ES2687259T5 - Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNF - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos estables y solubles que inhiben TNF
Antecedentes de la invención
El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa, también conocido como caquectina) es una citocina de mamíferos de origen natural y es producido por numerosos tipos de células, incluidos los monocitos y macrófagos, como respuesta a endotoxinas u otros estímulos. TNFa es un mediador importante de las reacciones inflamatorias, inmunológicas y patofisiológicas (Grell, M. et al. (1995) Cell, 83: 793-802).
El TNFa soluble se forma mediante la escisión de una proteína transmembrana precursora (Kriegler et al. (1988) Cell 53: 45-53) y los polipéptidos de 17 kDa secretados se ensamblan en complejos homotrímeros solubles (Smith et al.(1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; para consultar artículos de revisión sobre el TNFA, remítase a Butler et al. (1986), Nature 320:584; Old (1986), Science 230: 630). A continuación, estos complejos se unen a receptores que se encuentran en una diversidad de células. La unión produce una serie de efectos proinflamatorios, que incluyen (i) la liberación de otras citocinas proinflamatorias tales como interleucina IL-6, IL-8 e IL-1, (ii) la liberación de metaloproteinasas de la matriz y (iii) el aumento de la expresión de moléculas de adhesión endotelial, que amplifican adicionalmente la cascada inflamatoria e inmunitaria al atraer leucocitos hacia los tejidos extravasculares.
Un gran número de trastornos están asociados con niveles elevados de TNFa, muchos de los cuales con una importancia médica significativa. Se ha mostrado que TNFa presenta una mayor expresión en varias enfermedades humanas, incluidas las enfermedades crónicas tales como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), trastornos intestinales inflamatorios que incluyen la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, septicemia, insuficiencia cardiaca congestiva, asma bronquial y esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para el TNFa humano producen niveles elevados de TNFa de forma constitutiva y desarrollan una poliartritis destructiva espontánea que se asemeja a la RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10,4025-4031). Por consiguiente, se hace referencia a TNFa como una citocina proinflamatoria.
En la actualidad, está bien establecido que el TNFa es clave en la patogénesis de la RA, la cual es una enfermedad crónica, progresiva y debilitante, caracterizada por la inflamación y destrucción de las articulaciones poliarticulares, con síntomas sistémicos de fiebre, malestar y fatiga. La RA también conduce a una inflamación sinovial crónica, con una evolución frecuente hacia la destrucción del cartílago articular y del hueso. Se encuentran niveles elevados de TNFa tanto en el líquido sinovial como en la sangre periférica de pacientes que padecen RA. Cuando se administran agentes bloqueadores de TNFa a pacientes que padecen RA, estos reducen la inflamación, mejoran los síntomas y retrasan el daño articular (McKown et al. (1999), Arthritis Rheum. 42:1204-1208).
Desde el punto de vista fisiológico, el TNFa también se asocia con la protección de infecciones particulares (Cerami. et al. (1988), Immunol. Today 9:28). El TNFa es liberado por macrófagos que han sido activados por lipopolisacáridos de bacterias gramnegativas. En este sentido, el TNFa parece ser un mediador endógeno de importancia central implicado en el desarrollo y la patogénesis del choque endotóxico asociado con la sepsis bacteriana (Michie et al. (1989), Br. J.Surg.76:670-671.; Debets. et al. (1989), Second Vienna Shock Forum, pág. 463-466; Simpson et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987). Lancet 1: 355-357; Hammerle. et al. (1989) Second Vienna Shock Forum pág. 715­ 718; Debets. et al. (1989), Crit. Care Med. 17:489-497; Calandra. et al. (1990), J. Infect. Dis. 161:982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123:162-170).
Al igual que con otros sistemas de órganos, también se ha demostrado que el TNFa juega un papel clave en el sistema nervioso central, en particular en los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios del sistema nervioso, que incluyen la esclerosis múltiple, el síndrome de Guillain-Barré y la miastenia grave, y en los trastornos degenerativos del sistema nervioso, que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington. El TNFa también está implicado en trastornos de sistemas relacionados de la retina y del músculo, que incluyen neuritis óptica, degeneración macular, retinopatía diabética, dermatomiositis, esclerosis lateral amiotrófica y distrofia muscular, así como en lesiones del sistema nervioso, que incluyen lesión cerebral traumática, lesión aguda de la médula espinal y accidente cerebrovascular.
La hepatitis es otro trastorno inflamatorio relacionado con el TNFa que, entre otros factores desencadenantes, puede estar provocado por infecciones víricas, que incluyen el virus de Epstein-Barr, citomegalovirus y virus de hepatitis A-E. La hepatitis provoca inflamación aguda del hígado en la región portal y lobular, seguida de fibrosis y evolución hacia un tumor. El TNFa también puede mediar en la caquexia en el cáncer, que provoca la mayor parte de la morbilidad y mortalidad por cáncer (Tisdale M. J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305).
El papel clave que juega el TNFa en la inflamación, las respuestas inmunitarias celulares y la patología de muchas enfermedades ha conducido a la búsqueda de antagonistas de TNFa. Una clase de antagonistas de TNFa diseñada para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNFa son los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a TNFa y con ello bloquean su función. El documento US2006/0216293 divulga anticuerpos que neutralizan TNFa procedentes de conejos. El uso de anticuerpos anti-TNFa ha demostrado que un bloqueo de TNFa puede revertir los efectos atribuidos al TNFa, incluidas las disminuciones de IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, moléculas de adhesión y la destrucción de tejidos (Feldmann et al. (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350). Entre los inhibidores específicos de TNFa que se han comercializado recientemente, se incluye un anticuerpo monoclonal quimérico de ratónhumano dirigido contra TNFa (infliximab, Remicade™; Centocor Corporation/Johnson & Johnson), que ha demostrado eficacia clínica en el tratamiento de la RA y la enfermedad de Crohn. Todos los inhibidores comercializados de TNFa se administran por vía intravenosa o subcutánea en intervalos semanales o más largos como inyecciones de bolo, lo que da como resultado concentraciones de partida altas que disminuyen de manera constante hasta la siguiente inyección. Su volumen de distribución es limitado.
A pesar de estos avances, sigue existiendo la necesidad de formas nuevas y eficaces de anticuerpos u otros inmunoligadores para el tratamiento de trastornos asociados al TNFa, tales como RA. En particular, existe una necesidad urgente de inmunoligadores con propiedades funcionales óptimas para el tratamiento eficaz y continuo de la artritis y otros trastornos mediados por TNFa que permitan una administración y formulación más flexibles y tengan una penetración tisular mejorada y, con ello, un volumen de distribución incrementado.
Compendio de la invención
Por lo tanto, es un objeto general de la invención proporcionar un anticuerpo estable y soluble u otro inmunoligador, que se una específicamente al TNFa in vivo e in vitro. La presente invención proporciona un inmunoligador que se une específicamente al TNFa humano, comprendiendo el inmunoligador: (i) una secuencia de marco variable de cadena pesada humana y secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 que proceden de un inmunoligador de conejo, donde el marco de la región variable de cadena pesada humana tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2; y (ii) una secuencia de marco variable de la cadena ligera humana y secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligador de conejo, donde la secuencia de marco de la región variable de la cadena ligera humana tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. La invención se define mediante las reivindicaciones.
En una realización preferida, dicho inmunoligador es un anticuerpo scFv o un fragmento Fab.
La presente invención proporciona anticuerpos scFv y fragmentos Fab estables y solubles específicos para TNFa, que comprenden secuencias de cadena ligera y de cadena pesada específicas que están optimizadas para conseguir estabilidad, solubilidad, unión de TNFa in vivo e in vitro y baja inmunogenicidad. Dichos anticuerpos están diseñados para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos mediados por TNFa. También se divulgan ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención, métodos para aislarlos y el uso de dichos anticuerpos en medicina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa la capacidad relativa de los sobrenadantes de 44 hibridomas RabMab anti-TNF de unirse al TNFa (ensayo Biacore) y neutralizar su actividad (ensayo L929).
La Figura 2 representa la capacidad de 20 anticuerpos monocatenarios RabMab anti-TNF y 7 anticuerpos monocatenarios anti-TNF humanizados de unirse selectivamente a TNFa (ensayo de secreción ELISA, téngase en cuenta que para este ensayo se utilizó sobrenadante de cultivo bacteriano, que no se normalizó respecto al contenido de anticuerpos monocatenarios).
La Figura 3 representa la cinética de unión (Figura 3A) de EP43max y la cinética de unión (Figura 3B) de EP34max a TNF alfa humano.
La Figura 4 representa la potencia de EP43max (cuadrados blancos) y la potencia (círculos negros) de ESBA105. La CE50 de EP43max es 1 ng/ml y la CE50 de ESBA105 es 6,5 ng/ml.
La Figura 5 representa el rendimiento de EP43max, EP6max y EP19max en un ensayo de despliegue térmico (FTIR).
La Figura 6 representa las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y derivados del mismo que se comparan mediante análisis FTIR.
La Figura 7 representa la comparación de EP43max (Figura 7A) y su variante EP43minmax (Figura 7B) en una prueba de estrés térmico.
La Figura 8 representa la definición de CDR H1 utilizada en la presente para injertar sitios de unión a antígenos de anticuerpos monoclonales de conejo en los marcos de anticuerpos humanos altamente solubles y estables.
La Figura 9a ilustra la potencia de Epi34max y adalimumab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para Ep34max y adalimumab era 1,03 ng/ml y 8,46 ng/ml, respectivamente. La Figura 9b ilustra la potencia de adalimumab y Epi34max para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para infliximab y Ep34max (791) era 66,2 ng/ml y 0,69 ng/ml, respectivamente.
La Figura 10a ilustra la potencia de Epi34max e infliximab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para Ep34max e infliximab era 1,04 ng/ml y 13,9 ng/ml, respectivamente. La Figura 10b ilustra la potencia de infliximab y Epi34max (791) para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para infliximab y Ep34max era 14,8 ng/ml y 0,63 ng/ml, respectivamente.
La Figura 11 ilustra el perfil de desnaturalización térmica de BioATR FT-IR ajustado a partir de los espectros infrarrojos con transformada de Fourier en la región de la banda de amida I de Ep34max en comparación con ESBA903. La V50 para ESBA903 fue 71,12 y para EP34max 71,50; la pendiente para ESBA903 2,481 y 2,540 para EP34max.
La Figura 12 ilustra las curvas de despliegue térmico de CDB para los anticuerpos scFv Ep34max y ESBA903. La Tm de EP34max es 78,11 °C y la Tm para ESBA903 es 76,19 °C.
Descripción detallada de la invención
Es un objeto general de la invención proporcionar un inmunoligador estable y soluble que se una específicamente al TNFa in vivo e in vitro. En una realización preferida, dicho derivado de anticuerpo es un anticuerpo scFv o un fragmento Fab. Los inmunoligadores de la invención comprenden preferentemente una cadena ligera y/o pesada.
Definiciones
Con el fin de que la presente invención se pueda entender más fácilmente, se definirán ciertos términos tal como se indica a continuación. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
El término «anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, es un sinónimo de «inmunoglobulina». Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser inmunoglobulinas enteras o fragmentos de estas, que comprenden al menos un dominio variable de una inmunoglobulina, tal como dominios variables únicos, Fv (Skerra A. y Pluckthun, A. (1988) Science 240:1038-41), scFv (Bird, R.E. et al., (1988) Science 242:423-26; Huston, J.S. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83), Fab, (Fab')2 u otros fragmentos muy conocidos por un experto en la técnica.
El término «CDR» se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión al antígeno. Una de las definiciones utilizadas más habitualmente para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Publicación de NIH 91-3242). Tal como se utiliza en la presente, la definición de Kabat de las CDR solamente se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3, o L1, L2, L3), así como a CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3, o H2, H3). Sin embargo, la CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), tal como se utiliza en la presente, está definida por los siguientes residuos (numeración de Kabat): Empieza en la posición 26 y termina antes de la posición 36. Esto es básicamente una fusión de CDR H1 tal como se define de forma diferente según Kabat y Chotia (remítase también a la Figura 8 con fines ilustrativos).
La expresión «marco de anticuerpo», tal como se utiliza en la presente, se refiere a la parte del dominio variable, ya sea VL o Vh , que sirve como un armazón para los bucles de unión al antígeno (CDR) de este dominio variable. Básicamente, es el dominio variable sin las CDR.
Se pretende que el término «anticuerpo monocatenario», «Fv monocatenario» o «scFv» se refiera a una molécula que comprende un dominio (o región; Vh) variable de cadena pesada de anticuerpo y un dominio (o región; Vl) variable de cadena ligera de anticuerpo conectados por un conector. Tales moléculas de scFv pueden tener las estructuras generales: NH2-VL-conector-VH-CoOH o NH2-VH-conector-VL-COOH.
El término «inmunoligador» se refiere a una molécula que contiene la totalidad o una parte del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, la totalidad o parte del dominio variable de cadena pesada y/o ligera, de tal modo que el inmunoligador reconoce específicamente un antígeno diana. Los ejemplos no limitantes de inmunoligadores incluyen moléculas de inmunoglobulina completa y scFv, así como fragmentos de anticuerpo, que incluyen pero no se limitan a (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fab'; (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único brazo de un anticuerpo, (vi) un anticuerpo monodominio tal como un fragmento Dab, que consiste en un dominio Vh o Vl, un anticuerpo de camélido o de tiburón (por ejemplo, Ig-NAR de tiburón Nanobodies®); y (vii) un nanocuerpo, una región de cadena pesada que contiene el dominio variable y dos dominios constantes.
Los sistemas de numeración tal como se utilizan en la presente para identificar posiciones de residuos de aminoácidos en las regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo corresponden al definido por A. Honegger, J.Mol.Biol.
309 (2001) 657-670 (el sistema AHo). Las tablas de conversión entre el sistema AHo y el sistema más comúnmente utilizado según definen Kabat et al. (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N.° 91-3242) se proporcionan en A. Honegger, J.Mol.Biol. 309 (2001) 657-670.
El término «epítopo» o «determinante antigénico» se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o un anticuerpo (por ejemplo, TNF). Un epítopo incluye habitualmente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Tomo 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
Los términos «unión específica», «unión selectiva», «se une selectivamente» y «se une específicamente» se refieren a un anticuerpo que se une a un epítopo en un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad (Kd) de aproximadamente menos de 10-7 M, tal como aproximadamente menos de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M o incluso menor.
El término «Kd» se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, los anticuerpos de la invención se unen a TNF con una constante de equilibrio de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 10'7 M, tal como menos de aproximadamente 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o incluso menor, por ejemplo, tal como se determina utilizando tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento BIACORE.
