ES2687808T3 - Región constante de anticuerpo modificado - Google Patents

Abstract

Una región constante de anticuerpo humano que comprende deleciones de ambas Gly en la posición 329 (posición 446 en el sistema de numeración EU) y Lys en la posición 330 (posición 447 en el sistema de numeración EI) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la amidación del aminoácido C-terminal de la región constante del anticuerpo IgG1 humana está suprimida.

Description

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DESCRIPCION

Región constante de anticuerpo modificado Campo técnico

La presente invención se refiere a regiones constantes de anticuerpo que tienen mejores propiedades fisicoquímicas (estabilidad y homogeneidad), inmunogenicidad (antigenicidad) y seguridad y/o semivida en el plasma; y anticuerpos que comprenden las regiones constantes.

Antecedentes de la invención

Los anticuerpos atraen la atención como productos farmacéuticos puesto que son muy estables en el plasma (sangre) y tienen pocos efectos adversos. De ellos, están disponibles en el mercado una serie de productos farmacéuticos de anticuerpos de tipo IgG, y actualmente están en desarrollo muchos productos farmacéuticos de anticuerpos (documentos de no patente 1 y 2).

Casi todos los productos farmacéuticos de anticuerpos disponibles en el mercado son de la subclase IgG1. Se espera que los anticuerpos de tipo IgG1 sean útiles como productos farmacéuticos de anticuerpos anticáncer puesto que se pueden unir al receptor Fcy y ejercer actividad de ADCC. Sin embargo, la unión del dominio Fc al receptor Fcy, que es importante para la función efectora tal como la ADCC, puede producir efectos adversos innecesarios, y por lo tanto, es preferible eliminar dicha actividad de unión de los productos farmacéuticos de anticuerpos dirigidos a la neutralización de la actividad biológica (documento de no patente 3). Además, puesto que el receptor Fcy es expresado en células presentadoras de antígeno, las moléculas que se unen al receptor Fcy tienen a ser presentadas como antígenos. Se ha descrito que la inmunogenicidad es por y se puede potenciar por la unión de una proteína o péptido al dominio Fc de la IgGl (documento de no patente 4 y documento de patente 1). Se cree que la interacción entre el dominio Fc del anticuerpo y el receptor Fcy es causa de efectos adversos graves encontrados en ensayos clínicos de fase I de TGN1412 (documento de no patente 5). Por lo tanto, se considera que la unión al receptor Fcy es desfavorable en productos farmacéuticos de anticuerpos dirigidos a la neutralización de la actividad biológica de un antígeno desde la perspectiva de los efectos adversos y la inmunogenicidad.

Un método para impedir la unión al receptor Fcy es alterar el subtipo del anticuerpo IgG de IgG1 a IgG2 o IgG4; sin embargo, este método no puede inhibir completamente la unión (documento de no patente 6). Uno de los métodos descritos para inhibir completamente la unión al receptor Fcy es alterar artificialmente el dominio Fc. Por ejemplo, las funciones efectoras de anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD4 producen efectos adversos. Por lo tanto, se introdujeron aminoácidos que no están presentes en la secuencia de tipo natural en el dominio de Fc de unión al receptor Fcy (documentos de no patente 3 y 7), y actualmente se están llevando a cabo ensayos clínicos para evaluar anticuerpos anti-CD3 que no se unen al receptor Fcy y anticuerpos anti-CD4 que tienen un dominio de Fc mutado (documentos de no patente 5 y 8). Alternativamente, se pueden preparar anticuerpos que no se unen al receptor Fcy alterando el dominio de unión a FcyR de la IgG1 (en las posiciones 233, 234, 235, 236, 327, 330 y 331 en el sistema de numeración de la UE) a una secuencia de IgG2 o IgG4 (documento de no patente 9 y documento de patente 2). Sin embargo, estas moléculas contienen nuevas secuencias de péptidos no naturales de 9 a 12 aminoácidos, que pueden constituir un péptido epítopo de linfocitos T y por lo tanto suponen riesgo de inmunogenicidad. No hay descripciones previas sobre anticuerpos que no se unen al receptor Fcy que hayan superado estos problemas.

A la vez, las propiedades fisicoquímicas de proteínas anticuerpos, en particular, la homogeneidad y estabilidad, son cruciales en el desarrollo de productos farmacéuticos de anticuerpos. Para el subtipo IgG2, se ha descrito heterogeneidad originada en los enlaces disulfuro en la región bisagra (documento de no patente 10 y documento de patente 3). No es fácil fabricarlos como producto farmacéutico a gran escala a la vez que se mantiene la heterogeneidad relacionada con las sustancias objetivo/sustancias relacionadas entre producciones. Por lo tanto, son deseables, tanto como sea posible, sustancias individuales para moléculas de anticuerpo desarrolladas como productos farmacéuticos.

La IgG2 e IgG4 son inestables en condiciones ácidas. Los anticuerpos de tipo IgG en general están expuestos a condiciones ácidos en el procedimiento de purificación usando proteína A y el procedimiento de inactivación de virus. Por lo tanto, hay que intervenir en relación con la estabilidad de la IgG2 e IgG4 durante estos procedimientos, y es preferible que las moléculas de anticuerpo desarrolladas como productos farmacéuticos sean también estables en condiciones ácidas. La IgG2 e IgG4 naturales, y los anticuerpos que no se unen al receptor Fcy derivados de la IgG2 e IgG4 (documentos de no patente 6 y 7 y documento de patente 2) tienen dichos problemas. Es deseable resolver estos problemas cuando se desarrollan anticuerpos en productos farmacéuticos.

Los anticuerpos de tipo IgG1 son relativamente estables en condiciones ácidas y el grado de heterogeneidad originado de los enlaces disulfuro en la región bisagra también es menor en este tipo de anticuerpos. Sin embargo, se ha descrito que los anticuerpos de tipo IgG1 sufren escisión de enlace peptídico no enzimática en la región bisagra en soluciones, cuando se almacenan como formulaciones, y como resultado se generan fragmentos Fab como impurezas (documento de no patente 11). Es conveniente superar la generación de impurezas cuando se desarrollan anticuerpos en productos farmacéuticos.

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Además, para la heterogeneidad de la secuencia C-terminal de un anticuerpo, se ha descrito la eliminación del resto de lisina del aminoácido C-terminal, y la amidación del grupo amino C-terminal debido a la eliminación de los dos aminoácidos C-terminales, glicina y lisina (documento de no patente 12). Es preferible eliminar dicha heterogeneidad cuando se desarrollan anticuerpos en productos farmacéuticos.

La región constante de un producto farmacéutico de anticuerpo dirigido a la neutralización de un antígeno, preferiblemente tiene una secuencia que supera todos los problemas descritos antes. Sin embargo, no se ha descrito una región constante que cumpla todos los requisitos.

Se cree que una forma preferida de administración del producto farmacéutico de anticuerpo es la formulación subcutánea en enfermedades autoinmunitarias crónicas y similares. Los productos farmacéuticos de anticuerpos convenientes, de coste bajo, que se pueden administrar por vía subcutánea en intervalos más largos, se pueden proporcionar aumentando la semivida de un anticuerpo en el plasma para prolongar su efecto terapéutico y de esta forma reducir la cantidad de proteína administrada, y confiriendo al anticuerpo estabilidad alta de modo que se puedan preparar formulaciones de concentración alta.

En general, es necesario que las formulaciones subcutáneas sean formulaciones de concentración alta. Desde la perspectiva de la estabilidad o similar, el límite de concentración de las formulaciones de anticuerpos de tipo IgG en general se cree que es aproximadamente 100 mg/ml (documento de no patente 13). Por lo tanto, es un reto asegurar la estabilidad con concentración alta. Sin embargo, no hay publicaciones sobre la mejora de la estabilidad de la IgG a concentraciones altas introduciendo sustituciones de aminoácidos en su región constante. Se ha descrito un método para prolongar la semivida del anticuerpo en el plasma y sustituye aminoácidos en la región constante (documentos de no patente 14 y 15); sin embargo, la introducción de secuencias no naturales en la región constante no es indeseable desde la perspectiva del riesgo de inmunogenicidad.

Como se ha descrito antes, cuando el fin del producto farmacéutico de anticuerpo es neutralizar un antígeno, es preferible haber superado todos los problemas descritos antes con respecto a su secuencia de la región constante. Sin embargo, no se ha descrito una región constante que cumpla todos los requisitos. Por lo tanto, se piden regiones constantes de anticuerpo que hayan superado los problemas descritos antes.

A continuación se describen documentos de las técnicas anteriores relacionadas para la presente invención.

[Documento de no patente 1] Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden y Matthew C Dewitz. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nature Biotechnology (2005) 23, 1073-1078

[Documento de no patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ. The therapeutic antibodies market to 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm., abril 2005; 59(3):389-96

[Documento de no patente 3] Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, Payne A, Fishman-Lobell J, Tsui P, Dal Monte PR, Doyle ML, Brigham-Burke MR, Anderson D, Reff M, Newman R, Hanna N, Sweet RW, Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J. Immunol., Feb 2000 15; 164(4):1925-33

[Documento de no patente 4] Guyre PM, Graziano RF, Goldstein J, Wallace PK, Morganelli PM, Wardwell K, Howell AL. Increased potency of Fc-receptor-targeted antigens. Cáncer Immunol. Immunother. Nov-Dic 1997; 45(3-4):146-8

[Documento de no patente 5] Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned, future directions. Nat. Rev. Drug Discov. enero 2007; 6(1):75-92

[Documento de no patente 6] Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann. Hematol., Jun 1998; 76(6):231-48

[Documento de no patente 7] Cole MS, Anasetti C, Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J. Immunol. 1 Oct 1997; 159(7):3613-21

[Documento de no patente 8] Chau LA, Tso JY, Melrose J, Madrenas J. HuM291 (Nuvion), a humanized Fc receptor- nonbinding antibody against CD3, anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor. Transplantation, abril 2041 15; 71(7):941-50

[Documento de no patente 9] Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur. J. Immunol., agosto 1999; 29(8):2613-24

[Documento de no patente 10] Chu GC, Chelius D, Xiao G, Khor HK, Coulibaly S, Bondarenko PV. Accumulation of Succinimide in a Recombinant Monoclonal Antibody in Mildly Acidic Buffers Under Elevated Temperatures. Pharm. Res. 24 marzo 2007, 24; 24(6):1145-56

[Documento de no patente 11] AJ Cordoba, BJ Shyong, D Breen, RJ Harris. Nonenzymatic hinge region fragmentation of antibodies in solution. J. Chromatogr. B. Anal. Technol. Biome. Life Sci. (2005) 818, 115-121

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[Documento de no patente 12] Johnson KA, Paisley-Flango K, Tangarone BS, Porter TJ, Rouse JC. Catión exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal. Biochem., 1 enero 2007; 360(1):75-83

[Documento de no patente 13] Shire SJ, Shahrokh Z, Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J. Pharm. Sci., junio 2004; 93(6):1390-402

[Documento de no patente 14] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N. An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life. J. Immunol., 1 enero 2006; 176(1):346-56

[Documento de no patente 15] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES. Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis. Nat. Biotechnol., Jul 1997; 15(7):637- 40

[Documento de patente 1] US 20050261229A1 [Documento de patente 2] WO 99/58572 [Documento de patente 3] US 2006/0194280 Descripción de la invención Problemas que ha de resolver la invención

La presente invención se llevó a cabo en vista de las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente invención es proporcionar regiones constantes de anticuerpos que tengan mejores propiedades fisicoquímicas (estabilidad y homogeneidad), inmunogenicidad, seguridad y farmacocinéticas (retención en el plasma (sangre)) por alteración de los aminoácidos.

Medios para resolver los problemas

Los autores de la presente invención llevaron a cabo estudios específicos para generar regiones constantes de anticuerpos que mejoren por alteración de sus secuencias de aminoácidos y tengan mejores propiedades fisicoquímicas (estabilidad y homogeneidad), inmunogenicidad y seguridad y farmacocinéticas. Como resultado, los autores de la presente invención mejoraron con éxito regiones constantes de anticuerpos para tener mayor estabilidad en condiciones ácidas, menor heterogeneidad originada en los enlaces disulfuro en la región bisagra, menor heterogeneidad originada en el extremo C de la cadena H y mayor estabilidad a concentraciones altas, y también descubrieron nuevas secuencias de la región constante que tienen menor actividad de unión al receptor Fcy mientras que se minimizaba la generación de nuevos péptidos epítopos de linfocitos T.

La presente invención se refiere a regiones constantes de anticuerpos que son superiores en términos de seguridad, riesgo de inmunogenicidad, propiedades fisicoquímicas (estabilidad y homogeneidad) y farmacocinética, una mejora por la alteración de aminoácidos; anticuerpos que comprenden dicha región constante de anticuerpo; composiciones farmacéuticas que comprenden dicho anticuerpo; y métodos para producirlos. Más específicamente, la presente invención proporciona:

[1] una región constante de anticuerpo humano de una cualquiera de:

(a) una región constante de anticuerpo humano que comprende eliminaciones tanto de Gly en la posición 329 (posición 446 en el sistema de numeración EU, véanse secuencias de proteínas de interés inmunológico, Publicación NIH N° 91-3242) como de Lys en la posición 326 (posición 447 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 en donde la amidación del aminoácido del extremo C-terminal de la región constante del anticuerpo IgG1 humana está suprimida. En la región constante de IgG1 de la invención, el aminoácido Asn en la posición 317 (posición 434 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se han sustituido por otro aminoácido; La invención comprende una región constante de anticuerpo humano que comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 43 y un anticuerpo que comprende las regiones constantes arriba mencionadas. La invención también incluye un anticuerpo, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que tiene lsa regiones constantes que se definen en las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica que muestra el resultado de usar cromatografía de filtración en gel para analizar el contenido de agregados en WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, IgG2-M397V y IgG4-R409K purificados por elución con ácido clorhídrico.

La figura 2 es un diagrama que muestra el resultado del análisis por cromatografía de intercambio catiónico (IEC) de WT-IgG1, WT-IgG2 y WT-IgG4.

La figura 3 es un diagrama que muestra los enlaces disulfuro previstos en la región bisagra de la WT-IgG2.

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La figura 4 es un diagrama que muestra los enlaces disulfuro previstos en la región bisagra de la IgG2-SKSC.

La figura 5 es un diagrama que muestra el resultado del análisis por cromatografía de intercambio catiónico (IEC) de WT-IgG2 y IgG2-SKSC.

La figura 6 es un diagrama que muestra el resultado del análisis por cromatografía de intercambio catiónico (IEC) del anticuerpo PM-1 humanizado, anticuerpo AK C-terminal de cadena H, y anticuerpo AGK C-terminal de cadena H.

La figura 7 muestra la comparación de las cantidades de WT-IgGI, WT-IgG2, WT-IgG4, WT-M14AGK, WT-M17AGK, y WT-M11AGK unidos a FcyRI.

La figura 8 es una gráfica que muestra la comparación de las cantidades de WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT- M14AGK, WT-M17AGKy WT-M11AGK unidos a FcYRIIa.

