 y ONLPTF890 son cebadores de PCR de hebra superior e inferior. ONUATF890 y ONUCTF890 son hebras superiores y ONLBTF890 es una hebra inferior. El ADNbc se corta con Bsu36I que escinde

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cada hebra tras CC. Por tanto, el solapamiento es 5'-TCA-3' en la hebra superior y 5'-TGA-3' en la hebra inferior. Esto significa que los ligamientos juntarán las hebras superiores. Si se hubiera usado una enzima que produce una proyección palindrómica, las hebras superiores e inferiores se unirían aleatoriamente. Tras la escisión, los insertos largos se ligan en un vector que tiene un sitio Bsu36l compatible en condiciones que favorecen la inserción de múltiples insertos. Usando sitios de cebado fuera del sitio de inserción de Bsu36I, se examinan aislados para encontrar aquellos con 3, 4, 5, 6, 7 u 8 insertos. El vector puede diseñarse para permitir la expresión en células eucariotas, preferiblemente células de mamífero. Tal como se muestra en la tabla 28, los codones para los residuos S3-F20, 125-R47 y C51-X_h varían de un modo que mantiene la secuencia de aminoácidos de dominio Kunitz codificada pero maximizaron la diversidad de ADN. Los residuos en el ligador pueden ser o bien G o bien S. Por tanto, las cadenas de unidades tendrán solo segmentos cortos de identidad exacta.

Ejemplo 6: Estabilización de dominios Kunitz

Los dominios Kunitz con enlaces disulfuro pueden oligomerizarse a alta concentración y 37 °C en almacenamiento prolongado. La oligomerización puede resultar del intercambio de disulfuros entre monómeros. El disulfuro C14-C38 se expone sobre la superficie de dominios Kunitz canónicos y puede intercambiarse con cisteínas en otros dominios Kunitz formando enlaces intermoleculares. Por consiguiente, pueden diseñarse dominios Kunitz que inhiben proteasas diana pero que es menos probable que formen oligómeros mediante la eliminación del disulfuro C14-C38. En particular, los residuos de cisteína en estas posiciones pueden mutarse a aminoácidos distintos de cisteína, por ejemplo, alanina, glicina o serina. En una realización, las mutaciones son C14G o C38V. Un dominio Kunitz mutado de este tipo puede ser menos estable con respecto a la fusión pero más estable con respecto a la multimerización.