Tal como se utiliza en la presente, «identidad» se refiere a la coincidencia secuencial entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de dos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las respectivas moléculas son idénticas en esa posición. El «porcentaje de identidad» entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden, entonces las dos secuencias tienen un 60 % de identidad. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50 % de identidad (3 de las 6 posiciones totales coinciden). Generalmente, se realiza una comparación cuando dos secuencias están alineadas para obtener la máxima identidad. Tal alineación se puede proporcionar utilizando, por ejemplo, el método de Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, implementado convenientemente por programas informáticos tales como el programa Align (DNAstar, Inc.). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de peso de residuos PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de programas informáticos GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Son secuencias «similares» aquellas que, cuando se alinean, comparten residuos aminoacídicos idénticos y similares, donde los residuos similares son sustituciones conservadoras para residuos aminoacídicos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una «sustitución conservadora» de un residuo en una secuencia de referencia es una sustitución por un residuo que es física o funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente, por ejemplo, que tiene un tamaño, una forma, una carga eléctrica, propiedades químicas similares, que incluyen la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Por tanto, una secuencia «modificada por sustitución conservadora» es una que difiere de una secuencia de referencia o una secuencia natural (wildtype o wt) en que hay una o más sustituciones conservadoras presentes. El «porcentaje de similitud» entre dos secuencias es una función del número de posiciones que contienen residuos coincidentes o sustituciones conservadoras compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden y 2 de 10 posiciones contienen sustituciones conservadoras, entonces las dos secuencias tienen un 80 % de similitud positiva.
Tal como se utiliza en la presente, se pretende que el término «modificaciones conservadoras de la secuencia» se refiera a modificaciones de aminoácidos que no afectan ni alteran negativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras de la secuencia incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucléotidos y aminoácidos. Por ejemplo, pueden introducirse modificaciones mediante técnicas estándar conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen aquellas en las que el residuo aminoacídico se reemplaza por un residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones en la posición beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo aminoacídico no esencial predicho en un anticuerpo anti-VEGF humano se reemplaza preferentemente por otro residuo aminoacídico de la misma familia de cadenas laterales. Los métodos de identificación de sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión a antígeno son muy conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).
«Secuencia de aminoácidos consenso», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos que se puede generar utilizando una matriz de al menos dos, y preferentemente más, secuencias de aminoácidos alineadas, y permitiendo huecos en la alineación, de tal modo que es posible determinar el residuo aminoacídico más frecuente en cada posición. La secuencia consenso es aquella secuencia que comprende los aminoácidos que están representados con la mayor frecuencia en cada posición. En el caso de que dos o más aminoácidos estén representados por igual en una única posición, la secuencia consenso incluye ambos o todos estos aminoácidos.
La secuencia de aminoácidos de una proteína se puede analizar a diferentes niveles. Por ejemplo, se puede presentar conservación o variabilidad a nivel de un único residuo, nivel de múltiples residuos, múltiples residuos con huecos, etc. Los residuos pueden presentar conservación del residuo idéntico o pueden estar conservados a nivel de clase. Los ejemplos de clases de aminoácidos incluyen grupos R polares pero sin carga (serina, treonina, asparagina y glutamina); grupos R cargados positivamente (lisina, arginina e histidina); grupos R cargados negativamente (ácido glutámico y ácido aspártico); grupos R hidrófobos (alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina y tirosina); y aminoácidos especiales (cisteína, glicina y prolina). Un experto en la técnica conoce otras clases y estas se pueden definir utilizando determinaciones estructurales u otros datos para evaluar su sustituibilidad. En ese sentido, un aminoácido sustituible se puede referir a cualquier aminoácido que se puede sustituir y mantener la conservación funcional en esa posición.
Sin embargo, se reconocerá que los aminoácidos de la misma clase pueden variar en gran medida en cuanto a sus propiedades biofísicas. Por ejemplo, se reconocerá que ciertos grupos R hidrófobos (por ejemplo, alanina, serina o treonina) son más hidrófilos (es decir, de hidrofilia mayor o hidrofobia menor) que otros grupos R hidrófobos (por ejemplo, valina o leucina). La hidrofilia o hidrofobia relativa se puede determinar utilizando métodos reconocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Rose et al., Science, 229: 834-838 (1985) y Cornette et al., J. Mol. Biol., 195: 659-685 (1987)).
Tal como se utiliza en la presente, cuando una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una primera secuencia Vh o Vl) se alinea con una o más secuencias de aminoácidos adicionales (por ejemplo, una o más secuencias VH o VL en una base de datos), una posición de aminoácido en una secuencia (por ejemplo, la primera secuencia Vh o Vl) se puede comparar con una «posición correspondiente» en la una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Tal como se utiliza en la presente, la «posición correspondiente» representa la posición equivalente en la secuencia o secuencias que se están comparando cuando las secuencias tienen una alineación óptima, es decir, cuando las secuencias están alineadas para conseguir el porcentaje de identidad o porcentaje de similitud más alto.
Los inmunoligadores «quiméricos», tal como se utilizan en la presente, tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica u homóloga respecto a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo respecto a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos. Un anticuerpo humanizado, tal como se utiliza en la presente, es un subgrupo de anticuerpos quiméricos.
Los «anticuerpos humanizados», tal como se utilizan en la presente, son inmunoligadores que se han sintetizado utilizando tecnología de ADN recombinante para eludir la respuesta inmunitaria a antígenos exógenos. La humanización es una técnica bien consolidada para reducir la inmunogenia de anticuerpos monoclonales de fuentes xenogénicas. Un anticuerpo humanizado consiste en una región variable de cadena pesada humanizada, una región variable de cadena ligera humanizada y dominios constantes completamente humanos. La humanización de una región variable implica la elección de un marco aceptor, normalmente un marco aceptor humano, la extensión de las CDR del inmunoligador donante que se ha de insertar en el marco aceptor del dominio variable y la sustitución de residuos del marco donante en el marco aceptor. En la Patente de EE. UU. N.° 5225539, Winter divulga un método general para injertar CDR en marcos aceptores humanos. El documento US 6407 213 divulga una serie de posiciones de aminoácidos del marco en las que se prefiere una sustitución del inmunoligador donante.
Tal como se utiliza en la presente, el término «propiedad funcional» es una propiedad de un polipéptido (por ejemplo, un inmunoligador) para el que una mejora (por ejemplo, relativa a un polipéptido convencional) es deseable y/o ventajosa para un experto en la técnica, por ejemplo, con el fin de mejorar las propiedades de fabricación o la eficacia terapéutica del polipéptido. En una realización, la propiedad funcional es una estabilidad mejorada (por ejemplo, estabilidad térmica). En otra realización, la propiedad funcional es una solubilidad mejorada (por ejemplo, en condiciones celulares). En otra realización más, la propiedad funcional es la no agregación. En todavía otra realización, la propiedad funcional es una mejora en la expresión (por ejemplo, en células procariotas). En otra realización más, la propiedad funcional es una mejora en el rendimiento de replegamiento después de un proceso de purificación de cuerpos de inclusión. En determinadas realizaciones, la propiedad funcional no es una mejora en la afinidad de unión al antígeno.
El término «molécula de ácido nucleico» se refiere a moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero es preferentemente ADN bicatenario. Un ácido nucleico está «unido operativamente» cuando se establece una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor influye en la transcripción de la secuencia.
El término «vector» se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un «plásmido», que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores tienen capacidad de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma hospedador.
El término «célula hospedadora» se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión. Las células hospedadoras pueden incluir células bacterianas, microbianas, vegetales o de animales. Las bacterias, que son susceptibles de transformación, incluyen miembros de las enterobacterias, tales como cepas de Escherichia coli o Salmonella; Bacillaceae, tales como Bacillus subtilis; neumococos; estreptococos} y Haemophilus influenzae. Los microbios adecuados incluyen Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Las líneas celulares hospedadoras de animal adecuadas incluyen células CHO (líneas de ovario de hámster chino) y NS0.
Los términos «tratar», «que trata/n» y «tratamiento» se refieren a medidas terapéuticas o preventivas descritas en la presente. Los métodos de «tratamiento» emplean la administración a un sujeto, que necesita tal tratamiento, de un anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, un sujeto que padece un trastorno mediado por TNFa o un sujeto que puede desarrollar un trastorno de este tipo a la larga, con el fin de prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, o mejorar uno o más síntomas del trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto superando la esperada en ausencia de tal tratamiento.
El término «trastorno mediado por TNF» o «enfermedad mediada por TNS» se refiere a cualquier trastorno, la aparición, la evolución o la persistencia de los síntomas o estados patológicos de este que requiere la participación de TNF. Los trastornos mediados por TNF ilustrativos incluyen, sin carácter limitante, estados de inflamación crónicos y/o autoinmunitarios en general, trastornos inflamatorios inmunomediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan al ojo, las articulaciones, la piel, las membranas mucosas, el sistema nervioso central, el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis por HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluida la neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis (incluida la artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incluidas las manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto frente a huésped, reacciones de huésped frente a injerto, episodios de rechazo después de un trasplante de órgano o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, preclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis vírica, hepatitis alcohólica, inflamación posquirúrgica tal como después de una cirugía ocular (por ejemplo, cirugía de cataratas (reemplazo del cristalino) o cirugía de glaucoma), cirugía articular (incluida la cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo, ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo, pTc A, aterectomía, colocación de stent), procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intraabdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) o inflamación perioperatoria (prevención) en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob. Osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis óseas, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si están provocadas por efectos centrales o periféricos del TNFa y si se clasifican como inflamatorias, formas nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS), gota, neuralgia posherpética, fibromialgia, estados locales de dolor, síndromes de dolor crónico debidos a un tumor metastásico, dismenorrea. Sepsis bacteriana, vírica o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica. El término «dosis eficaz» o «dosificación eficaz» se refiere a una cantidad suficiente para conseguir o al menos conseguir parcialmente el efecto deseado. El término «dosis terapéuticamente eficaz» se define como una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones en un paciente que ya está sufriendo la enfermedad. Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la gravedad del trastorno que se esté tratando y el estado general del propio sistema inmunitario del paciente.
El término «sujeto» se refiere a cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar a un sujeto con un trastorno mediado por TNF.
El término «lagomorfos» se refiere a miembros del orden taxonómico Lagomorpha, que comprende las familias Leporidae (por ejemplo, liebres y conejos) y Ochotonidae (picas). En una realización más preferida, el lagomorfo es un conejo. El término «conejo», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un animal que pertenece a la familia de los lepóridos.
Se utilizaron diferentes nomenclaturas para los inmunoligadores generados. Estos se identifican normalmente mediante un número (por ejemplo, n.° 34). En aquellos casos en los que se utilizó un prefijo tal como EP o Epi (por ejemplo, EP 34 que es idéntico a Epi 34 o al n.° 34), con ello se indica el mismo inmunoligador.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o evaluación de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de contradicción, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.
En las siguientes subsecciones se describen más detalladamente varios aspectos de la invención. Se entiende que las diferentes realizaciones, preferencias e intervalos se pueden combinar según se desee. Además, dependiendo de la realización específica, es posible que no se apliquen definiciones, realizaciones o intervalos seleccionados.
Anticuerpos anti-TNFa
En un aspecto, la presente invención proporciona inmunoligadores que se unen a TNFa y, por lo tanto, son adecuados para bloquear la función de TNFa in vivo. Las CDR de estos inmunoligadores derivan de anticuerpos monoclonales anti-TNFa de conejo tal como se divulga en el documento US 7431 927. Existe constancia de que los anticuerpos de conejo tienen afinidades particularmente altas. Además, las secuencias de CDR divulgadas en la presente son secuencias naturales, lo que significa que no es necesario realizar maduración por afinidad alguna de los inmunoligadores resultantes. En una realización preferida, el inmunoligador neutraliza el TNFa in vivo.
El inmunoligador de la presente invención, el cual se une específicamente a TNFa, comprende una secuencia de aminoácidos CDRH1, una CDRH2, una CDRH3, una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3. Las secuencias de aminoácidos CDR ilustrativas para su uso en los inmunoligadores de la invención se exponen en las SEQ ID Nos: 3-50 (Tabla 1). Las CDR expuestas en las SEQ ID Nos: 3-50 se pueden injertar en cualquier soporte de unión adecuado utilizando cualesquiera métodos reconocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; la Patente de EE. UU. N o 5225539 de Winter, y las Patentes de EE. UU. N.os 5530 101, 5585089, 5693762 y 6180370 de Queen et al.). Las CDR de diferentes anticuerpos originales se pueden combinar en un anticuerpo para generar especies de anticuerpos adicionales. Sin embargo, se prefiere que los inmunoligadores descritos en la presente estén humanizados, siendo adecuados de este modo para aplicaciones terapéuticas.
Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona un inmunoligador que se une específicamente al TNFa humano, comprendiendo el inmunoligador:
(i) una región variable de cadena pesada humanizada (VH), comprendiendo la región variable de cadena pesada una secuencia de marco variable de cadena pesada humana y secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 que proceden de un inmunoligador de conejo, donde el marco de la región variable de cadena pesada humana tiene al menos un 90 % de identidad con la Se Q ID NO: 2; y
(ii) una región variable de cadena ligera humanizada (VL), comprendiendo la región variable de cadena ligera una secuencia de marco variable de cadena ligera humana y secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligador de conejo, donde el marco de la región variable de cadena ligera humana tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
Tal como se conoce en la técnica, muchas cadenas VH de conejo tienen cisteínas apareadas extra respecto a las homólogas murinas y humanas. Además del puente disulfuro conservado formado entre cys22 y cys92, también hay un puente cys21-cys79, así como un puente interCDR S-S formado entre el último residuo de CDRH1 y el primer residuo de CDR H2 en algunas cadenas de conejo. Además, a menudo se encuentran pares de residuos de cisteína en la CDR-L3.
Además, muchas CDR de anticuerpos de conejo no pertenecen a ninguna estructura canónica previamente conocida. En particular, la CDR-L3 es a menudo mucho más larga que la CDR-L3 de un homólogo humano o murino.
Además de los conejos, la invención se puede utilizar para injertar CDR de cualquier lagomorfo.