La figura 9 es una gráfica que muestra la comparación de las cantidades de WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT- M14AGK, WT-M17AGKy WT-M11AGK unidos a FcYRIlb.

La figura 10 es una gráfica que muestra la comparación de las cantidades de WT-IgG1, WT-IgG2, WT-IgG4, WT- M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK unidos a FcYRIIIa (Val).

La figura 11 es una gráfica que muestra el aumento de agregación en un ensayo de estabilidad para WT-IgG1, WT- M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK en concentraciones altas.

La figura 12 es una gráfica que muestra el aumento de fragmentos Fab en un ensayo de estabilidad para WT-IgG1, WT-M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK en concentraciones altas.

La figura 13 es un diagrama que muestra el resultado del análisis por cromatografía de intercambio catiónico (IEC) de WT-IgG2, WT-M14AGK y WT-M31AGK.

La figura 14 es una gráfica que muestra la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de WT-IgG1 y WT-M14 después de administración intravenosa a ratones transgénicos con FcRn humano.

La figura 15 es una gráfica que muestra la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de WT-IgG1, WT- M44, WT-M58 y WT-M73 después de administración intravenosa a ratones transgénicos con FcRn humano.

La figura 16 es un diagrama que muestra una evaluación basada en cromatografía de intercambio catiónico del efecto en la heterogeneidad de la región constante de anticuerpos anti-receptor de IL-6 WT y F2H/L39, anticuerpo HOLOanti-receptor IL-31, y anticuerpo DNS anti-RANKL.

La figura 17 es un diagrama que muestra una evaluación basada en cromatografía de intercambio catiónico del efecto en la heterogeneidad del dominio de cisteína de CH1 de anticuerpos anti-receptor de IL-6 de tipo natural y F2H/L39.

La figura 18 es un diagrama que muestra la evaluación basada en DSC del efecto en el máximo de desnaturalización del dominio de cisteína de CH1 del anticuerpos anti-receptor de IL-6 WT y F2H/L39.

La figura 19 es una gráfica que muestra las actividades de TOCILIZUMAB, el control y Fv5-M83 para neutralizar BaF/g130.

La figura 20 es una gráfica que muestra las actividades de TOCILIZUMAB, Fv3-M73 y Fv4-M73 para neutralizar BaF/gp130.

La figura 21 es una gráfica que muestra la evolución temporal de la concentración plasmática de TOCILIZUMAB, el control, Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 en macacos cangrejeros después de administración intravenosa.

La figura 22 es una gráfica que muestra la evolución temporal de la concentración de CRP en macacos cangrejeros después de administración intravenosa de TOCILIZUMAB, el control, Fv3-M73, Fv4-M73 o Fv5-M83.

La figura 23 una gráfica que muestra la evolución temporal de la concentración del receptor de IL-6 soluble libre en macacos cangrejeros después de administración intravenosa de TOCILIZUMAB, el control, Fv3-M73, Fv4-M73 o Fv5-M83.

La figura 24 es una gráfica que muestra la evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de WT-IgG1, WT- M14 y WT-M58 después de administración intravenosa a ratones transgénicos con FcRn humano.

Modo de llevar a cabo la invención

La presente divulgación proporciona regiones constantes de anticuerpos cuyas propiedades fisicoquímicas (estabilidad y homogeneidad), inmunogenicidad, seguridad y/o farmacocinética se han mejorado alterando la secuencia de aminoácidos de una región constante de anticuerpo; anticuerpos que comprenden dicha región

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constante; composiciones farmacéuticas que comprenden dicho anticuerpo; y métodos para producirlos.

En la presente memoria, la región constante se refiere a la región constante de tipo IgG1, IgG2 o IgG4. La región constante de anticuerpo preferiblemente es una región constante de anticuerpo humano. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de la IgG1, IgG2 e IgG4 humanas son conocidas (región constante de la IgG1 humana, SEQ ID NO: 1; región constante de la IgG1 humana, SEQ ID NO: 2; y región constante de la IgG4 humana, SEQ ID NO: 3). Las regiones constantes de anticuerpos que contienen sustituciones de aminoácidos de la presente invención, pueden comprender otras sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre que comprenden las sustituciones de aminoácidos de la presente invención. Por lo tanto, las regiones constantes de la IgG2 que comprendan las sustituciones de aminoácidos de la presente invención en la región constante de la IgG2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 incluyen regiones constantes de IgG2 que comprenden una o más sustituciones y/o modificaciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y además comprenden las sustituciones de aminoácidos de la presente invención, así como las regiones constantes de la IgG2 que comprenden las sustituciones de aminoácidos de la presente invención y además comprenden una o más sustituciones y/o modificaciones de aminoácidos. Se aplica lo mismo a las regiones constantes de IgG1 que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y las regiones constantes de IgG4 que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. La secuencia de la región constante de la IgG4 humana se ha alterado para mejorar la estabilidad de la región bisagra (Mol. Immunol., enero 1993;30(1):105- 8). Además, la cadena de azúcar en la posición 297 en el sistema de numeración EU puede ser de cualquier estructura de cadena de azúcar, o puede no haber ninguna cadena de azúcar unida en este sitio (por ejemplo, puede ser producida con E. coli).

IgG1 que tiene aminoácidos alterados

La presente invención proporciona regiones constantes de IgG1 que tienen la deleción de Gly en la posición 329 (posición 446 en el sistema de numeración EU) y Lys enla posición 330(posición 447 en el sistema de numeración EU) en la región constante de IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: donde la amidación del aminoácido del extremo C-terminal de la región constante del anticuerpo IgG1 humana está suprimido. La terogeneidad originada a partir del extremo C de la cadena H de un anticuerpo se puede reducir solo cuando ambos aminoácidos están suprimidos.

La presente invención proporciona además regiones constantes de IgG1 que comprenden una secuencia de aminoácidos en la que Asn en posición 317 (posición 434 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se ha sustituido por otro aminoácido. El tipo de aminoácido después de sustitución no está particularmente limitado; sin embargo, se prefiere la sustitución por Ala.

La presente invención proporciona una región constante que tiene eliminación de la Gly en la posición 329 y la Lys en la posición 330 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ED NO: 36. Más específicamente, la presente invención proporciona una región constante de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 (M83).

Las regiones constantes de IgG1 proporcionadas por la presente invención, que tienen menor heterogeneidad C- terminal, también pueden tener otras sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, siempre que tengan al menos las eliminaciones de aminoácidos descritas antes.

La presente invención también proporciona anticuerpos que comprenden una cualquiera de las regiones constantes de anticuerpo descritas antes. El tipo y origen de los anticuerpos de la presente invención no están particularmente limitados, siempre que comprendan la región constante de anticuerpo descrita antes, y pueden ser cualquier anticuerpo.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen productos modificados de anticuerpos que comprenden cualquiera de las sustituciones de aminoácidos descritas antes. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser quiméricos, humanizados, anticuerpos totalmente humanizados, o similares. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanizados.

Alternativamente, las regiones constantes de anticuerpos descritas antes y/o moléculas de anticuerpos que comprenden una región constante de anticuerpo descrita antes, se pueden unir en una forma de molécula de fusión Fc a molécula de unión de tipo anticuerpo (moléculas armazón), péptidos bioactivos, péptidos de unión, o similares.

Los anticuerpos de la presente invención también incluyen productos de modificación de un anticuerpo que comprende una cualquiera de las regiones constantes descritas antes.

Dichos productos de modificación de anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos unidos a diferentes moléculas tales como polietilenglicol (PEG) y sustancias citotóxicas. Dichos productos de modificación de anticuerpos se pueden obtener modificando químicamente anticuerpos de la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser anticuerpos biespecíficos. “Anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo que tiene en una sola molécula regiones variables que reconocen diferentes epítopos. Los

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epítopos pueden estar presentes en una sola molécula o en moléculas separadas.

Las regiones constantes de anticuerpos descritas antes se pueden usar como una región constante en un anticuerpo contra un antígeno arbitrario. El antígeno no está particularmente limitado.

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden obtener, por ejemplo, por los siguientes métodos. En una realización para obtener los anticuerpos de la presente invención, primero se eliminan o sustituyen uno o más restos de aminoácidos por otros aminoácidos de interés en la región constante. Los métodos para sustituir uno o más restos de aminoácidos por aminoácidos de interés incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida (Hashimoto- Gotoh, T., Mizuno, T., Ogasahara, Y., y Nakagawa, M. “An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis”. Gene (1995) 152, 271-275; Zoller, M. J., y Smith, M. “Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors”. Methods Enzymol. (1983) 100,468-500; Kramer, W., Drutsa, V., Jansen, H. W., Kramer, B., Pflugfelder, M., y Fritz, H. J. “The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction”. Nucleic Acids Res. (1984) 12, 9441-9456; Kramer W., y Fritz H. J. “Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods”. Enzymol. (1987) 154, 350367; Kunkel, T. A. “Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492). Estos métodos se pueden usar para sustituir aminoácidos diana en la región constante de un anticuerpo por aminoácidos de interés.

En otra realización para obtener anticuerpos, un anticuerpo que se une a un antígeno de interés se prepara primero por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Cuando el anticuerpo preparado se obtiene de un animal no humano, se puede humanizar. La actividad de unión del anticuerpo se puede determinar por métodos conocidos. Después, uno o más restos de aminoácidos en la región constante se eliminan o se sustituyen por aminoácidos de interés.

Se describen métodos para producir anticuerpos, que comprenden las etapas de:

(a) expresar un ADN que codifica una cadena H en la que uno o más restos de aminoácidos en la región constante se han eliminado o sustituido por aminoácidos de interés, y un ADN que codifica una cadena L; y

(b) recoger los productos de expresión de la etapa (a).

La primera etapa de los métodos de producción de la presente invención es expresar una ADN que codifica una cadena H en la que uno o más restos de aminoácidos en la región constante se han eliminado o sustituido por aminoácidos de interés, y un ADN que codifica una cadena L de anticuerpo. Un ADN que codifica una cadena H en la que uno o más restos de aminoácidos en la región constante se han eliminado o sustituido por aminoácidos de interés, se puede preparar, por ejemplo, obteniendo un ADN que codifica la región constante de una cadena H de tipo natural, e introduciendo una sustitución adecuada de modo que un codón que codifica un aminoácido particular en la región constante codifica un aminoácido de interés.

Alternativamente, un ADN que codifica una cadena H en la que uno o más restos de aminoácidos en la región constante se han eliminado o sustituido por aminoácidos de interés, también se puede preparar diseñando y después sintetizando químicamente un ADN que codifica una proteína en la que uno o más restos de aminoácidos en la región constante de la cadena H de tipo natural se han eliminado o sustituido por aminoácidos de interés.

El tipo de sustitución de aminoácido incluye las sustituciones descritas en la presente memoria, pero no se limitan a las mismas.

Alternativamente, un ADN que codifica una cadena H en la que uno o más restos de aminoácidos en la región constante se han eliminado o sustituido por aminoácidos de interés, también se puede preparar como una combinación de ADN parciales. Dichas combinaciones de ADN parciales incluyen, por ejemplo, la combinación de un ADN que codifica una región variable y un ADN que codifica una región constante, y la combinación de un ADN que codifica una región Fab y un ADN que codifica una región Fc, pero no se limitan a las mismas. Un ADN que codifica una cadena L también se puede preparar como una combinación de ADN parciales.

Los métodos para expresar los ADN descritos antes incluyen los métodos descritos a continuación. Por ejemplo, se construye un vector de expresión de una cadena H insertando una ADN que codifica una región variable de la cadena H en un vector de expresión junto con un ADN que codifica una región constante de la cadena H. Igualmente, un vector de expresión de la cadena L se construye insertando un ADN que codifica una región variable de la cadena L en un vector de expresión junto con un ADN que codifica una región constante de la cadena L. Alternativamente, estos genes de las cadenas H y L se pueden insertar en un solo vector. Los vectores de expresión incluyen, por ejemplo, vectores basados en el virus SV40, vectores basados en el virus EB y vectores basados en el BPV (papilomavirus), pero no se limita a los mismos.

Las células hospedantes se cotransforman con un vector de expresión de anticuerpo construido por los métodos descritos antes. Dichas células hospedantes incluyen las células descritas antes tales como células CHO (ovario de hámster Chino) así como microorganismos tales como E. coli, levadura, y Bacillus subtilis, y plantas y animales (Nature Biotechnology (2007) 25, 563-565; Nature Biotechnology (1998) 16, 773-777; Biochemical and Biophysical

Research Communications (1999) 255, 444-450; Nature Biotechnology (2005) 23, 1159-1169; Journal of Virology (2001) 75, 2803-2809; Biochemical and Biophysical Research Communications (2003) 308, 94-100). La transformación se puede lograr preferiblemente usando electroporación, el método de la lipofectina (R. W. Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 6077; P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7413), 5 método del fosfato de calcio (F. L. Graham y A. J. van der Eb, Virology (1973) 52, 456-467), método de DEAE- dextrano, y similares.

En la siguiente etapa de producción de anticuerpos, se recogen los productos de expresión obtenidos en la etapa (a). Los productos de expresión se pueden recoger, por ejemplo, cultivando los transformantes y después separando los productos de las células transformadas o medio de cultivo. La separación y purificación de anticuerpos se puede 10 lograr por una combinación adecuada de métodos tales como centrifugación, fraccionamiento con sulfato amónico, precipitación salina, ultrafiltración, columnas de 1q, FcRn, proteína A y proteína G, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel.

Métodos para mejorar la estabilidad de la región constante de IgG2 en condiciones ácidas

También se describen métodos para mejorar la estabilidad del anticuerpo en condiciones ácidas, que comprende la 15 etapa de sustituir la Met en la posición 276 (posición 397 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (IgG2) por otro aminoácido. Los métodos de la presente invenciónpara mejorar la estabilidad del anticuerpo en condiciones ácidas pueden comprender otras etapas de sustitución de aminoácidos, con la condición de que comprendan la etapa de sustitución de la Met en la posición 276 (posición 397 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (IgG2) por otro aminoácido. El tipo de 20 aminoácido después de la sustitución no está particularmente limitado; sin embargo, se prefiere la sustitución por Val. El método para la sustitución del aminoácido no está particularmente limitado. La sustitución se puede lograr, por ejemplo, por mutagénesis dirigida descrita antes o un método descrito en los ejemplos.

