ES2687786T3

ES2687786T3 - Conjugados para administración ósea y procedimiento de uso de estos para dirigir proteínas al hueso

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Publication number: ES2687786T3
Application number: ES11000196.3T
Authority: ES
Inventors: Philippe Crine; Guy Boileau; Isabelle Lemire; Thomas P. Loisel
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-04-21
Filing date: 2005-04-21
Publication date: 2018-10-29
Anticipated expiration: 2025-04-21
Also published as: WO2005103263A1; US11248021B2; US7960529B2; HUE055861T2; DE602005027461D1; US20100221234A1; PL2348114T3; US10000532B2; WO2005103263B1; JP2007533669A; CA2559228A1; SI3404102T1; EP1759001B1; DK3404102T3; US20190119323A1; PL3404102T3; EP1759001A1; JP4874954B2; US7763712B2; EP1759001A4

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a. Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la SEQ ID NO: 7; b. Un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 8; c. Una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en a) o b); y d. Una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos en c), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6 x SSC, 5 x reactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 ºC; y lavados en 2 x SSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2 x SSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1 x SSC y SDS al 0,5 % a 65 ºC tres veces durante 5 min; donde dicha molécula de ácido nucleico codifica una fosfatasa alcalina soluble activa que comprende en el extremo C una secuencia de poliaspartato Dn, donde n>=10 a 16.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados para administración ósea y procedimiento de uso de estos para dirigir proteínas al hueso 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos codificantes de conjugados para administración ósea.

Se describen composiciones para administración ósea que comprenden motivos peptídicos, modificados dentro de 10 la estructura de una proteína a través de tecnología de ADN recombinante para promover la unión a la matriz ósea.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los avances tecnológicos en biología molecular, la producción de proteínas recombinantes y la purificación de 15 proteínas a gran escala han permitido la producción de grandes cantidades de proteínas que ahora se utilizan como productos biofarmacéuticos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y las formas solubles del receptor TNF-a se han utilizado en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como la enfermedad de Crohn o varias formas de psoriasis (1). Otro ejemplo de uso de proteína recombinante es la terapia de reemplazo enzimático (ERT). La ERT se ha utilizado para tratar enfermedades de almacenamiento lisosómico. Este grupo de trastornos genéticos se 20 caracteriza por la pérdida de la función de las enzimas lisosómicas, lo que produce patologías somáticas, y a veces neuronales, graves. En la ERT para estas enfermedades, los pacientes reciben una infusión con grandes dosis de enzimas normales. Estas enzimas infundidas después se interiorizan desde la circulación a través de los receptores de la superficie celular (receptor de manosa-6 fosfato) e ingresan en la vía endocítica en el camino hacia el sitio de acción, el lisosoma. No todos los intentos de tratar los trastornos genéticos a través de la ERT han resultado 25 exitosos.

La hipofosfatasia es un tipo raro y hereditario de raquitismo u osteomalacia que ocurre con una incidencia de 1 por cada 100.000 nacimientos para la forma más grave de la enfermedad. Las formas más leves son más frecuentes. En este defecto del metabolismo innato, las mutaciones inactivan el gen que codifica la isoenzima no específica del 30 tejido de la fosfatasa alcalina. Se caracteriza bioquímicamente por una actividad subnormal de la fosfatasa alcalina en suero. La deficiencia de fosfatasa alcalina en los osteoblastos y condrocitos deteriora la mineralización esquelética, lo que produce raquitismo u osteomalacia.

Existe una gama muy amplia de expresividad de la hipofosfatasia, que va desde una forma perinatal que a menudo 35 causa el nacimiento de bebés muertos debido a un esqueleto sin mineralizar, hasta una forma más suave que solo presenta la pérdida prematura de los dientes. Los bebés y los niños gravemente afectados heredan la hipofosfatasia como un rasgo autosómico recesivo. Existen cuatro formas principales de la enfermedad: perinatal, infantil, de la niñez y adulta. La hipofosfatasia perinatal se manifiesta durante la gestación y la mayoría de los recién nacidos afectados sobreviven por poco tiempo. La hipofosfatasia infantil se manifiesta clínicamente antes de los 6 meses de 40 edad. Aproximadamente el 50 % de los pacientes muere en un año. La hipofosfatasia de la niñez varía enormemente en cuanto a la gravedad, pero la mayoría de estos pacientes sufrirán síntomas esqueléticos a lo largo de su vida. La hipofosfatasia en adultos aparece durante la mediana edad, con síntomas tales como fracturas dolorosas por esfuerzos recurrentes que tienen una curación deficiente.

45 Los osteoblastos y los condrocitos son normalmente ricos en fosfatasa alcalina no específica del tejido donde se adhiere a la superficie celular. En la hipofosfatasia, la falta de actividad de la fosfatasa alcalina provoca la acumulación extracelular de tres compuestos de fósforo que se cree que son sustratos de la enzima: fosfoetanolamina (PEA), pirofosfato inorgánico (PPi) y piridoxal 5'-fosfato (PLP). El PPi es un inhibidor del crecimiento de cristales de hidroxiapatita, y la acumulación de PPi en la enfermedad explica el deterioro de la 50 mineralización esquelética. En consecuencia, el suministro de enzimas activas a los pacientes que sufren de hipofosfatasia disminuye los niveles de PPi extracelular y mejora la mineralización esquelética.

Actualmente, no existe una terapia médica establecida para la hipofosfatasia. Los ensayos de reemplazo de enzimas mediante infusiones intravenosas de fosfatasa alcalina han fracasado. Parece que la actividad de la fosfatasa 55 alcalina se debe aumentar no en la circulación sino en el esqueleto mismo. Esta hipótesis se confirmó recientemente por el trasplante de médula ósea. Lamentablemente, los beneficios del trasplante solo duraron un período corto debido a un injerto deficiente.

Por lo tanto, es necesario proporcionar un enfoque de terapia de reemplazo enzimático para proporcionar enzimas 60 activas al esqueleto de los pacientes que sufren hipofosfatasia.

Las proteínas dirigidas a los huesos podrían ser útiles no solo para el tratamiento o la prevención de la hipofosfatasia (pérdida de la función de la fosfatasa alcalina), sino también para el tratamiento o la prevención de otras enfermedades genéticas caracterizadas por una actividad enzimática defectuosa implicada en el metabolismo 5 óseo, tal como raquitismo hipofosfatémico ligado a X (XLH) (pérdida de la función del gen regulador del fosfato con homología a endopeptidasas en el cromosoma X (PHEX)).

El XLH es la más prevalente de las hipofosfatemias familiares (OMIM 307800, 307810). Se caracteriza por una reducción de la reabsorción de fosfato en el riñón, hipofosfatemia, normocalcemia, niveles plasmáticos de 1,2510 dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D, calcitriol) de normales a bajos, función normal de la glándula paratiroides y actividad elevada de la fosfatasa alcalina plasmática. Estos cambios están asociados con el retraso del crecimiento, la deformidad de las extremidades inferiores, la evidencia radiológica e histomorfométrica del raquitismo y la osteomalacia. Esta enfermedad parece ser el resultado de la combinación de defectos renales en la reabsorción de fosfato tubular y el metabolismo de la vitamina D, así como un trastorno funcional en los huesos y los dientes. El 15 XLH es el resultado de la inactivación de mutaciones en el gen PHEX, un miembro de la familia de la metalopeptidasa de zinc de las glicoproteínas de membrana integral tipo II. Estas mutaciones impiden la expresión de una enzima PHEX funcional en la superficie celular de los osteoblastos. Hasta ahora, el tratamiento de los pacientes con XLH se limita a la suplementación con complementos de fosfato inorgánico (Pi) orales en cuatro o cinco dosis divididas por día, y la coadministración de 1,25(OH)2D para compensar la síntesis inadecuada de 20 1,25(OH)2D. Estas altas dosis de fosfato con frecuencia provocan intolerancias gastrointestinales, particularmente diarrea, lo que lleva al incumplimiento del paciente. Por un lado, la carga de fosfato conlleva el riesgo de provocar un hiperparatiroidismo secundario (que puede ser lo suficientemente grave como para requerir una paratiroidectomía) mientras que, por otro, la administración de un exceso de 1,25(OH)2D puede provocar hipercalciuria, hipercalcemia y nefrocalcinosis.

25

Por lo tanto, la ERT útil para el XLH trataría de reemplazar la enzima PHEX defectuosa en pacientes con XLH por una enzima funcional obtenida a través de tecnología de ADN recombinante. Como la enzima PHEX normal está anclada en la membrana plasmática de los osteoblastos por un péptido hidrofóbico, la forma natural de PHEX no puede ser producida y purificada en cantidades suficientes para su uso en un preparado farmacéutico. Para evitar el 30 problema, se diseñó y se produjo una forma soluble de PHEX recombinante (o sPHEX) en cultivos celulares, se purificó y se formuló para administración intravenosa (IV) (WO 00/50580). sPHEX se inyectó posteriormente en ratones Hyp, un modelo de ratón para el XLH, tal como se describe en la solicitud estadounidense pendiente de aprobación n.° 10/362.259. Se observó una mejora de diversos parámetros séricos relacionados con el hueso, incluida una reducción de los niveles anormalmente altos de fosfatasa alcalina sérica. Aunque estos experimentos 35 fueron exitosos, se creyó que la eficacia del sPHEX terapéutico podría aumentar si la proteína recombinante se modificaba para promover su unión a los minerales óseos.

Por lo tanto, se necesitan medios para dirigir con éxito las proteínas a la matriz ósea.

40 Se sabe que los bifosfonatos presentan una unión de afinidad alta con la hidroxiapatita (HA), y se han utilizado para dirigir moléculas pequeñas (4) y proteínas (5) a los huesos. Sin embargo, esta estrategia requiere modificaciones químicas de las proteínas purificadas y presenta varias desventajas, entre ellas una posible interferencia con la actividad de las proteínas y etapas de purificación adicionales.

45 Otra estrategia para dirigir moléculas pequeñas a los huesos ha sido conjugar estas entidades con péptidos ácidos como el poli-Asp (6). Esta estrategia se desarrolló tras la observación de que diversas proteínas sintetizadas por osteoblastos, las células formadoras de huesos, se unen a la matriz ósea a través de secuencias particularmente ricas en residuos de aminoácidos ácidos (Asp y Glu). Este es el caso de la osteopontina (7) y la sialoproteína ósea, dos proteínas no colagenosas. Por lo tanto, se utilizaron péptidos ácidos (E2-10 y D2-10) para dirigir moléculas 50 pequeñas (es decir, metotrexato, FITC, Fmoc, biotina, estradiol) a la hidroxiapatita in vitro. Se utilizaron péptidos ácidos (E6 y D6-10) para dirigir moléculas pequeñas (es decir, FITC, Fmoc, estradiol) a la hidroxiapatita in vivo. Por último, se demostró que E6 confiere a BSA, hemoglobina y IgG la capacidad de unirse a la hidroxiapatita in vitro. En todos los casos anteriores, la unión de la secuencia ácida se realizó químicamente.

55 WO 98/35703 A2describe procedimientos y composiciones para la administración de agentes terapéuticos, que incluyen proteínas, al tejido óseo empleando conjugados de oligómeros peptídicos cargados negativamente.

Oda K y col. (1999; Journal of Biochemistry 126(2): 694-699) describe la purificación de una forma soluble de fosfatasa alcalina no específica de tejidos humanos (TNSALP).

La presente invención busca abordar estas y otras necesidades.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN:

5 La presente invención muestra que las moléculas grandes y complejas, como las proteínas, pueden fusionarse con péptidos ácidos para dirigirse con éxito al hueso in vivo.

La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

10

a. un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la SEQ ID NO: 7;

b. un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 8;

15

c. una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en a) o b); y

d. una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de 20 nucleótidos en c), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6 x SSC, 5

x reactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2 x SSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2 x SSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1 x sSc y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 min; donde dicha molécula de ácido nucleico codifica una fosfatasa alcalina soluble activa que comprende en el extremo C una 25 secuencia de poliaspartato Dn, donde n=10 a 16.

Se describe un conjugado para administración ósea que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en: A) X-Dn-Y-proteína-Z; y B) Z-proteína-Y-Dn-X, donde X está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Y está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; Z está 30 ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y Dn es un poli aspartato donde n = 10 a 16. También se describe que la proteína en el conjugado para administración ósea es un gen regulador de fosfato soluble con homología para las endopeptidasas en el cromosoma X (sPHEX). También se describe que la estructura del conjugado es: X-Dn-Y-sPHEX-Z. Se describe que sPHEX tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 46 a 749 de la figura 10; 47 a 749 de la figura 10; 48 a 749 de la figura 10; 49 a 749 de 35 la figura 10; 50 a 749 de la figura 10; 51 a 749 de la figura 10; 52 a 749 de la figura 10; 53 a 749 de la figura 10; y 54 a 749 de la figura 10.

Se describe que, en estos conjugados para administración ósea, n es 10. Además, se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 11. Además,

40 se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 12. Además, se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 13. Además,

se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 14. Además, se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 15. Además, se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 16.

45 Además, se describe que el sPHEX consiste en la secuencia de aminoácidos 46 a 749 de la figura 10 y n=10.

Se describe que la proteína en el conjugado es una fosfatasa alcalina soluble (sALP).

Se describe que la estructura del conjugado es: Z-sALP-X-Dn-Y.

50

Se describe que sALP está codificado por la secuencia como se presenta en la figura 16A. Además, se describe que sALP tiene la secuencia como se presenta en la figura 16B. Se describe que, en estos conjugados para administración ósea, n es 10. Se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 11. Se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 12. Se describe que, en este conjugado para administración 55 ósea, n es 13. Se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 14. Se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 15. Se describe que, en este conjugado para administración ósea, n es 16. Además, se describe que n=10.

Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada 60 del grupo que consiste en: un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de

aminoácidos como se presenta en la figura 8; un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la figura 11; un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la figura 7; una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b) o (c); y una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar 5 en condiciones de rigurosidad elevada con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6XSSC, 5Xreactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2XSSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2XSSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1XSSC y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 minutos.

10

También se proporciona un vector recombinante que comprende dicha secuencia. También se proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende dicho vector.

La invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos 15 seleccionada del grupo que consiste en: un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la figura 17a; un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la figura 17B; una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) o (b); y una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos en (c), donde las condiciones de rigurosidad alta 20 comprenden: prehibridación e hibridación en 6XSSC, 5Xreactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2XSSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2XSSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1XSSC y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 minutos; donde dicha molécula de ácido nucleico codifica una fosfatasa alcalina soluble fisiológicamente activa que comprende en el extremo C una secuencia de poliaspartato Dn, donde n 25 = 10 a 16.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada codificante de PHEX soluble funcional que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 54 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de 30 un sPHEX que comprende los aminoácidos 53 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 52 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 51 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 50 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 49 a 749 como se presenta en la figura 35 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 48 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 47 a 749 como se presenta en la figura 10; un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los aminoácidos 46 a 749 como se presenta en la figura 10; una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) a (i); y una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada 40 con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) a (j), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6XSSC, 5Xreactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2XSSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2XSSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1XSSC y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 minutos. Además, se describe que la molécula de ácido nucleico aislada además comprende 45 en su extremo 5', un polinucleótido codificante de un poli-aspartato seleccionado del grupo que consiste en D10 a D16.

También se describe un polipéptido de sPHEX aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: aminoácidos 54 a 749 como se presenta en la figura 10; aminoácidos 53 a 749 como se presenta en la 50 figura 10; aminoácidos 52 a 749 como se presenta en la figura 10; aminoácidos 51 a 749 como se presenta en la

figura 10; aminoácidos 50 a 749 como se presenta en la figura 10; aminoácidos 49 a 749 como se presenta en la

figura 10; aminoácidos 48 a 749 como se presenta en la figura 10; aminoácidos 47 a 749 como se presenta en la

figura 10; y aminoácidos 46 a 749 como se presenta en la figura 10.

55 Se describe una composición para administración ósea que comprende un conjugado para administración ósea y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describe un procedimiento para administrar una proteína a tejido óseo de un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un conjugado para administración ósea tal como se describió.

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También se describe un procedimiento para administrar sPHEX a tejido óseo de un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un conjugado para administración ósea.

También se describe un procedimiento para administrar ALP a tejido óseo de un mamífero que lo necesita que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva de un conjugado para administración ósea.

También se describe un procedimiento para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de gen regulador de fosfato funcional con homología para las endopeptidasas en el cromosoma X (PHEX) que comprende administrar a un mamífero que lo necesita un conjugado, donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describe que la afección o la enfermedad es raquitismo hipofosfatémico ligado a X (XLH).

Se describe un procedimiento para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de fosfatasa alcalina funcional que comprende administrar a un mamífero que lo necesita un conjugado, donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describe que la afección o la enfermedad es hipofosfatasia.

Se describe un conjugado para administración ósea para administrar una proteína al tejido óseo de un mamífero.

Se describe un uso de un conjugado para administración ósea para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de gen regulador de fosfato funcional con homología para las endopeptidasas en el cromosoma X (PHEX), donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describe un uso de un conjugado para administración ósea en la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de gen regulador de fosfato funcional con homología para las endopeptidasas en el cromosoma X (PHEX). Se describe que la afección o la enfermedad es raquitismo hipofosfatémico ligado a X (XLH).

También se describe un uso de un conjugado para administración ósea para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de fosfatasa alcalina funcional, donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describe un uso de un conjugado para administración ósea de la presente invención en la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de fosfatasa alcalina funcional, donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describe que la afección o la enfermedad es hipofosfatasia.

También se describe un procedimiento para evaluar péptidos para uso en un conjugado de proteína-péptido para administración ósea que comprende las etapas de: fusionar un péptido candidato con una proteína indicadora para formar un conjugado de proteína-péptido; poner en contacto el conjugado con tejido óseo o la fase mineral del hueso; y donde el péptido candidato se selecciona cuando la presencia de la proteína indicadora en el tejido óseo o la fase mineral del hueso es mayor cuando se conjuga con el péptido candidato que cuando no lo hace.

Se describe un conjugado para administración ósea de una proteína fusionada a un péptido seleccionado del grupo que consiste en deca-aspartato (D10) a hexadeca-aspartato (D16).

Se describe que

el sPHEX está fusionado en su extremo N a D10. el sPHEX está fusionado en su extremo N a D11. el sPHEX está fusionado en su extremo N a D12. el sPHEX está fusionado en su extremo N a D13. el sPHEX está fusionado en su extremo N a D14. el sPHEX está fusionado en su extremo N a D15. el sPHEX está fusionado en su extremo N a D16,

Se describe que Se describe que Se describe que Se describe que Se describe que Se describe que

Se describe que en los conjugados

el sALP está fusionado en el extremo C a D10. Se describe que

el sALP está fusionado en el extremo C a D11

el sALP está fusionado en el extremo C a D12

el sALP está fusionado en el extremo C a D13

el sALP está fusionado en el extremo C a D14

5 el sALP está fusionado en el extremo C a D15

el sALP está fusionado en el extremo C a D16

Se describe que Se describe que Se describe que Se describe que Se describe que

sPHEX

10 Tal como se usa en la presente, sPHEX significa cualquier fragmento biológicamente activo soluble de PHEX o muteína de este. Los expertos en la técnica pueden preparar construcciones de expresión diferentes de las que se describen expresamente en la presente para la producción óptima de sPHEX en líneas celulares adecuadas transfectadas con este. Además, los expertos pueden diseñar fragmentos de ADNc codificantes de fragmentos biológicamente activos adecuados y muteínas de PHEX de origen natural que poseen la misma actividad biológica o 15 similar que la enzima de longitud completa de origen natural.

Para crear una fuente recombinante para sPHEX, se puede construir y evaluar una amplia serie de vectores de expresión en cuanto a la expresión de un ADNc de PHEX. Basándose en los experimentos de transfección transitoria, así como en las transfecciones estables, se puede identificar una construcción de expresión que 20 proporcione un nivel particularmente alto de expresión.

Se describe cualquier sPHEX que comprende al menos una porción de ectodominio de PHEX natural que comienza con la cisteína en la posición 54 de la secuencia presentada en la figura 10.

25 Los conjugados invención por lo tanto son cualquier sPHEX que comprende este fragmento de 54-749 del PHEX natural, o el fragmento natural 53-749, o el fragmento natural 52-749, o preferentemente el fragmento natural 51749, o el fragmento natural 50-749 o el fragmento natural 49-749 o el fragmento natural 48-749, o el fragmento natural 47-749, o el fragmento natural 46-749, junto con un poli-aspartato seleccionado del grupo que consiste en D10 a D16 fusionado inmediatamente corriente arriba de este fragmento.

30

El conjugado además puede comprender opcionalmente uno o más aminoácidos adicionales 1) corriente arriba del poli-aspartato; y/o 2) entre el poli-aspartato y el fragmento natural o el equivalente funcional. Estos aminoácidos pueden ser cualquier aminoácido. Se pueden seleccionar de forma independiente del grupo que consiste en cualquier aminoácido excepto la cisteína, la prolina y el triptofano, a saber, los aminoácidos que se sabe que 35 inducen la formación de enlaces disulfuro o cambios en la conformación.

Estos aminoácidos pueden estar presentes en el conjugado cuando, por ejemplo, la estrategia de clonación utilizada para producirlo los introduce en estas ubicaciones.

40 De acuerdo con las estrategias de clonación específicas, los aminoácidos ubicados corriente arriba del poli-aspartato en el PHEX escindible recombinante se pueden seleccionar de acuerdo con parámetros conocidos para proporcionar un sustrato adecuado para enzimas específicas de la vía de secreción (p. ej., furina o peptidasa señal) de la célula hospedadora que se utilizará para escindir los PHEXs escindibles recombinantes producidos en un sPHEX dirigido a huesos secretado. La probabilidad de que una secuencia diseñada sea escindida por la peptidasa 45 señal de la célula hospedadora se puede predecir mediante un algoritmo informático apropiado como el descrito enBendtsen y col. (J Mol Biol. 16 de julio de 2004;340(4):783-95) y que está disponible en la Web en
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ que considera parámetros incluidos los siguientes: los aminoácidos en la posición -3 y -1 del sitio de escisión por la peptidasa señal tienen de forma deseable cadenas laterales pequeñas y no cargadas. Preferentemente, en la posición -1: Ala, Ser, Gly, Cys, Thr y, a veces, Gln, Pro y Leu. De forma similar, 50 aquellos en la posición -3, deben ser preferentemente: Ala, Ser, Gly, Cys, Thr, Ile, Leu, Val. Además, los aminoácidos en la posición -6 y -4 del sitio de escisión son de forma deseable aquellos capaces de inducir la formación de residuos de giro beta (tal como Pro).

Se describen conjugados que comprenden aminoácidos adicionales que se pueden seleccionar basándose en la 55 estrategia de clonación utilizada para producir un PHEX recombinante escindible. Por lo tanto, el PHEX recombinante escindible descrito en los ejemplos 3 y 4 abajo contiene dichos aminoácidos adicionales corriente arriba del poli-aspartato y entre el poli-aspartato y la secuencia de ectodominio natural. Además, se describe un conjugado que comprende la secPHEX descrita en la solicitud copendiente n.°WO 02/15918preparada mediante la fusión del fragmento de extremo N NL-1 que comprende un sitio de furina para el ectodominio natural de PHEX con 60 el vector pCDNA3/RSV/NL-1-PHEX, y un secPHEX que comprende un fragmento de inmunoglobulina en el extremo

N. Más específicamente, la figura 12 presenta esquemáticamente la estructura de secPHEXs que comprenden aminoácidos adicionales corriente arriba del fragmento del ectodominio de 46-749 PHEX natural. Las construcciones n.° 1 a 3 y 5 se pueden fusionar a un poli-aspartato y utilizarse como conjugados.

5 La construcción n.° 4 constituye un conjugado: comprende un poli-aspartato Dio y un fragmento de ectodominio natural.

Los conjugados también abarcan adicionalmente sPHEXs que comprenden eliminaciones en el extremo C que no afectan su actividad enzimática.

10

Además, se describen conjugados donde el poli-aspartato estaría unido en el extremo C del fragmento de ectodominio de PHEX natural.

sALP

15

ALP es una proteína unida a membrana anclada a través de un glicolípido a su extremo C. Este anclaje de glicolípido (GPI) se agrega postraduccionalmente después de la eliminación de un extremo C hidrofóbico que actúa como anclaje de membrana transicional y como una señal para el agregado de GPI. Por lo tanto, el sALP utilizado en el ejemplo 6 en la presente está constituido por un ALP donde el primer aminoácido de la secuencia de extremo 20 C hidrofóbica, a saber, alanina, es reemplazado por un codón de parada. El ALP soluble formado de este modo contiene todos los aminoácidos de la forma natural y, por lo tanto, anclada activa de ALP.

Los conjugados de sALP descritos son cualquier sALP junto con un poli-aspartato seleccionado del grupo que consiste en D10 a D16 fusionado inmediatamente corriente abajo de este fragmento.

25

El conjugado además puede comprender opcionalmente uno o más aminoácidos adicionales 1) corriente arriba del poli-aspartato; y/o 2) entre el poli-aspartato y el fragmento de sALP natural o el equivalente funcional. Este es el caso, por ejemplo, cuando la estrategia de clonación utilizada para producir el conjugado de direccionamiento óseo introduce aminoácidos exógenos en estas ubicaciones. Sin embargo, los aminoácidos exógenos se deben 30 seleccionar de modo que no proporcionen un sitio de transaminación adicional. La probabilidad de que una secuencia diseñada sea escindida por la transaminasa de la célula hospedadora se puede predecir según lo descrito porIkezawa (Biol Pharm. Bull. 2002, 25(4) 409-417).

Los conjugados descritos también abarcan adicionalmente sALPs que comprenden eliminaciones en el extremo N 35 que no afectan su actividad enzimática.

Además, se describen conjugados donde el poli-aspartato estaría unido en el extremo N del fragmento anclado a ALP natural o su fragmento biológicamente activo.

40 El término "proteína recombinante" se utiliza en la presente para hacer referencia a una proteína codificada por un ácido nucleico manipulado genéticamente insertado en una célula hospedadora procariota o eucariota. El ácido nucleico se ubica generalmente dentro de un vector, tal como un plásmido o un virus, según sea adecuado para la célula hospedadora. Aunque E. coli se ha utilizado como un hospedador para expresar los conjugados descritos en los ejemplos presentados en la presente, un experto en la técnica comprenderá que se puede usar una serie de 45 otros hospedadores para producir proteínas recombinantes de acuerdo con los procedimientos que son rutina en la técnica. Se describen procedimientos representativos enManiatis y col. Cold Springs Harbor Laboratory (1989). "Proteína escindible recombinante", según se usa en la presente, se refiere a una proteína recombinante que se puede escindir por una enzima del hospedador para producir una proteína secretada/soluble. I

50 El término "fragmento de ectodominio" significa en la presente, cuando se utiliza con relación a PHEX, el fragmento de PHEX que se ubica fuera de la membrana celular cuando se encuentra en su forma natural.

La expresión "tejido óseo" se utiliza en la presente para referirse a un tejido sintetizado por osteoblastos compuesto por una matriz orgánica que contiene mayoritariamente colágeno y mineralizada por el depósito de cristales de 55 hidroxiapatita.

Las proteínas de fusión comprendidas por los conjugados para administración ósea son útiles para el tratamiento terapéutico de las afecciones de defectos óseos porque proporcionan una cantidad efectiva de la proteína de fusión al hueso. La proteína de fusión se proporciona en forma de una composición farmacéutica en cualquier vehículo 60 farmacéuticamente aceptable estándar, y se administra mediante cualquier procedimiento estándar, por ejemplo,

mediante inyección intravenosa.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente para hacer referencia, cuando se elige la administración parenteral como vía de administración, a disolventes, suspensiones o emulsiones acuosas o no 5 acuosas estériles farmacéuticamente aceptables. Algunos ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, el aceite vegetal, el aceite de pescado y los ésteres orgánicos inyectables. Los disolventes acuosos incluyen agua; soluciones de agua-alcohol; solución salina fisiológica; vehículos parenterales médicos amortiguados que incluyen solución de cloruro de sodio, solución de dextrosa de Ringer, solución de dextrosa más cloruro de sodio, regeneradores de fluidos y nutrientes; regeneradores de electrolitos; solución de Ringer que 10 contiene lactosa o aceites fijos.

El término "cantidad efectiva" se utiliza en la presente para hacer referencia a la cantidad mínima de una composición farmacéutica que se debe administrar a un mamífero para lograr un efecto terapéutico significativo. Las dosificaciones dependerán de muchos factores, incluido el modo de administración. Típicamente, la cantidad de 15 proteína presente dentro de una dosis única será una cantidad que impida, retrase o trate de forma efectiva una afección no deseada relacionada con los huesos sin inducir toxicidad significativa. En particular, una cantidad efectiva del conjugado y las composiciones comprenderá una cantidad de proteína de fusión que provocará un alivio significativo de los síntomas clínicos de la afección.