El dominio Kunitz 1 de TFPI puede modificarse por ingeniería genética para dar un inhibidor potente de elastasa de neutrófilos humana mediante las mutaciones Kl5I, I17F, M18F, K19P y E39Q. Para eliminar el disulfuro 14-38, pueden hacerse las mutaciones C14G y C38V tal como encontraron Hagihara et al. (Hagihara, et al., 2002, J Biol Chem, 277:51043-8). Esto podría disminuir la unión a elastasa de neutrófilos humana. La tabla 26 muestra un casete de presentación para el dominio Kunitz 1 de TFPI en el que se han hecho las mutaciones K15I, I17F, M18F y K19P con el fin de conferir afinidad por elastasa de neutrófilos humana. Además, se permite que las posiciones 12, 13, 14, 38 y 39 sean cualquier aminoácido excepto Cys. Esto proporciona una diversidad de 2.476.099. Obsérvese que NHK codifica los aminoácidos FLSY<terminación>PHQIMTNKVADE mientras que BGG codifica los aminoácidos WRG. Usando ambos de estos codones, se permiten todos los aminoácidos excepto Cys. ONTAAAxC tiene un sitio de restricción NcoI, y los codones hasta T27 con NHK en los codones 12, 13 y 14. ONTAABxC cubre el mismo intervalo excepto que 12 y 13 son NHK y 14 es BGG. ONTABAxC tiene BGG en 13 y NHK en 12 y 14. ONTABBxC tiene BGG en tanto 13 como 14 y NHK en 12. ONTBAAxC, ONTBABxC, ONTBBAxc y ONTBBBxC tienen todos BGG en 12 y NHK o BGG en 13 y 14 en el mismo patrón que los primeros cuatro oligonucleótidos. Por tanto se permite que 12, 13 y 14 sean cualquier AA excepto C. ONLoAAxC cubre los codones R20 a E49 (en donde está el sitio XbaI) más ADN de costra. Debido a que ONLoAAxC es una hebra inferior, tiene los complementos inversos de NHK y BGG, concretamente MDN y ccV. La tabla 27 muestra oligonucleótidos que implementarían esta estrategia. Los ocho oligonucleótidos largos se mezclan y los oligonucleótidos cortos se usan como cebadores para generar ADN que se extiende desde NcoI hasta XbaI. El producto de PCR se escinde con NcoI y XbaI y se liga a una versión de DY3P82 que contiene dominio Kunitz 1 de TFPI o un derivado del mismo que tiene los sitios NcoI y XbaI. La tabla 29 contiene la secuencia anotada de DY3P82TFPI1, un vector de fago que presenta el dominio Kunitz1 de TFPI sobre el muñón de M13 III. DY3P82TFPI1 tiene un gen de M13 iii de tipo natural y un gen de presentación regulado por PLac de modo que a) la expresión de la presentación puede suprimirse con glucosa e inducirse con IPTG, y b) la mayoría de los fagos presentan una o menos proteínas de dominio Kunitz::muñón de III. Esto permite distinguir muy buenos agentes de unión de agentes de unión meramente adecuados. Se seleccionan agentes de unión a elastasa de neutrófilos humana de la colección de fagos. Puesto que DX-890 se une a elastasa de neutrófilos humana con KD de aproximadamente 3 pM, se usan lavados muy rigurosos. Además, puede usarse DX-890 como agente de elución.

Se espera que puedan seleccionarse dominios Kunitz que carecen del disulfuro 14-38 y que inhiben proteasas diana. Una vez determinada una secuencia de aminoácidos que proporciona unión de alta afinidad e inhibición de elastasa de neutrófilos humana, puede construirse una colección de multímeros tal como se proporciona en el ejemplo 5. Este enfoque puede aplicarse a cualquier dominio Kunitz y a cualquier proteasa diana, y a proteasas diana plurales. Por ejemplo, si calicreína plasmática humana es la diana, es posible variar la secuencia de DX-88 en las posiciones 12, 13, 14, 38 y 39 excluyendo cualquier Cys de los aminoácidos variados.

Ejemplo 7: Un derivado de TFPI de conejo para estudios de inmunogenicidad y PK.

La tabla 32 muestra la secuencia de aminoácidos de TFPI de conejo. La tabla 33 muestra el ADNc de TFPI de conejo. La tabla 34 muestra RaTFPKE01, un derivado modificado por ingeniería genética de TFPI de conejo. En el dominio Kunitz 1, las mutaciones son Y17R, I18F, K19D y F21W que están diseñadas para conferir actividad inhibidora de plasmina humana en el dominio Kunitz 1. En el dominio Kunitz 2, las mutaciones son I13P, G16A, Y17A, I18H, T19P y L39E que están diseñadas para conferir inhibición de h.pKal en el dominio Kunitz 2. En el dominio Kunitz 3, las mutaciones son L13P, Q15I, N17F, E18F, I19P, S36G y G39Q que están diseñadas para conferir inhibición de elastasa de neutrófilos humana en el dominio Kunitz 3. El péptido básico C-terminal se ha

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truncado. Esta proteína puede producirse en células CHO de la misma manera que PlaKalEl01. La proteína debe tener una masa molecular de aproximadamente 30 KDa más glicosilación. Hay seis posibles sitios de Nx(S/T) pero uno es NPT y no es probable que esté glicosilado. Debido a que se ha alterado el tercer dominio Kunitz y se ha eliminado el péptido C-terminal rico en lisina, RaTFPKE01 debe tener una semivida razonable y no debe unirse a células.