Métodos para reducir la heterogeneidad originada en la región bisagra de la región constante de IgG2

Se describen métodos para reducir la heterogeneidad del anticuerpo, que comprenden la etapa de sustituir la Cys en 25 la posición 14 (posición 131 en el sistema de numeración EU), Arg en la posición 16 (posición 133 en el sistema de numeración EU), y/o Cys en la posición 102 (posición 219 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (IgG2) por otros aminoácidos. El tipo de aminoácido después de la sustitución no está particularmente limitado; sin embargo, se prefieren las sustituciones de Cys por Ser en la posición 14, Arg por Lys en la posición 16, y Cys por Ser en la posición 102. Los métodos de la presente memoria para reducir la 30 heterogeneidad del anticuerpo pueden comprender otras etapas de sustitución de aminoácidos, siempre que comprendan la etapa de sustituir la Cys en la posición 14 (posición 131 en el sistema de numeración EU), Arg en la posición 16 (posición 133 en el sistema de numeración EU), y/o Cys en la posición 102 (posición 219 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (IgG2). El método para la sustitución de aminoácido no está particularmente limitado. Las sustituciones se pueden lograr, por ejemplo, por mutagénesis 35 dirigida descrita antes o un método descrito en los ejemplos. En la sustitución del aminoácido, se pueden sustituir los tres aminoácidos descritos antes o se pueden sustituir uno o dos de ellos (por ejemplo, posiciones 14 y 102).

Métodos para mejorar la farmacocinética por sustitución de aminoácidos de la región constante de IgG1

La presente descripción también se refiere a métodos para mejorar la farmacocinética de un anticuerpo, que comprenden la etapa de sustituir Asn en la posición 317 (EU434) en una región constante de la IgG1 que 40 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El tipo de aminoácido después de la sustitución no está limitado de manera particular; sin embargo, se prefiere la sustitución por Ala. Los métodos de la presente invención para mejorar la farmacocinética de un anticuerpo pueden comprender otras etapas de sustitución de aminoácidos, siempre que comprendan la etapa descrita antes.

La presente descripción también se refiere a métodos para mejorar la farmacocinética de un anticuerpo y reducir la 45 heterogeneidad originada en la eliminación de aminoácidos C-terminales, que comprenden la etapa de sustituir la Asn en la posición 317 (EU434) y eliminar la Gly en la posición 329 (EU446) y la Lys en la posición 330 (EU447) en una región constante de la IgG1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El tipo de aminoácido después de la sustitución no está particularmente limitado; sin embargo, se prefiere la sustitución por Ala. Los métodos de la presente invenciónpara mejorar la farmacocinética de un anticuerpo pueden comprender 50 otras etapas de sustitución de aminoácidos siempre que comprendan la etapa descrita antes.

Composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular, además de con los anticuerpos, con 55 vehículos farmacéuticamente aceptables por métodos conocidos. Por ejemplo, las composiciones se pueden usar por vía parenteral, cuando los anticuerpos se formulan en una solución o suspensión estéril para inyección usando agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular

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combinando adecuadamente los anticuerpos con vehículos o medios farmacéuticamente aceptables, específicamente, agua estéril o solución salina fisiológica, aceites vegetales, emulsionantes, agentes de suspensión, tensioactivos, estabilizantes, agentes aromatizantes, excipientes, vehículos, conservantes, agentes aglutinantes, y similares, mezclándolos en una dosis y forma unitaria necesaria para las implementaciones farmacéuticas aceptadas en general. El contenido del principio activo en dicha formulación se ajusta de modo que se pueda obtener una dosis adecuada dentro del intervalo requerido.

Las composiciones estériles para inyección se pueden formular usando vehículos tales como agua destilada para inyección, de acuerdo con protocolos convencionales.

Las soluciones acuosas usadas para inyección incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen glucosa u otros adyuvantes tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico. Estos se pueden usar junto con solubilizantes adecuados tales como alcohol, específicamente etanol, polialcoholes tales como propilenglicol y polietilenglicol, y tensioactivos no iónicos tales como polisorbato 80TM y HCO-50.

Los aceites incluyen aceites de sésamo y aceites de soja, y se pueden combinar con solubilizantes tales como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. Estos se pueden formular con tampones, por ejemplo, tampones de fosfato o tampones de acetato sódico; analgésicos, por ejemplo, hidrocloruro de procaína; estabilizantes, por ejemplo alcohol bencílico o fenol; o antioxidantes. Las inyecciones preparadas típicamente se dividen en partes alícuotas en ampollas adecuadas.

La administración se lleva a cabo preferiblemente por vía parenteral y específicamente incluye la administración intranasal, administración intrapulmonar y administración percutánea. Por ejemplo, las inyecciones se pueden administrar por vía sistémica o local por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea.

Además, el método de administración se puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con la edad y síntomas del paciente. Se puede seleccionar una dosis única de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo o un polinucleótido que codifica un anticuerpo, por ejemplo, del intervalo de 0,0001 a 1.000 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, la dosis puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 100.000 mg/persona. Sin embargo, la dosis no está limitada a estos valores. La dosis y el método de administración varían dependiendo del peso corporal, edad y síntomas del paciente, y los pueden seleccionar adecuadamente los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, los códigos de tres letras y de una letra para los respectivos aminoácidos son los siguientes:

Alanina: Ala (A)

Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N)

Ácido aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C)

Glutamina: Gln (Q)

Ácido glutámico: Glu (E)

Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H)

Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L)

Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M)

Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P)

Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T)

5

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50

Triptófano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y)

Valina: Val (V)

Todos los documentos del estado de la técnica citados se incorporan por referencia íntegramente.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describe más específicamente con referencia a los ejemplos, pero no se debe considerar que la limiten.

Ejemplo 1. Mejora de la estabilidad de la IgG2 e IgG4 en condiciones ácidas

Construcción de vectores de expresión para anticuerpos contra el receptor de IL-6 humanizados convertidos con IgG2 o IgG4 y expresión de los anticuerpos.

Para reducir la afinidad de unión al receptor Fcy, la región constante de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano, anticuerpo para PM-1 humanizado (Cáncer Res. Feb 1993 15; 53(4):851-6), que es del isotipo IgG1, se sustituyó por IgG2 o IgG4 (Mol. Immunol., enero 1993;30(1): 105-8) para generar moléculas WT-IgG2 (SEQ ID NO: 13) y Wt- IgG4 (SEQ ID NO: 14). Se usó un vector de expresión en célula animal para expresar las IgG. Se construyó un vector de expresión, en el que la región constante del anticuerpo PM-1 humanizado (IgG1) usado en el ejemplo de referencia 1, se digirió con Nhel/Notl y después se sustituyó por la región constante de la IgG2 o IgG4 por ligado. La secuencia de nucleótidos de cada fragmento de ADN se determinó con un secuenciador de ADN (ABI PRISM 3730xL DNA Sequencer o ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems)) usando el kit de secuenciación BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) de acuerdo con el manual de instrucciones. Usando la cadena L WT (por sus siglas en inglés wild type, tipo natural) (SEQ ID NO: 15), se expresaron WT-IgG1, WT-IgG2, y WT-IgG4 por el método descrito a continuación. Se suspendieron células HEK293H derivadas de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen) en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10% (Invitrogen). Las células se sembraron en placas (10 ml/placa; densidad celular de 5 a 6 x 105células/ml) para células adherentes (10 cm de diámetro, CORNING) y se cultivaron en un incubador con CO2 (37°C, 5% de CO2) durante un día y una noche enteros. Después, se separó el medio por aspiración, y se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen). La mezcla de ADN plasmídico preparada (13,8 |jg en total) se combinó con 20,7 jl de polietilenimina 1 jg/ml (Polysciences Inc.) y 690 jl de CHO-S-SFMII. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 10

min, y después se añadió a las células en cada placa. Las células se incubaron en un incubador con CO2 (37°C con

5% de CO2) durante 4 a 5 horas. Después se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) a las placas, y las células se incubaron en un incubador con CO2 durante 3 días. Se recogieron los líquidos sobrenadantes y se centrifugaron (aproximadamente 2000 g, 5 min, temperatura ambiente) para separar las células, y se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 jm MILLEX(R)-GV (Millipore). Las muestras se almacenaron a 4°C hasta su uso.

(1) anticuerpo PM-1 humanizado cadena H (PM-1 VH + IgG1), SEQ ID NO: 12 (secuencia de aminoácidos)

(2) PM-1 humanizado cadena H PM-1 VH + IgG2, SEQ ID NO: 13 (secuencia de aminoácidos)

(3) PM-1 humanizado cadena H PM-1 VH + IgG4, SEQ ID NO: 14 (secuencia de aminoácidos)

Purificación de WT-IgG1, WT-IgG2 y WT-IgG4 por elución en proteína A usando ácido clorhídrico

Se añadieron 50 jl de rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) suspendidos en TBS a los líquidos sobrenadantes de cultivo obtenidos, y las disoluciones combinadas se mezclaron por inversión a 4°C durante 4 horas o más. Las disoluciones se transfirieron a copas de filtro de 0,22 jm de Ultrafree®-MC (Millipore). Después de lavar 3 veces con 500 jl de TBS, las resinas rProtein A Sepharose™ se suspendieron en 100 jl de HCl 10 mM/NaCl 150 mM (pH 2,0) y las mezclas se incubaron durante 2 minutos para eluir los anticuerpos (elución con ácido clorhídrico). Inmediatamente, los eluatos se neutralizaron añadiendo 6,7 jl de Tris-HCl 1,5 M (pH 7,8). La elución se llevó a cabo dos veces, dando 200 jl de anticuerpos purificados.

Análisis por cromatografía de filtración en gel de WT-IgG1, WT-IgG2 y WT-IgG4 purificados por elución con ácido clorhídrico

El contenido de agregados en las muestras purificadas obtenidas por la elución con ácido clorhídrico, se evaluó por análisis de cromatografía de filtración en gel.

Método de evaluación de la agregación:

Sistema: Waters Alliance

Columna: G3000SWxl (TOSOH)

Fase móvil: fosfato sódico 50 mM, KCl 300 mM, pH 7,0 Caudal, longitud de onda: 0,5 ml/min, 220 nm

El resultado se muestra en la figura 1. Aunque el contenido de agregados en WT-IgG1 después de purificación era aproximadamente 2%, los de WT-IgG2 y WT-IgG4 después de purificación eran aproximadamente 25%. Esto 5 sugiere que la IgG1 es estable al ácido durante la elución con ácido clorhídrico, y en cambio, la IgG2 e IgG4 son inestables y sufren desnaturalización/agregación. Por lo tanto, la estabilidad de la IgG2 y la IgG4 en condiciones ácidas se demostró que era menor que la de la IgG1. La proteína A se ha usado con frecuencia para purificar moléculas de IgG, y las moléculas de IgG eluyen de la proteína A en condiciones ácidas. Además la inactivación de virus, que es necesaria cuando se desarrollan moléculas de IgG como productos farmacéuticos, en general se lleva 10 a cabo en condiciones ácidas. Por lo tanto, es conveniente que la estabilidad de las moléculas de IgG en condiciones ácidas sea mayor. Sin embargo, se encontró que la estabilidad de las moléculas de IgG2 e IgG4 en condiciones ácidas era menor que la de la IgG1, y sugiere por primera vez que hay un problema de desnaturalización/agregación en condiciones ácidas en el desarrollo de moléculas de IgG2 e IgG4 como productos farmacéuticos. Es conveniente superar este problema de desnaturalización/agregación cuando se desarrollan como 15 productos farmacéuticos. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha publicado ningún método para resolver este problema por sustitución de aminoácidos.

Preparación y evaluación de WT-IgG2 y WT-IgG4 que tienen un dominio CH3 alterado

La estabilidad de las moléculas de IgG2 e IgG4 en condiciones ácidas se demostró que era menor que la de la IgG1. Por lo tanto, se ensayaron formas alteradas de moléculas de IgG2 e IgG4 para mejorar la estabilidad en condiciones 20 ácidas. De acuerdo con modelos de las regiones constantes de las moléculas de IgG2 e IgG4, uno de los

potenciales factores desestabilizantes en condiciones ácidas se cree que era la inestabilidad en la interfase del dominio CH3-CH3. Se pensó que la metionina en la posición 397 en el sistema de numeración EU en la IgG2, o arginina en la posición 409 en el sistema de numeración EU en la IgG4, desestabilizaban la interfase CH3/CH3. Puesto que las posiciones 397 y 409 de la IgG1 en el sistema de numeración EU son valina y lisina, 25 respectivamente, se preparó un anticuerpo IgG2 alterado que comprende la sustitución de la metionina por valina en

la posición 397 en el sistema de numeración EU (IgG2-M397V, SEQ ID NO: 16 (secuencia de aminoácidos)) y un anticuerpo IgG4 alterado que comprende la sustitución de arginina por lisina en la posición 409 en el sistema de numeración EU (IgG4-R409K, SEQ ID NO: 17 (secuencia de aminoácidos)).

Los métodos usados para construir vectores de expresión para los anticuerpos de interés, y expresión y purificación 30 de los anticuerpos, eran los mismos que los usados para la elución con ácido clorhídrico descrita antes. El análisis de cromatografía por filtración en gel se llevó a cabo para calcular el contenido de agregados en las muestras purificadas obtenidas por elución con ácido clorhídrico de la proteína A.

Método de evaluación de la agregación:

Sistema: Waters Alliance

35 Columna: G3000SWxl (TOSOH)

Fase móvil: fosfato sódico 50 mM, KCl 300 mM, pH 7,0

Caudal, longitud de onda: 0,5 ml/min, 220 nm

El resultado se muestra en la figura 1. Aunque el contenido de agregados en WT-IgG1 después de purificación era aproximadamente 2%, los de WT-IgG2 y WT-IgG4 después de purificación eran aproximadamente 25%. En cambio, 40 el contenido de agregados en variantes con el dominio CH3 alterado, IgG2-M397V y IgG4-R409K, era comparable (aproximadamente 2%) al de la IgG1. Este descubrimiento demuestra que la estabilidad de un anticuerpo IgG2 o IgG4 en condiciones ácidas se puede mejorar sustituyendo la metionina por valina de la IgG2 en la posición 397 en el sistema de numeración EU o la arginina por lisina de la IgG4 en la posición 409 en el sistema de numeración EU, respectivamente. Los anticuerpos purificados se dializaron contra una disolución de acetato sódico 20 mM, NaCl 150 45 mM, pH 6,0 (EasySEP, TOMY). La medición por DSC (mediciones de temperatura en el punto medio y valor de Tm) se llevó a cabo a una velocidad de calentamiento de 1°C/min de 40 a 100°C con una concentración de proteína de aproximadamente 0,1 mg/ml. Además, se determinaron las temperaturas del punto medio de la desnaturalización térmica de WT-IgG2, WT-IgG4, IgG2-M397V y IgG4-R409K. El resultado mostró que el valor de Tm para el dominio CH3 alterado era mayor en IgG2-M397V y IgG4-R409K comparado con WT-IgG2 y WT-IgG4, respectivamente. Esto 50 sugiere que IgG2-M397V y IgG4-R409K también son superiores en términos de estabilidad térmica comparados con WT-IgG2 y WT-IgG4, respectivamente.

La IgG2 e IgG4 se exponen a condiciones ácidas en el procedimiento de inactivación de virus y en el procedimiento de purificación usando proteína A. Por lo tanto, la desnaturalización/agregación en los procedimientos anteriores era problemática. Sin embargo, se descubrió que el problema se podía resolver usando IgG2-M397V y IgG4-R409K 55 para las secuencias de las regiones constantes de la IgG2 e IgG4. Además, la utilidad de IgG2-M397V y IgG4- R409K también se demostró por el descubrimiento de que eran superiores en estabilidad térmica.

