ES2682928T3 - Método de purificación para proteínas dependientes de vitamina K mediante cromatografía de intercambio aniónico - Google Patents

Método de purificación para proteínas dependientes de vitamina K mediante cromatografía de intercambio aniónico Download PDF

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Abstract

Método para la separación de proteína dependiente de vitamina K inactiva de proteína dependiente de vitamina K activa en un método para la purificación de una proteína dependiente de vitamina K que comprende las etapas de: (a) cargar un material de resina de intercambio aniónico (a continuación también "el primer material de resina de intercambio aniónico") con la proteína dependiente de vitamina K en un tampón de carga en ausencia o baja concentración de cationes divalentes, opcionalmente seguido por de una a tres etapas de lavado; (b) eluir la proteína dependiente de vitamina K con un eluyente que comprende calcio y un contraión para formar un eluato que contiene la proteína dependiente de vitamina K, en el que: - está comprendido calcio 1-3 mM en el eluyente - el eluyente tiene una conductividad de 14 - 23 mS/cm (25 °C) y - el pH del eluyente es de entre 7,0 y 9,0, en el que la etapa (b) se selecciona del siguiente grupo: - la conductividad es de entre 18 y 20 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 -7,4 y Ca++ 1 mM, - la conductividad es de entre 18,5 y 21 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 1 mM, - la conductividad es de entre 19 y 22,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,6 - 8,0 y Ca++ 1 mM, o - la conductividad es de entre 20 y 23 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 1 mM, - la conductividad es de entre 15 y 17,0 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 - 7,4 y Ca++ 2 mM, - la conductividad es de entre 16 y 18 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 2 mM, - la conductividad es de entre 19,5 y 22 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 2 mM, - la conductividad es de entre 14,0 y 15 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 - 7,4 y Ca++ 3 mM, - la conductividad es de entre 15 y 15,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 3 mM, - la conductividad es de entre 14 y 16,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,6 - 8,0 y Ca++ 3 mM, o - la conductividad es de entre 15 y 19 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 3 mM.