La tabla 36 muestra un gen que codifica RaTFPKE01. La secuencia se dispone tal como se muestra: a) secuencia señal, b) primer ligador de tFpI de conejo, c) dominio Kunitz 1 con codones de cisteína subrayados y mutaciones mostradas en mayúsculas y negrita, d) el segundo ligador, e) dominio Kunitz 2, f) tercer ligador, g) dominio Kunitz 3 y g) ligador final. La tabla 37 muestra oligonucleótidos que pueden usarse para construir el gen de la tabla 36 de TFPI de conejo ADNc. Un primer oligonucleótido usa ADNc de TFPI de conejo y ONrSfi y TruncLo para producir un producto de 776 bases, PrTF1. Se usa PrTF1 como molde con ONrSfi y ONrK1Bot para producir PrTF2, un oligonucleótido de 162 bases. Se usa PrTF1 como molde con ONrK1Top y ONrK2Bot1 para producir PrTF3, un oligonucleótido de 239 bases. Se usa PrTF1 como molde con ONrK2To1 y ONrK2B2 para producir PrTF4, un

oligonucleótido de 103 bases. Se usa PrTF1 como molde con ONrK2T2 y ONrK3B1 para producir PrTF5, un

oligonucleótido de 236 bases. Se usa PrTF1 como molde con ONrK3T1 y ONrK3B2 para producir PrTF6, un

oligonucleótido de 99 bases. Se usa PrTF1 como molde con ONrK3T2 y ONrXbaIL para producir PrTF7, un

oligonucleótido de 117 bases. Se mezclan PrTF2-7 y se usan ONrSfi y ONrXbaIL como cebadores para producir PrTF8, un oligonucleótido de 790 bases que se corta con SfiI y XbaI y se liga a un vector de expresión cortado de manera similar.

La tabla 40 muestra la secuencia de aminoácidos de RaTFPKE04 madura, un derivado de TFPI de conejo. RaTFPKE04 tiene todas las mutaciones de RaTFPKE01 y tiene C14G y C38V en cada uno de los dominios Kunitz. El propósito es preparar una proteína que sea menos probable que se agregue que RaTFPKE01.

La tabla 35 muestra la secuencia de aminoácidos de RaTFPKE02, una proteína de 509 AA formada por la unión de dos copias de RaTFPKE01 madura con un ligador = GGSGSSGSGGSGSSG. La proteína madura debe tener una masa molecular de aproximadamente 56 Kda más glicosilación. RaTFPKE02 debe tener una semivida prolongada en conejos y no debe ser inmunogénica. La tabla 41 muestra la secuencia de aminoácidos de RaTFPKE05 madura. RaTFPKE05 es similar a RaTFPKE02 pero en cada dominio Kunitz, C14 se cambia a G y C38 se cambia a V. RaTFPKE05 es menos probable que se agregue que RaTFPKE02.

Ejemplo 8: Un inhibidor para hNE, hPr3 y hGatG

Los neutrófilos liberan tres serina proteasas cuando se activan: elastasa de neutrófilos (hNE, también conocida como elastasa leucocitaria), proteinasa 3 (Pr3) y catepsina G (CatG). Para bloquear el daño provocado por una activación excesiva de neutrófilos, puede usarse un agente que inhibe dos o más de estas proteasas, por ejemplo, las tres proteasas, cada una con alta afinidad y especificidad. Se conocen dominios Kunitz que inhiben elastasa de neutrófilos humana. Pueden obtenerse inhibidores de CatG mediante selección de una colección de dominios Kunitz (patente estadounidense 5.571.698). Podrían obtenerse inhibidores para PR3 a partir de una colección de dominios Kunitz de una manera similar.

En una realización, los residuos de aminoácido que confieren actividad inhibidora de Pr3 pueden transferirse entonces a otro dominio Kunitz, por ejemplo, un dominio Kunitz de una proteína de múltiples dominios, por ejemplo, una proteína que incluye tres dominios Kunitz. Los residuos de aminoácido que confieren actividad inhibidora de CatG pueden transferirse asimismo a otro dominio Kunitz de la proteína. Los residuos de aminoácido que confieren actividad inhibidora de hNE pueden transferirse al tercer dominio.