En el caso de anticuerpos, las CDR de conejo expuestas en las SEQ ID Nos: 3-50 pueden injertarse en las regiones marco de cualquier anticuerpo de cualquier especie. Sin embargo, se ha descubierto previamente que los anticuerpos o derivados de anticuerpo que comprenden los marcos identificados en el denominado cribado de «control de calidad» (documento WO0148017) se caracterizan por una estabilidad y/o solubilidad generalmente alta y, por tanto, también pueden ser útiles en el contexto de aplicaciones extracelulares tales como la neutralización de TNFa humano. Es más, se ha descubierto además que una combinación particular de estos marcos solubles y estables de VL (cadena ligera variable) y VH (cadena pesada variable) es particularmente adecuada para albergar CDR de conejo. Se descubrió sorprendentemente que tras el injerto en dicho marco o sus derivados, se podía mantener por completo la conformación de bucle de una gran diversidad de CDR de conejo, con gran independencia de la secuencia del marco donante. Además, dicho marco o sus derivados que contienen diferentes CDR de conejo se expresan bien y se producen de forma satisfactoria, contrariamente a las cadenas sencillas de origen natural de conejo, y siguen reteniendo casi completamente la afinidad de los anticuerpos de conejo donantes originales. Por consiguiente, en una realización, las CDR expuestas en las SEQ ID Nos: 3-50 se pueden injertar en los marcos de anticuerpo humano obtenidos mediante el cribado de «control de calidad» divulgado en el documento EP1479694. Las secuencias de aminoácidos de marcos ilustrativos para su uso en la invención se exponen en las SEQ ID Nos: 1 y 2 que figuran a continuación.
SEQ ID No 1
Variable light chain of FW1.4
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3-50WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3_50
VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3-5oFGQGTKLTVLG
SEQ ID No 2
Variable heavy chain of FW1.4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(X)n=3-5oWVRQAPGKGLEWVS(X) n=3-so RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK(X)n=3-5oWGQGTLVTVSS
X puede ser cualquier aminoácido de origen natural. Pueden estar presentes al menos tres y hasta 50 aminoácidos. Las c Dr se insertan normalmente en los sitios donde X está presente.
En otras realizaciones, la invención proporciona un inmunoligador, que se une específicamente a TNFa, que comprende al menos una secuencia de aminoácidos de VH o de VL. Secuencias de aminoácidos de VH o VL ilustrativas para su uso en los inmunoligadores de la invención se exponen en las SEQ ID Nos: 51-111.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona además un inmunoligador, que se une específicamente a TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una similitud sustancial respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 51-111, y donde el inmunoligador retiene o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoligador anti-TNFa de la invención. Las similitudes porcentuales ilustrativas incluyen, sin carácter limitante, aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona además un inmunoligador, que se une específicamente al TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad sustancial respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 51-111, y donde el inmunoligador retiene o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoligador anti-TNFa de la invención. Las identidades porcentuales ilustrativas incluyen, sin carácter limitante, aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona además un inmunoligador, que se une específicamente al TNFa, que comprende una secuencia de aminoácidos con sustituciones conservadoras respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 51-111, y donde el inmunoligador retiene o mejora las propiedades funcionales deseadas del inmunoligador anti-TNFa de la invención.
En una realización más preferida, el inmunoligador de la invención comprende al menos una secuencia de CDR que tiene una identidad de al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, 90 %, 95 % o 100 % con una cualquiera de las SEQ ID Nos: 3-50.
En una realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 3-8.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 9-14.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 15-20.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 21-26.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 27-32.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 33-38.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 39-44.
En otra realización preferida de la invención, se proporciona un inmunoligador que comprende al menos una, preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o de la forma más preferida seis CDR del grupo que consiste en las SEQ ID Nos: 45-50.
Las secuencias de CDR proporcionadas en la presente en las SEQ ID Nos: 3-50 pueden comprender además sustituciones. Preferentemente, las secuencias tienen 3 sustituciones, más preferentemente 2 y de la forma más preferida solo una sustitución. Preferentemente, dichas sustituciones son tales que la capacidad de unión selectiva del inmunoligador no se ve afectada, pero la afinidad del inmunoligador está alterada, preferentemente potenciada.
Tabla 1. CDR donantes de Rabmab
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
En otra realización, la invención proporciona anticuerpos que se unen a un epítopo del TNFa humano, tal como lo reconoce un anticuerpo monoclonal que contiene un conjunto de CDR (H1-H3, L1-L3; pertenecientes a un clon de Rabmab) tal como se expone en la Tabla 1. Los anticuerpos de este tipo pueden identificarse basándose en su capacidad para competir de forma cruzada con un anticuerpo de la Tabla 1 en un ensayo de unión a TNF estándar. La capacidad de un anticuerpo de prueba de inhibir la unión de un anticuerpo de la Tabla 1 al TNFa humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con el anticuerpo de la Tabla 1 por la unión al TNFa humano y, por lo tanto, implica al mismo epítopo en el TNFa humano que el anticuerpo de la Tabla 1. En una realización preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en el TNFa humano que los anticuerpos expuestos en la Tabla 1 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar y aislar tal como se describe en la presente.
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monocatenarios (scFv) o fragmentos Fab. En el caso de anticuerpos scFv, se puede unir un dominio VL seleccionado a un dominio VH seleccionado en cualquier orientación mediante un conector flexible. Un conector adecuado del estado de la técnica consiste en secuencias de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 122) repetidas o variantes de estas. En una realización preferida de la presente invención, se utiliza un conector (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 72) o su derivado, pero también son posibles variantes de 1-3 repeticiones (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Se describen otros conectores que se pueden utilizar para la presente invención en Alfthan et al., (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al., (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al., (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al., (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 y Roovers et al., (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. La disposición puede ser NH2-VL-conector-VH-COOH o NH2-VH-conector-VL-COOH, siendo la primera orientación la preferida. En el caso de fragmentos Fab, los dominios variables VL de la cadena ligera seleccionados se condensan con la región constante de una cadena kappa de Ig humana, mientras que los dominios variables VH de la cadena pesada adecuados se condensan con el primer dominio constante (N-terminal) CH1 de una IgG humana. En el extremo C se forma un puente disulfuro entre cadenas entre los dos dominios constantes.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención pueden tener afinidades por el TNF humano con constantes de disociación Kd en un intervalo de 1 fM -10 ^M. En una realización preferida de la presente invención, la Kd es < 1 nM. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno se puede determinar experimentalmente utilizando un método adecuado (Berzofsky et al., «Antibody-Antigen Interactions», en Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: Nueva York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: Nueva York, NY) y métodos descritos en ellos.
Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos que tienen una región de cadena pesada variable (VH) y/o de cadena ligera variable (VL) de entre las siguientes secuencias de VH y VL (secuencias de CDR subrayadas):
SEQ ID NO: 51
■VH de EP43min
EVQLVES6GGLVQPgáSLRL'gCMS(5FgLS'SGAMSWVRQAPGKGLEWVSVII'SSGATv
YYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGGPDDSNSMGTFDPWGQ GTLVTVSS
■SEQ ID NO: 52
■VL de EP43min
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 53
■VH de EP43max
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGAT YYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQ GTLVTVSS
■SEQ ID NO: 54
■VL de EP43max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG FPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 55
■VH de EP43maxDHP
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGAT YYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQ GTSVTVSS
■SEQ ID NO: 56
■VL de EP43minmax: VL con T22K EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 57
■VL de EP43minmax: VL con V58F
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG FPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 58
VL de EP43minmax: VL con Q79E
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 59
VL de EP43minmax: VL con D81A
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASRLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 60
VH de EPImin
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNDAISWVRQAPGKGLEWVSYXSDWSIR YYANWAQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGDNGIWGQGTLV TVSS .. .. . . ........ NOTA: CDR-H1 de EPImin no coincide con la de EPImax
SEQ ID NO: 61
VL de EPImin
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQGTKLTVL G NOTA: CDR-H1 de EPImin no coincide con la de EPImax
SEQ ID NO: 62
VH de EPImax
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWVAYISDWSIR YYANWAQGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTV TVSS SEQ ID NO: 63
VL de EPImax
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQGTKLTVL G SEQ ID NO: 64
VH de EP6min
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVSTIGEAGRA YYANWARSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEVFNNGWGAFNIWGQG TLVTVSS
■SEQ ID NO: 65
■VL de EP6min
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESTYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 66
■VH de EP6max
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGTIGEAGRA YYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEVFNNGWGAFNIWGQG TLVTVSS
■SEQ ID NO: 67
■VL de EP6max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESTYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLAISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 68
■VH de EP15min
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGVSWVRQAPGKGLEWVSAIGETGRA YYANWAKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGEEFNNGWGAFNIWGQG TLVTVSS
■SEQ ID NO: 69
■VL de EP15min
.ElVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASG, VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 70
■VH de EP15max
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGAIGETGRA YYANWAKSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGEEFNNGWGAFNIWGQG TTVTVSS
■SEQ ID NO: 71
■VL de EP15max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFATSNVENPFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 72
■conector de glicina-serina
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 73
VH de EP19maxmod
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLS C TVSGFSLNSNEISWVRQAPGKGLEWVGYIGNGGMT HYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCASSVEYTDLYYLNIWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 74
VL de EP19maxmod
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLQSG VPSRFSGSGSGTOFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 75
VH de EP19minmod
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLNSNEISWVRQAPGKGLEWVSYIGNGGMT HYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSVEYTDLYYLNIWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 76
VL de EP19minmod
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASDNIYRGLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLQSG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCLGVYGYSSDDGAAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 77
VH de EP34min
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVSCIYGDND ITPLYANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLGYADYAYDLWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 78
VL de EP34min
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKPGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDEATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG SEQ ID NO: 79
VH de EP34max
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISRSYWICWVRQAPGKGLEWVACIYGDND ITPLYANWAKGRFPVSTDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGYADYAYDLWGQG TLVTVSS SEQ ID NO: 80
VL de EP34max
EIVMTQSPSTLSASLGDRVIITCQSSQSVYGNIWMAWYQQKSGKAPKLLIYQASKLA SGVPSRFSGSGSGAEFSLTISSLQPDDFATYYCQGNFNTGDRYAFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 81
■VH de EP35min
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSVGYWICWVRQAPGKGLEWVSCIDAGTS GGTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGVSSNGYYFKLWGQ GTLVTVSS
■SEQ ID NO: 82
■VL de EP35min
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASG VPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 83
■VH de EP35max
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVGYWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTS GGTYYATWAKGRF TISKD TSKNTVYLQMNSLRAED TATYYCARGVS SNGYYFKLWGQ GTTVTVSS
■SEQ ID NO: 84
■VL de EP35max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIVAASKLASG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKLTVLG
■SEQ ID NO: 85
■VH de EP42min
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWGIK YYASWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGAPGAGDNGIWGQGTLV TVSS NOTA: CDR-H1 de EP42min no coincide con la de EP42max
■SEQ ID NO: 86
■VL de EP42min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLA SGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQGTKLTVL
G
■SEQ ID NO: 87
■VH de EP42max
EVQLVESGGGSVQPGGS-LRLSCTySGIDLRNDAISWVRQAPGKGLEWVSY.ISDWGI-K YYASWVKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARGAPGAGDNGIWGQGTTV TVSS
■SEQ ID NO: 88
■VL de EP42max
STLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLASGVPSRFS GSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQGTKLTVLG
Producción de anticuerpos anti-TNF
La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los marcos de anticuerpos humanos altamente solubles y estables identificados mediante un ensayo de control de calidad (QC) son marcos particularmente adecuados para acomodar CDR de otras especies animales no humanas, por ejemplo, CDR de conejo. En particular, la invención se basa en el descubrimiento de que las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano particular (el denominado anticuerpo «FW 1.4») son particularmente adecuadas como aceptores de c Dr de una diversidad de anticuerpos de conejo de diferentes especificidades de unión. Aunque FW1.4 de marco monocatenario humano de ESBATech tuvo un rendimiento claramente inferior en el ensayo de control de calidad y cuando se expresó en células HeLa cuando se utilizó junto con sus CDR originales (tal como se divulga en el documento WO03/097697), se determinó sorprendentemente que, cuando se combina con otras CDR, tales como CDR de conejo, da lugar a anticuerpos monocatenarios muy estables, solubles y que se pueden producir de forma satisfactoria. Además, los inmunoligadores humanizados generados mediante el injerto de CDR de conejo en estos marcos ligeros y pesados altamente compatibles conservan de forma reproducible y fiable las propiedades de unión de los anticuerpos de conejo a partir de los que se obtienen las CDR donantes. Además, los inmunoligadores generados mediante los métodos de la invención exhiben de manera fiable propiedades funcionales superiores, tales como solubilidad y estabilidad. Por consiguiente, es un objeto general de la invención proporcionar métodos para injertar CDR de conejo y otras CDR no humanas, en los marcos de anticuerpos humanos de cadena ligera y/o de cadena pesada solubles y estables de SEQ ID NO: 1 (K127) y SEQ ID NO: 2 (a43), respectivamente, con lo que se generan de este modo anticuerpos humanizados con propiedades biofísicas superiores.
En una realización preferida, el marco comprende una o más sustituciones en el marco de cadena pesada (VH) en una posición del grupo que consiste en las posiciones H24, H25, H56, H82, H84, H89 y H108 (sistema de numeración AHo). De manera adicional o alternativa, el marco puede comprender una sustitución en el marco de cadena ligera (VH) en la posición L87 de acuerdo con el sistema de numeración AHo. Se ha demostrado que la presencia de dichas sustituciones proporciona un marco aceptor que conserva casi completamente la afinidad de los anticuerpos donantes originales. En una realización más preferida, la una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: treonina (T) en la posición H24, valina (V) en la posición H25, glicina (G) o alanina (A) en la posición H56, lisina (K) en la posición H82, treonina (T) en la posición H84, valina (V) en la posición H89 y arginina (R) en la posición H108 y treonina (T) en la posición L87 de acuerdo con el sistema de numeración AHo están presentes en la secuencia marco.