20 La cantidad efectiva se puede proporcionar por día, por semana, por mes o fracciones de estos. Típicamente, se puede administrar una composición farmacéutica en una cantidad de entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal por día (p. ej., 10 mg, 50 mg, 100 mg o 250 mg). Las dosificaciones se pueden proporcionar en un régimen de dosificación única o múltiple. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cantidad efectiva es una dosis en el intervalo de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 25 gramos del conjugado que se va a dirigir al hueso por día, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 10 gramos del conjugado que se va a dirigir al hueso por día, entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 5 gramos del conjugado que se va a dirigir al hueso por día, aproximadamente 1 gramo del conjugado que se va a dirigir al hueso por día, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 25 gramos del conjugado que se va a dirigir al hueso por semana, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 10 gramos del conjugado que se va 30 a dirigir al hueso por semana, entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 5 gramos del conjugado que se va a dirigir al hueso cada dos días y aproximadamente 1 gramo del conjugado que se va a dirigir al hueso una vez por semana.

Esto es solo una guía, ya que la dosis real debe ser seleccionada cuidadosamente y titulada por el médico tratante 35 basándose en los factores clínicos exclusivos para cada paciente. La dosis diaria óptima será determinada por los procedimientos conocidos en la técnica y se verá afectada por factores tales como la edad del paciente y otros factores clínicamente pertinentes. Además, los pacientes pueden estar tomando medicamentos para otras enfermedades o afecciones. Los otros medicamentos se pueden continuar durante el tiempo que la proteína para administración al hueso se proporcione al paciente, pero es aconsejable, en particular, en dichos casos, comenzar 40 con dosis bajas para determinar si se experimentan efectos secundarios adversos.

La expresión "condiciones de rigurosidad elevada" se refiere a condiciones que permiten secuencias con una homología alta para la unión. Sin limitarse en ese sentido, se enumeran ejemplos de dichas afecciones en el manual "Molecular cloning, a laboratory manual, segunda edición de 1989 de Sambrooky col.: 6XSSC o 6XSSPE, con o sin 45 reactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y la temperatura utilizada para obtener condiciones de rigurosidad elevada suele ser de aproximadamente 68 °C (véanse las páginas 9.47 a 9.55 de Sambrook) para el ácido nucleico de 300 a 1500 nucleótidos. Aunque la temperatura óptima que se va a utilizar para una sonda de ácido nucleico específica se puede calcular empíricamente, y aunque existe la posibilidad de alternativas en las condiciones del amortiguador seleccionadas, dentro de estos intervalos de condiciones muy conocidos, el ácido nucleico captado no variará 50 significativamente. De hecho, Sambrook indica claramente que la "elección depende en gran medida de la preferencia personal" (véase la página 9.47). Sambrook especifica que la fórmula para calcular la temperatura óptima que varía de acuerdo con la fracción de guanina y citosina en la sonda de ácido nucleico y la longitud de la sonda (10 a 20 °C inferior que Tm donde Tm= 81,5 °C + 16,6(log1ü[Na+]) + 0,41(fracción G+C)-0,63 (% de formamida -(600/l)) (véanse las páginas 9,50 y 9,51 de Sambrook).

55

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

En los dibujos adjuntos:

60 La figura 1 presenta el estado de pureza de las proteínas GST y GST-D10 en un gel de poliacrilamida SDS después

de la cromatografía de CL-4B;

La figura 2 muestra la estimulación de la unión de GST al hueso por los motivos peptídicos Da, D10 y D16 a través del porcentaje de la dosis inyectada de GST recombinante que se encuentra asociado con tejidos específicos;

La figura 3 proporciona una representación esquemática del plásmido pCDNA3-RSV- DiosPHEX-vector NEO;

5 La figura 4 presenta un perfil cromatográfico de la detección a 280 nm del flujo de PHEX para SP-Sepharose™ HP (A) y blue-Sepharose HP (B). La línea recta representa la proporción de amortiguador;

La figura 5 presenta un análisis de SDS-PAGE teñido Sypro-ruby™ de las diferentes fracciones recolectadas a

través del procedimiento de purificación de DiosPHEX;

La figura 6 muestra la variación en los niveles de fosfatasa alcalina sérica (ALP) observados en ratones Hyp 10 inyectados diariamente con dosis i.v. de sPHEX y Dio-sPHEX durante 14 días. Los valores U/l representan la disminución observada entre el día - 3 (correspondiente en la gráfica a 0 U/l) y el día 15 del régimen de inyección y son el promedio de las medidas realizadas en 6 animales;

La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN recombinante codificante de una proteína escindible para producir D10-sPHEX (SEQ ID NO: 1);

15 La figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos codificada por D10-sPHEX de la figura 7 (SEQ ID NO: 2);

La figura 9 compara la unión a la fase mineral del hueso de las proteínas (A. GST B. sPHEX) con el de sus

contrapartes fusionadas a deca-aspartato;

La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos de un PHEX natural (o unido a membrana) (SEQ ID NO: 3);

La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de un conjugado de D10-sPHEX producido 20 mediante la escisión de la proteína escindible recombinante de la figura 8;

La figura 12 ilustra esquemáticamente la estructura y las actividades de diversas construcciones de secPHEX;

La figura 13 ilustra gráficamente a través de medición fluorimétrica la actividad de la fosfatasa alcalina en el extracto celular soluble y el medio usado de HEK293 transfectadas transitoriamente con los vectores de expresión codificantes de sALP-D10 y sALP;

25 La figura 14 ilustra gráficamente la detección de sALP y sALP-D10 por análisis de transferencia Western con el anticuerpo B4-78 específico en los medios usados y el extracto celular de HEK-293 después de la transfección transitoria. (Panel A: tinción roja de Ponceau; Panel B: análisis de transferencia a-B4-78). A la izquierda se muestran los tamaños de los marcadores de peso molecular;

La figura 15 muestra gráficamente la unión a la fase mineral ósea de un deca-aspartato fusionado a la fosfatasa 30 alcalina secretada;

La figura 16 muestra A. la secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 5) de una fosfatasa alcalina soluble; y B. la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de esa fosfatasa alcalina soluble;

La figura 17 muestra A. la secuencia nucleotídica (SEQ ID NO: 7): codificante de un conjugado de la presente invención, a saber, sALP-D10; y B. la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de ese conjugado; y 35 La figura 18 muestra gráficamente el efecto de D10-sALP sobre la inhibición de la mineralización mediada por PPi.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Se muestra que los péptidos poli-aspárticos específicos fusionados en marco a una proteína, como se ejemplifica en 40 la presente por la proteína glutatión-S-transferasa (GST), utilizada como una proteína indicadora, por sPHEX y por sALP, pueden aumentar significativamente la capacidad de unión ósea de estas proteínas.

La tabla 1 presenta la secuencia de oligonucleótidos utilizada en los ejemplos 1 a 7.

45 TABLA 1: SECUENCIA DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS UTILIZADOS EN LOS EJEMPLOS 1 A 7

D6: SEQ ID NO:9. 5'-GATCCGATGACGATGACGATGACGC-3'

: SEQ ID NO:10 5'-GGCCGCGTCATCGTCATCGTCATCG-3'

D10: SEQ ID NO:11 5'-GAT C C GAT GAC GAT GAC GAT GAC GAT GAC GAT GAC GC-3'

: SEQ ID NO:12 5'-GGCCGCGT CATCGTCAT OGTCATCGT CATCGT CATCG-3'

D16: SEQ ID NO:13 5'- GAT C C GAT GAC GAT GAC GAT GAC GAT GAC GAT GAC GAT GAC GAT GACGAT GACGC-3'

: SEQ ID NO:14 5'- GGCCGCGTCATCGTCATCGTCATCGTCATCGTCATCQTCAT CQTCATCGTCATCG-3'

hMEPE: SEQ ID NO:15 5'- GATC C GATGACAGTAGTGAGTCATCTGACAGTGGCAGTTCA AGT GAGAGCGAT GGT GACGC-3'

: SEQ ID NO:16 5'-

hStatherin

hMGP

hOsteoponti

n

hBSP2

SEQ ID NO:17

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:19

SEQ ID NO:20

SEQ ID NO:21

SEQ ID NO:22

SEQ ID NO:23

GGCCGCGTCACCATCGCT CT CACTT GAACT GCCACTGT CAG

ATGACTCACTACTGTCATCG-3'_________________________

5'-

GATCCGATTCATCTGAAGAGAAATTTTTGCGTAGAATTGGAA

GATTCGGTGC-3'_____________________________________

5'-

GGCCGCACCGAATCTTCCAATTCTACGCAAAAATTTCTCTTC

AGAT GAATCG-3'_____________________________________

5'-

GATCCTGTTATGAATCACATGAAAGCATGGAATCTTATGAAC

TTAATCCCTTCATTGC-3'_______________________________

5-

GGCCGCAATGAAGGGATTAAGTTCATAAGATTCCATGCTTT

CATGT GATT CATAACAG-3,_____________________________

S'-

GATCCCAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAAACCAATGACTTTA

AAGC-3'_____________________________________________

5'-

GGCCGCTTTAAAGTCATTGGTTTCTTCAGAGGACACAGCAT

TCTGG-3'

ff- ' .

gatccggcagtagtgactcatocgaagaaaatggagatgacagttcagaagaggaggagga/

3'

SEQ ID NO:24

hIGFBP5

M81736

CBS

SEQ ID NO:25

SEQ ID NO:26

SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:28

ff-GGCCGCTTCCTCCTCCTCTTCTGAACTGTCATCTCCATTTTCTTCGGATGAGTCACTACTGC

3|____________________'_______________________________________________________

5'-

GATCCCGCAAAGGATTCTACAAGAGAAAGCAGTGCAAACCT

TCCCGT GGGCCGCAAGCGT GC-3'______________________

5'-

GGCCGCACGCTTGCGGCCACGGGAAGGTTTGCACTGCTTT

CTCTTGTAGAATCCTTTGCGG-3'________________________

5'-AGTCGGGATCCGGAACAAGCAGCGTGTTCTAC-3'_______

5'-AGATCGCGGCCGCTCAATTGTGCACGGTGTGATTAAAGG-

D

10

______________31________________________________________________

SEQ ID NO:29 5'-CCGGAGAT GACGAT GACGAT GACGAT GACGAT GACT-3' SEQ ID NO:30 3'-TCTACTGCTACTGCTACTGCTACTGCTACTGAGGCC-5'

EJEMPLO 1

Unión ósea de GST-Ü6, GST-D10 y GST-D16

5

Se utilizó tecnología de ADN recombinante para generar un plásmido que contiene un ácido nucleico codificante de GST seguido en marco por un ácido nucleico codificante de un péptido ácido D6, D10 o D16. Para obtener los conjugados de GST-D6, GST-D10 y GST-D16, el oligonucleótido de SEQ ID NO:9 (véase la tabla 1) se mezcló en primer lugar con el oligonucleótido de SEQ ID NQ:10, el oligonucleótido de SEQ ID NO:11 mezclado con el 10 oligonucleótido de SEQ ID NO:12, y el oligonucleótido de SEQ ID NO:13 mezclado con el oligonucleótido de SEQ ID NO:14. Este procedimiento generó oligonucleótidos dúplex codificantes para D6, D10 y D16, respectivamente, y que tienen extremidades compatibles con la clonación en el plásmido pGEX3T-4 (Pharmacia biotechnology) predigerido con las endonucleasas de restricción BamHI y NotI. Se transformaron los vectores pGEX3T-4 en proteasa AP401 menos la cepa de bacterias E. coli (/on::mini tetRara-Alac-pro nalA argEam rifRthiI [F'pro AB laclq Z M15]).

15

Se utilizaron colonias bacterianas positivas para sembrar un precultivo de 10 ml de medios YT dobles y 100 mg/litro de ampicilina. Se cultivaron las bacterias durante la noche a 37 °C en un agitador orbital a 250 rpm. Se agregó el precultivo a 500 ml de medio de ampicilina YT doble nuevo en un matraz de 2 litros Erlenmeyer. Se dejó crecer a las bacterias a 37 °C bajo agitación orbital hasta alcanzar una densidad óptica a 595 nm de 0,7. Después, se indujo la 20 expresión de proteínas mediante el agregado de 500 pl de solución de IPTG 0,1 M y se volvieron a colocar en incubación las bacterias durante 2 horas. Se centrifugaron las bacterias a 8000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Se suspendió el sedimento en 25 ml de PBS helado que contenía inhibidor de proteasa en cápsulas de EDTA completo (Boehringer Mannheim) y se congeló a -20 °C.

Se descongelaron las células bacterianas y se alteraron en hielo con 6 pulsos de sonicación cada 50 segundos antes de la centrifugación a 12000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Se mezcló el sobrenadante con 500 pl de resina húmeda GS-4B (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con PBS. Se mantuvo la resina como una suspensión 5 durante la incubación durante la noche a 4 °C. Se enjuagó la resina con PBS hasta que la densidad óptica a 280 nm fue inferior a 0,01. Después, se colocó la resina en una columna vacía y se eluyeron las proteínas con glutatión 10 mM disuelto en PBS. Se dializaron las fracciones eluidas agrupadas contra PO4 de sodio 1 mM a pH 7,4 y NaCl 150 mM. Se filtraron las proteínas dializadas en un entorno estéril en una membrana PES de 0,22 pm y se mantuvieron a 4 °C. Se recuperaron típicamente 40 y 60 mg de proteínas puras por litro de cultivo respectivamente. La figura 1 10 muestra un ejemplo de un análisis SDS-PAGE del GST purificado y GST-D10. Se yodaron las proteínas purificadas utilizando el reactivo de yodación perlas de yodo (Pierce).