Description

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DESCRIPCION
Metodo de purificacion para protemas dependientes de vitamina K mediante cromatograffa de intercambio anionico Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para la purificacion de protemas dependientes de vitamina K, en particular FIX (recombinante), con alto rendimiento y alta pureza sobre materiales de resina de intercambio anionico.
Antecedentes de la invencion
Desde la aparicion de la tecnologfa recombinante, muchas protemas de mairnfero se producen en celulas huesped, por ejemplo, transfectando celulas con ADN que codifica para dichas protemas y haciendo crecer las celulas recombinantes en condiciones favorables para la expresion de dichas protemas. Las protemas secretadas por las celulas en el medio de cultivo celular, o que residen dentro de las celulas, pueden separarse del medio de cultivo y otros componentes usando tecnicas cromatograficas, por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de afinidad, y similares. Para aplicaciones farmaceuticas adicionales, la pureza es de importancia particular. Sin embargo, al mismo tiempo la actividad biologica de la protema debe conservarse tras la purificacion concienzuda de las protemas de interes. El concepto de elucion de protemas de union a calcio de resinas de intercambio anionico mediante cationes divalentes se notifico por primera vez hace casi treinta anos. Aunque se aislo satisfactoriamente el factor VII bovino de plasma bovino, la purificacion de factor VII humano era todavfa problematica, es decir, el material producido era solo parcialmente puro o se obtuvo en cantidades muy pequenas. Los investigadores en el campo tuvieron exito en el aislamiento de factor VII humano a partir de plasma humano en cantidades suficientes (con un rendimiento de aproximadamente el 30 %) por medio de adsorcion de protemas a un cation divalente, es decir, citrato de bario, y luego la separacion de la protema mediante cromatograffa de intercambio anionico. Ademas, estaban disponibles metodos para recuperar y purificar protemas dependientes de vitamina K del medio de un cultivo celular que produce protemas dependientes de vitamina K con diferentes actividades espedficas por medio de resinas de intercambio ionico convencionales, por ejemplo, resinas de intercambio anionico, y usando un eluyente que contiene cationes divalentes, por ejemplo, ion de calcio (Ca2+), ion de magnesio (Mg2+), ion de bario (Ba2+) e ion de estroncio (Sr2+).
Ademas, estaban disponibles metodos para la purificacion del factor IX (FIX) en disolucion, que comprenden las etapas de aplicar la disolucion que contiene FIX a una resina de intercambio anionico, lavar la resina de intercambio anionico con una disolucion que tiene una conductividad que es menor que la requerida para eluir FIX de la resina, y eluir FIX de la resina de intercambio anionico con un primer eluyente que incluye cationes divalentes para formar un primer eluato. El primer eluato se aplica entonces a una resina de heparina o similar a la heparina para formar un segundo eluato, y el segundo eluato se aplica a hidroxiapatita para formar un tercer eluato, utilizando un agente de lavado de alta conductividad en la etapa de lavado.
El factor IX (FIX) es una serina proteasa dependiente de vitamina K del sistema de coagulacion, que pertenece a la familia de peptidasas S1. FIX es inactivo a menos que se active por el factor XIa o el factor VIIa. Para su activacion, se requieren calcio, y fosfoffpidos de membrana. La deficiencia de FIX provoca el trastorno hemorragico recesivo hereditario hemofilia B, que puede tratarse satisfactoriamente mediante la administracion de FIX modificado postraduccionalmente, es decir, FIX fosforilado y sulfatado. FIX puede convertirse ademas en FIX “activado” (procesado adicionalmente), es decir FIXa. Puesto que FIXa puede afectar negativamente a una composicion dada de FIX (por ejemplo aumentando su trombogenicidad tal como se describe en la bibliograffa), los productos de FIX deben contener preferentemente un bajo contenido en FIXa. Debe tenerse cuidado para no confundir FIX “activado”, es decir, FIXa, que es un FIX procesado adicionalmente que tiene los efectos negativos posibles descritos anteriormente, con FIX activo que es el FIX que tiene una actividad deseada en un sujeto dado y que no se ha procesado adicionalmente aun, por ejemplo, por FXIa o FVIIa. Por tanto, es igualmente importante que un producto de FIX tenga un alto contenido en FIX activo, y un bajo contenido en FIX inactivo, preferiblemente junto con un bajo contenido de FIXa “activado”. Un posible FIX inactivo puede ser FIX con un pro-peptido, FIX con una baja gamma- carboxilacion, FIX oxidado, FIX desamidado, FIX con una estructura terciaria incorrecta, etc. Ademas, el factor VII (FVII) es una serina proteasa dependiente de vitamina K que desempena un papel significativo en la cascada de coagulacion, donde inicia el proceso de coagulacion con factor tisular (TF). Tras la lesion de un vaso, se expone TF a la sangre y FVII circulante. Una vez unido a TF, se activa FVII a FVIIa por trombina, factor Xa, IXa, Xlla y el complejo de FVIIa-TF cuyos sustratos son FX y FIX.
Por tanto, el problema que subyace a la presente invencion es proporcionar un metodo mejorado para la purificacion de protemas dependientes de vitamina K con alto rendimiento y alta pureza, preferiblemente con un bajo contenido de FIX inactivo. La solucion al problema tecnico anterior se logra mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Sumario de la invencion
La presente invencion, en una realizacion preferida (punto 1), se refiere a un metodo tal como se define en la
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reivindicacion 1.
En ese sentido, la etapa (a) tal como se describe se lleva a cabo preferiblemente en ausencia o a baja concentracion de cationes divalentes libres. Cationes divalentes “libres” en ese contexto significara cationes divalentes no complejados. Es decir si, por ejemplo, estaba presente Ca++ aproximadamente 1 mM complejado con EDTA, se considerana todav^a que esta en ausencia de cationes divalentes (libres).
En una realizacion adicional preferida, el metodo para la purificacion comprende ademas las siguientes etapas:
(c) diluir el conjunto de eluatos obtenido, ((1) para disminuir opcionalmente la conductividad), y aumentar la concentracion del calcio,
(d) cargar un segundo material de resina de intercambio anionico con el eluato tal como se obtiene tras la etapa (c); y
(e) recoger la fraccion no retenida que contiene la protema dependiente de vitamina K.
La etapa opcional c (1) de disminuir la conductividad es necesaria solo si la conductividad no se ha disminuido ya en la ultima etapa de lavado opcional; preferiblemente, la disminucion de la conductividad se lleva a cabo en la etapa de lavado 3, tal como se describe en mas detalle a continuacion.
Lo siguiente describe las combinaciones para los parametros que se muestra que son decisivos para la separacion de protema dependiente de vitamina K inactiva. Todos los intervalos de parametros de la invencion descritos en el presente documento se refieren a la etapa de elucion (b).
El metodo segun el punto 1, en el que en la etapa (b):
- La conductividad es de entre 18 y 20 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 - 7,4 y Ca++1 mM