Por tanto, en una realización incluso más preferida, el marco aceptor es
SEQ ID NO. 89: variable heavy chain framework o f rFW1.4
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=3-5o
WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-50
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)n=3_5o WGQGTLV TVSS
SEQ ID NO. 90: variable heavy chain framework o f rFW1.4(V2)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)„=3-5o WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-50
RFTISKDTSKNTV YLQMN SLRAEDTA V YY C AR(X)n=3.5o WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO. 91: substituted variable light chain framework o f FW1.4
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3.5oWYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3-50
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3.5o FGQGTKLTVLG
SEQ ID NO. 92: framework o f rFW1.4
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3-5oWYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3-50
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3_5o FGQGTKLTVLG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS(X)n=3-50
WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3.5o RFTISRDTSKNTVYLQMNS
LRAEDTAVYYCAR(X)n=3.5o WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO. 93: framework o f rFW1.4(V2)
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC(X)n=3-5o WYQQKPGKAPKLLIY(X)n=3.50
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)n=3-50 FGQGTKLTVLG
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVS(X)n=3-50
WVRQAPGKGLEWVG(X)n=3-5o RFTISKDTSKNTVYLQMNSLR
A EDTAV Y YC A R ( X )n-3.5o WGQGTLVTVSS ::' = "
X puede ser cualquier aminoácido de origen natural; pueden estar presentes al menos tres y hasta 50 aminoácidos. Las CDR se insertan normalmente en los sitios donde X está presente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención se pueden generar utilizando técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Conociendo las secuencias de los polipéptidos, se pueden generar los ADNc que los codifican mediante síntesis génica utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Estos ADNc se pueden clonar en plásmidos vectoriales adecuados. Una vez que se obtiene el A d N que codifica un dominio VL y/o un VH, se puede realizar una mutagénesis dirigida al sitio, por ejemplo, mediante PCR utilizando cebadores mutagénicos, para obtener diferentes derivados. La mejor secuencia «de partida» se puede elegir dependiendo del número de alteraciones deseadas en las secuencias VL y/o VH. Una secuencia preferida son las secuencias de TB-A y sus derivados, por ejemplo, se pueden elegir secuencias de scFv o secuencias de péptidos de fusión de Fab como moldes para la clonación y/o mutagénesis dirigida por PCR.
Los métodos para incorporar o injertar CDR en regiones marco incluyen los que se exponen, por ejemplo, en Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; Patente de EE. UU. N.° 5225539 de Winter y las Patentes de EE. UU. Nos 5530 101,5585 089, 5693762 y 6180370 de Queen et al., así como los divulgados en las Solicitudes Provisionales de EE. UU. con Nos de serie 61/075697 y 61/155041, tituladas «Humanization of Rabbit Antibodies Using Universal Antibody Frameworks», presentadas el 25 de junio de 2008 y el 4 de febrero de 2009, respectivamente.
Se pueden utilizar técnicas de clonación y mutagénesis estándar muy conocidas por el experto en la técnica para acoplar conectores, reordenar dominios o construir fusiones para la producción de fragmentos Fab. Se describen protocolos básicos que divulgan los métodos generales de esta invención en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook y Russell, 3.a ed. 2001) y en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).
La secuencia de ADN que alberga un gen que codifica un polipéptido de scFv, o en el caso de fragmentos Fab, que codifica bien dos genes separados o bien un operón bicistrónico que comprende los dos genes para las fusiones VL-Ck y VH-CH1 se clonan en un vector de expresión adecuado, preferentemente uno con un promotor inducible. Se debe procurar que delante de cada gen esté presente un sitio de unión al ribosoma apropiado que garantice la traducción. Se ha de entender que los anticuerpos de la presente invención comprenden las secuencias que se divulgan en lugar de que consistan en ellas. Por ejemplo, las estrategias de clonación pueden requerir que se prepare un constructo a partir del cual esté presente un anticuerpo con uno o unos pocos residuos adicionales en el extremo aminoterminal. Específicamente, la metionina derivada del codón de iniciación puede estar presente en la proteína final en casos donde no se ha escindido postraduccionalmente. La mayoría de los constructos para anticuerpos scFv dan lugar a una alanina adicional en el extremo aminoterminal. En una realización preferida de la presente invención, se elige un vector de expresión para la expresión periplásmica en E. coli (Krebber, 1997). Dicho vector comprende un promotor delante de una secuencia señal escindible. La secuencia codificante para el péptido de anticuerpo se fusiona entonces en el mismo marco de lectura con la secuencia señal escindible. Esto permite dirigir el polipéptido expresado al periplasma bacteriano donde la secuencia señal se escinde. Entonces el anticuerpo se pliega. En el caso de los fragmentos Fab, ambos péptidos de las fusiones VL-Ck y VH-CH1 deben estar unidos a una señal de exportación. El enlace S-S covalente se forma en las cisteínas carboxiterminales una vez que los péptidos han llegado al periplasma. Si se prefiere la expresión citoplásmica de anticuerpos, dichos anticuerpos normalmente se pueden obtener en rendimientos altos a partir de cuerpos de inclusión, que se pueden separar fácilmente de otros fragmentos celulares y proteína. En este caso, los cuerpos de inclusión se solubilizan en un agente desnaturalizante tal como, por ejemplo, clorhidrato de guanidina (GndHCl) y a continuación se vuelven a plegar mediante procesos de renaturalización muy conocidos por los expertos en la técnica.
Se introducen plásmidos que expresan los polipéptidos de scFv o Fab en un hospedador adecuado, preferentemente una célula bacteriana, de levadura o de mamífero, de la forma más preferida una cepa de E. co liadecuada como, por ejemplo, JM83 para la expresión periplásmica o BL21 para la expresión en cuerpos de inclusión. El polipéptido se puede recoger ya sea a partir del periplasma o a partir de cuerpos de inclusión y purificar utilizando técnicas estándar tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase inversa, cromatografía de afinidad y/o filtración en gel conocidas por el experto en la técnica.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención se pueden caracterizar con respecto al rendimiento, la solubilidad y la estabilidad in vitro. Las capacidades de unión respecto a TNF, preferentemente respecto a TNFa humano, se pueden evaluar in vitro mediante ELISA o resonancia de plasmones superficiales (BIACore), utilizando TNF humano recombinante tal como se describe en el documento WO9729131, permitiendo este último método determinar también la constante de velocidad koff, que debe ser preferentemente de menos de 10-3s-1. Se prefieren valores de Kd á 10 nM.
Aparte de los anticuerpos con fuerte afinidad de unión por el TNF humano, también es deseable generar anticuerpos anti-TNF que tengan propiedades beneficiosas desde una perspectiva terapéutica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser uno que muestre actividad neutralizante en un ensayo de citotoxicidad mediado por TNFalfa L929. En este ensayo, se indujo la toxicidad de células de fibroblastos L929 de ratón tratadas con actinomicina con TNF humano recombinante (hTNF). Se determinó que se obtuvo un 90 % de la citotoxicidad máxima inducida por hTNF a una concentración de TNF de 1000 pg/ml.
Todas las células L929 se cultivaron en RPMI 1640 con rojo fenol, con medio de L-Glutamina complementado con suero de ternera fetal (al 10 % v/v). La actividad neutralizante de ligadores anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo fenol y suero de ternera fetal al 5 %. Se añaden diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de ligadores anti-TNF a las células L929 en presencia de 1000 pg/ml de hTNF para determinar la concentración a la que el efecto antagonista alcanza la mitad de la inhibición máxima (CE50%). La curva de dosis-respuesta se ajustó con una regresión sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculó la CE50.
Variantes optimizadas
Los anticuerpos de la invención se pueden optimizar además para que tengan propiedades funcionales mejoradas, por ejemplo, solubilidad y/o estabilidad mejoradas.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se optimizan de acuerdo con la metodología de «consenso funcional» divulgada en la solicitud de PCT con N.° de serie PCT/EP2008/001958, titulada «Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies», presentada el 12 de marzo de 2008. Por ejemplo, los inmunoligadores de TNFa de la invención se pueden comparar con una base de datos de scFv seleccionados funcionalmente para identificar posiciones de residuos de aminoácidos que sean más o menos tolerantes a la variabilidad que la posición o posiciones correspondientes en el inmunoligador de VEGF, con lo que se indica que este tipo de posición o posiciones de residuos identificadas puede ser adecuado para la modificación para mejorar la funcionalidad, tal como la estabilidad y/o solubilidad.
Se describen posiciones de marco ilustrativas para la sustitución en la solicitud de PCT N.° PCT/CH2008/000285, titulada «Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodies with Improved Functional Properties», presentada el 25 de junio de 2008, y la solicitud PCT N.° PCT/CH2008/000284, titulada «Sequence Based Engineering and Optimization of Single Chain Antibodies», presentada el 25 de junio de 2008. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes sustituciones en una posición de aminoácido (se hace referencia a la numeración AHo para cada una de las posiciones de aminoácidos enumeradas a continuación) en la región variable de la cadena pesada de un inmunoligador de la invención:
(a) Q o E en la posición de aminoácido 1;
(b) Q o E en la posición de aminoácido 6;
(c) T, S o A en la posición de aminoácido 7, más preferentemente T o A, incluso más preferentemente T;
(d) A, T, P, V o D, más preferentemente T, P, V o D, en la posición de aminoácido 10,
(e) L o V, más preferentemente L, en la posición de aminoácido 12,
(f) V, R, Q, M o K, más preferentemente V, R, Q o M en la posición de aminoácido 13;
(g) R, M, E, Q o K, más preferentemente R, M, E o Q, incluso más preferentemente R o E, en la posición de aminoácido 14;
(h) L o V, más preferentemente L, en la posición de aminoácido 19;
(i) R, T, K o N, más preferentemente R, T o N, incluso más preferentemente N, en la posición de aminoácido 20; (j) I, F, L o V, más preferentemente I, F o L, incluso más preferentemente I o L, en la posición de aminoácido 21; (k) R o K, más preferentemente K, en la posición de aminoácido 45;
(l) T, P, V, A o R, más preferentemente T, P, V o R, incluso más preferentemente R, en la posición de aminoácido 47; (m) K, Q, H o E, más preferentemente K, H o E, incluso más preferentemente K, en la posición de aminoácido 50; (n) M o I, más preferentemente I, en la posición de aminoácido 55;
(o) K o R, más preferentemente K, en la posición de aminoácido 77;
(p) A, V, L o I, más preferentemente A, L o I, incluso más preferentemente A, en la posición de aminoácido 78; (q) E, R, T o A, más preferentemente E, T o A, incluso más preferentemente E, en la posición de aminoácido 82; (r) T, S, I o L, más preferentemente T, S o L, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 86; (s) D, S, N o G, más preferentemente D, N o G, incluso más preferentemente N, en la posición de aminoácido 87; (t) A, V, L o F, más preferentemente A, V o F, incluso más preferentemente V, en la posición de aminoácido 89; (u) F, S, H, D o Y, más preferentemente F, S, H o D, en la posición de aminoácido 90;
(v) D, Q o E, más preferentemente D o Q, incluso más preferentemente D, en la posición de aminoácido 92;
(w) G, N, T o S, más preferentemente G, N o T, incluso más preferentemente G, en la posición de aminoácido 95; (x) T, A, P, F o S, más preferentemente T, A, P o F, incluso más preferentemente F, en la posición de aminoácido 98; (y) R, Q, V, I, M, F o L, más preferentemente R, Q, I, M, F o L, incluso más preferentemente Y, incluso más preferentemente L, en la posición de aminoácido 103; y
(z) N, S o A, más preferentemente N o S, incluso más preferentemente N, en la posición de aminoácido 107.
Adicionalmente o como alternativa, se pueden introducir una o más de las siguientes sustituciones en la región variable de cadena ligera de un inmunoligador de la invención:
(aa) Q, D, L, E, S o I, más preferentemente L, E, S o I, incluso más preferentemente L o E, en la posición de aminoácido 1;
(bb) S, A, Y, I, P o T, más preferentemente A, Y, I, P o T, incluso más preferentemente P o T en la posición de aminoácido 2;
(cc) Q, V, T o I, más preferentemente V, T o I, incluso más preferentemente V o T, en la posición de aminoácido 3;
(dd) V, L, I o M, más preferentemente V o L, en la posición de aminoácido 4;
(ee) S, E o P, más preferentemente S o E, incluso más preferentemente S, en la posición de aminoácido 7; (ff) T o I, más preferentemente I, en la posición de aminoácido 10;
(gg) A o V, más preferentemente A, en la posición de aminoácido 11;
(hh) S o Y, más preferentemente Y, en la posición de aminoácido 12;
(ii) T, S o A, más preferentemente T o S, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 14; (jj) S o R, más preferentemente S, en la posición de aminoácido 18;
(kk) T o R, más preferentemente R, en la posición de aminoácido 20;
(ll) R o Q, más preferentemente Q, en la posición de aminoácido 24;
(mm) H o Q, más preferentemente H, en la posición de aminoácido 46;
(nn) K, R o I, más preferentemente R o I, incluso más preferentemente R, en la posición de aminoácido 47; (oo) R, Q, K, E, T o M, más preferentemente Q, K, E, T o M, en la posición de aminoácido 50;
(pp) K, T, S, N, Q o P, más preferentemente T, S, N, Q o P, en la posición de aminoácido 53;
(qq) I o M, más preferentemente M, en la posición de aminoácido 56;
(rr) H, S, F o Y, más preferentemente H, S o F, en la posición de aminoácido 57;
(ss) I, V o T, más preferentemente V o T, R, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 74; (tt) R, Q o K, más preferentemente R o Q, incluso más preferentemente R, en la posición de aminoácido 82; (uu) L o F, más preferentemente F, en la posición de aminoácido 91;
(vv) G, D, T o A, más preferentemente G, D o T, incluso más preferentemente T, en la posición de aminoácido 92;
(xx) S o N, más preferentemente N, en la posición de aminoácido 94;
(yy) F, Y o S, más preferentemente Y o S, incluso más preferentemente S, en la posición de aminoácido 101; y (zz) D, F, H, E, L, A, T, V, S, G o I, más preferentemente H, E, L, A, T ,V, S, G o I, incluso más preferentemente A o V, en la posición de aminoácido 103.
En otras realizaciones, los inmunoligadores de la invención comprenden una o más de las mutaciones que mejoran la solubilidad y/o estabilidad descritas en la Solicitud Provisional de EE. UU. con N.° de serie 61/075692 titulada «Solubility Optimization of Immunobinders», presentada el 25 de junio de 2008. En ciertas realizaciones preferidas, el inmunoligador comprende una mutación que mejora la solubilidad en una posición de aminoácido seleccionada del grupo de posiciones de aminoácido de cadena pesada que consiste en 12, 103 y 144 (convenio de numeración de AHo). En una realización preferida, el inmunoligador comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144. En otra realización, el inmunoligador comprende las siguientes sustituciones: (a) Serina (S) en la posición de aminoácido de cadena pesada 12; (b) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 103; y (c) Serina (S) o Treonina (T) en la posición de aminoácido de cadena pesada 144.
