ES2665821T3 - Nuevo polipéptido de endolisina - Google Patents

Abstract

Polipéptido de endolisina específico para Staphylococcus, dicho polipéptido que comprende: i). un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 2, o ii). un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 1 y que tiene una deleción de al menos 5, 10, 20, 30, o 40 aminoácidos en la región de aminoácidos 156 a 199 de la SEQ ID N.º: 1, donde el polipéptido de endolisina tiene una actividad específica mejorada y/o una inmunogenicidad reducida en comparación con un polipéptido de endolisina con la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID N.º: 1.

Description

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20 horas a 30 °C. Las imágenes se tomaron usando un escáner de gel. Como control positivo se utilizó caldo CASO sin endolisina, y como control negativo se utilizó caldo CASO sin células de S. aureus.

Resultados

Determinación de la actividad específica de un polipéptido de endolisina según la invención mediante análisis de concentraciones inhibidoras mínimas

[0071] La actividad específica de XZ.700, un polipéptido de endolisina con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 se comparó con la de SA.100, un polipéptido de endolisina de referencia con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. Los resultados se representan en la Figura 1. Los valores de la MIC se obtuvieron por exposición de 2-3E + 5 ufc de S. aureus Newbold a diluciones en serie de Staphefekt en un formato de 200 µl. La imagen se tomó después de 20 h de incubación en medio CASO. El valor de la MIC de SA.100 fue de 62,5 nM y el valor de la MIC de XZ.700 fue de 15,6 nM en tres ensayos independientes; es decir, el valor de la MIC de XZ.700 es cuatro veces menor que el de SA.100, lo que indica una actividad específica cuatro veces mayor de XZ.700.

Determinación de la estabilidad térmica y la actividad específica de un polipéptido de endolisina según la invención mediante ensayo de turbidez

[0072] La estabilidad térmica y la actividad específica de XZ.700, un polipéptido de endolisina con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 se compararon con los de SA.100, un polipéptido de endolisina de referencia con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. En resumen, 200mM de SA.100 y XZ.700 se sometieron a 10 minutos de exposición a calor (eje X) seguido de enfriamiento en hielo. La actividad relativa en vista de SA.100 a 20 grados Celsius se determinó posteriormente por ensayo de turbidez por lisis. Se puede observar claramente en la Figura 2 que la actividad de XZ.700 es algo menor que SA.100 desde aproximadamente 55 grados Celsius y más allá, mientras que la actividad de XZ.700 es significativamente mayor que SA.100 hasta aproximadamente 55 grados Celsius. A temperatura ambiente, la actividad de ZX.700 es aproximadamente un 70% más alta que la de SA.100.

[0073] La actividad específica y la estabilidad térmica también se determinaron usando un ensayo cinético. XZ.700 y SA.100 a concentraciones de 200 nM se expusieron a calor entre 42 grados Celsius y 72 grados Celsius durante 10 minutos en tampón PBS en un termociclador de gradiente. Después del enfriamiento posterior en hielo, se registraron las cinéticas de lisis en ensayos de reducción de turbidez dinámica estándar a concentraciones de proteína de 100 nM frente a S. aureus SA.113 en tampón PBS pH 7.4. Las curvas de lisis se representan en la Figura 3 y muestran reducciones de la densidad óptica (eje Y, DO600nm~1 inicial) a lo largo del tiempo (eje X, duración 1 h). Se puede observar claramente que, hasta 60 grados Celsius, ZX.700 tiene una curva significativamente más pronunciada que SA.100, lo que indica una mayor actividad específica.

Predicción de inmunogenicidad de un polipéptido de endolisina según la invención.

[0074] Se realizaron predicciones de inmunogenicidad sobre las secuencias de polipéptidos XZ.700 y SA.100 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente) usando la página web tools.immuneepitope.org/bcell/ con los parámetros: posición central 4, tamaño de ventana 7 y umbral 1.0. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Está claro que el fragmento de péptido inmunogénico "VKELKHIYSNH" (posición 197-207 en SA.100) no está presente en XZ.700.

[0075] En conjunto, en este ejemplo no limitativo, se demostró que el polipéptido de endolisina según la invención XZ.700 tiene una actividad específica más alta y una inmunogenicidad más baja que el polipéptido de endolisina SA.100 de la técnica anterior.

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