- la conductividad es de entre 18,5 y 21 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++1 mM

- la conductividad es de entre 19 y 22,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,6 - 8,0 y Ca++1 mM

- la conductividad es de entre 20 y 23 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++1 mM

- la conductividad es de entre 15 y 17,0 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 -7,4 y Ca++ 2 mM
- la conductividad es de entre 16 y 18 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 2 mM

- la conductividad es de entre 19,5 y 22 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 2 mM
- la conductividad es de entre 14,0 y 15 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 - 7,4 y 3 mM Ca++

- la conductividad es de entre 15 y 15,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 3 mM

- la conductividad es de entre 14 y 16,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,6 - 8,0 y Ca++ 3 mM, o
- la conductividad es de entre 15 y 19 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 3 mM.
En una realizacion particularmente preferida de la elucion (b), el intervalo para la conductividad y el pH se eligen a partir de las areas sombreadas en la figura 2A para una concentracion de Ca++ 1 mM, mientras que se eligen de las areas sombreadas en la figura 2B para una concentracion de Ca++ 2 mM, y mientras que se eligen de las areas sombreadas en la figura 2C para una concentracion de Ca++ 3 mM, siempre tal como se definio anteriormente. En una realizacion adicional preferida de la elucion (b), la conductividad y concentracion de Ca++ se eligen
- para un pH de 7,0, basandose en las areas sombreadas de la figura 3A,
- para un pH de 8,0, basandose en las areas sombreadas de la figura 3B, y
- para un pH de 9,0, basandose en las areas sombreadas de la figura 3C.
Todos los parametros de concentracion de calcio, pH y conductividad del eluyente (es decir, el tampon de elucion) tal como se describio anteriormente son parametros importantes. Todos pueden interferir con la elucion que tiene lugar sobre la resina de intercambio anionico e influir en la pureza final de la protema deseada.
Muy sorprendentemente, los inventores tambien pudieron mostrar que era necesaria una concentracion menor de
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Ca++ que la ensenada previamente en la tecnica anterior para lograr un resultado ventajoso.
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que es necesario controlar estos parametros en intervalos mas estrechos que los ensenados previamente y, en particular, en una relacion espedfica entre s^ si una protema diana inactiva debe separarse de una protema diana activa. Los inventores han mostrado que, por ejemplo, puede separarse rFIX inactivo de rFIX activo manteniendo los parametros anteriores controlados tal como se describe en el presente documento. En particular, el FIX inactivo podna separarse eficazmente en el esquema de purificacion descrito en el presente documento. Muy sorprendentemente, los inventores tambien pudieron mostrar que no era necesario un desplazamiento del pH desde la carga/lavado hasta la elucion en el primer material de intercambio anionico, siempre que los intervalos de parametros se fijaran tal como se describio anteriormente o tal como se muestra en las areas sombreadas de las figuras adjuntas.