Como se ha mencionado anteriormente, las combinaciones de las secuencias de VL y VH, en particular de aquellas que tienen el mismo o esencialmente el mismo conjunto de secuencias de CDR, pero diferentes secuencias marco, por ejemplo, debido a la presencia de las sustituciones mencionadas anteriormente, se pueden transponer y combinar mediante una secuencia conectora. Las combinaciones ilustrativas incluyen, sin carácter limitante:
SEQ ID NO: 94
EP43 min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVSVIISSGATYYASWAKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDT A V Y Y C AKGGPDDSN SMGTFDP W GQGTL VT V S S SEQ ID NO: 95
EP43max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGAMSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTV YLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 96
EP43minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGA MSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTAVYYCARGGPDDSNSMGTFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 97
EP43max DHP EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISGLEPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGF SLSSG AYISWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMN SLRAEDT AT Y Y C ARGGPDDSN SMGTFDP W GQGTS VT V S S SEQ ID NO: 98
EP43minmaxDHP EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG AMS W VRQ APGKGLE W VG VIIS SG AT Y Y AS W AKGRFTISKDTSKNT V YLQMN SLRAEDT AT Y Y C ARGGPDD SN SMGTFDP WGQGTSVTV S S SEQ ID NO: 99
VL de EP43minmax : T22K
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIIKCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG FSLSSGA MSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDT A VY Y C ARGGPDDSNSMGTFDP WGQGTL VT V S S
SEQ ID NO: 100
EP43minmax: VL: V58F
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGFPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A
MS W VRQAPGKGLE W V G VIIS SGAT Y Y A S WAKGRFTISKDTSKNT VYLQMN S LRAEDT A V Y Y C ARGGPDDSN SMGTFDP W GQGTL VTV S S
SEQ ID NO: 101
VL de EP43minmax : D81A
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPADFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDTA V Y Y C ARGGPDDSNSMGTFDP W GQGTL VTV S S
SEQ ID NO: 102
VL de EP43minmax : Q79E
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISDWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASR LASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLEPDDFATYYCQQGWSDSYVDNLFGQGTK-LTVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSG A MSWVRQAPGKGLEWVGVIISSGATYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNS LRAEDT A V Y Y C ARGGPDDSNSMGTFDP W GQGTL VTV S S
SEQ ID NO: 103
EP1min
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA AS GFTFSNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWSIRYYANWAQGRFTISRDNSKNT L YLQMN SLRAEDT A V Y Y C AKG APGAGDNGIWGQGTLVTV S S
SEQ ID NO: 104
EP1max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWVAYISDWSIRYYANWAQGRFTISKDTSK NTV YLQMNSLRAEDT AT Y Y C ARG APGAGDNGIWGQGTTVT V S S SEQ ID NO: 105
EPIminmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGSGTANGSFGQ
GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLSNDAISWVRQAPGKGLEWVAYISDWSIRYYANWAQGRFTISKDTSK NTV YLQMN SLRAEDT AT Y Y C ARG APGAGDNGI W GQGTTVT V S S SEQ ID NO: 106
EP6min EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVSTIGEAGRAYYANWARSRFTISRDNSKNTL YLQMN SLRAEDTA V Y Y C AKGEVFNN G W GAFNIWGQGTL VTV S S SEQ ID NO: 107
EP6max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGTDFTLAISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENRFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRYGVSWVRQAPGKGLEWVGTIG EAGRAYYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEVFNN GWGAFNIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 108
EP6minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASESIYSGLAWYQQKPGKAPKLLIYQASTL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGFGTSNVENPFGQGTKLT VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSRY GVSWVRQAPGKGLEWVGTIGEAGRAYYANWARSRSTISRDTSKNTVYLQM N SLRAEDTA V Y Y C ARGE VFNNG W GAFNI W GQGTL VTV S S SEQ ID NO: 109
EP15min
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASENIYTSLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTL a s g w s r f s g s g s g a e f t l t is s l q p d d f a t y y c q q g f a t s n v e n p f g q g t k .lt VLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRY GVSWVRQAPGKGLEWVSAIGETGRAYYANWAKSRFTISRDNSKNTLYLQMN SLRAEDT A V Y Y C AKGEEFNNG WG AFNIW GQGTL VT V S S
SEQ ID NO: 110
EP15max
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SEQ ID NO: 111
EP15minmax
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SEQ ID NO: 112
EP19minmod
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SEQ ID NO: 113
EP19maxmod
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SEQ ID NO: 114
EP34min
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■EP34max
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■SEQ ID NO: 116
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■SEQ ID NO: 117
■EP35max EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIVAASKL ASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVG YWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYL QMN SLRAEDT AT Y Y C ARG V S SNG Y YFKL WGQGTT VTV S S
■SEQ ID NO: 118
■EP35minmax EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISNLLAWYQQKPGKAPKLLIYAASKL ASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGWSHTNVDNTFGQGTKL TVLG GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASGFSFSVG YWICWVRQAPGKGLEWVACIDAGTSGGTYYATWAKGRFTISKDTSKNTVYL QMN SLRAEDT AT Y Y C ARG V S SNG Y YFKL WGQGTTVT V S S
■SEQ ID NO: 119
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EP42max
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQSTESVYKNNYLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGYYRSGFGTANGSFGQ GTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCT VSGIDLRNDAISWVRQAPGKGLEWVSYISDWGIKYYASWVKGRFTISKDTSK NTV YLQMN SLRAEDT AT Y YC ARGAPG AGDN GIW GQGTTVT V S S
■SEQ ID NO: 121
■EP42minmax
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En una realización preferida, una secuencia tiene al menos un 90 % de identidad, más preferentemente al menos un 95 % de identidad y de la forma más preferida un 100 % de identidad respecto a una cualquiera de las secuencias SEQ ID No.
94-121.
Usos de anticuerpos anti-TNF
Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos anti-TNF de la invención se administran a un mamífero, preferentemente un ser humano, en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable tal como las que se han expuesto anteriormente, incluidas aquellas que se pueden administrar a un ser humano por vía intravenosa tales como un bolo o por infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación. Los anticuerpos también se pueden administrar convenientemente por vía intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
Para la prevención o el tratamiento de una enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que se vaya a tratar, tal como se ha definido anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el anticuerpo se administra a efectos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la anamnesis del paciente y la respuesta al anticuerpo, y el criterio del médico responsable. El anticuerpo se administra convenientemente al paciente una vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Los anticuerpos anti-TNF son útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF. Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis candidata inicial para la administración al paciente es de aproximadamente 1 |jg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por ejemplo, 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas, o mediante una infusión continua. Una dosis diaria o semanal típica puede variar de aproximadamente 1 |jg/kg a aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La evolución de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales, que incluyen, por ejemplo, formación de imágenes radiográficas de tumores.
De acuerdo con otra realización de la invención, la efectividad del anticuerpo en la prevención o el tratamiento de la enfermedad se puede mejorar administrando el anticuerpo en serie o en combinación con otro agente que sea eficaz para esos fines, tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiogénica del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico o el factor de crecimiento hepatocítico (HGF), un anticuerpo capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, proteína C o proteína S (véase Esmon etal., Publicación de Patente de PCT N.° WO 91/01753, publicada el 21 de febrero de 1991), un anticuerpo capaz de unirse al receptor de HER2 (véase Hudziak et al., Publicación de Patente de PCT N^ WO 89/06692, publicada el 27 de julio de 1989), o uno o más agentes terapéuticos convencionales tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, anti-metabolitos del metabolismo de ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos purínicos, aminas, aminoácidos, nucleósidos triazólicos o corticosteroides. Estos otros agentes pueden estar presentes en la composición que se está administrando o se pueden administrar por separado. Además, el anticuerpo se puede administrar convenientemente en serie o en combinación con tratamientos radiológicos, ya sea que impliquen irradiación o la administración de sustancias radioactivas.
Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como una resina Sephadex o papel de filtro, utilizando métodos muy conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene la proteína TNF (o un fragmento de esta) que se ha de purificar, y posteriormente el soporte se lava con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra excepto la proteína TNF, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará la proteína TNF del anticuerpo.
Los anticuerpos anti-TNF también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína TNF, por ejemplo, detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Tales métodos de diagnóstico pueden ser útiles en el diagnóstico del cáncer.
Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo se marcará normalmente con un resto detectable. Existen numerosos marcadores disponibles que se pueden agrupar generalmente en las siguientes categorías:
(a) Radioisótopos, tales como .111In, .99Tc, .14C, .131I, 125I, 3H, 32P o 35S. El anticuerpo se puede marcar con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Tomos 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nueva York, N.Y., Pubs. (1991), por ejemplo, y la radioactividad se puede medir utilizando conteo de centelleo.
(b) Existen marcadores fluorescentes disponibles tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, Lisamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Los marcadores fluorescentes se pueden conjugar con el anticuerpo utilizando las técnicas divulgadas, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, mencionado anteriormente. La fluorescencia se puede cuantificar utilizando un fluorímetro.
(c) Existen diversos marcadores de enzima-sustrato disponibles y la Pat. de EE. UU. N.° 4275 149 proporciona una revisión de algunos de ellos. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que se puede medir utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que se puede medir espectrofotométricamente. Como alternativa, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Anteriormente se han descrito técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia. El sustrato quimioluminiscente pasa a un estado electrónico excitado mediante una reacción química y puede emitir entonces luz que se puede medir (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de EE. UU. N.° 4 737 456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malato-deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, .beta.-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos (por ejemplo, glucosa-oxidasa, galactosa-oxidasa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina-oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Se describen técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, en Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, Nueva York, 73:147-166 (1981). Los ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con hidrógeno-peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno-peroxidasa oxida un precursor de tinte (por ejemplo, orto-fenilendiamina (OPD) o clorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (Tm B));
(ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenilfosfato como sustrato cromógeno; y
iii) beta.-D-galactosidasa (.beta.-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, P-nitrofenil-.beta.-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-.beta.-D- galactosidasa.
Existen numerosas combinaciones de enzima-sustrato diferentes disponibles para los expertos en la técnica. Para consultar una revisión general de estas, véanse las Pat. de EE. UU. N.° 4275 149 y 431898o. A veces, el marcador se conjuga indirectamente con el anticuerpo. El experto conocerá diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo se puede conjugar con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcadores mencionadas anteriormente se puede conjugar con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, por lo tanto, el marcador se puede conjugar con el anticuerpo de esta manera indirecta. Como alternativa, para lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo, anticuerpo anti-digoxina). Por lo tanto, se puede lograr la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
En otra realización de la invención, no es necesario marcar el anticuerpo anti-TNF, y su presencia puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo contra TNF.
Los anticuerpos de la presente invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de tipo sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de la muestra de prueba por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína TNF en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición, de modo que el patrón y el analito que están unidos a los anticuerpos se puedan separar convenientemente del patrón y el analito que quedan sin unirse.
Los ensayos de tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una porción inmunógena o epítopo diferente, de la proteína que se ha de detectar. En un ensayo de tipo sándwich, un primer anticuerpo que está inmovilizado en un suporte sólido se une al analito de la muestra de prueba, y después un segundo anticuerpo se une al analito, para formar así un complejo de tres partes insoluble. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N.° 4 376 110. El segundo anticuerpo puede estar de por sí marcado con un resto detectable (ensayos de tipo sándwich directos) o se puede medir utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que esté marcado con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.
Para la inmunohistoquímica, la muestra tumoral puede ser fresca o estar congelada, o puede estar embebida en parafina 0 fijada con un conservante tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, el anticuerpo está marcado con un radionúclido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3 H, 32P o 35S) de tal modo que el tumor se puede localizar utilizando inmunogammagrafía.
El anticuerpo de la presente invención se puede proporcionar en un kit, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diferentes reactivos se pueden modificar en gran medida para proporcionar concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos se pueden proporcionar como polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que al disolverse proporcionarán una disolución de los reactivos con la concentración apropiada.
Preparados farmacéuticos
En un aspecto, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-TNF para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF. El término «formulación farmacéutica» se refiere a preparados que están en una forma tal que permita que la actividad biológica del anticuerpo o derivado de anticuerpo sea inequívocamente eficaz, y que no contienen componentes adicionales que sean tóxicos para los sujetos a los que se les administraría la formulación. Los excipientes (vehículos, aditivos) «farmacéuticamente aceptables» son aquellos que se pueden administrar razonablemente a un sujeto que es un mamífero para proporcionar una dosis eficaz del principio activo empleado.
Una formulación «estable» es una en la que el anticuerpo o derivado de anticuerpo de esta retiene esencialmente su estabilidad física y/o estabilidad química y/o actividad biológica tras su almacenamiento. En la técnica se dispone de varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de proteínas y se revisan, por ejemplo, en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. l0: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo de tiempo seleccionado. Preferentemente, la formulación es estable a temperatura ambiente (aproximadamente 30 °C) o a 40 °C durante al menos 1 mes y/o estable a aproximadamente 2-8 °C durante al menos 1 año o durante al menos 2 años. Además, la formulación es preferentemente estable después de congelar (por ejemplo, a -70 °C) y descongelar la formulación.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo «conserva su estabilidad física» en una formulación farmacéutica si no muestra signos de agregación, precipitación y/o desnaturalización tras el examen visual del color y/o la claridad, o según lo medido por dispersión de luz UV o cromatografía de exclusión por tamaño.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo «conserva su estabilidad química» en una formulación farmacéutica si la estabilidad química en un momento dado es tal que se considera que la proteína sigue conservando su actividad biológica tal como se define a continuación. La estabilidad química se puede evaluar detectando y cuantificando químicamente formas alteradas de la proteína. La alteración química puede implicar una modificación del tamaño (por ejemplo, recorte) que puede evaluarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, SDS-PAGE y/o desorción/ionización láser asistida por una matriz con espectroscopía de masas por tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS). Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de la carga (por ejemplo, que se produce como resultado de una desamidación) que puede evaluarse, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico.
Un anticuerpo o derivado de anticuerpo «conserva su actividad biológica» en una formulación farmacéutica si la actividad biológica del anticuerpo en un momento dado difiere como máximo en aproximadamente un 10 % (dentro de los márgenes de error del ensayo) respecto a la actividad biológica presentada en el momento en el que se preparó la formulación farmacéutica según se determina, por ejemplo, en un ensayo de unión a antígeno. Otros ensayos de «actividad biológica» para anticuerpos se explican detalladamente más adelante en la presente.
Por «isotónica» se entiende que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir, por ejemplo, utilizando un osmómetro de tipo presión de vapor o congelación de hielo.
Un «poliol» es una sustancia con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcares y ácidos de azúcares. Los polioles preferidos en la presente tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un «azúcar reductor» es aquel que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones metálicos o reaccionar covalentemente con lisina y otros grupos amino en proteínas y un «azúcar no reductor» es aquel que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Son ejemplos de azúcares reductores la fructosa, manosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, melecitosa y rafinosa. El manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcares. En lo que respecta a ácidos de azúcares, estos incluyen L-gluconato y sus sales metálicas. Cuando se desea que la formulación sea estable a la congelacióndescongelación, el poliol es preferentemente uno que no cristalice a temperaturas de congelación (por ejemplo, -20 °C) de modo tal que desestabilice el anticuerpo en la formulación. Los azúcares no reductores tales como sacarosa y trehalosa son los polioles preferidos en la presente, con preferencia por la trehalosa frente a la sacarosa, debido a la superior estabilidad en disolución de la trehalosa.