Se dializaron GST y GST fusionado a péptidos contra PBS y se fijó la concentración a 2 mg/ml. Se inició la reacción de yodación agregando 2 perlas de yodo enjuagadas con PBS a 2 mCi de Na125I (100pCi/pl, ICN) disuelto en 500 15 pl de PBS. Se incubaron las perlas a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de agregar 1 mg de proteína dializada. La reacción de yodación avanzó durante 15 minutos antes de que se eliminara la perla y se enjuagara en 500 ml de PBS. A los 1,5 ml finales de solución de proteína yodada, se agregaron 15 pl de Nal 6 mM para diluir la radiactividad no específica. Después, se desaló la mezcla utilizando columnas de filtración en gel de PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibradas con PBS. Se eluyeron las proteínas en el volumen vacío. Se 20 concentraron y se dializaron contra el amortiguador in vivo (PO4 de sodio 1 mM a pH 7,4 y NaCl 150 mM) utilizando cartuchos Centriprep-YM10™ (Amicon). Se midió la radiactividad utilizando un contador de radiación gamma, se evaluó la concentración de proteínas mediante el ensayo Bradford y se reveló la unión química de 125I a las proteínas mediante autorradiografía de SDS-PAGE seco. Se mantuvieron las muestras yodadas a 4 °C.

25 Capacidad de unión ósea de las proteínas de fusión de los péptidos GST-poli-aspárticos comparada con la de GST sola

Se inyectaron las proteínas de fusión a GST yodadas en ratones con anestesia de isoflurano como un bolo intravenoso a través de la vena subclavia. Se inyectó una dosis de 1 mg de proteína yodada/por kg de peso 30 corporal. Se estableció el volumen de dosis máximo en 10 ml/kg. La duración del tratamiento fue de sesenta minutos. Diez y sesenta minutos después de la inyección, se tomaron muestras de sangre (0,1 a 0,2 ml) a través de la vena subclavia con anestesia en tubos activadores de la coagulación de suero/gel Microvette™ (Sarstedt, #20.1291). En la necropsia, se tomaron muestras de sangre y se sacrificaron los animales mediante desangrado del corazón con anestesia de isoflurano. Se recogieron los órganos (riñones, hígado, fémures, tibias y tiroides), se 35 enjuagaron en solución salina al 0,9 % USP, se secaron en gasa y se transfirieron a tubos contadores de gamma. Se pesaron las muestras de suero y los órganos y se midió la radiactividad. Se expresaron los resultados como porcentaje de la dosis inyectada. Ni D10-GST, ni D16-GST promovieron la unión a otros órganos diferentes del hueso. Esto mostró la especificidad de estos conjugados con respecto al hueso (no se muestran los datos).

40 La figura 2 muestra que la proteína de fusión a GST-D6 no se unió más a la tibia o el fémur que GST sola. En cambio, los motivos peptídicos de D10 y D^promovieron la unión de GST a los huesos.

El hecho de que D6, un péptido que se ha demostrado que administra con éxito moléculas pequeñas al hueso, no pueda administrar con éxito una proteína, a saber, GST, al hueso demuestra que no se puede predecir si un péptido 45 ácido específico que se sabe que administra con eficacia una molécula pequeña al hueso también resultará efectivo para administrar una proteína al hueso.

EJEMPLO 2

50 Capacidad de unión de GST fusionada con diversos péptidos

La fosfoglicoproteína extracelular de matriz humana (hMEPE) es una proteína sintetizada por osteoblastos que muestra similitudes importantes con un grupo de fósforo-glicoproteínas de la matriz mineral de huesos y dientes, proteínas que se sabe que se unen naturalmente a la matriz ósea (8). Cabe señalar que hMEPE presenta en su 55 extremo carboxi una secuencia de 18 residuos de aminoácidos (DDSSESSDSGSSSESDGD) (sEq ID NO: 31) similar a los péptidos ácidos que se encuentran en la fosforina de dentina y la sialofosfoproteína de dentina, que se sabe que se unen a la matriz ósea (8).

La estaterina humana (hStatherin) es una proteína sintetizada por las glándulas salivales, que de modo similar a la 60 histatina modula directamente la nucleación y/o el crecimiento de la hidroxiapatita. Cabe señalar que la hStatherin

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

presenta una secuencia de 15 residuos de aminoácidos en las posiciones 20 a 34 (DSSEEKFLRRIGRFG) (SEQ ID NO: 32) que se ha demostrado que se unen estrechamente a la hidroxiapatita (9).

La proteína Gla de la matriz humana (hMGP) es una proteína sintetizada por células musculares lisas vasculares y condrocitos que funciona como inhibidor de la polimerización de hidroxiapatita al unirse a núcleos cristalinos. Cabe señalar que hMGP presenta en su extremo amino una secuencia de 17 residuos de aminoácidos en las posiciones 19 a 35 del marco de lectura abierto (CYESHESMESYELNPFI) (SEQ ID NO: 33) similar a los péptidos de ácido carboxiglutámicos gamma fosforilados que se encuentran en la osteocalcina que se sabe que se unen a la matriz ósea, y se cree que promueve la unión a la matriz ósea (10).

La osteopontina humana (hOPN) es una proteína sintetizada por osteoblastos que regula el crecimiento de cristales de hidroxiapatita. Esta proteína pertenece a la familia de sialofosfoproteína ósea. Cabe señalar que hOPN presenta una secuencia de 13 residuos de aminoácidos (QNAVSSEETNDfK) (SEQ ID NO: 34) en las posiciones 58 a 70 del marco de lectura abierto. Esta secuencia muestra un nivel alto de homología entre las especies de mamíferos. La predicción de la estructura secundaria hace que esta secuencia sea adecuada para la exposición a disolventes y se demostró que esta secuencia está fosforilada en sus residuos de serina. Se cree que esta última característica afecta la unión a la matriz ósea (11).

La sialoproteína ósea humana II (hBSP2) es una proteína sintetizada por osteoblastos que muestra similitudes importantes con un grupo de fósforo-glicoproteínas de la matriz mineral de huesos y dientes, proteínas que se sabe que se unen naturalmente a la matriz ósea. Cabe señalar que hBSPII presenta en su extremo amino una secuencia de 18 residuos de aminoácidos en las posiciones 62 a 79 del marco de lectura abierto (GSSDSSEENGDDSSEEEE) (SEQ ID NO: 35) similar a los péptidos ácidos que se encuentran en la fosforina de dentina y MEPE, y se cree que promueve la unión a la matriz ósea (8).

La proteína de unión del factor de crecimiento similar a la insulina humano-5 (hIGFBP5) es sintetizada por osteoblastos. Esta proteína, de forma similar a las proteínas de la familia IGFBP, se cree que regula la función de los osteoblastos en el proceso de remodelación ósea. Cabe señalar que la hIGFBP5 presenta una secuencia de 18 residuos de aminoácidos en las posiciones 221 a 238 del marco de lectura abierto (RKGFYKRKQCKPSRGRKR) (SEQ ID NO: 36) que se ha demostrado que se unen estrechamente a la hidroxiapatita (12).

La adhesina de colágeno de staphylococcus aureus (M81736) es una proteína expresada en la superficie de S.aureus que promueve la unión de las bacterias a la matriz de colágeno del hueso de mamíferos y tejidos cartilaginosos. Se informó que dicha unión era fundamental para el desarrollo de patogénesis como la osteomielitis y la artritis infecciosa. Cabe señalar que se informó que el dominio de unión a colágeno (CBS) de esta adhesina abarca 151 residuos de aminoácidos (G168 a N318) del marco de lectura abierto de la proteína (13, 14). La secuencia primaria de aminoácidos es la siguiente:

GTSSVFYYKTGDMLPEDTTHVRWFLNINNEKSYVSKDITI KDQIQGGQQLDLSTLNINVTGTHSNYYSGQSAITDFEKAFPGSKITVDNTKNTI DVTIPQGYGSYNSFSINYKTKITNEQQKEFVNNSQAWYQEHGKEEVNGKSFN H7VHN. (SEQ ID NO: 37)

se construyeron plásmidos que contenían las secuencias de péptidos ácidos derivados de hMEPE, hStatherin, hMGP, hOPN, hBSP2, hIGFBP5 y CBS después de GST en marco para determinar si podían promover el direccionamiento óseo de una proteína recombinante. Se utilizó tecnología de ADN recombinante tal como se describe en el ejemplo 1 para generar plásmidos para péptidos derivados de hMEPE, hStatherin, hMGP, hOPN, hBSP2 y hIGFBP5. Los pares de oligonucleótidos identificados en la tabla 1 para cada uno de estos péptidos se mezclaron para obtener la proteína de fusión de GST-péptido ácido correspondiente. Este procedimiento generó oligonucleótidos dúplex codificantes para estos péptidos ácidos y que tienen extremidades compatibles con la clonación en el plásmido pGEX3T-4 (Pharmacia biotechnology) predigeridos con las endonucleasas de restricción BamHI y Notl.

Se construyó un plásmido que contenía CBS del siguiente modo. Se obtuvo un gen sintético correspondiente a la secuencia de la CBS a partir de Bio S&T (Montreal) y se insertó en el plásmido pLIV Select. Los oligonucleótidos de SEQ ID NO: 27 y 28 se utilizaron como cebadores en las reacciones de PCR con el plásmido pLIV Select que

contenía el gen CBS para ampliar las secuencias específicas de CBS. Se transformaron los vectores pGEX-4T-3 en proteasa AP401 menos la cepa de bacterias E. coli (/on::mini tetRara- Alac-pro nalA argEamrifRthiI [F'pro AB laclq Z M15]).

5 Se realizaron la producción y la purificación de proteínas y la farmacodistribución de la proteína de fusión yodada como se describe en el ejemplo 1.

Ninguno de estos péptidos ácidos de GST se unió a los huesos (no se muestra el resultado).

10 El hecho de que el péptido derivado de la estaterina, un péptido que se ha demostrado que administra con éxito una pequeña parte de osteopontina al hueso, no pueda administrar con éxito la proteína GST al hueso demuestra que no se puede predecir si un péptido ácido específico que se sabe que administra con eficacia un péptido pequeño al hueso también resultará efectivo para administrar una proteína al hueso.

15 EJEMPLO 3

Dio aumenta la capacidad de sPHEX de corregir los niveles de fosfatasa alcalina en los ratones

PHEX es una metalopeptidasa que se cree ampliamente que controla el nivel de los factores peptídicos óseos que 20 participan en la regulación de la mineralización y la homeostasis de fosfato renal. PHEX se expresa en la superficie de los osteoblastos y los osteocitos que están en contacto o incrustados en la matriz ósea. Este ejemplo proporciona datos sobre el diseño, la producción y la purificación de una forma extendida de sPHEX que contiene en su extremo N una secuencia de 10 residuos de ácido aspártico diseñada para anclarse a la matriz ósea.

25 Vector de expresión de D^sPHEX

Se insertó un sitio de restricción de endonucleasa de BspEI mediante mutagénesis dirigida al sitio (QuickChange, Stratagene) en el vector pCDNA3-RSV-sPHEX-NEO (Boileau G. y col., Biochem. J. (2001) 355, 707-13) utilizando los siguientes cebadores de oligonucleótidos:

30

5’-

CAGTCAAGGTCTCTTATCCGGAAGTCTCCAAGCTAAACAGG-3’ (SEQ ID NO: 38)

y 5'-CTGTTTAGCTTGGAGACTTCCGGATAAGAGACCTTGACTGG-3' (SEQ ID NO: 39).

35 Se insertó la secuencia del hexámero BspEI (subrayada) en marco con y corriente arriba de la secuencia de ADN de sPHEX. Esta construcción codifica una proteína recombinante que se puede escindir entre la leucina y la serina en las posiciones 41 y 42, respectivamente en la figura 8. Por lo tanto, está constituida por dos aminoácidos exógenos, seguidos corriente abajo por un deca-aspartato, que a su vez está seguido por dos aminoácidos exógenos adicionales. Estos 4 aminoácidos exógenos derivan de la estrategia de clonación utilizada para producir el 40 conjugado. Se demostró que estos aminoácidos exógenos no anulan la actividad enzimática del conjugado (véase la figura 12 que muestra la actividad específica de esta construcción), pero se puede prescindir de ellos. Corriente abajo de estos aminoácidos exógenos hay un fragmento de ectodominio de PHEX natural que comienza, por lo tanto, con la serina en la posición 46 de la secuencia presentada en la figura 10. Se escindió el vector pCDNA3- RSV-NEO modificado con BspEI y después se digirió con fosfatasa alcalina para eliminar los grupos fosfato 5'. Un 45 dúplex de oligonucleótido codificante para deca-aspartato: [5'-

CCGGAGATGACGATGACGATGACGATGACGATGACT-3' (SEQ ID NO: 29) y 3'-

TCTACTGCTACTGCTACTGCTACTGCTACTGAGGCC-5' (SEQ ID NO: 30)] se fosforiló en primer lugar en sus extremos 5' con la polinucleótido cinasa T4 y se ligó al vector digerido BspEI. Esto proporcionó el vector pCDNA3- RSV-D10sPHEX-NEO (figure 3). Este vector comprendía la secuencia presentada en la figura 7, que codifica el 50 PHEX escindible recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 8.

Expresión de D^sPHEX recombinante

Para inducir la expresión estable de la proteína D^sPHEX, se transfectó el vector pCDNA3-RSV-D10sPHEX-NEO 55 en las células LLC-PK1 (células de riñón porcino; ATCC n.° CRL-1392) utilizando el kit de transfección de liposoma

Lipofectamine-Plus™ (Invitrogen). Se seleccionaron las células transfectadas mediante el agregado de 400 pg/ml G- 418 (Life Technologies) al medio. Se seleccionaron clones de células resistentes a G-418 para la expresión de DiosPHEX utilizando el ensayo enzimático fluorescente PHEX [Campos M. y col. Biochem. J. (2003) 373, 271-9]. Se calculó el peso molecular aparente de la proteína recuperada en el medio usado mediante inmunotransferencia 5 utilizando un anticuerpo monoclonal elevado contra un fragmento de PHEX humano recombinante (K121-E294) como se describió anteriormente (Ruchon AF y col. J. Bone Miner. Res. (2000) 15, 1440-1450). Se utilizó un clon resistente a G-418 que expresa 1 a 2 mg de D10sPHEX por litro para la producción de proteína. Se sembraron las células en Cellstack-10™ (Coming) a una densidad de 7 X 107 en 1,75 litros de medio (199 medio, FBS al 6 %, piruvato de Na 1 mM, penicilina 1x105U/litro, estreptomicina 100 mg/litro y G-418 al 1 %. Se aumentó la expresión de 10 D10sPHEX mediante incubación de las células en 1,75 litros de DMEM + butirato de sodio 10 mM durante cuatro días a 37 °C y CO2 al 5 % antes de la recolección del medio usado.