En otra realización, los dominios Kunitz que inhiben elastasa de neutrófilos, proteinasa 3 y catepsina G están físicamente asociados entre sí, por ejemplo, formando una proteína de fusión que incluye los diferentes dominios Kunitz.

En algunas realizaciones, la proteína modificada por ingeniería genética no se une a células y puede tener uno o más de los siguientes atributos (por ejemplo, dos, tres o cuatro de los siguientes): (a) capacidad para funcionar en presencia de defensinas de neutrófilos, (b) capacidad para resistir la degradación por MT6-MMP (leucolisina), (c) capacidad para inhibir proteasas unidas a superficies iónicas, (d) capacidad para reducir la producción de IL-8 a partir de neutrófilos y TNFa e IL-1 p a partir de monocitos.

Ejemplo 9: Farmacocinética en animales

Pueden usarse los siguientes métodos para evaluar la farmacocinética (PK) de proteínas tales como proteínas que incluyen dominios Kunitz en animales, por ejemplo, ratones y conejos.

La proteína que va a someterse a prueba se marca con yodo (125I) usando el método de método de yodógeno (Pierce). El tubo de reacción se enjuaga con tampón de reacción (Tris 25 mM, NaCl 0,4 M, pH 7,5). Se vacía el tubo y luego se reemplaza por 0,1 ml de tampón de reacción y 12 |il de yodo-126 libre de portador, aproximadamente

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1,6 mCi. Tras seis minutos, se transfiere el yodo activado a un tubo que contiene la proteína que va a someterse a prueba. Tras nueve minutos, se termina la reacción con 25 |il de disolución de tirosina saturada. La reacción puede purificarse en una columna de sal de D-poliacrilamida 6000 de 5 ml en Tris/NaCl. Puede usarse HSA para minimizar la adhesión al gel.

Se obtiene un número suficiente de ratones (aproximadamente 36). Se registra el peso de cada animal. En el caso de los ratones, se les inyecta a los animales en la vena de la cola aproximadamente 5 |ig de la proteína que va a someterse a prueba. Se recuperan muestras en cada punto de tiempo por animal, con cuatro animales por punto de tiempo, a aproximadamente 0, 7, 15, 30 y 90 minutos, 4 horas, 8 horas, 16 horas y 24 horas tras la inyección. Se recogen muestras (aproximadamente 0,5 ml) en anticoagulante (0,02 ml de EDTA). Se centrifugan las células y se separan del plasma/suero. Las muestras pueden analizarse mediante recuento de radiación y columna peptídica de SEC en HPLC con detección de radiación en línea.

Para conejos, el material se inyecta en la vena de la oreja. Pueden recogerse muestras a los 0, 7, 15, 30, 90 minutos, 4, 8, 16, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 horas tras la inyección. Las muestras pueden recogerse y analizarse como para los ratones.

Los datos pueden ajustarse a una curva de desintegración biexponencial (ecuación 1) o triexponencial (ecuación 2) que describe las fases “rápida”, “lenta” y “más lenta” del aclaramiento in vivo:

Ecuación 1 y = Aexp(-at) + Bexp(-pt)

Ecuación 2 y = Aexp(-at) + Bexp(-pt) + Cexp(-yt)

en donde:

y = cantidad de marcador que queda en el plasma a tiempo = t tras la administración A = marcador total en la fase de aclaramiento “rápida”

B = marcador total en la fase de aclaramiento “lenta”

C = marcador total en la fase de aclaramiento “más lenta” a = constante de desintegración de la fase de aclaramiento “rápida”

P = constante de desintegración de la fase de aclaramiento “lenta” y = constante de desintegración de la fase de aclaramiento “más lenta” t = tiempo tras la administración