Tal como se utiliza en la presente, «tampón» se refiere a una disolución tamponada que resiste cambios en el pH por la acción de sus componentes de conjugado ácido-base. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0; preferentemente de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5; y de la forma más preferida tiene un pH de aproximadamente 5,0. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos. Cuando se desea una formulación estable a la congelación-descongelación, preferentemente el tampón no es fosfato.
En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una «cantidad terapéuticamente eficaz» de un anticuerpo o derivado de anticuerpo se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o el tratamiento de un trastorno para cuyo tratamiento el anticuerpo o derivado de anticuerpo es eficaz. Una «enfermedad/trastorno» es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con el anticuerpo o derivado de anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen aquellas afecciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión.
Un «conservante» es un compuesto que se puede incluir en la formulación para reducir esencialmente la acción bacteriana en esta, lo cual facilita así la producción de una formulación multiuso, por ejemplo. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de benzetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil- o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en la presente es el alcohol bencílico.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más anticuerpos o compuestos derivados de anticuerpo, junto con al menos un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, uno o más de agua, tampones (por ejemplo, disolución salina tamponada neutra o disolución salina tamponada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, sulfóxido de dimetilo, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutationa y/o conservantes. Tal como se ha indicado anteriormente, se pueden incluir otros principios activos (pero no es necesario) en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente.
Un portador es una sustancia que se puede asociar con un anticuerpo o derivado de anticuerpo antes de la administración a un paciente, a menudo a fin de controlar la estabilidad o biodisponibilidad del compuesto. Los portadores para su uso dentro de tales formulaciones son generalmente biocompatibles y también pueden ser biodegradables. Los portadores incluyen, por ejemplo, moléculas monovalentes o multivalentes tales como albúmina sérica (por ejemplo, humana o bovina), albúmina de huevo, péptidos, polilisina y polisacáridos tales como aminodextrano y poliamidoaminas. Los portadores también incluyen materiales de soporte sólidos tales como microesferas y micropartículas que comprenden, por ejemplo, polilactato poliglicolato, poli(láctido-co-glicólido), poliacrilato, látex, almidón, celulosa o dextrano. Un portador puede portar los compuestos de diversas formas, que incluyen enlace covalente (ya sea directamente o a través de un grupo conector), interacción no covalente o mezcla.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier forma apropiada de administración, que incluye, por ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, rectal o parenteral. En determinadas realizaciones, se prefieren composiciones en una forma adecuada para uso oral. Tales formas incluyen, por ejemplo, píldoras, comprimidos, sellos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. En otras realizaciones más, las composiciones proporcionadas en la presente se pueden formular como un liofilizado. El término parenteral, tal como se utiliza en la presente, incluye la inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, raquídea, intracraneal, intratecal e intraperitoneal, así como cualquier técnica de inyección o infusión similar.
Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y pueden contener uno o más agentes, tales como agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparados atractivos y apetecibles. Los comprimidos contienen el principio activo mezclado con excipientes fisiológicamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Tales excipientes incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes (por ejemplo, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio), agentes granulantes y desintegrantes (por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico), agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga) y agentes lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco). Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y con ello proporcionar una acción sostenida a lo largo de un periodo más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retraso temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse en forma de cápsulas de gelatina dura donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín), o en forma de cápsulas de gelatina blanda donde el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso (por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva). Las suspensiones acuosas contienen el anticuerpo o derivado de anticuerpo mezclado con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia); y agentes dispersantes o humectantes (por ejemplo, fosfátidos que se producen de forma natural, tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tales como estearato de polioxietileno, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tales como monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como monooleato de sorbitán polietilenado). Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservantes, por ejemplo phidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. Los jarabes y elixires se pueden formular con agentes edulcorantes, tales como glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. Tales formulaciones también pueden comprender uno o más agentes demulcentes, conservantes, aromatizantes y/o colorantes.
Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de Arachis, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco) o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes, tales como los expuestos anteriormente y/o agentes aromatizantes para proporcionar preparados orales apetecibles. Tales suspensiones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados se ilustran mediante los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.
Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva o aceite de Arachis), un aceite mineral (por ejemplo, parafina líquida) o una mezcla de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas que se producen de forma natural (por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto), fosfátidos que se producen de forma natural (por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol), anhídridos (por ejemplo, monooleato de sorbitán) y productos de condensación de ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol con óxido de etileno (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado). Una emulsión también puede comprender uno o más agentes edulcorantes y/o aromatizantes.
La composición farmacéutica se puede preparar como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril en la que el modulador, dependiendo del vehículo y la concentración utilizados, está bien suspendido o bien disuelto en el vehículo. Una composición de este tipo se puede formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando dispersantes, agentes humectantes y/o agentes de suspensión adecuados tales como los mencionados anteriormente. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, 1,3-butanodiol, disolución de Ringer y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, se pueden emplear aceites fijos, estériles como un medio de suspensión o disolvente. A este efecto, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluidos mono- o diglicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar ácidos grasos tales como el ácido oleico en la preparación de composiciones inyectables, y se pueden disolver adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y/o agentes tamponantes en el vehículo.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que efectúa una liberación lenta del modulador después de la administración). Tales formulaciones se pueden preparar generalmente utilizando tecnología muy conocida y se pueden administrar mediante, por ejemplo, implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio diana deseado. Los portadores para su uso en tales formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferentemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del modulador. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende de, por ejemplo, el sitio de implantación, la velocidad y la duración esperada de la liberación y la naturaleza de la enfermedad/trastorno que se ha de tratar o prevenir.
El anticuerpo o derivados de anticuerpo proporcionados en la presente se administran generalmente en una cantidad que consigue una concentración en un humor corporal (por ejemplo, sangre, plasma, suero, LCR, líquido sinovial, linfa, líquido intersticial celular, lágrimas u orina) que es suficiente para unirse de forma detectable a TNF y prevenir o inhibir enfermedades/trastornos mediados por TNF. Se considera que una dosis es eficaz si da como resultado un beneficio perceptible para el paciente tal como se describe en la presente. Las dosis sistémicas preferidas varían de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 140 mg por kilogramo de peso corporal al día (de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente al día), multiplicándose las dosis orales generalmente por 5-20 respecto a las dosis intravenosas. La cantidad de anticuerpo o derivado de anticuerpo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una única forma farmacéutica variará dependiendo del hospedador tratado y el modo particular de administración. Las formas farmacéuticas unitarias generalmente contendrán de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg de un principio activo.
Las composiciones farmacéuticas se pueden envasar para tratar afecciones que responden a un anticuerpo o derivado de anticuerpo dirigido a TNF. Las composiciones farmacéuticas envasadas pueden incluir un recipiente que contiene una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o derivado de anticuerpo tal como se describe en la presente e instrucciones (por ejemplo, etiquetado) que indican que la composición contenida se ha de utilizar para tratar una enfermedad/trastorno que responde a un anticuerpo o derivado de anticuerpo después de la administración en el paciente.
Los anticuerpos o derivados de anticuerpo de la presente invención también se pueden modificar químicamente. Los grupos modificadores preferidos son polímeros, por ejemplo, un polímero de polialqueno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada sustituido opcionalmente, o un polisacárido ramificado o no ramificado. Tal grupo efector puede incrementar la semivida del anticuerpo in vivo. Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol), poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada sustituido opcionalmente, o derivados de estos. Los polímeros que se producen de forma natural particulares incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glicógeno o derivados de estos. El tamaño del polímero se puede modificar según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de pesos moleculares promedio de 500 Da a 50000 Da. Para una aplicación local en la que el anticuerpo está diseñado para penetrar en el tejido, un peso molecular preferido del polímero es de alrededor de 5000 Da. La molécula polimérica se puede acoplar al anticuerpo, en particular al extremo carboxiterminal de la cadena pesada del fragmento Fab a través un péptido bisagra unido covalentemente tal como se describe en el documento WO0194585. En lo que respecta al acoplamiento de restos de PEG, se hace referencia a «Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications», 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York y «Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences», 1998, M. Aslam y A. Dent, Editorial Grove, Nueva York.
Después de preparar el anticuerpo o derivado de anticuerpo de interés tal como se ha descrito anteriormente, se prepara la formulación farmacéutica que lo comprende. El anticuerpo que se ha de formular no se ha sometido a liofilización previa y la formulación de interés de la presente es una formulación acuosa. Preferentemente, el anticuerpo o derivado de anticuerpo de la formulación es un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. La cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo presente en la formulación se determina teniendo en cuenta los volúmenes de dosis y el modo o modos de administración deseados, por ejemplo. Una concentración de anticuerpo ilustrativa en la formulación es de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferentemente de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml y de la forma más preferida de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml.
Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo o derivado de anticuerpo en una solución tamponada de pH. El tampón de esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0; preferentemente de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5; y de la forma más preferida tiene un pH de aproximadamente 5,0. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen tampones de acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, preferentemente de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la isotonicidad deseada de la formulación. El tampón preferido es acetato de sodio (aproximadamente 10 mM), pH 5,0.
En la formulación se incluye un poliol, que actúa como un tonificador y puede estabilizar el anticuerpo. En realizaciones preferidas, la formulación no contiene una cantidad tonificante de una sal tal como cloruro de sodio, ya que esto puede hacer que el anticuerpo o derivado de anticuerpo precipite y/o puede provocar la oxidación a pH bajo. En realizaciones preferidas, el poliol es un azúcar no reductor, tal como sacarosa o trehalosa. El poliol se añade a la formulación en una cantidad que puede variar en función de la isotonicidad deseada de la formulación. Preferentemente la formulación acuosa es isotónica, en cuyo caso las concentraciones adecuadas del poliol en la formulación están en el intervalo de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 15 % p/v, preferentemente en el intervalo de aproximadamente un 2 % a aproximadamente un 10 % p/v, por ejemplo. Sin embargo, las formulaciones hipertónicas o hipotónicas también pueden ser adecuadas. La cantidad de poliol añadida también puede variar en función del peso molecular del poliol. Por ejemplo, se puede añadir una cantidad menor de un monosacárido (por ejemplo, manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa).
También se añade un tensioactivo a la formulación de anticuerpo o derivado de anticuerpo. Los tensioactivos ilustrativos incluyen tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). La cantidad de tensioactivo añadida es tal que reduzca la agregación del anticuerpo/derivado de anticuerpo formulado y/o minimice la formación de particulados en la formulación y/o reduzca la adsorción. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación en una cantidad de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 0,5 %, preferentemente de aproximadamente un 0,005 % a aproximadamente un 0,2 % y de la forma más preferida de aproximadamente un 0,01 % a aproximadamente un 0,1 %.
En una realización, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (es decir, anticuerpo o derivado de anticuerpo, tampón, poliol y tensioactivo) y está esencialmente exenta de uno o más conservantes, tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y bencetonio Cl. En otra realización, se puede incluir un conservante en la formulación, particularmente cuando la formulación es una formulación multidosis. La concentración de conservante puede estar en el intervalo de aproximadamente un 0,1 % a aproximadamente un 2 %, de la forma más preferida de aproximadamente un 0,5 % a aproximadamente un 1 %. Se pueden incluir uno o más portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables diferentes tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 21.a edición, Osol, A. Ed. (2006) en la formulación siempre que no afecten de forma adversa a las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son atóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen: agentes tamponantes adicionales; codisolventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Znproteína); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sales, tales como sodio.
Las formulaciones que se van a utilizar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o después de, la preparación de la formulación.
La formulación se administra a un mamífero que necesite tratamiento con el anticuerpo, preferentemente un ser humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como la administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o inhalatoria. En realizaciones preferidas, la formulación se administra al mamífero mediante administración intravenosa. Para tales fines, la formulación puede inyectarse, por ejemplo, utilizando una jeringa o mediante una línea IV.
La dosificación apropiada («cantidad terapéuticamente eficaz») del anticuerpo dependerá, por ejemplo, de la enfermedad que se vaya a tratar, la gravedad y la evolución de la afección, si el anticuerpo se administra a efectos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la anamnesis del paciente y la respuesta al anticuerpo, el tipo de anticuerpo utilizado y el criterio del médico responsable. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se administra convenientemente al paciente una vez o a lo largo de una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento a partir del diagnóstico. El anticuerpo o derivado de anticuerpo se puede administrar como tratamiento único o junto con otros fármacos o terapias útiles en el tratamiento de la afección en cuestión.
Como propuesta general, la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o derivado de anticuerpo administrada estará en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente ya sea mediante una o más administraciones, siendo el intervalo típico de anticuerpo utilizado de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 20 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 15 mg/kg, administrados a diario, por ejemplo. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles. La evolución de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas convencionales.
Artículos de fabricación
En otra realización de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un recipiente que contiene la formulación farmacéutica de la presente invención, preferentemente una formulación farmacéutica acuosa, y opcionalmente proporciona instrucciones para su uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y jeringas. El recipiente puede estar formado por una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. Un recipiente ilustrativo es un vial de vidrio de un solo uso de 3-20 cc. Como alternativa, para una formulación multidosis, el recipiente puede ser un vial de vidrio de 3-100 cc. El recipiente contiene la formulación y la etiqueta sobre, o asociada con, el recipiente puede indicar el modo de empleo. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos del envase con instrucciones de uso.
Ejemplificación
La presente divulgación se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, los cuales no se deben interpretar como más limitantes. A lo largo de los ejemplos, se utilizan los siguientes materiales y métodos a menos que se indique lo contrario.