Ejemplo 2. Mejora de la heterogeneidad derivada de los enlaces disulfuro en la IgG2 Purificación de WT-IgG1, WT-IgG2 y WT-IgG4 por elución con ácido acético de la proteína A

Se añadieron 50 jl de rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) suspendidos en TBS a los líquidos sobrenadantes de cultivo obtenidos en el ejemplo 1, y las disoluciones combinadas se mezclaron por 5 inversión a 4°C durante 4 horas o más. Las disoluciones se transfirieron a copas de filtro de 0,22 jm de Ultrafree®- MC (Millipore). Después de lavar 3 veces con 500 jl de TBS, las resinas rProtein A Sepharose™ se suspendieron en 100 jl de disolución acuosa de acetato sódico 50 mM (pH 3,3) y las mezclas se incubaron durante 2 minutos para eluir los anticuerpos. Inmediatamente, los eluatos se neutralizaron añadiendo 6,7 jl de Tris-HCl 1,5 M (pH 7,8). La elución se llevó a cabo dos veces, dando 200 jl de anticuerpos purificados.

10 Análisis por cromatografía de intercambio catiónico (IEC) de WT-IgG1, WT-IgG2 y WT-IgG4

Se analizó la homogeneidad de las WT-IgG1, WT-IgG2 y WT-IgG4 purificadas por cromatografía de intercambio catiónico.

Método de evaluación usando IEC:

Sistema: Waters Alliance

15 Columna: ProPac WCX-10 (Dionex)

Fase móvil A: MES-NaOH 25 mM, pH 6,1

B: MES-NaOH 25 mM, acetato Na 250 mM, pH 6,1

Caudal, longitud de onda: 0,5 ml/min, 280 nm

Gradiente B: 50%-75% (75 min) en el análisis de WT-IgG1

20 B: 30%-55% (75 min) en el análisis de WT-IgG2 y WT-IgG4

El resultado se muestra en la figura 2. La WT-IgG2 mostró más de un pico en el análisis de intercambio catiónico mientras que la WT-IgG1 y WT-IgG4 presentaron un solo pico. Esto sugiere que la molécula de IgG2 es más heterogénea comparada con la IgG2 e IgG4. Realmente, se ha descrito que los isotipos de IgG2 tienen heterogeneidad derivada de enlaces disulfuro en la región bisagra (documento de no patente 10). Por lo tanto, los 25 picos heterogéneos de la IgG2 mostrados en la figura 2 también se supone que son sustancia objetivo/sustancias relacionadas derivadas de los enlaces disulfuro. No es fácil fabricarlas como productos farmacéuticos a gran escala mientras se mantiene la heterogeneidad relacionada con sustancia objetivo/sustancias relacionadas entre producciones. Por lo tanto, son deseables sustancias homogéneas (menos heterogéneas) tanto como sea posible, para las moléculas de anticuerpos desarrolladas como productos farmacéuticos. Para la IgG2 de tipo natural hay un 30 problema de homogeneidad que es importante en el desarrollo de productos farmacéuticos de anticuerpos. Realmente, el documento USA20060194280 (A1) ha mostrado que la IgG2 natural da diferentes picos heterogéneos como resultado de los enlaces disulfuro en el análisis de cromatografía de intercambio iónico, y que la actividad biológica varía entre estos picos. El documento USA20060194280 (A1) describe el replegado en el procedimiento de purificación como un método para combinar los picos heterogéneos en uno solo, pero el uso de dicho procedimiento 35 en la producción es costoso y complicado. Por lo tanto, un método preferido para combinar los picos heterogéneos en uno solo se basa en las sustituciones de aminoácidos. Aunque la heterogeneidad originada en los enlaces disulfuro en la región bisagra debe superarse para desarrollar la IgG2 como productos farmacéuticos, no se ha publicado hasta la fecha ningún método para resolver este problema por la sustitución de aminoácidos.

Preparación y evaluación del dominio CH1 de WT-IgG2 y región bisagra

40 Como se muestra en la figura 3, hay diferentes patrones de enlaces disulfuro potenciales para una molécula de IgG2. Las posibles causas de la heterogeneidad derivada de la región bisagra de la IgG2 eran los diferentes patrones de enlaces disulfuro y cisteínas libres. La IgG2 tiene dos cisteínas (en las posiciones 219 y 220 en el sistema de numeración EU) en la región bisagra superior, y las cisteínas adyacentes a las dos cisteínas de la región bisagra superior incluyen la cisteína en la posición 131 en el sistema de numeración EU en el dominio CH1 de la 45 cadena H y la cisteína C-terminal de la cadena L, y dos cisteínas correspondientes en la región bisagra superior de la cadena H del patrón de dimerización. Específicamente, hay 8 cisteínas en total en la proximidad de la región bisagra superior de la IgG2 cuando el anticuerpo está en la forma asociada de H2L2. Esta puede ser la razón de los diferentes patrones heterogéneos debidos a enlaces disulfuro y cisteínas libres erróneos.

La secuencia de la región bisagra del dominio CH1 de la IgG2 se alteró para reducir la heterogeneidad originada en 50 la región bisagra de la IgG2. Se llevaron a cabo exámenes para evitar la heterogeneidad de la IgG2 debida al patrón diferencial de los enlaces disulfuro y cisteínas libres. El resultado de examinar diferentes anticuerpos alterados sugería que la heterogeneidad podría evitarse sin disminuir la estabilidad térmica sustituyendo la cisteína y la arginina por serina y lisina en las posiciones 131 y 133 en el sistema de numeración EU, respectivamente, en el

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50

dominio CH1 de la cadena H, y sustituyendo la cisteína por serina en la posición 219, numeración EU, en la región bisagra superior de la cadena H de la secuencia de la región constante de la IgG2 de tipo natural (en lo sucesivo IgG2-SKSC) (IgG2-SKSC, SEQ ID NO: 18). Estas sustituciones permitirían que IgG2-SKSC formara un enlace covalente homogéneo entre las cadenas H y L, que es un enlace disulfuro entre la cisteína C-terminal de la cadena L y la cisteína en la posición 220 en el sistema de numeración EU (Fig. 4).

Los métodos descritos en el ejemplo de referencia 1 se usaron para construir un vector de expresión para IgG2- SKSC y para expresar y purificar IgG2-SKSC. Se analizó la homogeneidad de la IgG2-SKSC purificada y la IgG2 de tipo natural (WT-IgG2) por cromatografía de intercambio catiónico.

Método de evaluación usando IEC:

Sistema: Waters Alliance

Columna: ProPac WCX-10 (Dionex)

Fase móvil A: MES-NaOH 25 mM, pH 5,6

B: MES-NaOH 25 mM, acetato Na 250 mM, pH 5,6

Caudal, longitud de onda: 0,5 ml/min, 280 nm

Gradiente B: 50%-100% (75 min)

El resultado se muestra en la figura 5. Como se esperaba antes, se mostró que la IgG2-SKSC era eluida con un solo pico, mientras que WT-IgG2 daba múltiples picos. Esto sugiere que la heterogeneidad derivada de enlaces disulfuro en la región bisagra de la IgG2 se puede evitar usando alteraciones tales como las usadas para generar IgG2- SKSC, lo que permite la formación de un solo enlace disulfuro entre la cisteína C-terminal de la cadena L y la cisteína en la posición 220 en el sistema de numeración EU. Las temperaturas del punto medio de la desnaturalización térmica de WT-IgG1, WT-IgG2 y IgG2-SKSC se determinaron por los mismos métodos descritos en el ejemplo 1. El resultado mostró que la WT-IgG2 daba un pico para el dominio Fab que tenía un valor de Tm menor que WT-IgG1, mientras que IgG2-SKSC no daba dicho pico. Esto sugiere que IgG2-SKSC también es superior en estabilidad térmica comparada con WT-IgG2.

Aunque se creía que la IgG2 de tipo natural tenía un problema de homogeneidad que es importante en el desarrollo de productos farmacéuticos de anticuerpos, se encontró que este problema se podía resolver usando IgG2-SKSC para la secuencia de la región constante de la IgG2. Por lo tanto, IgG2-SKSC es muy útil en el desarrollo de productos farmacéuticos de anticuerpos de IgG2. Además, la utilidad de la IgG2-SKSC también se demostró encontrando que era superior en estabilidad térmica.

Ejemplo 3. Mejora de la heterogeneidad C-terminal en moléculas de IgG

Construcción de un vector de expresión para el anticuerpo de cadena H C-terminal AGK a partir de WT-IgG1

Para la heterogeneidad de las secuencias C-terminales de un anticuerpo, se ha descrito la eliminación del resto de aminoácido C-terminal lisina y la amidación del grupo amino C-terminal debido a la eliminación de ambos de los dos aminoácidos C-terminales, glicina y lisina (documento de no patente 12). Se prefiere la ausencia de dicha heterogeneidad cuando se desarrollan productos farmacéuticos de anticuerpos. De hecho, en el anticuerpo PM-1 humanizado TOCILIZUMAB, el componente principal de la secuencia que carece del aminoácido C-terminal lisina, que es codificado por la secuencia de nucleótidos pero eliminado en la modificación postranscripcional, y el componente minoritario que tiene la lisina, también coexisten como heterogeneidad. Específicamente, los autores de la presente invención alteraron la secuencia de nucleótidos de la IgG1 de tipo natural para eliminar la lisina y glicina C-terminales de la región constante de la cadena H de la IgG1, y evaluaron si la amidación del grupo amino C- terminal se podía suprimir eliminando los dos aminoácidos C-terminales glicina y lisina.

Se introdujeron mutaciones en la secuencia C-terminal de la cadena H usando el vector pB-CH que codifica el anticuerpo PM-1 humanizado (WT) obtenido en el ejemplo de referencia 1. La secuencia de nucleótidos que codifica la Lys en la posición 447 y/o la Gly en la posición 446 en el sistema de numeración EU, se convirtió en un codón de parada introduciendo una mutación usando el kit QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene), de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Por lo tanto, se construyeron los vectores de expresión para el anticuerpo diseñado para carecer del aminoácido C-terminal lisina (posición 447 en el sistema de numeración EU) y el anticuerpo diseñado para carecer de los dos aminoácidos C-terminales glicina y lisina (posiciones 446 y 447 en el sistema de numeración EU, respectivamente). Los anticuerpos de cadena H C-terminal Ak y AGK se obtuvieron expresando las cadenas H diseñadas y la cadena L del anticuerpo PM-1 humanizado. Los anticuerpos se expresaron y purificaron por el método descrito en el ejemplo de referencia 1.

El anticuerpo de cadena H C-terminal AGK purificado se analizó por cromatografía de intercambio catiónico de acuerdo con el siguiente procedimiento. El efecto de la eliminación C-terminal en la heterogeneidad se evaluó por análisis por cromatografía de intercambio catiónico usando el anticuerpo de cadena H C-terminal AGK purificado de

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acuerdo con el método descrito a continuación. Las condiciones del análisis por cromatografía de intercambio catiónico se describen a continuación. Se compararon los cromatogramas para el anticuerpo PM-1 humanizado, anticuerpo de cadena H C-terminal AKy anticuerpo de cadena H C-terminal AGK.

Columna: ProPac WCX-10 (Dionex)

Fase móvil A: MES/NaOH 25 mmol/l, pH 6,1

B: MES/NaOH 25 mmol/l, NaCl 250 mmol/l, pH 6,1

Caudal: 0,5 ml/min

Gradiente B: 25% de B (5 min) -> (105 min) -> 67% de B -> (1 min) -> 100% B (5 min)

Detección: 280 nm

El resultado del análisis para el anticuerpo PM-1 humanizado no alterado, anticuerpo de cadena H C-terminal AK y anticuerpo de cadena H C-terminal AGK, se muestra en la figura 6. De acuerdo con el documento de no patente 10, un pico básico con tiempo de retención más prolongado que el del pico principal contiene un extremo C de cadena H con Lys en la posición 449 y un extremo C de cadena H con Pro aminada en la posición 447. La intensidad del pico básico era significativamente menor en el anticuerpo de cadena H C-terminal AGK, mientras que no se observó reducción significativa en el anticuerpo de cadena H C-terminal AK. Esto sugiere que la heterogeneidad C-terminal de la cadena H se puede reducir solo cuando los dos aminoácidos C-terminales se eliminan de la cadena H.

La temperatura de la desnaturalización térmica del anticuerpo de cadena H C-terminal AGK se determinó por DSC para evaluar el efecto de la eliminación de los dos restos del extremo C de la cadena H en la estabilidad térmica. Para la medición por DSC, el anticuerpo se dializó contra tampón de ácido acético 20 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 150 mM para cambiar el tampón. Después de desaireación completa, las disoluciones del anticuerpo PM-1 humanizado y el anticuerpo de cadena H C-terminal AGK, y la disolución de referencia (dializado exterior) se encerraron en celdas calorimétricas, y se equilibraron térmicamente completamente a 40°C. Después, se hizo el barrido de las muestras de 40 a 100°C con una velocidad de aproximadamente 1 K/min. Se asignaron los picos de desnaturalización resultante (Rodolfo et al., Immunology Letters, 1999, pág. 47-52). El resultado mostraba que la eliminación C-terminal no tenía efecto en la temperatura de desnaturalización térmica del dominio CH3.

Por lo tanto, la heterogeneidad originada del aminoácido C-terminal se puede reducir sin afectar a la estabilidad térmica del anticuerpo, eliminando la lisina y glicina C-terminales de la región constante de la cadena H a nivel de secuencia de nucleótidos. Puesto que todas las regiones constantes de los anticuerpos humanos IgG1, IgG2 e IgG4 contienen Gly y Lys en las posiciones 446 y 447 en el sistema de numeración EU en sus secuencias C-terminales, el método de reducción de la heterogeneidad de aminoácidos C-terminales descubierto en este ejemplo y otros, se espera que también sea aplicable a las regiones constantes de la IgG2 e IgG4.

Ejemplo 4. Construcción de M14AGK con una nueva secuencia de región constante optimizada

Cuando un producto farmacéutico de anticuerpo está dirigido a neutralizar un antígeno, funciones efectoras tales como la ADCC del dominio Fc son innecesarias, y por lo tanto la unión al receptor Fcy es innecesaria. Se supone que la unión al receptor Fcy no es favorable desde la perspectiva de la inmunogenicidad y los efectos adversos (documentos de no patente 5 y 6). El anticuerpo IgG1 anti-receptor de IL-6 TOCILIZUMAB no necesita unirse al receptor Fcy, porque solo necesita unirse específicamente al receptor de IL-6 y neutralizar su actividad biológica con el fin de ser usado como un agente terapéutico para enfermedades asociadas con la IL-6, tales como la artritis reumatoide.