Las constantes de desintegración a, P y y pueden convertirse en semividas para sus respectivas bases como: semivida de fase a = 0,69 (1/a) semivida de fase P = 0,69 (1/p) semivida de fase y = 0,69 (1/y)

En el caso en el que los datos se ajustan usando la ecuación biexponencial, los porcentajes del marcador total aclarado de la circulación in vivo a través de las fases a y p se calculan como:

% de fase a = [A/(A+B)] x 100

% de fase p = [B/(A+B)] x 100

En el caso en el que los datos se ajustan usando la ecuación triexponencial, los porcentajes del marcador total aclarado de la circulación in vivo a través de las fases a y p se calculan como:

% de fase a = [A/(A+B+C)] x 100

% de fase p = [B/(A+B+C)] x 100

% de fase y = [C/(A+B+C)] x 100

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Ejemplo 10: Un gen que codifica TIFP menos la región C-terminal cargada positivamente.

La tabla 50 muestra un gen que se ha optimizado para la expresión en células CHO y que codifica hTFPImC1. hTFPImC1 comprende: a) una secuencia señal, b) un ligador corto para promover la escisión por señal peptidasa, c) una etiqueta de seis-his para facilitar la purificación de la proteína de múltiples KuDom codificada, d) un sitio de escisión de trombina, e) codones correspondientes a TFPI 2-270. Este gen puede expresarse en células de mamífero, tales como células CHO. Se han eliminado los codones 271-304. Los residuos 271-304 hacen que TFPI se una a superficies celulares, que internalice y altere la expresión génica. Estos efectos no se desean en un inhibidor de proteasas terapéutico. hTFPImC1 puede purificarse en una resina de quelación de cobre por medio de la etiqueta de His6. La etiqueta de His puede eliminarse mediante tratamiento con trombina, que debe escindir tras R38.

La tabla 53 muestra el ADN de un vector que contiene el gen de la tabla 50 de modo que puede expresarse en células eucariotas. La tabla 56 muestra la secuencia de aminoácidos de hTFPImC1. Los residuos de Asn en donde se espera glicosilación unida a N se muestran como N en negrita con un “*” por encima.

Se expresó hTFPImC1 en células HEK293T transformadas con el vector mostrado en la tabla 53. Se purificó la mediante cromatografía de afinidad, y se analizó una muestra mediante cromatografía en gel, que mostró una masa molecular aparente de ~42,5 kDa.

Se sometió a prueba la unión a superficie celular de hTFPImC1 mediante citometría de flujo, que no mostró unión a superficie celular detectable (por encima del fondo).

Ejemplo 11: Un TFPI modificado, hTFPI[PpKhNE]

La tabla 51 muestra un gen anotado para hTFPI[PpKhNE]. hTFPI[PpKhNE] tiene el primer KuDom de TFPI modificado de modo que inhibirá plasmina humana (hPla), el segundo KuDom modificado de modo que inhibirá calicreína plasmática humana (h.pKal) y el tercer KuDom modificado de modo que inhibirá elastasa de neutrófilos humana (hNE). Para lograr estas especificidades, se han hecho las siguientes mutaciones. En el primer KuDom, se hicieron las mutaciones K15R, I17R, M18F, K19D y F21W para conferir actividad anti-plasmina. En el segundo KuDom, se hicieron las mutaciones I13P, G16A, Y17A, I18H, T19P, Y21W, K34I y L39E para conferir actividad plasmática anti-calicreína. En el tercer KuDom, se hicieron las mutaciones L13P, R15I, N17F, E18F, N19P, K34P, S36G y G39Q para conferir actividad anti-elastasa de neutrófilos humana. La tabla 54 muestra la secuencia de ADN de un vector que permite la expresión del gen mostrado en la tabla 51 en células eucariotas tales como células CHO. La tabla 57 muestra la secuencia de aminoácidos de hTFPI[PpKhNE] con anotación. Para cada uno de los KuDom, los AA de tipo natural se muestran a continuación de la secuencia de AA real. Debido a que la proteína se ha truncado y el tercer KuDom se ha modificado, no se espera que se una a superficies celulares (véase el ejemplo 10, anteriormente). Se espera que hTFPI[PpKhNE] inhibirá fuertemente plasmina humana (h.Pla), calicreína plasmática humana (h.pKal) y elastasa de neutrófilos humana (hNE).