“FIX activo” es FIX que tiene la actividad deseada en un sujeto dado. Los inventores creen, aunque esto es una hipotesis solo y no quieren restringirse a la misma, que el FIX activo es una molecula de cadena sencilla de longitud completa sin pro-FIX que porta gamma carboxilaciones en el extremo N-terminal y que tiene una integridad estructural completa (union por disulfuros, estructura secundaria y terciaria correctas) asf como glicosilacion. “FIX inactivo” es un FIX que no tiene la actividad deseada en un sujeto dado. Segun una posible teona, FIX inactivo puede originarse por infracarboxilacion, contenido en pro-peptido, oxidacion, desamidacion, disgregacion estructural, cambio en enlaces disulfuro, etc. El contenido de FIX inactivo en una composicion dada puede determinarse por medio de medicion de la actividad de FIX espedfica, que es menor en presencia de FIX inactivo. Fracciones que contienen solo FIX inactivo no tendran ninguna actividad de FIX espedfica en absoluto.
En la parte experimental, los inventores pudieron mostrar en el presente documento que una fraccion de aproximadamente el 25 % de protema dependiente de vitamina K podfa separarse durante la primera etapa de intercambio anionico (carga mas elucion) que era completamente inactiva. Eso muestra claramente que el material de carga, tal como se origina a partir de por ejemplo produccion recombinante de FIX en celulas CHO, comprende aproximadamente el 25 % de FIX inactivo, que no debe estar comprendido preferiblemente en la preparacion farmaceutica final. En una realizacion preferida de esta invencion, la protema de union a vitamina K se selecciona de un FIX, FVII o FX, producido de manera recombinante en celulas CHO, lo mas preferiblemente FIX, producido de manera recombinante en celulas CHO. Tras separar la protema dependiente de vitamina K inactiva por medio del presente esquema de purificacion de la invencion de la protema dependiente de vitamina K activa, la preparacion resultante se enriquece en vitamina K activa, preferiblemente libres esencialmente de vitamina K inactiva.
El presente metodo cromatografico sobre una resina de intercambio anionico permite por tanto la separacion de polipeptidos de rFlX (longitud completa) activos e inactivos.
Tambien se prefieren para la etapa de elucion (b) las siguientes realizaciones, en las que se reflejan combinaciones preferidas de conductividad, concentracion de Ca++ y pH basandose en los experimentos adjuntos:
- Ca
-pH. - Cond.
- mM
- - mS/cm (25 °C)
-1
- 7,0 -18,6
-1
- 7,0 - 19,8
-1
- 8,0 -21,2
-1
- 8,0 -22,4
-1
- 8,3 -23
-1
- 8,75 -23
-2
- 7,0 - 15,8
-2
- 7,0 - 16,9
-2
- 8,0 - 19,5
-2
- 9,0 -20,9
-2
- 9,0 -22,0
- 3
- 7,0 - 14,0
- 3
- 7,4 - 14,0
- 3
- 8,0 - 15,5

Claims (5)

  1. 10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
  2. 2.
    45
    50
  3. 3. 55
  4. 4.
    60
  5. 5. 65
    REIVINDICACIONES
    Metodo para la separacion de protema dependiente de vitamina K inactiva de protema dependiente de vitamina K activa en un metodo para la purificacion de una protema dependiente de vitamina K que comprende las etapas de:
    (a) cargar un material de resina de intercambio anionico (a continuacion tambien “el primer material de resina de intercambio anionico”) con la protema dependiente de vitamina K en un tampon de carga en ausencia o baja concentracion de cationes divalentes, opcionalmente seguido por de una a tres etapas de lavado;
    (b) eluir la protema dependiente de vitamina K con un eluyente que comprende calcio y un contraion para formar un eluato que contiene la protema dependiente de vitamina K, en el que:
    - esta comprendido calcio 1-3 mM en el eluyente
    - el eluyente tiene una conductividad de 14 - 23 mS/cm (25 °C) y
    - el pH del eluyente es de entre 7,0 y 9,0, en el que la etapa (b) se selecciona del siguiente grupo:
    - la conductividad es de entre 18 y 20 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 -7,4 y Ca++ 1 mM,
    - la conductividad es de entre 18,5 y 21 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++1 mM,
    - la conductividad es de entre 19 y 22,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,6 - 8,0 y Ca++1 mM, o