Construcción y evaluación de M14AGK, M11AGK y M17AGK, regiones constantes optimizadas, que no se unen al receptor Fcy

Un posible método para deteriorar la unión al receptor Fcy es convertir el anticuerpo IgG del isotipo IgG1 al isotipo IgG2 o IgG4 (Ann. Hematol., junio 1998;76(6):231-48). Como método para eliminar completamente la unión al receptor Fcy, se ha descrito un método de introducción de una alteración artificial en el dominio Fc. Por ejemplo, puesto que las funciones efectoras del anticuerpo anti-CD3 y anticuerpo anti-CD4 producen efectos adversos, se han introducido mutaciones de aminoácidos que no están presentes en la secuencia de tipo natural, en la región de unión al receptor Fcy del dominio Fc (documentos de no patente 3 y 7), y los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD4 que no se unen al receptor Fcy resultantes están actualmente en ensayos clínicos (documentos de no patentes 5 y 8). De acuerdo con otro informe (documento de patente 3), los anticuerpos que no se unen al receptor Fcy se pueden preparar convirtiendo el dominio de unión al FcyR de la IgG1 (en las posiciones 233,234, 235, 236, 327, 330 y 331 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de la IgG2 (en las posiciones 233,234, 235 y 236 en el sistema de numeración EU) o la IgG4 (en las posiciones 327, 330 y 331 en el sistema de numeración EU). Sin embargo, si todas las mutaciones anteriores se introducen en la IgG1, se generarán nuevas secuencias de péptidos de nueve aminoácidos, que sirven potencialmente como péptidos de epítopos de linfocitos T no naturales, y esto aumenta el riesgo de inmunogenicidad. El riesgo de inmunogenicidad debería minimizarse en el desarrollo de productos

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farmacéuticos de anticuerpos.

Para superar el problema anterior, se consideraron alteraciones en la región constante de la IgG2. El dominio de unión al FcyR de la región constante de IgG2, restos en las posiciones 327, 330 y 331 en el sistema de numeración EU, es diferente de la secuencia de no unión de la IgG4 mientras que los de las posiciones 233,234, 235 y 236 en el sistema de numeración EU, son aminoácidos de tipo no unión. Por lo tanto, es necesario alterar los aminoácidos en las posiciones 327, 330 y 331 en el sistema de numeración EU, a la secuencia de la IgG4 (G2Aa descrito en Eur. J. Immunol., agosto 1999;29(8):2613-24). Sin embargo, puesto que el aminoácido en la posición 339 en el sistema de numeración EU en la IgG4 es alanina mientras que el correspondiente resto en la IgG2 es treonina, una simple alteración de los aminoácidos en las posiciones 327, 330 y 331 en el sistema de numeración EU a la secuencia de la IgG4, genera de modo desfavorable una nueva secuencia peptídica de 9 aminoácidos, que sirve potencialmente como un péptido epítopo de linfocitos T no naturales, y por lo tanto aumenta el riesgo de inmunogenicidad. Entonces, los autores de la invención encontraron que la generación de la nueva secuencia de péptido se podía prevenir introduciendo la sustitución de treonina por alanina en la posición 339 en el sistema de numeración EU en la IgG2, además de la alteración descrita antes.

Además de las mutaciones descritas antes, se introdujeron otras mutaciones, y eran la sustitución de metionina por valina en la posición 397 en el sistema de numeración EU, que se descubrió en el ejemplo 1 para mejorar la estabilidad de la IgG2 en condiciones ácidas; y la sustitución de cisteína por serina en la posición 131 en el sistema de numeración EU, la sustitución de arginina por lisina en la posición 133 en el sistema de numeración EU, y la sustitución de cisteína por serina en la posición 219 en el sistema de numeración EU, que se descubrieron en el ejemplo 2, para mejorar la heterogeneidad originada en los enlaces disulfuro en la región bisagra. Además, puesto que las mutaciones en las posiciones 131 y 133 generan una nueva secuencia de péptido de 9 aminoácidos, que sirve potencialmente como un péptido epítopo de linfocitos T no naturales, y por lo tanto genera el riesgo de inmunogenicidad, la secuencia peptídica alrededor de las posiciones 131 a 139 se convirtió en una secuencia humana natural introduciendo la sustitución del ácido glutámico por glicina en la posición 137 en el sistema de numeración EU y la sustitución de serina por glicina en la posición 138 en el sistema de numeración EU. Además, la glicina y lisina en las posiciones 446 y 447 en el sistema de numeración EU se eliminaron del extremo C de la cadena H para reducir la heterogeneidad C-terminal. La secuencia de la región constante que tiene todas las mutaciones introducidas se denominó M14AGK (M14AGK, SEQ ID NO: 5). Aunque hay una mutación de cisteína en la posición 219 a serina en M14AGK como nueva secuencia peptídica de 9 aminoácidos que sirve potencialmente como un péptido epítopo de linfocitos T, el riesgo de inmunogenicidad se consideró que era muy bajo, puesto que la propiedad del aminoácido serina es similar al de la cisteína. La predicción de inmunogenicidad por TEPlToPE también sugería que no había diferencia de inmunogenicidad.

Se construyó un vector de expresión para la secuencia de la cadena H del anticuerpo cuya región variable era de tipo natural y la región constante era M14AGK (M14AGK, SEQ ID NO: 5; WT-M14AGK, SEQ ID NO: 19) por el método descrito en el ejemplo de referencia 1. Un anticuerpo que tenía WT-M14AGK como cadena H y el tipo natural como cadena L, se expresó y purificó por el método descrito en el ejemplo de referencia 1.

Además, en WT-M11AGK (M11AGK, SEQ ID NO: 8; WT-M11AGK, SEQ ID NO: 21), se introdujeron mutaciones con el mismo método en la región constante de la IgG4 en las posiciones 233, 234, 235 y 236 en el sistema de numeración EU (G4Ab descrito en Eur. J. Immunol., agosto 1999; 29(8):2613-24; esta alteración genera nuevas secuencias no humanas y por lo tanto aumenta el riesgo de inmunogenicidad) para reducir la unión al receptor Fcy. Además de la alteración anterior, para reducir el riesgo de inmunogenicidad, se introdujeron mutaciones en las posiciones 131, 133, 137, 138, 214, 217, 219, 220, 221 y 222 en el sistema de numeración EU, de modo que el patrón de enlaces disulfuro en la región bisagra era el mismo que el de M14AGK; se introdujo una mutación en la posición 409 en el sistema de numeración EU (ejemplo 1) para mejorar la estabilidad en condiciones ácidas; y se eliminaron los aminoácidos en las posiciones 446 y 447 en el sistema de numeración EU (ejemplo 3) para reducir la heterogeneidad C-terminal.

Además, se construyeron WT-M17AGK (M17AGK, SEQ ID NO: 10; WT-M17AGK, SEQ ID NO: 20) introduciendo mutaciones en la región constante de la IgG1 en las posiciones 233, 234, 235, 236, 327, 330, 331 y 339 en el sistema de numeración EU (G1Aab descrito en Eur. J. Immunol., agosto 1999; 29(8):2613-24) para dificultar la unión al receptor Fcy y eliminando los aminoácidos en las posiciones 446 y 447 en el sistema de numeración EU para reducir la heterogeneidad C-terminal (ejemplo 3).

Se usaron WT-M17AGK o WT-M11AGK como la cadena H y se usó el tipo natural como cadena L. Estos anticuerpos se expresaron y purificaron por el método descrito en el ejemplo 1.

Evaluación de WT-M14AGK, WT-M17AGKy WT-M11AGK para la unión al receptor Fcy

La unión al FcyRI se evaluó por el procedimiento descrito a continuación. Usando Biacore T100, el receptor de Fcy I de tipo humano (en lo sucesivo FcyRI) inmovilizado sobre un chip sensor se dejó que interaccionara con IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGK o M1AGK 7 como analito. Se compararon las cantidades de anticuerpo unido. Las mediciones se llevaron a cabo usando FcRIA/CD64 (R&D systems) recombinante humano como FcyRI de tipo humano, e IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGK y M17AGK como muestras. El FcyRI se inmovilizó sobre el chip

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sensor CM5 (BIACORE) por el método de acoplamiento de aminas. La cantidad final de hFcYRI inmovilizado era aproximadamente 13000 RU. El tampón de ejecución usado era HBS-EP+, y el caudal era 20 pl/min. La concentración de muestra se ajustó a 100 pg/ml usando HBS-EP+. El análisis incluía dos etapas: 2 minutos de fase de asociación donde se inyectaron 10 pl de una disolución de anticuerpo y los 4 minutos posteriores de fase de disociación donde la inyección se cambió por HBS-EP+. Después de la fase de disociación, el chip sensor se regeneró por inyección de 20 pl de hidróxido sódico 5 mM. La asociación, disociación y regeneración constituyen un ciclo de análisis. Se inyectaron diferentes disoluciones de anticuerpo para obtener sensogramas. Como analitos se inyectaron IgG4, IgG2, IgG1, M11, M14 y M17, en este orden. Esta serie de inyecciones se repitió dos veces. El resultado de comparación de datos de las cantidades determinadas de anticuerpo unido se muestra en la figura 7. La comparación muestra que la cantidad de anticuerpo unido se reduce en el orden: IgG1 > IgG4 >> TgG2 = M11AGK = M14AGK = M17AGK. Por lo tanto, se puso de manifiesto que la unión al FcyRI de la IgG2 de tipo natural, M11AGK, M14AGK, y M17AGK era más débil que la de la IgG1 e IgG4 de tipo natural.

La unión al FcYRIIa se evaluó por el procedimiento descrito a continuación. Usando Biacore T100, el receptor Fcy IIa de tipo humano (en lo sucesivo FcYRIIa) inmovilizado sobre un chip sensor se dejó que interaccionara con IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGK o Ml7AGK como analito. Se compararon las cantidades de anticuerpo unido. Las mediciones se llevaron a cabo usando FcRIIA/CD32a recombinante humano (R&D systems) como FcYRIIa de tipo humano, e IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGKy M17AGK como muestras. El FcYRIIa se inmovilizó sobre el chip sensor CM5 (BIACORE) por el método de acoplamiento de aminas. La cantidad final de FcYRIIa inmovilizado era aproximadamente 3300 UR. El tampón de ejecución usado era HBS-EP+, y el caudal era 20 pl/min. Después, el tampón de ejecución se inyectó hasta que se estabilizó el valor base. La medición se llevó a cabo después de que se estabilizara el valor base. El FcYRIIa inmovilizado se dejó que interaccionara con un anticuerpo de cada isotipo de IgG(IgG1, IgG2 o IgG4) o anticuerpo introducido con mutaciones (M11AGK, M14AGK o M17aGk) como analito. Se observó la cantidad de anticuerpo unido. El tampón de ejecución usado era HBS-EP+, y el caudal era 20 pl/min. La temperatura de medición era 25°C. La concentración de cada IgG o forma alterada de la misma se ajustó a 100 pg/ml. Se inyectaron 20 pl de un analito y se dejaron interaccionar con el FcYRIIa inmovilizado. Después de interacción, el analito se disoció del FcYRIIa y el chip sensor se regeneró inyectando 200 pl de tampón de ejecución. Como analitos, se inyectaron IgG4, IgG2, IgG1, M11AGK, M14AGK y M17AGK, en este orden. Esta serie de inyecciones se repitió dos veces. El resultado de comparación de datos de las cantidades determinadas de anticuerpo unido se muestra en la figura 8. La comparación muestra que la cantidad de anticuerpo unido se reduce en el orden: IgG1 > IgG2 = IgG4 > M11AGK = M14AGK = M17AGK. Por lo tanto, se puso de manifiesto que la unión al FcYRIIa de M11AGK, M14AGK, y M17AGKera más débil que la de las IgG1, IgG2, e IgG4 de tipo natural.

La unión al FcYRIIb se evaluó por el procedimiento descrito a continuación. Usando Biacore T100, el receptor Fcy IIb de tipo humano (en lo sucesivo FcYRIIb) inmovilizado sobre un chip sensor se dejó que interaccionara con IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGK o M17AGK como analito. Se compararon las cantidades de anticuerpo unido. Las mediciones se llevaron a cabo usando FcRIIB/C recombinante humano (R&D systems) como FcYRIIb de tipo humano, e IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGKy M17AGK como muestras. El FcYRIIb se inmovilizó sobre el chip sensor CM5 (BIACORE) por el método de acoplamiento de aminas. La cantidad final de FcYRIIb inmovilizado era aproximadamente 4300 UR. Después, se inyectó el tampón de ejecución hasta que se estabilizó el valor base. La medición se llevó a cabo después de que se estabilizara el valor base. El FcYRIIb inmovilizado se dejó que interaccionara con un anticuerpo de cada isotipo de IgG (IgG1, IgG2 o IgG4) o anticuerpo introducido con mutaciones (M11AGK, M14AGK o M17AGK) como analito. Se observó la cantidad de anticuerpo unido. El tampón de ejecución usado era HBS-EP+, y el caudal era 20 pl/min. La temperatura de medición era 25°C. La concentración de cada IgG o forma alterada de la misma se ajustó a 200 pg/ml. Se inyectaron 20 pl de un analito y se dejaron interaccionar con el FcYRIIb inmovilizado. Después de interacción, el analito se disoció del FcYRIIb y el chip sensor se regeneró inyectando 200 pl de tampón de ejecución. Como analitos, se inyectaron IgG4, IgG2, IgG1, M11AGK, M14AGK y M17AGK, en este orden. Esta serie de inyecciones se repitió dos veces. El resultado de comparación de datos de las cantidades determinadas de anticuerpo unido se muestra en la figura 9. La comparación muestra que la cantidad de anticuerpo unido se reduce en el orden: IgG4 > IgG1 > IgG2 > M11AGK = M14AGK = M17AGK. Por lo tanto, se puso de manifiesto que la unión al FcYRIIb de M11AGK, M14AGK y M17AGK era más débil que la de las IgG1, IgG2 e IgG4, de tipo natural.