Purificación y caracterización

15 Se centrifugó el sobrenadante celular a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C y se filtró en fibra de vidrio (Fisher, APFC09050) y se concentró 10 a 40 veces utilizando un dispositivo de filtración de flujo tangencial Ultrasette™ 30 (Pall Canada). El pH de la solución se llevó a 5,6 con ácido acético 1 M antes de una diálisis durante la noche a 4 °C contra acetato de sodio 50 mM, NaCl 100 mM pH 5,6 (amortiguador SP). Se cargó el sobrenadante dializado a una velocidad de flujo de 4 ml/min, en una columna de intercambio catiónico de SulfoPropyl-Sepharose de 20 ml 20 (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada anteriormente con amortiguador SP. Se lavó la columna con el mismo amortiguador a la misma velocidad de flujo hasta que se alcanzó la referencia de absorbancia de 280 nm. Después, se eluyó la mayoría de las proteínas contaminantes con una etapa de NaCl 226 mM en el amortiguador SP. Después, se eluyó D^sPHEX con una etapa de NaCl 280 mM (figura 4A). Se analizaron las fracciones mediante SDS-PAGE y con el ensayo de la actividad enzimática PHEX. Se agruparon las fracciones que contenían sPHEX y 25 se dializaron ampliamente contra MOPS 20 mM pH 7, NaCl 250 mM antes de cargarse en una columna Blue- Sepharose™ HP de 5 ml (Amersham Pharmacia) a 5 ml/min. Se enjuagó la columna a la misma velocidad de flujo con el mismo amortiguador y se recuperó la mayoría de la proteína D^sPHEX mediante el aumento de la concentración de NaCl en etapas hasta 350 mM (figura 4B). La pureza de la fracción final fue mayor que el 95 %. Alternativamente, la Blue-Sepharose™ se pudo reemplazar por Heparin-Sepharose™ (Amersham Pharmacia) en la 30 cual D10sPHEX se une estrechamente en un intervalo de pH (5 a 8). Se eluyó D10sPHEX mediante el uso de gradiente de NaCl. Se determinó la pureza como mayor que el 90 %. Se concentró D^sPHEX y se dializó contra PO4 de sodio 1 mM pH 7,4, NaCl 150 mM utilizando cartuchos Centriprep-50™. Se filtró la muestra dializada en un entorno estéril en una membrana de 0,22 pm. Se demostró que D^sPHEX purificado permanece estable durante meses a 4 °C. Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante el procedimiento de Bradford. (Kit de 35 ensayo de proteína DC; Biorad) con albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. Se evaluó la pureza de la proteína mediante tinción con Sypro-Ruby™ (Molecular Probes) de las proteínas resueltas en SDS-PAGE 4-12 % (figura 3). Se determinó la actividad enzimática de D^sPHEX utilizando el sustrato fluorigénico.

Efecto de las inyecciones de sPHEX y Dm-sPHEX sobre los niveles en circulación de fosfatasa alcalina en 40 ratones Hyp

Los ratones Hyp ligados a X albergan una eliminación amplia en la región 3' del gen PHEX y es el homólogo murino de la hipofosfatemia ligada a X humana (XLH). Por lo tanto, estos ratones representan un modelo útil para estudiar la fisiopatología de la XLH, así como para probar la eficacia de los agentes terapéuticos en estudios preclínicos.

45

Por lo tanto, se investigó el posible efecto terapéutico de D^sPHEX y sPHEX con inyección intravenosa de bolo a ratones Hyp/Y durante un período de 2 semanas.

Se dializaron D^sPHEX y sPHEX contra el vehículo y se filtraron las soluciones a través de un filtro de proteína de 50 unión baja de 0,22 pm. Se dividieron en alícuotas las soluciones y se analizaron nuevamente para detectar la actividad enzimática y la concentración mediante ensayo enzimático fluorogénico y el procedimiento de Bradford, respectivamente.

Se anestesió a cada ratón con isoflurano vaporizado (2 %) y D^sPHEX, o se inyectó sPHEX como un bolo 55 intravenoso a través de la vena subclavia. La dosis fue 5 mg/kg de peso corporal para cada grupo. Se trataron los animales una vez al día durante 14 días consecutivos. Se recogieron las muestras de sangre (0,1-0,2 ml) a través de la vena subclavia con anestesia en los días del estudio - 3 y +15 (antes de la necropsia, 24 horas después de la última inyección). Se evaluaron los niveles totales de fosfatasa alcalina (ALP) en suero diluido (30 pl de muestra de suero con 90 pl de solución salina al 0,9 % USP). Aunque las dosificaciones adecuadas para los pacientes humanos 60 no son proporcionales a las utilizadas en los ratones, estas dosificaciones predicen los intervalos de dosificaciones

que pueden ser adecuados en los seres humanos utilizando las tablas publicadas.

Tal como se observa en la figura 6, la forma extendida de D10 de sPHEX indujo una mayor disminución en los niveles de fosfatasa alcalina que la forma de sPHEX normal.

5

EJEMPLO 4

La fusión de Dio a GST recombinante aumenta su unión a la fase mineral del hueso in vitro 10 Marcado con fluoresceína de proteínas purificadas

Se marcaron proteínas purificadas recombinantes con isotiocianato de fluoresceína (FITC, Molecular Probes F143). Se realizó la reacción mediante el agregado de proteínas a fosfato de sodio 10 mM, amortiguador de NaCl 50 mM pH 7 a una concentración de proteína final de 1 mg/ml. La reacción de marcado inició mediante el agregado de FITC 15 disuelto en DMSO en una concentración de 20 mg/ml para alcanzar una proporción molar de 20:1 con respecto a la concentración de proteína. Se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante una hora. Se separó la proteína marcada de la fluoresceína libre en una columna PD-10™ (Pharmacia) antes de la diálisis en el amortiguador de unión (fosfato de sodio 1 mM NaCl 150 mM, pH 7,4).

20 Preparación de la fase mineral de los huesos

Se diseccionaron huesos largos de una rata y se trituraron hasta convertirlos en polvo en un mortero enfriado con nitrógeno líquido. El polvo se mantuvo a -80 °C o se utilizó directamente. Se lavó una alícuota del polvo (300 mg) 3 veces con 8 ml de PBS y se le agregaron 8 ml de HCl 1 M. Se mantuvo la mezcla en suspensión en un mezclador 25 giratorio durante 1 hora a temperatura ambiente. Se centrifugó la fracción insoluble y se recogió el sobrenadante ácido claro. Esta solución ácida permaneció estable a temperatura ambiente durante al menos dos semanas.

Reacción de unión

30 Se mezclaron alícuotas de 20 pl de extracto óseo ácido con 2 pl de NaOH 10 M y se sedimentó el precipitado a 10.000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se enjuagó el sedimento dos veces mediante resuspensión en 100 pl de amortiguador de unión. Después, se mezcló el extracto óseo con 100 pl de una solución que contenía 5 a 45 pg de proteína marcada con fluoresceína en el amortiguador de unión al cual se le agregó fosfato para alcanzar una concentración final de 80 mM. Se incubaron las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente en la 35 rueda giratoria para mantener la fase mineral en suspensión. Después, se centrifugaron las muestras durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se disolvió el sedimento que contenía la proteína unida en 200 pl de EDTA 0,5 M pH 8. Para calcular la cantidad de proteína libre presente, se agregaron 100 pl de EDTA 0,5 M pH 8 al sobrenadante. Se midió la fluorescencia de las diferentes muestras en un lector de placas de 96 pocillos configurado a 494 nm para la excitación y a 516 nm para la emisión.

40

Resultados

Se utilizaron las muestras que contenían 50 pg de GST y GST-D10 marcados con fluoresceína en el ensayo de unión descrito arriba. La figura 9A muestra que la fusión de la secuencia de D10 a GST provocó un aumento de 6 45 veces en la unión a la fase mineral del hueso.

EJEMPLO 5

La fusión de D10 a sPHEX aumenta su unión al hueso

50

Utilizando un procedimiento análogo al descrito en el ejemplo 4 arriba, se utilizaron muestras que contenían 50 pg de sPHEX y D 10sPHEX marcados con fluoresceína en un ensayo de unión. La figura 9B muestra que la fusión de la secuencia de D10 a sPHEX provocó un aumento de 4,3 en la unión a la fase mineral del hueso.

55 En cambio, D6-sPHEX se construyó y se evaluó después de la inyección in vivo en animales (como se describe en el ejemplo 1 arriba) y no promovió la unión de las proteínas recombinantes al hueso (no se muestran los datos).

EJEMPLO 6

60 La fusión de D10 a una forma soluble de fosfatasa alcalina aumenta su direccionamiento a la fase mineral del

hueso

Construcción de vectores de expresión codificantes de fosfatasa alcalina soluble recombinante humana, sALP y sALP-Dm

Se obtuvo ADNc de longitud completa humano codificante de fosfatasa alcalina no específica de tejido (ALP) de ARN poliA de médula ósea (Clonetech) mediante RT-PCR. En resumen, se transcribieron de forma inversa 20 ng de poliA con SuperscriptII™ y un oligo dT12-18 utilizando el First Strand Synthesis System (Invitrogen). Se utilizó directamente una alícuota que representa 1/20 de la etapa de RT en una reacción de PCR con oligos específicos de 10 ALP (5'-gataaagcaggtcttggggtgcacc-3' directo (SEQ ID NO: *); 5'-gttggcatctgtcacgggcttgtgg-3' inverso (SEQ ID NO: *)) y el Expand High Fidelity Enzyme Kit™ (Roche). Se separó el producto específico de ALP resultante (1644. bp) y se purificó a partir de un gel de agarosa (1 %) utilizando el Qiaquick Gel Extraction Kit™ (QIAGEN). El ADNc de AlP después se ligó en el vector pCR4-blunt-TOPO™ (Invitrogen), se transformó en bacterias Top10™ (Invitrogen) y un clon positivo identificado por PCR de colonia. Se verificó la identidad de ADNc mediante secuenciación de ADN 15 automática.

Se construyeron formas secretadas de ALP (sALP) con eliminación de la señal de anclaje de GPI mediante PCR utilizando el kit Expand High Fidelity Enzyme Kit™. Comprendían los residuos 1-502, seguidos de un codón de parada (sALP) o un motivo de direccionamiento de deca aspartato y un codón de parada (sALP-D10). En ambos 20 casos, el cebador directo (5-tggafccaccatgatttcaccattcttagtac-3' (SEQ ID NO: 40)) cubrió el iniciador metionina (subrayado) e incluyó un sitio BamHI (en cursiva). Los cebadores inversos (sALP: 5'- tfcfagactacgagctqgcaqgagcacagtggccg-3' (SEQ ID NO: 41); sALP-D1ü5'-

tfcfagactagtcgtcatcatcgtcatcatcgtcgtcatccgagctggcaggagcacagtggccg-3' (SEQ ID NO: 42)) contenían un codón de parada (subrayado) y un sitio XbaI (en cursiva). Los productos de PCR fueron digeridos con BamHI y XbaI y se 25 clonaron en pCDNA3.1-RSV que se había predigerido con las mismas enzimas. Se secuenció el ADN de plásmido.

Ensayo enzimático fluorescente de ALP

Se evaluó la actividad enzimática de sALP y sALP-D10 utilizando 4-metilumbeliferil fosfato (MUP, Molecular Probes, 30 M8425) como sustrato fluorigénico de acuerdo conGee KR y col. (Anal. Biochem. 273, 41-48 (1999)) Típicamente, se realizó el ensayo a 37 °C en placas de 96 pocillos en un volumen final de 200 pl con 10 pM de MUP. Se registraron las lecturas utilizando un lector de placas Spectramax Gemini™ (Molecular Devices) en cada minuto durante 30 minutos a 450 nm tras excitación a 360 nm. El límite de longitud de onda de emisión se fijó en 435 nm. Se calculó la tasa de velocidad inicial de la ALP mediante un ajuste de regresión lineal (con r2 igual o mayor que 0,98).

35

Expresión de proteínas sALP y sALP-Dm recombinantes

Para determinar si se secretaron las proteínas sALP y sALP-D10 recombinantes, se transfectó transitoriamente cada construcción (pCDNA3-RSV-sALP-NEO y pCDNA3-RSV-sALP-D10-NEO) en células HEK-293S (células de riñón 40 embrionarias humanas; ATCC n.° CRL-1392) utilizando el kit Lipofectamine-Plus liposome transfection kit™ (Invitrogen). Las células HEK-293S también se transfectaron de forma simulada como control negativo. El día después de la transfección, se incubaron las células durante 24 h en DMEM sin suero. Se recogieron los medios acondicionados y se centrifugaron a 14000 RPM durante 5 min a 4 °C para eliminar las células muertas y los desechos. Se evaluaron los sobrenadantes en cuanto a la actividad enzimática y la expresión de sALP o sALP-D10 45 utilizando el ensayo enzimático fluorescente de ALP y análisis de transferencia Western respectivamente. Para el análisis de transferencia Western, se precipitó el medio usado durante 1 h sobre hielo con ácido tricloroacético (concentración final de 10 % (v/v)). Se centrifugaron las proteínas precipitadas a 14000 RPM durante 20 min a 4 °C, se lavaron una vez con acetona fría, se secaron y se resuspendieron en 60 pl 1X de amortiguador de muestra Laemmli con DTT y se hirvieron durante 5 min.

50

Para evaluar el contenido intracelular de sALP y sALP-D10, se lavaron las células 3 veces con PBS y se lisaron con 200 pl de Tris-HCl 50 mM (pH 8) que contenía NaCl 150 mM y NP-40 al 1 % sobre hielo durante 20 min. Se centrifugaron los lisados y se evaluó el sobrenadante en cuanto a la actividad enzimática y la expresión de sALP o sALP-D 10 utilizando el ensayo enzimático fluorescente de ALP y análisis de transferencia Western respectivamente. 55 Para el análisis de transferencia Western, se mezclaron alícuotas de 50 pl con 10 pl 6X de amortiguador de muestra Laemmli con DTT y se hirvieron durante 5 min.

Se cargaron las muestras en un gel de Tris-glicina poliacrilamida al 4-12 % Novex precast™ (Invitrogen) y se transfirieron a nitrocelulosa de 0,45 pm (Protran, Schleicher&Schuell, Keene, NH) con Tris-glicina que contenía 60 metanol al 10 %. Se tiñó la membrana con rojo Ponceau y se bloqueó durante 1 h a temperatura ambiente con PBS

que contenía Tween 20™ al 0,05 % (PBST) y leche deshidratada 5 %. Después, se incubó la membrana secuencialmente a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-hBAP (mAb 4B-78, Developmental Studies Hybridoma Bank) (1:1000 en PBST con leche deshidratada al 5 %) y una IgG de conejo anti-ratón acoplada con peroxidasa de rábano picante (Sigma) (1:12000 en PBST con leche deshidratada al 5 %). Se desarrolló la señal con 5 Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus™ (PerkinElmer).