Materiales y métodos generales
En general, la puesta en práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas estándar de preparación de polipéptidos. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
Mediciones de termoestabilidad
Se obtuvieron espectros de IR de transformada de Fourier de reflectancia total atenuada (FTIR-ATR) para diversas cadenas sencillas y moléculas de seguimiento utilizando la celda FT-IR Bio-ATR en un Tensor Bruker. Las moléculas se concentraron hasta 3mg/ml y se dializaron durante la noche a 4 °C frente a PBS, pH 6,5 y se recogió el caudal de tampón como blanco. Los perfiles de desnaturalización se obtuvieron termoestimulando las moléculas con un intervalo amplio de temperaturas en incrementos de 5 °C (de 25 a 95 °C). Todas las manipulaciones de los espectros se realizaron utilizando el programa informático OPUS. La señal de fondo atmosférico transitorio (CO2 y H2O) y del tampón principal se sustrajeron del espectro de la proteína. El espectro de la proteína resultante se corrigió entonces respecto a la línea basal y los espectros de amida I de la proteína se determinaron a partir de la anchura del pico resoluble más ancho en la región esperada. Se obtuvieron espectros de la segunda derivada para los espectros de la banda de amida I utilizando una función polinómica de tercer grado con una función de suavizado. Se estimaron los cambios en la estructura de la proteína mediante un análisis de la segunda derivada de la amida I utilizando una curva de calibrado lineal para los cálculos de ajuste a la curva inicial suponiendo un 0 % de desnaturalización para las 3 mediciones más bajas y un 100 % de desnaturalización para las 3 mediciones más altas. Se utilizaron los perfiles de desnaturalización para aproximar los puntos medios de las transiciones de desplegamiento térmicas (TM) para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Mediciones de solubilidad
Se midió la solubilidad relativa de diversas moléculas de scFv después de fomentar la agregación y precipitación de la proteína en presencia de sulfato de amonio. Se añadió sulfato de amonio a la proteína en disoluciones acuosas para conseguir incrementos de un 5 % de la saturación en la mezcla de sal-proteína final. La precipitación en el intervalo dinámico se determinó empíricamente y los intervalos de saturación se redujeron en este intervalo a intervalos de saturación de un 2,5 % en la mezcla final. Después de la adición de sulfato de amonio, se mezclaron las muestras cuidadosamente y se centrifugaron 30 minutos a 6000 rpm. Se recuperó la proteína remanente en los sobrenadantes para cada porcentaje de saturación de sulfato de amonio. Las curvas de solubilidad se determinaron midiendo la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando el espectrofotómetro NanoDropTM 1000. Las mediciones de la proteína soluble remanente en los sobrenadantes se normalizaron y se utilizaron para estimar los puntos medios de solubilidad relativa para cada variante aplicando el modelo sigmoidal de Boltzmann.
Prueba de estabilidad a corto plazo
La proteína se examinó después de dos semanas de incubación a 40 °C en busca de agregados solubles y productos de degradación. Las proteínas con una concentración de 10 mg/ml se dializaron durante la noche a 4 °C frente a PBS con un amplio intervalo de pH (3,5, 4,5, 5,5, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,5). La proteína de control con la misma concentración en tampón PBS estándar (pH 6,5) se almacenó a -80 °C durante el periodo de 2 semanas. La determinación de las bandas de degradación mediante SDS-PAGE se realizó en los puntos de tiempo t=0 y t=14d, y se evaluaron los agregados solubles en el SEC-HPLC. La determinación de la actividad remanente después de 2 semanas a 40 °C se realizó utilizando Biacore.
Ensayo de potencia
La actividad neutralizante de los ligadores anti-TNFa se evaluó en un ensayo de citotoxicidad L929 mediado por TNFa. La toxicidad de las células de fibroblastos de ratón L929 tratadas con actinomicina se indujo con TNF humano (hTNF) recombinante. Se determinó que se obtuvo un 90 % de la citotoxicidad máxima inducida por hTNF a una concentración de TNF de 1000 pg/ml. Todas las células L929 se cultivaron en RPMI 1640 con rojo fenol, con medio de L-Glutamina complementado con suero de ternera fetal (al 10 % v/v). La actividad neutralizante de ligadores anti-TNFa se evaluó en RPMI 1640 sin rojo fenol y suero de ternera fetal al 5 %. Se añaden diferentes concentraciones (0 - 374 ng/mL) de ligadores anti-TNF a las células L929 en presencia de 1000 pg/ml de hTNF para determinar la concentración a la que el efecto antagonista alcanza la mitad de la inhibición máxima (CE50%). La curva de dosis-respuesta se ajustó con una regresión sigmoidea no lineal con pendiente variable y se calculó la CE50.
Análisis de unión Biacore de scFv anti-TNF
Para las mediciones de afinidad de unión a pH 5 y pH 7,4 (datos no mostrados), se emplearon mediciones de resonancia de plasmones superficiales con BIAcore™ -T100 utilizando un chip sensor NTA y TNF marcado con His (producido en ESBATech). La superficie del chip sensor de NTA consiste en una matriz de dextrano carboximetilado preinmovilizada con ácido nitrilotriacético (NTA) para la captura de moléculas marcadas con histidina mediante una quelación de Ni2 NTA. El níquel captura trímeros de N-his y TNFa humano (5 nM) a través de sus marcas de his N-terminales y se inyecta ESBA105 (analito) a varias concentraciones que varían de 30 nM a 0,014 nM en etapas de dilución en serie de 3 veces. En la etapa de regeneración, el complejo formado por níquel, ligando y analito se elimina mediante un lavado. Esto permite el uso de las mismas condiciones de regeneración para diferentes muestras. La señal de respuesta se genera mediante la tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) y se mide en unidades de resonancia (RU). Todas las mediciones se realizan a 25 °C. Se generaron sensogramas para cada una de las muestras de scFv anti-TNF después de la corrección de la celda de referencia en línea seguida de la sustracción de la muestra de tampón. La constante de la velocidad de disociación aparente (kd), la constante de la velocidad de asociación aparente (ka) y la constante de equilibrio de disociación aparente (Kd) se calcularon utilizando el modelo de unión de Langmuir en correspondencia uno a uno con el programa informático de evaluación BIAcore T100, versión 1.1.
Ejemplo 1:
Injerto de CDR y humanización funcional de anticuerpos monoclonales anti-TNF de conejo.
Injerto de CDR de conejo
A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean el marco aceptor de anticuerpos humanos que comparte la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donante no humano, las CDR de conejo se injertaron en el marco FW1.4 (Se Q ID Nos. 1 y 2, unidas mediante un conector (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 72)) para generar un injerto Min o en el marco «conejizado» rFW1.4 (SEQ ID No. 92) o su variante rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 93) para generar un injerto Max. Ambos marcos se seleccionaron fundamentalmente en función de propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad), idoneidad estructural para albergar una gran variedad de CDR de conejo y homología razonable con la secuencia consenso de dominio variable de conejo. El marco rFW1.4 es un derivado de FW1.4 que se diseñó además con el objetivo de servir como marco aceptor universal para prácticamente cualquier conjunto de CDR de conejo. Aunque la secuencia de marco estable y soluble FW1.4 presenta una alta homología con anticuerpos de conejo, no es la secuencia más homóloga disponible.
Identificación de residuos involucrados potencialmente en la unión
Para cada secuencia de dominio variable de conejo, se identificó la parte complementaria de la línea germinal de conejo más cercana. Si no se pudo determinar la línea germinal más próxima, la secuencia se comparó frente al consenso de un subgrupo o el consenso de secuencias de conejo con un porcentaje de similitud alto. Los residuos de marco inusuales se consideraron como resultado posible de la hipermutación somática y, por lo tanto, que desempeñan una función en la unión al antígeno. Por consiguiente, tales residuos se tuvieron en cuenta para el injerto en el marco aceptor rFW1.4 o rFW1.4(v2) a fin de generar injertos Max. Particularmente, se injertaron los residuos involucrados potencialmente en contacto directo con el antígeno o que afectaban a la disposición de VL y VH. En caso necesario, se sustituyeron residuos adicionales descritos como influentes sobre la estructura de CDR. No se realizaron sustituciones de marco cuando se injertaron CDR en FW1.4 (injertos Min). Se pueden identificar ejemplos de posiciones de marco que se injertaron para obtener los injertos Max tal como se divulgan en la presente haciendo un alineamiento de secuencias de las regiones marco de rFW1.4, rFW1.4 (v2) y las secuencias de scFv de interés proporcionadas en la presente. Con tal fin se pueden utilizar, por ejemplo, herramientas en línea como las conocidas en la técnica (por ejemplo, ClustalW según su disponibilidad el 23 de junio de 2009 en http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html o MultiAlin según su disponibilidad el 23 de junio de 2009 en http://bioinfo.genotoul.fr/multalin). Todas las posiciones de marco en las que rFW1.4 y rFW1.4(v2) contienen el mismo residuo y en las que el scFv de interés revela un residuo diferente, son posiciones de marco que se injertaron para obtener los injertos Max.
Reordenamiento de dominios
Se combinaron cadenas ligeras variables de injertos Min con injertos Max de cadena pesada variable para identificar combinaciones óptimas en cuanto a propiedades biofísicas (solubilidad y estabilidad) y actividad.
Clonación y expresión de scFv
Los scFv descritos y caracterizados en la presente se produjeron tal como se indica a continuación. Las secuencias de VL humanizadas y las secuencias de VH humanizadas (SEQ ID NO: 51-88, sin SEQ ID NO: 72) se conectaron mediante el conector de s Eq ID NO: 72 para producir un scFv de la siguiente orientación: NH2-VL-conector-VH-COOH (véanse, por ejemplo, las SEQ ID NO: 94-121). En muchos casos, se sintetizaron de novo secuencias de ADN que codificaban los diferentes scFv en el proveedor de servicios Entelechon GmbH (www.entelechon.com). Los insertos de ADN resultantes se clonaron en el vector de expresión bacteriano pGMP002 a través de los sitios de restricción NcoI e HindIII introducidos en el extremo 5' y 3' de la secuencia de ADN de scFv, respectivamente. Entre la secuencia de ADN del dominio VL y el dominio VH, se sitúa un sitio de restricción BamHI. En algunos casos, el ADN que codificaba scFv no se sintetizó de novo, sino que los constructos que expresaban scFv se clonaron mediante reordenamiento de dominios. Por consiguiente, los dominios VL se extrajeron e introdujeron en los nuevos constructos a través de los sitios de restricción NcoI y BamHI, y los dominios VH a través de los sitios de restricción BamHI e HindIII. En otros casos, se introdujeron mutaciones puntuales en el dominio VH y/o VL utilizando métodos de ensamblaje por PCR del estado de la técnica. La clonación de GMP002 se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235. La producción de los scFv se realizó de forma análoga a ESBA105 tal como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO2008006235.
Ejemplo 2: Perfilado y selección de anticuerpos donantes de CDR de conejo
El procedimiento experimental general que se siguió para la selección de anticuerpos de conejo («RabMabs») con actividad inhibidora de TNF es el siguiente: Los anticuerpos de conejo se emplearon como anticuerpos donantes para CDR en la generación de inmunoligadores de TNF altamente solubles. Los conejos se inmunizaron con TNFa antes de la esplenectomía. Se aislaron esplenocitos de los conejos para la generación de hibridomas. Se aisló un total de 44 hibridomas y se perfilaron los sobrenadantes de estos hibridomas para determinar la afinidad de unión, la potencia biológica y la especificidad de unión.
La Figura 1 representa la capacidad relativa de los sobrenadantes de los 44 hibridomas anti-TNF RabMab para neutralizar TNFa in vivo. La neutralización se evaluó midiendo la inhibición de la citotoxicidad de TNFa en fibroblastos L929 de ratón cultivados. Los sobrenadantes muestran diferentes eficacias en el ensayo con L929. Los valores de CE50 (concentración efectiva para lograr un 50 % de inhibición) se determinaron en cribados primarios (barras azules) y secundarios (barras rojas) y se normalizaron con respecto al mejor comportamiento en cada uno de los ensayos. La afinidad de unión al TNF también se midió mediante análisis BIACore para cada RabMab (barras verdes).
Los RabMabs codificados por cada uno de los hibridomas también se secuenciaron y las secuencias se sometieron a análisis filogenético basado en la predicción de agrupaciones de epítopos. Se seleccionaron cuatro Rabmabs representativos (EPI-6, EPI-19, EPI-34 y EPI-43) con alta actividad de unión y potente actividad neutralizante de entre diferentes familias filogenéticas como anticuerpos donantes para injertos de CDR. Se seleccionaron cuatro (4) Rabmabs adicionales (EPI-1, EPI-15, EP-35 y EP-42) para el injerto de CDR basándose en su actividad favorable en un ELISA de secreción (véase la Figura 2).
Ejemplo 3: Injerto de CDR y humanización funcional de anticuerpos donantes de conejo
A diferencia de los métodos de humanización tradicionales que emplean el marco aceptor de anticuerpos humanos que comparte la mayor homología de secuencia con el anticuerpo donante no humano, las CDR de conejo se injertaron en un marco humano (FW 1.4) que fue preseleccionado por propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad) utilizando un ensayo de control de calidad. Aunque la secuencia de marco estable y soluble exhibió una alta homología con el RabMab, el anticuerpo aceptor seleccionado no es la secuencia más homóloga disponible.
Se generó un cierto número de injertos de CDR para cada uno de los Rabmabs. El término «injerto Min» o «min», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un dominio variable humanizado que se generó mediante el injerto de CDR de conejo de un dominio variable de conejo en un marco aceptor humano de origen natural (FW 1.4, SEQ ID NOs. 1 y 2, conectadas mediante un conector (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 72)). No se realizan cambios en las regiones de marco. El marco en sí se preseleccionó en función de propiedades funcionales deseables (solubilidad y estabilidad). El término «injerto Max» o «max», tal como se utiliza en la presente, se refiere a un domino variable humanizado que se generó injertando CDR de conejo procedentes de un dominio variable de conejo en el marco aceptor humano, «conejizado» «RabTor» (rFW1.4, Se Q iD No. 92) o en un derivado de este denominado rFW1.4(v2) (SEQ ID No. 93). El marco «RabTor» se preparó incorporando residuos de conejo conservados (que por lo demás son bastante variables en otras especies) en posiciones del marco involucradas generalmente en la estructura y estabilidad del dominio variable de conejo, con el objetivo de generar un marco aplicable universalmente que acepte prácticamente cualquier conjunto de CDR de conejo sin la necesidad de injertar residuos del marco donante aparte de en posiciones que son diferentes en su presunta secuencia progenitora, por ejemplo, que se alteraron durante la hipermutación somática y, por tanto, contribuyen posiblemente a la unión al antígeno. La presunta secuencia progenitora se define como el equivalente de la línea germinal de conejo más cercano y, en caso de que no se pueda establecer el equivalente de la línea germinal más cercano, el consenso del subgrupo de conejo o el consenso de secuencias de conejo con un alto porcentaje de similitud. «Min-Max» o «minmax» se refieren a un dominio variable humanizado que consiste en una cadena ligera variable «injerto Min» combinada con una cadena pesada variable «injerto Max», mientras que «Max-Min» o «maxmin» se refieren a un dominio variable humanizado que consiste en una cadena ligera variable «injerto Max» combinada con una cadena pesada variable «injerto Min».