    - la conductividad es de entre 20 y 23 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++1 mM,

    - la conductividad es de entre 15 y 17,0 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 - 7,4 y Ca++ 2 mM,

    - la conductividad es de entre 16 y 18 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 2 mM,

    - la conductividad es de entre 19,5 y 22 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 2 mM,

    - la conductividad es de entre 14,0 y 15 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,0 - 7,4 y Ca++ 3 mM,

    - la conductividad es de entre 15 y 15,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,4 - 7,6 y Ca++ 3 mM,

    - la conductividad es de entre 14 y 16,5 mS/cm (25 °C) a un pH de 7,6 - 8,0 y Ca++ 3 mM, o
    - la conductividad es de entre 15 y 19 mS/cm (25 °C) a un pH de 8,0 - 9,0 y Ca++ 3 mM.
    Metodo para la purificacion segun la reivindicacion 1, que comprende ademas las siguientes etapas:
    (c) diluir el conjunto de eluatos obtenido, ((1) para disminuir opcionalmente la conductividad), y aumentar la concentracion del calcio,
    (d) cargar un segundo material de resina de intercambio anionico con el eluato tal como se obtiene tras la etapa (c); y
    (e) recoger la fraccion no retenida que contiene la protema dependiente de vitamina K.
    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que tras la etapa de cargar se realizan una o mas etapas de lavado (1), (2) y/o (3) con un tampon de lavado (1), (2) y/o (3) en ausencia de un cation divalente pero en presencia de un contraanion.
    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los materiales de resina de intercambio anionico primero y segundo tienen cada uno un grupo cargado positivamente que se selecciona independientemente del grupo que consiste en dietilaminoetano (DEAE), dimetilaminoetano (DMAE), trimetilaminoetilo (TMAE), polietilenimina (PEI), aminoalquilo cuaternario, aminoetano cuaternario (QAE) y amonio cuaternario (Q).
    Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la protema dependiente de vitamina K es una protema de union a cation divalente, preferiblemente una protema de union a calcio, y mas preferido, se selecciona del grupo que consiste en factor II, factor VII, factor IX, factor X, protema C y protema S.
    Conductiy/idad. tamper de eluci&n
    Figura 1
    Inuesligacidn: Gngfico de cenlemo de capture de FIX
    imagen1
    ElUCiorLpH = S Lavado2^pH " 0 Lavado2_LF =18
    Condirctividad de elucion
    imagen2
    pH de elucion ElucionCa = 1 Figura 2 A
    pH de elucion Eluci6n_Ca =12 Figura 2B
    pH de elucion Lavado2J>H = 6
    Eluci6n_Ca = 3 Lavado2_LF - 18
    Figura 2C
    Investigation: FIX_CPN:Akta_DOE CCF Grafik Diseno: CCF
    pH_E
    A
    9
    AM
    Ca t
    pH_E ;
    ZEF
    17
    ?
    7
    Ca E
    LF_e
    IF C
    pH_E
    imagen3
    Ca E
    LF..E
    i\j
    -^i
    LF W
    imagen4
    LF E
    LF_E
    imagen5
    LF„.E
    Lavado 2: pH: pH_W;conductividad; Con_W
    Elucion: pH: pH_E; conductividad: Con E; concentracidn de calcio Ca E
    pH.E
    imagen6
    LF_E
    imagen7
    pHJ
    Jr
    T-t
    O
    -7\
    To
    Ca E
    LF_E
    Figura 3
    pH_W
    —--------►
    M00DL9.1 -2012-06 22 16:12:02 [UTC + 1J
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