La actividad enzimática de ALP medida en los medios acondicionados de HEK293 después de la transfección transitoria fue muy alta y de magnitud similar para pCDNA3-RSV-sALP-NEO (sALP) y pCDNA3-RSV-sALP-D10-NEO (sALP-D 10) (figura 13). Esta actividad fue específica del ADN del plásmido transfectado, ya que no se podía detectar 10 en las células con transfección simulada (simulación). La actividad relativa medida en los medios fue 35 veces mayor que la medida en los extractos celulares, lo que demuestra la naturaleza secretora de sALP y sALP-D10. En consecuencia, para sALP y sALP-D10, la inmunotransferencia utilizando un anticuerpo monoclonal elevado contra fosfatasa alcalina humana no específica de tejido recombinante (mAb 4B-78, Developmental Studies Hybridoma Bank) reveló una señal mucho más fuerte en los medios acondicionados que en los extractos celulares (figura 14B, 15 comparar los carriles 2, 3 frente a 5, 6). No se visualizó ninguna señal en las muestras transfectadas de forma simulada (figura 14B, carriles 4 y 7). La señal que aparece en las células con transfección simulada consiste en la traza de BSA. El peso molecular aparente de la proteína detectada se calculó en 70 kDa en los extractos celulares (flecha) y ligeramente superior en los medios acondicionados (punta de flecha). Se realizó una tinción con rojo Ponceau de la membrana para monitorizar la carga uniforme de las muestras (figura 14A).

20

Generación de células HEK293 que segregan constitutivamente sALP y sALP-Dm

Para inducir la expresión estable de las proteínas sALP y sALP-D10, se transfectaron los vectores pCDNA3-RSV- sALP-NEO y pCDNA3-RSV-sALP-D10-NEO por separado en células HEK-293S utilizando el kit Lipofectamine-Plus 25 liposome transfection kit™ (Invitrogen). Se seleccionaron las células transfectadas mediante el agregado de 800 pg/ml G418 (Life Technologies) al medio. Para cada transfección, se analizó un grupo de células resistentes a G-418 para la expresión de sALP o sALP-D10 en el medio de cultivo usado utilizando el ensayo enzimático fluorescente de ALP. Los medios acondicionados recogidos de las líneas celulares estables se utilizaron para el estudio del ensayo de unión en el mineral óseo.

30

Unión a la fase mineral reconstituida del hueso

Se mezclaron alícuotas de 20 pl de extracto óseo ácido con 2 pl de NaOH 10 M y se sedimentó el precipitado a 10.000 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se enjuagó el sedimento dos veces en 100 pl de 35 amortiguador (fosfato de sodio 1 mM pH 7,4 + NaCl 150 mM). Después, se mezcló la fase mineral de hueso resultante (equivalente a 0,37 mg de polvo seco) con 100 pl de una solución que contenía proteínas de sALP o sALP-D10 en el amortiguador de unión (fosfato de sodio 80 mM pH 7,4 + NaCl 150 mM). Se incubaron las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente en la rueda giratoria para mantener la fase mineral en suspensión. Después, se centrifugaron las muestras durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se mezcló el sedimento que 40 contenía la proteína unida con 180 pl del amortiguador de ensayo enzimático ALP que contenía BSA al 0,1 % y se inició la reacción mediante el agregado de 20 pl de MUP 100 pM. Para permitir un ensayo más homogéneo, las condiciones de la placa de 96 pocillos se agitaron durante 10 segundos cada minuto durante la duración del ensayo.

Se comparó la actividad enzimática retenida en la fase ósea mineral reconstituida con la actividad enzimática 45 equivalente agregada en el ensayo de unión. Se calcularon valores de 0,98 % y 13,3 % de actividad de proteína total unida a la fase mineral ósea para sALP y sALP-D10, respectivamente. Una diferencia de unión de más de 13 veces a favor de sALP-D10 sugiere que la secuencia de deca-aspartato fusionada al extremo C dirige directamente a sALP a la fase mineral del hueso. Además, el hecho de que haya sido posible medir directamente la actividad de ALP unida a la fase mineral del hueso indica que la enzima está unida de forma competente desde el punto de vista catalítico a 50 los cristales de hidroxiapatita.

Dicha proteína de fusión se puede dirigir directamente a los huesos donde la acumulación de PPi inhibe la mineralización esquelética.

55 EJEMPLO 7

D10-ALP disminuye el efecto inhibidor del pirofosfato sobre la mineralización ósea

Se cultivaron las células UMR106 hasta la confluencia. Después, se cultivaron durante otros 7 días en medio que 60 contenía p-glicerofosfato 10 mM para inducir la mineralización. A lo largo de este período de cultivo de 7 días, se

trataron las células con o sin pirofosfato (PPi) 75 pM, un inhibidor de la mineralización y un sustrato de fosfatasa alcalina. Para evaluar la capacidad de la fosfatasa alcalina de rescatar la inhibición de la mineralización inducida por PPi, se cultivaron células tratadas con o sin PPi con concentraciones variadas de D10-sALP semipurificado producido a partir de HEK293, células de riñón embrionarias humanas. Se evaluó la mineralización mediante 5 absorción de 45Ca. Los parámetros utilizados para este experimento se presentan en la tabla 2 abajo.

TABLA 2 - PARÁMETROS UTILIZADOS EN D10-ALP SOBRE LA INHIBICIÓN DE LA MINERALIZACIÓN INDUCIDA POR PPI

ALP: [ALP] (unidades/pocillo) pl ALP/pocillo 3-GP (mM) PPi (pM)

-: 0 0 10 0

-: 0 0 10 75

D10-sALP: 1,5 0,5 10 0

D10-sALP: 1,5 0,5 10 75

D10-sALP: 3 1,0 10 0

D10-sALP: 3 1,0 10 75

D10-sALP: 4,5 1,5 10 0

D10-sALP: 4,5 1,5 10 75

D10-sALP: 6 2 10 0

D10-sALP: 6 2 10 75

10 7 días de tratamiento con PPi produjeron una disminución del 43 % en la mineralización. El cotratamiento de los cultivos con D10sALP produjo un rescate que responde a la dosis de esta inhibición de la mineralización. El tratamiento con 1,5 unidades de D10-sALP produjo una disminución del 30 %, 3 y 4,5 unidades una disminución del 24 % y 6 unidades produjeron una disminución del 15 % en la mineralización, lo que corresponde a un rescate del 65 % de la inhibición de la mineralización inducida por PPi.

15

Estos resultados muestran que el tratamiento de los osteoblastos mineralizantes con D10-sALP rescata de forma que responde a la dosis la inhibición de la mineralización inducida por PPi.

Los ejemplos anteriores muestran que una fusión de poli-aspartato con proteínas recombinantes aumenta su unión a 20 la fase mineral del hueso o al tejido óseo y aumenta la capacidad de la proteína para llevar a cabo su actividad biológica en comparación con cuando se administra sola.

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7- Hunter GK, Kyle CL, Goldberg HA (1994) Modulation of crystal formation by bone phosphoproteins: structural specificity of the osteopontin-mediated inhibition of hydroxyapatite formation. Biochem J 300: 723-728.

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45 9-Gilbert M, Shaw WJ, Long JR, Nelson K, Drobny GP, Giachelli CM, Stayton PS (2000) Chimeric peptides of statherin and osteopontin that bind hydroxyapatite and mediate cell adhesion. J Biol Chem 275: 16213-16218.

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11- Salih E, Ashkar S, Gerstenfeld FC, Glimcher MJ (1997) Identification of the phosphorylated sites of metabollicaly 32P-labeled osteopontin from cultured chicken osteoblasts. J Biol Chem 272: 13966-13973.

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10

Se describe:

1. Un conjugado para administración ósea que tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:

15: A) X-Dn-Y-proteína-Z;

y

: B) Z-proteína-Y-Dn-X,

20

donde X está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

Y está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido;

Z está ausente o es una secuencia de aminoácidos de al menos un aminoácido; y Dn es un poli aspartato donde n = 10 a 16.

25

2. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 1, donde la proteína es un gen regulador de fosfato soluble con homología para las endopeptidasas en el cromosoma X (sPHEX).

3. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 2, donde dicha estructura es: X-Dn-Y-sPHEX-Z.

30

4. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 3, donde sPHEX tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 46 a 749 de la figura 10; 47 a 749 de la figura 10; 48 a 749 de la figura 10; 49 a 749 de la figura 10; 50 a 749 de la figura 10; 51 a 749 de la figura 10; 52 a 749 de la figura 10; 53 a 749 de la figura 10; y 54 a 749 de la figura 10.

35

5. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 3, donde el sPHEX consiste en la secuencia de aminoácidos 46 a 749 de la figura 10 y n=10.

6. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 1, donde la proteína es una fosfatasa alcalina 40 soluble (sALP).

7. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 6, donde dicha estructura es: Z-sALP-X-Dn-Y.

8. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 7, donde sALP está codificado por la secuencia 45 como se presenta en la figura 16A.

9. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 7, donde el sALP tiene la secuencia como se presenta en la figura 16B.

50 10. Un conjugado para administración ósea como se menciona en 7, donde n=10.

11. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

55 a) un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la figura 8;

b) un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la figura 11;

c) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la figura 7;

60 d) una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos

en (a), (b) o (c); y

e) una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a), (b), (c) o (d), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6XSSC, 5Xreactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100mg/ml de ADN de esperma de 5 salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2XSSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2XSSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1XSSC y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 minutos.

12. Un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos aislada de 11.

10

13. Una célula hospedadora recombinante que comprende el vector de 12. La presente invención se refiere a:

14. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

15

a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la figura 17A;

b) un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la figura 17B;

c) una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en 20 (a) o (b); y

d) una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos en (c), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6XSSC, 5Xreactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2XSSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2XSSC y SDS al 0,1 % a

25 temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1XSSc y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 minutos; donde dicha molécula de ácido nucleico codifica una fosfatasa alcalina soluble activa que comprende en el extremo C una secuencia de poliaspartato Dn, donde n = 10 a 16.

Se describe:

30

15. Una molécula de ácido nucleico aislada codificante de PHEX soluble funcional que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los 35 figura 10;

b) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

c) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

40 d) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

e) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

f) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los 45 figura 10;

g) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

h) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

50 i) un polinucleótido codificante de un sPHEX que comprende los figura 10;

j) una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) a (i); y

k) una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con cualquiera de las 55 secuencias de nucleótidos en (a) a (j), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e

hibridación en 6XSSC, 5Xreactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2XSSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2XSSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1XSSC y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 minutos.

aminoácidos: 54 a 749

aminoácidos: 53 a 749

aminoácidos: 52 a 749

aminoácidos: 51 a 749

aminoácidos: 50 a 749

aminoácidos: 49 a 749

aminoácidos: 48 a 749

aminoácidos: 47 a 749

aminoácidos: 46 a 749

como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la como se presenta en la

16. Una molécula de ácido nucleico aislada como se menciona en 15 que además comprende en su extremo 5', un polinucleótido codificante de un poli-aspartato seleccionado del grupo que consiste en D10 a D16.

17. Un polipéptido de sPHEX aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

5

a) los aminoácidos 54 a 749 como se presenta en la figura 10;

b) los aminoácidos 53 a 749 como se presenta en la figura 10;

c) los aminoácidos 52 a 749 como se presenta en la figura 10;

d) los aminoácidos 51 a 749 como se presenta en la figura 10;

10 e) los aminoácidos 50 a 749 como se presenta en la figura 10;

f) los aminoácidos 49 a 749 como se presenta en la figura 10;

g) los aminoácidos 48 a 749 como se presenta en la figura 10;

h) los aminoácidos 47 a 749 como se presenta en la figura 10; y

i) los aminoácidos 46 a 749 como se presenta en la figura 10.

15

18. Una composición para administración ósea que comprende un conjugado para administración ósea como se menciona en 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un uso de un conjugado para administración ósea como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 10 para administrar una proteína al tejido óseo de un mamífero.

20. Un uso de un conjugado para administración ósea como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de gen regulador de fosfato funcional con homología para las endopeptidasas en el cromosoma

25 X (PHEX), donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Un uso de un conjugado para administración ósea como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 en la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de gen regulador de fosfato funcional con homología para

30 las endopeptidasas en el cromosoma X (PHEX).

22. Un uso como se menciona en 20 o 21, donde la afección o la enfermedad es raquitismo hipofosfatémico ligado a X (XLH).

35 23. Un uso de un conjugado para administración ósea como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de fosfatasa alcalina funcional, donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

40 24. Un uso de un conjugado para administración ósea como se menciona en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en la fabricación de un medicamento para tratar una afección o enfermedad relacionada con un defecto óseo caracterizado por una falta de o una cantidad insuficiente de fosfatasa alcalina funcional, donde dicho conjugado se encuentra en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

45 25. Un uso como se menciona en 23 o 24, donde la afección o la enfermedad es hipofosfatasia.

26. Un procedimiento para evaluar péptidos para uso en un conjugado de proteína-péptido para administración ósea que comprende las etapas de:

50 fusionar un péptido candidato con una proteína indicadora para formar un conjugado de proteína-péptido; poner en contacto el conjugado con tejido óseo o la fase mineral del hueso; y

donde el péptido candidato se selecciona cuando la presencia de la proteína indicadora en el tejido óseo o la fase mineral del hueso es mayor cuando se conjuga con el péptido candidato que cuando no lo hace.

55 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ENOBIA PHARMA INC.