La unión al FcYRIIIa se evaluó por el procedimiento descrito a continuación. Usando Biacore T100, el receptor Fcy IIIa de tipo humano (en lo sucesivo FcYRIIIa) inmovilizado sobre un chip sensor se dejó que interaccionara con IgG1, IgG2, IgG4, M11AGK, M14AGK o M17AGK como analito. Se compararon las cantidades de anticuerpo unido. Las mediciones se llevaron a cabo usando hFcYRIIIaV-His6 (hFcYRIIIaV-His6 recombinante preparado en la empresa de los autores de la invención) como FcYRIIIa de tipo humano, e IgG1, IgG2, IgG4, M11aGk, M14AGK y M17AGK como muestras. El FcYRIIIa se inmovilizó sobre el chip sensor CM5 (BIACORE) por el método de acoplamiento de aminas. La cantidad final de hFcYRIIIaV-His6 inmovilizado era aproximadamente 8200 UR. El tampón de ejecución usado era HBS-EP+, y el caudal era 5 pl/min. La concentración de la muestra se ajustó a 250 pg/ml usando HBS- EP+. El análisis incluía dos etapas: dos minutos de fase de asociación donde se inyectaron 10 pl de una disolución de anticuerpo y los posteriores 4 minutos de fase de disociación donde la inyección se cambió a HBS-EP+. Después de la fase de disociación, el chip sensor se regeneró inyectando 20 pl de ácido clorhídrico 5 mM. La asociación, disociación y regeneración constituyen un ciclo de análisis. Se inyectaron diferentes disoluciones de anticuerpo para obtener sensogramas. Como analitos se inyectaron IgG4, IgG2, IgG1, M11AGK, M14AGK y M17AGK, en este

orden. El resultado de comparación de datos de las cantidades determinadas de anticuerpo unido se muestra en la figura 10. La comparación muestra que la cantidad de anticuerpo unido se reduce en el orden: IgG1 >> IgG4 > IgG2 > M17AGK > M11AGK = M14AGK. Por lo tanto, se puso de manifiesto que la unión al FcYRIIIa de M11AGK, M14AGK y M17AGK era más débil que la de las IgG1, IgG2 e IgG4 de tipo natural. Además, se encontró que la 5 unión al FcYRIIIa de M11AGK y M14AGK era más débil que la de M17AGK que contenía la mutación G1Aab descrita en Eur. J. Immunol., agosto 1999;29(8):2613-24.

El descubrimiento descrito antes demuestra que la unión al receptor Fcy de M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK se reduce notablemente comparado con la IgG1 de tipo natural. El riesgo de inmunogenicidad debido a la internalización mediada por el receptor Fcy en APC y los efectos adversos causados por la función efectora tal como 10 la ADCC, se pueden evitar usando WT-M14AGK, WT-M17AGK o WT-M11AGK como una región constante. Por lo tanto, WT-M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK son útiles como la secuencia de la región constante de productos farmacéuticos de anticuerpos dirigidos a neutralizar antígenos.

Evaluación de la estabilidad de WT-M14AGK, WT-M17AGKy WT-M11AGK a altas concentraciones

Se evaluó la estabilidad de WT-M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK a altas concentraciones. Los anticuerpos 15 purificados deWT-IgG1, WT-M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK se dializaron contra una disolución de cloruro de histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5 (EasySEP, TOMY) y después se concentraron mediante ultrafiltros. Se ensayó la estabilidad de los anticuerpos a altas concentraciones. Las condiciones eran las siguientes.

Anticuerpos: WT-IgG1, WT-M14AGK, WT-M17AGK y WT-M11AGK

Tampón: cloruro de histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,5

20 Concentración: 61 mg/ml

Temperatura de almacenamiento y periodo de tiempo: 40°C durante dos semanas, 40°C durante un mes, 40°C durante dos meses.

Método de evaluación de la agregación:

Sistema: Waters Alliance 25 Columna: G3000SWxl (TOSOH)

Fase móvil: fosfato sódico 50 mM, KCl 300 mM, pH 7,0 Caudal, longitud de onda: 0,5 ml/min, 220 nm Se analizaron muestras diluidas 100 veces

El contenido de agregados en las formulaciones iniciales (inmediatamente después de la preparación) y las 30 formulaciones almacenadas en diferentes condiciones, se calcularon por cromatografía de filtración en gel descrita antes. Las diferencias (aumento de cantidades) de contenido de agregados con respecto a las formulaciones iniciales se muestran en la figura 11. El resultado mostró que las cantidades de agregados en WT-M14AGK, WT- M17AGK y WT-M11AGK aumentaban solo ligeramente comparado con la WT-IgG1 y eran aproximadamente la mitad del contenido en el tipo natural. Además, como se muestra en la figura 12, el aumento de la cantidad de

35 fragmento Fab era comparable entre WT-IgG1 y WT-M17AGK, mientras que el aumento de cantidad en WT-

M14AGK y WT-M11AGK eran aproximadamente una cuarta parte que la cantidad en el tipo natural. Las rutas de degeneración de las formulaciones de anticuerpos de tipo IgG incluyen la formación de agregados y la generación de Fab degradado como se describe en el documento WO 2003/039485. Basándose en los dos criterios, la agregación y la generación de fragmentos Fab, se demostró que WT-M14AGK y WT-M11AGK tenían estabilidad 40 superior en formulaciones comparado con la WT-IgG1. Por lo tanto, incluso para anticuerpos que tienen una región constante de IgG1 con poca estabilidad y no se podrían preparar como productos farmacéuticos de anticuerpos en formulaciones líquidas de alta concentración, se esperaba que el uso de WT-M14AGK, WT-M17AGK o WT-M11AGK como una región constante permitiera la producción de formulaciones líquidas de alta concentración estables.

En particular, se esperaba que M14AGK fuera muy útil como una nueva secuencia de la región constante que (1) 45 superara la inestabilidad de la molécula de IgG2 original en condiciones ácidas; (2) mejorara la heterogeneidad

originada en los enlaces disulfuro en la región bisagra; (3) no se uniera al receptor FcY; (4) tuviera un número

minimizado de nuevas secuencias de péptidos de 9 aminoácidos que sirvieran potencialmente como péptidos epítopos de linfocitos T; y (5) tuviera una mejor estabilidad que la IgG1 en formulaciones de alta concentración.

Ejemplo 5. Preparación y evaluación de M31AGK

50 M14AGK preparada en el ejemplo 4 se alteró sustituyendo en la secuencia de IgG2 los aminoácidos en las posiciones 330, 331 y 339 en el sistema de numeración EU para construir M31AGK (M31AGK, SEQ ID NO: 7). Se construyó un vector de expresión para una secuencia de la cadena H de anticuerpo cuya región variable es WT y

secuencia de la región constante es M31AGK (WT-M31AGK, SEQ ID NO: 22) por el método descrito en el ejemplo de referencia 1. Usando la cadena H WT-M31AGK y la cadena L WT, se expresó y purificó WT-M31AGK por el método descrito en el ejemplo de referencia 1.

Además de WT-M31AGK, se expresaron y purificaron WT-IgG2 y WT-M14AGK al mismo tiempo, y se analizaron por 5 cromatografía de intercambio catiónico por el procedimiento descrito a continuación. Las condiciones usadas en el análisis de cromatografía de intercambio catiónico eran las siguientes. Se compararon los cromatogramas para WT- IgG2, WT-M14AGK y WT-M31AGK.

Columna: ProPac WCX-10 (Dionex)

Fase móvil: A: MES/NaOH 25 mmol/l, pH 6,1

10 B: MES/NaOH 25 mmol/l, NaCl 250 mmol/l, pH 6,1

Caudal: 0,5 ml/min

Gradiente: 0% de B (5 min) -> (65 min) -> 100% de B -> (1 min)

Detección: 280 nm

El resultado del análisis para WT-IgG2, WT-M14AGK y WT-M31AGK se muestra en la figura 13. Como WT- 15 M14AGK, se demostró que WT-M31AGK era eluida como un solo pico, mientras que WT-IgG2 daba múltiples picos. Esto indica que la heterogeneidad derivada de los enlaces disulfuro en la región bisagra de la IgG2 también se puede evitar en WT-M31AGK.

Ejemplo 6. Evaluación de la retención en el plasma de WT-M14 Método para calcular la retención en el plasma humano

20 Se sabe que la retención prolongada (eliminación lenta) de la molécula de IgG en el plasma se debe a la función de FcRn que se conoce como receptor de rescate de la molécula de IgG (Nat. Rev. Immunol., Sep 2007;7(9):715-25). Cuando son absorbidas en los endosomas por pinocitosis, en condiciones ácidas dentro del endosoma (aproximadamente pH 6,0), las moléculas de IgG se unen al FcRn expresado en los endosomas. Mientras que las moléculas de IgG que no se unen al FcRn son transferidas y degradas en los lisosomas, las unidas al FcRn son 25 translocadas a la superficie celular y después liberadas de nuevo del FcRn al plasma en las condiciones neutras en el plasma (aproximadamente pH 7,4).

Los anticuerpos de tipo IgG conocidos incluyen los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las semividas en el plasma de estos isotipos en el ser humano se ha descrito que son aproximadamente 36 días para la IgG1 y IgG2; aproximadamente 29 días para la IgG3; y 16 días para la IgG4 (Nat. Biotechnol., dic 2007; 25(12):1369-72). Por lo 30 tanto, se cree que la retención en el plasma de la IgG1 e IgG2 es la más larga. En general, los isotipos de anticuerpos usados como agentes farmacéuticos son IgG1, IgG2 e IgG4. Los métodos descritos para mejorar más la farmacocinética de estos anticuerpos IgG incluyen métodos para mejorar la unión descrita antes al FcRn humano, y esto se logra alterando la secuencia de la región constante de IgG (J. Biol. Chem., 19 de enero 2007;282(3):1709- 17; J. Immunol., 1 de enero 2006;176(1):346-56).

35 Hay diferencias específicas de especie entre el FcRn de ratón y el FcRn humano (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 5 dic 2006;103(49):18709-14). Por lo tanto, para predecir la retención en el plasma de los anticuerpos IgG que tienen una secuencia de la región constante alterada en seres humanos, es conveniente evaluar la unión al FcRn humano y la retención en el plasma en ratones transgénicos con FcRn humano (Int. Immunol., dic 2006; 18(12):1759-69).

Evaluación de la unión al FcRn humano

40 El FcRn es un complejo de FcRn y microglobulina 132. Se prepararon cebadores oligo-ADN basados en la secuencia descrita del gen de FcRn humano (J. Exp. Med. (1994) 180 (6), 2377-2381). Se preparó un fragmento de ADN que codifica el gen entero por PCR usando ADNc humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como molde y los cebadores preparados. Usando el fragmento de ADN obtenido como molde, se amplificó un fragmento de ADN que codifica el dominio extracelular que contiene la región señal (Metl-Leu290) por PCR, y se insertó en un 45 vector de expresión de célula animal (la secuencia de aminoácidos del FcRn humano expuesta en la SEQ ID NO: 24). De la misma forma, se prepararon cebadores oligo-ADN basándose en la secuencia descrita del gen de 32- microglobulina humana (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2002) 99 (26), 16899-16903). Se preparó un fragmento de ADN que codifica el gen entero por PCR usando ADNc humano (Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) como molde y los cebadores preparados. Usando el fragmento de ADN obtenido como molde, se amplificó un fragmento 50 de ADN que codifica la 32-microglobulina entera que contiene la región señal (Met1-Leu119) por PCR, y se insertó en un vector de expresión de célula animal (la secuencia de aminoácidos de la 32-microglobulina humana expuesta en la SEQ ID NO: 25).

El FcRn humano se expresó por el siguiente procedimiento. Los plásmidos construidos para el FcRn humano y la

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132-microglobulina se introdujeron en células de la línea celular obtenida de cáncer renal embrionario HEK293H (Invitrogen) usando suero bovino fetal al 10% (Invitrogen) por lipofección. El líquido sobrenadante del cultivo resultante se recogió y el FcRn se purificó usando IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) por el método descrito en J. Immunol., 1 nov 2002; 169(9):5171-80, seguido de purificación adicional usando HiTrap Q HP (GE Healthcare).

La unión al FcRn humano se evaluó usando Biacore 3000. Se unió un anticuerpo a la proteína L o anticuerpo de conejo anti-cadena kappa de IgG humana inmovilizado sobre un chip sensor, se añadió FcRn humano como analito para la interacción con el anticuerpo, y se calculó la afinidad (KD) a partir de la cantidad de FcRn humano unido. Específicamente, la proteína L o anticuerpo de conejo anti-cadena kappa de IgG humana se inmovilizó sobre el chip sensor CM5 (BIACORE) por el método de acoplamiento de amina usando tampón de fosfato Na 50 mM (pH 6,0) que contenía NaCl 150 mM como tampón de ejecución. Después, se diluyó un anticuerpo con un tampón de ejecución que contenía Tween20 al 0,02% y se inyectó para unirlo al chip. Después, se inyectó el FcRn humano y se evaluó la unión del FcRn humano al anticuerpo.

La afinidad se calculó usando el programa BIAevaluation. El sensograma obtenido se usó para calcular la cantidad de FcRn unido al anticuerpo inmediatamente antes del final de la inyección del FcRn humano. La afinidad del anticuerpo por el FcRn humano se calculó por ajuste con el método de afinidad de estado de equilibrio.

Evaluación de la retención en el plasma en ratones transgénicos con FcRn humano

La farmacocinética en ratones transgénicos con FcRn humano (ratones Tg línea 276 +/+ B6.mFcRn-/-.hFcRn; Jackson Laboratories) se evaluó por el siguiente procedimiento. Se administró un anticuerpo por vía intravenosa una vez con una dosis de 1 mg/kg a los ratones, y se recogió sangre en los tiempos de medición adecuados. La sangre recogida se centrifugó inmediatamente a 15.000 rpm y 4°C durante 15 min para obtener el plasma sanguíneo. El plasma separado se almacenó en un refrigerador a -20°C o menos hasta su uso. La concentración plasmática se determinó por ELISA.

Evaluación predictiva de la retención en el plasma de WT-M14 en seres humanos

La unión de WT-IgG1 y WT-M14 al FcRn humano se evaluó por BIAcore. Como se muestra en la tabla 1, el resultado indicaba que la unión de WT-M14 era ligeramente mayor que la de WT-IgG1.

Tabla 1

KD (|JM)

WT-IgG1

2,07

WT-M14

1,85

Sin embargo, como se muestra en la figura 14, la retención en el plasma era comparable entre la WT-IgG1 y WT- M14 cuando se evaluó usando ratones transgénicos con FcRn humano. Este descubrimiento sugiere que la retención en el plasma de la región constante M14 en seres humanos es comparable a la de la región constante de IgG1.

Ejemplo 7. Preparación de WT-M44, WT-M58 y WT-M73 que tienen mejor farmacocinética Preparación de la molécula de WT-M58

Como se describe en el ejemplo 6, la retención en el plasma de WT-M14 en ratones transgénicos con FcRn humano era comparable a la de WT-IgG1. Los métodos conocidos para mejorar la farmacocinética incluyen aquellos para bajar el punto isoeléctrico de un anticuerpo y aquellos que potencian la unión al FcRn. Aquí, se introdujeron las modificaciones descritas a continuación para mejorar la farmacocinética de WT-M14. Específicamente, se introdujeron las siguientes sustituciones en WT-M31AGK, que se preparó a partir de WT-M14 como se describe en el ejemplo 4: sustitución de valina por metionina en la posición 397; sustitución de histidina por glutamina en la posición 268; sustitución de arginina por glutamina en la posición 355; y sustitución de glutamina por ácido glutámico en la posición 419 en el sistema de numeración EU. Estas cuatro sustituciones se introdujeron en WT-M31AGK para generar WT-M58 (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26). Los vectores de expresión se prepararon por el mismo método descrito en el ejemplo 1. Se usaron WT-M58 y L(WT) como la cadena H y la cadena L, respectivamente. WT-M58 se expresó y purificó por el método descrito en el ejemplo 1.