Ejemplo 12: Pla301B, un inhibidor triple de plasmina humana.

La tabla 52 muestra un gen que codifica Pla301B, una proteína derivada de TFPI humano y que tiene tres KuDom, cada uno de los cuales está diseñado para inhibir h.Pla. La tabla 55 muestra la secuencia de un vector que permite la expresión de Pla301B en células eucariotas. La tabla 58 muestra la secuencia de aminoácidos de Pla301B. Para conferir actividad anti-h.Pla en Pla301B, se hicieron las siguientes mutaciones. En el primer KuDom, se hicieron las mutaciones K15R, I17R, M18F, K19D, F21W. En el segundo KuDom, se hicieron las mutaciones I13P, G16A, Y17R, I18F, T19D, Y21W y K34I. En el tercer KuDom, se hicieron las mutaciones L13P, N17R, E18F, N19D, F21W, K34I, S36G y G39E. Cada KuDom debe ser ahora un potente inhibidor de h.Pla.

Se sabe que la plasmina humana se activa por activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA). uPA se une a menudo a superficies celulares mediante el receptor de activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPA-R). h.Pla que se activa por el complejo uPA-uPAR se une a menudo al receptor de plasmina (Pla-R).

Se expresó Pla301B en células HEK293T con el vector mostrado en la tabla 55. Se sometió a ensayo la proteína para detectar la inhibición de plasmina y se encontró que era activa.

Ejemplo 13: Un inhibidor de múltiples KuDom que inhibe plasmina, matriptasa y hepsina.

HAI-1 inhibe matriptasa (Herter et al., Biochem J. 2005 390(Pt 1):125-36) por medio del dominio Kunitz 1(Kirchhofer et al., FEBS Lett. 2005 579(9):1945-50). (El primer dominio Kunitz de HAI-1B es idéntico al primer dominio Kunitz de HAI-1). HAI-2, dominio 1 inhibe hepsina (Parr y Jiang, Int J Cancer. 1 de septiembre de 2006; 119(5):1176-83.). La tabla 61 muestra una secuencia de aminoácidos de PlaMatHep, una proteína diseñada para inhibir plasmina, matriptasa y hepsina. En el primer KuDom de TFPI, se ha mutado K15 a R, 117 a R, M18 a F, K19 a D y F21 a W. Esto corresponde a DX-1000 (un potente inhibidor de plasmina) mostrado en la tabla 7. En el segundo KuDom, se

ha mutado 113 a R, Y17 a S, I18 a F, T19 a P, Y21 a W, E31 a K, R32 a S y K34 a V. El dominio mutado se muestra en la tabla 7 como TFPI-K2matt con AA de tipo natural en minúscula y mutaciones en mayúscula. Estos cambios deben hacer que el segundo dominio de PlaMatHep sea un potente inhibidor de matriptasa. En el tercer dominio de TFPI, se hicieron las mutaciones R11 a V, L13 a R, N17 a S, E18 a M, N19 a P, F21 a W, K34 a V, S36 a G, E42 a S 5 y K48 a E. La mutación K48E reducirá la posibilidad de unión a glucosaminoglucanos. Estos cambios se muestran en la tabla 7 como TFPI-K3hep y deben hacer que el tercer dominio de PlaMatHep sea un potente inhibidor de hepsina. Un gen para expresar la proteína mostrada en la tabla 61 se construye fácilmente a partir de los genes de otros derivados de TFPI mostrados en el presente documento.