Crine, Philippe Loisel, Thomas 60 Lemire, Isabelle

Boileau, Guy

<120> CONJUGADOS PARA ADMINISTRACIÓN ÓSEA Y PROCEDIMIENTO DE USO DE ESTOS PARA DIRIGIR PROTEÍNAS AL HUESO 5

<130> 12987.50

<140> PCT/CA05/000615 <141> 2005-04-21

10

<150> US 60/563,828 <151> 2004-04-21

<150> US 60/614,984 15 <151> 2004-10-04

<150> US 60/590,347 <151> 2004-07-23

20 <160> 44

<170> Versión de patente 3.2 <210> 1

25 <211> 2280 <212> ADN <213> Artificial

<220>

30 <223> Conjugado escindible codificante <400> 1

atggaagcag: aaacagggag cagcgtggag actggaaaga aggycaaesg aggcactcga 60

attgccí'cgg: tcgtgcttgt cctqacagtg ategetcaac aaacaaccag tcaaqgtctt! 120

ttatccggag: atgacga tga cgatgacgat gacgatgact ccggaagtcí ccaagctaaa 100

caggagtact: gcctgaaqce aqaatgcatc gaageggctg ctgccatctt aagtaaagta 240

aatctgtetg: tggatccttg tgar.aatt te ttccggtteg cttgtgatgg Ctggataagc 300

sataatc:sa: atcccgaaga tatgecaage eatggggttt atccL tggct gagacat aat J60

gttgacctca: ag ttga agga acttttggag aaatcaatca gtagaaggcg ggacaccgaa 420

geeatacaga: aagccaaaat cct ttat tea tcctgcatga atgagaaagc gat t gaaaaa 400

gcagatqcca: agccactgct acacatccta cggcattcac et ctecgctg gcecgcgcCt 540

gaatctaata: trqgccccga aggggtttgg teagagagaa agt t cagee: tctgeagaca 500

cttgcaacgt ttcgtggtca stacagcaat tctgtgttca tccgtttgta tgtgtccccc 660 gatgacaaag catccaatga acatatcttg aagctggacc aagcaacact ctccetggcc 720 gtgagggaag actaccttga taacagtaca gaagccaagt cttatcggga tgccctttac 780 aagttcatgg tggatactgc cgtgctttta ggagctaaca gctccagagc agagcatgac 840 atgaagtcag tgctcagatt ggaaattaag atagctgaga taatgattcc acatgaaaac 900 cgaaccagcg aggccatgta caacaaaatg aacatttctg aactgagtgc tatgatteec 960

cagttcgaet ggctgggcta catcaagaag gtcattgaca ccagactcta cccccatctg: 1020

aaagacatca gcccctccga gaatgtggtg gtccgcgtcc cgcagtactt taaagatttg: 1080

tttaggatat tagggtctga gagaaagaag accattgcca actatttggt gtggagaatg: 1140

gtttattcca gaattccaaa ccttagcagg cgctttcagt aCagatggct ggaattctca: 1200

agggtaatcc aggggaccac aactttgctg cctcaatggg acaaatgtgt aaactttatt: 1260

gaaagtgccc tcccttatgt tgttggaaag atgtttgtag atgtgtactt ccaggaagat: 1320

aagaaggaaa tgatggagga attggttgag ggcgttcgct gggcctttat tgacatgcta: 1 3G0

gagaaagaaa atgagtggat ggatgcagga acgaaaagga aagccaaaga aaaggcgaga: 1440

gctgttttgg caaaagttgg ctatccagag tttataatga atgatactca tgttaatgaa: 1500

gacctcaaag ctatcaagtt ttcagaagcc gactactttg gcaacgtcct acaaactcgc: 1560

aagtatttag cacagtctga tttcttctgg ctaagaaaag ccgttccaaa aacagagtgg: 1620

tttacaaatc cgacgactgt caatgccttc tacagtgcat ccaccaacca gacccgattt: 1660

ccagcaggag agctccagaa gcctttcttt tggggaacag aatatcctcg atctctgagt: 1740

tatggtgcta taggagcaat tgtcggacat gaatctacac atggacttga taataatggt: íaco

agaaaatatg ataaaaatgg aaacctggat ccttggtggt ctactgaatc agaagaaaag: 1860

tttaaggaaa aaacaaaatg catgattaac cagCatagca actattattg gaagaaagct: 1920

ggcttaaatg tcaaggggaa gaggaccctg ggagaaaata ttgctgataa tggaggcctg: 1960

cgggaagctt ttagggctta caggaaaCgg aCaaatgaca gaaggcaggg acttgaggag: 2040

cctcttctac caggeatcac attcaccaac aaccagetct tcttcctgag ttatgctcat: 2100

gtgaggtgca attcctacag accagaagct gcccgagaac aagtccaaat cggtgctcac: 2160

agtccccctc agtttagggt caatggtgca attagtaact ttgaagaatt ccagaaagct: 2220

tttaactgtc cacccaattc cacgatgaac agaggcatgg actcctgccg aetctggtag: 22S0

<210>2 <211>759 5 <212> PRT <213> Artificial

<220

<223> Conjugado de PHEX escindible

<400>2

Met Glu Ala Glu Thr Gly Ser Ser Val Glu Thr Gly Lys Lys Ala Asn 1 & 10 15

Arg Gly Thr Arg lie Ala Leu Val Val Phe Val Leu Thr Val lie Ala 30 35 00

Gln Gln Thr Thr Ser Gln Gly Leu Leu Ser Gly Asp Asp Asp Asp Asp 35 4 0 45

Asp Asp Asp Asp Asp Ser Gly Ser Leu Gln Ala Lys Gln Glu Tyr Cys 50 55 GC

Leu Lys Pro Glu Cys lie Glu Ala Ala Ala Ala lie Leu Ser Lys Val 65 70 15 80

Asn Leu Ser Val Asp Pro Cys Asp Asn Phe Phe Arg Phe Ala Cys Asp

85 90 95

Gly Trp lie Ser Asn Asn Pro lie Pro Glu Asp Met Pro Ser Tyr Gly 100 105 110

Val Tyr Pro Trp Leu Arg His Asn Val Asp Leu Lys Leu Lys Glu Leu 111 130 125

Leu Glu Lys Ser lie Ser Arg Arg Arg Asp Thr Glu Ala lie Gln Lys 130 135 140

Ala Lys lie Leu Tyr Ser Ser Cys Met Asn Glu Lys Ala lie Glu Lys 14$ 150 155 ISO

Ala Asp Ala Lys Pro Leu Leu His lie Leu Arg His Ser Pro Phe Arg 165 170 175

Trp Pro Val Leu Glu Ser Asn lie Gly Pro Glu Gly Val Trp Ser Glu 130 185 1,30

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

5 a. Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos como se presenta en la SEQ ID NO: 7;

b. Un polinucleótido codificante de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se presenta en la SEQ ID NO: 8;

c. Una secuencia de nucleótidos completamente complementaria con cualquiera de las secuencias de nucleótidos en a) o b); y

10 d. Una secuencia de nucleótidos que se puede hibridar en condiciones de rigurosidad elevada con la secuencia de nucleótidos en c), donde las condiciones de rigurosidad alta comprenden: prehibridación e hibridación en 6 x SSC, 5 x reactivo de Denhardt, SDS al 0,5 % y 100 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 68 °C; y lavados en 2 x SSC y SDS al 0,5 % a temperatura ambiente durante 10 min; en 2 x SSC y SDS al 0,1 % a temperatura ambiente durante 10 min; y en 0,1 x SSC y SDS al 0,5 % a 65 °C tres veces durante 5 min; donde dicha 15 molécula de ácido nucleico codifica una fosfatasa alcalina soluble activa que comprende en el extremo C una secuencia de poliaspartato Dn, donde n=10 a 16.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de polinucleótidos codificante de la fosfatasa alcalina soluble activa que comprende en el extremo C una

20 secuencia de poliaspartato D10(sALP- D10).
3. Un vector recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos aislada de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.

25 4. Una célula hospedadora recombinante que comprende el vector recombinante de acuerdo con la

reivindicación 3.
5. El vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, que es pCDNA3-RSV-sALP-D10-NEO, donde dicho sALP-D10 tiene la secuencia de nucleótidos como se presenta en SEQ ID NO: 7.

30
6. Una célula hospedadora recombinante que comprende el vector recombinante de la reivindicación 5, donde la célula hospedadora es una célula HEK293.
7. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde el polipéptido en b) es 35 la fosfatasa alcalina soluble que comprende en el extremo C una secuencia de poliaspartato D10(sALP-D10).
8. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde la fosfatasa alcalina soluble activa disminuye los niveles de PPi extracelulares.

40 9. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, donde la fosfatasa alcalina

soluble activa es una fosfatasa alcalina biológicamente activa.

imagen1

% de dosis inyectada

imagen2

imagen3

Apa LI (369)

pCDNA3RSVDl Osphex NEO

8015 pb

RSv

8043

ApaU (7532)

EcoRI C188)

Seal (7345)

ampicilina

Pstl (390)

£CORI (391)

Seal (664)

B<2mHr <729)

HL1903

ApaU (6286)

Pitt <1073)

Seal <i&43>

Dio sPhex

SCORI (1628)

ECOHI (1669)

BamHi (2304)

Hjndiii (2482)

Wcoi (¡5053)

Aval (2609)

ECORI C2683)

neomic na

PSTI (4’74l

Hinálll (2693)

Smal <4434)

ffindlll (3182)

Aval (4432!)

eq PCR2.1

«Mal C4432)

£coRl (3202)

WC0K4318)

BamHI (3249)

EcORI (3280)

Pífl (3289)

ECORV (3292)

Notl (3307)

Aval (3313)

Figura 3

imagen4

imagen5

en

CT>

Figura 6

sPHEX H/Y DmsPHEX H/Y

Cambios en ALP total

(U/l)

1 tn

1 o ¿n en

o

o

o

o

o

1 ...i

imagen6

atggaagcagaaacagggagcagcgtggagactggaaagaaggccaacagaggcac tcgaattgccctggtcgtgtttgtcctgacagtgatcgctcaacaaacaaccagtc aaggtctcttatccggagatgacgatgacgatgacgatgacgatgactccggaagt ctccaagctaaacaggagtactgcctgaagccagaatgcatcgaagcggctgctgc catcttaagtaaagtaaatctgtctgtggatccttgtgataatttcttccggttcg cttgtgatggctggataagcaataatccaattcccgaagatatgccaagctatggg gtttatccttggctgagacataatgttgacctcaagttgaaggaacttttggagaa atcaatcagtagaaggcgggacaccgaagccatacagaaagccaaaatcctttatt cateetgcatgaatgagaaagcgattgaaaaagcagatgccaagccactgctacac atcctacggcattcacctttccgctggcccgtgcttgaatctaatattggccctga a9999tttggtcagagagaaagttcagccttctgcagacaettgcaacgtttcgtg gtcaatacagcaattctgtgttcatccgtttgtatgtgtcccctgatgacaaagca tccaatgaacatatcttgaagctggaccaagcaacactctccctggccgtgaggga agactaccttgataacagtacagaagccaagtcttatcgggatgccctttacaagt tcatggtggatactgccgtgcttttaggagctaacagttccagagcagagcatgac atgaagtcagtgctcagattggaaattaagatagctgagataatgattccacatga aaaccgaaccagcgaggccatgtacaacaaaatgaacatttctgaactgagtgcta tgattccccagttcgactggctgggctacatcaagaaggtcattgacaccagactc tacccccatctgaaagacatcagcccctccgagaatgtggtggtccgcgtcccgca gtactttaaagatttgtttaggatattagggtctgagagaaagaagaccattgcca actatttggtgtggagaatggtttattccagaattccaaaccttagcaggcgcttt cagtatagatggctggaattctcaagggtaatccaggggaccacaactttgctgcc tcaatgggacaaatgtgtaaactttattgaaagtgccctcccttatgttgttggaa agatgtttgtagatgtgtacttccaggaagataagaaggaaatgatggaggaattg gttgagggcgttcgctgggcctttattgacatgctagagaaagaaaatgagtggat ggatgcaggaacgaaaaggaaagccaaagaaaaggcgagagctgttttggcaaaag ttggctatccagagtttataatgaatgatactcatgttaatgaagacctcaaagct atcaagttttcagaagccgactactttggcaacgtcctacaaactcgcaagtattt agcacagtctgatttcttctggctaagaaaagccgttccaaaaacagagtggttta caaatccgacgactgtcaatgccttctacagtgcatccaccaaccagatccgattt ccagcaggagagctccagaagcctttcttttggggaacagaatatcctcgatctct gagttatggtgctataggagtaattgtcggacatgaatttacacatggatttgata ataatggtagaaaatatgataaaaatggaaacctggatccttggtggtctactgaa tcagaagaaaagtttaaggaaaaaacaaaatgcatgattaaccagtatagcaacta ttattggaagaaagctggcttaaatgtcaaggggaagaggaccctgggagaaaata ttgctgataatggaggcctgcgggaagcttttagggcttacaggaaatggataaat gacagaaggcagggacttgaggagcctcttctaccaggcatcacattcaccaacaa ccagctcttcttcctgagttatgctcatgtgaggtgcaattcctacagaccagaag ctgcccgagaacaagtccaaattggtgctcacagtceceetcagtttagggtcaat ggtgcaattagtaactttgaagaattccagaaagcttttaactgtccacccaattc cacgatgaacagaggcatggactcctgccgactctggtag

Figura 7

MEAETGSSVETGKKANRGTRIALWFVLTVIAQQTTSQGLLSGDDDDDDDDDDSGS LQAKQEYCLKPECIEAAAAILSKVNLSVDPCDNFFRFACDGWISNNPIPEDMPSYG VYPWLRHNVDLKLKELLEKSISRRRDTEAIQKAKILYSSCMNEKAIEKADAKPLLH ILRHSPFRWPVLESNIGPEGVWSERKFSLLQTLATFRGQYSNSVFIRLYVSPDDKA SNEHILKLDQATLSLAVREDYLDNSTEAKSYRDALYKFMVDTAVLLGANSSRAEHD MKSVLRLEIKIAEIMIPHENRTSEAMYNKMNIS ELSAMIPQFDWLGYIKKVIDTRL YPHLKDISPSENVWRVPQYFKDLFRILGSERKKTIANYLVWRMVYSRIPNLSRRF QYRWLEFSRVIQGTTTLLPQWDKCVNFIESALPYWGKMFVDVYFQEDKKEMMEEL VEGVRWAFIDMLEKENEWMDAGTKRKAKEKARAVLAKVGYPEFIMNDTHVNEDLKA IKFSEADYFGNVLQTRKYLAQSDFFWLRKAVPKTEWFTNPTTVNAFYSASTNQIRF PAGE LQ KPFFWGTEY PRSLSYGAIGVIVGHEFTHGFDNNGRKYDKNGNLD PWWSTE SEEKFKEKTKCMINQYSNYYWKKAGLNVKGKRTLGENIADNGGLREAFRAYRKWIN DRRQGLEEPLLPGITFTNNQLFFLSYAHVRCNSYRPEAAREQVQIGAHSPPQFRVN GAISNFEEFQKAFNCPPNSTMNRGMDSCRLW