Construcción de la molécula WT-M73

Por otra parte, WT-M44 (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27) se generó introduciendo en la IgG1 una sustitución por alanina del aminoácido en la posición 434, numeración EU. WT-M83 (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58) también se generó por eliminaciones de la glicina en la posición 446, numeración EU y la lisina en

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la posición 447, numeración EU, para reducir la heterogeneidad C-terminal de la cadena H. Además, WT-M73 (secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28) se generó introduciendo en WT-M58 una sustitución por alanina en la posición 434, numeración EU.

Los vectores de expresión para los anticuerpos anteriores se construyeron por el método descrito en el ejemplo 1. Se usó WT-M44, WT-M58 o WT-M73 como la cadena H, mientras que se usó L (WT) como la cadena L. WT-M44, WT-M58 y WT-M73 se expresaron y purificaron por el método descrito en el ejemplo 1.

Evaluación predictiva de la retención en el plasma de WT-M44, WT-M58 y WT-M73 en seres humanos

La unión de WT-IgG1, WT-M44, WT-M58 y WT-M73 al FcRn humano se evaluó por BIAcore. Como se muestra en la tabla 2, el resultado indica que las uniones de WT-M44, WT-M58 y WT-M73 son mayores que la de WT-IgG1, y aproximadamente 2,7, 1,4 y 3,8 veces la de WT-IgG1, respectivamente.

Tabla 2

KD(pM)

WT-IgG1

1,62

WT-M44

0,59

WT-M58

1,17

WT-M73

0,42

Como resultado de evaluar la retención en el plasma de WT-IgG1, WT-M14 y WT-M58 en ratones transgénicos con FcRn humano, como se muestra en la figura 24, se confirmó que WT-M58 tenía mayor retención en el plasma con respecto a WT-IgG1 y WT-M14. Además, se evaluó la retención en el plasma de WT-IgG1, WT-M44, WT-M58 y WT- M73 en ratones transgénicos con FcRn humano. Como se muestra en la figura 15, se confirmó que todos, WT-M44, WT-M58 y WT-M73, tenían farmacocinética mejorada con respecto a la WT-IgG1. El efecto de mejora de la farmacocinética se correlacionaba con la actividad de unión al FcRn humano. En particular, el nivel en el plasma de WT-M73 el día 28 era mejor en aproximadamente 16 veces que el de WT-IgG1. Este descubrimiento sugiere que la farmacocinética de los anticuerpos con la región constante M73 en seres humanos también es potenciada significativamente comparada con anticuerpos con la región constante de IgG1.

Ejemplo 8. Efecto de las nuevas regiones constantes M14 y M58 en la reducción de la heterogeneidad en diferentes anticuerpos

Como se describe en el ejemplo 4, se demostró que la heterogeneidad originada en la región bisagra de la IgG2 se podía reducir convirtiendo la región constante de IgG2 en M14 en el anticuerpo PM1 anti-receptor de IL6 humanizado (WT). También se ensayaron otros anticuerpos de tipo IgG2 distintos del anticuerpo PM1 humanizado para evaluar si la heterogeneidad se podía reducir convirtiendo sus regiones constantes en M14 o M58.

Los anticuerpos distintos del anticuerpo PM1 humanizado eran: el anticuerpo F2H/L39 anti-receptor de IL-6 (las secuencias de aminoácidos de F2H/L39_VH y F2H/L39 VL se exponen en las SEQ ID NO: 29 y 30, respectivamente); anticuerpo H0L0 anti-receptor de IL-31 (las secuencias de aminoácidos de H0L0_VH y H0L0_VL se exponen en las SEQ ID NO: 31 y 32, respectivamente); y anticuerpo DNS anti-RANKL (las secuencias de aminoácidos de DNS_VH y DNS_VL se exponen en las SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente). Para cada uno de estos anticuerpos, se generaron anticuerpos con la región constante de IgG1 (SEQ ID NO: 1), región constante de IgG2 (SEQ ID NO: 2), o M14 (SEQ ID NO: 5) o M58 (SEQ ID NO: 35).

Se evaluó en los anticuerpos generados la heterogeneidad por cromatografía de intercambio catiónico usando un gradiente adecuado y un caudal adecuado en una columna ProPac WCX-10 (Dionex) (fase móvil A: acetato sódico 20 mM (pH 5,0), fase móvil B: acetato sódico 20 mM/NaCl 1 M (pH 5,0)). El resultado de la evaluación obtenido por cromatografía de intercambio catiónico (IEC) se muestra en la figura 16.

Como se muestra en la figura 16, se demostró que la conversión de la región constante desde un tipo de IgG1 a un tipo de IgG2 aumentaba la heterogeneidad no solo en el anticuerpo PM1 anti-receptor de IL6 humanizado (WT), sino también en el anticuerpo F2H/L39anti-receptor de IL-6, en anticuerpo H0L0 anti-receptor de IL-31 y el anticuerpo DNS anti-RANKL. En cambio, la heterogeneidad se podía reducir en todos estos anticuerpos convirtiendo su región constante en M14 o M58. Por lo tanto, se demostró que, independientemente del tipo de antígeno o secuencia de la región variable del anticuerpo, se podía reducir la heterogeneidad originada en la IgG2 natural, sustituyendo cisteínas por serinas en la posición 131, numeración EU, en el dominio CH1 de la cadena H y la posición 219, numeración EU, en la región superior de la bisagra de la cadena H.

Ejemplo 9. Efecto de la nueva región constante M58 para mejorar la farmacocinética en diferentes anticuerpos

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Como se describe en el ejemplo 7, se demostró que la conversión de la región constante de IgG1 en M58 en el anticuerpo PM1 anti-receptor de IL6 humanizado (WT) mejoraba la unión al FcRn humano y la farmacocinética en los ratones transgénicos con FcRn humano. Por lo tanto, también se ensayaron anticuerpos de tipo IgG1 distintos del anticuerpo PM1 humanizado para evaluar si su farmacocinética se puede mejorar convirtiendo su región constante en M58.

Anticuerpos distintos del anticuerpo PM1 humanizado (WT) eran el anticuerpo H0L0 anti-receptor de IL-31 (las secuencias de aminoácidos de H0L0_VH y H0L0_VL se exponen en las SEQ ID NO: 31 y 32, respectivamente); y anticuerpo DNS anti-RANKL (las secuencias de aminoácidos de DNS_VH y DNS_VL se exponen en las SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente). Para cada uno de estos anticuerpos, se generaron anticuerpos con la región constante de IgG1 (SEQ ID NO: 1) o M58 (SEQ ID NO: 35) y se evaluó su unión al FcRn humano por los métodos descritos en el ejemplo 6. El resultado se muestra en la tabla 3.

Tabla 3

KD (|JM)

WT H0L0 DNS

IgG1

1,42 1,07 1,36

M58

1,03 0,91 1,03

Como se muestra en la tabla 3, se demostró que como resultado de la conversión de la región constante del tipo IgG1 a M58, como con el anticuerpo anti-receptor de IL-6 WT, se mejoraron las uniones tanto del anticuerpo H0L0 anti-receptor de IL-31 como del anticuerpo dNs anti-RANKL al FcRn humano. Esto sugiere la posibilidad de que independientemente del tipo de antígeno o secuencia de la región variable del anticuerpo, la farmacocinética en el ser humano mejora por la conversión de la región constante del tipo IgG1 a M58.

Ejemplo 10. Efecto de la cisteína en el dominio CH1 en la heterogeneidad y estabilidad

Como se describe en el ejemplo 2, las cisteínas en la región bisagra y el dominio CH1 de la IgG2 se sustituyeron para disminuir la heterogeneidad de la IgG2 natural. La evaluación de diferentes anticuerpos alterados puso de manifiesto que la heterogeneidad se podía reducir sin disminuir la estabilidad usando SKSC (SEQ ID NO: 38). SKSC (SEQ ID NO: 38) es una región constante alterada obtenida sustituyendo la cisteína por serina en la posición 131 y la arginina por lisina en la posición 133, numeración EU, en el dominio CH1 de la cadena H, y la cisteína por serina en la posición 219, numeración EU, en la región bisagra superior de la cadena H de la secuencia de la región constante de IgG2 de tipo natural.

Mientras, otro posible método para disminuir la heterogeneidad es una sola sustitución de cisteína por serina en la posición 219, o de cisteína por serina en la posición 220, numeración EU, en la región bisagra superior de la cadena H. La región constante de la IgG2 alterada SC (SEQ ID NO: 39) se preparó sustituyendo la cisteína por serina en la posición 219 y CS (SEQ ID NO: 40) se preparó sustituyendo la cisteína por serina en la posición, numeración EU, en la IgG2. WT-Sc (SEQ ID NO: 41) y WT-cS (SEQ ID NO: 42) se prepararon para tener Sc y CS, respectivamente, y se compararon con WT-IgG1, WT-IgG2, WT-SKSC y WT-M58 en términos de heterogeneidad y estabilidad térmica. Además, F2H/L39-IgG1, F2H/L39-IgG2, F2H/L39-SC, F2H/L39-CS, F2H/L39-SKSC y F2H/L39-M14, que tienen la región constante de IgG1 (SEQ ID NO: 1), IgG2 (SEQ ID NO: 2), SC (SEQ ID NO: 39), CS (SEQ ID NO: 40), SKSC (SEQ ID NO: 38), o M14 (SEQ ID NO: 5), respectivamente, se prepararon a partir de F2H/L39 (las secuencias de aminoácidos F2H/L39_VH y F2H/L39_vL expuestas en las SEQ ID NO: 29 y 30, respectivamente), que es un anticuerpo anti-receptor de IL-6 diferente del Wt. Los anticuerpos se compararon en relación con la heterogeneidad.

Se evaluó la heterogeneidad de WT-IgG1, WT-IgG2, WT-SC, WT-CS, WT-SKSC, WT-M58, F2H/L39-IgG1, F2H/L39- IgG2, F2H/L39-SC, F2H/L39-CS, F2H/L39-SKSC y F2H/L39-M14, por cromatografía de intercambio catiónico usando un gradiente adecuado y un caudal adecuado en una columna ProPac WCX-10 (Dionex) (fase móvil A: acetato sódico 20 mM (pH 5,0), fase móvil B: acetato sódico 20 mM/NaCl 1 M (pH 5,0)). El resultado de la evaluación obtenida por cromatografía de intercambio catiónico se muestra en la figura 17.

Como se muestra en el figura 17, se demostró que la conversión de la región constante de un tipo de IgG1 a un tipo de IgG2 aumentaba la heterogeneidad tanto en WT como en F2H/L39. En cambio, la heterogeneidad disminuía significativamente convirtiendo la región constante en SKSC y M14 o M58. Mientras, la conversión de la región constante en SC disminuía significativamente la heterogeneidad, como en el caso de SKSC. Sin embargo, la conversión en CS no mejoraba suficientemente la heterogeneidad.

Además de la baja heterogeneidad, en general se desea una alta estabilidad cuando se preparan formulaciones estables en el desarrollo de productos farmacéuticos de anticuerpos. Por lo tanto, para evaluar la estabilidad, la temperatura del punto medio de la desnaturalización térmica (valor de Tm) se determinó por calorimetría diferencial

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de barrido (DSC) (VP-DSC; Microcal). La temperatura del punto medio de la desnaturalización térmica (Tm) sirve como un indicador de la estabilidad. Con el fin de preparar formulaciones estables como agentes farmacéuticos, se prefiere una temperatura de punto medio mayor de la desnaturalización térmica (valor de Tm) (J. Pharm. Sci., abril 2008; 97(4):1414-26). WT-IgG1, WT-IgG2, WT-SC, WT-CS, WT-SKSC y WT-M58 se dializaron (EasySEP; TOMY) contra una disolución de acetato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. La medición por DSC se llevó a cabo a una velocidad de calentamiento de 1°C/min en un intervalo de 40 a 100°C, y con una concentración de proteína de aproximadamente 0,1 mg/ml. Las curvas de desnaturalización obtenidas por DSC se muestran en la figura 18. Los valores de Tm de los dominios Fab se dan en la siguiente tabla 4.

Tabla 4

Tm/°C

WT-IgG1

94,8

WT-IgG2

93,9

WT-SC

86,7

WT-CS

86,4

WT-SKSC

93,7

WT-M58

93,7

Los valores de Tm de WT-IgG1 y WT-IgG2 era casi iguales (aproximadamente 94°C; Tm de IgG2 era aproximadamente 1°C inferior). Mientras que los valores de Tm de WT-Sc y WT-CS eran aproximadamente 86°C y por lo tanto significativamente menores que los de WT-IgG1 y WT-IgG2. Por otra parte, los valores de Tm de WT- M58 y WT-SKSC eran aproximadamente 94°C y comparables a los de WT-IgG1 y WT-IgG2. Esto sugiere que WT- SC y WT-CS son notablemente inestables comparados con la IgG2, y por lo tanto, se prefieren WT-M58 y WT- SKSC, los cuales comprenden ambos sustitución de cisteína por serina en el dominio CH1, en el desarrollo de productos farmacéuticos de anticuerpos. La razón para la disminución significativa de Tm en WT-SC y WT-CS con respecto a IgG2 se cree que son las diferencias en el patrón de enlaces disulfuro entre WT-SC o WT-CS y la IgG2.

Además, la comparación de las curvas de desnaturalización de DSC mostraba que WT-IgG1, WT-SKSC y WT-M58 daba cada uno un pico de desnaturalización único y agudo para el dominio Fab. En cambio, WT-SC y WT-CS daba cada uno un pico de desnaturalización más ancho para el dominio Fab. WT-IgG2 daba también un hombro en el lado de temperatura inferior del pico de desnaturalización del dominio Fab. En general, se considera que un solo componente da un pico de desnaturalización agudo en DSC, y cuando hay presentes dos o más componentes con diferentes valores de Tm (en concreto, heterogeneidad), el pico de desnaturalización se hace más ancho. Específicamente, el resultado descrito antes sugiere la posibilidad de que cada uno de WT-IgG2, WT-SC y WT-CS contiene dos o más componentes, y por lo tanto la heterogeneidad de la IgG2 natural no se ha reducido suficientemente en WT-SC y WT-CS. Este descubrimiento sugiere que no solo las cisteínas en la región bisagra sino también las del dominio CH1, están implicadas en la heterogeneidad de IgG2-tipo natural, y es necesario alterar no solo las cisteínas en la región bisagra sino también las del dominio CH1 para disminuir la heterogeneidad por DSC. Además, como se ha descrito antes, la estabilidad comparable a la de la IgG2 de tipo natural solo se puede lograr cuando se sustituyen las cisteínas tanto en la región bisagra como en el dominio CH1.