10 Tablas TABLAS

Tabla 1: LACI humano (TFPI)

AA: Función Secuencia de AA

1-28: señal 112 2 1 5 0 5 0 5 MIYTMKKVHALWASVCLLLNLAPAPLNA

29-49: Ligador 1 3 3 4 4 4 0 5 0 5 9 DSEEDEEHTIITDTELPPLKL

50-107: KuDom 1 1 1 55S677S89900 050505050505 MHSFCAFKñDDGPCKAIMKRFPFNIFTRQCEEFIYGGCEGHQHRFESLEECKKMCTRD

108-120: Ligador 2 111 112 0 5 0 NANRIIKTTIjQQE

121-178: KuDom 2 111111111111 223344556677 150505050505 KPDFCFLEEDPGICKGYITRYFYNHQTKQCBJRFKYGGCLGNMNNFETLEECKNICEDG

179-212: Ligador 3 11112 2 2 8 8 9 S 0 0 1 0 5 0 5 0-5 0 PWGFQVDNYGTQLtiIAVHNSl.TPQSTKVPSL.FEFH

213-270: KuDom 3 222222222222 12233 4 455667 505050505050 GPSWC1.TPADRGLCRANENRFYYNSVIGKCRPFKYSGCGGNENNFTSKQECLRA.CKKG

271-304: Ligador 4 22 222 2 33 77 889900 15 050504 FIQRISKGGLIKTKRKRKKQRVKIAYEEIFVfCNM

Tabla 2: Secuencias de AA de los KuDom en LACI humano (TFPI)

imagen1

Tabla 3: ADNc de LACI humano (TFPI)

LOCUS

DEFINICIÓN

REGISTRO

VERSIÓN

NM—006287 X431 pb ARNm lineal

Inhibidor de la ruta de factor tisular de Homo sapiens (Inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteina) (TFPI), ARNm NM_006287

NM 006287.3 GI:40254845

PRI 08-JUN-2005

siq peptide_____133 . .216

/gen ="TFPI"

/ nota = “péptido señal de inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteina" mat_peptide 217..1044

/gen ="TFPI"

/producto = "inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteina"

ORIGEN

1 ggcgggtctg cttctaaaag aagaagtaga gaagataaat cctgtctCca atacctggaa' 61 ggaaaaacaa aataacctca actccgtttt gaaaaaaaca ttccaagaac tttcatcaga 121 gattttactt agatgattta cacaatgaaq aaagtacatg cactttgggc ttctgtatqc 181 ctgctgctta atcttgcccc tgcccctctt aatgctgatt ctgaggaaga tgaagaacac 241 acaattatca cagatacgga gttgccacca ctgaaactta tgcattcatt ttgtgcattc 301 aaggcggatg atggcccatg taaagcaatc atgaaaagat ttttcttcaa tattttcact 361 cgacagtgcg aagaatttat atatggggga tgtgaaggaa atcagaatcg atctgaaagt 421 ctggaagagt gcaaaaaaat gtgtacaaga gataatgcaa acaggattat aaagacaaca 481 ttgcaacaag aaaagccaga tttctgcttt ttggaagaag atcctggaat atgtcgaggt 541 tatattaccá ggtattttta taacaatcag acaaaacagt gtgaacgttt caagtatggt 601 ggatgcctgg gcaatatgaa caattttgag acactggaag aatgcaagaa catttgtgaa 661 gatggtccga atggtttcca ggtggataat tatggaaccc agctcaatgc tgtgaataac 721 eccctgactc cgcaatcaac caaggttccc agcctttttg aatttcacgg tccctcatgg 781 tgtctcactc cagcágacag aggattgtgt cgtgccaatg agaacagatt ctactacaat 841 tcagtcattg ggaaatgccg cccatttaag tacagtggat gtgggggaaa tgaaaacaat 901 tttacttcca aacaagaatg tctgagggca tgtaaaaaag gtttcatcca aagaatatca 961 aaaggaggcc taattaaaac caaaagaaaa agaaagaagc agagagtgaa aatagcatat 1021 gaagaaattt ttgttaaaaa tatgTGAatt tgttatagca atgtaacatt aattctacta 1081 aatattttat atgaaatgtt tcactatgat tttctatttt tcttctaaaa tcgttttaat 1141 taatatgttc attaaatttt ctatgcttat tgtacttgCt atcaacacgt tCgeatcaga 1201 gttgcttttc taatcttgtt aaattgctta ttctaggtct gtaatttatt aactggctac 1261 tgggaaatta cttattttct ggatctatct gtattttcat ttaactacaa aCtatcatac 1321 taccggctac atcaaatcag tcctttgatt ccatttggtg accatctgtt tgagaatatg 1381 atcatgtaaa tgattatctc ctttatagcc tgtaaccaga ttaagccccc c