Figura 8

imagen7

1 MEAETGSSVE TGKKANRGTR 61 EAAAAILSKV NLSVDPCDNF 121 KSISRRRDTE AIQKAKILYS 181 SERKFSLLQT LATFRGQYSN 241 EAKSYRDALY KFMVDTAVLL 301 NISELSAMIP QFDWLGYIKK 361 TIANYLVWRM VYSRIPNLSR 421 MFVDVYFQED KKEMMEELVE 481 FIMNDTHVNE DLKAIKFSEA 541 YSASTNQIRF PAGELQKPFF 601 PWWSTESEEK FKEKTKCMIN 661 INDRRQGLEE PLLPGITFTN 721 ISNSEEFQKA FNCPPNSTMN

IALWFVGGT LVLGTILFLV FRFACDGWIS NNPIPEDMPS SCMNEKAIEK ADAKPLLHIL SVFIRLYVSP DDKASNEHIL GANSSRAEHD MKSVLRLEIK VIDTRLYPHL KDISPSENW RFQYRWLEFS RVIQGTTTLL GVRWAFIDML EKENEWMDAG DYFGNVLQTR KYLAQSDFFW WGTEYPRSLS YGAIGVIVGH QYSNYYWKKA GLNVKGKRTL NQLFFLSYAH VRCNSYRPEA RGMDSCRLW

Figura 10

SQGLLSLQAK QEYCLKPECI YGVYPWLRHN VDLKLKELLE RHSPFRWPVL ESN1GPEGVW KLDQATLSLA VREDYLDNST IAEIMIPHEN RTSEAMYNKM VRVPQYFKDL FRILGSERKK PQWDKCVNFI ESALPYWGK TKRKAKEKAR AVLAKVGYPE LRKAVPKTEW FTNPTTVNAF EFTHGFDNNG RKYDKNGNLD GENIADNGGL REAFRAYRKW AREQVQIGAH SPPQFRVNGA

sgddddddddddsgslqakqeyclkpecieaaaailskvnlsvdpcdnffrfacdg

WISNNPIPEDMPSYGVYPWLRHNVDLKLKELLEKSISRRRDTEAIQKAKILYSSCM NEKAIEKADAKPLLHILRHSPFRWPVLESNIGPEGVWSERKFSLLQTLATFRGQYS NSVFIRLYVSPDDKASNEHILKLDQATLSLAVREDYLDNSTEAKSYRDALYKFMVD TAVLLGANSSRAEHDMKSVLRLEIKIAEIMIPHENRTSEAMYNKMNISELSAMIPQ FDWLGYIKKVIDTRLYPHLKDISPSENVWRVPQYFKDLFRILGSERKKTIANYLV WRMVYSRIPNLSRRFQYRWLEFSRVIQGTTTLLPQWDKCVWFIESALPYWGKMFV DVYFQEDKKEMMEELVEGVRWAFIDMLEKENEWMDAGTKRKAKEKARAVLAKVGYP EFIMNDTHVNEDLKAIKFSEADYFGNVLQTRKYLAQSDFFWLRKAVPKTEWFTNPT TVNAFYSASTNQIRFPAGELQKPFFWGTEYPRS LSYGAIGVIVGHEFTHGFDNNGR KYDKNGNLDPWWSTESEEKFKEKTKCMINQYSNYYWKKAGLNVKGKRTLGENIADN GGLREAFRAYRKWINDRRQGLEEPLLPGITFTNNQLFFLSYAHVRCNSYRPEAARE QVQIGAHSPPQFRVNGAISNFEEFQKAFNCPPNSTMNRGMDSCRLW

Figura 11

Construcción de proteína Actividad específica (UAF/seg/pg) Representación esquemática

1

sPHEX 12,3 | SLQAK...

L-dJ - =1

2

Fc-sPHEX 5,75 TSDKTH.j SLQAK...

M 1 i

3

pCDNA3-RSV-NLl furina-sPHEX N/A SVSLQAK...

4

Di0sPHEX 12,0 |SGDDDDDDDDDDSGSLQAK...

i hs-,1 1

5

D6sPHEX 8,55 |SDDDDDDYVSLQAK...

[ Eíd 1

r 1: Representa el dominio Iransmembrana mutado de PHEX : Representa el péptido señal de IgGl humano

166566^1: Representa la bisagra de dominios de cadena pesada de IgGl humano, CH2 y CH3 : Secuencia de extremo N 1 con el sitio de escisión de furina (RTWKR|SV).

|: Sitio de escisión de furina

|| Sitio de escisión de señal de peptidasa

Figura 12

Actividad específica (RFU/seg/pocillo)

imagen8

imagen9

imagen10

A

BamHI

1 GGATCCACCA TGATTTCACC ATTCTTAGTA

71 AGAAAGAGAA AGACCCCAAG TACTGGCGAG

141 GAAGCTCAAC ACCAACGTGG CTAAGAATGT

211 ACGGCTGCCC GCATCCTCAA GGGTCAGCTC

281 AGTTCCCCTT CGTGGCCCTC TCCAAGACGT

351 CACCGCCTAC CTGTGTGGGG TGAAGGCCAA

421 CGGTGCAACA CCACCCAGGG GAACGAGGTC

4 91 TGGGCATTGT GACCACCACG AGAGTGAACC

561 GGACTGGTAC TCAGACAACG AGATGCCCCC

631 CTCATGCATA ACATCAGGGA CATTGACGTG

701 AAACTGATGT GGAGTATGAG AGTGACGAGA

771 CACCTGGAAG AGCTTCAAAC CGAGATACAA

841 CTTGACCCCC ACAATGTGGA CTACCTATTG

911 GGAACAACGT GACGGACCCG TCACTCTCCG

981 CAAAGGCTTC TTCTTGCTGG TGGAAGGAGG

1051 GCCCTGCATG AGGCGGTGGA GATGGACCGG

1121 CTCTGACCGT GGTCACTGCG GACCATTCCC

1191 TATCTTTGGT CTGGCCCCCA TGCTGAGTGA

1261 GGGCCTGGCT ACAAGGTGGT GGGCGGTGAA

1331 ACCAGGCGCA GTCTGCTGTG CCCCTGCGCC

14 01 GGGCCCCATG GCGCACCTGC TGCACGGCGT

1471 GCCTGCATCG GGGCCAACCT CGGCCACTGT

B

1 MISPFLVLAI GTCLTNSLVP EKEKDPKYWR

51 AKNVIMFLGD GMGVSTVTAA RILKGQLHHN

101 TOTNAQVPDS AGTATAYLCG VKANEGTVGV

151 LRWAKDAGKS VGIVTTTRVN KATPSAAYAH

201 CKDIAYQLMH NIRDIDVIMG GGRKYMYPKN

251 DLVDTWKSFK PRYKKSHFIW NRTELLTLDP

301 RNNVTDPSLS EMVWAIQIL RKNPKGFPLL

3 51 EAVEMDRAIG QAGSLTSSED TLTWTADHS

401 MLSDTDKKPF TAILYGNGPG YKWGGEREN

4 51 HETHGGEDVA VFSKGPMAHL LHGVHEQNYV

501 SS

CTGGCCATTG GCACCTGCCT TACTAACTCC TTAGTGCCAG ACCAAGCGCA AGAGACACTG AAATATGCCC TGGAGCTTCA CATCATGTTC CTGGGAGATG GGATGGGTGT CTCCACAGTG CACCACAACC CTGGGGAGGA GACCAGGCTG GAGATGGACA ACAACACCAA TGCCCAGGTC CCTGACAGCG CCGGCACCGC TGAGGGCACC GTGGGGGTAA GCGCAGCCAC TGAGCGTTCC ACCTCCATCC TGCGCTGGGC CAAGGACGCT GGGAAATCTG ATGCCACCCC CAGCGCCGCC TACGCCCACT CGGCTGACCG TGAGGCCTTG AGCCAGGGCT GTAAGGACAT CGCCTACCAG ATCATGGGGG GTGGCCGGAA ATACATGTAC CCCAAGAATA AAGCCAGGGG CACGAGGCTG GACGGCCTGG ACCTCGTTGA GCACTCCCAC TTCATCTGGA ACCGCACGGA ACTCCTGACC GGTCTCTTCG AGCCAGGGGA CATGCAGTAC GAGCTGAACA AGATGGTGGT GGTGGCCATC CAGATCCTGC GGAAGAACCC CAGAATTGAC CACGGGCACC ATGAAGGAAA AGCCAAGCAG GCCATCGGGC AGGCAGGCAG CTTGACCTCC TCGGAAGACA ACGTCTTCAC ATTTGGTGGA TACACCCCCC GTGGCAACTC CACAGACAAG AAGCCCTTCA CTGCCATCCT GTATGGCAAT CGAGAGAATG TCTCCATGGT GGACTATGCT CACAACAACT ACGAGACCCA CGGCGGGGAG GACGTGGCCG TCTTCTCCAA CCACGAGCAG AACTACGTCC CCCACGTGAT GGCGTATGCA Xbal

GCTCCTGCCA GCTCGTAGTC TAGA

DQAQETLKYA LELQKLNTNV PGEETRLEMD KFPFVALSKT SAATERSRCN TTQGNEVTSI SADRDWYSDN EMPPEALSQG KTDVEYESDE KARGTRLDGL KNVDYLLGLF EPGDMQYELN VEGGRIDHGH HEGKAKQALH HVFTFGGYTP RGNSIFGLAP VSMVDYAHNN YQAQSAVPLR PHVMAYAACI GANLGHCAPA

Figura 16

A

BamHI

1 GGATCCACCA TGATTTCACC ATTCTTAGTA CTGGCCATTG GCACCTGCCT TACTAACTCC TTAGTGCCAG

71 AGAAAGAGAA AGACCCCAAG TACTGGCGAG ACCAAGCGCA AGAGACACTG AAATATGCCC TGGAGCTTCA

141 GAAGCTCAAC ACCAACGTGG CTAAGAATGT CATCATGTTC CTGGGAGATG GGATGGGTGT CTCCACAGTG

211 ACGGCTGCCC GCATCCTCAA GGGTCAGCTC CACCACAACC CTGGGGAGGA GACCAGGCTG GAGATGGACA

281 AGTTCCCCTT CGTGGCCCTC TCCAAGACGT ACAACACCAA TGCCCAGGTC CCTGACAGCG CCGGCACCGC

351 CACCGCCTAC CTGTGTGGGG TGAAGGCCAA TGAGGGCACC GTGGGGGTAA GCGCAGCCAC TGAGCGTTCC

421 CGGTGCAACA CCACCCAGGG GAACGAGGTC ACCTCCATCC TGCGCTGGGC CAAGGACGCT GGGAAATCTG

4 91 TGGGCATTGT GACCACCACG AGAGTGAACC ATGCCACCCC CAGCGCCGCC TACGCCCACT CGGCTGACCG

561 GGACTGGTAC TCAGACAACG AGATGCCCCC TGAGGCCTTG AGCCAGGGCT GTAAGGACAT CGCCTACCAG

631 CTCATGCATA ACATCAGGGA CATTGACGTG ATCATGGGGG GTGGCCGGAA ATACATGTAC CCCAAGAATA

701 AAACTGATGT GGAGTATGAG AGTGACGAGA AAGCCAGGGG CACGAGGCTG GACGGCCTGG ACCTCGTTGA

771 CACCTGGAAG AGCTTCAAAC CGAGATACAA GCACTCCCAC TTCATCTGGA ACCGCACGGA ACTCCTGACC

841 CTTGACCCCC ACAATGTGGA CTACCTATTG GGTCTCTTCG AGCCAGGGGA CATGCAGTAC GAGCTGAACA

911 GGAACAACGT GACGGACCCG TCACTCTCCG AGATGGTGGT GGTGGCCATC CAGATCCTGC GGAAGAACCC

981 CAAAGGCTTC TTCTTGCTGG TGGAAGGAGG CAGAATTGAC CACGGGCACC ATGAAGGAAA AGCCAAGCAG

1051 GCCCTGCATG AGGCGGTGGA GATGGACCGG GCCATCGGGC AGGCAGGCAG CTTGACCTCC TCGGAAGACA

1121 CTCTGACCGT GGTCACTGCG GACCATTCCC ACGTCTTCAC ATTTGGTGGA TACACCCCCC GTGGCAACTC

1191 TATCTTTGGT CTGGCCCCCA TGCTGAGTGA CACAGACAAG AAGCCCTTCA CTGCCATCCT GTATGGCAAT

1261 GGGCCTGGCT ACAAGGTGGT GGGCGGTGAA CGAGAGAATG TCTCCATGGT GGACTATGCT CACAACAACT

1331 ACCAGGCGCA GTCTGCTGTG CCCCTGCGCC ACGAGACCCA CGGCGGGGAG GACGTGGCCG TCTTCTCCAA

1401 GGGCCCCATG GCGCACCTGC TGCACGGCGT CCACGAGCAG AACTACGTCC CCCACGTGAT GGCGTATGCA

1471 GCCTGCATCG GGGCCAACCT CGGCCACTGT GCTCCTGCCA GCTCGGATGA CGACGATGAT GACGATGATG

Xbal

1541 ACGACTAGTC TAGA

B

1 MISPFLVLAI GTCLTNSLVP EKEKDPKYWR DQAQETLKYA LELQKLNTNV

51 AKNVIMFLGD GMGVSTVTAA RILKGQLHHN PGEETRLEMD KFPFVALSKT

101 YKTNAQVPDS AGTATAYLCG VKANEGTVGV SAATERSRCN TTQGNEVTSI

151 LRWAKDAGKS VGIVTTTRVN HATPSAAYAH SADRDWYSDN EMPPEALSQG

201 CKDIAYQLMH NIRD1DVIMG GGRKYMYPKN KTDVEYESDE KARGTRLDGL

251 DLVDTWKSFK PRYKHSHFIW NRTELLTLDP HNVDYLLGLF EPGDMQYELN

301 RNNVTDPSLS EMVWAIQIL RKNPKGFFLL VEGGRTDHGH HEGKAKQALH

351 EAVEMDRAIG QAGSLTSSED TLTWTADHS HVFTFGGYTP RGNSIFGLAP

401 MLSDTDKKPF TAILYGNGPG YKWGGEREN VSMVDYAHNN YQAQSAVPLR

451 HETHGGEDVA VFSKGPMAHL LHGVHEQNYV PHVMAYAACI GANLGHCAPA

501 SSDDDDDDDD DD

Figura 17

imagen11