La Tabla 2 muestra un resumen de los datos de caracterización detallados para los anticuerpos de cadena sencilla humanizados que se originan a partir de ocho anticuerpos monoclonales de conejo o Rabmabs diferentes (EP1, EP6, EP15, EP19, EP34, EP35, EP42 y EP43). Los denominados injertos «min» (por ejemplo, EP1min) se refieren a constructos en los que solo se injertaron las CDR del donante de conejo, mientras que para los denominados injertos «max», no solo se injertaron las CDR, sino también algunas posiciones de aminoácidos en el marco del donante. Adicionalmente, la Tabla 2 muestra los datos de dos anticuerpos de cadena sencilla marcados con His (EP34min_C-His y EP19max_C-His), así como el anticuerpo de cadena sencilla de referencia ESBA105 descrito en el documento WO 2006/131013. La tercera columna, a la que se alude como «L929», indica las potencias relativas de los diferentes anticuerpos de cadena sencilla según se determina en un ensayo de L929 y en comparación con la potencia de ESBA105. Los valores de kon, koff y K d se indican en unidades de M 'V , s-1 y M, respectivamente. La séptima columna indica el punto medio del despliegue inducido térmicamente según se determina con FT-IR. La última columna indica el rendimiento relativo de proteína correctamente plegada que se obtiene a partir de cuerpos de inclusión solubilizados después de una estrategia de replegamiento.
En la Figura 3 se proporcionan algunos ejemplos de datos de BIACore que se incluyeron en la Tabla 2: Se muestran las cinéticas de unión para la unión de ESBA105 (Fig. 3a), EP43max (Fig. 3b) y EP34max (Fig. 3c) a TNFa humano. Se proporcionan ejemplos de ensayos de potencia celular en la Figura 4, la cual compara ESBA105 (círculos negros) con EP43max (cuadrados en blanco) en un ensayo con L929. En las Figuras 9 y 10 se proporcionan más ejemplos de ensayos de potencia celular que comparan EP34max con los anticuerpos comercializados infliximab y adalimumab.
Tabla 2: Resumen de los datos de caracterización detallados para los cuatro anticuerpos monoclonales de conejo (EP6, EP1 EP 4 EP4 v ri n n DR in r .
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Ejemplo 4: Optimización de la solubilidad y estabilidad de EP43max, un potente ligador de TNFa
Se seleccionó EP43max para una mayor optimización en función de su potente actividad de unión al TNF. La caracterización biofísica de este inmunoligador reveló que exhibe un alto punto medio de desnaturalización (Tm > 70 °C) en un ensayo de despliegue térmico (FTIR) (véase la Figura 5). No obstante, EP43max se sometió a una optimización de la solubilidad para estrechar su amplia fase de transición en el despliegue térmico. Con el fin de mejorar la solubilidad del EP43max nativo, las tres posiciones de residuos 12, 103 o 144 en la cadena VH se sustituyeron con aminoácidos con mayor hidrofilicidad. Se demostró que esta combinación aumenta la solubilidad de la proteína nativa sin afectar a la estabilidad o la actividad de unión. Se introdujeron (V ^ S en la posición 12 de AHo, V ^ T en la posición 103 de AHo y L ^ T en la posición 144 de AHo) para reemplazar los residuos hidróbofos en la interfaz del dominio V-C de la región de la cadena pesada variable (VH) de EP43max. Además de las mutaciones potenciadoras de la solubilidad, se identificaron nueve mutaciones estabilizantes (T10S, K47R, Y57S, L91F y T103V en VL y E1Q, E6Q, S7T y V103L I en VH) en EP43max (véase la Tabla 3). Estos residuos estabilizantes se identificaron a partir de un análisis de consenso funcional de los marcos de control de calidad (QC) de ESBATech. Los residuos estabilizantes en las posiciones 1 y 3 en VL y en la posición 89 en VH ya estaban presentes en la molécula EP43max. Se identificó una mutación estabilizante adicional (M ^ L) en la posición 4 de VL, pero se eliminó de la consideración basándose en su papel predicho en la unión al antígeno.
Tabla 3: Mutaciones estabilizantes en EP43max
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Columna 1, dominio variable. Columna 2, posición de aminoácido de AHo. Columna 3, residuo progenitor en EP43max. Columna 4, sustitución preferida para la posición indicada en la columna 2. Columna 5, mutación estabilizante.
Ejemplo 5: Variantes optimizadas de EP43max, un potente ligador de TNFa
Las Tablas 4 y 5 muestran los datos de caracterización para tres variantes optimizadas de EP43max. EP43_maxDHP es una variante de solubilidad mejorada de EP43max y comprende las tres mutaciones potenciadoras de la solubilidad anteriores (V ^ S en la posición 12 de AHo, V ^ T en la posición 103 de AHo y L ^ T en la posición 144 de AHo). Las variantes EP43_maxmin y EP43_minmax se generaron mediante el reordenamiento de dominios entre injertos «min» y «max». Por ejemplo, la variante «minmax» comprende la versión de injerto mínimo (solo injerto de CDR) de la cadena ligera y la versión de injerto máximo de la cadena pesada (es decir, CDR de conejo injertadas más residuos de marco de conejo que participan en la unión al antígeno), mientras que la variante «maxmin» comprendía la versión de injerto máximo de la cadena ligera y la versión de injerto mínimo de la cadena pesada.
T l 4: D r riz i n r EP4 m x v ri n .
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T l : D r riz i n r EP4 m x v ri n .
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Las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas se compararon mediante análisis FTIR (véase la Figura 6 y la Tabla 6). Se determinó que EP43minmax tiene un punto medio de despliegue más bajo que EP43max.
Tabla 6: Comparación de las curvas de desnaturalización térmica de EP43max y sus variantes optimizadas mediante análisis FTIR
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Además, la variante mimax exhibió una transición de despliegue de una etapa, lo que indica que ambos dominios se despliegan a temperaturas muy similares. EP43 max (Figura 7A) y su variante EP43minmax (Figura 7B) se compararon adicionalmente en una prueba de estrés térmico. Se evaluó el contenido de láminas beta y la concentración de proteína soluble después de una concentración térmica a temperaturas cada vez mayores (50, 60 y 70 °C). EP43minmax fue considerablemente más estable que EP43max a la temperatura intermedia de 60 °C.
Ejemplo 6: Comparación de EP34max con ligadores de TNFa comercializados
La capacidad de EP34max, adalimumab e infliximab de bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNF alfa humano recombinante se comparó como se ha detallado anteriormente en un ensayo con L929. La capacidad de EP43max, adalimumab e infliximab de bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNF alfa humano recombinante se evaluó en un ensayo con Kym-1. Los resultados se muestran en las Figuras 9a, b y las Figuras 10a, b, respectivamente.
La Figura 9a ilustra la potencia de EP34max y Adalimumab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para EP34max y Adalimumab era 1,03 ng/ml y 8,45 ng/ml, respectivamente. La Figura 9b ilustra la potencia de adalimumab y Ep34max para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para adalimumab y EP34max (791) era 66,2 ng/ml y 0,69 ng/ml, respectivamente.
La Figura 10a ilustra la potencia de EP34max e infliximab para bloquear la actividad citotóxica de 1000 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células L929 murinas). Se determinó que la CI50 para EP34max e infliximab era 1,04 ng/ml y 13,9 ng/ml, respectivamente. La Figura 10b ilustra la potencia de infliximab y Ep34max (791) para bloquear la actividad citotóxica de 10 pg/ml de TNF alfa humano recombinante (células Kym-1 humanas). Se determinó que la CI50 para infliximab y EP34max era 14,98 ng/ml y 0,63 ng/ml, respectivamente. Por lo tanto, en ambos casos, EP34max mostró un mejor comportamiento que infliximab.
EQUIVALENTES
Numerosas modificaciones y realizaciones alternativas de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica teniendo en cuenta la descripción anterior. Por consiguiente, esta descripción debe interpretarse como ilustrativa únicamente y tiene el propósito de enseñar a los expertos en la técnica el mejor modo de llevar a cabo la presente invención.
En caso de que uno o más de los elementos bibliográficos citados y materiales similares difieran o contradigan esta solicitud, incluidos los términos definidos, uso del término, técnicas descritas o similares, prevalecerá esta solicitud.
Los encabezamientos de las secciones que se utilizan en la presente solo tienen fines organizativos y no se deben interpretar como limitantes de la materia descrita de ninguna manera.
Aunque la presente invención se ha descrito junto con diversas realizaciones y ejemplos, no se pretende que el contenido de la presente esté limitado por tales realizaciones o ejemplos.

Claims (26)

REIVINDICACIONES
1. Un inmunoligador que se une específicamente al TNFa humano, comprendiendo el inmunoligador:
(i) una secuencia de marco variable de cadena pesada humana y secuencias de CDR H1, CDR H2 y CDR H3 que proceden de un inmunoligador de conejo, donde el marco de la región variable de cadena pesada humana tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2; y
(ii) una secuencia de marco variable de cadena ligera humana y secuencias de CDR L1, CDR L2 y CDR L3 que proceden de un inmunoligador de conejo, donde la secuencia de marco de la región variable de cadena ligera humana tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
2. El inmunoligador de la reivindicación 1, donde el marco de la región variable de cadena pesada humana es o comprende la SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90 y la secuencia de marco de la región variable de cadena ligera humana es o comprende la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 91.
3. El inmunoligador de la reivindicación 2, que comprende una o más sustituciones en el marco de cadena pesada (VH) en una posición del grupo que consiste en las posiciones H24, H25, H56, H82, H84, H89 y H108; y/o una sustitución en el marco de cadena ligera (VL) en la posición L87 de acuerdo con el sistema de numeración Aho, donde el marco de la región variable de cadena pesada es o comprende la SEQ ID NO: 2 y la región variable de cadena ligera humana es o comprende la SEQ ID NO: 1.
4. El inmunoligador de la reivindicación 3, donde la sustitución se selecciona del grupo que consiste en treonina (T) en la posición H24, valina (V) en la posición H25, glicina (G) o alanina (A) en la posición h 56, lisina (K) en la posición H82, treonina (T) en la posición H84, valina (V) en la posición H89 y arginina (R) en la posición H108 y treonina (T) en la posición L87 de acuerdo con el sistema de numeración AHo.
5. El inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones previas, donde el inmunoligador comprende una sustitución potenciadora de la solubilidad en al menos una de las posiciones de aminoácidos 12, 103 y 144 de la cadena pesada (numeración AHo).
6. El inmunoligador de la reivindicación 5, donde la sustitución potenciadora de la solubilidad se selecciona del grupo que consiste en: (a) serina (S) en la posición 12; (b) treonina (T) en la posición 103; y (c) treonina (T) en la posición 144.
7. El inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además:
a) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8; b) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14;
c) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20;
d) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26;
e) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32;
f) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38;
g) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44; o
h) una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 y SEQ ID NO: 50.
8. El inmunoligador de la reivindicación 7, donde el marco de cadena pesada del inmunoligador que comprende una o más secuencias de CDR que tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo de d), e), f), g) o h) tiene deleciones en las posiciones del marco 85 y 88.
9. El inmunoligador de la reivindicación 7, donde la una o más secuencias de CDR tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo de a), que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 22, 74, 95, 97 y 99 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con el sistema de numeración Aho, preferentemente treonina (T) en la posición L22, fenilalanina (F) o tirosina (Y) en la posición L74, glutamato (E) L95 o alanina (A) en la posición L99.
10. El inmunoligador de la reivindicación 7, donde la una o más secuencias de CDR tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo de c), que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 87, 89 y 92 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con el sistema de numeración AHo.
11. El inmunoligador de la reivindicación 7, donde la una o más secuencias de CDR tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo de e), que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 86 y 87 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con el sistema de numeración Aho, preferentemente treonina (T) en la posición L87 y glutamina (Q) en la posición L88.
12. El inmunoligador de la reivindicación 7, donde la una o más secuencias de CDR tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo de f), que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 15, 48 y 90 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con el sistema de numeración AHo.
13. El inmunoligador de la reivindicación 7, donde la una o más secuencias de CDR tienen una identidad de al menos un 80 % con una secuencia seleccionada del grupo de g), que tiene una sustitución en al menos una de las posiciones 57 y 87 de la región variable de cadena ligera (VL) de acuerdo con el sistema de numeración Aho, preferentemente valina (V) en la posición L57 y treonina (T) en la posición L87.
14. El inmunoligador de la reivindicación 7, que comprende:
a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 55, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59;
b) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 62, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 61 y SEQ ID NO: 63;
c) que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 66, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en Se Q ID NO: 65 y SEQ ID NO: 67;
d) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 70, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 71;
e) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 73 y SEQ ID NO: 75, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 76;
f) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 79, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 80;
g) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81 y SEQ ID NO: 83, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84; o
h) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 87, y una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 88.
15. El inmunoligador de la reivindicación 14, que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 %, preferentemente un 100 %, con cualquiera de SEQ ID NO: 94 a SEQ ID NO: 121.
16. El inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo, scFv, Fab o Dab.
17. Una composición que comprende el inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un portador farmacéuticamente aceptable.
18. La composición de la reivindicación 17, formulada para la administración tópica, oral, nasal, rectal o parenteral.
19. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una región de cadena pesada variable (VH) y/o una región de cadena ligera variable (VL) de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
20. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 19.
21. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 20.
22. El inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso como producto farmacéutico.
23. El inmunoligador para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, para las vías de administración intramuscular, intraperitoneal, intracerobroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación.
24. Uso del inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 en la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad mediada por TNFa humano.
25. El inmunoligador de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad mediada por TNFa humano.
26. El uso de la reivindicación 24 o el inmunoligador para su uso de la reivindicación 25, donde la enfermedad mediada por TNFa se selecciona del grupo que consiste en estados de inflamación crónicos y/o autoinmunitarios en general, trastornos inflamatorios inmunomediados en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan al ojo, las articulaciones, la piel, las membranas mucosas, el sistema nervioso central, el tracto gastrointestinal, el tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis por HLA-B27+, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluida la neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis (incluida la artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incluidas las manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EpOC), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto frente a huésped, reacciones de huésped frente a injerto, episodios de rechazo después de un trasplante de órgano o de médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematoso sistémico y discoide, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, preclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis vírica, hepatitis alcohólica, inflamación posquirúrgica tal como después de una cirugía ocular (por ejemplo, cirugía de cataratas (reemplazo del cristalino) o cirugía de glaucoma), cirugía articular (incluida la cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo, ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo, PTCA, aterectomía, colocación de stent), procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intraabdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) o inflamación perioperatoria (prevención) en general, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob. Osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis óseas, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si están provocadas por efectos centrales o periféricos del TNFa y si se clasifican como inflamatorias, formas nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (CRPS), gota, neuralgia posherpética, fibromialgia, estados locales de dolor, síndromes de dolor crónico debidos a un tumor metastásico, dismenorrea. Sepsis bacteriana, vírica o fúngica, tuberculosis, SIDA, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardíaca e insuficiencia cardíaca crónica.
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