El descubrimiento anterior sugiere que desde la perspectiva de la heterogeneidad y estabilidad, SC y CS, que son regiones constantes introducidas con sustitución por serina de solo la cisteína de la región bisagra, son insuficientes como regiones constantes para disminuir la heterogeneidad originada en la región bisagra de la IgG2. Por lo tanto, se descubrió que la heterogeneidad se podía disminuir significativamente mientras que se mantenía una estabilidad equivalente a la IgG2, solo cuando la cisteína en la posición 131, numeración EU, en el dominio CH1 se sustituía por serina además de la cisteína de la región bisagra. Dichas regiones constantes incluyen M14, M31, M58 y M73 descritas antes. En particular, M58 y M73 son estables y menos heterogéneas, y presentan mejor farmacocinética, y por lo tanto se espera que sean muy útiles como regiones constantes para productos farmacéuticos de anticuerpos.

Ejemplo 11. Generación de anticuerpos anti-receptor de IL-6 totalmente humanizados con PK/PD mejorada

Para generar un anticuerpo anti-receptor de IL-6 totalmente humanizado con PK/PD mejorada, se crearon las moléculas descritas a continuación alterando TOCILIZUMAB (cadena H, WT-IgG1 (SEQ ID NO: 12); cadena L, WT (SEQ ID NO: 15)). Se prepararon los siguientes anticuerpos anti-receptor de IL-6 totalmente humanizados que usaban como región constante M73 o M83 preparados en el ejemplo 7:

Fv3-M73 (cadena H, VH4-M73, SEQ ID NO: 48; cadena L, VL1-kappa, SEQ ID NO: 49),

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Fv4-M73 (cadena H, VH3-M73, SEQ ID NO: 46; cadena L, VL3-kappa, SEQ ID NO: 47), y Fv5-M83 (cadena H, VH5-M83, SEQ ID NO: 44; cadena L, VL5-kappa, SEQ ID NO: 45).

Las afinidades de Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 preparados contra el receptor de IL-6 se compararon con las de TOCILIZUMAB. Las afinidades de estos anticuerpos anti-receptor de IL-6 determinadas se muestran en la tabla 5 (véase el ejemplo de referencia para el método). Además, sus actividades neutralizantes de BaF/gp130 se compararon con las de TOCILIZUMAB y el control (el anticuerpo anti-receptor de IL-6 de alta afinidad conocido descrito en el ejemplo de referencia, y VQ8F11-21 hIgG1 descrito en el documento US 2007/0280945 ) (véase el ejemplo de referencia para el método). Los resultados obtenidos determinando las actividades biológicas de estos anticuerpos usando BaF/gp130 se muestran en la figura19 (TOCILIZUMAB, el control, y Fv5-M83 con una concentración final de IL-6 de 300 ng/ml) y la figura 20 (TOCILIZUMAB, Fv3-M73 y Fv4-M73 con una concentración final de IL-6 de 30 ng/ml). Como se muestra en la tabla 5, Fv3-M73 y Fv4-M73 tienen una afinidad de aproximadamente dos a tres veces mayor que TOCILIZUMAB, mientras que Fv5-M83 presenta una afinidad de aproximadamente 100 veces mayor que TOCILIZUMAB (puesto que era difícil medir la afinidad de Fv5-M83, en su lugar se determinó la afinidad usando Fv5-IgG1, que tiene una región constante de tipo IgG1; en general se cree que la región constante no tiene efecto en la afinidad). Como se muestra en la figura 20, Fv3-M73 y Fv4-M73 presentan actividades ligeramente más fuertes que TOCILIZUMAB. Como se muestra en la figura 19, Fv5-M83 tiene una actividad muy fuerte, que es más de 100 veces mayor que la de TOCILIZUMAB, en términos de concentración inhibidora de 50%. Fv5-M83 también presenta una actividad neutralizante aproximadamente 100 veces mayor en términos de concentración inhibidora de 50%, que el control (el anticuerpo anti-receptor de IL-6 de alta afinidad conocido).

Tabla 5

ka(1/Ms) kd (1/s) KD (M)

TOCILIZUMAB

4,0E+05 1,1E-03 2,7E-09

Fv3-M73

8,5E+05 8,7E-04 1,0E-09

Fv4-M73

7,5E+05 1,0E-03 1,4E-09

Fv5-M83

1,1E+06 2,8E-05 2,5E-11

Los puntos isoeléctricos de TOCILIZUMAB, el control, Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83, se determinaron por enfoque isoeléctrico usando un método conocido para los expertos en la técnica. El resultado mostraba que el punto isoeléctrico era aproximadamente 9,3 para TOCILIZUMAB; aproximadamente de 8,4 a 8,5 para el control; aproximadamente de 5,7 a 5,8 para Fv3-M73; aproximadamente de 5,6 a 5,7 parar Fv4-M73; y de 5,4 a 5,5 para Fv5-M83. Por lo tanto, cada uno de los anticuerpos tenía un punto isoeléctrico significativamente menor cuando se comparaba con TOCILIZUMAB y el control. Además, el punto isoeléctrico teórico de las regiones variables VH/VL se calculó mediante GENETYX (GENETYX CORPORATION). El resultado mostraba que el punto isoeléctrico teórico era 9,20 para TOCILIZUMAB; 7,79 para el control; 5,49 para Fv3-M73; 5,01 para Fv4-M73; y 4,27 para Fv5-M83. Por lo tanto, cada uno de los anticuerpos tenía un punto isoeléctrico significativamente menor cuando se comparaba con TOCILIZUMAB y el control. Por consiguiente, se pensó que la farmacocinética de Fv3-M73, Fv4-M73, y Fv5- M83 había mejorado comparada con TOCILIZUMAB y el control.

Se analizaron los epítopos de linfocitos T en la secuencia de la región variable de TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4- M73 o Fv5-M83 usando TEPITOPE (Methods., dic 2004; 34(4):468-75). Como resultado, se predijo que TOCILIZUMAB tenía epítopos de linfocitos T, de los cuales muchos se podían unir a HLA. En cambio, el número de secuencias que se predijo que se unían a epítopos de linfocitos T era significativamente menor en Fv3-M73, Fv4- M73 y Fv5-M83. Además, la región armazón de Fv3-M73, Fv4-M73 o Fv5-M83 no tiene secuencia de ratón y por lo tanto está completamente humanizado. Esto sugiere la posibilidad de que el riesgo de inmunogenicidad esté significativamente reducido en Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 cuando se compara con TOCILIZUMAB.

Ejemplo 12. Ensayo de PK/PD de los anticuerpos anti-receptor de IL-6 totalmente humanizados en macacos

Cada uno de TOCILIZUMAB, el control, Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83, se administraron por vía intravenosa una vez con una dosis de 1 mg/kg a macacos cangrejeros para evaluar la evolución temporal de sus concentraciones plasmáticas (véase el ejemplo de referencia para el método). La evolución temporal de las concentraciones plasmáticas de TOCILIZUMAB, Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 después de administración intravenosa se muestra en la figura 21. El resultado mostraba que cada uno de Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 presentaba farmacocinética mejorada en los macacos cangrejeros cuando se comparaba con TOCILIZUMAB y el control. De ellos, Fv3-M73 y Fv4-M73 presentaban farmacocinética sustancialmente mejorada cuando se comparaba con TOCILIZUMAB.

Se evaluó la eficacia de todos los anticuerpos para neutralizar el receptor de IL-6 de macaco cangrejero unido a membrana. Se administró IL-6 de macaco cangrejero por vía subcutánea en la región lumbar con 5 pg/kg cada día desde el día 6 al día 18 después de administración del anticuerpo (día 3 a día 10 para TOCILIZUMAB), y la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

concentración de CRP en todos los animales se determinó 24 horas más tarde (véase el ejemplo de referencia para el método). La evolución temporal de la concentración de CRP después de administración de cada anticuerpo se muestra en la figura 22. Para evaluar la eficacia de cada anticuerpo para neutralizar el receptor de IL-6 de macaco cangrejero soluble, se determinó la concentración plasmática del receptor de IL-6 de macaco cangrejero soluble libre en los macacos cangrejeros y se calculó el porcentaje de neutralización del receptor de IL-6 soluble (véase el ejemplo de referencia para el método). La evolución temporal del porcentaje de neutralización del receptor de IL-6 soluble después de administración de cada anticuerpo, se muestra en la figura 23.

Todos los Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83, neutralizaban el receptor de IL-6 de macaco cangrejero unido a membrana de una forma más sostenible, y suprimían el aumento de CRP a lo largo de un periodo de tiempo más largo cuando se comparaban con TOCILIZUMAb y el control (el anticuerpo anti-receptor de IL-6 de alta afinidad conocido). Además todos los Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 neutralizaban el receptor de IL-6 de macaco cangrejero soluble de una forma más sostenible, y suprimían el aumento del receptor de IL-6 de macaco cangrejero soluble libre a lo largo de un periodo de tiempo más lago cuando se comparaban con TOCILIZUMAB y el control. Estos descubrimientos demuestran que todos los Fv3-M73, Fv4-M73 y Fv5-M83 son superiores manteniendo la neutralización de receptores de IL-6 unidos a membrana y solubles, que TOCILIZUMAB y el control. De ellos, Fv3-M73 y Fv4-M73 son notablemente superiores en mantener la neutralización. Mientras que Fv5-M83 suprimía CRP y el receptor de IL-6 de macaco cangrejero soluble de forma más fuerte que Fv3-M73 y Fv4-M73. Por lo tanto, Fv5-M83 se considera que es más fuerte que Fv3-M73, Fv4-M73 y el control (el anticuerpo anti-receptor de IL-6 de alta afinidad conocido) en la neutralización de los receptores de IL-6 unidos a membrana y solubles. Se consideró que los resultados in vivo de los macacos cangrejeros reflejaban la afinidad más fuerte de Fv5-M83 por el receptor de IL-6 y la actividad biológica más fuerte de Fv5-M83 en el sistema de ensayo BaF/gp130 con respecto al control.

Estos descubrimientos sugieren que Fv3-M73 y Fv4-M73 son muy superiores en el mantenimiento de sus actividades como un anticuerpo neutralizante anti-receptor de IL-6 cuando se comparaba con TOCILIZUMAB y el control, y por lo tanto permiten reducir significativamente la dosis y la frecuencia de administración. Además, se demostró que Fv5-M83 era notablemente superior en términos de fuerza de actividad como un anticuerpo neutralizante anti-receptor de IL-6, así como manteniendo su actividad. Por lo tanto, se espera que Fv3-M73, Fv4- M73 y Fv5-M83 sean útiles como antagonistas de IL-6 farmacéuticos.

Ejemplo de referencia

Preparación de receptor de IL-6 recombinante soluble de macaco cangrejero (cIL-6R)

Se prepararon cebadores de oligo-ADN basándose en la secuencia de gen descrita para el receptor de IL-6 del macaco Rhesus (Birney et al., Ensembl 2006, Nucleic Acids Res., 1 enero 2006; 34 (número de base de datos):D556-61). Se preparó un fragmento de ADN que codificaba el gen del receptor de IL-6 de macaco cangrejero entero por PCR usando los cebadores, y como molde ADNc preparado a partir del páncreas del macaco cangrejero. El fragmento de ADN resultante se insertó en un vector de expresión de célula animal, y se preparó una línea de CHO de expresión estable (línea de células CHO que producen cyno.sIL-6R) usando el vector. El medio de cultivo de células CHO que producen cyno.sIL-6R se purificó usando una columna HisTrap (GE Healthcare Bioscience) y después se concentró con Amicon Ultra-15 Ultracel-10k (Millipore). Se obtuvo una muestra purificada final del receptor de IL-6 de macaco cangrejero soluble (en lo sucesivo cIL-6R) por purificación adicional en una columna de filtración en gel Superdex200pg16/60 (GE Healthcare Bioscience).

Preparación de IL-6 recombinante de macaco cangrejero (cIL-6)

Se preparó IL-6 de macaco cangrejero por el procedimiento descrito a continuación. Se preparó la secuencia de nucleótidos que codifica 212 aminoácidos depositada en SWISSPROT con el n° de acceso P79341 y se clonó en un vector de expresión de célula animal. El vector resultante se introdujo en células CHO para preparar una línea de células de expresión estable (línea de células CHO que producen cyno.sIL-6). El medio de cultivo de las células CHO que producen cyno.sIL-6 se purificó usando una columna de SP-Sepharose/FF (GE Healthcare Bioscience) y después se concentró con Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). Se obtuvo una muestra final purificada de IL-6 de macaco cangrejero (en lo sucesivo cIL-6) por purificación adicional en una columna de filtración en gel Superdex75pg26/60 (GE Healthcare Bioscience), seguido de concentración con Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore).

Preparación de un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de alta afinidad conocido

Se construyó un vector de expresión de célula animal para expresar VQ8F11-21 hIgG1, un anticuerpo anti-receptor de IL-6 de alta afinidad conocido. VQ8F11-21 hIgG1 se describe en el documento US 2007/0280945 A1 (US 2007/0280945 A1; las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L se exponen en las SEQ ID NO: 19 y 27, respectivamente). La región variable del anticuerpo se construyó por PCR usando una combinación de oligo- ADN sintéticos (PCR de ensamblaje). Se usó IgG1 como la región constante. Las regiones variable y constante del anticuerpo se combinaron entre sí por PCR de ensamblaje, y después se insertaron en un vector de expresión de célula animal para construir vectores de expresión para la cadena H y la cadena L de interés. Las secuencias de nucleótidos de los vectores de expresión resultantes se determinaron por un método conocido por el experto en la

Claims (6)

1. Una región constante de anticuerpo humano que comprende deleciones de ambas Gly en la posición 329 (posición 446 en el sistema de numeración EU) y Lys en la posición 330 (posición 447 en el sistema de numeración EI) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en donde la amidación del aminoácido C-terminal de la región

5 constante del anticuerpo IgG1 humana está suprimida.

2. La región constante de anticuerpo de la región de la reivndicación 1, en la que el aminoácido Asn en posición 317 (posición 434 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ IDNO: 1 ha sido sustituida por otro aminoácido.

3. Un método para reducir la heterogeneidad C-terminal de un anticuerpo, que comprende una etapa de 10 suprimir ambas Gly en la posición 329 (posición 446 en el sistema de numeración EU) y Lys en la posición 330

(posición 447 en el sistema de numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de SEQ iD NO: 1, en donde la amidación del aminoácido C-terminal de la región constante del anticuerpo IgG1 humana está suprimida.

4. Una región constante de anticuerpo que se caracteriza por tener una heterogeneidad C-terminal reducida que se puede obtener mediante el método de la reivindicación 3.

15 5. Una región constante de anticuerpo humano de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, o como se puede

obtener mediante el método de la reivindicación 3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43.

6. Un anticuerpo, un anticuerpo anti-receptor de IL-6, un anticuerpo anti-receptor de IL-31, un anticuerpo anti- RANKL, o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que tiene la región constante de cualquiera

20 de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, o como puede obtenerse por el método de la reivindicación 3.

7. Un anticuerpo o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo que tiene dos regiones constantes de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, o como puede obtenerse por el método de la reivindicación 3.

114

FIG. 1

AGREGACIÓN SEC (%)

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MINUTOS

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FIG. 8

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FIG. 9

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124

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FIG. 13

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CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPO (pg/ml)

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□: Fv5-M83

FIG. 19

INHIBICIÓN (%)

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FIG. 20

134

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FIG. 23

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