5 Tabla 4: La secuencia de ADN anotada de pFTFPI_V1

!pFTFPI_Vl 5705

i

l Elementos que no cortan !AfeI AGCgct ÍApaLI Gtgcac ! BlpX GCtnagc .'BstXl CCANNNNNntgg !ECORV GATatC

¡Hpal GTTaac !Noti GCggccgc !PpuMI RGgwccy !SbfI CCTGCAgg ¡SnaBI TACgta ISwaI ATTTaaat !

CIRCULAR

AflII Cttaag

AscI GGcgcgcc

Bsgl ctgcac

Bsu36I CCtnagg

EspI GCtnagc

Mfei Caattg

Pací TTAATtaa

PshAI GACNNnngtc

SgfI GCGATcgc

Spel Actagt

Xcml CCANNNNNnnnntgg

Agel Accggt BglII Agatct BsiWI Cgtacg EcoNI CCTNNnnnagg Fsel GGCCGGcc Nhei Gctagc Pmel GTTTaaac Pstl CTGCAg SgrAI CRccggyg Sse8387l CCTGCAgg

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Proteína aislada que inhibe al menos calicreína tisular humana (h.K1) y calicreína plasmática humana, comprendiendo la proteína aislada al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética, en la

5

que al menos uno de los dominios Kunitz comprende la región de entramado del dominio Kunitz 1 del inhibidor de la ruta de factor tisular humano (TFPI), y comprende sustitución o modificación en uno o más de los residuos 11-19, 31, 32, 34 y 38-40, numerados con respecto a la secuencia de inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI) proporcionada en la tabla 7.

10 2.

Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que los al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética son al menos el 90 o el 95 % idénticos.
3.

Proteína aislada según la reivindicación 1 que inhibe cada proteasa humana con una Ki de menos de 10 nM.
15 4.

Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que la proteína comprende tres, cuatro, cinco o seis dominios Kunitz.

LO O CM

Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que al menos uno de los dominios Kunitz modificados por ingeniería genética contiene solo dos enlaces disulfuro.
6.

Proteína aislada según la reivindicación 1:

25

a) que tiene un peso molecular de al menos 15 kiloDaltons; b) que tiene una semivida en fase beta de al menos 30 minutos; c) que está modificada con dos o más restos PEG;

30

d) que inhibe las proteasas humanas en presencia de defensinas de neutrófilos; e) que es resistente a la degradación por MT6-MMP (leucolisina); o
35 7.

f) que no incluye sitios de escisión reconocidos por MMP-8 o MMP-12. Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que los al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética difieren entre sí.

4^ O 0°

Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que los al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética están conectados por un ligador hidrófilo flexible.
9.

Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que los al menos dos dominios Kunitz modificados por ingeniería genética no están separados por un resto seroalbúmina.

4^ en o

Proteína aislada según la reivindicación 1: a) que tiene menos de tres sitios de glicosilación;

50

b) que no tiene sitios de glicosilación; o c) que no tiene sitios de glicosilación unida a N.
11.

Proteína aislada según la reivindicación 1, en la que al menos uno de los dominios Kunitz modificados por ingeniería genética tiene la secuencia de aminoácidos de

55

EAMHSFCAFKADDGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD.
12.

Composición farmacéutica que comprende una proteína aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un portador farmacéuticamente aceptable.

60 13.

Proteína aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de un trastorno provocado por calicreína tisular humana y calicreína plasmática humana.